KR20200062154A - 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물 - Google Patents

항암 치료 효과 증진용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본원은 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

항암 치료 효과 증진용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR ENHANCING EFFECT OF ANTI-CANCER TREATING}
본원은 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물과 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서, 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고 비조절적인 방식으로 증식하고 불사화 되어 발생하는 질병이다. 암 발생의 원인으로는 화학물질, 바이러스, 세균, 전리방사선 등의 환경적 또는 외적 요인과 선천성 유전자 변이 등의 내적 요인을 들 수 있다.
암을 치료하는 대표적인 3대 요법으로 수술요법, 화학요법, 방사선 요법이 있다. 상기 수술요법은 침습적 방법으로 암 세포를 제거하는 것이기 때문에 전이되지 않은 고형암을 제거하는 데는 효과적이나, 전이암에는 그 효과가 제한적이다. 또한, 상기 화학요법은 약제 내성을 갖는 암세포가 생길 수 있어 효과가 완벽하지 못한 실정이다.
한편, 위암은 전 세계적으로 가장 빈도가 높은 암종의 하나이며, 미국과 유럽에서는 발병률이 낮은 반면 우리나라를 포함한 극동에서의 발생률이 유의하게 높은 종양이다. 특히, 위암의 경우 항암요법의 효율이 좋지 않은 것으로 알려져 있기 때문에 항암 효과를 증진시켜 줄 수 있는 인자의 개발이 요구되고 있다. 따라서 대한민국등록특허 10-0597535와 같이, 암 치료를 위하여 다양한 보조용 조성물이 개발되고 있지만, 아직 확실한 효과를 보인다고 인정된 것은 없다.
본원은 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본원은 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들에 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1측면은, 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 위암은 암세포 중 암관련섬유모세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 억제제는 인터루킨-6 자체 억제제; 인터루킨-6의 발현을 억제할 수 있는 siRNA; 인터루킨-6에 특이적으로 결합하는 항체; 인터루킨-6에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 항암제는 5-FU, 악템라, 독소루비신, 파클리탁셀, 마이토마이신, 도세탁셀, 시스플라틴, 이리노테칸, 에포토사이드, 카페시타빈, 옥살리플라틴, 이들의 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 2측면은, 암관련섬유모세포를 포함하는 위암 조직 또는 암관련섬유모세포와 혼합된 위암 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계; 상기 처리한 위암 조직 또는 위암 세포주에서 인터루킨-6의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 처리하지 않은 대조군과 비교하여 인터루킨-6의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 감소시키는 피검화합물을 선별하는 단계;를 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인터루킨-6 mRNA의 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인터루킨-6 단백질의 발현은 웨스턴 블랏(Western Blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원은 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물 또는 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본원의 발명자들은 위암에서 종양 내 기질을 구성하는 주요 세포인 암관련섬유모세포(cancer-associated fibroblast, CAF)을 배양한 배양액을 위암 세포와 공동 배양한 후, 항암제를 투여시 항암 효과가 감소되는 것을 확인하였다. 더불어 CAF에서 IL-6이 분비되며, 이로 인해 항암 효과가 감소되는 것을 확인하였다. 그러므로 IL-6의 발현을 타겟으로 하여, IL-6의 mRNA 또는 단백질의 발현을 억제하면 항암제 내성을 갖는 위암의 치료에 있어서 큰 치료 효과를 볼 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서 본원은 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물을 제공할 수 있다. 더불어 IL-6의 mRNA 또는 단백질의 발현을 억제할 수 있는 피검화합물을 선별하는, 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포에서 정상 위조직 섬유모세포 (normal gastric tissue-associated fibroblast, NAF) 혹은 암관련섬유모세포(cancer-associated fibroblast, CAF)를 배양한 조건배양액(conditioned media, CM)를 첨가시 항암제 반응성(IC50)의 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포주 MKN-45와 MKN-1에서 CAF에 의해서 항암제 5-FU의 반응 억제 효과가 증가되는 것을 세포들의 형태 변화로 나타낸 결과 사진이다.
도 3 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포를 NAF 혹은 CAF와 공동배양시에 항암제 첨가시 세포사멸 표지자(Cleaved caspase 3 & PARP)의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포에서 CAF의 CM을 첨가했을 때 IL-6의 신호전달 경로 중 JAK-STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 신호전달 경로가 활성화됨을 확인한 결과이다.
도 5의 (A)는 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포주 MKN-45에 CAF를 공동배양 했을 때 IL-6, IL-8 등의 사이토카인이 증가하는 것을 확인한 결과이고, 도 5의 (B)는 본원의 일 실시예에 따른 위암 세포주 MKN-45에 CAF를 공동배양 했을 때 IL-6의 신호전달 경로 중 JAK-STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 신호전달 경로가 활성화됨을 확인한 결과이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른, NAF에 비하여 CAF에서 IL6의 발현이 증가된 것을 RT-qPCR로 확인한 결과이며, 위암 세포에서의 IL-6의 발현은 거의 없으나 주로 섬유모세포에서 발현되면서 NAF에 비하여 CAF에서의 발현이 단백질 수준에서도 높음을 RT-PCR과 ELISA로 확인한 결과이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른, IL-6의 발현이 테트라사이클린에 의해서 억제되는, IL-6 억제된 CAF를 제작한 뒤 이를 위암 세포와 공동 배양하면서 IL-6의 발현을 억제 시켰을 때, CAF에 의해서 억제된 세포사멸 표지자의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른, IL-6의 발현이 단일클론항체에 억제되는, IL-6 억제된 CAF를 제작한 뒤 이를 위암 세포와 공동배양하면서 IL-6의 발현을 억제 시켰을 때, CAF에 의해서 억제된 세포사멸 표지자의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포에서 IL-6와 IL-6 수용체 항체의 투여에 따른 STAT3 신호 전달 경로의 변화와 CAF의 CM에 의한 항암제 반응성에 대한 영향 및 IL-6 수용체 항체에 의한 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포 또는 위암 세포와 CAFs를 동반 주사한 마우스 모델에 5-FU 단독 투여 또는 IL-6 수용체 억제제인 악템라(actemra)를 동반 투여했을 때 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 항암제인 5-FU의 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 본원의 일 실시예에 따른 NAF와 CAF에 대한 전사체 분석 결과이다.
도 13은 본원의 일 실시예에 따른 NAF와 CAF에서 나타나는 유전자 발현을 RT-PCR과 ELISA로 확인한 결과이다.
도 14는 본원의 일 실시예에 따른 암세포주에서 CAF-CM의 유무, 단일클론항체의 유무, lgG의 유무에 따른 세포활성도를 나타낸 결과이다.
도 15는 본원의 일 실시예에 따른, 수술 전 항암치료를 받은 위암 환자들의 항암 치료 전 생검 조직에서의 유전자 발현의 차이를 엔카운터(nCounter)방법으로 분석한 결과이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하에서는 본원의 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물과 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1측면은 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 의 작용 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물에 관한 것이다.
본원의 발명자들은 위암에서 종양 내 기질을 구성하는 주요 세포인 암관련섬유모세포(cancer-associated fibroblast, CAF)을 배양한 배양액을 위암 세포와 공동 배양한 후, 항암제를 투여시 항암 효과가 감소되는 것을 확인하였다. 더불어 CAF에서 IL-6이 분비되며, 이로 인해 항암 효과가 감소되는 것을 확인하였다. 그러므로 IL-6의 발현을 타겟으로 하여, IL-6의 mRNA 또는 단백질의 발현을 억제하거나 IL-6에 의한 위암 세포의 활성화를 억제한다면 항암제 저항성을 갖는 위암의 치료에 있어서 큰 치료 효과를 볼 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서 본원의 일 구현예에 따르면, 상기 위암은 암세포 중 암관련섬유모세포 (cancer-associated fibroblasts; CAFs)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "암관련섬유모세포(cancer-associated fibroblasts, CAF)"는 암(cancer) 또는 악성종양(malignant tumor) 주변을 둘러싸고 있는 조직에 존재하는 섬유모세포를 의미한다. 상기 암관련섬유모세포(CAF)는 예컨대 특정의 악성 종양 조직을 절제하여 얻은 표본(specimens)으로부터 용이하게 분리할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 CAF의 분리 원(isolation source)이 되는 악성 종양 조직은 위암 조직인 것이 바람직하다.
상기 인터루킨-6(interleukin-6)은 IL-6으로 약기되며 B세포의 항체생산세포로의 최종 분화를 유도하는 B세포자극인자2(BSF-2)로 분리한 분자량이 210,000인 당단백질이다. T림프구, B림프구, 대식세포, 섬유아세포 등 여러 세포에서 생산되는 시토카인으로, 인터페론β2(IFN-β2)와 동일분자이다. 면역응답, 조혈계와 신경계 세포의 증식 및 분화, 급성 반응 등에 관여한다.
사람의 IL-6은 28개의 신호펩티드를 포함한 212개의 아미노산 잔기로 구성되어 있다. IL-6의 과잉 생산은 여러 가지 면역이상증, 염증성 질환, 림프계 종양의 발증과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 억제제는 인터루킨-6 자체 억제제; 인터루킨-6의 발현을 억제할 수 있는 siRNA; 인터루킨-6에 특이적으로 결합하는 항체; 인터루킨-6에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체는 다클론성 항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론 항체(monoclonal antibody)이다.
상기 다클론성 항체는 당업자에 알려진 방법에 따라 면역원으로 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조할 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양 또는 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다.
상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자에 의해 발현된 단백질을 마우스에 면역화시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨다. 마우스에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종(myeloma)과 융합하여 불멸화된 하이브리도마(hybridoma)를 생성하며, 상기 하이브리도마 세포를 가지고 간접적인 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assays, ELISA)을 사용하여 모노클노날 항체의 생성 여부를 확인하고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리정제하거나 랫트의 복강에 주입한 후 복수를 채취함으로써, 단일클론 항체를 제조할 수 있다.
상기 단일클론 항체는 일반적으로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 결합된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응 시킴으로써 정량분석할 수도 있고, 또는 직접 상기 단백질에 대한 단일클론 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 결합된 것을 사용하여 정량분석할 수 있다.
상기 단백질과 항체의 반응은 웨스턴 블랏(western blot), 면역침강법(Immunoprecipitation, IP), 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assays, ELISA) 및 면역염색법(Immunohistochemistry, IHC)등의 단백질 확인 실험을 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 항암제는 위암 치료를 위해 사용될 수 있는 공지된 항암제라면 제한없이 사용가능하다. 예를 들어, 상기 항암제는 5-FU(Fluorouracil), 악템라(actemra), 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 마이토마이신(mitomycin), 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan), 에포토사이드(epotoside), 카페시타빈(Capecitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 이들의 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항암제를 이용한 항암 요법은 전신에 효과를 나타낼 수 있는 요법이나, 치료시 암세포가 항암제에 반응하지 않거나, 초기에는 효과적으로 종양이 줄어들지만 치료 도중 또는 치료 후에 항암제 치료에 대한 내성이 생겨 치료 효과가 감소되는 경우가 많다. 이런 경우, 치료에 사용된 항암제뿐 아니라, 다른 종류의 항암제에 대해서도 내성을 나타내는 이른바, 다중 약제 내성 (MDR; multi-drug resistance)을 나타내기 때문에 일단 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득하면, 이 후, 암 치료에 있어서 큰 어려움을 겪게 된다. 따라서 암세포의 항암제에 대한 저항성을 감소시킬 수 있는 방법의 개발은 매우 중요하다.
본 발명에 따른 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 약효가 충분히 발휘될 수 있도록 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 이러한 약학 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 비강흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
본원의 제 2측면은 암관련섬유모세포를 포함하는 위암 조직 또는 암관련섬유모세포와 혼합된 위암 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계; 상기 처리한 위암 조직 또는 위암 세포주에서 인터루킨-6의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 처리하지 않은 대조군과 비교하여 인터루킨-6의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 감소시키는 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본원의 일 실시예에 따르면 상기 CAFs를 포함하는 위암의 경우 항암제에 대한 저항성을 가지고 있으며, CAFs에서는 IL-6이 분비되는 것이 확인되었다. 특히, 상기 IL-6의 발현으로 인해 암세포의 항암제에 대한 저항성이 증가하는 것을 확인하였으므로, 상기 IL-6의 발현을 4감소시킬 수 있는 피검화물을 스크리닝할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인터루킨-6 mRNA의 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 인터루킨-6 단백질의 발현은 웨스턴 블랏(Western Blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 2측면은 CAFs를 포함하는 위암에서의 IL-6 발현 조절을 바탕으로 한 항암 보조제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본원의 제 1측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본원의 제 1측면에 대해 설명한 내용은 본원의 제 2측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1] 암관련섬유모세포를 배양한 배양액에 의한 항암제의 효과 감소 확인
정상위조직 섬유모세포(Normal gastric tissue-associated fibroblast, NAF) (위암 환자의 정상 위조직으로부터 직적 분리) 또는 암관련섬유모세포(cancer- associated fibroblast, CAF)(위암 환자의 위암 조직으로부터 직접 분리)를 1차 배양한 조건배양액(conditioned media, CM)을 이용하여 위암 세포주 MKN-1과 MKN-45(한국 세포주 은행에서 에서 구입)를 배양한 후, 항암제인 5-FU를 첨가하여 항암제에 대한 위암 세포주의 반응성을 확인하였다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포에서 정상 위조직 섬유모세포 (normal gastric tissue-associated fibroblast, NAF) 및 암관련섬유모세포(cancer-associated fibroblast, CAF)에 배양한 조건배양액(conditioned media, CM)를 첨가시 항암제 반응성(IC50)의 변화를 확인한 결과이다.
그 결과 도 1과 같이, NAF를 배양한 CM을 첨가한 경우, 5-FU 농도가 증가함에 따라 세포가 사멸되는 것을 확인할 수 있었으나, CAFs를 배양한 CM을 첨가한 경우, 사멸되는 암 세포가 더 적다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 IC50의 경우, NAF를 배양한 CM을 첨가한 경우보다 CAFs를 첨가한 경우가 약 3배 이상의 값이 보여, CAFs에 의하여 항암제의 효과가 감소한 것을 확인하였다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포주 MKN-45와 MKN-1에서 CAF에 의해서 항암제 5-FU의 반응 억제 효과가 증가되는 것을 세포들의 형태 변화로 나타낸 결과 사진이다.
구체적으로, 도 2에 나타난 결과에 따르면, CAF가 없는 위암 세포주(MKN-45 및 MKN-1)는 항암제인 5-FU에 의해 세포수가 감소된 것을 확인할 수 있으나, CAF가 있는 위암주 세포는 항암제인 5-FU의 반응이 억제되어 세포수의 변화가 없는 것을 확인하였다.
[실시예 2] CAF에 의한 항암제의 효과 감소 확인
NAFs 및CAFs 공동 배양에 의해서 위암 세포주 MKN45의 항암제 효과에 영향을 받음을 확인하였다. 이를 위해 MKN45를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 배지에 배양하면서 0.4 um의 구멍크기를 갖는 트랜스웰 디바이스(transwell device)를 배양접시 위쪽에 위치시킨 후 NAF 혹은 CAF를 공동배양하고 배양하였고 5-FU 5 uM 를 72시간 동안 처리하였다.
그런 후, 세포사멸(Apoptosis)의 표지자인 절단된 카스파제-3(cleaved caspase-3) 또는 PARP(poly-ADP ribose polymerase) 단백질의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하여 NAF 및 CAF 공동 배양의 영향을 확인하였다.
상기 웨스턴 블랏을 위해 배양 접시의 세포를 수거한 후 세포를 용해시켰다. 이로부터 단백질을 추출하여 정량한 후 전기영동장치를 이용해 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 폴리멤브레인(membrane)으로 이동시켰다. 그 후 상기 단백질들에 대한 항체 및 형광물질 발현을 위한 이차 항체를 붙이는 방식으로 각 단백질의 발현을 확인하였다.
이를 통해 CM에서 분비된 물질이 IL-6인 것으로 확인하였다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포를 NAF 혹은 CAF와 공동배양시에 항암제 첨가시 세포사멸 표지자(Cleaved caspase 3 & PARP)의 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
더불어 도 3과 같이, 5-FU 치료 후 세포사멸 표지자인 절단된 카스파제-3와 PARP가 증가하였다가 NAF 및 CAF와의 공동 배양에 의해 다시 감소되는 것을 확인하였다.
[실시예 3] IL-6 신호전달경로 확인
CAF-CM을 이용하여 5-FU를 투여한 위암 세포주를 자극한 후, IL-6의 신호전달경로(signal pathway)인 JAK -STAT3 가 활성화되는 것을 확인하였다.
배양 접시에 MKN45 세포주를 배양한 후 5-FU를 투여하고 동시에 CAF-CM 혹은 IL-6를 72시간 동안 투여하였다. 각 세포에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 방법으로 Jak-STAT3의 활성화를 정량적으로 확인하였다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포에서 CAF의 CM을 첨가했을 때 IL-6의 신호전달 경로 중 JAK-STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 신호전달 경로가 활성화됨을 확인한 결과이다.
그 결과 도 4와 같이, 공지된 문헌(Mihara M et al. Clinical Science 2012)에 근거하여, CAF-CM에 의하여, IL-6 신호전달경로 중 하나인 JAK(Janus kinase) 및 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 등이 인산화되는 것을 확인하였다.
도 5의 (A)는 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포주 MKN-45에 CAF를 공동배양 했을 때IL-6, IL-8 등의 사이토카인이 증가하는 것을 확인한 결과이고, 도 5의 (B)는 본원의 일 실시예에 따른 위암 세포주 MKN-45에 CAF를 공동배양 했을 때 IL-6의 신호전달 경로 중 JAK-STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 신호전달 경로가 활성화됨을 확인한 결과이다.
배양 접시에 MKN45 세포주를 배양한 후 5-FU를 투여하고 동시에 CAF을 6시간 및 24시간 동안 투여하였다. 각 세포에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 방법으로 Jak-STAT3의 활성화를 정량적으로 확인하였다.
도 5에 나타난 결과에 따르면, 위암 세포주 MKN-45가 단독으로 있을 때에는 IL-6, IL-8 등의 사이토카인이 증가하지 않는 반면, 위암 세포주 MKN-45와 CAF를 공동 배양했을 때에는 IL-6, IL-8 등의 사이토카인이 증가하는 것을 확인하였습다. 또한, 신호 전달 체계인 JAK-STAT3 인산화가 CAF가 있음으로써 증가하는 것을 확인하였다.
[실시예 4] CAF 특이적인 IL-6 과발현 확인
IL-6가 주로 섬유모세포에서 발현하는 것을 확인하였으며, NAF에 비하여 CAF에서 특이적으로 과발현됨을 확인하였다.
이를 위해 CAF를 포함하지 않는 위암 세포(KATO-Ⅲ, MKN-28 및 MKN-45)는 각각 한국세포주은행에서 구입하였고, CAF를 포함하는 위암 세포는 각 위암 세포에 CAF를 처리하여 공동배양 함으로써 준비하였다.
다양한 위암 세포주와 CAF 및 NAF에서 IL-6 발현을 RNA 레벨과 단백질 수준에서 평가하여 확인하였다.
이를 위해 13쌍의 NAF 및 CAF에서 RNA를 추출하여 qRT-PCR방법으로 IL-6의 발현을 정량적으로 측정하고 확인하였다.
또한, KATO-Ⅲ, MKN28, MKN45 및 다양한 NAF, CAF 쌍에서 RNA를 추출하여 RT-PCR방법으로 IL-6를 비롯하여 IL-6 수용체인 IL-6R, gp130 등의 발현을 확인하였다.
더불어, 단독 혹은 MKN45와 공동 배양된 경우의 배양액과 다양한 위암 세포주들을 배양한 배양액으로 배양한 NAF 및 CAF에서 IL-6의 단백질 수준에서의 발현을 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른, NAF에 비하여 CAF에서 IL6의 발현이 증가된 것을 RT-qPCR로 확인한 결과이며, 위암 세포에서의 IL-6의 발현은 거의 없으나 주로 섬유모세포에서 발현되면서 NAF에 비하여 CAF에서의 발현이 단백질 수준에서도 높음을 RT-PCR과 ELISA로 확인한 결과이다.
그 결과 도 6을 참고하면, NAF와 비교할 때 CAF에서 IL-6 유전자가 의미 있게 높게 발현되었으며, 위암세포주에서는 IL-6가 거의 발현되지 않았으나, CAF에서는 IL-6가 발현됨을 RNA 레벨에서 확인할 수 있었다. 또한, NAF에 비하여 CAF에서 IL-6이 더 높게 발현되어 세포 밖으로 분비됨을 단백질 수준에서 확인하였으며, 위암 세포주들에서는 이러한 분비가 거의 없음을 확인하였다.
[실시예 5] CAF에서 IL-6 발현 억제시와 IL-6에 의한 암세포 자극 차단 시에 위암 세포주에서 항암제 반응성 확인
IL-6의 발현이 억제된 CAF와 공동 배양시 항암제에 대한 저항성이 감소되는 것을 확인하였다.
이를 위하여, 테트라사이클린(tetracycline) 투여시 IL-6의 발현이 억제되도록 tet-on 유도 IL-6 shRNA 벡터를 제작하여 CAF에 주입한 후 실제 IL-6의 억제를 RT-PCR을 통하여 확인하였다.
이렇게 제작된 세포주를 MKN-45와 상기 실시예 2와 같은 방법으로 공동 배양을 시행한 후 테트라사이클린을 투여하여 IL-6 발현을 억제시키고, 세포사멸 표지자들의 변화를 웨스턴블랏으로 확인하였다.
더불어 IL-6 수용체 단일 항체에 의한 위암 세포주 IL-6 신호 전달 체계 억제와 항암제 감수성 증가 효과도 확인하였다.
이를 위하여, 상기 실시예 3과 같은 방법으로 웨스턴블랏을 실시하였다. 특히, IL-6에 대한 단일클론항체(Anti-IL6R AB, Sino Biological에서 구입)를 800ng/ml의 농도로 배지에 투여하여 IL-6 신호 전달 억제시 항암제 반응성을 확인하였으며, 대조 실험으로 IgG에 대한 항체 (800ng/ml)의 효과도 확인하였다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른, IL-6의 발현이 테트라사이클린에 의해서 억제되는, IL-6 억제된 CAF를 제작한 뒤 이를 위암 세포와 공동 배양하면서 IL-6의 발현을 억제 시켰을 때, CAF에 의해서 억제된 세포사멸 표지자의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른, IL-6의 발현이 단일클론항체에 억제되는, IL-6 억제된 CAF를 제작한 뒤 이를 위암 세포와 공동배양하면서 IL-6의 발현을 억제 시켰을 때, CAF에 의해서 억제된 세포사멸 표지자의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 7 및 도 8에 나타난 결과에 따르면, IL-6에 의하여 STAT3가 활성화되고, 항암제에 대한 반응이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 항체를 이용하여 IL-6를 억제한 경우, STAT3 활성화가 감소되고, 항체의 농도에 따라 항암제에 대한 반응성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 동물 모델에서 IL-6 발현 확인
BALB/c 누드 마우스(nude mouse)에 위암세포를 이종이식(xenograft)한 후, 항암제를 투여하여 CAF와 혼합하였을 때 종양 형성 유무와, 항암제에 대한 영향을 확인하였다.
6에서 8주된 12마리의 BALB/c 누드 마우스의 피하에 MKN45 세포주 (1x107) 단독 혹은 CAFs (5x105) 와 함께 주사하여 종양을 형성시킨 후 5-FU를 주당 3회 25mg/kg의 농도로 복강 내 투여하고 3주간 크기 변화를 측정하였다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포에서 IL-6와 IL-6 수용체 항체의 투여에 따른 STAT3 신호 전달 경로의 변화와 CAF의 CM에 의한 항암제 반응성에 대한 영향 및 IL-6 수용체 항체에 의한 효과를 확인한 결과이다.
그 결과, 도 9와 같이 위암 세포주 단독 주사시보다 CAFs 와 함께 주사했을 때 5-FU의 효과가 감소하는 것을 알 수 있었다.
[실시예 7] 동물 모델에서 IL-6 억제에 의한 효과 확인
6에서 8주된 BALB/c 누드 마우스의 피하에 MKN1 세포주 단독 (1x106) 혹은 CAFs (5x105)와 함께 주사하여 종양을 형성시킨 후, 5-FU를 실시예 6과 같은 방법으로 단독 투여하고, CAFs를 함께 주입한 마우스의 일부에 IL-6R 항체(Anti-IL-6 Ab) 를 동반 투여하여 IL-6 억제에 의한 효과를 확인하였다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른, 위암 세포 또는 위암 세포와 CAFs를 동반 주사한 마우스 모델에 5-FU 단독 투여 또는 IL-6 수용체 억제제인 악템라(actemra)를 동반 투여했을 때 효과를 확인한 결과이다.
그 결과 도 10과 같이, CAFs에 의하여 감소되었던 항암제의 효과가 IL-6 수용체에 대한 항체를 통해 IL6의 역할을 억제하였을 때 다시 증가되어, 종양 크기 및 중량이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히, 항암제 투여시 체중이 감소될 수 있는데, IL-6를 억제한 경우, 항암제 단독 투여 또는 CAF와 함께 주사한 경우 보다 체중이 더 무거운 것을 확인할 수 있었다. 또한 치료 3주 후 절제한 조직에 대한 면역화학염색에서, CAF와 함께 주사하여 형성된 종양에서는 섬유모세포 표지자인 알파 평활근 액틴(alpha-smooth muscle actin)을 발현하는 세포의 수가 증가 한 것을 확인하였으며, 악템라 투여에도 변함없이 증가함을 확인하였지만, 세포 사멸 표지자인 카스파제-3의 발현이 CAF 와 함께 주사 시 의미 있게 감소하였다가 악템라 투여 후 다시 증가함을 확인하였다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 항암제인 5-FU의 효과를 확인한 결과이다.
구체적으로, 도 11에 나타난 결과에 따르면, 위암세포주 MKN-1에서 NAF에 비하여 CAF에 의해서 항암제인 5-FU 반응의 억제 효과가 증가됨을 이종이식 모델을 통하여 확인하였다. 특히, CAF와 혼합한 종양에서 종양 내 섬유모세포의 축적이 증가하고, 5-FU 항암제 치료 시 세포사멸 표지자의 발현이 감소되는 것을 면역화학염색을 통해 확인하였다.
[실시예 8] IL-6의 발현 확인
IL-6가 암세포가 아닌 CAF에서 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
도 12는 본원의 일 실시예에 따른 NAF와 CAF에 대한 전사체 분석 결과이다.
도 12에 나타난 결과에 따르면, CAF에서 증가하는 유전자 중에서 JAK-STAT3 신호전달과 관련된 유전자는 LIF, IL-6, IL-12,IL-24,IL-15-RA, IL-6T, IL-24 등이 있는 것으로 확인하였다.
도 13은 본원의 일 실시예에 따른 NAF와 CAF에서 나타나는 유전자 발현을 RT-PCR과 ELISA로 확인한 결과이다.
도 13에 나타난 결과에 따르면, NAF와 비교했을 때, CAF에서 증가하는 유전자는 IL-6가 유일한 것임을 확인하였다. 특히, IL-6가 암세포가 아닌 CAF에서 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
[실시예 9] IL-6 발현 억제시에 위암 세포주에서 항암제 반응성 확인
IL-6의 발현이 억제된 CAF와 공동 배양시 항암제에 대한 저항성이 감소되는 것을 확인하였다.
이를 위하여, IL-6에 대한 단일클론항체(Anti-IL6R AB, Sino Biological에서 구입)를 400ng/ml 또는 800ng/ml의 농도로 배지에 투여하여 IL-6 신호 전달 억제시 항암제 반응성을 확인하였으며, 대조 실험으로 IgG에 대한 항체 (400 ng/mg 또는 800ng/ml)의 효과도 확인하였다.
도 14는 본원의 일 실시예에 따른 암세포주에서 CAF-CM의 유무, 단일클론항체의 유무, lgG의 유무에 따른 세포활성도를 나타낸 결과이다.
도 14에 나타난 결과에 따르면, 단일클론항체로 IL-6를 억제시켰을 때, 항암제인 5-FU 및 시스플라틴(cisplatin)의 투여 시 암세포주인 MKN-1 및 MKN-45의 세포활성도가 감소하는 것을 확인하였다. 구체적으로, MKN-45에서 단일클론항체의 농도가 800ng/ml일 때 암세포주인 MKN-45의 세포 활성도가 감소하는 반면, lgG에 대한 항체의 농도가 증가했을 때, 암세포주인 MKN-45의 세포 활성도가 변하지 않았다. 즉, 단일클론항체가 IL-6를 효과적으로 억제시키며, 상기 IL-6를 억제시킴에 따라서 항암제의 효과가 상승하여 암세포주의 세포 활성도가 감소하는 것을 확인하였다.
[실시예 10] CAF에서 생성되는 세포외 기질 관련 유전자의 항암제에 대한 반응 확인
CAF에서 주로 생성되는 세포 외 기질 관련 유전자의 증가 유무에 따른 항암제 반응을 확인하였다.
도 15는 본원의 일 실시예에 따른, 수술 전 항암치료를 받은 위암 환자들의 항암 치료 전 생검 조직에서의 유전자 발현의 차이를 엔카운터(nCounter)방법으로 분석한 결과이다.
도 15에 나타난 결과에 따르면, IL-6을 비롯한 CAF에서 주로 생성되는 세포 외 기질 관련 유전자의 증가 시 항암제에 대한 반응이 감소하는 것을 확인하였다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

  1. 인터루킨-6 의 발현을 억제할 수 있는 siRNA; 인터루킨-6 에 특이적으로 결합하는 항체; 인터루킨-6 에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 억제제를 유효성분으로 포함하는, 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물에 있어서,
    상기 위암은 항암제 저항성에 관여하는 위암 내 기질 조직의 주요성분인 암관련섬유모세포(cancer-associated fibroblasts; CAFs)를 포함하는 것이고,
    상기 위암은 상기 암관련섬유모세포에서 분비된 상기 인터루킨-6 에 의해 항암제 내성을 갖는 것을 포함하는 것이고,
    상기 암관련섬유모세포는 암 또는 악성종양 주변을 둘러싸고 있는 조직에 존재하는 것인, 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항암제는 5-FU, 악템라, 독소루비신, 파클리탁셀, 마이토마이신, 도세탁셀, 시스플라틴, 이리노테칸, 에포토사이드, 카페시타빈, 옥살리플라틴, 이들의 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 위암용 항암제의 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물.
  3. 암관련섬유모세포를 포함하는 위암 조직 또는 암관련섬유모세포와 혼합된 위암 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
    상기 처리한 위암 조직 또는 위암 세포주에서 인터루킨-6 의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
    처리하지 않은 대조군과 비교하여 인터루킨-6 의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 감소시키는 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하고,
    상기 위암은 항암제 저항성에 관여하는 위암 내 기질 조직의 주요성분인 암관련섬유모세포를 포함하는 것이고,
    상기 위암은 상기 암관련섬유모세포에서 분비된 상기 인터루킨-6 에 의해 항암제 내성을 갖는 것을 포함하는 것이고,
    상기 암관련섬유모세포는 암 또는 악성종양 주변을 둘러싸고 있는 조직에 존재하는 것인, 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 인터루킨-6 mRNA 의 수준은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것인, 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 인터루킨-6 단백질의 발현은 웨스턴 블랏(Western Blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것인, 위암 개선 또는 치료용 항암 보조제의 스크리닝 방법.
KR1020200063587A 2017-05-16 2020-05-27 항암 치료 효과 증진용 약학 조성물 KR20200062154A (ko)

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