KR20200088358A - 전기 화학 센서를 사용한 분석물의 캘리브레이션 프리 체내 측정 - Google Patents

전기 화학 센서를 사용한 분석물의 캘리브레이션 프리 체내 측정 Download PDF

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케빈 플락스코
쿠라스 넷자왈코요틀 아로요
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더 리젠트스 오브 더 유니이버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

일반적인 전기 화학 센서는 전류 출력의 표적-유도된 변화를 측정한다. 이러한 표적 결합의 측정은 개별 센서에 걸쳐 일관성이 없고, 나아가 신호는 센서가 장기간 배치될 때 시간에 걸쳐 드리프트할 것이다. 이 단점은 표적 결합의 표시자로 전류 감쇠 속도론을 측정하는 크로노암페로메트리의 새로운 사용에 의해 회피될 수 있다. 전류 감쇠 수명은 농도 의존적인 방식으로 변화할 것이지만, 개별 센서 및 시간에 걸쳐 안정적으로 유지되어, 캘리브레이션-프리 동작을 가능하게 한다. 이들 방법에 의하여, 앱타머 기반 전기 화학 센서와 다른 센서 타입이 확장된 기간 동안 체내에 배치될 수 있고 캘리브레이션 없이 표적 결합의 정확한 측정을 제공할 것이다.

Description

전기 화학 센서를 사용한 분석물의 캘리브레이션 프리 체내 측정
본 출원은 본 명세서에 참조로서 통합되는 2017년 10월 30일 출원된 "Calibration Free In-Vivo Measurement of Analytes Using Electrochemical Sensors"라는 제목의 미국 가특허출원 제62/578,665호에 대한 우선권을 주장한다.
연방 후원되는 연구 또는 개발에 관한 선언: 본 발명은 미육군 연구청에 의해 수여되는 승인 번호 W911NF-09-0001호 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부가 본 발명의 특정 권리를 가진다.
표적 분자의 검출을 위한 다양한 타입의 전기화학 센서가 공지되어 있다. 이러한 많은 센서는 전류 출력을 생성하는데, 전류 출력의 크기는 표적 분자의 결합에 따라 달라진다. EA-B(electrochemical aptamer-based) 센서는 산화환원-리포터-변형된 전극 결합 앱타머를 사용하는데, 앱타머의 결합-유도된 배좌 변화는 산화환원 리포터와 전극 간의 전자 흐름의 측정 가능한 변화를 야기한다. EA-B 센서는 본 분야에 복잡한 샘플의 표적 분석물의 측정을 위한 다용도 플랫폼을 제공하였다. EA-B 센서는 흐르는 전혈에서 약물과 다른 표적종의 실시간 검출을 위한 체내 동작을 보여왔다. 하지만, 이 플랫폼의 대단한 가능성에도 불구하고, E-AB 센서는 임상적 채용을 제한하는 특정 단점의 문제가 있다.
구체적으로, EA-B 센서는 모든 복잡한 장치와 마찬가지로, 제조의 불일치 문제가 있는데, 심지어 동일 배치에서 제조될 때에도 상이한 수의 인식 요소가 개별 센서에 존재한다. 이 센서-대-센서 물리적 변동성은 동일 설계의 상이한 센서로부터 획득하는 출력이 현저하게 달라질 수 있음을 의미한다. 나아가, 전혈과 같은 복잡한 샘플 환경에서 채용될 때, 최고의 E-AB조차 드리프트의 대상이 되는데, 앱타머와 샘플의 분자의 복잡한 혼합물 간의 비-특정 상호작용이 시간이 흐름에 따른 가변 판독을 야기한다. 이들 인자는 센서 출력을 해석하기 위해 캘리브레이션 단계나 신호 보정 측정이 수행되어야 할 것을 요구한다. 체내 주입되는 센서의 경우, 캘리브레이션이 실용적이지 않거나 종종 불가능하고, 상술한 오류원은 임상적 구현에 심각한 장애물이 된다.
따라서, 본 분야에 캘리브레이션-프리 측정을 가능하게 하는 이러한 센서를 구동하는 새로운 전기 화학 센서 시스템과 방법의 필요가 남아있다. 나아가, 본 분야에 신호 드리프트에 의해 혼동되지 않고 체내에서 분석물을 정확하게 측정하는 수단의 필요가 남아있다. 본 분야에 기존의 검출 플랫폼의 성능과 효율을 향상시킬 필요가 남아있다.
선행 기술의 전기 화학 검출 방법은 표적 농도를 결정하기 위해 SWV 피크와 같은 전류 출력(즉, 절대 전류값)의 측정에 의존하는데, 이러한 측정은 센서-대-센서 변동성과 센서 드리프트에 심하게 영향 받는다. 본 출원의 발명자는 전기 화학 센서의 신호 출력 속도론의 특정 양태, 특히 전류 감쇠 속도론이 센서-대-센서 변동성과 센서 드리프트에 민감하지 않다는 것을 유리하게 발견했다. 절대 전류와 같이, 이들 전류 감쇠 속도론 파라미터가 농도-의존 방식으로 표적 결합에 반응하지만, 절대 전류와 달리, 주어진 클래스의 센서에 걸쳐 안정적이고, 시간이 흐름에 따라 안정적이어서 절대 전류에서 관찰되는 변동성을 회피하는 수단을 제공한다.
본 출원의 발명자는 새로운 전기 화학 센서 구동 및 센서 출력 해석 방법을 유리하게 개발하여, 상이한 센서에 의해 또는 상이한 시간에 생성되는 신호가 샘플의 표적 농도와 정확하게 상호 연관될 수 있게 한다. 본 발명의 방법은 한 클래스 내의 센서(예컨대, 동일한 인식 요소를 채용)가 연역적으로 효율적으로 캘리브레이션되고 체내 전혈과 같이 복잡한 환경에서 표적종의 확장된 캘리브레이션-프리 측정에 채용될 수 있게 한다.
제1 양태에서, 본 발명의 범위는 표적 분석물 농도의 정확한 측정을 제공하기 위한 센서 출력의 획득 및 해석 방법을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 범위는 드리프트-프리 또는 캘리브레이션-프리 측정으로 구동될 수 있는 센서 시스템을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 범위는 주어진 클래스의 전기 화학 센서를 포함하는데, 센서의 출력은 클래스의 모든 센서에 걸쳐 안정적인 관계에 의해 표적 농도와 상호 연관된다. 다른 양태에서, 본 발명의 범위는 표적 농도를 측정하기 위해 전기 화학 센서 출력의 획득 및 해석을 가능하게 하는 컴퓨터 프로그램, 소프트웨어 및 동작을 포함한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1a 및 1b. 도 1a는 E-AB 검출 플랫폼의 기본 동작을 도시하는데, 전극 기판(101)에 결합된 앱타머(102)는 메틸렌 블루 산화환원 리포터(103)로 변형된다. 표적이 없을 때, 메틸렌 블루와 기판 간의 전자 흐름(104)은 느리다. 표적(105)이 앱타머에 결합할 때, 야기되는 배좌 변경은 리포터(103)와 기판(101) 사이의 거리를 달라지게 하여, 전자 이동(104)의 속도를 증가시킨다. 도 1b는 이 타입의 E-AB 센서의 대표적 사각파 볼타메트리 트레이스를 도시하는데, 피크 전류는 표적이 없을 때보다 있을 때 더 높다.
도 2a 및 2b. 도 2a는 토브라마이신을 표적으로 사용하여 6개의 아미노글리코사이드-검출 센서의 세트를 위한 SWV 적정 곡선을 도시한다. 절대 피크 전류는 표적 분자의 농도뿐만 아니라 센서 표면의 산화환원-리포터-변형된 프로브의 수에도 의존하여 SWV를 사용하여 생성된다. 동작 전극의 활성 영역과 패킹된 앱타머 프로브의 밀도의 변화 때문에, 이들 절대 피크 전류는 센서에 따라 현저히 달라질 수 있어, 결국 로우(캘리브레이션되지 않은) 센서 출력에 큰 변동으로 이어진다. 도 2b는 캘리브레이션 단계를 수행함으로써 정규화될 때 도 2a의 센서 출력을 도시한다.
도 3. 도 3은 흐르는 전혈에서 아미노글리코사이드-결합 E-AB 센서의 크로노암페로메트리에 의해 측정된 평균 전류 대 시간의 과도 전류 로그-로그 플롯을 도시한다. 전류 감쇠는 두 지수기의 합으로 잘 설명된다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 수직 점선의 왼쪽의 제1 기는 이중층 충전 전류의 감쇠인데, 센서는 표적에 둔감하다. 수직선의 오른쪽으로, 과도 전류는 매우 표적 의존적이다. 표적이 없을 때 획득한 과도에서, 유도 전류의 더 느린 지수적 감쇠가 관찰된다. 표적이 있을 때(여기서 토브라마이신), 평균 전류 수명은 실질적으로 감소된다. 도시된 과도는 포텐셜을 -0.1V에서 -0.3V으로 스테핑하고 그에 따른 전류를 10μs마다 샘플링함으로써 기록되었다(모든 포텐션을 Ag/AgCl에 대해 보고됨). 실선은 실험 데이터의 다중 지수 맞춤이다.
도 4a, 4b 및 4c. 도 4a는 표적 농도가 증가함에 따라 감소하는 수명을 가지는 감쇠 과도 전류를 가지는 아미노글리코사이드-결합 E-AB 센서(토브라마이신을 표적으로)에 대해 크로노암페로메트리-측정된 평균 과도 전류를 도시한다. 실선은 두 과도 전류의 단일 지수 맞춤을 나타낸다. 도 4b는 아미노글리코사이드-결합 E-AB 센서의 세트에 대해 확립된 전류 수명과 버퍼 및 전혈의 표적 농도 간의 관계를 도시한다. 두 샘플 타입 간의 수명의 차이는 메틸렌 블루로부터의 전자 이동에 영향을 주는 전해액 조성과 점도의 변화로 인한 것일 확률이 높다. 도 4c는 도 4b의 표준 곡선을 생성하는데 사용된 클래스와 동일하지만 표준 곡선을 생성하는데 사용되지 않은 5개의 센서에 의해 측정된 토브라미이신 농도를 도시한다. 센서 클래스에 의해 생성된 곡선에 의해 흐르는 전혈의 토브라마이신의 농도를 추정하기 위해 이들 독립적 센서를 사용하여, 토브라마이신의 농도의 정확하고 정밀한 측정이 개별 센서를 캘리브레이션할 필요 없이 넓은 범위의 농도에 걸쳐 획득된다. 희석되지 않은 전혈에서 검사될 때 1μΜ 내지 1mM의 범위에 걸쳐 측정된 농도값이 토브라마이신의 실제(뾰족한) 농도의 10% 내에 있다. 도 4b 및 4c에서 오류 막대(도 4b에서는 보기 어려울 정도로 작다)는 표준 편차를 나타낸다.
도 5a 및 5b. 도 5a는 흐르는 전혈(여기서 표적 없음)의 E-AB 센서 출력을 도시하는데, SWV로부터 기록된 평균 피크 전류는 수시간 동안 현저히 드리프트한다(보정되지 않은 신호). 측정에 적용되는 속도론 차이 측정 보정 기술이 보정된 신호를 제공한다. 도 4b는 시간에 따른 전혈(표적 없음)에 채용된 동일 센서에 대한 평균 전류 크기 및 평균 전류 수명을 도시한다. 크로노암페로메트리 전류 감쇠의 크기는 검사 기간에 걸쳐 꽤 현저히 드리프트한다. 하지만, 이와 대조적으로 전류 수명은 시간에 걸쳐 안정적이고 검사 기간 동안 드리프트하지 않는다.
도 6a, 6b, 6c 및 6d. 도 6a는 살아있는 마취된 쥐의 경정맥의 센서 배치를 도시한다. 센서는 구조적 지지를 위해 22 게이지 카테터로 감싸지고, 외부 경정맥 내부에 2cm 깊이로 배치된다. 주입 라인은 약물 주입을 수행하기 위해 반대측에 심어진다. 도 6b는 전류 수명을 추출하고 실시간으로 표적 농도로 변환하기 위해 크로노암페로메트리에 의해 생성된 과도 전류의 실시간 비선형 회귀 분석을 도시한다. 트레이스는 20포인트의 연속 평균이다. 점선 상자는 토브라마이신이 주입된 타임프레임을 도시한다. 도 6c는 시간점당 300ms로 수명 대 시간 트레이스(20포인트의 연속 평균)을 도시하는데, 이 접근법의 시간 해상도는 약물 주입뿐만 아니라 순환계 내의 약물 균질화와 연관된 후속 수십초의 "혼합" 단계도 모니터링하기에 충분하다. 이 패널은 도 6b의 점선으로 표시된 확대된 영역에 대응한다. 도 6d는 평균 농도 대 시간을 도시하는데, 전례 없는 시간 해상도가 1,000개 이상의 실험점으로 약물의 분-규모의 분포 단계의 측정을 가능하게 하여, 결국 연관된 약물 속도론 파라미터의 초고정밀도의 추정을 생성한다.
동작 원리. 본 명세서에 개시되는 발명은 대규모의 전기 화학 센서 동작 연구 및 특정 출력이 센서 제조 변동성 및 신호 드리프트에 둔감하다는 발견으로부터 도출되었다. 일반 전기 화학 센서 구현에서, 전류 흐름은 표적 결합에 의해 변화되고 주기적 전압 전류계, 교류 전압 전류계 및 사각파 전압 전류계를 포함하여 전압 전류법에 의해 평가된다. 이들 방법은 피크 전류를 측정하는데, 결합된 산화환원-리포터-변형된 인식 요소의 일부에 관련되지만, 센서의 존재 및 활성인 인식 요소(예컨대, 앱타머)의 총 수에도 크게 의존한다.
본 출원의 발명자는 표적 결합에 의해 유도된 전자 이동의 변화를 모니터링하는 대안적 접근법을 개발하였다. 결합-의존적 전자 이동 속도론에 간접적으로 관련되는 전압 전류의 피크 전류를 측정하는 대신, 전자 이동 속도론이 직접 유리하게 측정될 수 있는데, 본 출원의 발명자는 피크 전류 측정에 영향을 주는 오류원에 둔감한 이들 값을 발견하였다. 본 출원의 발명자는 크로노암페로메트리 전류 감쇠를 통해 측정된 전자 이동 속도론이 주로 표적 결합에 의해 결정되고, 피크 전류와는 달리 각 센서의 활성 인식 유닛의 수에 독립적이라고 결정하였다. 따라서, 표적 농도와 전자 이동 속도론 간의 관계는 선택된 센서 구성에 대해 결정될 수 있고 이 관계는 안정적이며 유사 조건 하에 동작하는 모든 유사 센서에 적용가능할 것이다. 나아가, 이 예측적 관계는 긴 기간 동안 동작하는 개별 센서에 대해서도 안정적이다.
본 발명의 이 새로운 동작 원리는 개별 센서를 캘리브레이션할 필요를 제거하고, 체내와 같이 어려운 환경에서 드리프트-프리 동작을 위한 수단을 제공한다. 또한 측정은 극도로 세밀한 시간 규모로 획득될 수 있어, 수 밀리초의 시간 규모로 전기 화학 센서에 의한 생물학적 프로세스의 해상도를 가능하게 한다.
본 발명의 다양한 요소가 다음에 서술된다.
전기 화학 센서. 본 발명의 다양한 실시예가 전기 화학 센서 사용 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 전기 화학 센서는 샘플의 표적종의 농도를 측정할 수 있는 임의의 센서인데, 센서의 인식 요소에 대한 표적종의 결합은 검출 요소에 의해 출력되는 전류의 측정 가능한 변화를 유도하여, 센서의 출력이 샘플의 표적종의 농도를 추정하는데 사용될 수 있다.
EAB 센서. 제1 구현에서, 본 발명의 방법에서 이용되는 전기 화학 센서는 E-AB 센서를 포함한다. 본 분야에 공지된 임의의 E-AB 센서 설계나 구성이 사용될 수 있다. E-AB 센서에서, 공지된 바와 같이 인식 요소는 앱타머를 포함한다. 앱타머는 DNA 앱타머, RNA 앱타머 또는 비자연적 핵산을 포함하는 앱타머뿐만 아니라 상술한 것의 혼합을 포함할 수 있다. 인식 요소가 핵산이 아닌 E-AB 개념의 변종, 예컨대 단백질, 화학종 및 다른 분자를 사용하는 센서도 본 발명의 범위에 속한다.
E-AB 센서에서, 동작 전극의 하나 이상의 선택된 부분이 앱타머로 기능화된다. 앱타머는 임의의 적절한 화학, 예컨대 공유 결합, 화학 수착 또는 흡착에 의해 전극 표면에 결합되거나 다른 방식으로 연관될 수 있다. 알칸 티올 일분자층이 앱타머를 전극 표면에 결합시키는데 사용될 수 있는데, 특히 금 전극 표면에 적합하다.
각 앱타머는 하나 이상의 산화 환원 리포터로 기능화된다. 표적종의 결합은 앱타머가 그 구성을 바꾸도록 야기하여, 하나 이상의 산화 환원 리포터의 위치(또는 전극으로의 접근성)이 검출 가능하게 변경된다. 산화 환원종은 전극과 상호작용하여 그 접근성이나 전극으로의 거리의 변화가 전자 이동 속도론의 변화를 야기하는 임의의 조성의 물질을 포함할 수 있다. 산화 환원종의 예시는 메틸렌 블루, 페로센, 비올로겐, 안트라퀴논 또는 임의의 다른 퀴논, 브롬화 에티듐, 다우노마이신, 유기 금속 산화 환원 라벨, 예컨대 포르피린 합성물이나 크라운 에테르 고리나 선형 에테르, 루테늄, 비스-피리딘, 트리스-피리딘, 비스-이미디졸, 에틸렌 테트라아세틱 애시드-금속 합성물, 시토크롬 c, 플라스토시아닌 및 시토크롬 c'를 포함한다.
일부 구현에서, E-AB 센서는 신호-온 타입 센서로, 표적 결합이 신호를 강화하고, 다른 구현에서 E-AB 센서는 신호-오프 구성을 포함할 수 있다. 일실시예에서, E-AB는 이중 가닥 센서인데, 산화 환원종이 개별 가닥에 존재하고, 그 일부가 상보적으로 또는 다르게 역으로 앱타머의 일부로 결합할 수 있다. 표적종이 존재할 때, 산화 환원종의 가닥은 앱타머로부터 해방되어, 표적종이 앱타머에 결합할 수 있게 하고 산화 환원종은 전극에 접촉하거나 가까이 오게 된다.
센서 컴포넌트. 전기 화학 센서는 하나 이상의 동작 전극을 포함할 것인데, 복수의 인식 요소가 결합된다(예컨대, 0.1x1011 내지 1x1013 molecules/cm2의 밀도로). 동작 전극은 전기 화학 검출을 위한 임의의 적절한 전극 물질을 포함할 수 있는데, 예컨대 티올이나 아민과 결합을 형성하는 임의의 금속 표면, 금, 임의의 금 코팅된 금속(예컨대, 티타늄, 텅스텐, 백금, 탄소, 알루미늄, 구리 등), 맨 팔라듐 전극, 탄소 전극 등을 포함한다.
동작 전극은 임의의 원하는 형상이나 크기로 구성될 수 있다. 예를 들어, 노 형상의 전극, 직사각형 전극, 와이어 전극, 전극 어레이, 스크린 인쇄된 전극 및 다른 구성이 사용될 수 있다. 체내 측정의 경우, 가는 와이어 구성이 유리한데, 낮은 프로필 와이어가 정맥, 동맥, 조직 또는 장기에 삽입될 수 있고 혈관의 혈류를 방해하거나 조직의 실질적 손상을 야기하지 않을 것이기 때문이다. 예를 들어, 1-500μm, 예컨대 100μm의 직경을 가지는 와이어가 사용될 수 있다.
본 발명의 전기 화학 검출 시스템은 보조 또는 상대 전극, 예컨대 백금 보조 전극을 더 포함한다. 전기 화학 검출 요소는 참조 전극, 예컨대 Ag/AgCl 전극 또는 공지된 다른 참조 전극과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 전기 화학 센서는 2 전극 또는 3 전극 시스템으로 구성될 수 있는데, 크로노암페로메트리 측정을 수행하기에 적절하게 구성된다. 전극 포함 셀 시스템은 혼합 챔버나 다른 용기를 포함할 수 있는데 전극이 존재하며 샘플과 접촉한다.
센서와 전극 시스템은 샘플 내에 배치되거나 샘플에 노출될 때 유도 전류 측정을 획득하기 위한 조립체를 포함할 수 있다. 조립체는 하우징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생명체의 몸에 배치하기 위해, 하우징은 바늘, 카테터 또는 다른 주입 가능한 구조를 포함할 수 있다. 체외 응용을 위하여, 하우징은 웰, 미세 유체 용기 또는 랩 온 칩 장치에서 볼 수 있는 것과 같은 다른 구조를 포함할 수 있다.
본 발명의 전기 화학 센서는 크로노암페로메트리 측정을 수행하기에 적절한 컴포넌트와 기능적 연결될 것이다. 크로노암페로메트리 컴포넌트는 서로 전기적 및/또는 네트워크 연결된 둘 이상의 장치를 포함할 수 있거나, 단일 통합 장치를 포함할 수 있다.
크로노암페로메트리 측정을 수행하는 제1 컴포넌트는 소정의 진폭, 주파수 및 파형의 여기 전압 펄스를 검출 요소로 전달할 수 있는 장치나 장치의 조합을 포함한다. 크로노암페로메트리 컴포넌트는 포텐쇼스탯이나 다른 전압원 및 동작 전극에 전압 스텝을 부과하는 전압 제어기를 포함할 수 있다.
크로노암페로메트리 측정을 위한 제2 컴포넌트는 검출 요소로부터 시간 분해 유도 전류 출력을 획득할 수 있는 장치 또는 장치의 조합을 포함한다. 이들 컴포넌트는 아날로그-투-디지털 컨버터, 증폭기 및 저장 매체와 같은 컴포넌트를 포함하여 센서 출력을 판독하고 이러한 출력을 저장하거나 다른 장치로 출력을 전달하는 회로를 포함할 것이다. 아주 미세한 시간 규모, 예컨대 수 마이크로초 내지 수 밀리초의 시간 규모의 해상도는 대부분의 센서 시스템에서 전류 감쇠 속도론을 측정하기 위해 필수일 것이다.
다른 센서 타입. 본 발명의 범위는 E-AB 센서로 제한되지 않는다. 본 발명의 범위는 인식 요소로의 표적 결합이 검출 요소에 의해 측정 가능한 전자 이동 속도에 측정 가능한 변화를 생성하는 임의의 전기 화학 센서를 더 포함한다. 일 양태로, 비-매개 전기 화학 검출을 채용하는 센서가 사용될 수 있는데, 직접 전자 이동 및 산화 환원 평형을 신호 생성 방법으로 사용하는 것을 포함한다. 이들 생화학 센서는 예컨대 산화 환원쌍에 속하는 종의 소비나 생성을 검출하는 센서를 포함한다. 다른 센서가 매개 전기 화학 분석, 즉 전자 이동과 산화 환원 평형 확립을 위해 산화 환원종 매개 물질을 사용하는 것을 채용할 수 있다. 매개 및 비-매개 센서의 예시는 Sander et al. 2015, A Review of Nonmediated and Mediated Approaches. Environ. Sci. Technol. 49:5862-5878에서 찾을 수 있다.
추가 센서 타입은 화학적으로 변형된 전극, 면역 센서, 올리고펩티드 기반 센서 및 세포 기관(예컨대, 엽록체, 미토콘드리아), 동물 및 식물 조직, 미생물, 효소, 조직 박편, 펩티드 및 항체를 이용하는 센서를 포함한다.
추가 센서 타입은 용액상 산화 환원 리포터, 예컨대 Katayama et al. 2000, The Design of Cyclic AMP-Recognizing Oligopeptides and Evaluation of Its Capability for Cyclic AMP Recognition Using an Electrochemical System. Anal Chem. 2000;72(19):4671-4에 서술된 바와 같은 사이클릭 AMP를 특히 인식하는 17mer 펩타이드와 결합된 페로시안산염/페리시안산염 산화 환원 리포터로부터의 전자 이동의 변화를 측정하는 센서를 포함한다.
사용될 수 있는 다른 센서 구조는 Le Floch, 2006, Label-Free Electrochemical Detection of Protein Based on a Ferrocene-Bearing Cationic Polythiophene and Aptamer. Anal Chem. 2006;78(13):4727-31. doi: 10.1021/ac0521955에 서술된 바와 같은 앱타머 시스템에서 페로센 치환기를 매개 물질로 가지는 양이온성 폴리티오펜을 사용하는 센서와 같은 중합체 센서이다.
사용될 수 있는 다른 센서 타입은 리간드, 예컨대 Prasad, 2004, The Role of Ligand Displacement in Sm(II)-HMPA-Based Reductions. J Am Chem Soc. 2004;126(22):6891-4에 서술된 바와 같은 사마륨(II) 요오드화물을 가지는 헥사메틸포스포아미드의 표적 결합-유도된 이동으로 인한 전자 이동 변화에 기반한 센서이다.
다른 예시적 센서 타입은 산화 환원 리포터 재배치 에너지의 변화, 예컨대 Plumb, 2003, Interaction of a Ferrocenoyl-Modified Peptide with Papain: Toward Protein- Sensitive Electrochemical Probes. Bioconj Chem. 2003;14(3):601-6. doi: 10.1021/bc0256446에 서술된 바와 같은 페로세닐 펩타이드 또는 예컨대 Feld 2012, Trinuclear Ruthenium Clusters as Bivalent Electrochemical Probes for Ligand-Receptor Binding Interactions. Langmuir. 2012;28(1):939-49. doi: 10.1021/la202882k에 서술된 바와 같은 3핵 루테늄 클러스터에 기반한다.
사용될 수 있는 다른 센서 타입은 스캐폴드-부착 산화 환원 리포터가 밑의 전극 표면에 접근하는 효율에 입체적으로 유도된 변화, 예컨대 Ge 2010, A Robust Electronic Switch Made of Immobilized Duplex/Quadruplex DNA. Angew Chem Int Ed. 2010;49(51):9965-7. doi: 10.1002/anie.201004946에 서술된 바와 같은 이중 DNA, 4중 DNA 및 DNA 나노스위치 또는 Cash 2009, An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein-Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices. J Am Chem Soc. 2009;131(20):6955-7. doi: 10.1021/ja9011595에 서술된 바와 같은 DNA-포함 저분자 인식 요소에 기반한다.
센서 클래스. 본 발명의 다양한 방법은 특정 센서 출력, 즉 전류 감쇠 속도론이 주어진 타입의 센서 중에서 안정적이라는 발견에 기반한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 클래스는 하나 이상의 공유 특성을 가지는 복수의 센서를 지칭한다. 센서 특성은 다양한 인자를 포함하는데, 전극의 구성과 재질, 분석되는 샘플의 타입, 인식 요소의 타입, 산화 환원 리포터(들)의 타입과 그 배치, 동작 전극 상의 인식 요소의 패킹 밀도, 전극 기능화 화학 및 센서 출력에 영향을 주는 다른 센서 파라미터를 포함한다. 다른 클래스 파라미터는 센서의 제조 로트일 수 있는데, 한 클래스의 센서는 동일한 배치로 생산된 것들이다.
일실시예에서, 한 클래스의 센서는 실질적으로 동일한 센서 아키텍처, 동일한 인식 요소와 산화 환원 리포터 요소, 인식 요소의 동작 전극에 대한 부착을 위한 동일한 화학, 동일한 제조 방법 및 유사한 인식 요소 패킹 밀도(예컨대, 제곱 센티미터당 프로브의 몰의 관점에서 배치 내에서 센서 간에 1-20%만큼 달라질 수 있는 패킹 밀도)를 가지는 복수의 센서를 포함한다.
표적종 . 본 발명의 방법에 채용되는 센서는 표적종의 검출에 관한 것이다. 표적종은 무기 또는 유기 분자, 예컨대 저분자 약물, 대사물, 호르몬, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 호르몬, 대사물, 성장 인자, 신경 전달 물질 또는 영양소를 포함할 수 있다. 표적은 오염원이나 오염 물질을 포함할 수 있다. 표적은 독소를 포함할 수 있다. 표적은 병원체-유도 또는 병원체-도출 인자 또는 바이러스나 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 표적종은 화학 요법 약물과 같은 중대한 부작용을 가지는 약물 또는 좁은 치료 지수를 가지는 약물을 포함하는데, 혈중 농도의 정확한 측정은 안전한 복용이나 최소 부작용을 보장하는데 중요하다.
동작 조건. 센서는 선택된 동작 조건 하에서 이용되는데, 검출 프로세스의 다양한 측면을 포함한다. 동작 조건은 센서의 동작과 출력에 영향을 주는 인자의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
제1 양태에서, 동작 조건은 분석되는 샘플 타입을 포함한다. 본 발명의 표적종은 샘플에서 평가된다. 샘플은 액체를 포함할 것이다. 샘플은 전혈, 혈청, 타액, 소변, 땀, 간질액, 척수액, 뇌액, 조직 삼출물, 불린 조직 샘플, 세포 용액, 세포내 구간, 물, 세탁수, 폐수, 지하수, 음식, 음료 또는 다른 생물학적 및 환경적 샘플을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 샘플은 대상, 예컨대 인간 환자 또는 수의학 대상이나 검사 동물과 같은 비인간 동물로부터 도출된다. 일실시예에서, 샘플은 흐르는 전혈, 즉 대상의 생물체(예컨대, 순환계에)에 주입된 센서를 포함하는 검출 시스템에 의해 샘플링되는 혈액을 포함한다. 대안적 실시예에서, 방법이 기체의 표적종을 측정하는데 사용되는데, 기체는 액체 샘플과 평형을 이룬다.
일실시예에서, 샘플은 측정 전에 처리된다. 처리의 예시는 여과, 희석, 버퍼링, 원심 분리 및 분석에 앞서 샘플에 대한 다른 물질의 적용이나 처리를 포함한다. 일부 실시예에서, 샘플은 측정을 수행하기 전에 처리되지 않는데, 예컨대 샘플은 희석되지 않거나, 여과되지 않거나, 원심 분리되지 않는다.
제2 양태에서, 동작 조건은 분석 평가 조건을 포함한다. 일반적 분석 평가 조건은 샘플 체적, 온도, pH 등과 같은 분석 평가를 위한 반응 조건을 지칭할 것이다.
제3 양태에서, 동작 조건은 센서 측정을 얻기 위해 사용되는 동작 파라미터에 의해 지칭될 수 있다. 예를 들어, 인가되는 전압 파형의 형상과 주파수, 전압 스텝값 및 샘플링 간격이 동작 파라미터를 이루는 변수 중 일부이다.
전류 감쇠에 의한 표적 농도 측정. 제1 양태에서, 본 발명은 전기 화학 센서의 사용에 의한 샘플의 표적종의 농도를 측정하는 일반적 방법을 포함한다. 방법은 다음 일반적 단계를 포함한다.
(A) 전류 감쇠의 선택된 측정과 표적 농도 간의 수학적 관계가 선택된 동작 조건 세트 하에서 동작하는 선택된 클래스의 전기 화학 센서에 대해 결정된다.
(B) 선택된 클래스의 전기 화학 센서가 알려지지 않은 표적 농도의 샘플에 선택된 동작 조건 하에서 배치되고, 전류 감쇠의 선택된 측정값이 획득된다.
(C) 단계 (A)에서 확립된 전류 감쇠와 농도 간의 관계를 적용하고, 단계 (B)에서 관측된 전류 감쇠값이 샘플의 표적종의 농도를 결정하는데 사용된다.
예를 들어, 일실시예에서, 본 발명은 전기 화학 센서의 사용에 의하여 샘플의 표적종의 농도를 측정하는 방법을 포함하는데, 방법은:
샘플에 노출되도록 전기 화학 센서를 배치하는 단계;
전기 화학 센서에 하나 이상의 여기 펄스를 인가하는 단계;
하나 이상의 여기 펄스 각각에 따르는 시간-분해된 유도 전류 데이터를 획득하는 단계;
획득된 시간-분해된 유도 전류 데이터에 의하여, 전류 감쇠의 선택된 측정의 값을 계산하는 단계; 및
전류 감쇠의 측정의 계산된 값에 의하여, 전류 감쇠의 선택된 측정과 샘플의 표적종의 농도 간의 수학적 관계의 적용에 의하여 표적종의 농도를 계산하는 단계를 포함하고,
전기 화학 센서의 출력은 샘플의 표적종의 농도에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 유도 전류이고,
시간-의존적인 유도 전류 출력은 각 펄스에 의해 생성된다.
전류 감쇠 측정. 본 출원의 발명자는 여기 자극에 응답하여 생성되는 과도 전류의 감쇠 속도가 표적종의 농도와 관련되고 동일 클래스의 센서에 걸쳐 안정적이라고 유리하게 결정하였다. 따라서 본 발명의 방법은 전류 감쇠의 측정, 전류 감쇠 속도와 표적 농도 간의 관계 및 유사한 센서 간 및 시간에 따른 이 관계의 현저한 안정성에 의존한다. 크로노암페로메트리 감쇠의 수명은 결합 및 비결합 인식 요소의 절대 수가 아닌 결합 및 비결합 인식 요소(예컨대, 앱타머)의 상대적 인구수에만 의존하므로, 동일 클래스의 개별 센서 간에 현저히 달라질 수 있는 인자에 독립적인 표적 농도를 측정하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 각 인식 요소가 하나 이상의 산화 환원 리포터로 기능화되는, 복수의 인식 요소로 기능화되는 전극 기판을 포함하는 전기 화학 센서의 경우, 산화 환원 리포터의 전기적 여기는 산화 환원 리포터와 전극 기판 간의(또는 시스템의 구성에 따라 전극 기판과 산화 환원 리포터 간의) 전류의 일시적 흐름을 유도할 것이다. E-AB 센서의 기판과 같은 동작 전극의 전압을 스테핑하면, 동작 전극은 더 강한 환원제(더 음의 포텐셜로 스테핑하는 경우) 또는 더 강한 산화제(더 양의 포텐셜로 스테핑하는 경우)가 된다. 적절한 범위 내에서(예컨대, 산화 환원 리포터의 산화 환원 포텐셜 근처 또는 이상), 이 전압 스텝은 센서의 인식 요소의 산화 환원 리포터와 전극 기판 간의 유도 전류 흐름을 유도할 것이다. 전류가 흐름에 따라, 여기에 의해 동원된 전자 풀은 격감하고, 전류는 센서의 인식 요소의 결합 상태에 따른 속도와 크기로 지수적으로(또는 다중 지수적으로) 감쇠할 것인데, 표적 결합은, 예컨대 산화 환원 리포터의 동작 전극과의 거리를 변경함으로써 더 빠르거나 느린 전류 이동을 유도한다. 따라서, 샘플의 표적종의 농도에 비례하는, 표적에 결합되지 않은 인식 요소에 대한 표적 결합된 인식 요소의 비율은, 센서에 대해 관측된 전류 감쇠 속도와 크기를 전체로서 결정할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전류"는 샘플에 배치된 센서에 의해 측정되는 전자의 흐름을 지칭할 것이다. 예를 들어, 전류는 산화 환원 리포터에서 전극으로의 전자의 흐름을 포함할 수 있거나 전극에서 산화 환원 리포터로의 전자의 흐름을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전류 감쇠"는 센서나 샘플에 대한 여기 자극의 인가에 응답하여 시간이 흐름에 따라 센서에 의해 측정되는 과도 전류의 행동을 의미한다.
전류 감쇠의 측정은 공지된 바와 같은 크로노암페로메트리 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 감쇠 파라미터는 센서 및/또는 샘플에 여기를 인가하고 여기 이후 기간에 걸쳐 전류의 응답을 측정함으로써 측정될 수 있다. 따라서 감쇠 파라미터의 측정은 (1) 소정의 전압, 주파수 및 파형의 여기 펄스를 전달하고, (2) 과도 전류의 기간에 대응하는 시간 규모에 걸친 전류 응답을 측정하는 컴포넌트와 관련된 센서나 샘플 환경을 요구한다.
여기 펄스는 과도 전류를 유도하는 임의의 종류의 자극, 예컨대 산화 환원 리포터가 실질적으로(예컨대, 완전히) 산화 또는 환원될 값으로의 센서 전극의 포텐셜의 스테핑일 수 있다. 적절한 여기 파형이 공지된 대로 선택될 수 있다. 예를 들어, 1 내지 10,000Hz의 반복 속도, 예컨대 5Hz, 10Hz, 20Hz, 50Hz, 100Hz 및 1 및 10,000Hz 사이의 중간값으로 +/-0.1V 내지 0.5V 범위의 전압 스텝이 이용될 수 있다.
수 마이크로초 내지 수 밀리초의 시간 규모로 시간-분해된 전류 측정의 획득이 일반적으로 요구될 것이다. 일반적 과도 전류는 10 내지 100ms의 범위의 기간을 가지고, 더 짧은 시간 간격, 예컨대 1μs, 2μs, 3μs, 5μs 또는 10μs마다 샘플링됨으로써 분해될 수 있다.
시간-분해된 전류 데이터가 획득되면, 이 데이터는 전류 감쇠의 속도론을 서술하는 임의의 수의 수학적 파라미터를 도출하는데 분석될 수 있다. 감쇠의 선택된 측정은 샘플의 표적종의 농도에 농도-의존적인 방식으로 달라지는 과도 전류의 임의의 파라미터일 수 있다. 전류 감쇠의 선택된 측정은 감쇠 속도론의 임의의 측정, 예컨대 속도 상수, 수명, 반감기 또는 전류 감쇠의 임의의 다른 수량화로 평가될 수 있다. 예를 들어, 일실시예에서, 후술되는 바와 같이, 감쇠의 측정은 전체 감쇠 곡선을 함수에 맞추고 그 감쇠 곡선에 대해 수명(역 속도 상수)나 반감기를 채용함으로써 도출된다. 다른 실시예에서, 후술되는 바와 같이, 감쇠는 시간-분해된 데이터를 둘 이상의 지수의 합을 도출하는 함수에 맞추고 지수 컴포넌트의 상대적 크기 또는 유사한 측정을 채용함으로써 도출된다. .
선택된 수학적 분석이 획득된 시간-분해된 전류 데이터에 적용되어 감쇠의 선택된 측정을 도출한다. 임의의 회귀 분석이 전류 감쇠의 선택된 측정을 도출하는데 적용될 수 있어, 일치하는 결합 및 비결합 인식 요소의 전자 이동을 분석한다. 일실시예에서, 전류 감쇠의 측정은 센서 전류 트레이스에 단일 지수 맞춤을 사용하여 도출된다. 일실시예에서, 전류 감쇠의 측정은 다중 지수 맞춤을 사용하여 도출된다. 일실시예에서, 전류 감쇠의 측정은 이중 지수 맞춤을 사용하여 도출된다. 일실시예에서, 전류 감쇠의 측정은 삼중 지수 맞춤을 사용하여 도출된다. 전류 감쇠값은 단일 데이터 포인트에 의해 또는 다수의 데이터 포인트의 평균에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 샘플링된 감쇠값은 1 내지 100 사이클 사이의 범위, 예컨대 5, 10, 20, 50, 75 또는 100 사이클이나 그 중간값의 선택된 수의 여기-감쇠 사이클에 걸쳐 관찰된 평균값을 포함할 수 있다.
일부 센서 시스템에서, 인식 요소의 결합 및 비결합 상태 간의 속도론의 상호 변환은 센서에 의해 측정되는 전자 이동 이벤트보다 빠르다. 따라서, 관찰된 과도 전류는 결합 및 비결합 상태의 수-가중된 평균을 반영한다. 이것은 예컨대 도 4a에서와 같이 단일 지수 맞춤을 사용하여 전류 감쇠 수명을 근사함으로써 분석될 수 있다. 이 "최적 맞춤" 단일 지수의 수명은 표적의 농도에 단조적으로 관련된다. 다시 말해, 두 지수적 프로세스(비결합 감쇠 및 결합 감쇠)의 합계로 가장 잘 서술되는 전류 감쇠 트레이스는 단일 지수 곡선으로 맞춤될 수 있고, 그 파라미터(예컨대, 감쇠 상수, 반감기 등)는 표적 농도 결정 수단을 제공한다.
일실시예에서, 감쇠의 선택된 측정은 시간-분해된 전류 데이터를 두 지수의 합계를 도출하는 함수에 맞추고 지수 컴포넌트의 상대적 크기를 표적 결합의 측정으로 사용함으로써 도출된다. 예를 들어, 관찰된 전류 감쇠가 결합 및 비결합 감쇠의 조합이므로, 이중 지수 맞춤이 표적-결합 감쇠를 나타내는 더 빠른 단계와 비결합 감쇠를 나타내는 더 느린 단계로 감쇠 곡선을 서술하는데 사용될 수 있다. 감쇠의 상대적 크기, 즉 두 단계 모두의 총 크기에 대한 크기 또는 두 단계의 크기의 비율은 표적-결합된 인식 요소의 비율의 측정으로 이용될 수 있다. 대안적 구현에서, 감쇠는 셋 이상의 지수, 예컨대 삼중 지수 맞춤 등에 의해 서술될 수 있다.
예를 들어, 지수 맞춤을 이용하는 방법의 예시는 Kamman et al., C, Multi-exponential relaxation analysis with MR imaging and NMR spectroscopy using fat-water systems, In Magnetic Resonance Imaging, Volume 5, Issue 5, 1987, Pages 381-392에 서술된다.
예를 들어, 일 구현에서, 센서로부터의 크로노암페로메트리 전류 감쇠는 로그-i(전류)-로그-t(시간) 플롯으로 플로팅되고, 비선형 회귀 분석이 다음 식을 사용하여 수행된다.
단일 지수 시스템의 경우, 식 1:
(수학식 1)
Figure pct00001
이중 지수 시스템의 경우, 식 2:
(수학식 2)
Figure pct00002
삼중 지수 시스템의 경우, 식 3:
(수학식 3)
Figure pct00003
이 때, 식 1 내지 3에서, t는 여기 이후 시간, τ는 시간 상수, i는 전류, C는 존재한다면, 일정 배후 전류이다.
상대적 크기는 모든 크기의 합계 분의 한 선택된 크기의 비율로 계산된다. 예를 들어, 이중 지수 맞춤의 경우:
(수학식 4) 상대적 크기 1 =
Figure pct00004
(수학식 5) 상대적 크기 2 =
Figure pct00005
도 3은 전기 화학 센서에 대한 전류 감쇠 역학의 도시를 제공한다. 이 예시에서, 펄스 전압이 메틸렌 블루 산화 환원 리포터를 포함하는 E-AB 센서에 인가되고 전류가 펄스 이후에 측정된다. 두 곡선이 제시되는데, 첫번째 것은 표적을 포함하지 않는 샘플에 대한 전류 역학을 도시하고, 두번째 것은 표적의 포화 농도를 포함하는 샘플(즉, 센서의 모든 인식 요소 앱타머가 표적에 의해 결합된다)에 대한 전류 역학을 도시한다. 충분한 음의 포텐셜로 전압 스텝을 인가하면, 모든 메틸렌 블루 리포터의 완전한 환원이 달성된다. 이들 전자의 흐름이 펄스 종료 이후 시간에 따라 측정된다. 제1 단계에서, 수용액에 펄스 인가 후 일반적으로 약 0.1ms, 감쇠가 빠르다. 이 단계는 이 포텐셜 편향에서 전극 표면 상에 형성된 전기적 이중층의 충전에 기여한다(즉, 수 마이크로초의 시간 규모를 가지는 수성 이온의 이동). 이중층 충전 감쇠는 샘플의 표적 농도에 매우 둔감하고 일반적으로 표적 농도 예측에 유용하지 않다. 이 단계 후, 제2 단계가 관측되는데, 감쇠 속도론은 표적 결합에 강하게 관련되는데, 리포터의 유도 환원, 예컨대 메틸렌 블루의 로이코 메틸렌 블루로의 환원에 대응한다. 도 2에서, 표적-포화 인식 요소의 경우, 전류의 빠른 지수적 감쇠가 100±30μs의 수명으로 관측된다. 표적-프리 샘플의 인식 요소의 경우, 더 느린 감쇠가 6.5±0.5ms의 수명으로 관측된다. 수명의 ~5배 감소(포화된 샘플을 표적이 없는 샘플에 비교할 때)는 산화 환원 리포터의 전극 표면까지의 거리의 변화에 대응하고 표적-프리 앱타머보다 더 빠르게 전자를 운반하는 표적-결합된 앱타머의 수를 반영한다.
클래스 캘리브레이션 . 일 양태에서, 본 발명의 범위는 한 클래스의 센서를 클래스 중 센서의 대표 서브셋에 의해 캘리브레이션하는 방법에 관련된다. 캘리브레이션 단계의 목적은 클래스 내 모든 센서에 대한 센서 출력의 해석을 위한 표준 곡선을 생성하는 것이다. 따라서, 주어진 클래스의 센서의 캘리브레이션은 동일 설계의 대표 센서를 사용하여 수행되어, 센서가 배치될 것과 유사한 및/또는 대표하는 동작 조건 하에서 대표 샘플을 평가 분석한다. 이러한 캘리브레이션이 대표 서브셋을 사용하여 수행되면, 클래스의 다른 센서가 유사한 동작 조건 한에서 표적종의 캘리브레이션-프리 측정을 수행하는데 사용될 수 있다.
클래스 캘리브레이션은 선택된 동작 조건 하에서 대표 샘플에서 선택된 센서 타입에 대해 "감쇠-농도 관계"를 확립함으로써 달성된다. 감쇠-농도 관계는 샘플의 표적 농도와 동작 전극에서 전압 스텝에서 기인한 관측된 전류 감쇠값 간의 예측적 관계이다. 감쇠-농도 관계는 임의의 적절한 회귀 분석을 사용하여 계산될 수 있다. 신호 출력이 결합 및 비결합 감쇠의 조합된 합계이므로, 두 지수적 감쇠 곡선의 합계에 기반하여 단조 함수를 추정하는 모델이 계산 단계에 잘 맞추어질 것이다. 예를 들어, 전류 수명이 전류 감쇠의 선택된 측정이라면, 전류 수명과 농도 간의 관계가 결정된다. 다른 실시예에서, 캘리브레이션 데이터는 다중 지수 프로세스를 추출하기 위해 맞춤되고, 각 지수 단계에 대해 계산된 상대적 크기가 감쇠의 측정으로 쓰여서, 상대적 크기와 농도 간의 관계가 확립된다.
단계 (A)에서 관계를 확립하기 위해 사용되는 캘리브레이션 측정은 다양하고 알려진 표적 농도의 표준 세트를 사용하여 수행된다. 측정은 센서의 다이나믹 레인지, 즉 0 표적 내지 포화 표적 레벨 내의 표적 농도의 범위에 걸쳐, 예컨대 뾰족한 샘플 사용에 의해 이루어져야 한다. 임의의 수의 데이터 포인트가 생성될 수 있는데, 예컨대, 예컨대 2 내지 1,000개의 데이터 포인트가 샘플링되어 캘리브레이션 데이터를 생성할 수 있다. 예를 들어, 25 내지 100, 예컨대 50 내지 75개의 데이터 포인트가 캘리브레이션에서 사용될 수 있다.
클래스 캘리브레이션 프로세스는 센서의 대표 세트를 채용할 것이다. 대표 세트는 클래스의 다른 센서를 위해 정확하게 예측적인 캘리브레이션 곡선을 제공하기에 충분한 수의 센서를 포함할 것이다. 대표 세트의 센서의 수는 예컨대 서브-샘플 값에 기반한 샘플 수단을 결정하기 위해 공지된 방법에 의해 확립될 수 있다. 대표 세트는 예컨대 1, 3, 5, 10, 20, 50, 100 이상 및 그 중간값의 센서를 포함할 수 있다.
도 3b는 본 발명의 캘리브레이션 곡선을 도시한다. 5개의 E-AB 아미노글리코사이드-검출 센서에 대해, 현재 수명은 전혈 및 버퍼 모두에서 농도 범위에 걸쳐 평가되었다. "최적 맞춤" 단일 지수는 랭뮤어 등온선에 대한 농도 대 수명의 비선형 회귀에 의해 표적의 농도에 단조적으로 관련되었다. 이들 결과는 센서 출력의 상이한 동작 조건의 효과를 도시하는데, 혈액 및 버퍼 캘리브레이션은 상이하다.
유사한 동작 조건 하에서 동작하는 주어진 클래스의 센서는 그 클래스의 모든 센서에 대해 생성된 표준 곡선을 사용하여 표적의 예측을 가능하게 하기에 충분히 유사한 감쇠 출력을 가질 것이다. 동일 클래스의 센서는 주어진 표적 농도를 포함하는 유사한 샘플에 노출될 때, 제조의 엄격함, 시스템 고유의 신호 대 잡음비 및 다른 변수에 따라 20% 미만, 15% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만으로 분기하는 선택된 전류 감쇠 측정의 값을 가질 감쇠 출력을 가질 수 있다.
일실시예에서, 본 발명의 범위는 클래스-캘리브레이션된 센서를 포함한다. 클래스-캘리브레이션된 센서는 선택된 클래스, 예컨대 선택된 인식 요소, 선택된 산화 환원 리포터, 선택된 전극 부착 화학, 선택된 전극 구성 및 센서 성능을 정의하는 다른 파라미터를 가지는 센서를 의미하는데, 전류 감쇠의 선택된 측정 및 선택된 표적의 농도 간의 감쇠-농도 관계가 클래스의 센서에 대해 알려져 있다. 일실시예에서, 클래스 캘리브레이션된 센서는 앱타머 기반 전기 화학 센서이다.
캘리브레이션 - 프리 측정. 일 양태에서, 본 발명의 범위는 표적종 농도의 캘리브레이션-프리 측정 방법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 캘리브레이션-프리 동작은 센서 출력(예컨대, 전류 감쇠 수명이나 상대적 크기)가 선택된 클래스에 특정된 캘리브레이션 곡선의 사용에 의해 직접 표적 농도값으로 변환되는 선택된 클래스의 전기 화학 센서의 동작을 의미한다. 캘리브레이션-프리 동작에서, 센서는 측정 전, 동안 또는 이후에 반드시 캘리브레이션될 필요가 없다.
드리프트 - 프리 동작. 일 양태에서, 본 발명의 범위는 전기 화학 센서의 드리프트-프리 동작을 포함하는데, 센서는 확장된 기간, 예컨대 수 시간, 수일, 수개월 이상에 대해 동작한다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 흐르는 전혈에 직접 배치되는 E-AB 센서는 센서 출력이 사각파 볼타메트리에 의한 크기로 측정될 때 상당히 드리프트하는 출력을 가질 것이다. 이 심각한 기저 드리프트는 도 5b에서와 같이 전류 수명이 대신 측정될 때 제거되는데, 전류 수명은 8시간의 기간 동안 안정적인 반면 절대 센서 출력은 시험 기간 동안 상당히 드리프트한다.
서브초 시간 해상도. 본 발명의 방법은 체내에서 직접 분자의 캘리브레이션-프리, 서브-초-분해된 측정을 가능하게 한다. 예시에서와 같이, 혈액이나 다른 신체 부위의 표적 농도의 실시간 해상도가 본 발명의 방법에 의하여, 예컨대 100 내지 500ms의 시간 규모로 가능하게 된다. 이 접근법의 전례 없는 시간 해상도는 약물 흡수와 분포, 호르몬 및 신경 전달 물질 방출 및 짧은 시간 규모로 일어나는 다른 생리학적 사건과 같은 생리학적 사건 동안 빠르게 변동하는 표적 역학의 측정을 가능하게 한다. 크로노암페로메트리에 의해 가능해진 미세한 시간 규모 해상도는 본 방법의 발명을 특히 약동학적 분석에 잘 맞게 한다. 일실시예에서, 본 발명은 약물, 대사 물질, 배설물 또는 약물 대사에 수반되는 다른 종의 캘리브레이션-프리 측정에 의한 약동학적 파라미터의 실시간 계산을 포함한다.
센서 배치 및 동작. 유사한 동작 조건 하에서 동작하는 한 클래스의 센서에 걸친 전자 이동 속도론의 고유 안정성은 다양한 상황에서 전기 화학 센서의 사용을 가능하게 한다. 다양한 구현에서, 본 발명의 방법은 캘리브레이션이 불가능하거나, 부담이 되거나, 비싼 상황에 배치될 때 센서의 정확한 측정을 가능하게 한다. 본 발명의 캘리브레이션-프리 및 드리프트-프리 방법은 특히 체내 측정에 적절하다. 예를 들어, 검출 시스템의 검출 요소나 하우징은 생명체의 몸 내에 삽입, 주입 또는 다른 방식으로 배치될 수 있다. 검출 시스템의 센서 요소는 순환계 내에, 피하에, 복강 내로, 장기 내에 또는 다른 신체 부위 내로 주입될 수 있는데, 검출 요소는 체내 유체, 예컨대 간질액, 혈액, 예컨대 흐르는 전혈에 노출된다. 본 발명의 주입되는 검출 시스템은 신체 외부의 컴포넌트와 연결되어(예컨대, 리드, 선 또는 무선 통신 수단에 의해) 주입되는 검출 요소를 포함할 수 있는데, 외부 컴포넌트는 펄스 생성, 데이터 획득 또는 처리를 수행한다. 대안적으로, 검출 요소에 대한 하나 이상의 보조 컴포넌트, 또는 심지어 본 발명의 전체 검출 시스템이 신체에 주입되어, 데이터 수집을 위해 외부 장치와 통신할 수 있다(예컨대, 리드, 선 또는 무선 통신 장치에 의해).
일실시예에서, 본 발명의 방법은 공지된 피드백 제어 복용 시스템에서 수행되는데, 치료 지수나 안전성 지표 내로 혈중 농도를 유지하기 위해 약물이 관리된다. 예를 들어, 이러한 방법 및 시스템에서, 본 발명의 방법은 표적종의 농도를 측정하기 위해 대상 내에 주입되는 전기 화학 검출 요소를 사용하여 적용되는데, 표적종은 약물, 약물의 대사 물질 또는 약물이 관리되어야 함을 표시하는 생물지표이다. 표적종의 검출된 레벨이 대상이 약물이나 다른 물질의 관리의 필요가 있음을 나타낼 때, 주입된 펌프나 다른 물질 전달 수단은 약물이나 물질의 농도를 소정의 범위로 유지하기 위해 약물이나 물질이 정량으로 계량되도록 관리한다.
다른 문맥에서, 본 발명의 센서는 환경적 또는 산업 현장, 예컨대 강, 바다, 정수 처리장, 산업 시설, 식품 저리 시설 등의 장기 및/또는 계속적인 모니터링을 위해 이용된다.
본 발명의 센서는 체외 진단 응용에도 사용될 수 있다. 일실시예에서, 본 발명의 방법은 생명체에서 샘플을 빼내는 단계 및 캘리브레이션-프리 측정에 의해 샘플 내의 표적종의 농도를 측정하는 단계를 포함한다. 일실시예에서, 본 발명의 센서는 현장 검사 시스템에 채용된다. 예를 들어, 일실시예에서, 샘플은 혈액 샘플, 예컨대 자기 채취 핀-프릭 또는 핑거-프릭 혈액 샘플 또는 소변, 땀이나 타액 샘플이다. 이러한 실시예에서, 전기 화학 센서는 웰, 슬라이드, 랩-온-칩, 미세 유체 챔버 또는 다른 장치와 같은 하우징에 배치될 수 있다.
캘리브레이션이 있는 크로노암페로메트리 . 본 발명의 범위는 캘리브레이션-프리 크로노암페로메트리로 제한되지 않는다. 일 구현에서, 크로노암페로메트리를 수행하는 전기 화학 센서로부터 획득된 농도 측정의 정확도는 하나 이상의 캘리브레이션 단계의 수행에 의해 강화되는데, 즉 관측 및 예상된 농도값 간의 편차를 체크하고 이러한 임의의 편차를 보정하기 위하여 배치된 센서가 알려진 표적 농도의 하나 이상의 샘플에 노출된다. 이 실시예는 여전히 이 클래스의 센서를 조사하기 위해 확립된 전기 화학 방법에 비해 향상된 시간 해상도 크로노암페로메트리를 제공한다.
다른 실시예에서, 배치된 센서의 감쇠-농도 관계가 캘리브레이션에 의해 확립된다. 배치된 센서는 현재 동작 조건 하에서 센서의 감쇠-농도 관계를 확립하기 위하여 알려진 표적 농도의 하나 이상의 샘플에 노출될 수 있다.
컴퓨터 프로세스 및 프로그램. 본 발명의 범위는 소프트웨어, 컴퓨터 프로그램 및 프로그래밍된 장치를 포함하는 다양한 실시예를 포함한다. 일실시예에서, 본 발명의 범위는 컴퓨터가 일련의 동작을 실행하도록 하는 데이터 및/또는 인코딩 프로그램을 저장한 비일시적 컴퓨터 판독가능한 기록 매체를 포함한다. 컴퓨터는 임의의 일반 목적 컴퓨터, 프로세서, 임베딩된 프로세서, 모바일 장치 또는 다른 컴퓨팅 장치를 포함할 수 있다. 컴퓨터는 키보드, 마우스, 터치스크린 및 다른 입력과 같은 입력 장치를 포함하는 하드웨어 요소를 포함할 수 있다. 컴퓨터는 그래픽 사용자 인터페이스, 디스플레이 및 저장 장치를 포함하여 데이터의 출력, 저장 및 디스플레이를 위한 하드웨어 요소를 포함할 수 있다.
일실시예에서, 본 발명은 컴퓨터가 일련의 동작을 실행하도록 하는 데이터 및/또는 인코딩 프로그램을 저장한 비일시적 컴퓨터 판독가능한 기록 매체를 포함하는데, 데이터 및/또는 일련의 동작은 전기 화학 검출 시스템의 동작이 본 발명의 방법에 영양을 미치도록 한다. 다양한 실시예에서, 비일시적 컴퓨터 판독가능한 기록 매체는: 포텐시오스탯이나 동등한 장치가 배치된 전기 화학 센서에 일련의 스테핑된 전압 펄스를 전달하도록 제어하기; 데이터 수집 장치가 전압 펄스 전달 이후 센서 전류 출력을 기록하도록 제어하기; 프로세서가 센서 출력 데이터로부터 전류 감쇠의 하나 이상의 선택된 측정을 도출하는 계산을 수행하도록 제어하기; 표적 농도에 대한 전류 감쇠의 선택된 측정에 관련된 캘리브레이션 곡선을 저장하기; 프로세서가 센서 출력 및 저장된 캘리브레이션 곡선에 기반하여 표적 농도를 계산하도록 제어하기; 본 발명의 방법의 수행을 위한 명령어를 저장하기; 및 본 발명의 다른 동작과 같은 동작에 영향을 줄 수 있다.
일실시예에서, 본 발명의 범위는 본 발명의 동작을 수행하도록 프로그래밍된 장치, 예컨대 상술한 비일시적 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하거나 연결된(예컨대, 네트워크 연결) 장치를 포함한다.
키트 및 시스템. 본 발명의 범위는 본 발명의 분석물 농도 측정을 수행하도록 구성된 컴포넌트의 콜렉션으로 확장된다. 다양한 실시예에서, 본 발명의 범위는 본 발명의 방법의 수행을 위한 둘 이상의 아이템을 포함하는 콜렉션을 포함하는데, 둘 이상의 컴포넌트는: 선택된 동작 조건하에서 센서에 의해 획득된 감쇠 측정 및 표적 농도 간의 관계가 알려진 한 클래스의 전기 화학 센서; 선택된 샘플 타입에 센서를 배치하기 위한 하우징; 과도 전류를 생성하기 위해 전기 신호를 전달할 수 있는 포텐시오스탯 및 컨트롤러; 센서 전류 데이터로부터 전류 감쇠의 선택된 측정을 계산하기 위한 데이터 획득 및 컴퓨터 판독가능한 저장 매체 및/또는 프로세싱 수단; 전류 감쇠 데이터로부터 표적 농도를 계산하기 위한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체 및/또는 프로세싱 수단; 및 본 발명의 방법을 수행하기 위한 명령어로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
예시적인 실시예 .
일실시예에서, 본 발명은 전기 화학 센서의 사용에 의하여 샘플의 표적종의 농도를 측정하는 방법인데, 방법은:
샘플에 노출되도록 전기 화학 센서를 배치하는 단계;
전기 화학 센서에 하나 이상의 여기 펄스를 인가하는 단계;
하나 이상의 여기 펄스 각각에 따르는 시간-분해된 유도 전류 데이터를 획득하는 단계;
획득된 시간-분해된 유도 전류 데이터에 의하여, 전류 감쇠의 선택된 측정의 값을 계산하는 단계; 및
전류 감쇠의 측정의 계산된 값에 의하여, 전류 감쇠의 선택된 측정과 샘플의 표적종의 농도 간의 수학적 관계의 적용에 의하여 표적종의 농도를 계산하는 단계를 포함하고,
전기 화학 센서의 출력은 샘플의 표적종의 농도에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 유도 전류이고,
유도 전류 출력은 각 펄스에 의해 생성된다.
일실시예에서, 전기 화학 센서는 표적 결합시 배위 변화를 겪는 복수의 인식 요소로 기능화되는 전극을 포함하고, 각 인식 요소는 하나 이상의 산화 환원 리포터로 기능화된다. 일실시예에서, 인식 요소는 앱타머를 포함한다.
일실시예에서, 샘플은: 전혈, 혈청, 타액, 소변, 땀, 간질액, 척수액, 뇌액, 조직 삼출물, 불린 조직 샘플, 세포 용액, 세포내 구간, 물, 세척액, 폐수, 지하수, 식품 및 음료로 이루어지는 그룹에서 선택된다. 일실시예에서, 샘플은 측정 전에 처리되지 않는다.
일실시예에서, 표적종은: 저분자 약물, 대사 물질, 호르몬, 펩티드, 단백질. 탄수화물, 핵산, 지질, 호르몬, 대사 물질, 성장 인자, 신경 전달 물질, 영양소, 오염 물질, 병원체-유도된 또는 병원체-도출된 인자, 병원체 또는 세포로 이루어지는 그룹에서 선택된다.
일실시예에서, 표적 감쇠의 선택된 측정은 감쇠 상수, 평균 수명, 반감기 및 상대적 크기로부터 선택된다. 일실시예에서, 전류 감쇠의 선택된 측정은 시간-분해된 전류 데이터의 지수 맞춤으로부터 도출된다. 일실시예에서, 전류 감쇠의 선택된 측정은 시간-분해된 전류 데이터의 단일 지수 맞춤으로부터 도출된다. 일실시예에서, 전류 감쇠의 선택된 측정은 시간-분해된 전류 데이터의 이중 지수 맞춤으로부터 도출된다.
일실시예에서, 전류 감쇠의 선택된 측정과 표적 농도 간의 수학적 관계는 배치된 전기 화학 센서와 동일한 클래스의 센서에 대해 도출된다.
일실시예에서, 캘리브레이션 단계가 측정 이전이나 이후에 수행되지 않는다. 일실시예에서, 반복된 측정이 확장된 기간에 걸쳐 획득된다.
일실시예에서, 천기 화학 센서는 체내에 배치된다. 일실시예에서, 전기 화학 센서는 인간 대상에 배치된다. 일실시예에서, 전기 화학 센서는 비인간 동물에 배치된다. 일실시예에서, 전기 화학 센서는 체외에 배치된다. 일실시예에서, 전기 화학 센서는 현장 검사 시스템에 배치된다.
일실시예에서, 전기 화학 센서는 샘플에 배치될 때, 센서의 출력이 샘플의 표적종의 농도에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 유도 전류이도록 구성되고; 유도 전류 감쇠의 측정 및 표적 농도에 관한 안정적인 수학적 관계가 전기 화학 센서가 속하는 클래스의 센서에 대해 알려져 있다.
일실시예에서, 전기 화학 센서는 표적 결합시 배위 변화를 겪는 복수의 인식 요소로 기능화되는 전극을 포함하고, 각 인식 요소는 하나 이상의 산화 환원 리포터로 기능화된다. 일실시예에서, 클래스의 센서는 동일한 인식 요소 타입, 동일한 산화 환원 리포터 타입 및 전극으로의 결합을 위한 동일한 부착 화학을 포함한다. 일실시예에서, 인식 요소는 앱타머를 포함한다.
일실시예에서, 본 발명은 샘플에 배치될 때, 센서의 출력이 샘플의 표적종의 농도에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 유도 전류이도록 구성되는 전기 화학 센서;
전기 화학 센서로의 여기 펄스의 인가 및 각 펄스의 인가에 따르는 전기 화학 센서로부터의 시간-분해된 유도 전류 감쇠의 획득을 위한 장치를 포함하는 하드웨어 컴포넌트; 및
전기 화학 센서 및 하드웨어 컴포넌트에 의한 본 명세서에 서술된 방법의 수행을 가능하게 하는 데이터 및 컴퓨터 프로그램을 저장한 비일시적 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하는 전기 화학 검출 시스템이다. 시스템의 일실시예에서, 전기 화학 센서는 표적 결합시 배위 변화를 겪는 복수의 인식 요소로 기능화되는 전극을 포함하고, 각 인식 요소는 하나 이상의 산화 환원 리포터로 기능화된다. 일실시예에서, 인식 요소는 앱타머를 포함한다. 일실시예에서, 전기 화학 검출 시스템은 본 명세서에 개시된 방법에 의하여 샘플의 표적종의 농도를 도출하기 위하여 크로노암페로메트리 전류 감쇠 분석을 수행하도록 프로그래밍된다. 일실시예에서, 검출 시스템의 센서 요소는 동물의 신체에 주입되고 체외 하드웨어 컴포넌트와 무선 또는 유선 통신한다. 일실시예에서, 전압 펄스의 전달, 시간-분해된 전류 데이터의 수집 및 표적 농도의 계산을 위한 하나 이상의 보조 하드웨어 요소가 센서와 함께 주입된다. 일실시예에서, 전압 펄스의 전달을 위한 요소와 시간 분해된 전류 데이터의 수집과 분석을 위한 요소를 포함한 센서와 보조 요소에 추가로, 전원(예컨대, 배터리)가 동물의 신체에 주입된다. 일실시예에서, 시스템은 본 발명의 방법에 의해 검출되는 표적종의 임계 레벨에 응답하여 동물에의 의약 물질을 관리하기 위한 약물 전달 수단, 또는 의약 관리가 필요하다는 경고를 발행하기 위한 수단을 더 포함한다. 일실시예에서, 약물 전달 수단은 펌프이다. 일실시예에서, 의약 관리가 필요하다는 알람을 발행하기 위한 수단은 주입된 센서 시스템 컴포넌트와 유선 또는 무선 연결되는 웨어러블 또는 휴대 장치를 포함한다.
일실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에 의하여 크로노암페로메트리 전기 화학 검출 시스템이 샘플의 표적종의 농도를 도출하기 위하여 크로노암페로메트리 전류 감쇠 분석을 수행하기 위하여 구동하기 위한 컴퓨터 판독가능한 명령어를 가지는 비일시적 저장 매체를 포함한다.
예시. 예시 1. 크로노암페로메트리로 조사되는 E-AB 센서를 사용하여 생체에서의 직접 특정 분자의 실시간, 서브초-분해된 측정.
전기 화학 앱타머-기반 센서는 특정 분자 표적 측정에 화학적 반응성과 상관없이 계속적 실시간 측정에 모듈식 접근법을 제공한다. 산화 환원 활성 "리포터"로 변형되고 조사 전극에 부착된 앱타머 "프로브"로 구성된 플랫폼(도 1a)은 리포터로부터의 전자 이동을 달라지게 하는 결합-유도된 배좌 변경을 통한 신호를 보내, 결국 쉽게 측정 가능한 전기 화학 출력으로 이어진다(도 1b). 신호 메커니즘이 자연적으로 일어나는 신체의 수용체에 채용되는 배좌-연결된 신호 전달을 흉내내기 때문에, E-AB 센서는 특히 비특정 결합에 둔감하고 흐르는, 희석되지 않은 혈청에서 직접 쉽게 계속적, 확장된 측정을 지원한다. 그리고 E-AB 센서가 희석되지 않은 전혈에서 시도될 때 종종 현저한 드리프트를 보이는 반면, 본 출원의 발명자는 최근에, 보호막, 향상된 표면 부동화 화학 및/또는 활성 드리프트 보정 메커니즘과 조합될 때, E-AB 센서는 전혈에서 및 심지어 수시간 동안 생체에서 인 시추로 특정 분자의 계속적 실시간 측정을 지원한다.
E-AB 신호는 앱타머-결합 산화 환원 리포터의 전자 이동 속도론의 결합-유도된 변경에 의해 구동된다. 이전에 순환 전류, 교류 또는 사각파 볼타메트리가 피크 전류의 관찰에 의해 이 변화를 "판독"하는데 사용되었다. 가장 공통적으로 채용되는 사각파 볼타메트리(SWV)는 센서가 일련의 포텐셜 펄스를 받게 하고 사각파에 의해 정의된 지연 후 그에 따른 유도 전류를 샘플링함으로써 이 변환을 달성한다. 따라서 관찰된 전류의 크기는 전자 이동 속도(전류가 측정되는 시간에 따라 얼마나 감쇠되는지 정의)에 의존하고, 결국 표적의 농도에 정량적으로 의존한다. 구체적으로, E-AB 센서가 SWV에 의해 조사될 때, 그에 따른 피크 전류는 표적 농도가 오르며(도 1b) 단조적으로 오르거나 내린다(사각파 주파수에 따라). 이 결합-유도된 변화의 상대적 크기(즉, 신호 게인)는 센서에 채용된 앱타머에 의존하고 사각파 주파수와 진폭을 최적화함으로써 최대화될 수 있다.
SWV가 특히 편리하고 신뢰할 수 있는 전자 이동 속도론의 결합-유도된 변화를 쉽게 측정할 수 있는 출력으로 변환하는 수단인 것으로 입증되었지만, 이 접근법은 제한이 없지 않다. 먼저, SWV에 의해 생성되는 피크 전류(암페어로 측정)는 표적의 유무에만 의존하는 것이 아니라 센서의 표면 상의 산화 환원-리포터-변형된 앱타머의 수에도 의존하는데, 제조의 변형으로 인해 장치별로 현저히 변동할 수 있다(도 2a). 이전에, 이 변형은 사용 전 각 장치를 알려진(일반적으로 0) 표적 농도의 참조 샘플에서 캘리브레이션함으로써 다루어졌는데, 효과적이지만(도 2b) 복잡도를 증가시킨다. 둘째로, SWV-조사된 E-AB 센서가 희석되지 않은 혈청에 직접 배치되기에 충분히 선택적이지만, 전혈에 체외 또는 체내에서 배치될 때 현저한 드리프트를 보이고, 다양한 드리프트 보정과 드리프트-회피 메커니즘을 사용하여 극복해왔다. 마지막으로, SWV의 충분한 수백 밀리볼트 포텐셜 윈도우를 스캔하는데 필요한 시간 때문에, 그 시간-해상도는 수초로 제한된다. 본 명세서에 전자 이동 속도의 변화를 간접적으로 측정하는 볼타메트리를 직접 측정하는 크로노암페로메트리로 대체함으로써, 이들 제한이 극복되어 특정 분자의 캘리브레이션-프리, 서브초-분해된 생체 내 인 시추 측정을 달성한다.
결과 및 논의. 전자 이동 속도의 변화를 피크 전류의 변화로 변환하는, 따라서 이동 속도론을 간접적으로 보고하는 SWV와는 달리, 크로노암페로메트리 측정은 전자 이동 속도론을 직접 측정한다. 이는 전극의 포텐셜의 스테핑에 응답하여 생성되는 과도 전류의 수명을 산화 환원 리포터가 완전히 산화 또는 환원될 값으로 결정함으로써 된다. 아미노글리코사이드 항생 물질에 결합하는 E-AB 센서의 경우, 충분히 음의 포텐셜이 모든 메틸렌 블루 리포터의 완전한 환원을 유도하기 위해 적용되고 그 결과인 전류를 측정하였다(도 3). 전류 감쇠 트레이스는 두 지수 프로세스의 합으로 가장 잘 서술되는 것이 관찰되었다. 그 표적이 없는 경우, 예컨대 이들 센서는 100±30μs(이 명세서 전체에 걸쳐, 오류는 5개의 독립적으로 제조된 센서로부터의 표준 편차를 나타냄)의 수명을 가지는 한 빠른 지수 단계와 6.5±0.5ms의 수명을 가지는 더 느린 것을 나타낸다. 더 빠른 단계는 여전히 표적 농도의 변화에 둔감한 이 포텐셜 편향에서 전극 표면 상에 형성된 이중층의 충전(즉, μs의 시간 규모를 가지는 수성 이온의 이동)에 기여한다. 반면, 더 낮은 단계는 메틸렌 블루의 로이코메틸렌 블루로의 유도 환원에 대응한다. 포화 표적 농도의 추가시, 제2 단계는 1.20±0.01ms의 수명으로 더 빨라진다. 이 수명의 ~5배 감소(표적이 없는 샘플에 비교할 때)는 산화 환원 리포터의 전극 표면까지의 거리의 변화와 일치하고 아마 표적-프리 앱타머보다 더 빠르게 전자를 운반하는 표적-결합된 앱타머의 수를 반영한다.
이론상, 아미노글리코사이드-결합 앱타머의 배좌 역학이 2상태 모델에 따른다면, 지수적 단계의 상대적 크기(결합 및 비결합 앱타머의 수를 반영하는)는 표적 농도로 단조적으로 변화한다. 하지만 2상태 모델은 두 지수적 단계가 독립적으로 측정될 수 있음을 가정한다. 하지만 이것은 여기서의 경우가 아닌데, 두 지수적 단계의 수명은 임의의 주어진 표적 농도에서 꽤 유사하여, 충분한 정확도로 그 크기를 추출하기 어렵게 만들기 때문이다. 다시 말해, 여기서의 경우와 같이 앱타머의 결합 및 비결합 상태 간의 상호 변환의 속도론은 전자 이동 이벤트보다 빠를 때, 배위 평형은 이산적 정적 수로 샘플링될 수 없다. 대신, 측정된 수명은 결합 및 비결합 상태의 수-가중된 평균을 반영한다. 이 제한은 단일 지수 맞춤을 사용하여 전류 감쇠 수명을 근사함으로써 극복된다(도 4a).
E-AB 센서의 크로노암페로메트리 수명과 그 표적의 농도 간의 단조적 관계는 E-AB 측정을 수행하기 위한 캘리브레이션-프리 접근법을 제공한다. 즉, 센서 상의 앱타머의 총 수에 의존하는 절대 SWV 피크 전류와 달리, 크로노암페로메트리의 수명은 결합 및 비결합 앱타머의 상대적인 수에만 의존한다. 따라서, 주어진 타입의 센서에 대해 확립되면, 수명-농도 관계는 각 개별 센서를 캘리브레이션할 필요 없이 표적 농도를 결정하는데 사용될 수 있다. 수명-농도는 흐르는 전혈에서 체외 토브라마이신 검출을 위해 사용될 때 아미노글리코사이드-검출 E-AB 센서를 위해 확립됐다. 구체적으로, 랭뮤어 등온선으로의 수명 대 농도의 비선형 회귀가 수행되고(도 4b의 빨간 선) 농도에 대해 풀렸다. 5개의 새 E-AB 센서의 배치(즉, 초기 훈련 세트가 아닌 센서)가 전혈의 토브라마이신으로 시도되었고, 이전에 결정된 랭뮤어 등온선은 관찰된 크로노암페로메트리 수명을 추정된 농도로 변환하는데 사용되었다(도 4c). 이것은 약물의 농도를 1μM 내지 1000μM의 범위에 걸쳐 10% 이상의 정확도와 정밀도로 성공적으로 결정하였다.
캘리브레이션-프리에 추가로, 크로노암페로메트리로 결정된 전류 감쇠 수명을 표적 농도 정의 수단으로 사용하는 것은 드리프트에도 내성이 있다. 다시, SWV-조사된 E-AB 센서는 희석되지 않은 혈청에서 잘 수행되기에 충분히 선택적이지만, 흐르는 전혈에 직접 배치될 때 종종 심한 기저 드리프트를 보인다. 이전에 이것은 다중 주파수에서 취해지는 측정을 수반하는 사각파 볼타메트리 접근법을 사용하여 보정되었다. 반면, 크로노암페로메트리 수명 측정은 상술한 바와 같이 본질적으로 이러한 드리프트에 내성이 있고, 과도 전류의 총 크기는 현저히 드리프트하는 반면(아마 단일층22의 표면 재배열 때문에), 그 지수적 감쇠의 수명은 그 크기에 독립적이며 매우 드리프트-프리이다(도 5b).
크로노암페로메트리-조사된 E-AB 센서의 드리프트 내성은 살아있는 동물의 혈액의 직접 인 시추 계속적 실시간 측정을 지원하기에 충분하다. 아미노글리코사이드-결합 E-AB는 75μm 직경의 금-미세 와이어 상에 제조된 센서로, 구조적 지지를 위해 22 게이지 카테터로 감싸져서, 살아있는 쥐의 경정맥에 직접 배치되었다(도 6a). 항생 토브라마이신의 플라즈마 약동학은 총 2시간 동안 계속적 크로노암페로메트리 측정을 수행함으로써 30mg/kg의 정맥 관리에 따라서 모니터링되었다. -0.1V 및 -0.3V 사이에서 연속으로 E-AB 센서의 포텐셜을 펄스하고, 각 펄스를 100ms 길이만으로 유지함으로써 계속적 측정이 달성되었다. 그 후, 실시간으로 전류 감쇠 수명을 추출하기 위해 -0.3V에서 생성된 과도 전류의 비선형 회귀 분석이 수행되었고, 이들 수명은 이전에 결정된 랭뮤어 등온선을 사용하여 농도로 변환되었다(도 6c). 300ms의 시간 해상도로(앱타머-표적 결합 속도론, 데이터 획득 및 계산 시간에 의해 제한) 크로노암페로메트리 측정은 약물 투입 기간뿐만 아니라 약물이 "혼합"되어 투입 후 혈류에서 균질성에 도달하는데 걸리는 시간도 분해한다.
전례 없는 정밀도로 약물 약동학의 크로노암페로메트리로 조사되는 E-AB 센서 측정의 서브초 시간 해상도. 토브라마이신의 분포 α 및 제거 β, 수명이 체내 데이터를 두 칸막이 약동학 모형에 맞춤으로써 결정되었다. 크로노암페로메트리-조사되는 E-AB 센서의 300ms 시간 해상도는 약물의 분포 단계, α=3.74±0.04분의 결정을 천개 이상의 측정점과 -1%의 맞춤으로부터 계산된 표준 오차로 지원한다. 유사하게, 약물의 제거 단계는 겨우 3%로 맞춤의 표준 오차를 끌어내리며 14000개의 측정점으로 β=69±2분으로 결정되는데, 이 작은 오차의 많은 부분은 실험 동안 동물의 대사 변동으로 인해 오를 수 있다(즉, β는 실제로 정수가 아니다). 이 정확도는 사각파 볼타메트리를 사용하여 달성된 이전의 체내 E-AB 측정보다 향상된 자릿수인데, 즉 이전의 혈액 채취 및 체외 분석을 사용한 측정보다 큰 향상이다.
여기서 E-AB 센서의 크로노암페로메트리 조사가 체내에서 직접 특정 저분자의 캘리브레이션-프리, 서브초-분해된 측정을 달성하기 위해 사용된다. 이 접근법의 전례 없는 시간 해상도는 약물 흡수, 호르몬 및 신경 전달 물질 방출 및 중추신경계 내의 약물과 대사 물질의 이동과 같이 빠르게 변동하는 생리학적 사건의 우리의 이해를 향상시킬 수 있음을 제안한다. 실시간으로 신체의 특정 분자의 캘리브레이션-프리 측정을 수행하는 능력은 치료 약물 모니터링 내지 장기간 피드백-제어 약물 전달의 응용에서 약물이 복용되는 효율과 정확도로 향상시킬 수 있다.
E-AB 센서는 분석물의 검출을 위해 전자 이동 속도론의 결합-유도된 변화에 의존하는 바이오센서의 유일한 클래스가 아니다. 다른 예시는 용액상 산화 환원 리포터로부터의 전자 이동의 변화, 리간드의 결합-유도된 배치로 인한 전자 이동 변화, 리포터의 재배치 에너지의 변화 또는 스캐폴드-부착 산화 환원 리포터가 밑의 전극 표면에 접근하는 효율에 입체적으로 유도된 변화를 측정하는 센서를 포함한다. 이 관점에서, 전자 이동 속도론을 직접 측정하기 위한 크로노암페로메트리의 능력이 이들 다른 플랫폼의 조사에서도 가치가 있는 것으로 판명될지 모른다고 상정한다.
방법. E-AB 센서는 다음과 같이 제조된다: 순금(12cm 길이) 세그먼트, 백금(11.5cm) 및 은(11cm) 와이어가 센서를 만들기 위해 절단된다. 이들 와이어의 양 끝 약 2cm의 절연이 외과용 칼날을 사용하여 제거되어 전기적 접촉을 가능하게 한다. 그 후 60% 주석/40% 납 로진-코어 솔더(0.8mm 직경)을 사용하여 커넥터 케이블의 3개의 끝 중 하나에 각각 납땜되고 각 와이어의 가장자리에서 약 5mm의 작은 윈도우를 제외하고 와이어의 몸체 주위로 수축 튜브에 열을 가함으로써 함께 부착된다. 와이어는 금 와이어가 먼저 단독으로 금과 백금 와이어가 함께, 마지막으로 세 와이어 모두 함께 절연되는 층 방식으로 부착된다. 이 3층 두께 절연의 목적은 가단성 있는 프로브의 몸체에 기계적 강도를 주기 위한 것이다. 와이어간 전기적 단락을 방지하기 위하여, 상술한 바와 같이 상이한 길이가 각 와이어에 사용된다. 금 와이어의 센서 윈도우(즉, 절연이 없는 영역)는 약 3mm 길이로 절단된다. 은 와이어는 염화은 막을 형성하기 위해 먼저 밤새 표백제에 침지시킴으로써 참조 전극으로 채용된다. 금 동작 전극의 표면 영역을 증가시키기 위해(더 큰 피크 전류를 얻기 위해) 센서 표면을 0.5M 황산에 침지시켜 전기화학적으로 거칠게 한 후 16,000 펄스 동안 Ag/AgCl에 대해 Einitial=0.0V 내지 Ehigh=2.0V 사이의 포텐셜을 앞뒤로 스테핑한다. 각 포텐셜 스텝은 "조용한 시간(quiet time)"이 없는 20ms 길이이다. 센서 제조를 위해 DNA 구성의 부분 표본이 30분 동안 실온에서 1000배 몰 과량의 트리스(2-카복시에칠)인산염으로 환원된다. 그 후 새로 거칠게 된 프로브는 1시간 실온에서 PBS에 200nM으로 환원된 DNA 구성의 용액에 침지되기 전 이온이 제거된 물에 헹구어진다. 이어서 이 센서가 PBS에 20mM 6-메르캅토-1-헥산올에 12시간 동안 4°C에서 밤새 침지된다. 이후 센서는 이온이 제거된 물로 헹구어져서 PBS에 저장된다.
SWV 측정의 경우, 50mV 진폭, 1-5mV의 포텐셜 스텝 크기 및 10Hz 내지 500Hz의 가변 주파수를 사용하여 센서는 Ag/AgCl에 대해 0.0V에서 -0.5V까지 조사된다. 모든 SWV 측정은 세 전극 설정을 사용하여 KCl 포화 용액으로 채워진 상업적 Ag/AgCl 참조 전극 및 백금 상대 전극을 사용하여 CH Instruments(TM) 전기화학 워크스테이션(Austin, TX, Model 660D)으로 수행된다. 크로노암페로메트리의 경우, 센서의 포텐셜은 연속적으로 -0.1V에서 -0.3V로 스테핑되고, 각 스텝은 100ms 길이이다. 체외 측정의 경우 전류 샘플링이 10μs마다, 체내 측정의 경우 100μs마다 수행된다(지수점의 수를 감소시키고 데이터 획득 속도를 빠르게 하기 위해). 모든 크로노암페로메트리 측정은 상술한 3 전극 E-AB 센서를 사용하여 수행되고 GAMRY(TM) Reference 600+ Potentiostat/Galvanostat/ZRA (Warminster, PA)로 기록된다.
크로노암페로메트리 전류 감쇠의 행동을 연구하고, 앱타머 친화력을 측정하고, 표적 농도로 신호 게인을 상호 연관시키기 위해, 센서는 먼저 흐르는 PBS에서 그리고 이어서 흐르는 헤파린 첨가된 소의 혈액에서 대응하는 표적의 증가된 농도로 사각파 볼타메트리나 크로노암페로메트리에 의해 조사된다. 이들 실험은 정맥에서 발견되는 혈액 이동의 타입을 흉내내도록 의도된 폐쇄 플로우 시스템에서 수행된다. 혈액 흐름은 유량계에 의해 측정된 대로 유속을 1-10mL min- 1으로 설정한 자기 기어 펌프를 사용하여 달성된다. 결합 곡선을 구성하기 위하여(앱타머의 표적과의 적정), PBS 버터나 혈액 각각의 측정 전에 토브라마이신의 모액이 새로 준비된다. 토브라마이신 참조 표준으로부터 만들어진 모액에 대해 아미노글리코사이드-결합 E-AB 센서의 새 배치를 시도함으로써 센서는 캘리브레이션-프리 행동이 수행됨을 보이도록 시도된다.
체내 측정은 마취된 쥐 내에서 수행되는데, 실라스틱 카테터가 투입을 위해 삽입되거나 E-AB 센서가 경정맥 내에 측정을 위해 배치된다. 모든 체내 측정은 상술한 바와 같이 참조 전극이 염화은 막으로 코팅된 은 와이어이고 상대 전극이 백금 와이어인 3 전극 설정을 사용하여 수행된다. 기록은 최대 3시간까지 300밀리초당 한 점의 샘플링 속도로 취해진다. 실시간 데이터로부터 약동학 프로필을 얻기 위해 비선형 희귀 분석이 두 칸막이 모델을 사용하여 수행되어 정맥 주입에 맞추어진다. 희귀에 사용되는 식은 다음과 같다.
Figure pct00006
이 때 Cp는 측정된 플라즈마 농도, A와 B는 최대 농도 A+B=CMAX에 대한 각 약동학 구획의 기여분, α는 약물 분포의 1차 시간 상수, β는 약물의 제거 시간 상수이다. 희귀 분석 동안, 제곱된 오차가 최소화됨으로써 최적 맞춤이 결정되도록 모든 변수는 변동된다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 발행물은 각 개별 특허 출원이나 발행물이 구체적이고 개별적으로 참조로서 통합되도록 표시된 것처럼 동일 범위로 본 명세서에 참조로서 통합된다. 개시되는 실시예는 제한이 아니고 설명의 목적으로 제시된다. 본 발명이 서술되는 실시예를 참조하여 설명되었지만, 통상의 기술자는 전체로서 본 발명의 사상과 범위에서 벗어남 없이 본 발명의 구조와 요소에 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (26)

  1. 전기 화학 센서의 사용에 의하여 샘플의 표적종의 농도를 측정하는 방법으로서:
    샘플에 노출되도록 전기 화학 센서를 배치하는 단계;
    전기 화학 센서에 하나 이상의 여기 펄스를 인가하는 단계;
    하나 이상의 여기 펄스 각각에 따르는 시간-분해된 유도 전류 데이터를 획득하는 단계;
    획득된 시간-분해된 유도 전류 데이터에 의하여, 전류 감쇠의 선택된 측정의 값을 계산하는 단계; 및
    전류 감쇠의 측정의 계산된 값에 의하여, 전류 감쇠의 선택된 측정과 샘플의 표적종의 농도 간의 수학적 관계의 적용에 의하여 표적종의 농도를 계산하는 단계를 포함하고,
    전기 화학 센서의 출력은 샘플의 표적종의 농도에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 유도 전류이고,
    유도 전류 출력은 각 펄스에 의해 생성되는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    전기 화학 센서는 표적 결합시 배위 변화를 겪는 복수의 인식 요소로 기능화되는 전극을 포함하고, 각 인식 요소는 하나 이상의 산화 환원 리포터로 기능화되는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    인식 요소는 앱타머를 포함하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    샘플은: 전혈, 혈청, 타액, 소변, 땀, 간질액, 척수액, 뇌액, 조직 삼출물, 불린 조직 샘플, 세포 용액, 세포내 구간, 물, 세척액, 폐수, 지하수, 식품 및 음료로 이루어지는 그룹에서 선택되는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    샘플은 흐르는 전혈을 포함하는 방법.
  6. 청구항 4에 있어서,
    샘플은 측정 전에 처리되지 않는 방법.
  7. 청구항 4에 있어서,
    샘플은 희석되지 않는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    표적종은: 저분자 약물, 대사 물질, 호르몬, 펩티드, 단백질. 탄수화물, 핵산, 지질, 호르몬, 대사 물질, 성장 인자, 신경 전달 물질, 영양소, 오염 물질, 병원체-유도된 또는 병원체-도출된 인자, 병원체 또는 세포로 이루어지는 그룹에서 선택되는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    표적 감쇠의 선택된 측정은 감쇠 상수, 평균 수명, 반감기 및 상대적 크기로부터 선택되는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    전류 감쇠의 선택된 측정은 시간-분해된 전류 데이터의 지수 맞춤으로부터 도출되는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    전류 감쇠의 선택된 측정은 시간-분해된 전류 데이터의 단일 지수 맞춤으로부터 도출되는 방법.
  12. 청구항 1에 있어서,
    전류 감쇠의 선택된 측정은 시간-분해된 전류 데이터의 이중 지수 맞춤으로부터 도출되는 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    전류 감쇠의 선택된 측정과 표적 농도 간의 수학적 관계는 배치된 전기 화학 센서와 동일한 클래스의 센서에 대해 도출된 방법.
  14. 청구항 1에 있어서,
    캘리브레이션 단계가 측정 이전이나 이후에 수행되지 않는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    반복된 측정이 확장된 기간에 걸쳐 획득되는 방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    천기 화학 센서는 체내에 배치되는 방법.
  17. 청구항 15에 있어서,
    전기 화학 센서는 인간 대상에 배치되는 방법.
  18. 청구항 15에 있어서,
    전기 화학 센서는 비인간 동물에 배치되는 방법.
  19. 청구항 1에 있어서,
    전기 화학 센서는 현장 검사 시스템에 배치되는 방법.
  20. 전기 화학 센서로서,
    전기 화학 센서는 샘플에 배치될 때, 센서의 출력이 샘플의 표적종의 농도에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 유도 전류이도록 구성되고;
    유도 전류 감쇠의 측정 및 표적 농도에 관한 안정적인 수학적 관계가 전기 화학 센서가 속하는 클래스의 센서에 대해 알려져 있는 전기 화학 센서.
  21. 청구항 20에 있어서,
    전기 화학 센서는 표적 결합시 배위 변화를 겪는 복수의 인식 요소로 기능화되는 전극을 포함하고, 각 인식 요소는 하나 이상의 산화 환원 리포터로 기능화되는 전기 화학 센서.
  22. 청구항 21에 있어서,
    클래스의 센서는 동일한 인식 요소 타입, 동일한 산화 환원 리포터 타입 및 전극으로의 결합을 위한 동일한 부착 화학을 포함하는 전기 화학 센서.
  23. 청구항 21에 있어서,
    인식 요소는 앱타머를 포함하는 전기 화학 센서.
  24. 샘플에 배치될 때, 센서의 출력이 샘플의 표적종의 농도에 농도-의존적인 방식으로 변화하는 유도 전류이도록 전기 화학 시스템이 구성되는 전기 화학 센서;
    전기 화학 센서로의 여기 펄스의 인가 및 각 펄스의 인가에 따르는 전기 화학 센서로부터의 시간-분해된 유도 전류 감쇠의 획득을 위한 장치를 포함하는 하드웨어 컴포넌트; 및
    전기 화학 센서 및 하드웨어 컴포넌트에 의한 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 하나의 방법의 수행을 가능하게 하는 데이터 및 컴퓨터 프로그램을 저장한 비일시적 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하는 전기 화학 검출 시스템.
  25. 청구항 24에 있어서,
    전기 화학 센서는 표적 결합시 배위 변화를 겪는 복수의 인식 요소로 기능화되는 전극을 포함하고, 각 인식 요소는 하나 이상의 산화 환원 리포터로 기능화되는 전기 화학 검출 시스템.
  26. 청구항 24에 있어서,
    인식 요소는 앱타머를 포함하는 전기 화학 센서.
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