KR20080011346A - A method for preparing carrageenan lyase and oligo galactan from carrageenan using pseudomonas sp. hs5322 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 해양 미생물 슈도모나스 에스피 에치에스 5322 균주를 이용한 카라기난 분해효소 및 올리고당의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 피뿔고둥에서 분리한 신규 해양 미생물 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322 KCTC 18103P를 최적화 배지에서 배양하여 세포외 카라기난 분해효소의 고효율 제조 및 상기 분해효소를 이용한 올리고 갈락탄의 제조에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing carrageenan degrading enzyme and oligosaccharide using marine microorganism Pseudomonas sp. More specifically, the present invention is to cultivate a novel marine microorganism Pseudomonas sp . HS5322 KCTC 18103P isolated from the pyramid in an optimized medium for the high-efficiency production of extracellular carrageenan degrading enzyme and oligogalactan using the degrading enzyme It is about manufacture.
카라기난(Carrageenan)은 홍조류에서 제조되는 해조류의 세포벽을 구성성분으로 존재하는 해조 다당류로서 황산기가 다량 함유되어 있고, 구조에서 유래하는 독특한 물성으로 인해 다양한 분야에서 사용되고 있으며, 특히 식품의 물성을 조절하는 당질로 유가공, 육가공 및 소스류와 같은 식품 가공 산업에 널리 이용되고 있다. 카라기난은 갈락토스에 황산기가 다량 결합한 구조이고 황산기의 결합 위치에 따라 카파, 람다 및 아이오타 카라기난 등으로 나누며 종류에 따라 다양한 물성이 있다. 한편 황산기를 다량 함유하고 있는 카라기난을 생리활성 물질로 이용하기 위한 일련의 연구들이 행해진바 있으며, 항혈액응고 작용이나 항균활성과 같은 특정의 생리 활성을 가지는 것으로 밝혀진 바 있다.Carrageenan is a seaweed polysaccharide that contains the cell wall of algae manufactured in red algae as a component and contains a large amount of sulfate group, and is used in various fields because of its unique physical properties. Furnaces are widely used in food processing industries such as dairy processing, meat processing and sauces. Carrageenan has a structure in which sulfate groups are bonded to galactose in a large amount, and it is divided into kappa, lambda, and iota carrageenan according to the position of the sulfate group. On the other hand, a series of studies have been conducted to use carrageenan containing a large amount of sulfate as a physiologically active substance, and it has been found to have specific physiological activities such as anticoagulant activity and antibacterial activity.
최근 식생활이 서구화됨에 따라 비만, 동맥경화, 협심증, 당뇨병 등의 여러 가지 성인성 질병에 대한 예방과 치료에 식이섬유의 약리효과가 입증되었으며, 해조 중에 다량 함유되어 있는 다당류는 혈장 콜레스테롤 저하효과, 항혈액 응고효과, 항암효과 등의 약리효과와 식이섬유로서의 영양상의 효과가 높은 것으로 밝혀졌으며, 식이섬유 효과와 약리효과는 그 중합도를 낮추었을 때 원래의 다당류에 비해 그 효과가 증대된다는 연구결과도 보고되어 있다. With the recent westernization of diet, the pharmacological effects of dietary fiber have been demonstrated in the prevention and treatment of various adult diseases such as obesity, arteriosclerosis, angina pectoris and diabetes mellitus. Pharmacological effects such as blood coagulation effect, anticancer effect and nutritional effect were found to be high, and research results showed that the effect of dietary fiber effect and pharmacological effect is increased compared to the original polysaccharide when the degree of polymerization is lowered. It is.
국내에서의 해양자원을 이용한 올리고당 제조에 관한 연구는 주로 키토산의 산가수분해법에 대한 연구가 많이 수행되었고 특히 올리고키토산의 항암 및 면역활성에 관한 연구(류, 1992)와 키틴 및 키토산의 소화관내 기능성에 관한 in vitro 연구(장 등, 1994) 등이 되어 있다. 해조다당류의 이용에 관한 연구로는 윤 등에 의해 유기산에 의한 알긴산 올리고당 생산에 관한 제조방법이 특허로 출원된바 있다(대한민국 특허출원번호 제2001-0018801호).In Korea, research on the production of oligosaccharides using marine resources has been mainly conducted on the acid hydrolysis of chitosan. Especially, studies on the anti-cancer and immune activity of oligochitosan (Ryu, 1992) and the function of chitin and chitosan in the digestive tract About in in vitro studies (Chang et al., 1994). As a study on the use of seaweed polysaccharides, a manufacturing method for producing alginic acid oligosaccharides by organic acids has been filed by Yun et al. (Korean Patent Application No. 2001-0018801).
해조 다당류 카라기난의 올리고당화를 위한 방법으로 미생물 분해효소를 이용한 특허는 보고되어 있지 않고, 대한민국 특허출원번호 제1999-0034910호로 제출된 유기산을 이용한 카라기난 올리고당의 제조방법이 있을 뿐이다. 이처럼 카라기난을 이용한 올리고당 제조를 위하여 제조공정까지 진척되었음에도 불구하고 미생 물 유래 카라기난 분해효소 생산에 관한 연구 결과는 미진한 편이며 카라기난 분해효소를 고효율로 생산하는 미생물을 분리하는 연구 보고는 거의 없는 실정이다.Patents using microbial degrading enzymes as a method for oligosaccharide oligosaccharides of seaweed polysaccharides are not reported, and there is only a method for preparing carrageenan oligosaccharides using organic acids submitted to Korean Patent Application No. 1999-0034910. Despite the progress of the manufacturing process for the production of oligosaccharides using carrageenan, research on the production of microorganism-derived carrageenan degrading enzymes is inadequate, and there are few reports of separating microorganisms that produce carrageenan degrading enzymes with high efficiency.
이에 본 발명자들은 카라기난 분해효소 대량생산방법에 관한 연구를 거듭한 결과 미생물을 이용하여 대량생산하는 본 발명에 이르게 되었다.Accordingly, the present inventors have led to the present invention of mass production using microorganisms as a result of repeated studies on the mass production method of carrageenan degrading enzyme.
따라서, 본 발명의 목적은 카라기난 분해효소를 생산하는 해양 미생물을 분리 동정하고자 한다.Accordingly, an object of the present invention is to isolate and identify marine microorganisms producing carrageenan degrading enzymes.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 카라기난 분해효소(Carrageenan lyase)를 고효율로 제조하는 방법을 제공하고자 한다.Another object of the present invention is to provide a method for producing carrageenan lyase using the microorganism with high efficiency.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 카라기난 분해효소를 이용하여 카라기난 올리고당을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.Still another object of the present invention is to provide a method for preparing carrageenan oligosaccharides using the carrageenan degrading enzyme.
본 발명의 상기 목적을 달성하기 위하여 복족류의 피뿔고둥의 소화관으로부터 카라기난 분해효소 생산성이 우수한 신규 해양 미생물을 분리하고, 상기 미생물에서 카라기난 분해효소를 고효율로 제조하기 위한 최적조건을 확립하고, 상기 미생물에서 분리한 카라기난 분해효소를 이용하여 카라기난으로부터 올리고당을 제조하기 위한 최적조건을 확립함으로써 달성하였다. In order to achieve the above object of the present invention, a new marine microorganism having excellent carrageenan degrading enzyme productivity is isolated from a gastrointestinal python's digestive tract, establishing optimum conditions for producing carrageenan degrading enzyme from the microorganism with high efficiency, and This was accomplished by establishing optimum conditions for producing oligosaccharides from carrageenan using isolated carrageenan degrading enzymes.
본 발명은 피뿔고둥에서 카라기난 분해효소 생산능이 우수한 신규 해양 미생물 분리 동정단계; 상기 미생물에서 카라기난 분해효소를 고효율로 제조하기 위한 배양조건 확립단계; 및, 상기 카라기난 분해효소를 이용하여 올리고당을 제조하기 위한 최적조건 확립단계로 구성된다.The present invention is a new marine microorganism isolation step of excellent carrageenan degrading enzyme production ability in the pyramid; Culturing conditions for producing carrageenan degrading enzymes in the microorganism with high efficiency; And establishing optimal conditions for producing oligosaccharides using the carrageenan degrading enzyme.
본 발명은 피뿔고둥 유래의 신규한 해양 미생물 슈도모나스 에스 피(Pseudomonas sp.) HS5322 KCTC 18103P를 이용하는 것을 특징으로 하는 카라기난 분해효소의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing carrageenan degrading enzyme, characterized by using a novel marine microorganism Pseudomonas sp . HS5322 KCTC 18103P derived from the pyramid.
본 발명의 카라기난 분해효소를 제조하기 위해, 카라기난 10g/L, 펩톤 10g/L, 효모추출물 5g/L, 해수 750㎖/L 및 증류수 250㎖/L로 구성된 카라기난 분해효소 생산용 배지에 상기 미생물을 1×103 cell/㎖ 씩 접종하여 배양한다.In order to prepare the carrageenan degrading enzyme of the present invention, the microorganism is added to the carrageenan degrading enzyme production medium consisting of carrageenan 10g / L, peptone 10g / L, yeast extract 5g / L, seawater 750ml / L and distilled water 250ml / L. Inoculate 1 × 10 3 cells / ml and incubate.
본 발명의 카라기난 분해효소를 대량생산하기 위해, 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322 KCTC 18103P 배양액을 카라기난 10g/L, 펩톤 10g/L, 효모추출물 10g/L, 해수 750㎖/L 및 증류수 250㎖/L로 구성된 카라기난 분해효소 생산용 배지에 첨가하여 20℃, pH7.5에서, 76시간 동안 발효시킴을 특징으로 한다.To mass-produce the carrageenan degrading enzyme of the present invention, Pseudomonas sp . HS5322 KCTC 18103P culture medium was carrageenan 10g / L, peptone 10g / L, yeast extract 10g / L, seawater 750ml / L and distilled water 250ml / Carrageenan degrading enzyme production medium consisting of L is characterized in that the fermentation for 76 hours at 20 ℃, pH7.5.
본 발명은 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322 KCTC 18103P 유래의 카라기난 분해효소를 40℃, pH8, 2.0% NaCl의 효소반응조건에서 효소반응시켜 카라기난 올리고당을 제조하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for preparing carrageenan oligosaccharides by enzymatic reaction of carrageenan degrading enzyme derived from Pseudomonas sp . HS5322 KCTC 18103P at 40 ° C.,
본 발명은 해양 미생물 슈도모나스 에스피 에치에스 5322 균주를 이용한 카라기난 분해효소 및 올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 피뿔고둥에서 분리한 신규 해양 미생물 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322 KCTC 18103P를 최적화 배지에서 배양하여 세포외 카라기난 분해효소의 고효율 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서 본 발명은 홍조류의 진두발 등과 같은 해조류 유래 천연 다당류인 카라기난을 효소공학적 가수분해에 의해 카라기난 올리고당을 경제적으로 대량생산할 수 있는 고효율 카라기난 분해효소를 제공하므로 식품공학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.The present invention relates to a method for producing carrageenan degrading enzyme and oligosaccharide using marine microorganism Pseudomonas sp . Etches 5322 strain, and cultivated a novel marine microorganism Pseudomonas sp . HS5322 KCTC 18103P isolated from pyramids in cells Besides, there is an excellent effect of providing a high-efficiency manufacturing method of carrageenan degrading enzyme. Therefore, the present invention provides a highly efficient carrageenan degrading enzyme that can economically mass-produce carrageenan oligosaccharides by enzymatic engineering of carrageenan derived from algae-derived polysaccharides such as red head of red algae.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되지 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention and the present invention is not limited thereto.
실시예Example 1: One: 카라기난Carrageenan 분해효소 생산 미생물의 분리 및 동정 Isolation and Identification of Degrading Enzyme-producing Microorganisms
부산 기장군 칠암마을에서 채집된 피뿔고둥의 소화관 내용물에서 카라기난 분해효소를 생합성하는 미생물을 분리하기 위하여 121℃에서 15분간 멸균한 카라기난 분해 미생물 분리용 액체배지(카라기난 10g/L, 효모 추출물 2g/L, K2HPO4 2g/L, MgSO4·7H20 1g/L, KCl 1g/L, CaCl2·2H2O 0.05g/L) 50㎖이 들어있는 250㎖-삼각플라스크에 소화관 내용물 1g을 접종하여 20℃, 200rpm으로 유지되는 진탕배양기(VS-8480SF, 비전과학, 대한민국)에서 탄소원으로 카라기난을 분해하여 대사할 수 있는 미생물만 생존할 수 있도록 76시간씩 3회 배양하였다.Liquid medium for separating carrageenan-decomposing microorganisms sterilized at 121 ° C. for 15 minutes to separate the biosynthesis of carrageenan-degrading enzymes from the digestive tract contents of the pythons collected from Chil-Am Village, Busan, Korea (carrageenan 10g / L, yeast extract 2g / L, K 2 HPO 4 2g / L,
상기 배양액을 연속적으로 1×10- 2 부터 1×10-6까지 희석하여 카라기난 분해 미생물 고체배지(카라기난 10g/L, 효모 추출물 2g/L, NaCl 2g/L, K2HPO4 2g/L, MgSO4·7H20 1g/L, KCl 1g/L, CaCl2·2H2O 1g/L, agar 15g/L)에 각각 100㎕를 접종하 여 유리막대로 잘 분산시켜 20℃ 항온배양기(IB-25G, 제이오텍, 대한민국)에서 48시간 배양 후 105 희석액을 접종한 고체배지에서 카라기난 용해 능력이 있는 콜로니 5개를 분리하였다. 이들 콜로니를 상기 카라기난 분해 미생물 분리용 액체배지에 접종하여 진탕배양기에서 24시간 동안 배양하여 카라기난 분해효소 활성이 가장 우수한 HS5322 균주를 선발하였다.1 × 10 continuously the culture liquid-diluted from 2 to 1 × 10 -6 carrageenan degradation microbes solid medium (carrageenan 10g / L, yeast extract 2g / L, NaCl 2g / L ,
상기에서 신규로 분리한 HS5322균주의 정확한 계통학적 분류를 위하여 16S rDNA 유전자를 분리하여 1,474개의 염기서열을 분석하여 GenBank 데이터베이스의 다양한 미생물의 염기서열과 비교한 결과 슈도모나스속(Pseudomomas) 미생물과 97%이상 유사한 염기서열을 보여 피뿔고둥 소화관에서 신규로 분리한 HS5322균주를 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이라 명명하고, 2004년 6월 22일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 특허기탁하여 수탁번호 KCTC 18103P를 부여받았다.For accurate phylogenetic classification of the newly isolated HS5322 strain, 16S rDNA genes were isolated and analyzed for 1,474 nucleotide sequences and compared with nucleotide sequences of various microorganisms in the GenBank database. As a result, more than 97% of Pseudomomas microorganisms were identified. Pseudomonas sp . HS5322, a newly isolated HS5322 strain from the pyramidal gut, showed a similar sequence and was deposited and deposited with the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology (KCTC) on June 22, 2004. The number KCTC 18103P was assigned.
실시예Example 2: 본 발명 2: present invention 카라기난Carrageenan 분해효소 생산 미생물에서 고효율의 High efficiency in lyase-producing microorganisms 카라기난Carrageenan 분해효소 제조 Lyase
*상기 실시예 1에서 분리 동정한 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322에서 고효율의 카라기난 분해효소를 제조하기 위한 최적 조건을 확립하고자 하였다.* It was intended to establish the optimum conditions for the production of carrageenan degrading enzyme of high efficiency in Pseudomonas sp . HS5322 isolated and identified in Example 1.
실험예Experimental Example 1: One: 카라기난Carrageenan 분해효소 생산에 대한 On the production of degrading enzymes 카라기난Carrageenan 농도의 영향 Influence of concentration
카라기난 분해효소 생산에 대한 카라기난 농도의 영향을 확인하기 위하여 카라기난 분해효소 생산용 기본배지(펩톤 5g/L, 효모 추출물 10g, 증류수 250㎖/L, 해수 750㎖/L)에 카라기난이 0.6% 첨가한 배지부터 0.1% 증가시켜 1.3%까지(6~13g/L의 농도) 카라기난을 함유한 각 배지가 100㎖씩 들어있는 250㎖-삼각플라스크에 상기 분리/동정한 카라기난 분해효소 생합성 균주 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322 균주를 각각 1×103 cell/㎖ 접종 후 20℃, 200rpm을 유지되는 진탕 배양기(인트론바이오테크놀로지, 대한민국)에서 72시간 동안 배양하여, 세균 수와 카라기난 분해효소 활성을 측정하였다. To determine the effect of carrageenan concentration on carrageenan degrading enzyme production, carrageenan was added 0.6% to carrageenan degrading enzyme production medium (peptone 5g / L, yeast extract 10g, distilled water 250ml / L, seawater 750ml / L). Carrageenan degrading enzyme biosynthetic strain Pseudomonas sp. Isolated / identified in 250 ml-triangular flask containing 100 ml of each medium containing carrageenan from 0.1% to 1.3% (concentration of 6-13 g / L) from medium. sp .) HS5322 strain was incubated for 72 hours in a shake incubator (Intron Biotechnology, South Korea) maintained at 20 ℃, 200rpm after inoculating 1 × 10 3 cell / ml, respectively, and bacterial counts and carrageenan enzyme activity were measured.
세균수는 헤마토사이토메타를 이용하여 현미경으로 직접 계수하였고, 카라기난 분해효소 활성 측정은 기질로써 0.5% 카라기난 용액 0.9㎖에 배양액 0.1㎖을 첨가하여, 37℃에서 20분간 반응시킨 후 Somogyi-Nelson법에 의해 흡광도(510nm)를 측정하여 환원당 생성량을 측정하였다. 카라기난 분해효소 1Unit은 효소반응 1분동안 1mole의 환원당을 생산하는데 필요한 효소량으로 정의하였다. Bacterial count was directly counted under a microscope using hematocytometa. Carrageenan degrading enzyme activity was measured by adding 0.1 ml of culture solution to 0.9 ml of 0.5% carrageenan solution as a substrate and reacting at 37 ° C. for 20 minutes, followed by Somogyi-Nelson method. The absorbance (510 nm) was measured to determine the amount of reducing sugar produced. One unit of carrageenan degrading enzyme was defined as the amount of enzyme required to produce 1 mole of reducing sugar during one minute of enzymatic reaction.
표 1에 나타난 바와 같이, 배양 초기에 카라기난 10g/L을 첨가할 경우 카라기난 분해효소 활성이 가장 높은 결과를 보였다. 따라서 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 이용한 카라기난 분해효소 제조를 위한 최적 카라기난의 농도는 10g/L임을 알 수 있었다. As shown in Table 1, the addition of carrageenan 10g / L at the beginning of the culture showed the highest carrageenan degrading enzyme activity. Therefore, the optimum carrageenan concentration for preparing carrageenan degrading enzyme using Pseudomonas sp . HS5322 was found to be 10 g / L.
실험예Experimental Example 2: 2: 카라기난Carrageenan 분해효소 생산에 대한 질소원의 영향 Effect of Nitrogen Sources on the Production of Degrading Enzymes
실험예 1의 기본배지에서 탄소원을 카라기난 10g/L로 대체하고 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 이용한 카라기난 분해효소 생산에 대한 질소원의 영향을 살펴 보기 위하여 여러 종류의 질소원을 각각 10g/L로 첨가하여 실험예 1과 동일한 조건으로 배양하였다.In the basic medium of Experimental Example 1, the carbon source was replaced with 10 g / L of carrageenan and 10 g / L of various nitrogen sources were added to examine the effect of nitrogen source on carrageenan degrading enzyme production using Pseudomonas sp . HS5322. And cultured under the same conditions as in Experimental Example 1.
표 2에 나타난 바와 같이, 펩톤 10g/L를 질소원으로 이용할 경우 카라기난 분해효소 활성이 18U을 얻었다.As shown in Table 2, when using 10 g / L of peptone as a nitrogen source, 18U of carrageenan degrading enzyme activity was obtained.
상기로부터, 최적 질소원으로 펩톤 농도의 영향을 살펴보기 위하여 펩톤 농도를 5~20g/L로 달리하여 배양하였다. From the above, in order to examine the effect of the peptone concentration as the optimum nitrogen source, the peptone concentration was incubated by varying from 5 to 20g / L.
표 3에 나타난 바와 같이, 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 이용한 카라기난 분해효소 제조를 위한 최적 질소원은 펩톤 10g/L임을 알 수 있었다.As shown in Table 3, the optimum nitrogen source for the production of carrageenan degrading enzyme using Pseudomonas sp . HS5322 was found to be 10 g / L peptone.
실험예Experimental Example 3: 3: 카라기난Carrageenan 분해효소 생산에 대한 효모추출물의 영향 Effect of Yeast Extract on the Production of Degrading Enzymes
실험예 1의 카라기난 분해효소 생산용 기본배지에서 탄소원으로 카라기난 10g/L와 질소원으로 펩톤 10g/L로 대체하고 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 이용하여 카라기난 분해효소 생산에 대한 효모추출물의 영향을 살펴보기 위하여 효모 추출물을 0~10g/L로 첨가하여 배양하였다.In the basic medium for carrageenan degrading enzyme production of Experimental Example 1, 10g / L of carrageenan as a carbon source and 10g / L of peptone as a nitrogen source were used and the effect of yeast extract on carrageenan degrading enzyme production using Pseudomonas sp . In order to examine the yeast extract was incubated by adding 0 ~ 10g / L.
표 4에 나타난 바와 같이, 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 이용한 카라기난 분해효소 제조를 위한 최적 효모추출물은 5g/L임을 알 수 있었다.As shown in Table 4, the optimum yeast extract for the production of carrageenan degrading enzyme using Pseudomonas sp . HS5322 was found to be 5g / L.
실험예Experimental Example 4: 4: 카라기난Carrageenan 분해효소 생산에 대한 해수 농도의 영향 Effect of Seawater Concentration on the Production of Degrading Enzymes
슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 이용한 카라기난 분해효소 생산에 대한 해수 농도의 영향을 살펴보기 위하여 상기 실험예 3까지의 결과로부터 얻은 최적배지에서 해수 농도를 0~90%까지 달리하여 실험예 1과 동일한 조건으로 배양하였다.In order to examine the effect of seawater concentration on carrageenan degrading enzyme production using Pseudomonas sp . HS5322, the seawater concentration was varied from 0 to 90% in the optimum medium obtained from the results of
표 5에 나타난 바와 같이, 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 이용한 카라기난 분해효소 제조를 위한 최적 해수 농도는 75%임을 알 수 있었다.As shown in Table 5, the optimum seawater concentration for the production of carrageenan degrading enzyme using Pseudomonas sp . HS5322 was 75%.
실험예Experimental Example 5: 발효조 배양에 의한 5: by fermenter culture 카라기난Carrageenan 분해효소 제조 Lyase
상기 플라스크 배양으로부터 얻은 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322 배양액 200㎖을 카라기난 분해효소 생산에 대한 최적배지(펩톤 10g/L, 효모 추출물 10g/L, 카라기난 10g/L, 증류수 250㎖/L 및 해수 750㎖/L) 8L가 들어있는 10L 발효조(BG-12, Hanil R&D Co., 대한민국)에 접종하여 대량배양을 하였다. 200 ml of Pseudomonas sp . HS5322 culture broth obtained from the flask culture was optimally prepared for carrageenan degrading enzyme production (10 g / L of peptone, 10 g / L of yeast extract, 10 g / L of carrageenan, 250 ml / L of distilled water and 750 of seawater). ㎖ / L) was inoculated in a 10L fermenter (BG-12, Hanil R & D Co., South Korea) containing 8L was mass culture.
호기성 미생물이므로 200rpm으로 교반하면서 공기를 0.1vvm으로 공급하고, 2N HCl 수용액과 2N NaOH 수용액을 이용하여 발효조 내의 pH를 7.5로 자동제어하고 배양온도를 20℃로 유지하면서 120시간 동안 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 배양하였다.Since it is an aerobic microorganism, the air is supplied at 0.1vvm while stirring at 200rpm, and the pH in the fermenter is automatically controlled to 7.5 by using 2N HCl aqueous solution and 2N NaOH aqueous solution, and Pseudomonas sp is maintained for 120 hours while maintaining the culture temperature at 20 ° C. .) HS5322 was incubated.
도 1에 나타난 바와 같이, 배양 76시간 후에 카라기난 분해효소 17U을 제조할 수 있었다.As shown in Figure 1, after 76 hours of culture carrageenan degrading enzyme 17U could be prepared.
실시예Example 3: 슈도모나스 3: pseudomonas 에스피Esp (( PseudomonasPseudomonas spsp .) .) HS5322HS5322 유래의 Origin 카라기난Carrageenan 분해효소의 생화학적 특성 조사 Biochemical Characterization of Degrading Enzymes
상기 실험예 5의 발효조 배양으로부터 얻은 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322를 배양액을 12,000rpm으로 30분간 원심분리(SUPRA22K Hanil R&D Co., 대한민국)하여 균체를 제거하고, 배제 분자량 100kDa의 중공사막 카트리지를 장착한 한외여과장치(U/F system, 케미코어 인코퍼레이티드, 대한민국)에 균체가 제거된 상등액 5L(약 170,000 Unit)를 70㎖/min의 유속으로 여과하여 고분자 물질을 제거하여 4.0L의 배양액을 얻었다. 상기 배양액을 배제 분자량 10kDa의 중공사막 카트리지가 장착된 한외여과장치에서 저분자 물질을 제거하여 0.5L(약 150,000 Unit)로 농축하였다. 이 농축액에 4.5L의 0.2M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 7.0)을 3회로 나누어 첨가하면서 배제 분자량 10kDa의 중공사막 카트리지가 장착된 한외여과장치에서 70㎖/min의 유속으로 여과하여 탈염을 한 후 0.5L(약 110,000 Unit)의 탈염 카라기난 분해효소를 얻었다. 이를 직접 이용하여 효소의 생화학적 특성을 조사하였다. Pseudomonas sp . HS5322 obtained from the fermentor culture of Experimental Example 5 was centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes (SUPRA22K Hanil R & D Co., South Korea) to remove the cells, and a hollow fiber membrane cartridge having an exclusion molecular weight of 100 kDa was removed. The ultrafiltration device (U / F system, Chemicore Incorporated, Republic of Korea) equipped with 5L of supernatant (about 170,000 Units) from which the cells were removed was filtered at a flow rate of 70ml / min to remove the polymer material. A culture solution was obtained. The culture solution was concentrated to 0.5 L (about 150,000 Units) by removing the low molecular weight material from the ultrafiltration device equipped with a hollow fiber membrane cartridge of 10 kDa exclusion molecular weight. 4.5L of 0.2M potassium phosphate buffer (pH 7.0) was added to the concentrate in three portions, and filtered through an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber membrane cartridge with an exclusion molecular weight of 10 kDa at a flow rate of 70 ml / min, followed by desalination, followed by 0.5 L. (About 110,000 units) of desalted carrageenan degrading enzyme was obtained. This was used directly to investigate the biochemical properties of the enzyme.
실험예Experimental Example 1: One: 카라기난Carrageenan 분해효소의 최적 효소반응 온도 조사 Investigation of optimum enzyme reaction temperature
슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소의 최적 효소반응 온도를 결정하기 위하여 상기 제조된 카라기난 분해효소 2㎕을 0.2 M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 7.0) 100㎖에 희석(2U/㎖ 카라기난 분해효소 표준용액)하여 5~45℃까지 효소반응 온도를 달리하여 실시예 2의 실험예 1과 동일한 조건으로 효소반응을 시켰다.To determine the optimal enzyme reaction temperature of carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322, 2 µl of the prepared carrageenan degrading enzyme was diluted in 100 ml of 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) (2U / ml carrageenan). The enzyme was subjected to the enzyme reaction under the same conditions as Experimental Example 1 of Example 2 by varying the enzyme reaction temperature from 5 to 45 ° C.).
도 2에 나타낸 바와 같이 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소의 최적 효소반응 온도는 35℃이었다. As shown in Fig. 2, the optimum enzyme reaction temperature of carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322 was 35 ° C.
실험예Experimental Example 2: 2: 카라기난Carrageenan 분해효소의 효소반응의 최적 Optimal Enzyme Reaction of Degrading Enzyme pHpH 조사 Research
슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소의 최적 효소반응 pH를 결정하기 위하여 55℃에서 pH를 4~11까지 효소반응 pH를 달리하여 실시예 2의 실험예 1과 동일한 조건으로 효소반응을 시켰다.In order to determine the optimum enzyme reaction pH of carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322, the enzyme was changed at 55 ° C. from 4 to 11 at different enzyme reaction pH under the same conditions as in
도 3에 나타낸 바와 같이 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소의 최적 효소반응 pH는 7~8이었다.As shown in Fig. 3, the optimum pH of the carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322 was 7-8.
실험예Experimental Example 3: 3: 카라기난Carrageenan 분해효소의 열 안정성 조사 Thermal Stability of Degrading Enzymes
슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소의 열 안정성을 결정하기 위하여 효소 희석액을 0~80℃까지 온도를 달리하여 30분 동안 방치한 후 실시예 2의 실험예 1과 동일한 조건의 효소반응으로 잔여활성을 분석하였다.In order to determine the thermal stability of the carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322, the enzyme dilution was allowed to stand at different temperatures from 0 to 80 ° C. for 30 minutes and then under the same conditions as in
도 4에 나타낸 바와 같이 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소는 20~40℃범위에서 열 안정성이 있었으며 최적 열 안정성은 30~40℃이었다.As shown in FIG. 4, the carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322 had thermal stability in the range of 20-40 ° C., and the optimum thermal stability was 30-40 ° C. FIG.
실험예Experimental Example 4: 4: 카라기난Carrageenan 분해효소의 Degrading enzyme pHpH 안정성 조사 Stability investigation
슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소의 pH 안정성을 결정하기 위하여 pH를 4~11까지 달리하여 60분 동안 방치한 후 실시예 2의 실험예 1과 동일한 조건의 효소반응으로 잔여활성을 분석하였다.To determine the pH stability of Pseudomonas sp . HS5322-produced carrageenan degrading enzyme, the pH was varied from 4 to 11 and left for 60 minutes, followed by enzymatic reaction under the same conditions as in
도 5에 나타낸 바와 같이 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소는 pH 8~9 범위 내에서 pH 안정성이 있었으며 최적 pH 안정성은 pH 8.0이었다. As shown in FIG. 5, the carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322 had a pH stability within a pH range of 8-9 and an optimum pH stability of pH 8.0.
실험예Experimental Example 5: 5: 카라기난Carrageenan 분해효소의 효소반응의 최적 Optimal Enzyme Reaction of Degrading Enzyme NaClNaCl 의 농도 조사Investigation of concentration
슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소의 효소반응 NaCl 농도를 결정하기 위하여 NaCl 농도를 0.5~3%까지 달리하여 실시예 2의 실험예 1과 동일한 조건의 효소반응으로 잔여활성을 분석하였다.Enzymatic Reaction of Carrageenan Degrading Enzyme Produced by Pseudomonas sp . HS5322 NaCl concentration was varied from 0.5 to 3% to determine the residual activity by enzyme reaction under the same conditions as in
도 6에 나타낸 바와 같이 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소는 NaCl 2.0%에서 최적의 활성을 나타내었다.As shown in FIG. 6, carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322 showed an optimal activity at 2.0% of NaCl.
상기 결과로부터, 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp.) HS5322이 생산한 카라기난 분해효소의 열 안정성과 pH 안정성을 고려해 볼 때 해조류 유래 카라기난을 가수분해하여 카라기난 올리고당 제조를 위한 효소반응공정의 최적 온도는 40℃, 최적 pH는 8이고 최적의 NaCl 농도는 2.0%임을 알 수 있었다.From the above results, considering the thermal and pH stability of carrageenan degrading enzyme produced by Pseudomonas sp . HS5322, the optimum temperature of the enzymatic reaction process for the production of carrageenan oligosaccharides by hydrolyzing carrageenan derived from algae was 40 ° C. The optimal pH was 8 and the optimal NaCl concentration was 2.0%.
도 1은 세포 배양 시간과 카라기난 분해효소의 활성을 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the cell culture time and the activity of carrageenan degrading enzyme.
도 2는 카라기난 분해효소의 효소반응 온도를 달리하여 효소반응을 실험한 결과를 도시한 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the results of experiments on enzyme reaction by varying the enzyme reaction temperature of carrageenan degrading enzyme.
도 3은 카라기난 분해효소의 효소반응 pH를 달리하여 효소반응을 실험한 결과를 도시한 그래프이다.3 is a graph showing the results of experiments on enzyme reaction by varying the pH of the carrageenan degrading enzyme.
도 4는 카라기난 분해효소의 열안전성을 나타낸 그래프이다.4 is a graph showing the thermal safety of carrageenan degrading enzyme.
도 5는 카라기난 분해효소의 pH 안전성을 결정하기 위해 pH를 달리하여 방치한 후 잔여활성을 분석한 결과를 도시한 그래프이다.Figure 5 is a graph showing the results of analyzing the residual activity after leaving the pH different in order to determine the pH safety of carrageenan degrading enzyme.
도 6은 카라기난 분해효소의 효소반응 최적 NaCl 농도를 나타낸 그래프이다.6 is a graph showing the optimum NaCl concentration of the enzyme reaction of carrageenan degrading enzyme.
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| KR101316086B1 (en) * | 2012-03-12 | 2013-10-11 | 부경대학교 산학협력단 | Novel Microorganism Degrading agar and carrageenan |
| KR101381147B1 (en) * | 2013-05-31 | 2014-04-04 | 오혜숙 | Preparation method of seaweed extract and seaweed extract |
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