KR20200048312A - Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same - Google Patents

Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same Download PDF

Info

Publication number
KR20200048312A
KR20200048312A KR1020180130275A KR20180130275A KR20200048312A KR 20200048312 A KR20200048312 A KR 20200048312A KR 1020180130275 A KR1020180130275 A KR 1020180130275A KR 20180130275 A KR20180130275 A KR 20180130275A KR 20200048312 A KR20200048312 A KR 20200048312A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
hyaluronic acid
million
culture
ubc
Prior art date
Application number
KR1020180130275A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR102489403B1 (en
Inventor
강대중
임종혁
안광민
김동주
Original Assignee
마이크로바이오주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마이크로바이오주식회사 filed Critical 마이크로바이오주식회사
Priority to KR1020180130275A priority Critical patent/KR102489403B1/en
Publication of KR20200048312A publication Critical patent/KR20200048312A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102489403B1 publication Critical patent/KR102489403B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C12R1/46—

Abstract

The present invention relates to a novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain which can produce polymer hyaluronic acid with an average molecular weight of 5 million Da or more, has sugar-resistant properties, and has high production capacity of the polymer hyaluronic acid. In addition, the polymer hyaluronic acid production capacity is excellent even at high temperature of above 40°C due to heat-resistant properties. Accordingly, the concern about contamination by other contaminants and additional processes are significantly reduced in an industrial scale mass cultivation process, thereby having a great economic value.

Description

신규한 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법{Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same}New Streptococcus genus UBC-U46 strain and method for producing hyaluronic acid using the same {Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same}

본 발명은 신규한 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주(기탁번호 : KCTC13556BP) 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a novel Streptococcus genus UBC-U46 strain (Accession No .: KCTC13556BP) and a method for producing hyaluronic acid using the same.

히알루론산(Hyaluronic acid(HA), Hyaluronan, (C14H20NNaO11)n (n>1000))은 생체에 존재하는 고분자로써 glycosaminoglycan 다당류이다. 그 구조는 D-glucuronic acid와 N-acetylglucosamine이 β-1,3 과 β-1,4 결합으로 반복적으로 연결된 구조를 띠고 있다. 수용성 물질이며 점도가 매우 높고 고탄성의 특성을 가지고 있으며 분자량은 1,000~10,000,000 daltons에 이르는 광범위한 직쇄의 다당류이다.Hyaluronic acid (HA), Hyaluronan, (C 14 H 20 NNaO 11 ) n (n> 1000)) is a polymer present in the living body and is a glycosaminoglycan polysaccharide. The structure has a structure in which D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine are repeatedly linked by β-1,3 and β-1,4 bonds. It is a water-soluble substance, has a very high viscosity, has high elasticity, and has a wide range of straight chain polysaccharides ranging from 1,000 to 10,000,000 daltons.

히알루론산은 보습효과가 강할 뿐만아니라, 일례로 엘라스틴이나 콜라겐이 세포사이를 원활하게 움직일 수 있도록 해주는 윤활제 역할을 한다. 물리적 마찰 상태에서 강력한 윤활 작용의 기능이 매우 우수하며 세균 등의 침입에 대한 보호 효과 등의 효능과 물성에 있어서 매우 바람직한 장점을 보유하고 있기 때문에 치료 영역에 필요한 적용증이 매우 많다. 고기능성 바이오폴리머인 히알루론산은 생체물질로서 다른 폴리머 물질과 달리 독성이 낮고 생분해성이 우수하여, 독성이나 부작용이 야기되는 합성 폴리머를 대체할 수 있는 대안으로 제시되고 있다. 이 같은 장점은 화장품이나 의약품으로써의 역할뿐만 아니라 의약부외품과 식품 그리고 각종 다양한 소재에까지 적용할 수 있기 때문에 히알루론산을 기반으로 하는 적용 분야는 계속 확대되고 있다. 현재까지 개발된 용도로는 일례로, 관절치료제, 관절지지제, 인공눈물, 안과수술보조제, 필러, 화장품 및 식품 등 다양한 방면으로 이용되고 있고(특허문헌 1 및 특허문헌 2), 관련 시장은 계속 확장되고 있다. 특히 이러한 용도의 급증은 노인인구의 증가로 인한 QOL(quality of life)에 대한 수요와 뷰티산업의 수요가 높아지는 것과 맥락을 같이 한다. Hyaluronic acid not only has a strong moisturizing effect, but also acts as a lubricant that allows elastin or collagen to move smoothly between cells, for example. Since the function of strong lubrication in the physical friction state is very excellent and possesses very desirable advantages in terms of efficacy and properties, such as a protective effect against invasion of bacteria, there are many applications required in the treatment area. Hyaluronic acid, a high-functional biopolymer, is a biomaterial and has low toxicity and excellent biodegradability, unlike other polymer materials, and has been suggested as an alternative to synthetic polymers that cause toxicity or side effects. Since these advantages can be applied not only as a cosmetic or pharmaceutical, but also as quasi-drugs, food, and various materials, the field of application based on hyaluronic acid continues to expand. Examples of applications developed so far include, for example, joint treatments, joint supporters, artificial tears, ophthalmic surgery aids, fillers, cosmetics, and foods in various fields (Patent Documents 1 and 2), and related markets continue It is expanding. In particular, the rapid growth of these uses coincides with the increasing demand for quality of life (QOL) due to the increase in the elderly population and the demand for the beauty industry.

히알루론산을 생산하는 방법은, 크게 히알루론산 보유 생체조직에서 추출하는 방법과 미생물에서 발효 생산하는 두 가지 방법이 있다. 먼저 생체 조직 추출법은 닭벼슬이나 탯줄 등의 조직으로부터 히알루론산을 추출, 분리 및 정제하는 과정을 통해 수득하는데(특허문헌 3 참조), 협잡물로서 콘드로이틴황산 등이 혼입되거나, 조직 내에 포함되는 히알루로니다아제 등에 의해 저분자량화되기 쉽고, 바이러스의 감염이나 조직의 유지 관리 및 회수 등의 번거로움과 오염, 불순물, 염증 반응 등의 많은 단점이 보고되고 있으며, 이에 따라 정제과정이 복잡하고 생산 비용이 많이 드는 등 생산방식에 경쟁력이 확보되기 어려운 실정이다.There are two methods for producing hyaluronic acid: extraction from living tissues with hyaluronic acid and fermentation from microorganisms. First, the bio-tissue extraction method is obtained through the process of extracting, separating and purifying hyaluronic acid from tissues such as chicken crest or umbilical cord (refer to patent document 3), which is mixed with chondroitin sulfate as a contaminant or hyaluronic contained in the tissue. It is easy to become low-molecular-weight by agonists, and has been reported a number of shortcomings such as viral infection, tissue maintenance and recovery, and many disadvantages such as contamination, impurities, and inflammatory reactions. Accordingly, the purification process is complicated and the production cost is high. It is difficult to secure competitiveness in production methods such as lifting.

이에 반해 미생물 발효를 통한 히알루론산 생산방법은 비교적 생산 비용 및 방법이 저렴한 장점이 있고, 히알루론산의 생산성과 생산되는 히알루론산의 분자량 및 품질이 일정하게 유지가능하여 상대적으로 용이하게 고품질의 원료 수득이 가능한 것으로 알려졌다. 이러한 장점에 의하여 미생물 배양 생산 방식이 많아지고 있으며, 특히 미생물 배양에 의해 조절되어 생산된 히알루론산의 분자량 범위에 따라서 개발 용도가 결정되는 것이 최근의 추세이다. On the other hand, the hyaluronic acid production method through microbial fermentation has the advantage of relatively low production cost and method, and the productivity of hyaluronic acid and the molecular weight and quality of the hyaluronic acid produced can be kept constant, making it easy to obtain high-quality raw materials relatively easily. It is said to be possible. Due to these advantages, the production method of microbial culture is increasing, and it is a recent trend that development uses are determined according to the molecular weight range of hyaluronic acid produced by being controlled by microbial culture.

하지만 현재까지 알려진 미생물 발효 방식에 의해 생산된 히알루론산들은 동물성 유래 소재(생체 조직)에 비해 분자량이 낮아서, 고분자의 히알루론산이 필요한 관절주사제 및 관절지지체, 성형필러, 안과용 백내장 수술용 제제로의 활용에는 제한이 있는 실정이다. 따라서 고분자량의 히알루론산(HA)을 생산하는 방법 및 이에 사용될 미생물에 대한 개발이 필요한 실정이다. However, hyaluronic acids produced by microbial fermentation methods known to date have a lower molecular weight than animal-derived materials (biological tissues), and thus are used as joint injections, joint supports, plastic fillers and ophthalmic cataract surgical preparations that require polymer hyaluronic acid. There is a limit to the utilization. Therefore, there is a need to develop a method for producing high molecular weight hyaluronic acid (HA) and microorganisms to be used therefor.

또한, 통상적으로 상기 미생물 배양법에서 기존 미생물들은 28℃ 내지 38℃정도의 온도에서 배양되어오고 있는데, 이때 다른 오염균이 함께 생육되는 등의 위험성이 존재하고 있는 실정이다. In addition, in the conventional microorganism culture method, conventional microorganisms have been cultivated at a temperature of about 28 ° C to 38 ° C. At this time, there is a risk that other contaminants grow together.

대한민국 등록특허 10-1027630Republic of Korea Registered Patent 10-1027630 대한민국 공개특허 10-2017-0126416Republic of Korea Patent Publication 10-2017-0126416 대한민국 등록특허 10-0577075Republic of Korea Patent Registration 10-0577075

이에 본 발명자들은 고분자량의 히알루론산(HA)을 고수율로 생산하기 위한 새로운 전략을 연구하던 중, 고분자 HA를 생산하면서도 내열성 및 내당성을 보유하는 신규한 스트렙토코커스 속 UBC-U46(Streptococcus sp. UBC-U46) 균주를 통해 고품질의 HA를 고수율로 생산 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors are studying a new strategy for producing high-molecular weight hyaluronic acid (HA) in high yield, while producing high-molecular HA, the new streptococcus genus UBC-U46 ( Streptococcus sp. UBC-U46) It was confirmed that high-quality HA can be produced with a high yield through the strain, and the present invention was completed.

따라서 본 발명의 목적은, 스트렙토코커스 속 UBC-U46 (기탁번호 KCTC13556BP) 균주를 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a strain of UBC-U46 (Accession No. KCTC13556BP) of the genus Streptococcus.

본 발명의 다른 목적은, 상기 균주를 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing hyaluronic acid, comprising culturing the strain in a medium containing a carbon source and a nitrogen source.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 균주를 포도당, 만니톨, 소이펩톤 및 효모추출물을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing hyaluronic acid, comprising culturing the strain in a medium containing glucose, mannitol, soypeptone, and yeast extract.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스트렙토코커스 속 UBC-U46 (기탁번호 KCTC13556BP) 균주를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a strain of UBC-U46 (Accession No. KCTC13556BP) of the genus Streptococcus.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 균주를 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for producing hyaluronic acid, comprising culturing the strain in a medium containing a carbon source and a nitrogen source.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 균주를 포도당, 만니톨, 소이펩톤 및 효모추출물을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산 방법을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for producing hyaluronic acid, comprising culturing the strain in a medium containing glucose, mannitol, soypeptone, and yeast extract.

이하 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 스트렙토코커스 속 UBC-U46 (기탁번호 KCTC13556BP) 균주를 제공한다. The present invention provides a strain of UBC-U46 (Accession No. KCTC13556BP) of the genus Streptococcus.

본 발명의 스트렙토코커스 속 UBC-U46(Streptococcus sp. UBC-U46) 균주는 내열성을 보유하는 것을 특징으로 한다. Streptococcus genus UBC-U46 ( Streptococcus sp. UBC-U46) strain is characterized by retaining heat resistance.

일반적으로 Streptococcus 속 균들의 최적 성장 온도(optimal growth temperature)는 24-48 시간 배양 기준 37℃인 것으로 알려졌다(Susanne Lindahl, Streptococcus equi subsp. equi and Streptococcus equi subsp. zooepidemicus - Upper Respiratory Disease in Horses and Zoonotic Transmission to Humans, Doctoral Thesis Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala 2013 ISSN 1652-6880, p.30). In general, the optimal growth temperature (optimal growth temperature) of Streptococcus spp is known to be 24-48 hours incubation reference 37 ℃ (Susanne Lindahl, Streptococcus equi subsp equi and Streptococcus equi subsp zooepidemicus -.. Upper Respiratory Disease in Horses and Zoonotic Transmission to Humans, Doctoral Thesis Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala 2013 ISSN 1652-6880, p.30).

이에 반해 본원 발명의 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주는 이의 최적 성장 온도의 범위가 28℃ 내지 48℃로 그 범위가 넓은 것이 특징이다. 즉, 본 발명의 신균주는 40℃ 내지 48℃에서 내열성을 지니는 것을 특징으로 한다. 특히 바람직하게 40℃ 내지 45℃의 고온에서 생육(증식)이 우수할 뿐만아니라 고분자 히알루론산 생산능이 우수한 것이 특징이다.On the other hand, the UBC-U46 strain of the genus Streptococcus of the present invention is characterized by a wide range of its optimum growth temperature ranging from 28 ° C to 48 ° C. That is, the new strain of the present invention is characterized by having heat resistance at 40 ℃ to 48 ℃. Particularly, not only is it excellent in growth (proliferation) at a high temperature of 40 ° C to 45 ° C, it is also characterized by excellent polymer hyaluronic acid production capacity.

이러한 내열성 특징으로 인해서, 본원 발명의 균주를 이용하여 히알루론산 생산을 위한 배양을 할 시 40℃ 이상의 고온에서 배양을 함으로써 통상 28℃~38℃에서 잘 자라는 다른 오염균 생육에 대한 위험을 제거할 수 있어 산업적인 이용에서 경제적으로 매우 유리하다.Due to these heat-resistant characteristics, when culturing for hyaluronic acid production using the strain of the present invention, by culturing at a high temperature of 40 ° C or higher, the risk of growth of other contaminants that normally grow well at 28 ° C to 38 ° C can be eliminated. It is very economically advantageous for industrial use.

본 발명의 균주를 언급하면서 사용되는 용어‘내열성’은 당업계의 통상적인 방법(예를들어 진탕배양(예컨대, 50mL 배양 플라스크 이용), 발효기(예컨대, 교반기 및 자동 pH 조절기가 장착된 5L 발효기)를 이용한 방법 등)으로 배양될 시 40℃ 내지 48℃의 온도에서 증식 또는/및 고분자 HA 생산능이 현저함을 나타내는 배양학적 특성을 의미한다. 구체적으로 본 발명의 균주는 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃ 또는 48℃의 온도에서 우수한 증식능을 보일 뿐만아니라 고분자 HA 생산능을 가진다. 본 발명의 상기 균주는 바람직하게 온도 40℃ 내지 45℃, 보다 바람직하게는 온도 42℃ 내지 45℃의 온도에서 증식 또는/및 고분자 HA 생산능이 우수하다.The term 'heat resistance' used when referring to the strain of the present invention is a conventional method in the art (for example, shaking culture (for example, using a 50 mL culture flask), a fermenter (for example, a 5L fermentor equipped with a stirrer and an automatic pH adjuster). Means a culture characteristic that shows proliferation or / and high polymer HA production capacity at a temperature of 40 ° C to 48 ° C. Specifically, the strain of the present invention not only shows excellent proliferation ability at temperatures of 40 ° C, 41 ° C, 42 ° C, 43 ° C, 44 ° C, 45 ° C, 46 ° C, 47 ° C or 48 ° C, but also has polymer HA production capacity. The strain of the present invention is preferably at a temperature of 40 ° C to 45 ° C, more preferably at a temperature of 42 ° C to 45 ° C, and has excellent ability to proliferate or / and polymer HA.

또한 본 발명의 균주는 내당성을 보유하는 것을 특징으로 한다. 미생물을 대량 배양할시, 회분배양(batch culture)을 주로 하는 산업구조상 고농도의 포도당을 첨가할 수 있다는 것은 효율적으로 히알루론산의 고생산이 가능하다는 것을 의미하는 것으로, 공정효율에 장점을 지닌다. In addition, the strain of the present invention is characterized by having glucose tolerance. When a microorganism is cultivated in large quantities, being able to add high concentration of glucose in an industrial structure mainly for batch culture means that high production of hyaluronic acid can be efficiently performed, and it has an advantage in process efficiency.

본 발명의 균주를 언급하면서 사용되는 용어‘내당성’은 당업계의 통상적인 방법(예를들어 진탕배양(예컨대, 50mL 배양 플라스크 이용), 발효기(예컨대, 교반기 및 자동 pH 조절기가 장착된 5L 발효기)를 이용한 방법 등)으로 배양될 시 포도당 100g/L 내지 250g/L의 농도, 바람직하게는 포도당 100g/L 내지 200g/L의 농도, 보다 바람직하게는 포도당 150g/L 내지 200g/L의 농도에서 지속된 생육(증식)을 나타내는 배양학적 특성을 의미한다. 즉, 포도당을 기준으로 할 때, 본 발명의 신균주는 포도당 100g/L 내지 250g/L의 농도에서 내당성을 가지는 것을 특징으로 한다. The term 'glucose' used when referring to the strain of the present invention is a conventional method in the art (for example, shaking culture (for example, using a 50 mL culture flask), a fermenter (for example, a 5L fermentor equipped with an agitator and an automatic pH adjuster). )), When cultured with a concentration of 100 g / L to 250 g / L of glucose, preferably at a concentration of 100 g / L to 200 g / L of glucose, more preferably at a concentration of 150 g / L to 200 g / L of glucose Refers to the cultivated property that indicates sustained growth (proliferation). That is, when based on glucose, the new strain of the present invention is characterized by having glucose tolerance at a concentration of 100 g / L to 250 g / L of glucose.

본 명세서에서 용어‘지속된 생육’은 외부 스트레스(예를들어 고농도의 당(포도당) 또는 높은 배양 온도)의해 미생물이 사멸되지 않고 생장의 중단 없이 계속적인 증식을 하는 배양학적 특성을 의미한다. As used herein, the term “sustained growth” refers to a culture characteristic in which microorganisms are not killed by external stress (eg, high concentration of sugar (glucose) or high culture temperature) and are continuously proliferated without interruption of growth.

본 발명의 균주는 호기성 및 혐기성 조건에서 모두 배양 가능하다. The strain of the present invention can be cultured in both aerobic and anaerobic conditions.

본 발명의 하나의 실시 양태(embodiment)에서, 상기 균주는 호기성 조건에서 배양되는 것일 수 있다. In one embodiment of the invention (embodiment), the strain may be cultured in aerobic conditions.

상기 본 발명의 균주는 평균분자량이 500만 Da(달톤) 이상의 고분자의 히알루론산을 생산하는 것을 특징으로 한다. 구체적 일례로, 본 발명의 균주에 의해 생산되는 히알루론산은 평균분자량이 500만 Da, 501만 Da, 502만 Da, 503만 Da, 504만 Da, 505만 Da, 506만 Da, 507만 Da, 508만 Da, 509만 Da, 510만 Da, 511만 Da, 512만 Da, 513만 Da, 514만 Da, 515만 Da, 516만 Da, 517만 Da, 518만 Da, 519만 Da, 520만Da, 521만 Da, 522만 Da, 523만 Da, 524만 Da, 525만 Da, 526만 Da, 527만 Da, 528만 Da, 529만 Da, 530만 Da, 531만 Da, 532만 Da, 533만 Da, 534만 Da, 535만 Da, 536만 Da, 537만 Da, 538만 Da, 539만 Da, 540만 Da, 541만 Da, 542만 Da, 543만 Da, 544만 Da, 545만 Da, 546만 Da, 547만 Da, 548만 Da, 549만 Da, 550만 Da, 555만 Da, 560만 Da, 565만 Da 또는 570만 Da일 수 있다. The strain of the present invention is characterized in that it produces hyaluronic acid of a polymer having an average molecular weight of 5 million Da (Dalton) or more. As a specific example, the hyaluronic acid produced by the strain of the present invention has an average molecular weight of 5 million Da, 5,000,000 Da, 5,500,000 Da, 5,000,000 Da, 5,500,000 Da, 5,500,000 Da, 5,500,000 Da, and 5,507,000 Da, 5.8 million Da, 509 million Da, 510 million Da, 511 million Da, 512 million Da, 513 million Da, 514 million Da, 515 million Da, 516 million Da, 517 million Da, 518 million Da, 519 million Da, 520 million Da, 5.21 million Da, 5.21 million Da, 5.23 million Da, 5.25 million Da, 5.25 million Da, 5.26 million Da, 5.27 million Da, 5.28 million Da, 5.29 million Da, 5.3 million Da, 5.15 million Da, 5.53 million Da, 5.33 million Da, 5.3 million Da, 5.3 million Da, 536 million Da, 537 million Da, 538 million Da, 539 million Da, 5.4 million Da, 541 million Da, 542 million Da, 543 million Da, 5.4 million Da, 545 million It may be Da, 5.4 million Da, 547 million Da, 548 million Da, 549 million Da, 550 million Da, 555 million Da, 5.6 million Da, 565 million Da or 5.7 million Da.

바람직하게 본 발명의 균주에 의해 생산되는 히알루론산은 평균분자량이 500만 Da 내지 550만 Da이다. Preferably, the hyaluronic acid produced by the strain of the present invention has an average molecular weight of 5 million Da to 5.5 million Da.

하나의 실시 양태에서, 본 발명의 균주에 의해 생산되는 히알루론산은 평균분자량이 519만 Da 내지 546만 Da 일 수 있다. In one embodiment, the hyaluronic acid produced by the strain of the present invention may have an average molecular weight of 519,000 Da to 5.4 million Da.

본 명세서에 기재된 평균분자량은 모두 중량 평균 분자량(weight average molecular weight)이다.All of the average molecular weights described herein are weight average molecular weights.

본 발명의 균주는 상기 고분자의 히알루론산을 우수한 생산 효율로 생산가능한 것이 특징이며, 특히 이는 전술한 고온 배양 환경에서도 달성 가능하다. 본 발명 균주에 의한 히알루론산 생산성은 18시간 내지 24시간 배양 시를 기준으로, 평균 7g/L 내지 10g/L 수준에 달한다. 바람직하게 8g/L 내지 10g/L , 더욱 바람직하게는(특히, 최적 배양배지 및 조건에서) 9g/L 내지 10g/L의 생산 효율을 나타낼 수 있는 것이 특징이다. The strain of the present invention is characterized in that it is possible to produce hyaluronic acid of the polymer with excellent production efficiency, and particularly, it can be achieved even in the above-described high temperature culture environment. The hyaluronic acid productivity by the strain of the present invention is based on the cultivation period of 18 to 24 hours, reaching an average level of 7 g / L to 10 g / L. It is characterized in that it can exhibit a production efficiency of preferably 8 g / L to 10 g / L, more preferably 9 g / L to 10 g / L (especially in an optimal culture medium and conditions).

하나의 실시양태에서, 본 발명의 균주에 의한 고분자 히알루론산 생산성은 22시간 배양 시를 기준으로 9.6g/L 내지 10.0g/L일 수 있다.In one embodiment, the productivity of the polymer hyaluronic acid by the strain of the present invention may be 9.6 g / L to 10.0 g / L based on a 22 hour culture.

바람직한 하나의 양태(embodiment)에서 본원 발명의 균주는 다음과 같은 특징을 가진다: 야생형과 비교하여 내당성 및 내열성이 향상된 균주로서 포도당 100g/L 내지 250g/L를 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내고 온도 28℃ 내지 48℃에서 지속된 생육을 나타내며, 평균분자량 500만 Da 이상의 고분자 히알루론산을 생산하는 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주(기탁번호 : KCTC13556BP).In one preferred embodiment (embodiment) the strain of the present invention has the following characteristics: as a strain with improved glucose tolerance and heat resistance compared to the wild type, and shows sustained growth in a medium containing 100 g / L to 250 g / L of glucose. UBC-U46 strain of the genus Streptococcus which shows a growth sustained at a temperature of 28 ° C to 48 ° C and produces a polymer hyaluronic acid having an average molecular weight of 5 million Da or more (Accession No .: KCTC13556BP).

바람직한 하나의 양태(embodiment)에서 본원 발명의 균주는 다음과 같은 특징을 가진다: 야생형과 비교하여 내당성 및 내열성이 향상된 균주로서 포도당 100g/L 내지 250g/L를 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내고 온도 28℃ 내지 48℃에서 지속된 생육을 나타내며, 8g/L 내지 10g/L의 히알루론산 생산 수율을 가지는 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주(기탁번호 : KCTC13556BP).In one preferred embodiment (embodiment) the strain of the present invention has the following characteristics: as a strain with improved glucose tolerance and heat resistance compared to the wild type, and shows sustained growth in a medium containing 100 g / L to 250 g / L of glucose. UBC-U46 strain of the genus Streptococcus showing a growth sustained at a temperature of 28 ° C to 48 ° C and having a hyaluronic acid production yield of 8 g / L to 10 g / L (Accession No .: KCTC13556BP).

바람직한 하나의 양태(embodiment)에서 본원 발명의 균주는 다음과 같은 특징을 가진다: 야생형과 비교하여 내당성 및 내열성이 향상된 균주로서 포도당 100g/L 내지 250g/L를 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내고 온도 28℃ 내지 48℃에서 지속된 생육을 나타내며, 평균분자량 500만 Da 이상의 고분자 히알루론산을 생산하고 8g/L 내지 10g/L의 히알루론산 생산 수율을 가지는 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주(기탁번호 : KCTC13556BP).In one preferred embodiment (embodiment) the strain of the present invention has the following characteristics: as a strain with improved glucose tolerance and heat resistance compared to the wild type, and shows sustained growth in a medium containing 100 g / L to 250 g / L of glucose. UBC-U46 strain of Streptococcus genus showing growth sustained at a temperature of 28 ° C to 48 ° C, producing a polymer hyaluronic acid with an average molecular weight of 5 million Da or higher, and having a yield of 8 g / L to 10 g / L hyaluronic acid (Deposition No .: KCTC13556BP).

상기 본 발명의 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주는 통상적인 스트렙토코커스 속 미생물의 배양법에 의해 배양할 수 있다. 이에 본 발명은, 본 발명의 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주를 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산방법을 제공한다. The Streptococcus genus UBC-U46 strain of the present invention can be cultured by a conventional method for culturing microorganisms in Streptococcus genus. Accordingly, the present invention provides a method for producing hyaluronic acid comprising culturing the UBC-U46 strain of the genus Streptococcus in the present invention in a medium containing a carbon source and a nitrogen source.

하나의 실시 양태에서 상기 탄소원은, 바람직하게 포도당(덱스트로스), 만니톨, 과당, 유당, 만노스, 젖당, 자당, 자일로스, 전분, 덱스트린, 글리세린 및 이들의 혼합물(2개 이상의 혼합물)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 신균주는 상기 물질들을 탄소원으로 이용가능하다. In one embodiment, the carbon source is preferably a group consisting of glucose (dextrose), mannitol, fructose, lactose, mannose, lactose, sucrose, xylose, starch, dextrin, glycerin and mixtures (two or more mixtures) thereof. It may be selected from, but is not limited to. The new strain of the present invention can use the above materials as a carbon source.

하나의 실시 양태에서 상기 질소원은, 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract, 효모엑스), 트립톤(tryptone), 탈지우유(skim milk), 건조효모(dry yeast), 카제인(casein), 대두박(soybean meal), 소고기 추출물(beef extract) 및 이들의 혼합물(2개 이상의 혼합물)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The nitrogen source in one embodiment, peptone (peptone), yeast extract (yeast extract, yeast extract), tryptone (tryptone), skim milk (skim milk), dry yeast, casein, soybean meal (soybean meal), beef extract (beef extract) and mixtures thereof (two or more mixtures) may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

상기 펩톤은 당업계에서 미생물 배양에 사용하는 것으로 알려진 것이라면, 이의 기원이 특별히 제한되지 않으며, 예를들어 소이펩톤, 네오펩톤, 박토펩톤 등을 모두 포함한다. If the peptone is known to be used in the culture of microorganisms in the art, its origin is not particularly limited, and includes, for example, soypeptone, neopeptone, bactopeptone, and the like.

상기 배지는 추가적으로 아미노산을 포함할 수 있다. 하나의 실시 양태에서 상기 배지에 첨가되는 아미노산은 글루타민, 리신, 시스테인, 아르기닌, 메치오닌, 아스파르트산, 글리신, 발린, 트레오닌, 프롤린, 알라닌, 아스파라진, 히스티딘, 글루타민산, 타이로신 및 이들의 혼합물(2개 이상의 혼합물)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The medium may additionally include amino acids. In one embodiment, the amino acids added to the medium are glutamine, lysine, cysteine, arginine, methionine, aspartic acid, glycine, valine, threonine, proline, alanine, asparagine, histidine, glutamic acid, tyrosine and mixtures thereof (2) It may be selected from the group consisting of the above mixture), but is not limited thereto.

상기 배지는 추가적으로 임의의 염(salt)를 포함할 수 있다. 상기 염은 유기염과 무기염을 모두 포함한다. 하나의 실시 양태에서 상기 배지에 첨가되는 염은 염화나트륨(Sodium chloride), 염화칼륨(Potassium chloride), 염화칼슘(Calcium chloride), 모노소듐 인산염(Monosodium phosphate), 디소듐 인산염(Disodium phosphate), 모노포타슘 인산염(Monopotassium phosphate), 디포타슘 인산염(Dipotassium phosphate) 및 탄산나트륨(Sodium carbonate)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것일 수 있다. The medium may additionally include any salt. The salt includes both organic and inorganic salts. In one embodiment, the salt added to the medium is sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, monosodium phosphate, disodium phosphate, monopotassium phosphate ( It may be one or more selected from the group consisting of monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, and sodium carbonate.

상기 배지는 균주 배양(특히, 히알루론산 제조를 위한 배양)에 사용되기 전에 멸균, 필터링 등의 임의의 전처리 과정을 거칠 수 있다. The medium may be subjected to any pre-treatment process, such as sterilization and filtering, before being used for strain culture (especially culture for producing hyaluronic acid).

본 발명의 배양 방법은 특별히 한정되지 아니하며, 예를 들어 회분식, 유가식, 연속식 배양 등의 방법을 사용가능하다. The culture method of the present invention is not particularly limited, and for example, methods such as batch, fed-batch, and continuous culture can be used.

본 발명에서 상기 배양은 pH7.2 내지 pH8.2 환경에서 수행되는 것일 수 있다. 당업자는 상기 pH 범위를 유지하기 위하여, 배양 중에 완충작용을 하는 성분들을 임의로 첨가하는 등의 처리를 할 수 있으며, pH 유지를 위하여 배양 과정 중에 추가적으로 실시할 수 있는 임의의 처리에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.In the present invention, the culture may be performed in an environment of pH7.2 to pH8.2. Those skilled in the art can perform treatments such as optionally adding buffering components during cultivation to maintain the pH range, and any treatment that can be additionally performed during the cultivation process to maintain pH is well known in the art. Is known.

본 발명에서 상기 배양은 28℃ 내지 48℃ 온도에서 수행되는 것일 수 있다. 특히 본 발명에서의 배양은 균주 특성으로 인하여 40℃ 내지 48℃의 온도에서도 수행 가능한 것이 특징이며, 이에 대한 구체적 설명은 전술한 바를 참조로 한다. In the present invention, the culture may be performed at a temperature of 28 ° C to 48 ° C. In particular, the culture in the present invention is characterized in that it can be performed even at a temperature of 40 ° C to 48 ° C due to the characteristics of the strain, and detailed description thereof will be referred to the above.

하나의 바람직한 실시 양태에서, 상기 배양은 40℃ 내지 45℃의 온도 조건에서 수행되는 것일 수 있다. In one preferred embodiment, the culture may be carried out at a temperature condition of 40 ℃ to 45 ℃.

하나의 바람직한 실시 양태에서, 상기 배양은 42℃ 내지 45℃의 온도 조건에서 수행되는 것일 수 있다. In one preferred embodiment, the culture may be carried out at a temperature condition of 42 ℃ to 45 ℃.

바람직한 실시 양태의 일례로서 본 발명은, 본 발명의 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주를 포도당, 만니톨, 소이펩톤 및 효모추출물을 포함하는(또는 필수적으로 구성되는) 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산 방법을 제공한다.As an example of a preferred embodiment, the present invention comprises the step of culturing the UBC-U46 strain of the genus Streptococcus of the present invention in a medium containing (or consisting essentially of) glucose, mannitol, soypeptone, and yeast extract. Provide a production method.

또 다른 실시 양태의 일례로서 본 발명은, 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주를 포도당, 만니톨, 소이펩톤, 효모추출물 및 물(D.W.)로 구성되는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산 방법을 제공한다. As an example of another embodiment, the present invention provides a method for producing hyaluronic acid, comprising culturing Streptococcus genus UBC-U46 strain in a medium consisting of glucose, mannitol, soypeptone, yeast extract, and water (DW) do.

구체적인 하나의 실시양태로서, 상기 배지는In one specific embodiment, the medium is

포도당 100g/L 내지 200g/L;Glucose 100g / L to 200g / L;

만니톨 0.5g/L 내지 3g/L;Mannitol 0.5 g / L to 3 g / L;

소이펩톤 1g/L 내지 5g/L; 및Soypeptone 1 g / L to 5 g / L; And

효모추출물 10g/L 내지 50g/L을 포함하는(또는 필수적으로 구성되는) 것일 수 있다. It may be one containing (or consisting essentially of) yeast extract 10g / L to 50g / L.

구체적인 하나의 실시양태로서, 상기 배지는 In one specific embodiment, the medium is

포도당 100g/L 내지 200g/L;Glucose 100g / L to 200g / L;

만니톨 0.5g/L 내지 3g/L;Mannitol 0.5 g / L to 3 g / L;

소이펩톤 1g/L 내지 5g/L; Soypeptone 1 g / L to 5 g / L;

효모추출물 10g/L 내지 50g/L; 및Yeast extract 10 g / L to 50 g / L; And

물(D.W.)로 구성되는 것일 수 있다. It may be composed of water (D.W.).

본 발명의 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는’ 또는‘특징으로 하는’과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ‘~로 구성되는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(essentially consisting of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.The term 'comprising' of the present invention is used in the same way as 'containing' or 'characterizing', and does not exclude additional component elements or method steps not mentioned in the composition or method. . The term 'consisting of' means excluding additional elements, steps or ingredients, which are not described separately. The term 'essentially consisting of' means that in the scope of a composition or method, it includes the described component elements or steps, as well as component elements or steps that do not materially affect its basic properties.

본 발명자들은 포도당, 만니톨, 소이펩톤 및 효모추출물 성분이 포함된 배지에서 본 발명의 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주를 배양하였을 경우, 500만 Da 이상(바람직하게 500만 Da 내지 550만 Da)의 평균분자량을 가지는 고분자 히알루론산을 9g/L 이상의 높은 수율로 생산할 수 있음을 확인하였다. 특히 40℃ 이상(바람직하게, 40℃ 내지 48℃)의 고온 배양에서도 500만 Da 이상(바람직하게 500만 Da 내지 550만 Da)의 평균분자량을 가지는 고분자 히알루론산을 9g/L 이상(바람직하게 9g/L 내지 10g/L)의 높은 수율로 생산할 수 있음을 확인하였다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.When the present inventors cultured the UBC-U46 strain of the genus Streptococcus in the present invention in a medium containing glucose, mannitol, soypeptone and yeast extract components, the average of 5 million Da or more (preferably 5 million Da to 5.5 million Da) It was confirmed that a polymer hyaluronic acid having a molecular weight can be produced with a high yield of 9 g / L or more. In particular, the polymer hyaluronic acid having an average molecular weight of more than 5 million Da (preferably 5 million Da to 5.5 million Da) even at high temperature of 40 ° C or higher (preferably 40 ° C to 48 ° C) is 9g / L or more (preferably 9g) / L to 10g / L) was confirmed that it can be produced in a high yield. This is well illustrated in the specification examples of the present invention.

본 발명의 전술한 히알루론산 생산 방법은, 배양 단계 이후에 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다: 상기 균주 배양을 통해 수득한 배양액으로부터 히알루론산을 분리하는 단계.The above-described method for producing hyaluronic acid of the present invention may further include the following steps after the culture step: separating hyaluronic acid from the culture solution obtained through the culture of the strain.

배양액으로부터 히알루론산의 분리는 당업계에 공지된 임의의 정제법, 침전법, 또는 추출법에 의해 수행될 수 있으며, 그 구체적 방법 및 수단이 특별히 제한되지 않는다. 일례로 상기 히알루론산의 분리는 원심분리, 여과(예를들어 한외여과 등), 에탄올 침전 등의 방법으로 수행될 수 있다. Separation of hyaluronic acid from the culture medium may be performed by any purification method, precipitation method, or extraction method known in the art, and the specific method and means are not particularly limited. For example, the hyaluronic acid may be separated by centrifugation, filtration (for example, ultrafiltration, etc.) or ethanol precipitation.

상기 분리된 히알루론산은 당업자가 목적하는 제공 형태에 따라 임의의 후처리 공정을 거칠 수 있다. 일례로 농축, 건조, 분말화 등의 후처리 등이 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The separated hyaluronic acid may be subjected to any post-treatment process depending on the form provided by those skilled in the art. For example, post-treatment such as concentration, drying, and powdering may be performed, but is not limited thereto.

본 발명의 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주는 평균분자량 500만 Da 이상의 고분자 히알루론산을 생산 가능할 뿐만 아니라 내당성 특성을 보유하며 고분자 히알루론산의 생산능이 현저히 높은 것이 특징이다. 또한 내열성 특성을 보유하여 40℃ 이상의 고온에서도 고분자 히알루론산 생산능이 매우 우수하며, 이에 따라 산업적 규모의 대량 배양 공정에서 다른 오염균에 의한 오염 우려와 이에 따른 추가 공정들을 현저히 줄일 수 있어 경제적인 가치 또한 매우 우수하다. The UBC-U46 strain of the genus Streptococcus of the present invention is not only capable of producing a polymer hyaluronic acid having an average molecular weight of 5 million Da or more, but also possesses glucose tolerance characteristics and is characterized by a remarkably high production capacity of the polymer hyaluronic acid. In addition, it possesses heat-resistant properties, so it has excellent polymer hyaluronic acid production capacity even at high temperatures of 40 ℃ or higher. Accordingly, it is economically valuable because it can significantly reduce the risk of contamination by other contaminants and additional processes according to the industrial scale mass cultivation process. It is very good.

도 1은 D-glucuronic acid와 N-acetylglucosamine이 β-1,3과 β-1,4 결합을 이루는 히알루론산의 반복 단위를 나타낸다. 1 shows a repeating unit of hyaluronic acid in which D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine form β-1,3 and β-1,4 bonds.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited to the following examples.

실시예 1 : 고분자 히알루론산(HA)을 고수율로 생산 가능하며, 내당성 및 내열성을 가지는 우수 균주 선별_ Example 1: Selection of excellent strains capable of producing polymer hyaluronic acid (HA) with high yield and having sugar resistance and heat resistance_ Streptococcus sp.Streptococcus sp. UBC-U46 선별 UBC-U46 sorting

1-1. 1차 돌연변이 균주 풀(pool) 제작 및 고점성의 콜로니 선발1-1. Production of primary mutant strain pool and selection of high-viscosity colonies

Todd Hewitt 액체 배지(Todd Hewitt Broth, BD)에서 스트렙토코크스 쥬에피데미쿠스 균주(KCCM40304, 한국미생물보존센터)를 24시간 동안 34℃로 진탕 배양하였다. 배양액에 N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)를 처리하고 34℃에서 1시간 배양하여 사멸율 99%의 조건을 결정하였다. NTG가 처리된 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 50 mM Tris-maleate buffer(pH 8.0)로 세척하였다. 이렇게 돌연변이 유도된 포자를 멸균된 생리 식염수로 희석한 후, Todd Hewitt 고체 배지에 도말하고 34℃에서 배양하여, 고점성의 군락을 이루는 우수 콜로니를 선별하였다. In a Todd Hewitt liquid medium (Todd Hewitt Broth, BD), the Streptococcus jeopidemicus strain (KCCM40304, Korea Microbial Conservation Center) was shaken and cultured at 34 ° C. for 24 hours. The culture medium was treated with N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) and incubated at 34 ° C for 1 hour to determine a condition of 99% mortality. The culture medium treated with NTG was centrifuged to recover the cells and washed with 50 mM Tris-maleate buffer (pH 8.0). After diluting the mutagenic spores with sterile physiological saline, they were spread on Todd Hewitt solid medium and cultured at 34 ° C. to select excellent colonies forming a highly viscous colony.

1-2. HA 고생산 콜로니 선발 1-2. Selection of HA high production colonies

선별된 우수 콜로니들을 각각 Todd Hewitt 액체 배지(heart infusion agar, Neopeptone, Dextrose, Sodium chloride, Disodium phosphate, Sodium carbonate, Yeast extract, D.W.)에 접종하고 34℃로 24시간 동안 배양한 직후 히알루론산 생성능을 비교하였다.Each of the selected superior colonies was inoculated into Todd Hewitt liquid medium (heart infusion agar, Neopeptone, Dextrose, Sodium chloride, Disodium phosphate, Sodium carbonate, Yeast extract, DW), respectively, and the hyaluronic acid production capacity was compared immediately after incubation at 34 ° C for 24 hours. Did.

히알루론산의 정량은, 산성 점액성 다당류를 검증하기 위해 사용되는 색소인 alcian blue staining(Sigma-Aldrich) 방법으로 통상적인 프로토콜에 따라 수행되었다. 상기 정량을 통해, 히알루론산 생산능이 매우 높은 콜로니들을 1차 선발하였다. Quantification of hyaluronic acid was carried out according to a conventional protocol by the alcian blue staining (Sigma-Aldrich) method, a pigment used to verify acidic mucopolysaccharides. Through the above quantitation, colonies with very high hyaluronic acid production capacity were first selected.

1-3. 2차 돌연변이 균주 풀(pool) 제작 및 내당성이 높은 콜로니 선발1-3. Secondary mutant strain pool production and selection of colonies with high glucose tolerance

1차 선발된 후보 콜로니들을 Todd Hewitt 액체 배지에서 24시간 동안 34℃ 로 진탕 배양하였다. 배양액에 N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)를 처리하고 34℃에서 1시간 배양하여 사멸율 99%의 조건을 결정하였다. NTG가 처리된 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 50 mM Tris-maleate buffer (pH 8.0)로 세척하였다. 이렇게 돌연변이 유도된 포자를 멸균된 생리 식염수로 희석한 후, 고농도의 당(포도당 100g/L ~ 200g/L 농도)을 포함시킨 Todd Hewitt 고체 배지에 도말하고 34℃에서 24시간 동안 배양시키며 이들의 생육능을 비교하여, 생육능이 우수한 콜로니를 선별하였다. 배지 내에 포함된 당(포도당) 농도별 각 후보 균주들의 생육능을 비교 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 여러 가지 후보 콜로니(균주)들 중, 상대적으로 우수한 것으로 분류되었던 변이 균주들에 대한 실험결과만을 대표적으로 표 1에 축약하여 나타내었다. The primary candidate colonies were incubated with shaking at 34 ° C. for 24 hours in Todd Hewitt liquid medium. The culture medium was treated with N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) and incubated at 34 ° C for 1 hour to determine a condition of 99% mortality. The culture medium treated with NTG was centrifuged to recover the cells and washed with 50 mM Tris-maleate buffer (pH 8.0). After diluting the mutagenic spores with sterile physiological saline, they were spread on Todd Hewitt solid medium containing high concentration of sugar (100 g / L ~ 200 g / L concentration of glucose) and incubated at 34 ° C. for 24 hours to grow them. By comparing the ability, colonies having excellent growth ability were selected. Table 1 shows the results of comparing the viability of each of the candidate strains according to the concentration of sugar (glucose) contained in the medium. Among the various candidate colonies (strains), only the experimental results for the mutant strains classified as relatively excellent are summarized in Table 1.

하기 표 1에서 보는 바와 같이, 콜로니 S-049의 균은 200g/L 이상의 고농도 당을 포함하는 배지에서도 활발히 증식하는 것으로 확인된 반면, 다른 콜로니들은 고농도 당 환경에서 전혀 생육하지 못하거나 생존을 유지하고 있는 정도에 그쳤다. 이에 매우 높은 수준의 내당성을 보이는 콜로니 S-049를 2차 선발하였다. As shown in Table 1 below, colony S-049 bacteria were found to actively proliferate in a medium containing high concentration sugars of 200 g / L or more, while other colonies did not grow at all or maintained survival in a high sugar environment. It was just to a degree. Accordingly, the colony S-049, which exhibits a very high level of glucose tolerance, was selected second.

스크리닝
콜로니 No.Screening
Colony No. 포도당 농도(g/L)Glucose concentration (g / L) 5050 100100 150150 200200 KCCM40304KCCM40304 ++ -- -- -- S-002S-002 ++++ ++ -- -- S-007S-007 ++ -- -- -- S-043S-043 ++++ ++ -- -- S-049S-049 ++++ ++++ ++++ ++++ S-113S-113 ++ -- -- -- S-120S-120 ++ -- -- -- S-173S-173 ++++ -- -- -- S-174S-174 ++++ ++ ++ -- S-289S-289 ++++ ++ -- --

(-: 생육 안됨, +: 생육, ++: 생육 우수)(-: No growth, +: growth, ++: excellent growth)

1-4. 3차 돌연변이 균주 풀(pool) 제작 및 고분자 HA를 고농도로 생산하는 내열성이 높은 균주 선발 1-4. Preparation of a pool of tertiary mutant strains and selection of highly heat-resistant strains that produce high-molecular HA

2차 선발된 S-049 콜로니를 Todd Hewitt 액체 배지에서 24시간 동안 34℃ 로 진탕 배양하였다. 배양액에 N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)를 처리하고 34℃에서 1시간 배양하여 사멸율 99%의 조건을 결정하였다. NTG가 처리된 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 50 mM Tris-maleate buffer (pH 8.0)로 세척하였다. 이렇게 돌연변이 유도된 포자를 멸균된 생리 식염수로 희석한 후, Todd Hewitt 고체 배지에 도말하고 40℃~45℃의 고온에서 24시간동안 배양시켰다. 상기 실시예 1-3에서 확인한 수준의 내당성 능력을 보유하는 것을 전제로, 평균분자량이 매우 높은 HA를 생산하면서도 우수한 생산성과 생육능을 보유한 콜로니 S-049-051를 최종 3차 선발하였다(하기 표 2 및 표 3 참조).Secondly selected S-049 colonies were incubated with shaking at 34 ° C. for 24 hours in Todd Hewitt liquid medium. The culture medium was treated with N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) and incubated at 34 ° C for 1 hour to determine a condition of 99% mortality. The culture medium treated with NTG was centrifuged to recover the cells and washed with 50 mM Tris-maleate buffer (pH 8.0). The mutant-induced spores were diluted with sterile physiological saline, and then spread on Todd Hewitt solid medium and incubated at a high temperature of 40 ° C to 45 ° C for 24 hours. On the premise that it possesses the level of glucose tolerance confirmed in Examples 1-3, colony S-049-051, which has excellent productivity and viability while producing HA with a very high average molecular weight, was finally selected for the third time (below) See Table 2 and Table 3).

분자량은 극한점도(대한약전 11개정 히알루론산나트륨 극한점도)를 측정한 후 Mark-Houwink 공식에 따라 분자량으로 환산하였다. Mark-Houwink 공식은 계산식 1과 같다.The molecular weight was measured as the ultimate viscosity (the extreme viscosity of sodium hyaluronate of 11 revisions of the Korean Pharmacopoeia) and then converted to molecular weight according to the Mark-Houwink formula. The formula for Mark-Houwink is the same as Equation 1.

계산식 1 Formula 1

극한점도 = K x 분자량a Ultimate viscosity = K x molecular weight a

이때 상수 K와 a의 값은 Bother 공식(Int. J. Biol. Macromol., 1988, Vol. 10, 287-291)에 따라 계산하여 측정하였다.At this time, the values of the constants K and a were calculated and measured according to the Bother formula (Int. J. Biol. Macromol., 1988, Vol. 10, 287-291).

여러 가지 후보 콜로니(균주)들 중, 상대적으로 우수한 것으로 분류되었던 변이 균주들에 대한 실험결과만을 대표적으로 하기 표 2 및 표 3에 축약하여 나타내었다. Among the various candidate colonies (strains), only the experimental results for the mutant strains classified as relatively excellent are summarized in Tables 2 and 3 below.

스크리닝
콜로니 No.Screening
Colony No. 배양온도(℃)Culture temperature (℃) 3030 3535 4040 4545 KCCM40304KCCM40304 ++ ++ -- -- S-049-003S-049-003 ++ ++++ -- -- S-049-026S-049-026 ++++ ++++ ++ ++ S-049-048S-049-048 ++++ ++++ -- -- S-049-051S-049-051 ++++ ++++ ++++ ++++ S-049-055S-049-055 ++++ ++++ -- -- S-049-187S-049-187 ++ ++++ -- -- S-049-202S-049-202 ++++ ++++ ++++ ++ S-049-324S-049-324 ++ ++++ ++ ++

(-: 생육 안됨, +: 생육, ++: 생육 우수)(-: No growth, +: growth, ++: excellent growth)

스크리닝
콜로니 No.Screening
Colony No. 배양온도(℃)Culture temperature (℃) 3535 4040 4545 KCCM40304KCCM40304 2.7 g/L, 120만 달톤2.7 g / L, 1.2 million Daltons -- -- S-049-026S-049-026 5.5 g/L, 320만 달톤5.5 g / L, 3.2 million Daltons 3.2 g/L, 160만 달톤3.2 g / L, 1.6 million Daltons 2.0 g/L, 90만 달톤2.0 g / L, 900,000 Daltons S-049-051S-049-051 9.8 g/L, 540만 달톤9.8 g / L, 5.4 million Daltons 9.9 g/L, 540만 달톤9.9 g / L, 5.4 million Daltons 9.8 g/L, 540만 달톤9.8 g / L, 5.4 million Daltons S-049-202S-049-202 6.3 g/L, 260만 달톤6.3 g / L, 2.6 million Daltons 6.3 g/L, 250만 달톤6.3 g / L, 2.5 million Daltons 2.1 g/L, 130만 달톤2.1 g / L, 1.3 million Daltons S-049-324S-049-324 5.1 g/L, 200만 달톤5.1 g / L, 2 million Daltons 3.3 g/L, 120만 달톤3.3 g / L, 1.2 million Daltons 1.8 g/L, 50만 달톤1.8 g / L, 500,000 Daltons

상기 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같이, S-049-051 균주는 40℃~45℃의 고온에서도 매우 우수한 생육능을 보일 뿐만아니라, 상기 고온 조건에서 HA 생산능이 다른 균주들에 비해 월등히 우수한 것을 확인하였다. 또한 추가의 실험을 통해, S-049-051 균주는 48℃까지의 온도에서 생육 가능함을 확인하였다. As shown in Table 2 and Table 3, S-049-051 strain not only shows a very good growth ability even at high temperatures of 40 ° C to 45 ° C, and that HA production capacity is superior to other strains at high temperature conditions. Confirmed. In addition, through additional experiments, it was confirmed that the strain S-049-051 is capable of growing at a temperature up to 48 ° C.

이렇게 선발된 콜로니 S-049-051 균주를 스트렙토코크스 속 UBC-U46(Streptococcus sp. UBC-U46)로 명명하였고, 한국생명공학연구원에 2018년 6월 21일 기탁하였다(기탁번호: KCTC13556BP). 본원 발명의 스트렙토코크스 속 UBC-U46 균주(변이주)는 평균분자량 500만 Da 내지 550만 Da 범위의 히알루론산(HA)을 생산하면서도, 높은 수준의 내당성, 내열성 특성을 보유한다.The selected colony S-049-051 strain was named Streptococcus sp. UBC-U46 (Septococcus sp. UBC-U46) and deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on June 21, 2018 (Accession No .: KCTC13556BP). The Streptococcus genus UBC-U46 strain (variant strain) of the present invention produces hyaluronic acid (HA) having an average molecular weight of 5 million Da to 5.5 million Da, while retaining high levels of glucose tolerance and heat resistance.

실시예 2 : 스트렙토코크스 속 UBC-U46 균주로부터, 고분자 히알루론산(HA) 고생산Example 2: High production of polymer hyaluronic acid (HA) from strain UBC-U46 from the genus Streptocox

종균배양 1차는 Todd Hewitt 액체배지 50ml에 본 발명의 균주(Streptococcus sp. UBC-U46)를 접종하여 6시간 동안 42℃에서 150rpm으로 배양하였다. 상기 배양물을 Todd Hewitt 액체배지 150ml 2개에 6㎖씩 접종하고 상기 1차 종균배양과 동일한 조건으로 배양하여 종균배양 2차를 준비하였다. For the primary culture, the strain of the present invention ( Streptococcus sp. UBC-U46) was inoculated in 50 ml of Todd Hewitt liquid medium and cultured at 150 ° C at 42 ° C for 6 hours. The culture was inoculated with 6 ml of two 150 ml Todd Hewitt liquid medium and cultured under the same conditions as the primary seed culture to prepare a second seed culture.

스트렙토코크스 속 UBC-U46 균주에 특이적으로, 더욱 적합한 HA 생산 조건을 탐색하였다. 상기 2차 종균배양액을 본배양 배지에 접종하고 배양하여, 본배양 배지 조성에 따른 히알루론산의 생산성의 차이를 관찰하였다. Specifically, more suitable HA production conditions were searched for the UBC-U46 strain of the genus Streptococcus. The secondary seed culture medium was inoculated in the main culture medium and cultured to observe the difference in productivity of hyaluronic acid according to the composition of the main culture medium.

배양 완료 직후 배양액 내의 히알루론산의 정량은 카바졸방법(대한약전 11개정 히알루론산나트륨 정량법)으로 분석하였고, 분자량은 극한점도(대한약전 11개정 히알루론산나트륨 극한점도)를 측정한 후 Mark-Houwink 공식에 따라 분자량으로 환산하였다. Immediately after the completion of the culture, the amount of hyaluronic acid in the culture medium was analyzed by the carbazole method (Korea Pharmacopoeia 11 revision sodium hyaluronate quantitative method). According to the molecular weight.

HA 고생산을 위한 본배양 배지의 1가지 예로서, 본 발명자들은 포도당 100g/L ~ 200g/L, 만니톨 0.5g/L ~ 3g/L, 소이펩톤 1g/L ~ 5g/L, 및 효모추출물 10g/L ~ 50g/L가 포함된 배지가, 본 발명의 스트렙토코크스 속 UBC-U46 균주의 고분자 HA 생산성을 더욱 좋게 하는 것을 확인하였다. 스트렙토코크스 속 UBC-U46 균주는 pH7.2 내지 pH8.2 조건에서 고분자 HA를 생산 가능한 것을 확인하였다. As one example of the main culture medium for high production of HA, the present inventors are 100 g / L to 200 g / L of glucose, 0.5 g / L to 3 g / L of mannitol, 1 g / L to 5 g / L of soypeptone, and 10 g of yeast extract It was confirmed that the medium containing / L to 50 g / L further improved the polymer HA productivity of the UBC-U46 strain of the genus Streptocox of the present invention. It was confirmed that the UBC-U46 strain of the genus Streptocox was capable of producing polymer HA at pH7.2 to pH8.2.

하기 표 4는 5L 발효조에 준비된, 멸균된 포도당 150g/L, 소이펩톤 3g/L, 효모추출물 30g/L, 만니톨 2g/L 및 D.W.의 조성을 가지는 배지 2.5L에, 상기 2차 종균배양액 100㎖를 접종하여 42℃의 배양온도, pH 7.6의 조건하에서 22시간 동안 본배양한 결과를 나타낸다. 상기 본배양은 같은 조건으로 반복 수행되었다. Table 4 below is prepared in a 5L fermenter, sterilized glucose 150g / L, soypeptone 3g / L, yeast extract 30g / L, mannitol 2g / L, and medium 2.5L having the composition of DW, the secondary seed culture medium 100ml Inoculation shows the results of the main culture for 22 hours under the conditions of a culture temperature of 42 ° C and a pH of 7.6. The main culture was repeatedly performed under the same conditions.

본배양 차수Main culture order 히알루론산 생산성Hyaluronic acid productivity 히알루론산 평균 분자량Hyaluronic acid average molecular weight 1차Primary 9.7 g/L9.7 g / L 532만 달톤532 million Daltons 2차Secondary 9.6 g/L9.6 g / L 546만 달톤5.4 million Daltons 3차3rd 9.8 g/L9.8 g / L 519만 달톤519 million Daltons 4차4th 9.8 g/L9.8 g / L 534만 달톤5.35 million Daltons 5차5th 10.0 g/L10.0 g / L 529만 달톤5.29 million Daltons

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본원 발명의 스트렙토코크스 속 UBC-U46 균주를 이용하여 히알루론산을 생산하였을 경우 500만 달톤(Da) 이상의 분자량을 갖는 히알루론산이 9g/L~10g/L의 생산성으로 생산된다는 것을 반복적으로 확인 할 수 있었다. As shown in Table 4, when producing hyaluronic acid using the UBC-U46 strain of the genus Streptococcus of the present invention, hyaluronic acid having a molecular weight of 5 million Daltons (Da) or higher has a productivity of 9 g / L to 10 g / L. It was confirmed that it was produced repeatedly.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 신규한 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주(기탁번호 : KCTC13556BP) 및 이를 이용한 히알루론산 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 스트렙토코커스 속 UBC-U46 균주는 평균분자량 500만 Da 이상의 고분자 히알루론산을 생산 가능하며, 뿐만아니라 내당성 특성을 보유하며 고분자 히알루론산의 생산능이 현저히 높은 것이 특징이다. 또한 내열성 특성을 보유하여 40℃ 이상의 고온에서도 고분자 히알루론산 생산능이 매우 우수하며, 이에 따라 산업적 규모의 대량 배양 공정에서 다른 오염균에 의한 오염 우려와 이에 따른 추가 공정들을 현저히 줄일 수 있어 경제적인 가치 또한 매우 우수하므로, 산업상 이용가능성이 크다.As described above, the present invention relates to a novel Streptococcus genus UBC-U46 strain (accession number: KCTC13556BP) and a method for producing hyaluronic acid using the same. The UBC-U46 strain of the genus Streptococcus of the present invention is capable of producing a polymer hyaluronic acid having an average molecular weight of 5 million Da or more, as well as possessing sugar resistance characteristics and having a high production capacity of the polymer hyaluronic acid. In addition, it possesses heat-resistant properties, so it has excellent polymer hyaluronic acid production capacity even at high temperatures of 40 ℃ or higher. Accordingly, it is economically valuable because it can significantly reduce the risk of contamination by other contaminants and additional processes in industrial-scale mass cultivation processes. Since it is very good, it has great industrial applicability.

한국생명공학연구원Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KCTC13556BPKCTC13556BP 2018062120180621

Claims (12)

스트렙토코커스 속 UBC-U46 (Streptococcus sp. UBC-U46, 기탁번호 KCTC13556BP) 균주.
Streptococcus genus UBC-U46 ( Streptococcus sp.UBC-U46, accession number KCTC13556BP) strain.
제1항에 있어서, 상기 균주는 내열성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
The strain according to claim 1, wherein the strain has heat resistance.
제1항에 있어서, 상기 균주는 내당성을 갖는 것을 특징으로하는 균주.
The strain according to claim 1, wherein the strain has glucose tolerance.
제1항에 있어서, 상기 균주는 평균분자량 500만Da 이상의 고분자 히알루론산을 생산하는 것을 특징으로 하는 균주.
The strain of claim 1, wherein the strain produces a polymer hyaluronic acid having an average molecular weight of 5 million Da or more.
제1항의 균주를 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산방법.
A method for producing hyaluronic acid, comprising culturing the strain of claim 1 in a medium containing a carbon source and a nitrogen source.
제5항에 있어서, 상기 탄소원은 포도당, 만니톨, 과당, 유당, 만노스, 젖당, 자당, 자일로스, 전분, 덱스트린, 글리세린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 5, wherein the carbon source is selected from the group consisting of glucose, mannitol, fructose, lactose, mannose, lactose, sucrose, xylose, starch, dextrin, glycerin and mixtures thereof.
제5항에 있어서, 상기 질소원은 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract), 트립톤(tryptone), 탈지우유(skim milk), 건조효모(dry yeast), 카제인(casein), 대두박(soybean meal), 소고기 추출물(beef extract) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 5, wherein the nitrogen source is peptone (peptone), yeast extract (yeast extract), tryptone (tryptone), skim milk (skim milk), dry yeast (case yeast), casein, soybean meal (soybean meal) ), Beef extract (beef extract) and mixtures thereof.
제5항에 있어서, 상기 배양은 pH7.2 내지 pH8.2에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 5, wherein the culture is carried out at pH7.2 to pH8.2.
제5항에 있어서, 상기 배양은 28℃ 내지 48℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 5, wherein the culture is carried out at a temperature of 28 ℃ to 48 ℃.
제5항에 있어서, 상기 배양은 40℃ 내지 45℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 5, wherein the culture is performed at a temperature of 40 ° C to 45 ° C.
제1항의 균주를 포도당, 만니톨, 소이펩톤 및 효모추출물을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 히알루론산 생산 방법.
A method for producing hyaluronic acid, comprising culturing the strain of claim 1 in a medium containing glucose, mannitol, soypeptone, and yeast extract.
제11항에 있어서, 상기 배지는
포도당 100g/L 내지 200g/L;
만니톨 0.5g/L 내지 3g/L;
소이펩톤 1g/L 내지 5g/L; 및
효모추출물 10g/L 내지 50g/L을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 11, wherein the medium
Glucose 100g / L to 200g / L;
Mannitol 0.5 g / L to 3 g / L;
Soypeptone 1 g / L to 5 g / L; And
Method comprising the yeast extract 10g / L to 50g / L.
KR1020180130275A 2018-10-29 2018-10-29 Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same KR102489403B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180130275A KR102489403B1 (en) 2018-10-29 2018-10-29 Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180130275A KR102489403B1 (en) 2018-10-29 2018-10-29 Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200048312A true KR20200048312A (en) 2020-05-08
KR102489403B1 KR102489403B1 (en) 2023-01-17

Family

ID=70677293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180130275A KR102489403B1 (en) 2018-10-29 2018-10-29 Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102489403B1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230081015A (en) 2021-11-30 2023-06-07 한국생산기술연구원 Method for producing Polyhydroxyalkanoate from mixed alkanes

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100577075B1 (en) 2004-06-16 2006-05-08 주식회사 티앤라이프시스템 Method for purifying hyaluronic acid using calcium salt and phosphate salt, or calcium phosphate salt
KR101027630B1 (en) 2008-06-18 2011-04-07 주식회사 제네웰 Preparation method of porous scaffold by hyaluronic acid - collagen natural polymer for cartilage resuscitation
KR20130035808A (en) * 2011-09-30 2013-04-09 일동제약주식회사 Streptococcus dysgalactiae id9103 and method for production of hyaluronic acid using the same
KR101598329B1 (en) * 2013-03-20 2016-02-29 일동제약주식회사 Method for manufacturing of hyaluronic acid and the composition for anti adhesion comprising the hyaluronic acid by the same method
KR20170089469A (en) * 2016-01-26 2017-08-04 에스케이바이오랜드 주식회사 Anti-aging functional health food composition comprising hyaluronic acid
KR101784864B1 (en) * 2016-10-07 2017-10-12 (주)진우바이오 Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001 and Preparing Method for High Molecular Weight Hyaluronic Acid Using the same
KR20170126416A (en) 2016-05-09 2017-11-17 송석진 Injectable composition for filler comprising porous biodegradable microspheres and water soluble natural polymers

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100577075B1 (en) 2004-06-16 2006-05-08 주식회사 티앤라이프시스템 Method for purifying hyaluronic acid using calcium salt and phosphate salt, or calcium phosphate salt
KR101027630B1 (en) 2008-06-18 2011-04-07 주식회사 제네웰 Preparation method of porous scaffold by hyaluronic acid - collagen natural polymer for cartilage resuscitation
KR20130035808A (en) * 2011-09-30 2013-04-09 일동제약주식회사 Streptococcus dysgalactiae id9103 and method for production of hyaluronic acid using the same
KR101598329B1 (en) * 2013-03-20 2016-02-29 일동제약주식회사 Method for manufacturing of hyaluronic acid and the composition for anti adhesion comprising the hyaluronic acid by the same method
KR20170089469A (en) * 2016-01-26 2017-08-04 에스케이바이오랜드 주식회사 Anti-aging functional health food composition comprising hyaluronic acid
KR20170126416A (en) 2016-05-09 2017-11-17 송석진 Injectable composition for filler comprising porous biodegradable microspheres and water soluble natural polymers
KR101784864B1 (en) * 2016-10-07 2017-10-12 (주)진우바이오 Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001 and Preparing Method for High Molecular Weight Hyaluronic Acid Using the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Biosci Bioeng.,109(4):356-360(2009.10.31)* *
J Ind Microbiol Biotechnol.,36:1337-1344(2009.7.22.)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230081015A (en) 2021-11-30 2023-06-07 한국생산기술연구원 Method for producing Polyhydroxyalkanoate from mixed alkanes

Also Published As

Publication number Publication date
KR102489403B1 (en) 2023-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60131752T2 (en) BACILLUS SUBTILIS VAR. CHUNGKOOKJANG FOR THE PREPARATION OF POLY-GAMMA GLUTAMIC ACID WITH HIGH MOLECULAR WEIGHT
KR101322227B1 (en) Streptococcus dysgalactiae ID9103 and method for production of hyaluronic acid using the same
US20080138865A1 (en) Optimisation of culture conditions for production and process of purification of high molecular weight hyaluronic acid
US9896706B2 (en) Method for producing β-glucan
KR101970439B1 (en) A novel Komagataeibacter rhaeticus Strain and Method for Producing Cellulose Sheet Using the Same
US20160009828A1 (en) Preparation method for hyaluronic acid, and anti-adhesive composition comprising hyaluronic acid prepared by same preparation method
KR102489403B1 (en) Novel Streptococcus sp. UBC-U46 strain and method for production of hyaluronic acid using the same
RU2639557C1 (en) Xanthomonas campestris bacteria strain - xanthan producer
KR101087969B1 (en) Method of hyaluronic acid production through fermentation process from microorganism
KR100250573B1 (en) Hyaluronic acid
KR102249438B1 (en) Strain for producing hyaluronic acid and preparing method of hyaluronic acid using the same
KR101784864B1 (en) Streptococcus equi sub. zooepidemicus kdk0001 and Preparing Method for High Molecular Weight Hyaluronic Acid Using the same
JPH07102100B2 (en) Chitin degradation product food material
KR20120119060A (en) Streptococcus equisubsp. zooepidemicus and method for preparing hyaluronic acid using the same
KR100472007B1 (en) Microorganism producing hyaluronic acid and method of producing hyalironic acid using thereof
KR100462904B1 (en) Manufacturing process for producing Alginate lyase using Xanthomonas sp. BH-1, newly isolated marine bacterium
KR100303066B1 (en) Streptococcus sp. microorganism producing hyaluronic acid
RU2744107C1 (en) Xanthomonas fuscans bacterial strain - producer of xanthan gum
KR100494808B1 (en) Bacillus sp. A8 that is produced the polysaccharide, its application or polysaccharide produced from the same strain
Rajendran et al. Biocompatible nanofiber from exopolysaccharide produced by moderately halophilic Paenibacillus alvei
KR102546266B1 (en) The method for selectively obtaining a polysaccharide of specific molecular mass derived from microalgae
KR101081745B1 (en) Staphylococcus saprophyticus BMSZ711 producing poly-Ν-acetylglucosamine and method for producing poly―Ν―acetylglucosamine from Staphylococcus saprophyticus BMSZ711
KR20080011346A (en) A method for preparing carrageenan lyase and oligo galactan from carrageenan using pseudomonas sp. hs5322
KR20080006931A (en) Method for producing the alginate lyase from marine microorganism vibrio sp. s21
Hameed et al. Enhancement and optimization of cellulose production by Gluconacetobacter xylinus N2

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant