KR20200045431A - 암세포 사멸 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 암세포 사멸 조성물 및 암세포 사멸 방법에 관한 것이다. 본 출원은 암세포의 세포막에 활성산소를 제공하여 암세포의 세포막을 파괴시켜 암세포를 사멸시키는 기작을 이용하는 발명에 관한 것이다.

Description

암세포 사멸 조성물 및 이의 용도{A Composition for cancer cell death and its use}
본 출원은 활성산소를 생성하는 활성산소 생성 단백질 및 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 암세포 사멸 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 활성산소 생성 단백질, 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질 및 빛을 제공할 수 있는 광 단백질을 포함하는 암세포 사멸 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 암세포 사멸 조성물을 이용한 암세포 사멸방법에 관한 것이다.
본 출원은 상기 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다.
암세포 사멸 방법에는 수술적 절개를 통한 외과적 방법, 방사선을 이용하는 방법, 항암제를 복용하는 방법 등이 있다.
이러한 방법들은 대부분 암세포 사멸뿐만 아니라 정상세포의 사멸도 일어나는 문제점이 있다. 또한, 몸 속 깊은 곳에 존재하는 암세포의 사멸은 어렵다.
최근 각광받고 있는 암세포 사멸 방법은 광역학 방법이다. 광역학 방법은 빛과 산소에 의해 화학적 반응을 일으켜 발생하는 활성산소를 생성하는 광감각제를 체내에 주입하여 상기 활성산소를 이용하여 암세포를 사멸하는 방법이다.
상기 광역학 방법에 이용되는 광감각제는 화학적 광감작제로서 인체 내 대사가 느려 분해 및 배출시간이 오래 걸리고, 정상세포에도 저농도로 축적되어 빛에 노출 시 광독성의 부작용 등이 발견되고 있다. 특히 외부 광원을 필요로 하여 빛의 투과능에 대한 한계점 때문에 부피가 큰 종양이나 체내 안쪽에 존재하는 암세포에는 사용되고 있지 못하고 있다.
화학적 광감작제 대신 빛에 반응하여 활성산소를 발생하는 단백질을 코딩하는 유전자를 벡터를 이용하여 직접 체내에 주입할 수 있다.
하지만 벡터의 대부분은 기원이 병원성 바이러스이기 때문에 안정성 및 독성에 대한 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 암세포의 특이성이 없기 때문에 벡터가 정상세포에 들어갈 가능성이 있어 암세포 사멸 뿐만 아니라, 정상세포의 사멸도 발생하는 문제점이 있다. 특히, 유전자를 포함하는 벡터는 암세포를 인지하는 단계에서부터 작용하는 것이 아니라 세포 내부에 유입된 이후 단백질로 발현이 되는 과정을 거쳐야 하므로 발현시간이 소요되고 세포 마다 발현비율이 크게 차이가 나며, 발현 이후에도 활성산소 방출효과가 세포 내 발현 위치, 세포 내 단백질 분해기작을 포함한 다양한 원인에 의해 제한된 수 있다.
따라서, 지금까지의 활성산소 방출에 의한 암세포 사멸 방법들의 문제점들을 극복하기 위해, 정상세포 사멸에는 영향을 끼치지 않으면서 암세포 사멸성을 높이고, 몸 속 깊은 곳에 존재하는 암세포를 사멸할 수 있는 방법의 개발이 요구되어진다.
1. 국제 특허 WO2011US052156호 2. 국제 특허 WO2018EP066982호
1. J Photochem Photobiol B. 2018 Nov;188:107-115. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2018.09.006. 2. Dokl Biochem Biophys. 2018 Sep;482(1):288-291. doi: 10.1134/S1607672918050150. 3. Acta Naturae. 2016 Oct-Dec;8(4):118-123.
본 출원의 일 과제는, 활성산소 생성 단백질 및 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 암세포 사멸 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 다른 과제는, 활성산소 생성 단백질, 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질 및 광 단백질을 포함하는 암세포 사멸 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 또 다른 과제는, 상기 암세포 사멸 조성물을 이용한 암세포 사멸 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 다른 과제는, 상기 암세포 사멸 조성물의 다양한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원은 전술한 상기 과제를 해결하기 위하여, 암세포의 세포막에 활성산소를 제공하여 암세포의 세포막을 파괴시켜 암세포를 사멸시키는 기작을 이용한다.
이를 위해, 일 양태로
i) 활성산소를 생성하는 제 1단백질;및 암세포의 세포막과 특이적으로 결합하는 제 2단백질;을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질을 준비하는 단계;
ii) 상기 암세포 사멸 융합 단백질이 암세포의 세포막에 부착되도록 유도하는 단계; 및
iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 빛을 제공하는 단계;
를 포함하는 암세포 사멸 방법이 제공된다.
또한, 상기 암세포 사멸 융합 단백질은 빛을 제공할 수 있는 제 3단백질을 더 포함하여 제공된다. 이 때, 제 3단백질이 빛을 생성할 수 있도록 기질을 제공된다.
또한, 상기 iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 빛을 제공하는 단계;는 외부의 광원을 제공하여 빛을 제공할 수 있다.
상기 암세포 사멸 방법은 상기 제 2단백질이 암세포의 세포막에 직접적 또는 간접적으로 결합하여 상기 제 1단백질을 암세포의 세포막 근처에 위치되도록 유도하여, 상기 제 1단백질이 빛과 반응하여 생성하는 활성산소가 상기 암세포의 세포막에 제공되어 암세포가 사멸된다.
다른 양태로,
활성산소를 생성하는 제 1단백질; 암세포의 세포막에 특이적으로 결합하는 제 2단백질;을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질이 제공된다.
또 다른 양태로, 상기 암세포 사멸 융합 단백질은 빛을 제공할 수 있는 제 3단백질을 더 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질이 제공된다.
특히, 상기 제 2단백질은 하기의 기능 중 선택되는 어느 하나의 기능을 가지는 단백질이다.
암세포의 표면에 발현된 특정 수용체와 특이적으로 결합하는 단백질,
암세포막을 구성하는 막 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질,
상기 암세포의 표면에 발현된 특정 수용체 또는 암세포막을 구성하는 막단백질과 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 단백질,
상기 암세포의 표면에 발현된 특정 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 특정 영역과 결합하는 단백질, 및
암세포막에 투과성을 가지는 단백질(cancer specific cell-penetrating peptide).
상기 암세포 사멸 융합 단백질은 제 1단백질 및 제 2단백질을 연결시키는 제 1링커; 또는 제 2단백질 및 제 3단백질을 연결시키는 제 2링커;중 어느 하나 이상을 더 포함하여 제공될 수 있다.
본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.
첫째, 본 출원에 의하면, 활성산소 생성 단백질 및 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 암세포 사멸 조성물을 제공할 수 있게 된다. 나아가, 상기 조성물은 광 단백질을 더 포함한 암세포 사멸 조성물을 제공할 수 있게 된다.
둘째, 본 출원에 의하면, 상기 암세포 사멸 조성물을 이용한 암세포 사멸 방법을 제공할 수 있게 된다. 특히, 본 출원의 방법은 상기 조성물이 암세포의 세포막 부착되어 활성산소를 제공하여 암세포를 사멸시키는 방법을 제공할 수 있게 된다. 나아가, 정상세포 사멸에는 영향을 미치지 않고, 암세포 사멸에만 영향을 미치는 효과가 발생할 수 있다.
셋째, 본 출원에 의하면, 상기 암세포 사멸 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공할 수 있게 된다.
넷째, 본 출원에 의하면, 상기 암세포 사멸 조성물을 이용한 다양한 용도를 제공할 수 있게 된다.
도 1은 본 출원의 단백질 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2 내지 7은 본 출원에서 사용한 플라스미드 벡터의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 8의 (a) 및 (b)는 단백질의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다
도 9는 단백질에 따른 흡광 스펙트럼 및 형광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다. BL은 Bioluminescence를 의미하고, FL 은 Fluorescence를 의미한다. (a)는 RLuc8.6; RLuc8.6-KR; KR;의 결과이고, (b)는 RLuc8; RLuc8-MS; MS;의 결과이다.
도 10은 단백질에 따른 생물발광 스펙트럼 및 형광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다. (a)는 RLuc8.6; RLuc8.6-KR; KR;의 결과이고, (b)는 RLuc8; RLuc8-MS; MS;의 결과이다.
도 11은 단백질과 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine) 농도에 따라 반응해서 생성된 활성산소 측정 그래프이다. 기질반응 시간은 5분이고 활성산소 발생정도는 DHE (Dihydroethidium, superoxide 측정 chemical reagent, (a))) 혹은 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid, singlet oxygen 측정 chemical reagent, (b))를 사용하여 형광감소율 (% Fluorescence Beaching)로 나타내었다. (a)는 Rluc8.6-KR 단백질의 결과이고, (b) Rluc8-MS 단백질의 결과이다.
도 12는 단백질과 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine) 반응시간에 따라 생성된 활성산소 측정 그래프이다. h-coelenterazine 의 농도는 150μM이고, ROS 발생정도는 DHE (Dihydroethidium, superoxide 측정 chemical reagent, (a)) 혹은 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid, singlet oxygen 측정 chemical reagent, (b))를 사용하여 형광감소율 (% Fluorescence Beaching)로 나타내었다. (a)는 Rluc8.6-KR 단백질의 결과이고, (b) Rluc8-MS 단백질의 결과이다.
도 13은 다양한 종류의 단백질을 기질 사용없이 빛의 조사 (10mW/cm2, 30min) 후 생성된 활성산소 측정 그래프이다. (a)는 DHE에 의한 초과산화물 측정결과이고 (b)는 ADPA에 의한 일중항산소 측정결과를 나타낸다.
도 14는 다양한 종류의 단백질을 빛의 조사 없이 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine) 기질 150μM (30min 반응)을 처리하여 생성된 활성산소 측정 그래프이다. (a)는 DHE에 의한 초과산화물측정결과이고 (b)는 ADPA에 의한 일중항산소 측정결과를 나타낸다.
도 15는 단백질 (Rluc8.6-KR (A)와 Rluc8-MS (B))을 활성산소 Scavenger 처리 후 빛의 조사 없이 Co-h 기질 150μM (30min 반응) 반응에 의한 단백질의 활성산소 생성률 측정 결과를 나타낸 도면이다. (a)는 DHE에 의한 초과산화물 측정결과이고 (b)는 ADPA에 의한 일중항산소 측정결과를 나타낸다.
도 16 및 17은 단백질의 생물발광신호의 안정성 (stability)을 확인한 그래프이다. 단백질을 완충용액 (phosphate-buffered saline, PBS) 또는 100% 마우스 혈청(serum), 조건에 넣고 시간대별로 생물발광을 측정하였다. 생물발광은 모두 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine) 150μM를 사용하여 측정하였으며 상대적 생물발광신호는 최초의 발광신호 신호대비 변화율로서 나타내었다. 도 16 (a)는 Rluc8.6 단백질의 결과이고, 도 16(b) Rluc8.6-KR-LP 단백질의 결과이다. 도 17 (a)는 Rluc8 단백질의 결과이고, 도 17(b) Rluc8-MS-LP 단백질의 결과이다.
도 18 및 19는 MCF-7 유방암 세포주에서 다양한 단백질을 처리한 이후에 빛의 조사 시간에 따라 세포사멸여부를 확인한 도면이다. 빛의 조사는 10mW/cm2 조건을 유지하였으며 세포 사멸여부는 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)의 비색 변화에 의해 측정되었다.
도 18는 KR, RLuc8.6-KR, RLuc8.6-KR-LP 단백질에 대한 결과이다. 도 18 (a)는 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)의 비색 변화에 의해 측정한 결과이고, 도 18 (b)는 MTT 비색용액의 흡광값을 기반으로 상대적 세포 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 19는 MS, RLuc8-MS, RLuc8-MS-LP 단백질에 대한 결과이다. 도 19 (a)는 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)의 비색 변화에 의해 측정한 결과이고, 도 19 (b)는 MTT 비색용액의 흡광값을 기반으로 상대적 세포 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 20 및 21는 MCF-7 유방암 세포주에서 단백질(KR, RLuc8.6-KR, RLuc8.6-KR-LP)을 처리한 이후에 빛의 조사없이 Co-h 150μM를 처리한 이후 시간에 따라 세포사멸여부를 확인한 도면이다. 도 20 (a)는 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)의 비색 변화에 의해 측정한 결과이고, 도 20 (b)는 MTT 비색용액의 흡광값을 기반으로 상대적 세포 생존률을 나타낸 그래프이다. 도 21는 MTT 용액의 비색변화를 측정하고 난 다음, 플레이트 내의 용액을 제거하여 버퍼로 세척한 이후 표면에 부착된 세포수를 관찰한 광학현미경 결과이다.
도 22 및 23는 MCF-7 유방암 세포주에서 단백질(MS, RLuc8-MS, RLuc8-MS-LP)을 처리한 이후에 빛의 조사없이 Co-h 150μM를 처리한 이후 시간에 따라 세포사멸여부를 확인한 도면이다. 도 22 (a)는 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)의 비색 변화에 의해 측정한 결과이고, 도 22 (b)는 MTT 비색용액의 흡광값을 기반으로 상대적 세포 생존률을 나타낸 그래프이다. 도 23는 MTT 용액의 비색변화를 측정하고 난 다음, 플레이트 내의 용액을 제거하여 버퍼로 세척한 이후 표면에 부착된 세포수를 관찰한 광학현미경 결과이다.
도 24 및 25는 MCF-7 유방암 세포주에서 단백질(KR, RLuc8.6-KR, RLuc8.6-KR-LP)을 처리한 이후에 빛의 조사 시간에 따라 세포사멸여부를 확인한 도면이다. 빛의 조사는 10mW/cm2 조건을 유지하였다. 도 24는 KR, Rluc8.6-KR, 및 Rluc8.6-KR-LP간의 세포 사멸여부를 SYTOX Green (죽은세포 특이적 dye, 초록색; 화살표 표시)과 DAPI (살아있는 세포 특이적 dye, 파란색)로 측정한 형광 현미경 이미징 결과이다. 도 25은 도 24의 형광 현미경 이미지로부터 얻은 SYTOX Green의 형광을 동일한 면적을 기준으로 평균값을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 26 및 27은 MCF-7 유방암 세포주에서 생물발광에 의한 세포 사멸효과를 나타낸 도면이다. 빛의 조사없이 Co-h 150μM를 처리한 이후 시간에 따라 세포사멸여부를 확인하였다. 도 26는 KR, Rluc8.6-KR, 및 Rluc8.6-KR-LP간의 세포 사멸여부를 SYTOX Green (죽은세포 특이적 dye, 초록색; 화살표 표시)과 DAPI (살아있는 세포 특이적 dye, 파란색)로 측정한 형광 현미경 이미징 결과이다. 도 27은 형광 현미경 이미지로부터 얻은 SYTOX Green의 형광을 동일한 면적을 기준으로 평균값을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 28 및 29는 MCF-7 유방암 세포주에서 단백질(MS, Rluc8-MS, Rluc8-MS-LP)을 처리한 이후에 빛의 조사 시간에 따라 세포사멸여부를 확인한 도면이다. 빛의 조사는 10mW/cm2 조건을 유지하였다. 도 28은 MS, Rluc8-MS, 및 Rluc8-MS-LP간의 세포 사멸여부를 EthD-1 (죽은세포 특이적 dye, 빨강색;화살표 표시)과 DAPI (살아있는 세포 특이적 dye, 파란색)로 측정한 형광 현미경 이미징 결과이다. 도 29는 형광 현미경 이미지로부터 얻은 EthD-1의 형광을 동일한 면적을 기준으로 평균값을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 30 및 31은 MCF-7 유방암 세포주에서 생물발광에 의한 세포 사멸효과를 나타낸 도면이다. 빛의 조사없이 Co-h 150μM를 처리한 이후 시간에 따라 세포사멸여부를 확인하였다. 도 30은 MS, Rluc8-MS, 및 Rluc8-MS-LP간의 세포 사멸여부를 EthD-1 (죽은세포 특이적 dye, 빨강색;화살표 표시)과 DAPI (살아있는 세포 특이적 dye, 파란색;화살표 표시)로 측정한 형광 현미경 이미징 결과이다. 도 31은 형광 현미경 이미지로부터 얻은 EthD-1의 형광을 동일한 면적을 기준으로 평균값을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 32 및 33은 MCF-7 유방암 세포주에서 단백질 프로브 (RLuc8.6-KR-LP)의 시간에 따른 세포사멸 효과를 나타낸 결과이다. 단백질 프로브 (10μM)를 세포배양 용액에 넣고 37도에서 24시간 처리한 이후, 각각 생물발광반응 (도 32) 및 LED광조사 (도 33)를 유도하고 시간 변화에 따라 배양된 세포에 SYTOX Green(화살표 표시)과 DAPI를 넣고 염색한 형광세포 이미징 사진이다. 도 32는 Co-h 150μM 를 5분간 처리한 이후 시간 변화에 따라 나타낸 형광이미징 결과이다. 도 33은 광조사 10mW/cm2 조건에서 1분, 5분, 10분 노출시킨 이후 시간에 따라 나타낸 형광이미징 결과이다.
도 34는 MCF-7 유방암 세포주에 대해 단백질 RLuc8.6-KR-LP (10μM)을 넣은 이후 반응시간에 따른 세포사멸 효과 분석 결과이다. FBS (fetal bovine serum)을 넣지 않은 배양액 (RPMI)과 (위) 넣은 배양액 (아래) 조건을 동시에 비교하였다. 시간 변화에 따라 배양된 세포에 SYTOX Green(화살표 표시)과 DAPI를 넣고 염색한 형광세포 이미징 사진이다.
도 35는 MCF-7 유방암 세포주에 대해 단백질 RLuc8.6-KR-LP의 서로 다른 농도에서의 세포사멸 효과 분석 결과이다. FBS (fetal bovine serum)을 넣지 않은 배양액 (RPMI)과 (위) 넣은 배양액 (아래)에 동일하게 단백질 (RLuc8.6-KR-LP)을 농도별로 처리한 이후 12시간 방치시키고, Co-h 150μM, SYTOX Green(화살표 표시)과 DAPI을 동시에 처리하여 얻은 형광세포이미징 결과이다
도 36은 MCF-7 유방암 세포주에서 생물발광에 의한 단백질 프로브 결합 및 세포사멸 효과의 형광 유세포 분석 (FACS) 결과이다. 아무것도 처리하지 않은 세포와, Rluc8.6-KR를 처리한 세포, Rluc8.6-KR-LP를 처리한 세포의 유세포 분석 결과 (첫번째행)와, 여기에 Co-h 150μM를 처리한 이후 24시간이 지난 세포에 SYTOX Green 을 처리하거나 (두번째행) DAPI를 처리한 유세포 분석결과 (세번째행)를 나타내었다.
도 37은 도 36의 유세포 분석결과를 총세포수 대비 형광을 나타낸 세포수의 비율로 그래프로 나타낸 도면이다.
도 38는 다양한 유방암세포주 (MCF-7, BT-474, MDA-MB-435, SK-BR-3, MDA-MB-231, MCF-10A)에서 빛의 조사에 의한 단백질 RLuc8.6-KR-LP의 세포사멸 효과를 나타낸 형광세포 이미징 결과이다. 단백질프로브는 Rluc8.6-KR (비교사진의 위쪽)와 Rluc8.6-KR-LP (비교사진의 아래)를 각각 동일한 조건 (최종 10μM 12시간, serum-free 배양액)에서 처리한 다음 빛을 조사 (10mW/cm2을 10분)하였다. 이후 SYTOX Green 넣고 30분간 방치하여 형광이미지을 얻었고 DAPI는 이후 5분 추가 반응하여 형광이미지를 얻었음. SYTOX Green(화살표 표시)과 DAPI 염색 형광사진을 중첩하여 저배율 (x200, 위)과 고배율 (x800, 아래)에서 각각 비교하였다.
도 39 및 40은 다양한 유방암세포주 (MCF-7, BT-474, MDA-MB-435, SK-BR-3, MDA-MB-231, MCF-10A)에서 생물발광에 의한 단백질 RLuc8.6-KR-LP의 세포사멸 효과를 나타낸 형광세포 이미징 결과이다. 단백질프로브는 LP가 없는 것과 LP가 결합된 단백질 프로브를 각각 동일한 조건 (최종 10μM 24시간, FBS-free 배양액)에서 처리한 다음 Co-h (150μM, 5분)을 처리하였다. 이후 SYTOX Green 또는 을 넣고 30분간 방치하여 형광이미지를 얻었고 DAPI는 이후 5분 추가 반응하여 형광이미지를 얻었다 (적색은 EthD-1;화살표 표시, 녹색은 SYTOX Green;화살표 표시, 청색은 DAPI를 나타냄). 도 39는 Rluc8.6-KR와 Rluc8.6-KR-LP의 비교 결과이고, 도 40은 Rluc8-MS과 Rluc8-MS-LP의 비교 결과이다.
도 41은 유방암 환자에서 추출된 암세포주 (primary cell)에 대해 생물발광기반 세포사멸 효과를 나타낸 형광세포 이미징 결과이다. 유방암세포주는 estrogen receptor, progesterone receptor, HER2가 발현되지 않은 Triple negative악성 유방암 세포주이고, 단백질프로브는 Rluc8.6-KR와 Rluc8.6-KR-LP를 최종 10μM primary cell 배양액에서 24시간 처리한 후, Co-h (150μM)를 5분간 처리하거나 LED 광조사는 10mW/cm2 5분간 수행하였다. 이후 SYTOX Green(화살표 표시)과 DAPI를 처리하여 형광이미지를 얻어 중첩하여 비교하였다.
도 42 내지 44는 유방암세포주(MDA-MB-231)에서 생물발광에 의한 단백질 RLuc8.6-KR-LP의 세포사멸 효과를 나타낸 마우스 이미징과 조직 크기 결과이다. 단백질프로브는 LP가 결합된 단백질 프로브를 각각 동일한 조건 (최종 10μM, 24시간)에서 Intratumoural 처리한 다음 Co-h (150μM)을 Subcutaneous 주입하였다. 도 42는 IVIS 스펙트럼(Xenogen Inc.)으로 영상화한 도면이고, 도 43은 유방암 조직의 크기를 확인한 도면이다. 도 44는 유방암 조직의 크기를 날짜별로 측정하여 그래프로 나타낸 도면이다.
본 출원에서 기술하고 있는 출원의 특징은, 암세포의 세포막에 활성산소를 제공하여 암세포의 세포막을 파괴시켜 암세포를 사멸시키는 기작을 이용하는 데 있다.
암세포 사멸은 아폽토시스(apoptosis), 네크로시스(necrosis), 오토파지(autophagy) 등 다양한 기작으로 발생할 수 있는데, 암세포의 어느 부위에 단백질이 영향을 미치는지에 따라 암세포 사멸 기작이 달라질 수 있다.
단백질이 암세포의 미토콘드리아, 리보솜, 소포체, 세포막 등 다양한 부위에 영향을 미쳐 암세포 사멸에 영향을 끼칠 수 있으나, 본 출원의 단백질은 암세포의 세포막을 파괴하여 암세포 사멸에 영향을 미칠 수 있다.
본 출원은 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질 및 활성산소를 생성하는 활성산소 생성 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질을 이용하여 활성 산소를 생성하는 단백질을 세포막 주변에 위치시키고, 상기 활성 산소를 생성하는 단백질을 활성화시킴으로써, 암 세포막 주변에 활성산소를 제공함으로써 암세포를 사멸시킬 수 있다.
상기 활성산소를 생성하는 단백질의 활성화는 빛에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 광원 장치(예를 들어, LED, 레이저 등)를 이용하여 외부에서 제공할 수도 있고, 또는 상기 융합 단백질에 추가로 광 단백질을 더 포함시킴으로써 융합 단백질이 자체적으로 빛을 제공할 수도 있다. 특히, 광 단백질을 이용하는 경우에는 이를 활성화시키는 특정 기질 화합물을 이용할 수 있다.
한편, 상기 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합할 수 있는 단백질은 다음과 같은 방법을 이용하기 위해 선택될 수 있다:
암세포의 표면에 발현된 특정 수용체와 특이적으로 결합하는 단백질,
암세포막을 구성하는 막 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질,
상기 암세포의 표면에 발현된 특정 수용체 또는 암세포막을 구성하는 막단백질과 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 단백질 및
암세포막에 투과성을 가지는 단백질(cancer specific cell-penetrating peptide)
이러한 단백질을 이용하여 암세포의 세포막과 직간접적으로 결합하면, 융합되어 있는 활성산소를 생성하는 단백질은 크기 등을 이유로 세포 내로 도입되지 않은 채, 암세포막에 활성산소를 제공한다.
특히, 상기 활성산소를 생성하는 단백질은 주변 약 10~20nm의 범위에서 짧은 시간(약 0.01μs) 동안 활성산소를 발생시키기 때문에, 상기 암세포막과 직간접적으로 결합하는 단백질에 의해서 효과적으로 암세포막에 활성산소를 제공할 수 있고, 이에 의해 우수한 암세포 사멸효과를 나타낸다.
이러한 기술적 특징을 가지는 본 출원은 암세포막에 활성산소를 제공하여 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있기 때문에, 암세포에 대한 특이성 및 선택성을 현저히 높일 수 있다. 뿐만 아니라, 암세포 사멸과정 이후에는 생체조직에서는 본 출원의 융합 단백질은 빠르게 분해(degradation)되어 체내에 축적되지 않는다. 그러므로, 유전자를 벡터의 형태로 세포 내로 도입시킨 종래 기술과 비교하여, 정상세포 내로 도입되어 정상세포를 사멸시키는 문제점을 해결하면서, 체내 안정성을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
이하에서, 상기의 기술적 특징을 지닌 본 출원의 암세포 사멸 조성물 및 이의 용도 에 대해서 자세히 설명하도록 한다.
1. 암세포 사멸 조성물
본 출원의 일 태양은 암세포 사멸 조성물에 관한 것이다.
상기 암세포는 피부암 세포, 유방암 세포, 자궁암, 폐암 세포, 간암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 췌장암 세포, 혈액암 세포 및 이들의 암 줄기세포 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.
상기 조성물은 암세포를 인식하여, 암세포의 세포막에 부착되어 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 제공하여 암세포를 사멸시키는 조성물이다.
본 출원의 상기 조성물은
암세포의 세포막에 활성산소를 제공하는 활성산소를 생성하는 제 1단백질 및
암세포의 세포막에 특이적으로 결합하는 제 2단백질
을 포함한 암세포 사멸 융합 단백질일 수 있다.
본 출원에서 용어 "융합 단백질(fusion protein)"은 서로 다른 2 이상의 단백질이 연결되어 있는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, A단백질 및 B단백질을 포함한 융합 단백질이라고 하면, i) A단백질과 B단백질을 사이를 링커를 이용하여 연결시킨 융합 단백질; ii) A단백질과 B단백질이 링커 없이, 직접 연결된 융합 단백질; 모두를 포함하는 것으로 해석한다.
상기 제 1단백질은 빛에 의해 활성화 되어 활성산소를 생성할 수 있는 활성산소 생성능을 지닌 단백질이다.
상기 활성산소는 활성산소종(ROS, )으로도 불리는데, 산소 원자를 포함한 화학적으로 반응성이 있는 분자 모두를 지칭한다.
예를 들어, 상기 활성산소는 초과산화물(O2 -, superoxide), 수산화라디칼(hydroxyl radical, HO·), 일중항산소(singlet oxygen, 1O2), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 하이포아염소산(hypochlorous acid, HOCl) 등 일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 제 1단백질은 빛에 의해 활성화되어 상기 활성산소, 예를 들어, 초과산화물, 수산화라디칼, 일중항산소, 과산화수소, 하이포아염소산 중 선택되는 어느 하나 이상을 생성할 수 다.
상기 제 1단백질은 KillerRed, MiniSOG, SOPP, FPFB, SuperNova, mKate2, KillerOrange 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 또한, 상기 제1 단백질은 상기 KillerRed, miniSOG, SOPP, FPFB, SuperNova, mKate2, Killerorange 등의 변이체를 포함한다.
상기 KillerRed는 약 27 kDa 크기를 가진 Aequorea Victoria 유래 녹색형광단백질 (green fluorescent protein) 변이체로서 녹색빛을 받게 되면 초과산화물을 생성하는 것으로 알려져 있다.
상기 MiniSOG은 약 14 kD의 크기를 가진 Arabidopsis phototropin 2 의 LOV domain에서 유래하였으며 푸른색 빛을 받게 되면 일중항산소를 생성하는 것으로 알려져 있다.
본 출원의 제1 단백질은은 KillerRed, miniSOG, SOPP, FPFB, SuperNova, mKate2, Killerorange 중 선택되는 어느 하나의 서열의 일부 서열 또는 전체 서열을 포함할 수 있다.
상기 KillerRed, miniSOG, SOPP, FPFB, SuperNova, mKate2, Killerorange 중 선택되는 어느 하나 이상의 서열은 공지된 서열, 예를 들어 공지된 데이터 베이스에 개시된 이들의 서열을 이용할 수 있다. .
예를 들어, 상기 KillerRed 는 MLCCMRRTKQVEKNDEDQKISEGGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPHGDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQYGEPFFARYPDGISHFAQECFPEGLSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELDDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQLVDILPNETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHFDSKMTFNGSRAIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAYAHSVPRITSAIGSDED(SEQ ID No. 1) 서열의 일부 또는 전장을 포함할 수 있다.
상기 MiniSOG은 MEKSFVITDPRLPDNPIIFASDGFLELTEYSREEILGRNGRFLQGPETDQATVQKIRDAIRDQREITVQLINYTKSGKKFWNLLHLQPMRDQKGELQYFIGVQLDG(SEQ ID No. 2) 서열의 일부 또는 전장을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 제 1단백질은 빛에 의해 활성화 되어 활성 산소를 생성하고, 상기 생성된 활성 산소가 암세포의 세포막에 제공되어 상기 암세포가 사멸된다.
한편, 상기 제 2단백질은 암세포의 세포막과 직접적으로 또는 간접적으로 결합되는 단백질이다.
상기 제 2단백질은 하기의 기능 중 선택되는 어느 하나의 기능을 가질 수 있다.:
암세포의 표면에 발현된 특정 수용체와 특이적으로 결합하는 단백질,
암세포막을 구성하는 막 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질,
상기 암세포의 표면에 발현된 특정 수용체 또는 암세포막을 구성하는 막단백질과 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 단백질,
상기 암세포의 표면에 발현된 특정 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 특정 영역과 결합하는 단백질, 및
암세포막에 투과성을 가지는 단백질(cancer specific cell-penetrating peptide).
상기 제 2단백질은 암세포를 표적하는 항체(antibody), 인공 항체(Artificial antibody), 펩타이드(peptide), 압타머(aptamer)또는 일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 본 출원에서, 상기 제2 단백질은 암세포를 표적하는 단독의 화합물 또는 상기 화합물과 결합된 단백질일 수도 있다.
일 양태에서, 상기 제 2단백질은 암세포의 표면에 발현된 특정 수용체와 특이적으로 결합하는 단백질일 수 있다. 이 때, 상기 제 2단백질은, 결합하는 특정 수용체가 발현되는 암세포를 인식할 수 있다.
[표 1]에는 특정 수용체 및 이를 발현하는 암세포의 종류, 이와 결합할 수 있는 제 2단백질로서 특정 펩타이드가 기재되어 있다. 이는 예시일 뿐, 이에 한정하지 않는다.
No. 제2단백질
(Peptide) 		target receptor cancer cells
1 DHLASLWWGTEL GPC3 hepatocellular carcinoma cell HepG2
2 NYSKPTDRQYHF PD-L1 colon cancer cell line CT26
3 IPLPPPSRPFFK PDGFRβ human pancreatic carcinoma cell line BxPC3,
human breast cancer cell line MCF7
4 LMNPNNHPRTPR PKCδ Human glioblastoma astrocytoma U373
5 C HHNLTHA C PTPRJ Human cervical cancer cell HeLa, Human umbilical vein endothelial cell HUVEC
6 C LHHYHGS C
7 SPRPRHTLRLSL TfR 1 Human liver cancer cell line (SMMC-7721)
8 TMGFTAPRFPHY Tie 2 Human lung adenocarcinoma cell line SPC-A1,
Human non-small lung carcinoma cell line H1299
9 RMWPSSTVNLSAGRR CD-21 Malignant B cell lymphoma
10 NGYEIEWYSWVTHGMY VEGFRI (Flt-1) Primary human cerebral endothelial cells (HCECs)
11 FRSFESCLAKSH IL-10 RA -
12 YHWYGYTPQNVI EGFR -
13 FCDGFYACYADV HER2 Human breast cancer cells (SK-BR-3 and MDA-MB-231)
14 RGD4C αξβ3 integrin Human glioblastoma cells U87MG,
Human breast cancer cells MDA-MB-435,
Rat glioma cells C6, Mouse fibroblast cells L929
15 Cyclic(RGDfK) αξβ3 integrin Human non-small lung carcinoma cells H1299,
Murine melanoma cells B16-F10,
Human embryonic kidney cells HEK-293
16 QWAVGHL-Y(CH2-NH)-L-NH2 Bombesin Human pancreatic cancer cells CFPAC-1,
Human lung cancer cells DMS-53,
Human prostate cancer cells PC-3,
Human gastric cancer cells MKN-45
17 TFFYGGSRGKRNNFKTEEY Low-density lipoprotein receptor (LDLr) Glioblastoma (U87 MG), Hepatocarcinoma (SK-Hep-1), Lung carcinoma (NCI-H460)
예를 들어, [표 1]의 DHLASLWWGTEL 서열을 가진 펩타이드는, hepatocellular carcinoma cell HepG2가 특이적으로 발현하는 GPC3 수용체와 결합할 수 있다.
즉, 본 출원의 제 1단백질 및 DHLASLWWGTEL 서열(제 2 단백질)을 포함하는 암세포 사멸 융합단백질은 DHLASLWWGTEL 서열을 가진 펩타이드가 GPC3 수용체와 결합하여 제1 단백질을 상기 hepatocellular carcinoma cell HepG2의 암세포막 주변에 위치시키고, 빛에 의해 활성화되어 활성산소를 상기 암세포막에 제공함으로써, HepG2 를 선택적으로 사멸시킨다.
또 다른 예를 들어, [표 1]의 SPRPRHTLRLSL 서열을 가진 펩타이드는 TfR 1 수용체와 결합하여 상기 설명한 것과 동일한 메커니즘을 통해 Human liver cancer cell line (SMMC-7721)를 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
다른 양태에서, 상기 제 2단백질은 암세포막을 구성하는 막 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질일 수 있다.
일 예에서, 상기 제 2단백질은 특정 종류의 암세포의 막 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질일 수 있다.
다른 예에서, 상기 제 2단백질은 암세포의 특정 막 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질일 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서, 제 2단백질로서 특정 종류의 암세포의 막 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드인 SEQ ID No. 5(WXEAAYQRFLㅡ 이 때, 상기 X는 A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V 중 선택되는 1개 일 수 있음)을 사용하였다. 예를 들어, 상기 펩타이드는 SEQ ID No. 6 (WLEAAYQRFL) 서열을 가진 펩타이드일 수 있다.
상기 SEQ ID No. 5로 표시되는 펩타이드는 neuroblastoma 세포주인 WAC-2, SH-EP, TET21N와 유방암 세포주인 MDA-MB-435, MDA-MB-231, MCF-7의 세포막에 존재하는 막단백질을 인식하는 것으로 알려져 있고, 이러한 특성으로 인해 WAC-2, SH-EP, TET21N, MCF-7, MDA-MA-435, MDA-MB-231 세포주에 특이적인 펩타이드로 알려져 있다(Zhang, J.B et al, Cancer Lett 171, 153-164(2001); Ahmed, S et al, Anal Chem 82, 7533-7541 (2010)).
본 출원 실시예 22 내지 24에서는 SEQ ID No. 6 (WLEAAYQRFL)을 이용하여 다양한 유방암 세포주(MCF-7, BT-474, MDA-MB-435, SK-BR-3, MDA-MB-231, MCF-10A)에 대해 실험한 결과를 기재하고 있다. 이를 통해, 다양한 유방암 세포주들 중 특정 유방암 세포주인 MCF-7, MDA-MA-435, MDA-MB-231를 특이적으로 인식하여, 사멸시킴을 확인하였다. 하지만, 상기 SEQ ID No. 6이 인식하지 못하는 암세포주인 BT-474, SK-BR-3, MCF-10A는 사멸되지 않음을 확인하였다.
따라서, 본 출원 실시예를 통해 SEQ ID No. 6이 MCF-7, MDA-MA-435, MDA-MB-231 유방암 세포주의 세포막의 막 단백질과 특이적으로 결합하여 암세포의 세포막 근처로 제 1단백질을 위치시키고, 상기 제 1단백질이 빛에 의해 활성화되어 암세포막에 활성산소를 제공하여 암세포를 사멸시키는 것을 확인할 수 있었다.
또 다른 양태에서, 상기 제 2단백질은 상기 암세포막을 구성하는 막단백질과 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 단백질일 수 있다.
[표 2]에는 특정 암세포의 막단백질과 특이적으로 결합하는 리간드의 종류 및, 상기 특정 리간드와 결합할 수 있는 제 2단백질로서의 수용체 단백질이 기재되어 있다. 이는 예시일 뿐, 이에 한정하지 않는다.
No. 제2단백질
(Receptor) 		Ligand target Cancer
1 Transferrin TfR ligand (7pep) Breast
Transferrin Breast, Glioma
Transferrin + TRAIL Colon
Transferrin + folate Glioma
T7 peptide + TAT Glioma
TfR mAb Glioma
2 Folate Folic acid Lung, Cervical
Folate Cervical, Breast, Carcinoma
Folate + RGD Carcinoma
Folate + Asp8 Breast metastasis
Folate + transferrin Glioma
3 αvβ3 Integrin RGD Endothelial, Glioma, Lung, Melanoma, Breast
RGD + pHA Glioma
RGD + Estrone Breast
RGD + YPSMA-1 mAb Prostate
RGD + Folate Carcinoma
4 PSMA A10 PSMA Apt Prostate
YPSMA-1 mAb + RGD Prostate
anti-PSMA + anti-CD14 mAb Prostate
5 HER2 Trastuzumab Breast
anti-HER2 scFv Breast
neu peptide (FCDGFYACYADV) Breast
KCCYSL (P6.1 peptide) Breast
6 Estrogen Estrone Breast
Estrone + RGD Breast
17β-Estradiol Breast
Tamoxifen Breast
7 CXCR4 LFC131 peptide Lung, Breast
anti-CXCR4 mAb Breast
Peptide R Lung
8　 ICAM1 anti-ICAM1 mAb Breast
LFA-1 Cervical
9　 Androgen Testosterone Prostate
α- & β-Bicalutamide Prostate
10 CD CD14) anti-CD14 mAb + anti-PSMA Prostate
CD22) anti-CD22 mAb Lymphoma
CD44) Hyaluronic acid Breast, Melanoma
CD133. Aptamer Bone
11 EGFR anti-EGFR Breast, Lung
EGF Oral
Cetuximab Pancreatic
12 IL IL4) AP1 peptide Colon, Glioma
IL4) Pep-1 Lung
IL13) IL13 Glioma
13 TNF TRAIL + Transferrin Colon
14 Glycyrrhetinic glycyrrhetinic acid Liver
15 VEGF anti-VEGF mAb Pancreatic
AR7 + T7 peptide Glioma
예를 들어, [표 2]의 Transferrin 단백질은 TfR ligand (7pep)와 특이적으로 결합할 수 있다.
즉, 본 출원의 제 1단백질 및 Transferrin 단백질(제 2단백질)을 포함하는 암세포 사멸 융합단백질은 상기 Transferrin이 TfR ligand (7pep)와 특이적으로 결합하여 제 1단백질을 유방암 세포의 암세포막 주변에 위치시키고, 빛에 의해 활성화되어 활성산소를 상기 암세포막에 제공함으로써, 유방암세포를 선택적으로 사멸시킨다.
또 다른 예를 들어, [표 2]의 Folate 단백질은 Folic acid와 결합하여 상기 설명한 것과 동일한 메커니즘을 통해 폐암 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 제2 단백질은 암세포의 표면에 발현된 특정 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 특정 영역과 결합하는 단백질일 수 있다.
[표 3]에는 암세포를 표적하는 항체의 특정 부위(Fc region)를 인식하는 각각의 펩타이드가 제 2단백질로서 기재되어 있다. 이는 예시일 뿐, 이에 한정하지 않는다.
No. 제 2단백질
(Peptide) 		target
1 RRGW Fc region of IgG
2 HWRGWV Fc region of IgG
3 HYFKFD Fc region of IgG
4 HFRRHL Fc region of IgG
5 NKFRGKYK Fc region of IgG
예를 들어, [표 3]의 RRGW 서열을 가진 펩타이드는 암세포를 표적하는 항체의 IgG Fc region와 결합할 수 있다.
즉, 본 출원의 제 1단백질 및 RRGW 서열(제 2단백질)을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질은 암세포의 표면에 발현된 특정 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 Fc region of IgG와 결합하여 제 1단백질을 상기 암세포의 세포막 주변에 위치시키고, 빛에 의해 활성화되어 활성산소를 상기 암세포막에 제공함으로써, 암세포를 선택적으로 사멸시킨다.
상기 암세포를 표적하는 항체는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), HER2(Epidermal growth factor receptor) 등을 표적 할 수 있는 항체일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
예를 들어, EGFR을 표적하는 항체는 Cetuximab, Panitumumab 등일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
예를 들어, HER2를 표적하는 항체는 trastuzumab 등일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 양태의 제2 단백질을 포함하는 본 출원의 암세포 사멸 융합 단백질은, 면역항암제를 사용하는 경우 함께 적용함으로써 암세포 사멸 효과를 향상시킬 수 있다.
다른 태양으로, 본 출원의 암세포 사멸 융합 단백질은, 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 빛을 제공하는 제 3단백질을 더 포함할 수 있다.
상기 빛을 제공하는 제 3단백질은 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)에 의해 빛을 제공할 수 있는 단백질 또는 생물발광 공명 에너지 전이(Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET)에 의해 빛을 제공할 수 있는 단백질 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 공명 에너지 전이는 도너(donor) 분자와 어셉터(acceptor) 분자 사이에서 발생하는 공명 에너지가 전달되는 현상을 말한다. 상기 형광 공명 에너지 전이는 도너로써 형광물질을 이용하는 것이고, 상기 생물발광 공명 에너지 전이는 도너로써 생물발광 물질을 이용하는 것이다.
상기 형광 공명 에너지 전이에 의한 제 3단백질은 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP), 노랑형광단백질(Yellow Fluorescent Protein, YFP), 적색형광단백질(Red Fluorescent Protein, RFP), 파랑형광단백질(Blue fluorescent protein, BFP), 청록색형광단백질(Cyan Fluorescent Protein, CFP) 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.
본 출원의 제 3단백질은 녹색형광단백질, 노랑형광단백질, 적색형광단백질, 파랑형광단백질, 청록색형광단백질 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 생물발광 공명 에너지 전이를 이용하는 제 3단백질은 루시퍼라아제(luciferase) 서열을 포함하는 제 3단백질일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.
상기 루시퍼라아제는 기질을 산화시켜 생물발광을 일으키는 산화효소를 지칭한다.
상기 루시퍼라아제는 Photobacteria luciferase, Firefly luciferase, Railroad worm luciferase, Renilla luciferase, Gaussia luciferase, Metridia luciferase, Cypridiana luciferase, Oplophorus luciferase (NanolucTM) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 출원의 제 3단백질은 Photobacteria luciferase, Firefly luciferase, Railroad worm luciferase, Renilla luciferase(RLuc), Gaussia luciferase, Metridia luciferase, Cypridiana luciferase, Oplophorus luciferase (NanolucTM) 중 선택되는 어느 하나의 루시퍼라아제를 코딩하는 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함할수 있다.
상기 루시퍼라아제는 야생형(wild-type) 또는 돌연변이형(mutant)일 수 있다.
일 실시예로, 본 출원의 제 3단백질은 Renilla luciferase 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시예로, 본 출원의 제 3단백질은 Renilla luciferase 돌연변이형 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 Renilla luciferase(RLuc)의 돌연변이형은 RLuc8, RLuc8.6, RLuc8, RLuc6 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 RLuc8 은 MASKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYAYEHQDRIKAIVHMESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKLFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFLQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ(SEQ ID No. 3) 서열의 일부 서열 또는 전체 서열을 포함할 수 있다.
상기 RLuc8.6 은 MASKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGSALAFHYAYEHQDRIKAIVHMESVVDVIESWMGWPDIEEELALIKSEEGEKMVLENNFFVETLLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKLFIESDPGFFYNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFLQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ(SEQ ID No. 4) 서열의 일부 서열 또는 전체 서열을 포함할 수 있다.
상기 생물발광 공명 에너지 전이를 이용하는 제 3단백질은 기질에 의해 활성화될 수 있다.
생물발광 공명 에너지 전이를 이용하는 제 3단백질의 생물발광을 유도하기 위해 특정 기질과 반응시켜 생물발광을 유도할 수 있다.
상기 기질은 루시페린(luciferin) 또는 루시페린 변형체(mutant)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 루시페린 변형제는 코엘렌테라진(coelentrazine) 또는 코엘렌테라진 유도체(derivative)일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 코엘렌테라진 유도체는 cp-코엘렌테라진, f-코엘렌테라진, 코엘렌테라진-fcp, 코엘렌테라진-h 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 본 출원에서 상기 기질은 루시페린(luciferin), 코엘렌테라진(coelentrazine), cp-코엘렌테라진, f-코엘렌테라진, 코엘렌테라진-fcp, 코엘렌테라진-h 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 실시예로, 본 출원에서 상기 기질은 코엘렌테라진-h일 수 있다.
상기 제3 단백질과 기질을 반응, 예를 들어, 산화시킬 때, 산소 또는 ATP(Adenosine Tri-Phosphat) 중 어느 하나가 필요하다. 이는 상기 루시퍼라아제의 종류에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, 상기 Photobacteria luciferase, Renilla luciferase는 기질을 산화시킬 때 산소를 필요로 한다.
다른 예를 들어, Firefly luciferase는 기질을 산화시킬 때 ATP를 필요로 한다.
상기 제 3단백질이 기질과 반응하여 제공하는 빛의 파장대(wavelength)은 제 3단백질 또는 기질의 종류에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, 상기 Renilla luciferase 의 서열을 포함하는 단백질은 470~480 nm 파장에서 빛을 발생시킨다.
또한, 상기 제 3단백질은 나노입자, 폴리머 등과 결합하여 빛의 파장대를 다양하게 조절할 수 있다.
본 출원에서, 암세포 사멸 융합 단백질은 제 1단백질 및 제 2단백질을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질일 수 있다. 상기 암세포 사멸 융합 단백질은 외부 광원을 통해 빛을 제공함으로써 제1단백질이 활성산소를 생성하고, 상기 활성산소가 암세포막에 제공되어 암세포를 사멸시킬 수 있다.
또한, 상기 암세포 사멸 융합 단백질은 제 1단백질, 제 2단백질, ? 제 3단백질을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질일 수 있다. 이러한 본 출원의 암세포 사멸 융합 단백질의 모식도는 도 1을 통해 확인할 수 있다. 상기 암세포 사멸 융합 단백질은, 자체적으로 제 3 단백질에 의해 빛을 제공함으로써 제1단백질이 활성산소를 생성하고, 상기 활성산소가 암세포막에 제공되어 암세포를 사멸시킬 수 있다.
본 출원의 상기 암세포 사멸 융합 단백질은 링커를 더 포함할 수 있다.
상기 링커는 제 1 단백질, 제 2 단백질, 제 3 단백질을 서로 연결시켜 주는 기능을 가지는 물질을 의미한다.
예를 들어, 상기 암세포 융합 단백질은 제 1단백질-링커-제 2단백질을의 구성을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 암세포 융합 단백질은 제 1단백질-제 2단백질-링커- 제 3 단백질의 구성을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 암세포 융합 단백질은 제 1단백질-제 1링커-제 2단백질-제 2링커- 제 3 단백질의 구성을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 제 1링커 및 제 2링커는 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 링커는 제 1단백질, 제 2단백질 및 제 3단백질의 잠재적 간섭을 최소화하여 암세포 사멸 융합 단백질의 암세포 사멸 기능을 더 증가 시킬 수 있다. 또한, 상기 링커는 상기 융합단백질의 구조적인 유연성을 증가 시킬 수 있다.
상기 링커는 핵산, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 화합물의 작용기 등일 수 있으나, 상기 제 1 내지 3 단백질 사이를 연결할 수 있는 기능을 가진 것이라면, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 작용기는 Primary amines, Carboxyls, Sulfhydryls, Carbonyls, Bromide등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 링커는 1개 내지 100개의 아미노산으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 링커를 구성하는 아미노산은 소수성 아미노산, 친수성 아미노산, 염기성 아미노산, 산성 아미노산일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 소수성 아미노산은 Valine, Leucine, Isoleucine, Glycine, Alanine 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 친수성 아미노산은 Serine, Threonine, Tyrosine, Proline, Asparagine 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 염기성 아미노산은 Lysine, Arginine, Histidine 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 산성 아미노산은 Aspartic acid, Glutamic acid 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
구체적인 예를 들어, 상기 아미노산 서열은 G, GG, GGG, GGGS, TG, GGGGS, GGGGSTG, GGGGS-SKLTRAETVF, EFGGG 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다(서열은 N말단에서 C말단 방향).
일 실시예에서, GGG을 사용하여 융합단백질의 각각의 도메인을 연결시킬 때 구조적인 유연성과 안정적인 움직임을 제공하였다.
다른 실시예에서, EFGGG를 사용하여 융합단백질의 각각의 도메인을 연결시킬 때 구조적인 유연성과 안정적인 움직임을 제공하였다.
일 구체예에서, 상기 암세포 사멸 융합 단백질
RLuc8.6-KillerRed;
RLuc8.6-GGG-KillerRed;
RLuc8.6-KillerRed-WLEAAYQRFL;
RLuc8.6-GGG-KillerRed-WLEAAYQRFL;
RLuc8.6-KillerRed-GGG-WLEAAYQRFL;
RLuc8.6-GGG-KillerRed-GGG-WLEAAYQRFL;
RLuc8-MiniSOG;
RLuc8-GGG-MiniSOG;
RLuc8-EFGGG-MiniSOG;
RLuc8- MiniSOG-WLEAAYQRFL;
RLuc8-GGG-MiniSOG -WLEAAYQRFL;
RLuc8-EFGGG-MiniSOG -WLEAAYQRFL;
RLuc8- MiniSOG-GGG-WLEAAYQRFL;
RLuc8-GGG- MiniSOG-GGG-WLEAAYQRFL; 및
RLuc8-EFGGG-MiniSOG-GGG-WLEAAYQRFL; 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
상기 암세포 사멸 융합 단백질은 암세포 사멸 효과를 증진 시킬 수 있는 기능 도메인, 구조 도메인, 효소 도메인 등을 선택적으로 더 포함할 수 있으나, 암세포 사멸 효과를 증가시킬 수 있는 기능을 가진 것이라면 이에 한정하지 않는다.
본 출원의 암세포 사멸 융합 단백질의 암세포 사멸 효과의 결과는 도 18 내지 31를 통해 확인할 수 있다.
도 18 내지 31는 유방암 세포주에 상기 암세포 사멸 융합 단백질을 처리하여 유방암 세포 사멸을 확인한 결과를 도시한 도면이다.
코엘렌테라진-h(Co-h) 처리 없이 암세포 사멸 융합 단백질을 처리한 세포에 외부 광원을 조사하여 제 2단백질이 제 1단백질을 암세포의 세포막에 근접하게 위치시켜 상기 외부 광원에 의해 제 1단백질이 활성화되어 생성한 활성산소에 의해 유방암 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 18, 19, 24, 25, 28 및 29)
암세포 사멸 융합 단백질을 처리한 세포에 별도의 외부 광원에 의한 빛 제공 없이 기질인 코엘렌테라진-h(Co-h) 및 제3 단백질과의 반응에 의해 융합 단백질 자체적으로 빛을 제공함으로써 유방암 세포가 사멸됨을 확인하였다(도 20, 21, 22, 23, 26, 27, 30 및 31)
본 출원에서 개시하는 일 태양은, 본 출원의 상기 암세포 사멸 융합 단백질을 포함하는, 암 질환 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
이 때, 상기 "암(cancer)"은 조절할 수 없이 계속 진행되는 세포분열에 의해 발생하는 질병을 지칭한다. 상기 암은 종양(tumor), 신생물(neoplasma), 양성종양(benign tumor), 악성종양(malignant tumor), 암종(carcinoma), 육종(sarcoma) 등을 모두 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 본 출원에서 '암세포' 라고 하는 말은 암을 일으키는 능력을 가진 세포를 의미하는 것으로 해석한다. 용어 "암" 또는 "종양"은 상호교환 가능하게 사용된다.
상기 약학적 조성물은 암세포 사멸 융합 단백질 및/또는 기질을 유효성분으로 포함할 수 있다.
이 때, 암세포 사멸 융합 단백질 및 기질은 앞서 기재한 바와 같다.
약학적 조성물의 형태는 당업자가 필요에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 고체 제형, 겔 제형, 겔-스프레이 제형, 캡슐 제형 등으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 안정성과 편이성을 위해, 부형제, 희석제, 보존제 등 첨가제를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
암의 치료를 위해 상기 약학조성물을 암 질환을 가지고 있는 대상, 예를 들어, 포유류에 투여할 수 있다.
상기 포유류는 사람, 개, 고양이, 마우스, 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
"투여"는 어떠한 적절한 방법으로 포유류에 본 출원의 약학조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 출원의 약학 조성물의 투여 경로 는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 내피 투여, 비내 투여, 폐내투여, 종양(tumor)내투여, 직장내 투여, 강내 투여, 정맥 투여 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물의 투여는 벡터 형태(예를 들어, 암세포 사멸 융합 단백질을 코딩하는 DNA 벡터)가 아닌 단백질 형태로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여는 암질환의 종류, 암질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자를 고려하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 성인의 경우, 상기 약학적 조성물을 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다.
또한 본 출원의 약학적 조성물은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 공지된 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다.
또한 본 출원의 약학적 조성물은 목적하고자 하는 암의 치료를 위해 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법, 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다.
2. 암세포 사멸 방법 및 암 치료 방법
본 출원의 다른 태양은, 상기 암세포 사멸 융합 단백질 또는 이를 포함하는 조성물을 이용한 암세포 사멸 방법에 관한 것이다.
또한, 본 출원은 상기 암세포 사멸 융합 단백질 또는 이를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 치료방법이 제공될 수 있다.
상기 암세포 사멸 방법은 상기 제 2단백질이 암세포를 선택적으로 인식하여 암세포의 세포막에 부착되고, 상기 제 1단백질이 상기 빛에 의해 생성된 활성산소가 상기 암세포의 세포막에 작용하여 암세포가 사멸될 수 있다.
본 출원의 일 예에 있어서,
본 출원에 의해 개시되는 상기 암세포 사멸 방법은,
i) 활성산소를 생성하는 제 1단백질;및 암세포의 세포막과 특이적으로 결합하는 제 2단백질;을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질을 준비하는 단계;
ii) 상기 암세포 사멸 융합 단백질이 암세포의 세포막에 부착되도록 유도하는 단계; 및
iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 빛을 제공하는 단계;
를 포함할 수 있다.
또한, 상기 암세포 사멸 융합 단백질은 제 3단백질을 더 포함할 수 있다.
상기 제 1단백질, 제 2단백질 및 제 3단백질은 앞서 설명한 바와 동일하다.
상기 암세포 사멸 융합 단백질을 준비하는 단계는 공지된 단백질 수득 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 암세포 사멸 융합 단백질이 암세포의 세포막에 부착되도록 유도하는 단계는 상기 암세포 융합 단백질이 암세포의 세포막과 최대한 근접하게 부착되어 활성산소가 암세포의 세포막에 제공될 수 있도록 하는 것이다.
이를 위해서 상기 암세포 사멸 융합 단백질을 구성하는 제 2단백질이 암세포의 세포막과 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있도록 한다.
이를 위해서, 상기 암세포 사멸 융합 단백질을 암 질환을 가지는 대상에게 전신적으로 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 이 때, 상기 암세포 사멸 융합 단백질은 이를 코딩하는 DNA 벡터 형태가 아닌 단백질 형태로 투여한다.
상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 빛을 제공하는 단계;는
외부 광원으로 빛을 제공하는 것; 또는
제 3단백질을 기질과 반응시켜 빛을 제공하는 것; 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이 때, 상기 제 1단백질이 생성한 활성산소는 암세포막에 제공되어 암세포를 사멸시키는 효과를 나타낸다.
일 구체예에서, 상기 암세포 사멸 방법은,
i) 활성산소를 생성하는 제 1단백질;및 암세포의 세포막과 특이적으로 결합하는 제 2단백질;을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질을 준비하는 단계;
ii) 상기 암세포 사멸 융합 단백질이 암세포의 세포막에 부착되도록 유도하는 단계; 및
iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 외부 광원으로 빛을 제공하는 것;
를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 암세포 사멸 방법은,
i) 활성산소를 생성하는 제 1단백질; 암세포의 세포막과 특이적으로 결합하는 제 2단백질; 및 빛을 제공하는 제 3단백질을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질을 준비하는 단계;
ii) 상기 암세포 사멸 융합 단백질이 암세포의 세포막에 부착되도록 유도하는 단계; 및
iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 기질을 첨가하여, 상기 제 3단백질을 기질과 반응시켜 빛을 제공하는 단계;
를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 암세포 사멸 방법은,
i) 활성산소를 생성하는 제 1단백질; 암세포의 세포막과 특이적으로 결합하는 제 2단백질; 및 빛을 제공하는 제 3단백질을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질을 준비하는 단계;
ii) 상기 암세포 사멸 융합 단백질이 암세포의 세포막에 부착되도록 유도하는 단계; 및
iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 외부 광원으로 빛을 제공하는 것;
을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 암세포 사멸 방법은,
i) 활성산소를 생성하는 제 1단백질; 및 암세포의 세포막과 특이적으로 결합하는 제 2단백질;을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질을 준비하는 단계;
ii) 상기 암세포 사멸 융합 단백질이 암세포의 세포막에 부착되도록 유도하는 단계; 및
iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 제 3단백질과 기질을 함께 제공하여 서로 반응시킴으로써 빛을 제공하는 단계;
상기 방법에서,
제1단백질은 예를 들어, KillerRed, MiniSOG, SOPP, FPFB, SuperNova, mKate2, KillerOrange 중 선택되는 어느 하나일 수 있다, 일 실시예에서 KillerRed 또는 MiniSOG를 사용할 수 있다. 상기 제 1 단백질이 생성하는 활성산소는 초과산화물(O2-, superoxide), 수산화라디칼(hydroxyl radical, HO·), 일중항산소(singlet oxygen, 1O2), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 하이포아염소산(hypochlorous acid, HOCl) 등 일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 예를 들어, 제 1단백질이 KillerRed일 경우, 초과산화물을 생성할 수 있다. 다른 예를 들어, 제 2단백질이 MiniSOG일 경우, 일중항산소를 생성할 수 있다.
제2단백질은 예를 들어, 암세포의 표면에 발현된 특정 수용체와 특이적으로 결합하는 단백질, 암세포막을 구성하는 막 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질, 상기 암세포의 표면에 발현된 특정 수용체 또는 암세포막을 구성하는 막단백질과 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 단백질, 상기 암세포의 표면에 발현된 특정 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 특정 영역과 결합하는 단백질, 및 암세포막에 투과성을 가지는 단백질(cancer specific cell-penetrating peptide) 중 선택되는 어느 하나일 수 있고, 일 실시예에서 WXEAAYQRFL 서열, 예를 들어, WLEAAYQRFL 서열을 사용할 수 있다.
제3 단백질은 예를 들어, Photobacteria luciferase, Firefly luciferase, Railroad worm luciferase, Renilla luciferase, Gaussia luciferase, Metridia luciferase, Cypridiana luciferase, Oplophorus luciferase (NanolucTM) 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. 일 실시예에서 RLuc8 또는 RLuc8.6을 사용할 수 있다.
상기 암세포 사멸 방법이 외부에서 제공되는 광원을 이용하는 방법인 경우, 신체의 표면에 노출되어 있는 암세포를 사멸시키는데 용이할 수 있다.
외부에서 제공되는 광원을 제공하는 경우, 예를 들어, LED, 레이저와 같은 광원장치를 이용하는 경우에는 조사되는 빛이 대상의 직접적인 표면에 제공되는 한계점이 있기 때문에, 피부암 부위 또는 수술 후 해당 절개된 부위에 직접적으로 조사하는 방법 등으로 암세포 사멸 방법이 수행될 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 피부암 등을 치료할 수 있다.
상기 암세포 사멸 방법이 제 3단백질을 기질과 반응시키는 방법인 경우에는, 노출되지 않는 부위, 예를 들어, 체내 장기 등에 존재하는 암세포를 사멸시키는데 용이할 수 있다.
상기 3단백질을 기질과 반응시키는 경우에는 본 발명의 융합 단백질이 자체적으로 빛을 제공하기 때문에, 외부로 노출되지 않고 암 조직 내 깊숙히 존재하고 있는 암세포에도 효과적으로 빛을 제공할 수 있다. 이러한 방법을 통해 다양한 종류의 암을 치료할 수 있다.
[출원의 실시를 위한 형태]
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실험 재료
본 출원의 실시예에서는,
제1단백질로서, KillerRed(KR로 지칭), MiniSOG(MS로 지칭);
제2단백질로서 LP(Lead Peptide) -특정 종류의 암세포의 막 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드로 neuroblastoma 세포주인 WAC-2, SH-EP, TET21N와 유방암 세포주인 MDA-MB-435, MDA-MB-231, MCF-7의 세포막에 존재하는 막단백질을 인식하는 것으로 알려져 있는(Zhang, J.B et al, Cancer Lett 171, 153-164(2001); Ahmed, S et al, Anal Chem 82, 7533-7541 (2010)) 인 SEQ ID No. 6(WLEAAYQRFL) 사용-
제3단백질로서, Renilla luciferase 8.6(RLuc8.6로 지칭), Renilla luciferase 8(RLuc8로 지칭);
을 사용하였다.
● SEQ ID No. 7: pRSET-KillerRed(31kDa)
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPMLCCMRRTKQVEKNDEDQKISEGGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPHGDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQYGEPFFARYPDGISHFAQECFPEGLSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELDDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQLVDILPNETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHFDSKMTFNGSRAIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAYAHSVPRITSAIGSDED
● SEQ ID No. 8: pRSET-RLuc8.6-KillerRed(69kDa)
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPMASKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGSALAFHYAYEHQDRIKAIVHMESVVDVIESWMGWPDIEEELALIKSEEGEKMVLENNFFVETLLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKLFIESDPGFFYNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFLQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQEFGGGMLCCMRRTKQVEKNDEDQKISEGGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPHGDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQYGEPFFARYPDGISHFAQECFPEGLSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELDDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQLVDILPNETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHFDSKMTFNGSRAIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAYAHSVPRITSAIGSDED
● SEQ ID No. 9: pRSET-RLuc8.6-KillerRed-Lead peptide(71kDa)
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPMASKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGSALAFHYAYEHQDRIKAIVHMESVVDVIESWMGWPDIEEELALIKSEEGEKMVLENNFFVETLLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKLFIESDPGFFYNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFLQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQEFGGGMLCCMRRTKQVEKNDEDQKISEGGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPHGDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQYGEPFFARYPDGISHFAQECFPEGLSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELDDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQLVDILPNETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHFDSKMTFNGSRAIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAYAHSVPRITSAIGSDEDGGGWLEAAYQRFL
● SEQ ID No. 10: pRSET-MiniSOG (13kDa)
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● SEQ ID NO. 11: pRSET-RLuc8-MiniSOG (53kDa)
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● SEQ ID NO. 12: pRSET-RLuc8-MiniSOG-Lead Peptide (54kDa)
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SEQ ID No. 7: pRSET-KillerRed, SEQ ID No. 8: pRSET-RLuc8.6-KillerRed, SEQ ID No. 9: pRSET-RLuc8.6-KillerRed-Lead peptide는 pCS2-NXE+mem-KillerRed 플라스미드(plasmid)를 애드진(Addgene, USA)로부터 구입하여 재조합하였다. SEQ ID No. 10: pRSET-MiniSOG, SEQ ID No. 11: pRSET-RLuc8-MiniSOG, SEQ ID No. 12: pRSET-RLuc8-MiniSOG-Lead peptide는 mCherry-miniSOG-N1 플라스미드(plasmid)를 애드진(Addgene, USA)로부터 구입하여 재조합하였다. 각 플라스미드는 특이적 프라이머(SEQ ID No. 13 내지 28)를 이용하여 클로닝(cloning) 하였다.
모든 프라이머는 마크로젠(Macrogen, Korea)에서 구입하였다. 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 코엘렌테라진-h (Coelenterazine-h, Co-h)은 모두 나노라이트 테크놀로지(Nanolight technology, USA)로부터 구입하였다.
다른 모든 시약(reagents)은 상업적 출처에서 구입하였으며, 가장 높은 순도 등급을 가진 시약을 구입하여 사용하였다. 서열(sequence)은 마크로젠(Macrogen, Korea)의 시퀀싱 서비스(sequencing service)를 이용하여 분석하였다.
실시예 1: 융합 단백질의 발현 및 정제
E. coli 균주(strain) BL21 세포로 도 2 내지 7의 플라스미드를 각각 형질전환(transformation) 시켰다, 100㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함되어 있는 500㎖의 LB 배지(Luria-Bertani broth)를 이용하여 600nm에서 OD(optical density) 값이 0.9에 도달할 때까지 상기 형질전환시킨 균주(bacteria)를 37℃에서 배양하였다. 1mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 20℃에서 24시간 더 배양하였다. 세포를 7,800 rpm에서 20분간 원심분리하여 수확(harvest)하였다.
상기 수확된 세포 펠렛(pellet)은 20㎖의 용해 버퍼(lysis buffer; 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH8.0), 2㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme)으로 재현탁 시키고, 초음파처리 (ultrasonication)하여 파쇄하였다. 상기 파쇄한 조세포 추출물(crude cell extract)을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리 하고, 상층액(supernatant)을 여과하여, 1㎖의 Ni-NTA 비드(bead) 와 4℃에서 24시간 동안 쉐이킹(shaking) 하면서 인큐베이션(incubation) 하였다. 통과액(flow-through)을 제거하고 비드를 세척 버퍼(wash buffer; 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl 및 50mM 이미다졸, pH 8.0)로 세척하였다. 세척 버퍼 내 이미다졸의 농도를 0.5M로 하여 결합된 단백질을 선형 구배(linear gradient)로 용출(elution)시켰다. 발현된 단백질을 포함하는 분획(fraction)을 투석(dialysis)하고, PBS 1X로 농축(concentration)시켰다.
실시예 1을 수행하여 SEQ ID No. 7 내지 12를 코딩하는 단백질 각각을 수득하였다.
실시예 2: 단백질의 전기영동
실시예 1에서 제조한 단백질을 SDS-PAGE(Sodium DodecylSulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)로 분자량의 크기에 따라 각각의 단백질을 분리하여 확인하였다.
Running 젤(DW 3.35㎖, 30%의 아크릴아마이드 4㎖, 1.5M Tris-HCl pH8.8 2.5㎖, 10%의 SDS 100㎕, 10%의 APS 50㎕, TEMED 10㎕)과 Stacking 젤(DW 1.5㎖, 30%의 아크릴아마이드 330㎕, 1M Tris-HCl pH6.8 630㎕, 10%의 SDS 25㎕, 10%의 APS 12.5㎕, TEMED 5㎕)을 이용하여 gel을 제작하고 실시예 1에서 제조한 단백질을 웰에 넣어 100V에서 100분간 전기영동 하였다.
단백질의 전기영동 결과는 도 8에 도시하였다.
그 결과,
RLuc8.6은 38kDa, KillerRed는 31kDa, RLuc8.6-KillerRed는 69kDa, RLuc8.6-KillerRed-Lead peptide는 71kDa임을 알 수 있었다(도 8 (a)).
또한 RLuc8은 38kDa, MiniSOG은 13kDa, RLuc8-MiniSOG은 53kDa, RLuc8-MiniSOG-Lead peptide는 54kDa임을 알 수 있었다(도 8 (b))
실시예 3: 단백질의 형광 및 생물발광 측정
실시예 1에서 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 버퍼(1x PBS)를 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 32096))에 분주하였다. 그 후, 형광신호값은 Thermo Scientific? Varioskan? Flash Multimode Reader를 사용하여 형광 분석을 수행하였다.
도9을 통해 KillerRed의 여기(Excitation) 파장은 585nm, 방출(Emission) 파장은 610nm임을 확인할 수 있었다(도 9 (a)).
또한 MiniSOG의 여기(Excitation) 파장은 448nm, 방출(Emission) 파장은 500nm, 528nm임을 확인할 수 있었다(도 9 (b)).
또한, 실시예 1에서 정제한 단백질(최종 농도 1μM)이 포함되어 있는 100㎕의 버퍼(1x PBS)를 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30196))에 분주한 후, 천연형의 2-디옥시 유도체(2-deoxy derivative)인 Co-h 기질 용액 (최종 농도 50μM)이 포함되어 있는 50㎕의 버퍼(1x PBS)를 이용하여 생물발광 분석(bioluminescence assay)을 수행하였다. Thermo Scientific™ Varioskan™ Flash Multimode Reader를 사용하여 300-800nm 파장에서 생물발광 강도(bioluminescence intensity)를 즉시 측정하였다.
도10을 통해 RLuc8.6의 방출(Emission) 파장 535nm에서 KillerRed의 방출(Emission) 파장 610nm로 생물발광 공명 에너지 전이(BRET)가 일어났다는 것을 확인할 수 있었다(도 10(a)).
또한 RLuc8의 방출(Emission) 파장 480nm에서 MiniSOG의 방출(Emission) 파장 500nm로 생물발광 공명 에너지 전이(BRET)가 일어났다는 것을 확인할 수 있었다(도 10(b)).
실시예 4: h-코엘렌테라진 기질 농도에 따른 활성산소 생성 효과
단백질 RLuc8.6-KR (최종 농도 10μM), 초과산화물(Superoxide)이 존재할 때 형광 강도가 감소하는 DHE(Dihydroethidium, Sigma Aldrich., USA) (최종 농도 100μM), Co-h 기질 용액이 포함되어 있는 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 RLuc8.6-KR 단백질의 활성산소 생성 효과를 확인하였다. 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 DHE(Dihydroethidium)의 여기(Excitation) 파장은 370nm, 방출(Emission) 파장은 420nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 11(a)에서 DHE(Dihydroethidium)를 통해 확인한 초과산화물(Superoxide)의 생성률은 Co-h 기질 용액의 농도가 최종 농도 150μM까지 증가 후 일정하게 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
RLuc8-MS 단백질의 활성산소 생성효과는 단백질 RLuc8-MS (최종 농도 10μM), 일중항산소(Singlet oxygen)가 존재할 때 형광 강도가 감소하는 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid, Abcam., UK)(최종 농도 50μM), FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM), 기질(substrate) Co-h 용액(solution)이 포함되어 있는, 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 수행하였다. 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid)의 여기(Excitation) 파장은 380nm, 방출(Emission) 파장은 430nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 11(b)에서 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid)를 통해 확인한 일중항산소(Singlet oxygen)의 생성률은 Co-h 기질 용액의 농도가 150μM까지 증가 후 일정하게 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: h-코엘렌테라진 기질과의 반응 시간에 따른 활성산소 생성률 측정
RLuc8.6-KR 단백질의 활성산소 생성효과는
단백질 RLuc8.6-KR (최종 농도 10μM), 초과산화물(Superoxide)이 존재할 때 형광 강도가 감소하는 DHE(Dihydroethidium) (최종 농도 100μM);를 이용하고,
RLuc8-MS 단백질의 활성산소 생성효과는
단백질 RLuc8-MS (최종 농도 10μM), 일중항산소(Singlet oxygen)가 존재할 때 형광 강도가 감소하는 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid) (최종 농도 50μM)를 이용하여 측정하였다.
이 때, 각각의 단백질은 FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM), 기질(substrate) Co-h 용액(solution) (최종농도 150μM) 이 포함되어 있는 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 활성산소 생성률을 측정하였다.
플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 DHE의 여기(Excitation) 파장은 370nm, 방출(Emission) 파장은 420nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다. 또한, ADPA의 여기(Excitation) 파장은 380nm, 방출(Emission) 파장은 430nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 12(a)에서 초과산화물(Superoxide)의 생성률은 기질(substrate) Co-h와 반응 시간이 30분까지 증가 후 일정하게 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
도 12(b)에서 일중항산소(Singlet oxygen)의 생성률은 Co-h 기질 용액과 반응 시간이 20분까지 증가 후 일정하게 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 빛 조사 후 단백질의 활성산소 생성률 측정
활성산소 생성률은 단백질 KR, RLuc8.6-KR (최종 농도 10μM), 초과산화물(Superoxide)이 존재할 때 형광 강도가 감소하는 DHE(Dihydroethidium) (최종 농도 100μM)가 포함되어 있는, 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 수행하였다.
MS, RLuc8-MS (최종 농도 10μM), 초과산화물(Superoxide)이 존재할 때 형광 강도가 감소하는 DHE(Dihydroethidium) (최종 농도 100μM), FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM)가 포함되어 있는, 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 수행하였다.
빛(+LED Light로 명명) 10mW/cm2을 30min 조사 후 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 DHE(Dihydroethidium)의 여기(Excitation) 파장은 370nm, 방출(Emission) 파장은 420nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 13(a)에서 DHE(Dihydroethidium)를 통해 확인한 초과산화물(Superoxide)의 생성률은 KillerRed가 MiniSOG보다 높은 것을 확인할 수 있었다.
활성산소 생성률은 단백질 KR, RLuc8.6-KR (최종 농도 10μM), 일중항산소(Singlet oxygen)가 존재할 때 형광 강도가 감소하는 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid) (최종 농도 50μM)가 포함되어 있는, 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 수행하였다.
MS, RLuc8-MS (최종 농도 10μM), 일중항산소(Singlet oxygen)가 존재할 때 형광 강도가 감소하는 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid) (최종 농도 50μM), FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM)가 포함되어 있는 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 수행하였다.
빛 10mW/cm2을 30min 조사 후 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid)의 여기(Excitation) 파장은 380nm, 방출(Emission) 파장은 430nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 13(b)에서 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid)를 통해 확인한 일중항산소(Singlet oxygen)의 생성률은 MiniSOG가 KillerRed보다 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: Co-h 기질 반응 후 단백질의 활성산소 생성률 측정
활성산소 생성률은 단백질 KR, RLuc8.6-KR (최종 농도 10μM), 초과산화물(Superoxide)이 존재할 때 형광 강도가 감소하는 DHE(Dihydroethidium) (최종 농도 100μM), Co-h 기질(substrate) 용액(solution) (최종농도 150μM) 이 포함되어 있는, 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 측정하였다.
MS, RLuc8-MS (최종 농도 10μM), 초과산화물(Superoxide)이 존재할 때 형광 강도가 감소하는 DHE(Dihydroethidium) (최종 농도 100μM), FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM), Co-h 기질 용액 (최종농도 150μM) 이 포함되어 있는, 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 수행하였다. 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 DHE(Dihydroethidium)의 여기(Excitation) 파장은 370nm, 방출(Emission) 파장은 420nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 14(a)에서 DHE(Dihydroethidium)를 통해 확인한 초과산화물(Superoxide)의 생성률은 RLuc8.6-KR가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
활성산소 생성률은 단백질 KR, RLuc8.6-KR (최종 농도 10μM), 일중항산소(Singlet oxygen)가 존재할 때 형광 강도가 감소하는 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid) (최종 농도 50μM), 기질(substrate) Co-h 용액(solution) (최종농도 150μM) 이 포함되어 있는, 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 수행하였다.
MS, RLuc8-MS (최종 농도 10μM), 일중항산소(Singlet oxygen)가 존재할 때 형광 강도가 감소하는 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid) (최종 농도 50μM), FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM), Co-h 기질 용액 (최종농도 150μM)이 포함되어 있는 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 이용하여 수행하였다.
플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid)의 여기(Excitation) 파장은 380nm, 방출(Emission) 파장은 430nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 14(b)에서 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid)를 통해 확인한 일중항산소(Singlet oxygen)의 생성률은 RLuc8-MS이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: ROS Scavenger 처리 후 Co-h 기질 반응에 의한 단백질의 활성산소 생성률 측정
활성산소 생성률은 단백질 RLuc8.6-KR (최종 농도 10μM), 초과산화물(Superoxide)이 존재할 때 형광 강도가 감소하는 DHE(Dihydroethidium) (최종 농도 100μM), 활성산소종 Scavenger인 SOD (Superoxide scavenger, 최종 농도 800U/ml), Sodium azide (Singlet oxygen scavenger, 최종 농도 100mM) 및 D-Mannitol (Hydroxyl radical scavenger, 최종 농도 100mM) 이 포함되어 있는 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 30분 동안 반응하였다.
빛에 의한 단백질의 활성산소 생성을 위해 Co-h 기질 용액 2.6μL[Co-h(2.5mg/mL, 6000μM) Final 150uM, Total 102.6μl]을 넣고 상온에서 30분 동안 반응하였다. 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 DHE(Dihydroethidium)의 여기(Excitation) 파장은 370nm, 방출(Emission) 파장은 420nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 15(a)에서 DHE(Dihydroethidium)를 통해 확인한 KillerRed의 초과산화물(Superoxide)의 생성률은 SOD를 처리했을 때 가장 낮은 것으로 보아 SOD로 인해 초과산화물(Superoxide)의 생성이 억제된다는 것을 확인할 수 있었다.
활성산소 생성률은 RLuc8-MS (최종 농도 농도 10μM), 일중항산소(Singlet oxygen)가 존재할 때 형광 강도가 감소하는 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid) (최종 농도 50μM), FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM), 활성산소종 Scavenger인 SOD (Superoxide scavenger, Final 800U/ml), Sodium azide (Singlet oxygen scavenger, Final 100mM) 및 D-Mannitol (Hydroxyl radical scavenger, Final 100mM) 이 포함되어 있는, 100㎕의 버퍼(50mM HEPES-KOH, 24℃, pH7.4)를 30분 동안 반응하였다. 빛에 의한 단백질의 활성산소 생성을 위해 Co-h 기질 용액 2.6μL[Co-h(2.5mg/mL, 6000μM) Final 150uM, Total 102.6μl]을 넣고 상온에서 30분 동안 반응하였다. 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid)의 여기(Excitation) 파장은 380nm, 방출(Emission) 파장은 430nm에서 형광 강도 감소율을 측정하였다.
도 15(b)에서 ADPA(Anthracene-9,10-dipropionic acid)를 통해 확인한 확인한 MiniSOG의 일중항산소(Singlet oxygen)의 생성률은 Sodium azide를 처리했을 때 가장 낮은 것으로 보아 Sodium azide로 인해 일중항산소(Singlet oxygen)의 생성이 억제된다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: Co-h 기질 반응 후 생물발광 강도의 안정성 측정
생물발광 분석(bioluminescence assay)은 정제한 단백질 RLuc8.6 또는 RLuc8.6-KR-LP 또는 RLuc8 또는 RLuc8-MS-LP (최종 농도 10μM)가 포함되어 있는 30㎕의 버퍼(1x PBS)와 Co-h 기질 용액 0.8㎕(최종 농도 150μM)을 인큐베이션(37℃)에서 반응 후 수행하였다. 정제한 단백질 (최종 농도 10μM)가 포함되어 있는 30㎕의 정상 마우스 세럼(Jackson ImmunoResearch, USA) 기질(substrate) Co-h 용액(solution) 0.8㎕(최종 농도 150μM)을 인큐베이션(37℃)에서 반응 후 수행하였다. GLOMAX를 사용하여 생물발광 강도(bioluminescence intensity)를 즉시 측정하였다.
도 16(a) 및 (b)를 통해 버퍼(1x PBS) 혹은 정상 마우스 세럼 내 RLuc8.6 및 RLuc8.6-KR-LP 단백질의 발광 강도는 인큐베이션(37℃)에서 반응 시간이 증가하더라도 발광이 일정한 것을 확인할 수 있었다.
도 17(a) 및 (b)를 통해 버퍼(1x PBS) 혹은 정상 마우스 세럼 내 RLuc8 및 RLuc8-MS-LP 단백질의 발광 강도는 인큐베이션(37℃)에서 반응 시간이 증가하더라도 발광이 일정한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 10: 세포에 처리한 단백질 종류와 빛을 조사한 시간에 따른 MTT의 비색 변화와 세포 생존율 측정
MCF-7 세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI(Well Gene., Korea, Cat# LM011-02)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS 프리 배지를 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 동안 반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣는다. 빛 10mW/cm2을 시간에 따라 조사 후 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣는다. 10㎕의 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(Cell Biolabs Inc., USA) (최종 농도 1x)를 넣고 37℃에서 4시간 동안 반응하였다. 100㎕ 상층액을 제거 후 100㎕의 DMSO(Sigma-Aldrich., USA)를 첨가하고 10분 동안 반응하였다. 세포에 처리한 단백질 종류와 빛을 조사한 시간에 따른 MTT의 비색 변화를 확인한 후 플레이트 리더(Plate reader)를 사용하여 570㎚ 파장에서 흡광 강도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.
도 18 및 19의 결과를 통해, KR, RLuc8.6-KR, MS, RLuc8-MS을 처리한 세포는 제 2단백질이 없기 때문에, 세포가 살아있어 미토콘드리아 내로 MTT가 들어가서 염색이 핑크색으로 염색이 되는 것을 알 수 있다. 하지만, RLuc8.6-KR-LP 또는 RLuc8-MS-LP를 처리한 세포는 Co-h 용액과 반응한 시간이 증가함에 따라 세포가 사멸되기 때문에 핑크색으로 염색이 되지 않는 것을 알 수 있다.
즉, RLuc8.6-KR-LP를 처리한 세포는 빛을 조사한 시간이 증가함에 따라 MTT의 비색 변화가 증가하고, 세포의 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
본 실시예에서는 암세포에 대하여, 이미 발현시킨 KR, RLuc8.6-KR, MS, RLuc8-MS 단백질을 사용하고, 이러한 단백질들은 그 사이즈 때문에 암세포 내부로 도입되지 못한다. 그러므로, 활성산소를 이용하여 암세포를 사멸시키기 위해서는 해당 암세포 가까이에서 활성산소를 제공할 수 있는 요건이 충족될 필요가 있다.
상기 실험 결과를 통해서, 암세포를 사멸시키기 위해, 활성 산소를 발생시키는 KR, RLuc8.6-KR, MS, RLuc8-MS 단백질들을 암세포와 최대한 근접하게 위치시키게 하는 역할을 제 2단백질인 Lead peptide가 수행하고 있음으로 추측할 수 있다. 즉, 상기 Lead peptide가 암세포막 근처로 상기 단백질들을 위치시켜서 암세포의 막에 활성산소를 제공함으로써 암세포가 사멸시키는 것으로 생각된다.
실시예 11: 세포에 처리한 단백질 종류와 기질 Co-h 기질과 반응한 시간에 따른 MTT의 비색 변화와 세포 생존율 측정
MCF-7 세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다.
24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕ FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응하였다.
24시간 동안 반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 Co-h 기질 용액 (최종 농도 150μM)이 포함되어 있는, 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣는다. FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 100㎕의 새로운 FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣는다.
MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 10㎕(최종 농도 1x)를 넣고 37℃에서 4시간 동안 반응하였다. 100㎕ 상층액을 제거 후 100㎕의 DMSO를 첨가하고 10분 동안 반응하였다. 세포에 처리한 단백질 종류와 빛을 조사한 시간에 따른 MTT의 비색 변화를 확인한 후 플레이트 리더(Plate reader)를 사용하여 570㎚ 파장에서 흡광 강도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.
MTT는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)이 살아있는 세포의 미토콘드리아 내로 들어가서 세포의 증식 또는 살아있는 세포를 측정하는 방법이다.
도 20 내지 23의 결과를 통해, 활성 산소를 발생시키는 KR, RLuc8.6-KR, MS, RLuc8-MS 단백질들을 암세포와 최대한 근접하게 위치시키게 하는 역할을 제 2단백질인 Lead peptide가 없기 때문에, 살아있는 세포의 미토콘드리아 내로 MTT가 들어가서 염색이 핑크색으로 염색이 되는 것을 알 수 있다. 하지만, RLuc8.6-KR-LP 또는 RLuc8-MS-LP를 처리한 세포는 Co-h 용액과 반응한 시간이 증가함에 따라 세포가 사멸되기 때문에 핑크색으로 염색이 되지 않는 것을 알 수 있다.
즉, RLuc8.6-KR-LP 또는 RLuc8-MS-LP를 처리한 세포는 Co-h 용액과 반응한 시간이 증가함에 따라 MTT의 비색 변화가 증가하고, 세포의 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있다.
실시예 12: 세포에 처리한 단백질 종류와 i)빛을 조사한 시간; 또는 ii) Co-h 기질과 반응한 시간;에 따른 형광 합성 사진과 SYTOX Green 또는 EthD-1의 상대적 형광 강도 측정
MCF-7 세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응하였다.
24시간 동안 반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free media, RPMI)를 넣는다.
반응한 후, 8.1㎕의 FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM)을 넣는다. 18시간 동안 반응한 후, 24시간 동안 반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 FMN(Flavin mononucleotide) (최종농도 150μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣고 37℃에서 1시간 반응한다.
i) 빛을 조사한 시간에 따른 실험(도 24, 25, 28, 29)
빛 10mW/cm2을 시간에 따라 조사 후 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green(Thermo Scientific Inc., USA) 50㎕(최종 농도 261nM)을 넣고 37℃에서 30분 동안 반응한 후, 생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI(Vecta labs., Australia) 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다.
ii) Co-h 기질과 반응한 시간에 따른 실험(도 26, 27, 30, 31)
2.6㎕의 Co-h 기질 용액 (최종 농도 150μM)을 시간에 따라 반응 후 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green 50㎕(최종 농도 261nM) 또는 EthD-1(Ethidium homodimer 90㎕ (최종 농도 1x)을 넣고 37℃에서 30분 동안 반응한 후, 생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다.
세포에 처리한 단백질 종류와 i)빛을 조사한 시간 또는 ii)Co-h 기질과 반응한 시간에 따른 SYTOX Green 또는 EthD-1과 DAPI 형광을 공초점 현미경으로 형광 사진을 확인한 후 플레이트 리더(Plate reader)를 사용하여 SYTOX Green의 여기(Excitation) 파장은 504nm, 방출(Emission) 파장은 523nm에서 EthD-1의 여기(Excitation) 파장은 525nm, 방출(Emission) 파장은 590nm에서 상대적 형광 강도를 측정하여 세포의 사멸을 확인하였다.
세포 사멸여부는 SYTOX Green(죽은세포 특이적 dye, 초록색) 또는 EthD-1(죽은세포 특이적 dye, 빨간색)와 DAPI (살아있는 세포 특이적 dye, 파랑색) 를 이용하여 형광현미경으로 관찰하였다.
도 24 내지 31를 통해 KR, RLuc8.6-KR, MS, RLuc8-MS를 처리한 세포는 활성 산소를 발생시키는 단백질들을 암세포와 최대한 근접하게 위치시키게 하는 역할을 제 2단백질인 Lead peptide가 없기 때문에, 빛을 조사하거나 기질과 반응 시키더라도 세포가 DAPI로 염색되는 것을 알 수 있다. 하지만, RLuc8.6-KR-LP 또는 RLuc8-MS-LP를 처리한 세포는 빛을 조사하거나 기질(Co-h)용액과 반응한 시간이 증가함에 따라 세포가 SYTOX Green 또는 EthD-1로 염색되는 것을 알 수 있다.
즉, RLuc8.6-KR-LP를 처리한 세포가 빛을 조사한 시간 또는 기질과 반응하는 시간이 증가함에 따라 사멸한 세포가 증가하고, SYTOX Green 또는 EthD-1의 형광 강도가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 13: 단백질 RLuc8.6-KR-LP를 처리한 다양한 Co-h 기질 농도와 반응 이후 배양 시간에 따른 세포 사멸 확인
MCF-7 세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응하였다.
24시간 동안 반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 Co-h 기질 용액이 포함되어 있는, 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phernol red free media, RPMI)를 넣는다. Co-h 기질 용액을 농도에 따라 반응 후 37℃에서 배양하였다.
배양 후, 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green 50㎕(최종 농도 261nM)과 생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다. 세포에 빛을 조사한 시간에 따른 KillerRed, SYTOX Green과 DAPI 형광을 공초점 현미경으로 세포의 사멸을 확인하였다.
도 32를 통해 단백질 RLuc8.6-KR-LP를 처리한 세포에 25μM 농도 또는 50μM 농도의 기질용액을 5분 처리한 뒤 세포 배양 시간이 약 30분 이상 지났을 때 SYTOX Green으로 염색된 세포의 수가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만, 기질용액의 농도를 150μM 농도로 5분 처리한 뒤 세포 배양 시간에 따른 세포 사멸은 SYTOX Green으로 염색되는 세포가 약 10분 뒤에도 관찰되는 것을 알 수 있었다.
따라서, 다양한 Co-h 기질 용액의 농도를 처리 후 배양한 시간에 따른 세포사멸 효과는 기질 용액의 농도가 높아질수록 배양 후 단시간 이내에 SYTOX Green으로 염색된 세포의 수가 증가하는 즉, 세포사멸이 발생하는 것을 확인 할 수 있었다.
실시예 14: 단백질 RLuc8.6-KR-LP를 처리한 세포에 빛을 조사한 시간별 배양 시간에 따른 세포 사멸 확인
MCF-7 세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응하였다.
24시간 동안 반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣는다. 빛 10mW/cm2을 시간에 따라 조사 후 37℃에서 배양하였다.
배양 후, 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green 50㎕(최종 농도 261nM)와 생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI(Vector Laboratories Inc., USA) 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다. 세포에 빛을 조사한 시간에 따른 KillerRed, SYTOX Green과 DAPI 형광을 공초점 현미경으로 세포의 사멸을 확인하였다.
도 33을 통해 단백질 RLuc8.6-KR-LP를 처리한 세포에 빛 10mW/cm2을 1분 조사하였을 때는 세포 배양시간이 약 1시간 이상 지났을 때 SYTOX Green으로 염색된 세포의 수가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 빛 10mW/cm2을 5분 또는 10분 조사하였을 때는 세포 배양시간이 약 30분 이상 지났을 때부터 SYTOX Green으로 염색된 세포의 수가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
따라서, 세포에 빛 10mW/cm2을 조사한 시간이 길수록 세포 배양 시간이 지남에 따라 세포사멸이 증가되는 것을 알 수 있었다.
실시예 15: Co-h 기질을 사용하여 세럼의 유무와 단백질 RLuc8.6-KR-LP를 처리한 시간에 따른 세포 사멸 확인
MCF-7 세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI) 혹은 FBS 배지(FBS media, RPMI)를 넣고 37℃에서 시간에 따라 반응하였다.
반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 Co-h 기질 용액(최종 농도 150μM), 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green(최종 농도 261nM)이 포함되어 있는, 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phenol red free media, RPMI)를 넣고 37℃에서 30분 동안 반응하였다.
반응 후, 생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다. KillerRed, SYTOX Green과 DAPI 형광을 공초점 현미경으로 세포의 사멸을 확인하였다.
도 34를 통해 세포를 세럼 프리 배지(Serum-free media로 명명) 또는 세럼을 포함한 배지(Serum-containing media로 명명)에 배양하였을 때 모두 단백질 RLuc8.6-KR-LP을 처리한 시간이 약 4시간 이후부터 SYTOX Green으로 염색된 세포의 수가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
따라서, 세럼유무에 상관없이 단백질을 처리한 후 반응한 시간이 증가함에 따라 세포사멸이 증가하는 것을 알 수 있었다.
실시예 16: Co-h 기질을 사용하여 세럼의 유무와 단백질 RLuc8.6-KR-LP의 농도에 따른 세포 사멸 확인
MCF-7 세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol free media, RPMI)로 세척하고 정제한 단백질이 농도에 따라 포함되어 있는 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI) 혹은 FBS 배지(FBS media, RPMI)를 넣고 37℃에서 12시간 동안 반응하였다.
24시간 동안 반응한 후, 반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media, RPMI)로 세척하고 Co-h 기질 용액 (최종 농도 150μM), 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green (최종 농도 261nM)이 포함되어 있는, 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phernol red free media, RPMI)를 넣고 37℃에서 30분 동안 반응하였다.
반응 후, 생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다. KillerRed, SYTOX Green과 DAPI 형광을 공초점 현미경으로 세포의 사멸을 확인하였다. 세포 사멸여부는 SYTOX Green(죽은세포 특이적 dye, 초록색)과 DAPI (살아있는 세포 특이적 dye, 파랑색)를 이용하여 형광현미경으로 관찰하였다.
도 35를 통해 세포를 세럼 프리 배지(Serum-free media로 명명) 또는 세럼을 포함한 배지(Serum-containing media로 명명)에 배양하였을 때 모두 단백질 RLuc8.6-KR-LP을 처리한 농도가 증가할수록 SYTOX Green으로 염색된 세포의 수가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
따라서, 세럼유무에 상관없이 처리하는 단백질의 농도가 증가함에 따라 따라 세포사멸이 증가하는 것을 알 수 있었다.
실시예 17: 세포에 처리한 RLuc8.6-KR-LP와 Co-h 기질과 반응한 시간에 따른 KR, SYTOX Green, DAPI의 유세포 분석 측정
MCF-7 세포 1x106개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well(SPL, Cat# 34096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 배양 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media, RPMI)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media, RPMI)를 넣고 37℃에서 24시간(overnight) 동안 반응하였다.
KillerRed: FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media, RPMI)로 세척한 후 Trypsin EDTA(gibco?) 100㎕을 처리하여 세포를 떼어낸 후, 1,000RPM으로 3분 동안 원심분리하였다. 5% FBS가 포함되어 있는 1X DPBS 400㎕로 Cell strainer(SPL, cat# 93070)를 이용하여 Filteration하였다. 유세포 분석기(BD FACS Canto?)로 이 용액에서 형광을 발하는 특정 세포의 수를 분석하였다.
SYTOX Green: FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media, RPMI)로 세척한 후 Co-h 기질 용액이 포함되어 있는 100㎕(최종농도 150μM)의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media, RPMI)를 넣고 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세척 없이 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green 50㎕(최종농도 261nM)를 넣고 37℃에서 30분 동안 반응하였다. 세척없이 Trypsin EDTA(gibco?) 100㎕을 처리하여 세포를 떼어낸 후, 1,000RPM으로 3분 동안 원심분리하였다. 5% FBS가 포함되어 있는 1X DPBS 400㎕로 Cell strainer(SPL, cat# 93070)를 이용하여 Filteration하였다. 유세포 분석기(BD FACS Canto?)로 이 용액에서 형광을 발하는 특정 세포의 수를 분석하였다.
DAPI: FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media, RPMI)로 세척한 후 Co-h 기질 용액이 포함되어 있는 100㎕(최종농도 150μM)의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media, RPMI)를 넣고 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media, RPMI)로 세척한 후 100㎕의 배지(RPMI)를 넣었다. 살아있는 세포의 DNA를 염색하는 DAPI 10㎕를 넣고 37℃에서 30분 동안 반응하였다. 세척없이 Trypsin EDTA(gibco?) 100㎕을 처리하여 세포를 떼어낸 후, 1,000RPM으로 3분 동안 원심분리하였다. 5% FBS가 포함되어 있는 1X DPBS 400㎕로 Cell strainer(SPL, cat# 93070)를 이용하여 Filteration하였다. 유세포 분석기(BD FACS Canto?)로 이 용액에서 형광을 발하는 특정 세포의 수를 분석하였다.
도 36 및 37을 통해 단백질 RLuc8.6-KR-LP를 처리한 세포에서 KillerRed의 형광을 나타내는 세포의 수가 증가하고, SYTOX Green의 형광을 나타내는 세포의 수가 증가하는 반면에, DAPI로 염색되는 세포의 수가 감소하는 것을 알 수 있었다.
이는 RLuc8.6-KR을 처리한 세포는 활성 산소를 발생시키는 단백질들을 암세포와 최대한 근접하게 위치시키게 하는 역할을 제 2단백질인 Lead peptide가 없기 때문에, 기질과 반응 시키더라도 세포사멸 효과 없이 DAPI로 염색되는 세포의 수만 증가되는 것을 알 수 있다.
실시예 18: Lead Peptide의 유무와 세포의 종류에 따른 빛 조사 후 세포 사멸 확인
다양한 유방암세포주 (MCF-7, BT-474, MDA-MB-435, SK-BR-3, MDA-MB-231, MCF-10A)에서 빛의 조사에 의한 단백질 RLuc8.6-KR-LP의 세포사멸 효과를 확인하였다.
각 유방암 세포주에 대한 정보는 다음과 같다(표 4).
MCF-7: (Origin: breast, mammary gland, Species: human - female, 69 years old, Caucasian, Growth pattern: monolayer, Media: RPMI1640 with L-glutamine (300mg/L), 25mM HEPES and 25mM NaHCO3, 90%; heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 10%), 한국세포주은행에서 구입
SK-BR-7: (Origin: breast, mammary gland, Species: human - female, 43 years old, Caucasian, Growth pattern: monolayer, Media: RPMI1640 with L-glutamine (300mg/L), 25mM HEPES and 25mM NaHCO3, 90%; heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 10%), 한국세포주은행에서 구입
MDA-MB-231: (Origin: breast, mammary gland, Species: human - female, 51 years old, Caucasian, Growth pattern: monolayer, Media: DMEM with glucose (4.5g/L), L-glutamine and sodium pyruvate, 90%; heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 10%), 한국세포주은행에서 구입
MDA-MB-435: (Origin: breast, mammary gland, Species: human - female, 31 years old, Caucasian, Media: DMEM with glucose (4.5g/L), L-glutamine and sodium pyruvate, 90%; heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 10%), ATCC (USA)에서 구입
BT-474: (Origin: breast, mammary gland, Species: human, Media: RPMI1640 with L-glutamine (300mg/L), 25mM HEPES and 25mM NaHCO3, 90%; heat inactivated fetal bovine serum (FBS), 10%), 한국세포주은행에서 구입
MCF-10A: (Origin: breast, mammary gland, Species: human - female, 36 years old, Caucasian, Media: The base medium for this cell line (MEBM) with the additives can be obtained from Lonza/Clonetics Corporation as a kit: MEGM, Kit Catalog No. CC-3150), ATCC (USA)에서 구입.
Cell line estrogen receptor progesterone receptor HER2
receptor 		CK5/6 EGFR Ki-67 AR Subtype Response to Luc-RGP-LP
MCF-7 6 6 0-1+ - 1+ 90% 7 Luminal A Yes
BT-474 0 8 3+ - 1+ 70% 7 Luminal B No
MDA-MB-435 0 0 3+ - 0 80% 6 HER2 Yes
SK-BR-3 0 0 3+ - 2+ 20% 8 HER2 No
MDA-MB-231 0 0 0-1+ - 1+ 100% 8 Basal Yes
MCF-10A 0 0 0-1+ + 2+ 30% 0 Basal No
본 실시예에서 사용한 Lead peptide(WLEAAYQRFL)는 MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있다
세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media)를 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 동안 반응한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red free media)로 세척하고 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media)를 넣는다.
빛 10mW/cm2을 10분 동안 조사 후 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green 50㎕(최종 농도 261nM)을 넣고 37℃에서 30분 동안 반응하였다. 생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다. Killerred, SYTOX Green과 DAPI 형광을 공초점 현미경으로 세포의 사멸을 확인하였다.
그 결과를 도 38에 도시하였다.
그 결과, 공지된 기술적 사실에서와 같이, 서열번호 6의 리드 펩타이드는 MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 세포에 특이적이라는 점을 알 수 있었다. 다만, 상기 표 4에 기재한 바와 같이, 본 실시예에서 사용된 6개의 유방암 세포주는 각각 서로 다른 수용체를 발현하는 특성을 지니고 있는 세포주에 해당한다. 더욱이, MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 암세포주가 서로 공통적으로 발현하는 주요한 수용체의 종류가 상이하였다. 이러한 사실에 기초하여, 본 발명자들은 상기 서열번호 6의 리드 펩타이드는 MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 암세포주가 발현하는 공통의 수용체에 결합하는 것이 아니라, 이들 암세포들의 공통의 막 단백질과 결합하는 특성을 가지고 있을 것으로 추측하였다.
따라서, 상기 6개의 실험 유방암 세포주에 대하여, 상기 Lead peptide가 있는 RLuc8.6-KR-LP 단백질은 MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 세포주의 공통된 막 단백질만을 인식하여 상기 3가지 암세포주를 사멸시켰음을 SYTOX Green의 염색 결과를 통해 확인할 수 있었다.
또한, 상기 6개의 실험 유방암 세포주에 대하여, 상기 공통의 막 단백질을 인식할 수 있는 Lead peptide가 없는 RLuc8.6-KR 단백질은, 모든 실험군 유방암 세포주를 인식하지 못하여 상기 6개의 유방암 세포주가 모두 사멸되지 않았음을 DAPI 염색 결과로 확인할 수 있었다.
즉, RLuc8.6-KR-LP 단백질의 LP가 MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 세포주의 막 단백질과 특이적으로 결합하여 외부에서 조사된 빛에 의해 활성화된 KR이 세포막에 활성산소를 제공하여 유방암 세포가 사멸된 것이다.
실시예 19: Lead Peptide의 유무와 세포의 종류에 따른 기질의 유무에 따른 세포 사멸 확인
유방암 세포주는 실시예 22에서 사용한 것과 동일한 6종류를 사용하였다.
세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096))에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media)로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS free & Phenol red media)를 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응하였다.
이후, FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media)로 세척하고 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지(FBS & Phenol red free media)를 넣는다. Co-h 기질 용액 (최종 농도 150μM)이 포함되어 있는, 100㎕의 FBS & Phenol red 프리 배지((FBS & Phernol red free media, RPMI)를 넣고 37℃에서 5분 동안 반응하였다.
반응 후 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green 50㎕(최종 농도 261nM) 또는 EthD-1(Ethidium homodimer 90㎕ (최종 농도 1x)을 넣고 37℃에서 30분 동안 반응하였다. 생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다. KillerRed, SYTOX Green, MiniSOG, EthD-1 및 DAPI 형광을 공초점 현미경으로 세포의 사멸을 확인하였다.
그 결과를 도 39 및 40에 도시하였다. 본 실시예의 결과 또한 상기 실시예 22의 결과와 유사한 의미를 가지는 것으로 해석할 수 있었다.
즉, 상기 6개의 실험 유방암 세포주에 대하여, 상기 Lead peptide가 있는 RLuc8.6-KR-LP 또는 RLuc8-MS-LP 단백질은 MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 세포주만을 인식하여 이들을 사멸시켰음을 SYTOX Green 또는 EthD-1의 염색 결과를 통해 확인할 수 있었다.
또한, Lead peptide가 없는 RLuc8.6-KR 또는 RLuc8-MS 단백질은 모든 실험군 유방암 세포주를 인식하지 못하여 상기 6개의 유방암 세포주가 모두 사멸되지 않았음을 DAPI 염색 결과로 확인할 수 있었다.
즉, RLuc8.6-KR-LP 또는 RLuc8-MS-LP 단백질의 LP가 MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 세포주의 공통된 막 단백질과 특이적으로 결합하고, 첨가된 기질이 RLuc8 또는 RLuc8.6단백질과 반응하여 빛을 제공하여 KR 또는 MS가 활성산소를 생성하여 상기 유방암 세포가 사멸되는 것이다.
실시예 20: 환자의 유방암세포주 (Patient Primary Cell-BL-067233)에서 생물발광에 의한 단백질 RLuc8.6-KR-LP의 세포사멸 효과
세포 5x105개/㎖을 96-웰 플레이트(SPL Cell Culture Plate, 96 well (SPL, Cat# 30096)에 분주한 후 37℃에서 24시간(overnight) 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, Primary cell media로 세척하고 정제한 단백질(최종 농도 10μM)이 포함되어 있는 100㎕의 Primary cell media를 넣고 37℃에서 12시간 동안 반응하였다.
24시간 동안 반응한 후, Primary cell media로 세척하고 100㎕의 primary cell media를 넣는다. Co-h 기질 용액 (최종 농도 150μM)을 5분 동안 처리 또는 빛 10mW/cm2을 5분 동안 조사 후 사멸한 세포의 DNA를 염색하는 SYTOX Green 50㎕(최종 농도 261nM)을 넣고 37℃에서 30분 동안 반응하였다.
생존한 세포의 DNA를 염색하는 DAPI 10㎕을 넣고 5분 동안 반응하였다. 세포에 처리한 단백질 종류와 빛을 조사한 시간에 따른 SYTOX Green과 DAPI 형광을 공초점 현미경으로 형광 사진을 확인하여 세포의 사멸을 확인하였다. 본 실시예에서 사용한 환자의 유방암 세포주에 대한 정보는 다음과 같다(표 5).
No. of Patient Primary cell Sex Age Stage Phenotype
(ER, PR, Her2) 		Cytokeratin 5/6 EGFR
1 Female 32 3C Triple negative Positive Positive
2 Female 57 3B Triple negative Positive Positive
3 Female 48 2B Triple negative Positive Positive
그 결과는 도 41에 도시하였다.
상기 환자의 유방암 세포주에 대하여, 상기 Lead peptide가 있는 RLuc8.6-KR-LP를 처리한 유방암 세포주에서 세포사멸 효과를 나타냈다. 이 때, Co-h 기질을 첨가한 세포의 사멸이 보다 효과적으로 나타났다.
이러한 결과를 기초로, 본 발명자는,
본 실시예에서 사용된 Lead Peptide가 상기 암환자 유래의 암세포주에도 특이성을 가지는 것으로 판단할 수 있었다. 이를 통해, 상기 암환자 유래의 암세포주 또한, MCF-7, MDA-MB-231과 MDA-MB-435 세포주와 공통의 막 단백질을 가지는 것으로 예상된다이러한 Lead Peptide의 특성은 상기 암환자 유래의 암세포주가 ER, PR, Her2 등의 대표적인 암세포막 수용체를 전혀 발현하지 않는 경우에도, 해당 암세포를 타겟팅하여 사멸시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 21: 마우스에 처리한 RLuc8.6-KR-LP와 Co-h 기질 여부에 따른 IVIS 스펙트럼 in vivo 이미지와 조직 크기 측정
MDA-MB-231 암 세포(ATCC)를 5% FBS(Corning Inc.) 및 1% penicillin and streptomycin을 함유하는 RPMI(Corning Inc.)에서 배양하였다. 실험에 사용된 쥐는 7주 된 NOD-SCID 종으로 중앙실험동물에서 구입 후 본 연구기관에서 적응을 위해 2주 동안 식이 제한 없이 사육되었다. 암컷으로 무게는 17~23g이었다.
본 동물 실험은 아산 병원의 동물 관리와 사용 위원회(IACUC)에서 승인 후 진행되었으며 가이드 라인을 준수하여 수행되었다. RPMI에서 희석한 MDA-MB-231 세포 1x106개/50㎕와 Matrigel(Corning Inc.) 50㎕을 NOD-SCID 쥐의 지방체에 피하 주입하였다. 세포 주입 후 9일째, 쥐의 종양의 크기가 약 40mm2이 될 때 20㎕의 matrigel을 함유한 단백질 (RLuc8.6-KR-LP, 최종 농도 50μM)을 종양 내로 주입하였다. 쥐를 호흡 마취시킨 후, 단백질에서 발하는 형광을 IVIS 스펙트럼(Xenogen Inc.)으로 영상화하였다. BL-PDT를 위해 h-코엘렌테라진 (5㎍/50㎕, Nanolight Inc.)를 1x PBS (Corning Inc.)에 희석 후 피하 주입하였다. h-코엘렌테라진으로 부터의 발광은 IVIS 스펙트럼을 5초로 설정 후 이미징하였다.
도 42 내지 44을 통해 IVIS 스펙트럼으로 쥐의 종양 내 형광과 발광 모두 확인되었으며 단백질 RLuc8.6-KR-LP와 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine) 기질(substrate) 용액을 처리한 쥐의 종양 크기가 가장 작은 것을 확인하였다. 종양 크기가 가장 작은 것은 암세포의 사멸이 발생하였다는 것을 의미한다.
이는 단백질 RLuc8.6-KR-LP는 h-코엘렌테라진 기질이 존재하여야만 기질이 RLuc8.6와 반응하여 활성산소를 생성하여, 이러한 활성산소를 생성시키는 단백질들을 암세포와 최대한 근접하게 위치시키게 하는 역할을 제 2단백질인 Lead peptide가 이러한 단백질을 암세포의 세포막으로 이동시켜 세포막에 활성산소가 제공되어 세포사멸이 일어나 궁극적으로 종양의 성장이 억제되는 것을 시사한다.
<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY <120> A Composition for cancer cell death and its use <130> CP19-164 <150> KR 10-2018-0126301 <151> 2018-10-22 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KillerRed <400> 1 Met Leu Cys Cys Met Arg Arg Thr Lys Gln Val Glu Lys Asn Asp Glu 1 5 10 15 Asp Gln Lys Ile Ser Glu Gly Gly Pro Ala Leu Phe Gln Ser Asp Met 20 25 30 Thr Phe Lys Ile Phe Ile Asp Gly Glu Val Asn Gly Gln Lys Phe Thr 35 40 45 Ile Val Ala Asp Gly Ser Ser Lys Phe Pro His Gly Asp Phe Asn Val 50 55 60 His Ala Val Cys Glu Thr Gly Lys Leu Pro Met Ser Trp Lys Pro Ile 65 70 75 80 Cys His Leu Ile Gln Tyr Gly Glu Pro Phe Phe Ala Arg Tyr Pro Asp 85 90 95 Gly Ile Ser His Phe Ala Gln Glu Cys Phe Pro Glu Gly Leu Ser Ile 100 105 110 Asp Arg Thr Val Arg Phe Glu Asn Asp Gly Thr Met Thr Ser His His 115 120 125 Thr Tyr Glu Leu Asp Asp Thr Cys Val Val Ser Arg Ile Thr Val Asn 130 135 140 Cys Asp Gly Phe Gln Pro Asp Gly Pro Ile Met Arg Asp Gln Leu Val 145 150 155 160 Asp Ile Leu Pro Asn Glu Thr His Met Phe Pro His Gly Pro Asn Ala 165 170 175 Val Arg Gln Leu Ala Phe Ile Gly Phe Thr Thr Ala Asp Gly Gly Leu 180 185 190 Met Met Gly His Phe Asp Ser Lys Met Thr Phe Asn Gly Ser Arg Ala 195 200 205 Ile Glu Ile Pro Gly Pro His Phe Val Thr Ile Ile Thr Lys Gln Met 210 215 220 Arg Asp Thr Ser Asp Lys Arg Asp His Val Cys Gln Arg Glu Val Ala 225 230 235 240 Tyr Ala His Ser Val Pro Arg Ile Thr Ser Ala Ile Gly Ser Asp Glu 245 250 255 Asp <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MiniSOG <400> 2 Met Glu Lys Ser Phe Val Ile Thr Asp Pro Arg Leu Pro Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ile Ile Phe Ala Ser Asp Gly Phe Leu Glu Leu Thr Glu Tyr Ser Arg 20 25 30 Glu Glu Ile Leu Gly Arg Asn Gly Arg Phe Leu Gln Gly Pro Glu Thr 35 40 45 Asp Gln Ala Thr Val Gln Lys Ile Arg Asp Ala Ile Arg Asp Gln Arg 50 55 60 Glu Ile Thr Val Gln Leu Ile Asn Tyr Thr Lys Ser Gly Lys Lys Phe 65 70 75 80 Trp Asn Leu Leu His Leu Gln Pro Met Arg Asp Gln Lys Gly Glu Leu 85 90 95 Gln Tyr Phe Ile Gly Val Gln Leu Asp Gly 100 105 <210> 3 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLuc8 <400> 3 Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr 1 5 10 15 Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser 20 25 30 Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile 35 40 45 Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val 50 55 60 Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly 65 70 75 80 Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp 85 90 95 His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys 100 105 110 Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His 115 120 125 Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu 130 135 140 Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu 145 150 155 160 Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu 165 170 175 Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg 180 185 190 Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu 195 200 205 Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro 210 215 220 Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr 225 230 235 240 Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu 245 250 255 Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys 260 265 270 Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln 275 280 285 Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu 290 295 300 Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln 305 310 <210> 4 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RLuc8.6 <400> 4 Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr 1 5 10 15 Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser 20 25 30 Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile 35 40 45 Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val 50 55 60 Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly 65 70 75 80 Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp 85 90 95 His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys 100 105 110 Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Ala Phe His 115 120 125 Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu 130 135 140 Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Met Gly Trp Pro Asp Ile Glu 145 150 155 160 Glu Glu Leu Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu 165 170 175 Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Leu Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg 180 185 190 Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu 195 200 205 Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro 210 215 220 Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr 225 230 235 240 Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu 245 250 255 Ser Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys 260 265 270 Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln 275 280 285 Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu 290 295 300 Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln 305 310 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lead Peptide <400> 5 Trp Xaa Glu Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lead Peptide <400> 6 Trp Leu Glu Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-KillerRed <400> 7 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Pro Met Leu Cys Cys Met Arg Arg Thr Lys Gln Val Glu Lys Asn Asp 35 40 45 Glu Asp Gln Lys Ile Ser Glu Gly Gly Pro Ala Leu Phe Gln Ser Asp 50 55 60 Met Thr Phe Lys Ile Phe Ile Asp Gly Glu Val Asn Gly Gln Lys Phe 65 70 75 80 Thr Ile Val Ala Asp Gly Ser Ser Lys Phe Pro His Gly Asp Phe Asn 85 90 95 Val His Ala Val Cys Glu Thr Gly Lys Leu Pro Met Ser Trp Lys Pro 100 105 110 Ile Cys His Leu Ile Gln Tyr Gly Glu Pro Phe Phe Ala Arg Tyr Pro 115 120 125 Asp Gly Ile Ser His Phe Ala Gln Glu Cys Phe Pro Glu Gly Leu Ser 130 135 140 Ile Asp Arg Thr Val Arg Phe Glu Asn Asp Gly Thr Met Thr Ser His 145 150 155 160 His Thr Tyr Glu Leu Asp Asp Thr Cys Val Val Ser Arg Ile Thr Val 165 170 175 Asn Cys Asp Gly Phe Gln Pro Asp Gly Pro Ile Met Arg Asp Gln Leu 180 185 190 Val Asp Ile Leu Pro Asn Glu Thr His Met Phe Pro His Gly Pro Asn 195 200 205 Ala Val Arg Gln Leu Ala Phe Ile Gly Phe Thr Thr Ala Asp Gly Gly 210 215 220 Leu Met Met Gly His Phe Asp Ser Lys Met Thr Phe Asn Gly Ser Arg 225 230 235 240 Ala Ile Glu Ile Pro Gly Pro His Phe Val Thr Ile Ile Thr Lys Gln 245 250 255 Met Arg Asp Thr Ser Asp Lys Arg Asp His Val Cys Gln Arg Glu Val 260 265 270 Ala Tyr Ala His Ser Val Pro Arg Ile Thr Ser Ala Ile Gly Ser Asp 275 280 285 Glu Asp 290 <210> 8 <211> 606 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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195 200 205 Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Leu Leu Pro Ser Lys Ile Met 210 215 220 Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys 225 230 235 240 Glu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile 245 250 255 Pro Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn 260 265 270 Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile 275 280 285 Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys 290 295 300 Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu 305 310 315 320 Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val 325 330 335 Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln Glu Phe Gly Gly Gly Met Leu Cys 340 345 350 Cys Met Arg Arg Thr Lys Gln Val Glu Lys Asn Asp Glu Asp Gln Lys 355 360 365 Ile Ser Glu Gly Gly Pro Ala Leu Phe Gln Ser Asp Met Thr Phe Lys 370 375 380 Ile Phe Ile Asp Gly Glu Val Asn Gly Gln Lys Phe Thr Ile Val Ala 385 390 395 400 Asp Gly Ser Ser Lys Phe Pro His Gly Asp Phe Asn Val His Ala Val 405 410 415 Cys Glu Thr Gly Lys Leu Pro Met Ser Trp Lys Pro Ile Cys His Leu 420 425 430 Ile Gln Tyr Gly Glu Pro Phe Phe Ala Arg Tyr Pro Asp Gly Ile Ser 435 440 445 His Phe Ala Gln Glu Cys Phe Pro Glu Gly Leu Ser Ile Asp Arg Thr 450 455 460 Val Arg Phe Glu Asn Asp Gly Thr Met Thr Ser His His Thr Tyr Glu 465 470 475 480 Leu Asp Asp Thr Cys Val Val Ser Arg Ile Thr Val Asn Cys Asp Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Asp Gly Pro Ile Met Arg Asp Gln Leu Val Asp Ile Leu 500 505 510 Pro Asn Glu Thr His Met Phe Pro His Gly Pro Asn Ala Val Arg Gln 515 520 525 Leu Ala Phe Ile Gly Phe Thr Thr Ala Asp Gly Gly Leu Met Met Gly 530 535 540 His Phe Asp Ser Lys Met Thr Phe Asn Gly Ser Arg Ala Ile Glu Ile 545 550 555 560 Pro Gly Pro His Phe Val Thr Ile Ile Thr Lys Gln Met Arg Asp Thr 565 570 575 Ser Asp Lys Arg Asp His Val Cys Gln Arg Glu Val Ala Tyr Ala His 580 585 590 Ser Val Pro Arg Ile Thr Ser Ala Ile Gly Ser Asp Glu Asp 595 600 605 <210> 9 <211> 619 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8.6-KillerRed-Lead peptide <400> 9 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Pro Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile 35 40 45 Thr Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp 50 55 60 Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val 65 70 75 80 Ile Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val 85 90 95 Val Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Gly Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu 115 120 125 Asp His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro 130 135 140 Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Ala Phe 145 150 155 160 His Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met 165 170 175 Glu Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Met Gly Trp Pro Asp Ile 180 185 190 Glu Glu Glu Leu Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val 195 200 205 Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Leu Leu Pro Ser Lys Ile Met 210 215 220 Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys 225 230 235 240 Glu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile 245 250 255 Pro Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn 260 265 270 Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile 275 280 285 Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Tyr Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys 290 295 300 Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu 305 310 315 320 Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val 325 330 335 Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln Glu Phe Gly Gly Gly Met Leu Cys 340 345 350 Cys Met Arg Arg Thr Lys Gln Val Glu Lys Asn Asp Glu Asp Gln Lys 355 360 365 Ile Ser Glu Gly Gly Pro Ala Leu Phe Gln Ser Asp Met Thr Phe Lys 370 375 380 Ile Phe Ile Asp Gly Glu Val Asn Gly Gln Lys Phe Thr Ile Val Ala 385 390 395 400 Asp Gly Ser Ser Lys Phe Pro His Gly Asp Phe Asn Val His Ala Val 405 410 415 Cys Glu Thr Gly Lys Leu Pro Met Ser Trp Lys Pro Ile Cys His Leu 420 425 430 Ile Gln Tyr Gly Glu Pro Phe Phe Ala Arg Tyr Pro Asp Gly Ile Ser 435 440 445 His Phe Ala Gln Glu Cys Phe Pro Glu Gly Leu Ser Ile Asp Arg Thr 450 455 460 Val Arg Phe Glu Asn Asp Gly Thr Met Thr Ser His His Thr Tyr Glu 465 470 475 480 Leu Asp Asp Thr Cys Val Val Ser Arg Ile Thr Val Asn Cys Asp Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Asp Gly Pro Ile Met Arg Asp Gln Leu Val Asp Ile Leu 500 505 510 Pro Asn Glu Thr His Met Phe Pro His Gly Pro Asn Ala Val Arg Gln 515 520 525 Leu Ala Phe Ile Gly Phe Thr Thr Ala Asp Gly Gly Leu Met Met Gly 530 535 540 His Phe Asp Ser Lys Met Thr Phe Asn Gly Ser Arg Ala Ile Glu Ile 545 550 555 560 Pro Gly Pro His Phe Val Thr Ile Ile Thr Lys Gln Met Arg Asp Thr 565 570 575 Ser Asp Lys Arg Asp His Val Cys Gln Arg Glu Val Ala Tyr Ala His 580 585 590 Ser Val Pro Arg Ile Thr Ser Ala Ile Gly Ser Asp Glu Asp Gly Gly 595 600 605 Gly Trp Leu Glu Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Leu 610 615 <210> 10 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-MiniSOG <400> 10 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Pro Met Glu Lys Ser Phe Val Ile Thr Asp Pro Arg Leu Pro Asp Asn 35 40 45 Pro Ile Ile Phe Ala Ser Asp Gly Phe Leu Glu Leu Thr Glu Tyr Ser 50 55 60 Arg Glu Glu Ile Leu Gly Arg Asn Gly Arg Phe Leu Gln Gly Pro Glu 65 70 75 80 Thr Asp Gln Ala Thr Val Gln Lys Ile Arg Asp Ala Ile Arg Asp Gln 85 90 95 Arg Glu Ile Thr Val Gln Leu Ile Asn Tyr Thr Lys Ser Gly Lys Lys 100 105 110 Phe Trp Asn Leu Leu His Leu Gln Pro Met Arg Asp Gln Lys Gly Glu 115 120 125 Leu Gln Tyr Phe Ile Gly Val Gln Leu Asp Gly 130 135 <210> 11 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8-MiniSOG <400> 11 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Pro Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile 35 40 45 Thr Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp 50 55 60 Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val 65 70 75 80 Ile Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val 85 90 95 Val Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Gly Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu 115 120 125 Asp His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro 130 135 140 Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe 145 150 155 160 His Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met 165 170 175 Glu Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile 180 185 190 Glu Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val 195 200 205 Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met 210 215 220 Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys 225 230 235 240 Glu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile 245 250 255 Pro Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn 260 265 270 Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile 275 280 285 Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys 290 295 300 Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu 305 310 315 320 Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val 325 330 335 Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln Glu Phe Gly Gly Gly Met Glu Lys 340 345 350 Ser Phe Val Ile Thr Asp Pro Arg Leu Pro Asp Asn Pro Ile Ile Phe 355 360 365 Ala Ser Asp Gly Phe Leu Glu Leu Thr Glu Tyr Ser Arg Glu Glu Ile 370 375 380 Leu Gly Arg Asn Gly Arg Phe Leu Gln Gly Pro Glu Thr Asp Gln Ala 385 390 395 400 Thr Val Gln Lys Ile Arg Asp Ala Ile Arg Asp Gln Arg Glu Ile Thr 405 410 415 Val Gln Leu Ile Asn Tyr Thr Lys Ser Gly Lys Lys Phe Trp Asn Leu 420 425 430 Leu His Leu Gln Pro Met Arg Asp Gln Lys Gly Glu Leu Gln Tyr Phe 435 440 445 Ile Gly Val Gln Leu Asp Gly 450 455 <210> 12 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8-MiniSOG-Lead Peptide <400> 12 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp 20 25 30 Pro Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile 35 40 45 Thr Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp 50 55 60 Ser Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val 65 70 75 80 Ile Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val 85 90 95 Val Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Gly Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu 115 120 125 Asp His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro 130 135 140 Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe 145 150 155 160 His Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met 165 170 175 Glu Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile 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390 395 400 Thr Val Gln Lys Ile Arg Asp Ala Ile Arg Asp Gln Arg Glu Ile Thr 405 410 415 Val Gln Leu Ile Asn Tyr Thr Lys Ser Gly Lys Lys Phe Trp Asn Leu 420 425 430 Leu His Leu Gln Pro Met Arg Asp Gln Lys Gly Glu Leu Gln Tyr Phe 435 440 445 Ile Gly Val Gln Leu Asp Gly Gly Gly Gly Trp Leu Glu Ala Ala Tyr 450 455 460 Gln Arg Phe Leu 465 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-KillerRed)F <400> 13 cgggatccca tgctgtgctg tatgagaaga ac 32 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-KillerRed)R <400> 14 cccaagcttc taatcctcgt cgctaccgat ggcg 34 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8.6-KillerRed)F <400> 15 cggaattcgg aggaggaatg ctgtgctgta tgagaag 37 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8.6-KillerRed)R <400> 16 cccaagcttc taatcctcgt cgctaccgat g 31 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8.6-KillerRed-Lead peptide)F <400> 17 cggaattcat gggaggagga ctgtgctgta tgagaag 37 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8.6-KillerRed-Lead peptide)R1 <400> 18 cggcctccag ccatcctcct ccatcctc 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8.6-KillerRed-Lead peptide)R2 <400> 19 aagcgctggt aggcggcctc cagccatc 28 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8.6-KillerRed-Lead peptide)R3 <400> 20 cccaagcttc tacaggaagc gctggtaggc g 31 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-MiniSOG)F <400> 21 cgggatccca tggagaagag cttcgtgatc ac 32 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-MiniSOG)R <400> 22 cccaagcttc tagccgtcca gctgcacg 28 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8-MiniSOG)F <400> 23 cggaattcgg aggaggaatg gagaagagct tcgtg 35 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRSET-RLuc8-MiniSOG)R <400> 24 cccaagcttc 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Claims (15)

  1. 암세포 사멸 방법으로서,
    i) 활성산소를 생성하는 제 1단백질;및 암세포의 세포막과 특이적으로 결합하는 제 2단백질;을 포함하는 암세포 사멸 융합 단백질을 준비하는 단계;
    ii) 상기 암세포 사멸 융합 단백질이 암세포의 세포막에 부착되도록 유도하는 단계; 및
    iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 빛을 제공하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 제 1단백질에 의해 생성된 상기 활성산소가 상기 암세포의 세포막에 작용하여 암세포가 사멸되고, 상기 제1단백질은 세포 내도 도입되지 않는 것을 특징으로 하는
    암세포 사멸 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 iii) 상기 제 1단백질이 활성산소를 생성할 수 있도록 빛을 제공하는 단계;는
    외부에서 제공되는 광원을 제공하는 것을 특징으로 하는
    암세포 사멸 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 암세포 사멸 융합 단백질은 제 3단백질을 더 포함할 수 있고, 이 때, 상기 제 3단백질은 세포 내로 도입되지 않는 것을 특징으로 하는
    암세포 사멸 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 제 3단백질이 빛을 생성할 수 있도록 기질을 제공하는 것을 특징으로 하는
    암세포 사멸 방법.
  5. 제 1항 및 제 3항에 있어서,
    제 1단백질 및 제 2단백질을 연결시키는 제 1링커; 또는
    제 2단백질 및 제 3단백질을 연결시키는 제 2링커;
    중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는
    암세포 사멸 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 암세포는 피부암 세포, 유방암 세포, 자궁암, 폐암 세포, 간암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 췌장암 세포, 혈액암 세포 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는
    암세포 사멸 방법.
  7. 암세포의 세포막에 활성산소를 제공하여 상기 암세포를 사멸시키는 융합 단백질로서, 상기 융합단백질은
    활성산소를 생성하는 제 1단백질;및
    암세포의 세포막에 특이적으로 결합하는 제 2단백질;
    을 포함하고,
    상기 제 2단백질은
    암세포의 표면에 발현된 특정 수용체와 특이적으로 결합하는 단백질,
    암세포막을 구성하는 막 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질,
    상기 암세포의 표면에 발현된 특정 수용체 또는 암세포막을 구성하는 막단백질과 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 단백질,
    상기 암세포의 표면에 발현된 특정 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 특정 영역과 결합하는 단백질, 및
    암세포막에 투과성을 가지는 단백질(cancer specific cell-penetrating peptide) 중 선택되는 하나이고,
    상기 활성산소를 생성하는 제 1단백질은 빛에 의해 활성화되어 상기 암세포의 세포막에 활성산소를 제공하는,
    융합 단백질.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 암세포 사멸 융합 단백질은 빛을 제공할 수 있는 제 3단백질을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는
    융합 단백질.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 제 3단백질은 루시퍼라아제(luciferase)서열의 일부 또는 전부를 포함하는 것을 특징으로 하는
    융합 단백질.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 루시퍼라아제는 Photobacteria luciferase, Firefly luciferase, Railroad worm luciferase, Renilla luciferase, Gaussia luciferase, Metridia luciferase, Cypridiana luciferase, Oplophorus luciferase (NanolucTM) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는
    융합 단백질.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 제 1단백질은 KillerRed, MiniSOG, SOPP, FPFB, SuperNova, mKate2, KillerOrange 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는
    암세포 사멸 융합 단백질.
  12. 제 7항 및 8항에 있어서,
    제 1단백질 및 제 2단백질을 연결시키는 제 1링커; 또는
    제 2단백질 및 제 3단백질을 연결시키는 제 2링커;
    중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는
    융합 단백질.
  13. 암세포를 사멸시키는 항암 조성물로서,
    제 7항 또는 제 8항의 융합 단백질을 포함하는 항암 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    제 8항의 융합 단백질 및 기질을 포함하는 항암 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 기질은 루시페린 또는 루시페린 변형체 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는
    항암 조성물.
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