KR20200046596A - Large Capacity Biosample Concentration Device and Fabrication Method Thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 실시예가 속하는 기술 분야는 생체 시료 농축 장치 및 그 제조 방법에 관한 것이다. The technical field to which this embodiment pertains relates to a biological sample concentration device and a method for manufacturing the same.
이 부분에 기술된 내용은 단순히 본 실시예에 대한 배경 정보를 제공할 뿐 종래기술을 구성하는 것은 아니다.The contents described in this section merely provide background information for this embodiment, and do not constitute a prior art.
현대 의학은 단순하게 수명을 연장하는 것이 아니라, 건강하게 오래 사는 건강수명의 연장을 실현하는 것을 목적으로 한다. 따라서 미래의학은 치료의학 중심이 아니라, 예방의학(Preventive Medicine), 예측의학(Predictive Medicine), 맞춤의학(Personalized Medicine)의 3P를 구현하는 것으로 패러다임이 변화하고 있다. 이를 구체적으로 실현하기 위해서는 질병의 조기발견 및 조기 치료 등이 매우 중요한 수단이 되고 있으며, 이를 위한 수단으로서 바이오마커(Biomarker)에 대한 연구가 매우 활발하게 이루어지고 있다.Modern medicine aims not to simply extend the lifespan, but also to extend the lifespan of healthy and long-lived health. Therefore, the paradigm is changing as the future medicine is not centered on therapeutic medicine, but is implementing 3P of preventive medicine, predictive medicine, and personalized medicine. In order to realize this in detail, early detection and early treatment of diseases have become very important means, and as a means for this, research on biomarkers has been actively conducted.
바이오마커는 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 말한다. 바이오마커에는 핵산(DNA, RNA), 단백질, 지방질, 대사물질 등과 그 패턴의 변화 등이 이용되고 있다. 즉, 당뇨병의 진단을 위한 혈중 포도당 같은 간단한 물질부터 글리벡의 치료 타겟인 만성골수성백혈병의 BCR-ABL 유전자 융합 같은 유전자 등이 모두 바이오마커에 해당하며 임상에서 실제적으로 사용하는 바이오마커이다.Biomarkers are markers that can distinguish normal or pathological conditions, predict treatment responses, and measure objectively. In biomarkers, nucleic acids (DNA, RNA), proteins, fats, metabolites, and changes in their patterns are used. That is, from simple substances such as blood glucose for diagnosis of diabetes to genes such as BCR-ABL gene fusion of chronic myelogenous leukemia, which is a therapeutic target of Gleevec, all are biomarkers and are biomarkers that are actually used in clinical practice.
핵산 또는 단백질을 분석하여 질병의 발현 및 진행 정도를 파악할 수 있다. 단백질 분석을 위한 기술 및 소자들은 나노 기술을 이용함으로써 소자의 제작이 어렵고 비교적 고가이어서 보급화 되기 어려운 문제점이 있다. 또한, 단백질 분석 장치에 고감도의 센서가 필요하거나 적은 양의 샘플로는 정확한 분석이 어렵다는 단점이 있다. Analysis of nucleic acids or proteins can be used to determine the degree of disease expression and progression. Techniques and devices for protein analysis have a problem in that it is difficult to manufacture devices by using nanotechnology and are relatively expensive to be widely used. In addition, the protein analysis device requires a high-sensitivity sensor or has a disadvantage that accurate analysis is difficult with a small amount of sample.
특허문헌 1은 페이퍼를 접어서 맞닿은 연속된 면에 채널을 형성하고 페이퍼의 중간에 위치한 면에 대상물질을 농축시킨다. 이러한 농축 방식은 농축된 대상물질을 분리하기 편한 장점이 있지만, 대상물질을 대용량으로 농축하는데 한계가 있다.
본 발명의 실시예들은 대상물질이 이동하는 방향과 수직한 방향으로 시트의 길이를 증가시키고, 증가된 길이 방향으로 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 베이스를 형성하고, 기둥 형상을 갖는 두 개의 베이스 사이에 농축판을 위치시키고 전계를 인가함으로써, 대용량의 대상물질을 농축하는 데 발명의 주된 목적이 있다.Embodiments of the present invention increases the length of the sheet in a direction perpendicular to the direction in which the target material moves, winds or folds the sheet in the increased length direction to form a base having a columnar shape, and two bases having a columnar shape The main object of the invention is to concentrate a large-capacity target material by placing an concentrate plate between them and applying an electric field.
본 발명의 명시되지 않은 또 다른 목적들은 하기의 상세한 설명 및 그 효과로부터 용이하게 추론할 수 있는 범위 내에서 추가적으로 고려될 수 있다.Still other unspecified objects of the present invention can be further considered within the scope of being easily deduced from the following detailed description and its effects.
본 실시예의 일 측면에 의하면, 제1 시트의 일부에 제1 선택적 이온 투과층을 코팅하고, 제2 시트의 일부에 제2 선택적 이온 투과층을 코팅하는 코팅 단계, 상기 제1 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 제1 베이스를 형성하는 단계, 상기 제2 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 제2 베이스를 형성하는 단계, 및 상기 제1 베이스 및 상기 제2 베이스의 중간에 농축판을 위치시키고 상기 제1 베이스, 상기 제2 베이스, 및 상기 농축판을 고정시켜 기둥 형상을 갖는 생체 시료 농축 장치를 생성하는 단계를 포함하는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법을 제공한다.According to an aspect of the present embodiment, a coating step of coating a first selective ion permeable layer on a part of the first sheet and coating a second selective ion permeable layer on a part of the second sheet, winding or folding the first sheet Forming a first base having a columnar shape, winding or folding the second sheet to form a second base having a columnar shape, and placing a concentrate plate in the middle of the first base and the second base; It provides a method for manufacturing a large-capacity biological sample concentrating device comprising the step of generating a biological sample concentrating device having a columnar shape by fixing the first base, the second base, and the concentrating plate.
본 실시예의 다른 측면에 의하면, 제1 선택적 이온 투과층이 일부 코팅된 제1 시트가 권취되거나 접혀서 기둥 형상을 갖는 제1 베이스, 제2 선택적 이온 투과층이 일부 코팅된 제2 시트가 권취되거나 접혀서 기둥 형상을 갖는 제2 베이스, 상기 제1 베이스 및 상기 제2 베이스의 중간에 위치하는 기설정된 형상을 갖는 농축판, 및 상기 제1 베이스, 상기 제2 베이스, 및 상기 농축판을 고정시키는 고정수단을 포함하는 대용량 생체 시료 농축 장치를 제공한다.According to another aspect of this embodiment, the first sheet having the first selective ion permeable layer partially coated is wound or folded to form a first base having a column shape, and the second selective ion permeable layer partially coated second sheet is wound or folded. A second base having a column shape, a concentrate plate having a predetermined shape located in the middle of the first base and the second base, and fixing means for fixing the first base, the second base, and the concentrate plate It provides a large-capacity biological sample concentration device comprising a.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 실시예들에 의하면, 대상물질이 이동하는 방향과 수직한 방향으로 시트의 길이를 증가시키고, 증가된 길이 방향으로 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 베이스를 형성하고, 기둥 형상을 갖는 두 개의 베이스 사이에 농축판을 위치시키고 전계를 인가함으로써, 대상물질을 대용량으로 농축할 수 있는 효과가 있다.As described above, according to embodiments of the present invention, the length of the sheet is increased in a direction perpendicular to the direction in which the target material moves, and the sheet is wound or folded in the increased length direction to form a base having a column shape. , By placing the concentrate plate between the two bases having a column shape and applying an electric field, there is an effect that the target material can be concentrated in a large capacity.
여기에서 명시적으로 언급되지 않은 효과라 하더라도, 본 발명의 기술적 특징에 의해 기대되는 이하의 명세서에서 기재된 효과 및 그 잠정적인 효과는 본 발명의 명세서에 기재된 것과 같이 취급된다.Even if the effects are not explicitly mentioned here, the effects described in the following specification expected by the technical features of the present invention and the potential effects thereof are treated as described in the specification of the present invention.
도 1a 내지 도 1b는 본 발명의 실시예들에 따른 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법을 예시한 흐름도이다.
도 2a 내지 도 2f는 본 발명의 실시예들에 따른 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법의 각 단계를 예시한 도면이다.
도 3 내지 도 5는 본 발명의 실시예들에 따른 대용량 생체 시료 농축 장치를 예시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예들에 따른 대용량 생체 시료 농축 장치가 대상물질을 농축하는 과정을 예시한 도면이다.
도 7 내지 도 14는 본 발명의 실시예들에 따른 대용량 생체 시료 농축 장치를 이용하여 대상물질을 농축한 결과를 예시한 도면이다.1A to 1B are flowcharts illustrating a method of manufacturing a large-capacity biological sample concentration device according to embodiments of the present invention.
2A to 2F are diagrams illustrating each step of a method of manufacturing a large-capacity biological sample concentrator according to embodiments of the present invention.
3 to 5 are diagrams illustrating a large-capacity biological sample concentration device according to embodiments of the present invention.
6 is a diagram illustrating a process of concentrating a target material by a large-capacity biological sample concentrator according to embodiments of the present invention.
7 to 14 are views illustrating a result of concentrating a target material using a large-capacity biological sample concentrator according to embodiments of the present invention.
이하, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기능에 대하여 이 분야의 기술자에게 자명한 사항으로서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하고, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다.Hereinafter, when it is determined that the subject matter of the present invention may be unnecessarily obscured by those skilled in the art with respect to known functions related to the present invention, the detailed description will be omitted, and some embodiments of the present invention will be omitted. It will be described in detail through exemplary drawings.
도 1a 내지 도 2b는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법을 예시한 흐름도이고, 도 2a 내지 도 2f는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법의 각 단계를 예시한 도면이다.1A to 2B are flowcharts illustrating a method of manufacturing a large-capacity biological sample concentration device, and FIGS. 2A to 2F are diagrams illustrating each step of a method of manufacturing a large-capacity biological sample concentration device.
대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법은 대상물질이 이동하는 방향과 수직한 방향으로 시트의 길이를 증가시키고, 증가된 길이 방향으로 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 베이스를 형성하고, 기둥 형상을 갖는 두 개의 베이스 사이에 농축판을 위치시키고 전계를 인가함으로써, 대상물질을 대용량으로 농축할 수 있다.The method of manufacturing a large-capacity biological sample concentrator increases the length of a sheet in a direction perpendicular to the direction in which the target material moves, winds or folds the sheet in the increased length direction to form a base having a columnar shape, and has a columnar shape By placing the concentrate plate between the two bases and applying an electric field, the target material can be concentrated in a large capacity.
도 1a를 참조하면, 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법은 제1 시트의 일부에 제1 선택적 이온 투과층을 코팅하고, 제2 시트의 일부에 제2 선택적 이온 투과층을 코팅하는 코팅 단계(S10), 제1 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 제1 베이스를 형성하는 단계(S20), 제2 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 제2 베이스를 형성하는 단계(S30), 제1 베이스 및 제2 베이스의 중간에 농축판을 위치시키고 제1 베이스, 제2 베이스, 및 농축판을 고정시켜 기둥 형상을 갖는 생체 시료 농축 장치를 생성하는 단계(S40)을 포함한다.Referring to Figure 1a, a method of manufacturing a large-capacity biological sample concentration device is a coating step of coating a first selective ion permeable layer on a part of the first sheet and a second selective ion permeable layer on a part of the second sheet (S10) ), Winding or folding the first sheet to form a first base having a column shape (S20), winding or folding the second sheet to form a second base having a column shape (S30), a first base and And placing a concentration plate in the middle of the second base and fixing the first base, the second base, and the concentration plate to generate a biological sample concentration device having a column shape (S40).
도 1b를 참조하면, 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법은 생체 시료 농축 장치를 생성하는 단계(S40) 이후에, 생체 시료 농축 장치를 시료 용액에 침지시키는 단계(S50)를 수행할 수 있다.Referring to FIG. 1B, a method of manufacturing a large-capacity biological sample concentrating device may perform a step (S50) of immersing the biological sample concentrating device in a sample solution after the step of generating a biological sample concentrating device (S40).
대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법은 생체 시료 농축 장치를 시료 용액에 침지시키는 단계(S50) 이후에, 생체 시료 농축 장치의 제1 선택적 이온 투과층 및 제2 선택적 이온 투과층에 전계를 인가하여, 제1 베이스 및 2 베이스에 흡수된 시료의 이동 경로 상에 위치하는 농축판에 시료로부터 분리하려는 대상물을 농축하는 단계(S60)를 수행할 수 있다.The method of manufacturing a large-capacity biological sample concentrating device, after immersing the biological sample concentrating device in a sample solution (S50), applies an electric field to the first selective ion permeable layer and the second selective ion permeable layer of the biological sample concentrator, The step (S60) of concentrating the object to be separated from the sample may be performed on the concentration plate located on the movement path of the sample absorbed by the first base and the second base.
도 2a를 참조하면, 길이가 폭보다 길게 형성된 직사각형 형상을 갖는 제1 시트 및 제2 시트를 준비한다. 농축되는 대상물의 양에 따라 농축판의 두께 또는 농축판의 개수를 조절할 수 있다. 농축판은 복수로 중첩될 수 있다.2A, first and second sheets having a rectangular shape having a length longer than a width are prepared. Depending on the amount of the object to be concentrated, the thickness of the concentrate plate or the number of concentrate plates can be adjusted. Concentrated plates may be superimposed in plural.
도 2b를 참조하면, 복수의 시트에 선택적 이온 투과층을 코팅하는 코팅 단계(S10)는 제1 시트가 펼쳐진 상태에서 제1 시트의 일면을 가로지르도록 제1 선택적 이온 투과층을 코팅하고, 제2 시트가 펼쳐진 상태에서 제2 시트의 일면을 가로지르도록 제2 선택적 이온 투과층을 코팅한다.Referring to Figure 2b, the coating step of coating a selective ion permeable layer on a plurality of sheets (S10) is coated with a first selective ion permeable layer to cross one surface of the first sheet in a state in which the first sheet is unfolded, 2 The second selective ion permeable layer is coated to cross one surface of the second sheet while the sheet is unfolded.
도 2c를 참조하면, 복수의 시트로부터 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 베이스를 형성하는 단계(S20, S30)는 제1 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 제1 베이스를 형성하고, 제2 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 제2 베이스를 형성한다. 제1 시트 및 제2 시트는 길이 방향으로 권취되거나 기설정된 각도 또는 지그재그로 접혀서 기둥 형상을 가짐으로써, 선택적 이온 투과층의 길이 및 단면이 증가되고 대상물이 이동하는 채널의 단면을 증가시켜서 결국 농축되는 용량을 증가시킨다.Referring to FIG. 2C, the steps of winding or folding from a plurality of sheets to form a base having a column shape (S20, S30) are winding or folding the first sheet to form a first base having a column shape, and a second sheet. The second base having a column shape is wound up or folded to form a second base. The first sheet and the second sheet are wound in the longitudinal direction or folded at a predetermined angle or zigzag to have a column shape, thereby increasing the length and cross-section of the selective ion permeable layer and increasing the cross-section of the channel through which the object moves, resulting in concentration. Increase capacity.
도 2d를 참조하면, 생체 시료 농축 장치를 생성하는 단계(S40)는 제1 베이스 및 제2 베이스의 중간에 하나 이상의 농축판을 위치시키고 제1 베이스, 농축판, 및 제2 베이스를 테이프 등의 고정수단으로 감싸 고정시킨다. 고정수단은 플라스틱이나 폴리머 등으로 대체 가능하며 이에 한정되는 것은 아니고 구현되는 설계에 따라 적합한 재료가 사용될 수 있다. 생체 시료 농축 장치는 선택적 이온 투과층의 길이 및 단면이 증가되고 대상물이 이동하는 채널의 단면을 증가시킨 기둥 형상을 갖는다.Referring to Figure 2d, the step (S40) of generating a biological sample concentration device is to place one or more concentrate plates in the middle of the first base and the second base, and the first base, the concentrate plate, and the second base such as tape. It is wrapped and fixed with fixing means. The fixing means may be replaced with plastic or polymer, but is not limited thereto, and a suitable material may be used depending on the design to be implemented. The biological sample concentration device has a column shape in which the length and cross section of the selective ion permeable layer are increased and the cross section of the channel through which the object moves is increased.
도 2e를 참조하면, 생체 시료 농축 장치를 시료 용액에 침지시키는 단계(S50)는 일정 시간 동안 제1 베이스 및 제2 베이스에 시료 용액을 흡수시킨다.Referring to Figure 2e, the step of immersing the biological sample concentrator in the sample solution (S50) absorbs the sample solution to the first base and the second base for a period of time.
도 2f를 참조하면, 대상물을 농축하는 단계(S60)는 제1 선택적 이온 투과층 및 제2 선택적 이온 투과층에 전계를 인가하여, 기둥 형상의 제1 베이스 및 기둥 형상의 제 2 베이스에 흡수된 시료의 이동 경로 상에 위치하는 농축판에 시료로부터 분리하려는 대상물을 농축한다. 생체 시료 농축 장치는 기둥 형상으로 형성되고, 각각의 선택적 이온 투과층이 기둥의 양 밑면 근처에서 넓은 면적으로 분포하고, 대상물은 넓은 면적을 갖는 채널을 통하여 이동할 수 있다. 대상물이 농축된 농축판을 생체 시료 농축 장치로부터 분리할 수 있다.Referring to Figure 2f, the step of concentrating the object (S60) is applied to the first selective ion permeable layer and the second selective ion permeable layer, absorbed by the columnar first base and the columnar second base The object to be separated from the sample is concentrated on a concentration plate located on the moving path of the sample. The biological sample concentration device is formed in a columnar shape, and each selective ion permeable layer is distributed over a large area near both bases of the pillars, and the object can move through a channel having a large area. The concentrated plate in which the object is concentrated can be separated from the biological sample concentration device.
도 3 내지 도 5는 대용량 생체 시료 농축 장치의 형상을 예시한 도면이다.3 to 5 are views illustrating the shape of a large-capacity biological sample concentrator.
도 3을 참조하면, 제1 베이스(101)와 제2 베이스(201)는 원 기둥을 형성하며, 농축판(301)은 원 기둥이 절단된 단면과 동일한 형상일 수 있다.Referring to FIG. 3, the
제1 시트가 펼쳐진 상태에서 제1 선택적 이온 투과층은 제1 시트의 일면을 가로지르며, 제1 시트가 권취된 상태에서 제1 선택적 이온 투과층은 제1 베이스(101)의 단면(농축판과 맞닿는 영역)으로부터 기설정된 거리를 유지하며 위치한다. 즉, 일정한 부피를 갖는 원 기둥의 매질에 제1 선택적 이온 투과층을 형성한다.In the state where the first sheet is unfolded, the first selective ion permeable layer crosses one surface of the first sheet, and in the state where the first sheet is wound, the first selective ion permeable layer is a cross-section of the first base 101 (concentrated plate and It is located while maintaining a predetermined distance from the abutting area). That is, a first selective ion permeable layer is formed in a medium of a circular column having a constant volume.
제2 시트가 펼쳐진 상태에서 제2 선택적 이온 투과층은 제2 시트의 일면을 가로지르며, 제2 시트가 권취된 상태에서 제2 선택적 이온 투과층은 제2 베이스(201)의 단면으로부터 기설정된 거리를 유지하며 위치한다. 즉, 일정한 부피를 갖는 원 기둥의 매질에 제2 선택적 이온 투과층을 형성한다.In the state in which the second sheet is unfolded, the second selective ion permeable layer crosses one surface of the second sheet, and in the state in which the second sheet is wound, the second selective ion permeable layer is a predetermined distance from the cross section of the
도 4를 참조하면, 제1 베이스(102)와 제2 베이스(202)는 다각 기둥을 형성하며, 농축판(302)은 다각 기둥이 절단된 단면과 동일한 형상일 수 있다.Referring to FIG. 4, the
제1 시트가 펼쳐진 상태에서 제1 선택적 이온 투과층은 제1 시트의 일면을 가로지르며, 제1 시트가 기설정된 각도(예컨대, 90도, 120도, 135도 등으로 설정 가능)로 접힌 상태에서 제1 선택적 이온 투과층은 제1 베이스(101)의 단면(농축판과 맞닿는 영역)으로부터 기설정된 거리를 유지하며 위치한다. 즉, 일정한 부피를 갖는 다각 기둥의 매질에 제1 선택적 이온 투과층을 형성한다.In a state where the first sheet is unfolded, the first selective ion permeable layer crosses one surface of the first sheet, and the first sheet is folded at a predetermined angle (for example, can be set at 90 degrees, 120 degrees, 135 degrees, etc.). The first selective ion permeable layer is positioned while maintaining a predetermined distance from a cross section of the first base 101 (a region in contact with the thickening plate). That is, the first selective ion permeable layer is formed in the medium of the polygonal column having a constant volume.
제2 시트가 펼쳐진 상태에서 제2 선택적 이온 투과층은 제2 시트의 일면을 가로지르며, 제2 시트가 기설정된 각도로 접힌 상태에서 제2 선택적 이온 투과층은 제2 베이스(201)의 단면으로부터 기설정된 거리를 유지하며 위치한다. 즉, 일정한 부피를 갖는 다각 기둥의 매질에 제2 선택적 이온 투과층을 형성한다.In the state in which the second sheet is unfolded, the second selective ion permeable layer crosses one surface of the second sheet, and in the state in which the second sheet is folded at a predetermined angle, the second selective ion permeable layer is from the cross section of the
도 5를 참조하면, 제1 베이스(103)와 제2 베이스(203)는 다각 기둥을 형성하며, 농축판(302)은 다각 기둥이 절단된 단면과 동일한 형상일 수 있다.Referring to FIG. 5, the
제1 시트가 펼쳐진 상태에서 제1 선택적 이온 투과층은 제1 시트의 일면을 가로지르며, 제1 시트가 지그재그로 접힌 상태에서 제1 선택적 이온 투과층은 제1 베이스(101)의 단면(농축판과 맞닿는 영역)으로부터 기설정된 거리를 유지하며 위치한다. 즉, 일정한 부피를 갖는 다각 기둥의 매질에 제1 선택적 이온 투과층을 형성한다.In the state where the first sheet is unfolded, the first selective ion permeable layer crosses one surface of the first sheet, and in the state where the first sheet is folded in a zigzag manner, the first selective ion permeable layer is a cross-section of the first base 101 (concentrated plate And the area abutting the area). That is, the first selective ion permeable layer is formed in the medium of the polygonal column having a constant volume.
제2 시트가 펼쳐진 상태에서 제2 선택적 이온 투과층은 제2 시트의 일면을 가로지르며, 제2 시트가 지그재그로 접힌 상태에서 제2 선택적 이온 투과층은 제2 베이스(201)의 단면으로부터 기설정된 거리를 유지하며 위치한다. 즉, 일정한 부피를 갖는 다각 기둥의 매질에 제2 선택적 이온 투과층을 형성한다.In the state in which the second sheet is unfolded, the second selective ion permeable layer crosses one surface of the second sheet, and in the state in which the second sheet is folded in a zigzag manner, the second selective ion permeable layer is preset from the cross section of the
도 6은 본 발명의 실시예들에 따른 대용량 생체 시료 농축 장치가 대상물질을 농축하는 과정을 예시한 도면이다.6 is a diagram illustrating a process of concentrating a target material by a large-capacity biological sample concentrator according to embodiments of the present invention.
제1 시트, 제2 시트, 농축판은 다공성 매질로 구현될 수 있다. 매질은 종이(Paper), 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 매질은 단독 또는 다른 물질과 조합하여 사용될 수 있다.The first sheet, the second sheet, and the condensed plate may be embodied in a porous medium. Media include, but are not limited to, paper, cellulose, nitrocellulose, polyethersulfone, polyvinylidene, fluoride, nylon, and polytetrafluoroethylene. The medium can be used alone or in combination with other materials.
선택적 이온 투과층은 나피온(Nafion), 폴리스티렌 설포네이트(Polystyrene Sulfonate, PSS) 또는 폴리아릴아민 하이드로클로라이드(Polyallylamine Hydrochloride, PAH) 등의 고분자 전해질(Polyelectrolyte)로도 구현될 수 있으며, 선택적으로 이온 투과가 가능한 물질이라면 어떠한 물질로 구현될 수 있다.The selective ion permeation layer may also be implemented with a polyelectrolyte such as Nafion, Polystyrene Sulfonate (PSS) or Polyarylamine Hydrochloride (PAH), and optionally ion permeation. If possible, any material can be used.
선택적 이온 투과층에 전극이 부착될 수 있다. 대용량 생체 시료 농축 장치는 제1 선택적 이온 투과층에 연결된 제1 전극을 포함하고, 제2 선택적 이온 투과층에 연결된 제2 전극을 포함할 수 있다.An electrode may be attached to the selective ion permeable layer. The large-capacity biological sample concentrator may include a first electrode connected to the first selective ion permeable layer and a second electrode connected to the second selective ion permeable layer.
기둥 형상의 제1 베이스 및 제2 베이스는 채널과 같은 역할을 하게 된다. 선택적 이온 투과층이 형성된 채널은 양성자(Proton)를 선택하여 투과시키는 일종의 나노 필터의 역할을 수행한다. 예를 들면, 선택적 이온 투과 물질이 나피온(Nafion)인 경우 나피온의 화학 구조 중 SO3- 로 인해서 H+ 이온이 호핑(Hopping) 및 이동 메커니즘(Vehicle Mechanism)에 의하여 선택적으로 빠르게 투과되도록 한다. 따라서, 나피온과 같은 선택적 이온 투과 물질을 통해서 채널의 특정 영역에는 분석하고자 하는 단백질 물질들을 매우 빠른 시간에 효율적으로 농축할 수 있게 된다.The pillar-shaped first base and the second base serve as channels. The channel on which the selective ion permeable layer is formed serves as a kind of nano filter that selects and transmits protons. For example, when the selective ion permeation material is Nafion, H3- ions are selectively rapidly permeated by hopping and vehicle mechanisms due to SO3- of Nafion's chemical structure. Therefore, through selective ion permeation materials such as Nafion, protein materials to be analyzed can be efficiently concentrated in a very fast time in a specific region of the channel.
제1 베이스, 농축판, 및 제2 베이스는 미세 기공성 물질(예컨대, nafion 등)을 이용하여 ICP 현상을 발생시키도록 구현할 수 있다. 천연 물질 또는 인공 물질로 된 미세 기공성 투과 영역으로 구현될 수 있다. 여기서 미세 기공은 구현되는 설계에 따라 적합한 사이즈의 미세 기공이 사용될 수 있다. 두 개의 선택적 이온 투과층에 양의 전극, 음의 전극 또는 접지(Ground)를 연결하여 전위차가 발생함에 따라 이온 농도 분극(ICP, Ion Concentraion Polarization)에 의해 시료가 분리 및 농축되도록 할 수 있다. 선택적 이온 투과층에서 발생하는 디클리션 힘(Depletion Force)을 이용하여 대상물을 농축한다.The first base, the condensed plate, and the second base may be implemented to generate an ICP phenomenon using a microporous material (eg, nafion, etc.). It can be implemented as a microporous permeable region of natural or artificial materials. Here, fine pores of a suitable size may be used according to the design to be implemented. By connecting a positive electrode, a negative electrode, or a ground to the two selective ion permeable layers, a sample may be separated and concentrated by ion concentration polarization (ICP) as a potential difference occurs. The object is concentrated using a depletion force generated in the selective ion permeable layer.
양단에 배치된 선택적 이온 투과층에 전원을 인가하여 전압차가 발생하면, 전압차에 따른 전계에 의해 유체 내에 존재하는 이온들이 각 이온의 전기적 성질과 반대인 전극 쪽으로 이끌리게 된다. 이와 같이 이온들이 전기적 성질에 따라 채널 내에서 움직이면서 점성력에 의해 유체 입자들을 같이 이끌고 가게 된다. 전체적인 유체의 유동이 발생하게 되며, 이와 같은 유체의 이동현상을 전기삼투(Electro-Osmosis Flow, EOF)라고 하고, 이온의 움직임을 전기영동(electrophoresis, EP)이라 한다.When a voltage difference occurs by applying power to the selective ion permeable layer disposed at both ends, ions present in the fluid are drawn toward the electrode opposite to the electrical properties of each ion by an electric field according to the voltage difference. As such, the ions move in the channel according to the electrical properties, and the fluid particles are brought together by the viscous force. The entire fluid flow occurs, and the movement phenomenon of the fluid is called electro-osmosis flow (EOF), and the movement of ions is called electrophoresis (EP).
이러한 전기영동(Capillary Electrophoresis) 및 전기삼투(Electro-Osmosis)의 특성은 선택적 이온 투과 영역으로 구현된 채널 근처에서 그 특성이 달라져, 이온 농도 분극(Ion Concentration Polarization, ICP)이 발생한다. 따라서, 채널의 반응 영역에서 음극 쪽에는 이온 결핍(Depletion)이 발생하고, 양극 쪽에서는 이온 농축(Enrichment)이 발생하게 된다. 이때, 결핍된 낮은 이온농도와 그에 따른 높은 전계에 의해 결핍 영역(Depletion Zone)이 전하(Charge)를 띈 대상물에 대해 일종의 전기적 장벽(Electric Barrier)으로 작용을 하게 된다. 그 결과 대상물은 결핍 영역을 통과하지 못하고 그 앞에 농축된다. 대상물이 채널 내의 결핍 영역 앞에 매우 빠른 시간에 농축된다. 이온 농도 분극에 의한 결핍 영역의 크기는 시료의 이온 농도 분극이 진행됨에 따라 확장되므로, 대상물은 채널의 가운데 영역에 농축 영역을 형성한다.The characteristics of such capillary electrophoresis and electro-osmosis are changed near the channel implemented as a selective ion permeation region, resulting in ion concentration polarization (ICP). Therefore, in the reaction region of the channel, ion deficiency occurs on the negative side and ion enrichment occurs on the positive side. At this time, the depletion zone acts as a kind of electric barrier to the object having the charge due to the low ion concentration and the high electric field. As a result, the object does not pass through the deficient area and is concentrated before it. The object is concentrated very quickly in front of the deficient region in the channel. Since the size of the deficiency region due to the ion concentration polarization expands as the ion concentration polarization of the sample progresses, the object forms a concentrated region in the center region of the channel.
대용량의 생체 시료 농축 장치는 항체-항원 반응에 국한되지 않는 것으로, 본 명세서에서 언급되는 결합부위(리간드)는 다양한 대상물에 있어서 단백질 리간드 (Ligand), 핵산(DNA 또는 RNA) 분자 서열의 결합 부위 등을 포함하고, 특이적 결합물질은 결합부위에 선택적, 특이적으로 결합할 수 있는 단백질, 바이러스 파아지, 핵산분자 앱타머(Aptamer), 합텐(Hapten, DNP) 등을 포함하는 생체분자를 모두 포함하는 것으로, 나아가 기재 사항에 제한되는 것은 아니다.The large-capacity biological sample concentration device is not limited to the antibody-antigen reaction, and the binding site (ligand) mentioned in the present specification is a protein ligand (Ligand), a nucleic acid (DNA or RNA) molecular sequence binding site, etc. in various targets. Including, the specific binding material is a protein that can selectively and specifically bind to the binding site, virus phage, nucleic acid molecule aptamer (Aptamer), hapten (Hapten, DNP), etc. However, it is not limited to the description.
선택적 이온 투과층은 채널을 가로지르도록 생체 시료 농축 장치의 양단에 형성된다. 선택적 이온 투과층을 형성하는 선택적 이온 투과 물질은 특정한 이온과는 잘 결합하고 서로 끌어들이지만, 다른 이온과는 잘 결합하지 않고 끌어들이지 않는 특성을 가진 물질을 말한다. 선택적 이온 투과 물질은 예를 들어 나피온(nafion) 등이 될 수 있다.A selective ion permeable layer is formed at both ends of the biological sample concentrator to cross the channel. The selective ion permeable material forming the selective ion permeable layer refers to a material that binds well to and attracts specific ions, but does not bind well to other ions and does not attract. The selective ion permeable material may be, for example, nafion or the like.
도 7 내지 도 14는 본 발명의 실시예들에 따른 대용량 생체 시료 농축 장치를 이용하여 대상물질을 농축한 결과를 예시한 도면이다.7 to 14 are views illustrating a result of concentrating a target material using a large-capacity biological sample concentrator according to embodiments of the present invention.
도 7은 시트의 길이가 증가됨에 따라 대용량 농축 장치에서 처리 가능한 시료의 양을 도시한 그래프이다. 도 8은 상이한 길이를 갖는 시트로 형성된 복수의 대용량 농축 장치가 농축하는 과정을 시간에 따라 나타낸 도면이다. 시트의 길이를 증가시켜 기둥의 부피를 증가시키고, 기둥의 단면 및 농축판의 크기를 증가시킬 수 있다.7 is a graph showing the amount of a sample that can be processed in a large-capacity concentrator as the length of the sheet increases. 8 is a view showing the process of concentration by a plurality of large-capacity concentrating devices formed of sheets having different lengths over time. The length of the sheet can be increased to increase the volume of the column, and the cross-section of the column and the size of the thickening plate can be increased.
도 9는 Colorimetric 분석법을 통한 샘플이 농축되는 플러그의 위치를 분석한 그래프이다. 도 10은 상이한 길이를 갖는 시트로 형성된 복수의 대용량 농축 장치가 시간에 따른 miRNA-21의 농축한 결과를 나타낸 도면이다. 도 11 및 도 12는 형광분석을 통해 miRNA-21의 농축 플러그의 위치를 확인한 도면이다. 일정한 위치에서 농축됨을 파악할 수 있다. 도 13은 형광분 석을 통해 농축판에 농축된 miRNA-21을 추출한 결과이다. 도 14는 정량 분석을 통한 실제 농축판에 농축된 miRNA-21의 퍼센트와 농축비율을 나타낸다. 9 is a graph analyzing the location of the plug where the sample is concentrated through the Colorimetric method. 10 is a view showing a result of concentration of miRNA-21 over time by a plurality of large-capacity concentrating devices formed of sheets having different lengths. 11 and 12 are views confirming the location of the enrichment plug of miRNA-21 through fluorescence analysis. It can be seen that it is concentrated at a certain position. 13 is a result of extracting miRNA-21 concentrated in a concentrated plate through fluorescence analysis. 14 shows the percentage and concentration ratio of miRNA-21 concentrated in an actual concentrated plate through quantitative analysis.
도 7 내지 도 14에 도시된 바와 같이, 본 실시예들에 따른 생체 시료 농축 장치는 시료로부터 분리하려는 대용량의 대상물을 고농도로 농축할 수 있다.As illustrated in FIGS. 7 to 14, the biological sample concentration device according to the present embodiments can concentrate a large-capacity object to be separated from the sample at a high concentration.
본 실시예들에서는 대상물인 바이오마커를 이온 농도 분극(Ion Concentration Polarization, ICP)을 통해 분리하고 대상물을 몇 배 이상 농축함으로써, 일반 스트립에서 검출되지 않는 바이오마커를 검출할 수 있는 효과가 있다. 바이오마커는 HCG(human chorionic gonadotropin) 등의 hormone 뿐만 아니라 Protein도 적용할 수 있다. 예컨대, 심근경색 바이오마커 - troponin, 알츠하이머 바이오마커 - amyloid beta, 유방암 바이오마커 - HER2 등 많은 바이오마커를 농축하여 민감도(sensitivity)를 향상할 수 있다.In these embodiments, the biomarker as an object is separated through ion concentration polarization (ICP) and the object is concentrated several times or more, thereby detecting an biomarker that is not detected in a normal strip. Biomarkers can be applied to hormones such as HCG (human (chorionic gonadotropin), as well as proteins. For example, many biomarkers such as myocardial infarction biomarker-troponin, Alzheimer's biomarker-amyloid beta, breast cancer biomarker-HER2 can be concentrated to improve sensitivity.
비색분석(colorimetric)을 이용하여 대상물을 눈으로 확인할 수 있다. 반응 후 휴대폰으로 촬영하여 이미지를 이용한 색깔의 분석 및 정량화할 수 있다. 이미지 내의 색상의 선명도(intensity)를 측정하거나 수치(hue value)로 표현할 수 있다. 형광 분석, 즉 키트 내에 형광을 발하는 물질을 적용하여 정량적 분석이 가능하다.The object can be visually identified using colorimetric analysis. After the reaction, it can be photographed with a mobile phone to analyze and quantify the color using the image. The intensity of the color in the image can be measured or expressed as a hue value. Fluorescence analysis, that is, quantitative analysis is possible by applying a fluorescent material in the kit.
본 실시예들은 본 실시예의 기술 사상을 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 실시예의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 실시예의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 실시예의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.The present embodiments are for explaining the technical spirit of the present embodiment, and the scope of the technical spirit of the present embodiment is not limited by these examples. The protection scope of the present embodiment should be interpreted by the claims below, and all technical spirits within the equivalent range should be interpreted as being included in the scope of the present embodiment.
100, 101, 102, 103: 제1 베이스
200, 201, 202, 203: 제2 베이스
300, 301, 302, 303: 농축판100, 101, 102, 103: first base
200, 201, 202, 203: second base
300, 301, 302, 303: concentrated plate
Claims (17)
상기 제1 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 제1 베이스를 형성하는 단계;
상기 제2 시트를 권취하거나 접어서 기둥 형상을 갖는 제2 베이스를 형성하는 단계; 및
상기 제1 베이스 및 상기 제2 베이스의 중간에 농축판을 위치시키고 상기 제1 베이스, 상기 제2 베이스, 및 상기 농축판을 고정시켜 기둥 형상을 갖는 생체 시료 농축 장치를 생성하는 단계;
를 포함하는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법.A coating step of coating a first selective ion permeable layer on a portion of the first sheet and coating a second selective ion permeable layer on a portion of the second sheet;
Winding or folding the first sheet to form a first base having a column shape;
Winding or folding the second sheet to form a second base having a column shape; And
Generating a biological sample concentrating device having a columnar shape by placing a concentrating plate in the middle of the first base and the second base and fixing the first base, the second base, and the concentrating plate;
Method for producing a large-capacity biological sample concentration device comprising a.
상기 생체 시료 농축 장치를 생성하는 단계 이후에, 상기 생체 시료 농축 장치를 시료 용액에 침지시키는 단계를 추가로 포함하는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법.According to claim 1,
After the step of generating the biological sample concentration device, the method of manufacturing a large-capacity biological sample concentration device further comprising the step of immersing the biological sample concentration device in a sample solution.
상기 생체 시료 농축 장치를 시료 용액에 침지시키는 단계 이후에, 상기 생체 시료 농축 장치의 상기 제1 선택적 이온 투과층 및 상기 제2 선택적 이온 투과층에 전계를 인가하여, 상기 제1 베이스 및 상기 2 베이스에 흡수된 시료의 이동 경로 상에 위치하는 상기 농축판에 상기 시료로부터 분리하려는 대상물을 농축하는 단계를 추가로 포함하는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법.According to claim 2,
After the step of immersing the biological sample concentrating device in a sample solution, an electric field is applied to the first selective ion permeable layer and the second selective ion permeable layer of the biological sample concentrating device, so that the first base and the second base are applied. The method of manufacturing a large-capacity biological sample concentrating device further comprising the step of concentrating the object to be separated from the sample on the concentration plate located on the moving path of the sample absorbed in.
상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이가 폭보다 길게 형성된 직사각형 형상이며, 상기 제1 시트 및 상기 제2 시트의 폭 방향으로 시료를 이동시키는 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법.According to claim 1,
The first sheet and the second sheet have a rectangular shape having a length longer than the width, and the method for manufacturing a large-capacity biological sample concentrating device, characterized in that the sample is moved in the width direction of the first sheet and the second sheet.
상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이가 폭보다 길게 형성된 직사각형 형상이며, 상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이 방향으로 권취되어 용량을 증가시킨 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법.According to claim 1,
The first sheet and the second sheet have a rectangular shape having a length longer than the width, and the first sheet and the second sheet are wound in the longitudinal direction to increase the capacity, thereby producing a large-capacity biological sample concentrating device. Way.
상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이가 폭보다 길게 형성된 직사각형 형상이며, 상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이 방향으로 기설정된 각도 또는 지그재그로 접혀서 용량을 증가시킨 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치의 제조 방법.According to claim 1,
The first sheet and the second sheet have a rectangular shape having a length longer than the width, and the first sheet and the second sheet are folded at a predetermined angle or zigzag in the longitudinal direction to increase the capacity. Method of manufacturing a sample concentration device.
제2 선택적 이온 투과층이 일부 코팅된 제2 시트가 권취되거나 접혀서 기둥 형상을 갖는 제2 베이스;
상기 제1 베이스 및 상기 제2 베이스의 중간에 위치하는 기설정된 형상을 갖는 농축판; 및
상기 제1 베이스, 상기 제2 베이스, 및 상기 농축판을 고정시키는 고정수단
을 포함하는 대용량 생체 시료 농축 장치.A first base having a column shape by winding or folding a first sheet partially coated with a first selective ion permeable layer;
A second base having a column shape by winding or folding a second sheet partially coated with a second selective ion permeable layer;
A concentration plate having a predetermined shape located in the middle of the first base and the second base; And
Fixing means for fixing the first base, the second base, and the concentrate plate
Large-capacity biological sample concentration device comprising a.
상기 제1 선택적 이온 투과층 및 상기 제2 선택적 이온 투과층에 전계를 인가하여, 상기 제1 베이스 및 상기 2 베이스에 흡수된 시료의 이동 경로 상에 위치하는 상기 농축판에 상기 시료로부터 분리하려는 대상물을 농축하는 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 7,
An object to be separated from the sample on the concentration plate located on the movement path of the sample absorbed by the first base and the second base by applying an electric field to the first selective ion permeable layer and the second selective ion permeable layer Large-capacity biological sample concentrator, characterized in that to concentrate.
상기 농축판은 복수로 중첩되며, 상기 농축되는 대상물의 양에 따라 상기 농축판의 두께 또는 상기 농축판의 개수를 조절하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 농축 장치.The method of claim 8,
The concentration plate is overlapped in plural, the biological sample concentration apparatus characterized in that to adjust the thickness of the concentration plate or the number of the concentration plate according to the amount of the object to be concentrated.
상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이가 폭보다 길게 형성된 직사각형 형상이며, 상기 제1 시트 및 상기 제2 시트의 폭 방향으로 시료를 이동시키는 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 7,
The first sheet and the second sheet have a rectangular shape having a length longer than the width, and a large-capacity biological sample concentrating device characterized in that the sample is moved in the width direction of the first sheet and the second sheet.
상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이가 폭보다 길게 형성된 직사각형 형상이며, 상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이 방향으로 권취되어 용량을 증가시킨 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 7,
The first sheet and the second sheet have a rectangular shape having a length longer than the width, and the first sheet and the second sheet are wound in the longitudinal direction to increase the capacity.
상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이가 폭보다 길게 형성된 직사각형 형상이며, 상기 제1 시트 및 상기 제2 시트는 길이 방향으로 기설정된 각도 또는 지그재그로 접혀서 용량을 증가시킨 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 7,
The first sheet and the second sheet have a rectangular shape having a length longer than the width, and the first sheet and the second sheet are folded at a predetermined angle or zigzag in the longitudinal direction to increase the capacity. Sample concentrator.
상기 제1 시트가 펼쳐진 상태에서 상기 제1 선택적 이온 투과층은 상기 제1 시트의 일면을 가로지르며, 상기 제1 시트가 권취되거나 접힌 상태에서 상기 제1 선택적 이온 투과층은 상기 제1 베이스의 단면으로부터 기설정된 거리를 유지하며 위치하는 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 7,
In the state in which the first sheet is unfolded, the first selective ion permeable layer crosses one surface of the first sheet, and in the state where the first sheet is wound or folded, the first selective ion permeable layer is a cross-section of the first base. A large-capacity biological sample concentrator, characterized in that it is located while maintaining a predetermined distance from.
상기 제2 시트가 펼쳐진 상태에서 상기 제2 선택적 이온 투과층은 상기 제2 시트의 일면을 가로지르며, 상기 제2 시트가 권취되거나 접힌 상태에서 상기 제2 선택적 이온 투과층은 상기 제2 베이스의 단면으로부터 기설정된 거리를 유지하며 위치하는 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 7,
In the state in which the second sheet is unfolded, the second selective ion permeable layer crosses one surface of the second sheet, and in the state in which the second sheet is wound or folded, the second selective ion permeable layer is a cross-section of the second base. A large-capacity biological sample concentrator, characterized in that it is located while maintaining a predetermined distance from.
상기 제1 베이스와 상기 제2 베이스는 원 기둥을 형성하며,
상기 농축판은 상기 원 기둥이 절단된 단면과 동일한 형상인 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 7,
The first base and the second base form a circular pillar,
The concentrating plate is a large-capacity biological sample concentrating device, characterized in that the circular pillar has the same shape as the cut section.
상기 제1 베이스와 상기 제2 베이스는 다각 기둥을 형성하며,
상기 농축판은 상기 다각 기둥이 절단된 단면과 동일한 형상인 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 11,
The first base and the second base form a polygonal pillar,
The concentration plate is a large-capacity biological sample concentrator, characterized in that the polygonal column has the same shape as the cut section.
상기 제1 선택적 이온 투과층에 연결된 제1 전극을 포함하고, 상기 제2 선택적 이온 투과층에 연결된 제2 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 대용량 생체 시료 농축 장치.The method of claim 11,
And a first electrode connected to the first selective ion permeable layer, and a second electrode connected to the second selective ion permeable layer.
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| WO2022092537A1 (en) * | 2020-10-30 | 2022-05-05 | 주식회사 엘지화학 | Separation and concentration system for ionic compounds in sample, and method for analyzing ionic compounds using same |
| KR20220058405A (en) * | 2020-10-30 | 2022-05-09 | 주식회사 엘지화학 | System for separating and concentration of ionic compoundin sample and analysis method of ionic compound using the same |
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| Publication number | Publication date |
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| KR102125414B1 (en) | 2020-06-22 |
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