KR20200058425A - 세포 배양 수확물에서의 디술피드 결합의 환원 방지 방법 - Google Patents

세포 배양 수확물에서의 디술피드 결합의 환원 방지 방법 Download PDF

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바이엘 헬쓰케어 엘엘씨
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Abstract

본 개시내용은 재조합 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드 중의 디술피드 결합의 환원 방지 방법이며, 발효 후, 재조합 숙주 세포의 수확물 용액에 포스페이트를 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 중의 디술피드 결합이 비-환원으로 유지되는 것인 방법에 관한 것이다.

Description

세포 배양 수확물에서의 디술피드 결합의 환원 방지 방법
생물제약 산업은 세포 배양을 사용하여 다양한 치료용 단백질들을 생산하고 있다. 원핵생물 및 진핵생물 모두를 포함한 다양한 세포 유형들이 재조합 치료용 단백질을 발현시키는 데에 사용될 수 있다. 생물제약 산업은 포유동물 세포에 크게 의존하는데, 적정하게 폴딩되고 번역-후 변형된 단백질을 생성시키는 그의 능력에 기인한다. 치료용 단백질을 제조하는 것은 통상적으로 생물반응기에서 세포를 배양하는 것으로 시작한다. 최적의 세포 성장 및 단백질 생산을 보장하기 위하여, 다양한 영양소 및 공정 파라미터들이 모니터링된다. 치료용 단백질은 통상적으로 분비되며, 그에 따라 단백질을 수확하는 데에 있어서의 첫 번째 단계는 세포를 제거하는 것이다. 생물반응기에서 그리고 세포 제거 동안, 세포는 용해되어, 재조합 단백질을 변경시키거나 분해할 수 있는 성분들을 방출할 수 있다. 예를 들어, 수확물 중 효소 및 기타 성분들은 디술피드 결합을 환원시킬 수 있다. 무손상인 디술피드 결합은 단백질 구조 및 기능을 유지하는 데에 중요하기 때문에, 디술피드 환원의 방지 방법은 대단히 중요하다.
[발명의 개요]
실시양태들은 재조합 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드 중의 디술피드 결합의 환원 방지 방법이며, 발효 후, 재조합 숙주 세포의 수확물 용액에 포스페이트를 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 중의 디술피드 결합이 비-환원으로 유지되는 것인 방법을 제공한다.
통상의 기술자는 하기하는 도면이 예시 목적만을 위한 것임을 알고 있을 것이다. 어떠한 방식으로도, 도면으로 본 교시 또는 청구범위의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
도 1은 프로젝트 1 수확물 (IgG2를 발현하는 CHOK1-SV 세포) 및 가변 농도의 나트륨 포스페이트, pH 7.0을 사용한 디술피드 환원 검정을 나타낸다.
도 2는 프로젝트 2 수확물 (IgG1을 발현하는 CHO-M 세포) 및 가변 농도의 나트륨 포스페이트, pH 7.0을 사용한 디술피드 환원 검정을 나타낸다.
도 3(a)는 항체 환원을 방지하기 위하여 TFPI 수확물에 첨가된 다양한 포스페이트 농도를 나타낸다.
도 3(b)는 항체 환원을 방지하기 위하여 TFPI 수확물에 첨가된 다양한 포스페이트 농도에 있어서의 동일한 결과를 보여주는 실험 3(a)의 반복을 나타낸다.
본 개시내용은 폴리펩티드의 디술피드 결합의 환원 방지와 관련된 방법을 제공한다.
정의
적절할 경우, 단수로 사용되는 용어는 복수도 포함하게 되며, 그 반대도 마찬가지이다. 하기에서 제시되는 소정의 정의가 본원에 참조로 포함되는 임의의 문서를 포함한 임의의 다른 문서에서의 그 단어의 용도와 상충하는 경우, (예를 들면 그 용어가 원래 사용되는 문서에서) 명백하게 반대의 의미가 의도되지 않는 한, 본 명세서 및 그 관련 청구범위를 해석한다는 목적상 하기에서 제시되는 정의가 항상 우선해야 한다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에서의 "단수"의 사용은 달리 언급되거나 "하나 이상"의 사용이 명백하게 부적절하지 않은 한, "하나 이상"을 의미한다. "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함되다(include)", "포함되다(includes)" 및 "포함한(including)"의 사용은 호환가능하며, 제한되지 않는다. 예를 들어, "포함한"이라는 용어는 "포함하나, 제한되지는 않는"을 의미해야 한다.
본원에서 사용될 때의 "TFPI"라는 용어는 세포에 의해 자연상에서 발현되어 원형질에 존재하는 해당 형태 TFPI의 임의의 변이, 동형 및/또는 종 상동체를 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "TFPI"라는 용어는 본원에서 사용될 때의 TFPI의 활성화된 형태를 지칭하며, "항체"는 완전 항체, 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉 "항원-결합 부분") 또는 단일 사슬을 지칭한다. 상기 용어는 자연상에서 발생하거나 정상적인 이뮤노글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성되는 전장 이뮤노글로불린 분자 (예컨대 IgG 항체), 또는 특이적 결합 활성을 유지하는 항체 단편과 같은 이뮤노글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분을 포함한다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 전장 항체에 의해 인식되는 동일 항원과 결합한다. 예를 들어, 항-TFPI 모노클로날 항체 단편은 TFPI의 에피토프에 결합한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); (vii) 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 카파 바디 (예컨대 문헌 [Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57] 참조); (viii) 낙타류 IgG; 및 (ix) IgNAR가 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되기는 하지만, 재조합 방법을 사용하면, 그들을 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가의 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬이 될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 그들이 연결될 수 있다 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려져 있음; 예컨대 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 그와 같은 단일 사슬 항체 역시 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄하고자 한다. 이러한 항체 단편들은 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있는 통상적인 기술을 사용하여 수득되며, 무손상 항체에서와 동일한 방식으로 효용에 대하여 단편이 분석된다.
또한, 항원 결합 단편은 항체 모방체로도 포괄될 수 있을 것으로 생각된다. 본원에서 사용될 때의 "항체 모방체" 또는 "모방체"라는 용어는 항체와 유사한 결합을 나타내나 더 작은 대안적인 항체 또는 비-항체 단백질인 단백질을 의미한다. 그와 같은 항체 모방체는 스캐폴드에 포함될 수 있다. "스캐폴드"라는 용어는 재단된 기능 및 특징을 가지는 새로운 생성물의 조작을 위한 폴리펩티드 플랫폼을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "항-TFPI 항체"라는 용어는 그의 에피토프 및 헤파린 연관 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 생체 내에서 TFPI의 에피토프에 결합되는 경우, 본원에서 개시되는 항-TFPI 항체는 혈액 응고 연속단계의 1종 이상 국면을 증대시킨다.
본원에서 사용될 때, "결합을 억제하다" 및 "결합을 차단하다" (예컨대 TFPI에 대한 TFPI 기질 결합의 억제/차단을 지칭함)라는 용어는 호환가능하게 사용되며, 그의 기질과 함께하는 단백질의 부분적 및 완전한 억제 또는 차단 모두, 예컨대 적어도 약 10 %, 약 20 %, 약 30 %, 약 40 %, 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 % 또는 약 100 %만큼의 억제 또는 차단을 포괄한다. 본원에서 사용될 때, "약"은 표시되는 숫자 값의 +/- 10 %를 의미한다.
TFPI에 대한 TFPI 기질 결합의 억제 및/또는 차단과 관련하여, 억제 및 차단이라는 용어는 또한 항-TFPI 항체와 접촉되어 있지 않은 TFPI와 비교하였을 때의 항-TFPI 항체와 접촉되어 있는 경우에서의 생리학적 기질에 대한 TFPI 결합 친화도의 임의의 측정가능한 감소, 예컨대 적어도 약 10 %, 약 20 %, 약 30 %, 약 40 %, 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 % 또는 약 100 %만큼의 그의 기질과의 TFPI 상호작용의 차단을 포함한다.
본원에서 사용될 때의 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이라는 용어는 단일 분자 조성을 가지는 항체 분자들의 조제물을 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일한 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 이에 따라, "인간 모노클로날 항체"라는 용어는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 가지는, 단일한 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 상기 인간 항체는 인간 생식계열 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예컨대 시험관 내에서의 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 유도된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "단리된 항체"는 다른 항원 특이성을 가지는 항체를 포함한 다른 생물학적 분자가 실질적으로 없는 항체를 지칭하고자 하는 것이다 (예를 들어, TFPI에 결합하는 단리된 항체에는 TFPI가 아닌 다른 항원에 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 건조 중량 기준 적어도 약 75 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 %, 약 97 %, 약 99 %, 약 99.9 % 또는 약 100 % 순수하다. 일부 실시양태에서, 순도는 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석과 같은 방법에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 인간 TFPI의 에피토프, 동형 또는 변이에 결합하는 단리된 항체는 예컨대 다른 종 (예컨대 TFPI 종 상동체)으로부터 유래하는 다른 관련 항원에 대하여 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체에는 다른 세포성 재료 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본원에서 사용될 때, "특이적 결합"은 예정된 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 통상적으로, "특이적 결합"을 나타내는 항체는 적어도 약 10-5 M-1의 친화도로 항원에 결합하며, 무관한 항원 (예컨대 BSA, 카세인)에 대한 그의 결합 친화도에 비해 더 높은, 예를 들면 적어도 2-배 더 큰 친화도로 그 항원에 결합한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대하여 특이적인 항체"라는 구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 호환가능하게 사용된다. 본원에서 사용될 때, "최소한의 결합"이라는 용어는 특정 항원에 결합하지 않고/거나 그에 대하여 낮은 친화도를 나타내는 항체를 지칭한다. 통상적으로, 항원에 대하여 최소한의 결합을 나타내는 항체는 약 102 M-1 미만인 친화도로 그 항원에 결합하며, 무관한 항체에 그것이 결합하는 것에 비해 더 높은 친화도로는 예정된 항체에 결합하지 않는다.
본원에서 사용될 때, IgG 항체와 같은 항체에 대한 "높은 친화도"라는 용어는 적어도 약 10-7 M, 적어도 하나의 실시양태에서는 적어도 약 10-8 M, 일부 실시양태에서는 적어도 약 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 이상, 예컨대 1013 M-1 이상까지의 결합 친화도를 지칭한다. 그러나, "높은 친화도"의 결합은 다른 항체 동형에 대해서는 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 동형에 대한 "높은 친화도"의 결합은 적어도 약 107 M-1의 결합 친화도를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "동형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예컨대 IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
"상보성-결정 영역" 또는 "CDR"은 결합되는 항원의 3-차원 구조에 대하여 상보성인 N-말단 항원-결합 표면을 형성하는, 항체 분자의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 내 3개 초가변 영역들 중 하나를 지칭한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터 진행하여, 이러한 상보성-결정 영역들은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"로 표시된다 (문헌 [Wu TT, Kabat EA, Bilofsky H, Proc Natl Acad Sci U S A. 1975 Dec;72(12):5107] 및 [Wu TT, Kabat EA, J Exp Med. 1970 Aug 1;132(2):211]). CDR은 항원-항체 결합에 연관되는데, CDR3가 항원-항체 결합에 특이적인 고유 영역을 포함하고 있다. 이에 따라, 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 영역들을 포함하는 6개의 CDR를 포함할 수 있다. "에피토프"라는 용어는 항체가 거기에 특이적으로 결합하거나 그와 상호작용하는 항원의 구역 또는 영역을 지칭하며, 일부 실시양태에서는 항원이 항체와 물리적 접촉 상태에 있는 곳을 표시한다. 반대로, "파라토프"라는 용어는 항원이 특이적으로 결합하는 항체의 구역 또는 영역을 지칭한다. 경쟁 결합을 특징으로 하는 에피토프는 상응하는 항체의 결합이 상호 배제적인 경우, 즉 하나의 항체의 결합이 또 다른 항체의 동시적인 결합을 배제하는 경우, 중첩되는 것으로 지칭된다. 항원이 상응하는 두 항체의 결합을 동시에 수용할 수 있는 경우, 에피토프는 개별성인 (독자성인) 것으로 지칭된다.
본원에서 사용될 때의 "경쟁 항체"라는 용어는 본원에서 기술되는 바와 같은 TFPI에 대한 항체로서 대략, 실질적으로 또는 본질적으로 동일하거나 심지어는 동일한 에피토프에 결합하는 항체들을 지칭한다. "경쟁 항체"에는 중복성인 에피토프 특이성을 가지는 항체들이 포함된다. 경쟁 항체들은 예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 항체와 TFPI에의 결합에 대하여 효과적으로 경쟁할 수 있다. 일부 실시양태에서, 경쟁 항체는 본원에서 기술되는 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 경쟁 항체는 본원에서 기술되는 항체와 동일한 에피토프 특이성을 가지고 있다.
본원에서 사용될 때, "보존성 치환"은 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능 상실을 초래하지 않는, 유사한 생화학적 특성을 가지는 아미노산을 대신한 1종 이상 아미노산의 치환을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. "보존성 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기에 의해 아미노산 잔기가 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기들의 계열에 대해서는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이러한 계열에는 염기성 측쇄 (예컨대 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예컨대 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예컨대 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예컨대 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예컨대 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예컨대 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가지는 아미노산들이 포함된다.
본 개시내용의 항체는 항원 결합 활성을 여전히 유지하는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 가질 수 있다.
핵산 및 폴리펩티드에 있어서, "실질적인 상동성"이라는 용어는 2종의 핵산 또는 2종의 폴리펩티드, 또는 이들의 정해진 서열이 최적으로 정렬하여 비교하였을 때 적절한 뉴클레오티드 또는 아미노산 삽입 또는 결실을 포함하여 뉴클레오티드 또는 아미노산 중 적어도 약 80 %에서, 보통은 뉴클레오티드 또는 아미노산 중 적어도 약 85 %, 일부 실시양태에서는 약 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 또는 95 %, 적어도 하나의 실시양태에서는 적어도 약 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.1 %, 99.2 %, 99.3 %, 99.4 % 또는 99.5 %에서 동일하다는 것을 표시한다. 대안적으로, 핵산에 있어서의 실질적인 상동성은 가닥의 보체에 대하여 선택성인 혼성화 조건하에서 분절들이 혼성화하게 되는 경우에 존재한다. 역시 포함되는 것은 본원에서 언급되는 특정 핵산 서열 및 아미노산 서열에 대하여 실질적인 상동성을 가지는 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열이다. 2개 서열 사이의 % 동일성은 2개 서열의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다 (즉 % 상동성 = 동일한 위치의 수 / 총 위치 수 × 100). 2개 서열 사이에서의 서열들의 비교 및 % 동일성의 측정은 비제한적으로 벡터엔티아이(VectorNTI)™ (인비트로겐(Invitrogen) Corp. 사, 캘리포니아 칼스배드 소재)의 얼라인엑스(AlignX)™ 모듈과 같은 수학 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 얼라인엑스™의 경우, 다중 정렬의 디폴트 파라미터는 하기이다: 갭 개방 감점: 10; 갭 연장 감점: 0.05; 갭 분리 감점 범위: 8; 정렬 지연의 % 동일성: 40.
2개 서열 사이의 % 동일성은 2개 서열의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다 (즉 % 상동성 = 동일한 위치의 수 / 총 위치 수 × 100). 2개 서열 사이에서의 서열들의 비교 및 % 동일성의 측정은 비제한적으로 벡터엔티아이™ (인비트로겐 Corp. 사, 캘리포니아 칼스배드 소재)의 얼라인엑스™ 모듈과 같은 수학 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 얼라인엑스™의 경우, 다중 정렬의 디폴트 파라미터는 하기이다: 갭 개방 감점: 10; 갭 연장 감점: 0.05; 갭 분리 감점 범위: 8; 정렬 지연의 % 동일성: 40 (추가의 세부사항은 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEACommunities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html에 나와 있음).
포괄적 서열 정렬(global sequence alignment)로도 지칭되는 조회 서열 (본 개시내용의 서열)과 대상 서열 사이의 최고의 전체적 일치를 측정하는 또 다른 방법은 문헌 [Higgins et al., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191)]의 알고리즘을 바탕으로 하는 CLUSTALW 컴퓨터 프로그램 (문헌 [Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680])을 사용하여 측정될 수 있다. 서열 정렬에서, 조회 및 대상 서열은 모두 DNA 서열이다. 상기 포괄적 서열 정렬의 결과는 % 동일성이다. 쌍형식 정렬을 통하여 % 동일성을 계산하기 위하여 DNA 서열의 CLUSTALW 정렬에서 사용될 수 있는 파라미터는 하기이다: 행렬 = IUB, k-터플(tuple) = 1, 상부 대각선 수 = 5, 갭 감점 = 3, 갭 개방 감점 = 10, 갭 연장 감점 = 0.1. 다중 정렬의 경우, 하기의 CLUSTALW 파라미터들이 사용될 수 있다: 갭 개방 감점 = 10, 갭 연장 파라미터 = 0.05; 갭 분리 감점 범위 = 8; 정렬 지연의 % 동일성 = 40.
핵산은 전체 세포 중에, 세포 용해물 중에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 자연 환경에서 그것이 정상적으로 연관되는 다른 세포 구성요소로부터 정제 분리되었을 때, 핵산은 "단리"되거나, "실질적으로 순수해지는" 것이다. 핵산을 단리하기 위해서는, 하기와 같은 표준 기술이 사용될 수 있다: 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피.
본원에서 사용될 때, "약"이라는 용어는 제공되는 유닛 값의 +/- 10 %를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "실질적으로"라는 용어는 해당 특징 또는 특성의 전체적인 정도 또는 대략적인 정도를 나타내는 정성적인 조건을 지칭한다. 생물학 관련 기술분야 통상의 기술자는 생물학적 및 화학적 조성물 및 재료의 시험, 제조 및 저장에 영향을 주는 많은 변수들로 인하여, 그리고 생물학적 및 화학적 조성물 및 재료의 시험, 제조 및 저장에 사용되는 기기 및 장비에서의 본질적인 오차로 인하여, 생물학적 및 화학적 현상이 절대적인 결과를 있다 하더라도 극히 드물게 달성하거나 회피한다는 것을 알고 있을 것이다. 이에 따라, 본원에서 "실질적으로"라는 용어는 많은 생물학적 및 화학적 현상에서 본질적인 완전성의 잠재적 결핍을 표현하는 데에 사용된다.
[ 실시예 ]
실시예 1 - 재료
표준 제조 절차를 사용하여 세포 배양액을 제조하였다. 간략하게, 2 L 또는 5 L 유리 교반 탱크 생물반응기를 접종하기에 충분한 세포 수에 도달할 때까지 진탕 플라스크에서 항체를 발현하는 CHO 세포를 배양하였다. 접종 후, 용해 산소, pH, 온도 및 교반 속도를 조절하고, 정확도를 보장하기 위하여 매일 샘플을 분석하였다. 접종 2일 후부터 시작하여 연속적으로 농축 영양소 공급물을 첨가하고, 필요할 경우 글루코스 용액을 첨가함으로써 충분한 영양소를 제공하였다. 접종 14일 후에 세포 배양액을 수확하였다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 시약은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 사로부터 입수하였다. 맵셀렉트 슈어(MabSelect Sure) 수지는 GE 헬스케어 라이프 사이언시즈(Healthcare Life Sciences) 사로부터 입수하였다.
실시예 2 - 정화된 수확물 제조
정화된 수확물을 생성시키기 위하여, PDK5 심층 필터 (폴(Pall) 사) 후 이어지는 멸균 0.2 uM 필터 (폴 사)를 사용하여 수확된 세포 배양액으로부터 세포를 제거하였다.
실시예 3 - 소규모 환원 검정
수확된 세포 배양액을 질소가 충전된 글로브 백(glove bag) (아트모스백(Atmosbag), 시그마(Sigma) 사)에 위치시켰다. 40 mL의 수확물을 얼음상에서 50 mL 원추형 튜브에 붓고, 20분 동안 냉각하였다. 다음에, 수확물을 얼음상에서 파워 3으로 60초 동안 초음파처리하였다 (소닉 디스멤브레이터(Sonic Dismembrator) 모델 100, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) 사). 이와 같은 구성은 대략 99 %의 세포 용해를 초래하였다. 원추형 튜브를 긴밀하게 폐쇄하고, 백으로부터 꺼낸 후, 4000x g로 15분 동안 원심분리하였다. 다음에, 튜브를 다시 백에 넣고, 질소를 재-퍼징하였다. 용해된 세포 상청액을 0.45 um 멸균 필터 (밀리포어(Milipore) 사)로 여과한 후, 96 심층-웰 플레이트로 옮겼다. 산소에의 노출 없이 실온에서 용해된 세포 상청액을 인큐베이팅하였다. 각 시점에, 17.4 uL 250 mM NEM을 사용하여 200 uL의 샘플을 급랭시킴으로써, 모든 유리 티올을 캡핑하였다. 급랭된 샘플을 정제 및/또는 분석시까지 4 ℃에서 저장하였다. 억제제를 시험하기 위하여, 인큐베이션 개시시에 3 M 나트륨 포스페이트, pH 7.0의 모용액을 용해된 세포 상청액에 첨가함으로써, 0 내지 190 mM 범위의 농도를 달성하였다. 억제제 첨가 0, 24 및 48시간 후에, 샘플을 채취하여 급랭시켰다.
실시예 4 - 배치 단백질 A 정제
맵셀렉트 슈어 친화성 수지를 사용하여 수확된 세포 배양액으로부터 항체를 정제하였다. 평형화 완충제는 50 mM 트리스(Tris), 50 mM NaCl, pH 7.0이었다. 세척 완충제는 50 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 5.2이었다. 용리 완충제는 50 mM 나트륨 아세테이트, pH 3.7이었으며, 중화 완충제는 1 M 트리스, pH 8.0이었다. 96 웰 필터 플레이트에서, 20 uL의 수지 슬러리 (평형화 완충제 중 50 % v/v)를 170 uL의 급랭된 수확된 세포 배양액과 합쳤다. 플레이트를 30분 동안 인큐베이팅한 다음, 96 웰 플레이트를 원심분리하여 저부에 유통물(flow-through)을 포획한 후, 그것을 폐기하였다. 모든 원심분리 단계는 4000x g로 10분 동안 수행하였다. 120 uL의 세척 완충제를 사용하여 수지를 세척하고, 원심분리한 다음, 120 uL의 평형화 완충제를 사용하여 세척하고, 다시 원심분리하였다. 2회의 세척 단계 후, 50 uL의 용리 완충제를 필터 플레이트에 첨가하고, 3분 동안 인큐베이팅하였다. 28 uL의 중화 완충제를 사용하여 깨끗한 96 웰 플레이트를 준비하고, 용출액을 수집하는 데에 사용하였다. 위 아래로 피펫팅하는 것에 의해 항체 용액을 혼합한 다음, 분석시까지 -70 ℃로 저장하였다.
실시예 5 - 캘리퍼 검정
캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GX II를 사용하여 모세관 전기영동 측정치를 획득하였다. 샘플 제조는 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 랩칩 GX 소프트웨어를 사용하여 디지털 젤-유사 이미지를 생성시켰다.
결과 및 논의
무산소 환경에서 수확된 세포 배양액을 완전히 용해시키는 것에 의해, 환원에 대해 연구하였다. 이는 세포내 환원성 성분의 방출을 최대화하였으며, 산소 간섭을 최소화하고, 산소에 의한 디술피드의 재-산화를 방지하였다. 이는 환원 억제제가 "최악-경우" 또는 가능한 가장 환원성인 조건하에서 시험되는 것을 가능하게 하였다. 용해된 세포액으로부터 항체를 정제하는 것, 및 크기를 바탕으로 단백질을 분리하며 사슬간 디술피드 결합 절단을 검출할 수 있는 비-환원 모세관 전기영동을 사용하여 그것을 분석하는 것에 의해 시간 경과에 따라 항체 디술피드 환원을 모니터링하였다.
디술피드 환원을 방지하는 포스페이트의 효과성을 시험하기 위하여, 프로젝트 1 (IgG2를 발현하는 CHOK1-SV 세포) 및 프로젝트 2 (IgG1을 발현하는 CHO-M 세포)의 혐기성인 용해된 세포 배양 수확물에 다양한 농도의 나트륨 포스페이트, pH 7을 첨가하고, 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 6, 24 및 48시간 동안 환원을 방지하는 포스페이트의 최소 농도를 하기 표 1에 요약하였다. 프로젝트 2에서 환원을 방지하는 데에 더 높은 포스페이트 농도가 요구되었다. 이론적으로, 이는 IgG1 분자가 IgG2 분자에 비해 환원에 더 민감한 것, 또는 두 가지 세포주에서의 환원 효소 발현에 있어서의 차이에 기인한 것일 수 있다. 이와 같은 검정은 최고 환원성 (모든 세포내 환원성 성분이 방출되고 산소는 도입되지 않았음)하에서 요구되는 억제제의 농도를 측정하였다. 더 실제적인 정화된 수확물 조건하에서 환원을 방지하는 데에는 더 낮은 농도로 충분할 수 있다. 더 높은 포스페이트 농도 역시 효과적이다.
Figure pct00001
저렴하며, 비-독성이고, 단백질 A 크로마토그래피 동안의 정제 과정에서 종종 이미 사용되어 온 것을 볼 때, 포스페이트는 효과적인 접근법이다. 보통 완충제로 사용되기 때문에, 그것이 효소 억제제로 여겨지지는 않는데, 그것이 본 발명을 예상치 못한 이익 및 구현이 되게 한다.
상당히 놀랍고도 예상외로, 수확된 세포 배양액 (HCCF)에의 나트륨 포스페이트의 첨가에 의해 항체 디술피드 환원이 방지될 수 있다는 것이 발견되었다. 본 발명은 예상외로 (질소로 CO2를 탈기 제거한 후) 일부 디술피드 환원 실험의 pH를 조절하기 위하여 완충제를 첨가할 때 발견되었다. 원래는 포스페이트를 사용할 예정이 아니었는데 (그것이 pH 7용 완충제로서 유용할 수 있다 할지라도), 그것이 일부 효소 반응을 억제하는 것으로 알려져 있었기 때문이다. 낮은 농도 (40 mM)는 환원을 방지하지 않은 반면, 높은 농도 (150 mM)는 환원을 완전히 방지하였다 (도 3(a) 참조). 동일한 TFPI 수확물 배치를 사용하여 실험을 여러번 반복하였다 (도 3(b) 참조). 이론적으로 그것은 환원에 기여하는 수확물 중 효소를 억제하는 것에 의해 작용할 수 있다.
실험 A:
0, 40 mM 및 150 mM의 포스페이트 농도를 달성하도록 나트륨 포스페이트의 농축 용액을 TFPI 수확물에 첨가하였다 (표 2 참조). 다음에, (산소 억제를 방지하기 위하여) 수확물을 질소하에서 24시간 동안 유지하였다. 질소 유지 후, 항체를 정제하고, 모세관 전기영동을 사용하여 디술피드 환원을 분석하였다.
Figure pct00002
포스페이트 용액은 나트륨 포스페이트, 칼륨 포스페이트 등일 수 있다. 무수 포스페이트가 첨가될 수도 있다. 포스페이트는 세포 배양 배지, 수확-전 세포 배양액 또는 수확된 세포 배양액에 첨가될 수 있다. 그것은 포유동물 세포, 세균, 효모 등에서 생성되는 단백질과 작용해야 한다. 그것은 항체만이 아니라 디술피드 결합이 있는 어떠한 단백질에 대해서도 작용해야 한다. 포스페이트는 환원을 방지하는 선행 기술 (금속을 첨가하는 것, 글루타티온을 첨가하는 것, 공기/O2 스파징 등)에 비해 커다란 개선인데, 그것이 저렴하며, 비-독성이고, 효과적이며, 항체 제조 과정의 어딘가에서 이미 사용되고 있기 때문이다 (포스페이트 완충제는 보통 ProA 크로마토그래피시 사용됨). 그것이 이미 과정 중 다른 어딘가에서 사용되고 있기 때문에, 포스페이트는 항체에 유해하지 않다는 것을 알고 있다.
환원을 방지하기 위하여 금속을 첨가하는 것은 단백질 침전 (문헌 [Li, Osborne et al. 2012]), 산화 (문헌 [Li, Nguyen et al. 1995]; [Masaraw et al. 2009]) 및/또는 절단 (문헌 [Rustandi and Wang 2001], [Yan and Boyd 2011])을 유도하는 것에 의해 항체 안정성에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 공기 또는 산소를 사용하여 수확물을 스파징하는 것은 공기-액체 경계면에서 단백질 변성 및/또는 응집을 증가시킬 수 있다 (문헌 [Wiesbauer et al. 2013]; [Rudik et al. 2012]). 포스페이트는 (금속과 달리) 비-독성이기 때문에, 환자의 안전성에 대한 위험성이 없으며, 정화 연구를 필요로 하지 않는다. 또한, 특수화된 수확 탱크를 필요로 하는 스파징과 달리, 특별한 장비를 필요로 하지 않는다.
구체적인 실시양태 및 실시예들을 참조하여 본 발명의 실시양태를 기술하기는 하였지만, 본원에 첨부되는 청구범위의 진정한 기술사상 및 범주에서 벗어나지 않고도 다양한 변형 및 변화들이 이루어질 수 있으며 등가물들이 대체될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 명세서 및 실시예는 제한적인 의미보다는 예시적인 의미로 간주되어야 한다. 또한, 본원에 참조되는 모든 논문, 서적, 특허 출원 및 특허의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

Claims (16)

  1. 재조합 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩티드 중의 디술피드 결합의 환원 방지 방법이며, 발효 후, 재조합 숙주 세포의 수확물 용액에 포스페이트를 첨가하는 것을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 중의 디술피드 결합이 비-환원으로 유지되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 항체를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 생물학적으로 기능성인 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 진핵 세포를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 진핵 세포가 포유동물 세포를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 포스페이트를 10-1000 밀리몰 범위의 최종 용액을 구성하도록 수확물 용액에 첨가하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 포스페이트를 10-300 밀리몰 범위의 최종 용액을 구성하도록 수확물 용액에 첨가하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 포스페이트가 칼슘 포스페이트, 나트륨 포스페이트 및 칼륨 포스페이트로 이루어진 군에서 선택되는 포스페이트 염을 포함하는 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, IgG 항체를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, IgG 항체가 IgG2를 포함하는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, IgG 항체가 IgG1을 포함하는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, IgG 항체가 IgG4를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수확된 세포 배양액 (HCCF)으로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수확된 세포 배양액 (HCCF)으로부터 폴리펩티드를 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 포스페이트가
    (a) 5수화물 형태 또는 무수 형태이거나;
    (b) 10-1000 밀리몰의 농도로 첨가되거나;
    (c) 10-300 밀리몰의 농도로 첨가되거나;
    (d) 10-100 밀리몰의 농도로 첨가되거나; 또는
    (e) 상기 수확-전 배양액 또는 수확된 배양액 중의 포스페이트 농도의 적어도 약 2-배인 농도로 첨가되는 것인 방법.
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