KR20200041305A - 결정 및 결정화의 분석을 위한 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 결정질 상태 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 분석을 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 2차원 상관관계 (2DCOS) 및 공동-분포 분석 (2DCDS) 분석 플롯을 생성하고 분석할 수 있다. 비동기성 플롯은 사건의 순차적 순서를 확립하는데 도움을 줄 수 있다. 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 양의 크로스 피크가 식별될 수 있다. 오토 피크를 참조하여 분자의 결정화 상태에 대한 동인을 나타내는 가장 섭동된 분자의 영역을 신속하게 구별할 수 있다. 어느 관능기 유형 (예를 들어, 영역)이 가장 섭동되는지 (양의 강한 오토 피크)를 규정할 수 있고, 상이한 오토 피크가 가장 큰 강도 변화를 갖기 시작하는 방식을 관찰할 수 있다. 결정화의 상이한 단계에 대한 동기성 플롯에서의 오토 피크의 이러한 변화는 무정형으로부터 결정질 상태로의 과정의 역학에 대한 정보를 제공할 수 있다.
Description
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단백질 응집 현상은 산업적 생물공정 전반에 걸쳐 일반적인 것이다. 단백질은 그의 복잡한 물리-화학적 특성으로 인해 발현, 단리 및 정제에 많은 비용이 든다. 응집은 단백질 분해의 1차적인 형태로 간주되며, 이는 때때로 면역원성, 환자에서의 항-약물 항체 반응 (ADA) 및 효능의 손실로 이어진다. 단백질 응집체의 검출 및 결정은 생물제약 산업 및 다른 과학 연구 영역에서 주요 목적이다. 단백질 응집체의 형성은 이들이 단백질 치료제 (즉, 생물제제 또는 바이오시밀러)의 생산에 상당하게 영향을 미치고, 사실상 생산 수율을 저하시킬 수 있기 때문에 산업적 응용에서 중요하다.
본 기술은 예를 들어 하기에 기재된 다양한 측면에 따라서 예시된다. 본 기술의 측면의 다양한 예가 하기에 기재되어 있다. 이들은 예로서 제공되고, 본 기술을 제한하는 것은 아니다.
단백질 결정학 분야에서, 단백질 결정 검출 영역에 여전히 개선이 필요하다. 결정 스크리닝에서의 자동화 노력에도 불구하고, 결정 스크린의 모니터링시에 단점이 있고 그의 후속적인 검출 병목이 관찰된다. 현재, UV의 사용은 단백질이 그의 서열 내에 트립토판 또는 여러 개의 티로신 잔기를 함유하는 경우에만 유용하다. 가시광 스펙트럼이 상용적으로 사용되어왔지만, 이는 결정이 염인지 단백질인지를 구별할 수 없다. 많은 경우에, 2차 고조파 발생 (SHG)은 결정화 조건에 따라 가양성 및 가음성 둘 다를 갖는다. 게다가, 어떠한 기술도 결정화 과정 도중의 단백질의 심층 평가, 그의 안정성, 분자 상태 또는 그의 식별 중 어떠한 것도 제공하지 못한다.
본 기술의 측면은 단백질, 단백질-표적 및/또는 단백질 약물 복합체의 결정화 과정을 성공적으로 평가하기 위한 브레이크쓰루 접근법(breakthrough approach)을 제공하기 위해 QCL 현미경, 슬라이드 셀 액세서리, 및 맞춤 슬라이드 셀의 사용을 포함한다. 이 방법은 다양한 온도 및 결정화 조건 하에서의 하이퍼스펙트럼 영상 (HSI)의 획득을 수반하며, 이는 회절 패턴 수집 동안 가용 빔-시간의 손실을 수반하게 되는 응집체 또는 염 결정과는 구별되고 용액 중 단백질을 나타내는 것인 안정한 단백질 결정의 선택에 대한 포괄적인 이해를 제공한다. 이 방법은 슬라이드 셀 액세서리, 슬라이드 셀, 및 상세한 분자 분석을 위한 2D IR 및 공동-분포(co-distribution) 알고리즘을 포함하는 분석 기술을 사용함으로써 고처리량 방식으로 샘플의 어레이를 비교 평가할 수 있다.
본 기술의 측면은 소분자, 중합체, 단백질, 펩티드 및/또는 펩토이드를 포함한 분자의 결정 및/또는 결정화를 분석하는 방법을 제공한다.
본 기술의 측면에 따르면, 단백질 샘플을 분광학적으로 분석하고, 스펙트럼 데이터를 분석하여 결정화를 연구한다. 이 방법 및/또는 그의 일부는 완전히 자동화될 수 있고, 결정화 메카니즘의 결정을 위해 사용될 수 있다.
QCLM 및 2D IR 상관 분광분석법의 조합은 다양한 온도 조건 하에서 용액으로부터 분자의 핵형성 및 결정화를 모니터링할 수 있다. 결과는 유리 전이 온도 (T g )와 생성된 결정의 유형뿐만 아니라 그의 성장과의 관계를 이해하는 것을 포함한다. 용액의 시각적 영상, 결정 및 2D IR 상관 분광분석법을 사용하는 QCL IR 스펙트럼 데이터의 분석이 온도의 함수로서 평형 상태의 열역학적 사건을 설명하기 위해 사용될 수 있기 때문에 이 조합은 강력하다. 상 다이어그램이 또한 생성될 수 있다. 하이퍼스펙트럼 영상 (HSI)을 통한 사건의 실시간 모니터링에 의해 결정화의 동역학을 모니터링할 수 있다. 결정의 크기 및 2차원 치수는 저배율 (2.0 mm 이하의 영상 영역을 갖는 3-5 μm 영상 픽셀 크기) 또는 고배율 (650 μm의 영상 영역을 갖는 1.4 μm 영상 픽셀 크기) 대물렌즈를 사용하여 모니터링될 수 있다. 양자 캐스케이드 레이저는 1800-900 cm-1 스펙트럼 영역 내에서 증진된 신호 대 잡음 비 (SNR)를 제공한다. 또한, 맞춤 슬라이드 셀은 온도 제어된 액세서리와 함께 동일한 온도 섭동 조건 하에 샘플의 어레이를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본 기술은 (1) 침전제를 포함한 용매 조건 및 (2) 동일한 결정화 조건 하에서의 상이한 분자들의 비교 연구를 용이하게 한다. 결정화 조건이 수성 매질을 수반하는 경우에, 탈수의 증거는 중간 IR 영역의 지문 영역 내에서 밴드폭의 협소화에 의해 관찰될 수 있고, 이에 의해 용매화 및 탈수의 추가적인 이해가 제공된다. 본 기술은 수성 매질로 제한되지 않으며, 오히려 용매의 혼합물 및 분자 (예를 들어, 소분자)의 결정화에서의 그의 효과를 포함한다. 분자 (예를 들어, 소분자)의 결정화 과정은 관심 분자 및 용매 내의 관능기의 상이한 진동 모드를 모니터링함으로써 연구될 수 있다. 마지막으로, 분자 상호작용이 또한 결정되어 결정 내에서의 이들 분자의 역학을 제공할 수 있다.
본 기술의 측면에 따르면, 본원에 기재된 방법은 단일 성분으로서의 막 단백질, 친수성 단백질, 펩티드 및 펩토이드에 적용되거나, 또는 다른 펩티드 또는 지질 혼합물과의 2원 또는 3원 혼합물에 적용될 수 있다. 혼합물인 경우에, 성분 중 하나는 각각의 성분의 동시 검출을 용이하게 하기 위해 임의로 동위원소 표지될 수 있다.
본 기술의 측면은 샘플 제조의 유연성, 그의 자동화 가능성, 및 제약 단백질 제제에 대한 그의 유용성이 입증된 데이터 분석을 가능하게 한다.
본 기술의 측면에 따르면, 본원에 기재된 방법은 수성 또는 지질을 비롯한 여러 환경에서 임의의 분자, 예를 들어 소분자, 중합체, 단백질, 펩티드 또는 펩토이드 샘플에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 결정화 평가에 정성적으로 및/또는 정량적으로 사용될 수 있다. 데이터 분석을 수행하여 결정화의 메카니즘을 결정하고, 결정의 안정성 및/또는 다른 특성을 결정할 수 있다.
본 기술의 한 측면에 따르면, 이 방법은 결정화 또는 결정의 분석을 위해 투과 푸리에 변환 적외선 ("FT-IR") 및/또는 감쇠 전반사 ("ATR") 분광분석법, 양자 캐스케이드 레이저 현미경검사 ("QCL"), 2차원 상관 분광분석법 ("2DCOS"), 및/또는 2차원 공동-분포 분광분석법 ("2DCDS")을 수반한다. 본 기술의 측면에 따르면, 임의의 적합한 방법 및 장비, 예컨대 FT-IR 분광계, FT-IR 현미경, QCL 분광계 또는 QCL 현미경을 사용하여 스펙트럼 데이터를 수득할 수 있다. 본 기술의 측면들에서, QCL 현미경을 사용하여 스펙트럼 데이터를 수득하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 2DCDS를 사용하여 용액 중의 분포 집단을 확립할 수 있다. 따라서, 이를 사용하여 결정화 이전, 핵형성 도중 및 성장기 도중의 분자 설명을 확립할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 병렬 샘플을 평가할 수 있다. 하나는 결정일 수 있고, 이는 정의상 균일할 것이며, 다른 것은 용액 중 분자의 거동일 수 있다. 분석은 상기 언급된 단계 도중의 분자의 상이한 부분집합에 관한 것일 수 있다.
원하는 경우에, 결정 또는 결정화는 온도 및/또는 다른 섭동(perturbation)을 포함할 수 있는 적용된 섭동의 존재 하에 연구될 수 있다. 수성 용액의 경우, 적용된 섭동은 침전제, pH, 염, 및/또는 완충제 유형을 포함할 수 있다. 유기 용매의 경우, 적용된 섭동은 용매의 극성을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 적용된 섭동은 시간 (동반된 섭동을 갖거나 갖지 않음)을 포함할 수 있다.
동기성 및 비동기성 플롯 둘 다가 생성되고 분석될 수 있다. 예를 들어, 비동기성 플롯은 사건의 순차적 순서를 확립하는데 도움을 줄 수 있다. 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 양의 크로스 피크가 식별될 수 있다. 오토 피크를 참조하여 분자의 결정화 상태에 대한 동인을 나타내는 분자 중 가장 섭동된 영역을 신속하게 구별할 수 있다. 처음에, 분자가 용액 중에 있는 경우, 이는 무정형 상태로 존재하는 것으로 언급된다. 어느 관능기 유형 (예를 들어, 영역)이 가장 섭동되는지 (양의 강한 오토 피크)를 규정할 수 있고, 상이한 오토 피크가 가장 큰 강도 변화를 갖기 시작하는 방식을 관찰할 수 있다. 결정화의 상이한 단계에 대한 동기성 플롯에서의 오토 피크의 이러한 변화는 무정형으로부터 결정질 상태로의 과정의 역학에 대한 정보를 제공할 수 있다.
더욱이, 사건의 상세한 순차적 순서는 용액 또는 용매와 상호작용하는 분자가 주로 분자간 상호작용으로 전이하는 것으로 인한 변화의 관점에서 특징화될 수 있다. 이러한 사건은 분자 재배열을 야기하는 것으로 고려할 수 있고, 이는 크로스 피크를 사용하여 규정될 수 있다.
생물제약 산업에서 제제화는 치료 단백질을 안정화시키는데 효과적으로 사용되어 왔다. 부형제는 이러한 치료 단백질을 안정화시키는데 주요 역할을 해왔다. 열적 스트레스원 하에서의 부형제의 물리화학적 특성은 과거에 잘 기능하여 왔다. 본 기술은 온도에 의해 유도된 트레할로스 결정화에 의해 본원에서 입증된 바와 같이 화학적 영상화 및 분자 설명의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 예에서, 온도 조건에 의해 유도된 트레할로스의 결정화 과정은 수성 용액과의 수소 결합 상호작용의 손실 (탈수)을 포함하며, 동시에 결정 내의 트레할로스 분자 사이의 분자간 수소 결합을 증가시킨다. 중간 IR 영역의 지문 영역 내의 피크 또는 밴드 협소화는 트레할로스의 탈수로 인한 스펙트럼 특색의 극적인 변화이다. 그러나, 다른 탄수화물, 예컨대 수크로스 또는 아라비노스와 비교할 때, 증가된 온도에 의해 유도된 결정화는 일어나지 않는다.
QCLM을 사용한 실시간 영상 획득 및 2D IR 상관 분광분석법의 조합은 결정화의 현상을 추가로 이해하기 위해 사용될 수 있는 광범위한 양의 증거를 제공한다.
본 기술은 유기 분자의 평가에 제한되지 않고, 오히려 제약 응용에서 부형제로서 상용적으로 사용되는 금속-유기 종 및 생체분자를 포함할 수 있다. 본 기술의 실시양태는 핵형성 사건을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 기술의 실시양태는 결정 성장을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본 기술의 실시양태는 샘플과 그의 환경과의 감소된 수소 결합 상호작용을 검출함으로써 결정화로 인한 탈수 사건을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본 기술의 실시양태는 2D IR 상관 분광분석법을 사용함으로써 결정 내의 분자 유연성의 영역을 설명하는 샘플 내의 진동 모드를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본 기술의 추가 특색 및 이점은 하기 설명에서 제시될 것이고, 부분적으로 설명으로부터 명백할 것이거나 또는 본 기술의 실시에 의해 학습될 수 있다. 본 기술의 이점은 기록된 설명 및 그 청구범위 뿐만 아니라 첨부 도면에 구체적으로 지적된 구조에 의해 실현되고 얻어질 것이다.
상기 일반적 설명 및 이하의 상세한 설명 둘 모두는 예시적이고 설명적이며, 청구된 바와 같은 본 기술의 추가의 설명을 제공하려는 의도임을 이해하여야 한다.
본 기술의 추가의 이해를 제공하기 위해 포함되어 있고 본원에 포함되어 그 부분을 구성하는 첨부 도면은 본 기술의 측면을 예시하고 있고, 상세한 설명과 함께, 본 기술의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c는 본 기술의 일부 측면에 따른 단백질 응집을 결정하기 위해 사용되는 직교 분석 기술의 결과를 나타낸다. 도 1a는 크기 배제 크로마토그래피 ("SEC")의 결과를 나타낸다. 도 1b는 시차 주사 열량측정법 ("DSC")의 결과를 나타낸다. 도 1c는 동적 광 산란 ("DLS")의 결과를 나타낸다.
도 2는 본 기술의 일부 측면에 따른 방법의 상이한 단계를 나타내는 흐름도를 나타낸다.
도 3은 다단계 분석의 결과를 나타낸다.
도 4는 본 기술의 일부 측면에 따른 예시적인 컴퓨팅 시스템의 다이어그램을 나타낸다.
도 5는 본 기술의 일부 측면에 따른 예시적인 방법의 작동을 나타내는 흐름도를 나타낸다.
도 6은 본 기술의 일부 측면에 따른 예시적인 방법의 작동을 나타내는 흐름도를 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 다단계 분석의 결과를 나타낸다.
도 8a는 개발가능성 평가를 위한 ADC 단편 후보 아미노산 서열의 비교를 나타낸다. ADC 단편 0 ("ADC0"; 서열식별번호(SEQ ID NO): 1)은 N-말단 단부에 추가 7개의 아미노산 (APELLGG; 서열식별번호: 2)을 함유하는 전장 단편이다. ADC 단편 1 ("ADC1"; 서열식별번호: 3)은 N-말단 단부에서 말단절단되고, 상부 단편과 유사하게 1개의 디술피드 가교를 함유한다. ADC 단편 2 ("ADC2"; 서열식별번호: 4)는 ADC 단편 1과 비교할 때, 2개의 점 돌연변이 (L5C/K97C)를 갖고, 따라서 추가의 디술피드-가교가 부가되어 ADC 단편 2가 안정화된다.
도 8b는 주로 β-시트, β-턴 및 힌지뿐만 아니라 ADC 단편 내의 2개의 짧은 헬릭스로 구성된 리차드슨 리본 모델을 나타낸다. N-말단 단부, C-말단 단부, 위치 25, 62 및 71에서의 3개의 Arg, 위치 27 및 61에서의 이웃하는 Pro 잔기, 및 디술피드 결합 Cys31 및 Cys91이 나타나 있다. 이들 3개의 아르기닌 잔기는 ADC에 대한 내부 프로브로서 작용한다.
도 9a 및 도 9b는 응집체의 크기 및 정체를 나타낸다. 도 9a는 ADC0 및 ADC1에 대한 QCL 적외선 스펙트럼 오버레이를 나타낸다. 도 9b는 각각 24 및 28℃에 대한 플롯을 나타낸다. ADC 단편은 모두 완전히 H→D 교환되었다. 또한, 24℃에서의 아미드 I' 밴드 최대값은 응집된 ADC1에 상응하는 한편, 28℃에서의 최대값은 D2O 용액 중 ADC1에 상응한다.
도 10은 공동-분포 분석의 결과를 나타낸다. 응집 메카니즘은 아르기닌 잔기를 수반하고 단백질 내의 역평행 β-시트 및 β-턴을 선택한다. 따라서, 이러한 분석은 응집을 야기하는 단백질의 영역을 제공한다.
도 11a는 QCL 현미경 영상을 나타내고, 도 11b는 15% 수크로스 중 ADC 단편 2의 연관된 QCL 스펙트럼을 나타낸다. 이는 부형제 및 단백질 후보 둘 다의 존재 및 양을 검증하기 위해 사용될 수 있다.
도 12a, 도 12b 및 도 12c는 26℃에서 부형제로서 NaCl 및 다양한 양의 수크로스 (도 12a: 15% 수크로스, 도 12b: 30% 수크로스, 및 도 12c: 60% 수크로스)의 존재 하에 pH 6.6의 HEPES 중 ADC2에 대해 1400-1800 cm-1의 스펙트럼 영역 내에서 수득된 QCL 스펙트럼 결과를 나타낸다. 이들 결과는 정량적 분석이 수행될 수 있는 정도를 입증하여, 다른 경우에는 수득하기 어려운 중요한 정보를 제공한다. 원하는 부형제 조건 하에 단백질의 안정성 및 입체형태를 확인할 수 있는 동시에, 또한 용액 중의 관심 단백질 및 그의 부형제의 농도를 결정할 수 있다. 게다가, 이들 조건 하에 ADC2에 대해 응집체 종은 관찰되지 않았다.
도 13은 다양한 조건 하에서 QCL 현미경을 사용한 43개 실험에 대해 수행된 정규 분포 분석의 결과를 나타낸다. QbD 실험 설정은 324개의 스펙트럼 데이터를 분석하여 다양한 양의 NaCl, 수크로스 및 다양한 비의 2종의 부형제 (즉, NaCl & 수크로스)의 존재 하에 ADC 단편 2의 평가를 나타내도록 하였다.
도 14는 제2 최적 피트 모델 (AIC 모델)을 사용한 ADC2 QCL 현미경검사 스펙트럼 데이터에 대한 예측 프로파일을 포함하는, DOE 단계적 모델 피팅의 결과를 나타낸다.
도 15는 최적 피트 모델 (BIC 모델)을 사용하는 ADC2 QCL 현미경검사 스펙트럼 데이터에 대한 예측 프로파일을 포함하는, DOE 단계적 모델 피팅의 결과를 나타낸다. 결과는 실온 조건 근처에서 ADC2에 대한 최상의 부형제로서 18.5% 수크로스를 제안한다.
도 16a 및 도 16b는 26-28℃의 온도 범위 내에서 HEPES 및 15% 수크로스의 존재 하에 ADC 단편 2에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 16a: 동기성, 도 16b: 비동기성)을 나타낸다. 아미드 I' 및 측쇄 밴드가 1720-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에서 조사되었다. 동기성 플롯 (도 16a) ADC2는 주로 β-시트 및 β-턴 2차 구조를 가지며 응집체 종이 존재하지 않는 것으로 관찰되었다.
도 17은 단백질을 안정화시키는데 있어서 수크로스의 역할을 확인하기 위해 사용된 26℃의 온도 및 pH 6.6에서의 50 mM HEPES, 150mM NaCl, 3 mM KCl 및 15% 수크로스 중 ADC 단편 2에 대한 사건의 순차적 순서를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 26-28 ℃의 온도 범위에서 부형제로서 15% 수크로스 및 HEPES 중 ADC2에 대한 2D IR 공동-분포 분석 플롯 (도 18a: 동기성, 도 18b: 비동기성)을 나타낸다. π-헬릭스 및 β-턴 (힌지 루프)과 함께 측쇄가 저온에서 섭동되었다.
도 19는 D2O 중 ADC 단편 2에 대한 대표적 곡선-피트 분석을 나타내고, 여기서 2D IR 상관관계 분석으로부터 생성된 밴드 할당을 사용하고, 80.4 +/- 1.1%의 단백질이 β-구조를 포함하는 것으로 결정되었다 (또한 표 2 및 3 참조).
도 20a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1400 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 아미드 I, II 및 III 밴드를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 20b 및 도 20c는 도 16a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 20b: 동기성, 도 20c: 비동기성)을 나타낸다.
도 21a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1500 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 아미드 I 및 II 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 21b 및 도 21c는 도 21a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 21b: 동기성, 도 21c: 비동기성)을 나타낸다.
도 22는 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에 H2O 중 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 사건의 순차적 순서를 도시한다.
도 23은 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에 H2O 중 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다.
도 24a, 도 24b, 도 24c, 및 도 24d는 각각 도 21a, 도 21b, 도 21c 및 도 22의 플롯의 재현을 나타내고, 동기성 플롯 2D IR 상관관계 분석 플롯의 오토 피크와 교차하는 수직 파선이 추가되어 있다 (도 24b).
도 25a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1500 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 40 mg/mL의 BSA에 대한 아미드 I 및 II 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 25b 및 도 25c는 도 25a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 25b: 동기성, 도 25c: 비동기성)을 나타낸다.
도 26은 열 응력 (24-60℃) 하에서 H2O 중 BSA 40 mg/mL에 대한 사건의 순차적 순서를 나타낸다.
도 27은 24-60℃의 온도 범위 및 1750-1380 cm-1의 스펙트럼 영역 내의 열 응력 하에 H2O 중 BSA 40 mg/mL에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다.
도 28a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에서 NIST mAb/BSA (1:2, 몰 비율) 혼합물에 대한 아미드 I 및 II 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 28b 및 도 28c는 도 28a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 28b: 동기성, 도 28c: 비동기성)을 나타낸다.
도 29a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에서 600 mg/mL의 리소자임에 대한 아미드 I 및 II 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 29b 및 도 29c는 도 29a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 29b: 동기성, 도 29c: 비동기성)을 나타낸다.
도 30은 열 응력 (24-60℃) 하에서 H2O 중 600 mg/mL의 리소자임에 대한 사건의 순차적 순서를 나타낸다.
도 31은 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 및 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역 하에서 H2O 중 600 mg/mL의 리소자임에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다.
도 32a는 트레할로스의 모델을 나타낸다.
도 32b, 도 32c, 도 32d 및 도 32e는 QCLM 저배율 영상을 나타내고, 도 32f는 트레할로스에 대한 동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 나타낸다.
도 33a, 도 33b, 도 33d 및 도 33e는 QCLM 저배율 영상을 나타내고, 도 33c 및 도 33f는 트레할로스에 대한 핵형성 및 결정 성장 사건에 대한 동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 나타낸다.
도 34a는 0.1M 트리스 pH 8.5, 0.5% w/v PEG 5000, 0.8M 타르타르산나트륨칼륨 4수화물의 용액의 분취물 (1 uL)에 대한, 30-38℃의 범위 내에서 2℃ 온도 간격으로 증가하는 온도의 함수로서 단백질 복합체의 하이퍼스펙트럼 영상의 모음을 나타낸다.
도 34b는 도 34a의 샘플에 대한 30-38℃의 범위의 온도 범위 내에서 2℃ 온도 간격으로 획득된 1750-1480 cm-1의 스펙트럼 영역 내의 차트가 오버레이된 QCL IR 스펙트럼을 도시한다.
도 34c 및 도 34d는 도 34a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 34c: 동기성, 도 34d: 비동기성)을 나타낸다.
도 34e는 단백질-펩티드 복합체의 집단 내의 열 응력 하에서의 결정화 동안 주요 과정으로서의 응집 사건을 정리한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다:α-헬릭스 (1655 cm-1), β-시트 (1637 cm-1), 응집 (1611 cm-1), Arg (1578.5 cm-1).
도 35a는 0.1M HEPES pH 7.5, 10% w/v PEG 6000, 5% v/v 2-메틸-2,4-펜탄디올의 결정질 형태에 대하여 30-38℃의 범위 내에서 2℃ 온도 간격으로 증가하는 온도의 함수로서의 순수 재조합 단백질의 하이퍼스펙트럼 영상의 모음을 나타낸다.
도 35b는 도 34a의 샘플의 결정질 형태에 대하여 30-38℃의 범위의 온도 범위 내에서 2℃ 온도 간격으로 획득된 1690-1600 cm-1의 스펙트럼 영역에서의 차트가 오버레이된 QCL IR 스펙트럼을 도시한다.
도 35c 및 도 35d는 도 34a의 샘플의 결정질 형태에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 35c: 동기성, 도 35d: 비동기성)을 나타낸다.
도 35e는 열 응력 사건 및 결정화 동안의 순수 재조합 단백질의 대표적인 분포 집단을 정리한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타내며, 주로 나선 영역 (1655.0 cm-1) 내 다음 측쇄 모드를 포함한다: His (1606.0 cm-1), Arg (1581.3 cm-1), Glu- (1540.8 cm-1), Tyr (1517.0 cm-1), Trp (1461 cm-1).
도 35f는 용액 중의 도 34a의 샘플에 대한 비동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 나타낸다.
도 35g는 도 34a의 샘플의 결정질 형태에 대한 비동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 도시한다.
도 36은 컴퓨팅 시스템의 예시적인 다이어그램을 나타낸다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c는 본 기술의 일부 측면에 따른 단백질 응집을 결정하기 위해 사용되는 직교 분석 기술의 결과를 나타낸다. 도 1a는 크기 배제 크로마토그래피 ("SEC")의 결과를 나타낸다. 도 1b는 시차 주사 열량측정법 ("DSC")의 결과를 나타낸다. 도 1c는 동적 광 산란 ("DLS")의 결과를 나타낸다.
도 2는 본 기술의 일부 측면에 따른 방법의 상이한 단계를 나타내는 흐름도를 나타낸다.
도 3은 다단계 분석의 결과를 나타낸다.
도 4는 본 기술의 일부 측면에 따른 예시적인 컴퓨팅 시스템의 다이어그램을 나타낸다.
도 5는 본 기술의 일부 측면에 따른 예시적인 방법의 작동을 나타내는 흐름도를 나타낸다.
도 6은 본 기술의 일부 측면에 따른 예시적인 방법의 작동을 나타내는 흐름도를 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 다단계 분석의 결과를 나타낸다.
도 8a는 개발가능성 평가를 위한 ADC 단편 후보 아미노산 서열의 비교를 나타낸다. ADC 단편 0 ("ADC0"; 서열식별번호(SEQ ID NO): 1)은 N-말단 단부에 추가 7개의 아미노산 (APELLGG; 서열식별번호: 2)을 함유하는 전장 단편이다. ADC 단편 1 ("ADC1"; 서열식별번호: 3)은 N-말단 단부에서 말단절단되고, 상부 단편과 유사하게 1개의 디술피드 가교를 함유한다. ADC 단편 2 ("ADC2"; 서열식별번호: 4)는 ADC 단편 1과 비교할 때, 2개의 점 돌연변이 (L5C/K97C)를 갖고, 따라서 추가의 디술피드-가교가 부가되어 ADC 단편 2가 안정화된다.
도 8b는 주로 β-시트, β-턴 및 힌지뿐만 아니라 ADC 단편 내의 2개의 짧은 헬릭스로 구성된 리차드슨 리본 모델을 나타낸다. N-말단 단부, C-말단 단부, 위치 25, 62 및 71에서의 3개의 Arg, 위치 27 및 61에서의 이웃하는 Pro 잔기, 및 디술피드 결합 Cys31 및 Cys91이 나타나 있다. 이들 3개의 아르기닌 잔기는 ADC에 대한 내부 프로브로서 작용한다.
도 9a 및 도 9b는 응집체의 크기 및 정체를 나타낸다. 도 9a는 ADC0 및 ADC1에 대한 QCL 적외선 스펙트럼 오버레이를 나타낸다. 도 9b는 각각 24 및 28℃에 대한 플롯을 나타낸다. ADC 단편은 모두 완전히 H→D 교환되었다. 또한, 24℃에서의 아미드 I' 밴드 최대값은 응집된 ADC1에 상응하는 한편, 28℃에서의 최대값은 D2O 용액 중 ADC1에 상응한다.
도 10은 공동-분포 분석의 결과를 나타낸다. 응집 메카니즘은 아르기닌 잔기를 수반하고 단백질 내의 역평행 β-시트 및 β-턴을 선택한다. 따라서, 이러한 분석은 응집을 야기하는 단백질의 영역을 제공한다.
도 11a는 QCL 현미경 영상을 나타내고, 도 11b는 15% 수크로스 중 ADC 단편 2의 연관된 QCL 스펙트럼을 나타낸다. 이는 부형제 및 단백질 후보 둘 다의 존재 및 양을 검증하기 위해 사용될 수 있다.
도 12a, 도 12b 및 도 12c는 26℃에서 부형제로서 NaCl 및 다양한 양의 수크로스 (도 12a: 15% 수크로스, 도 12b: 30% 수크로스, 및 도 12c: 60% 수크로스)의 존재 하에 pH 6.6의 HEPES 중 ADC2에 대해 1400-1800 cm-1의 스펙트럼 영역 내에서 수득된 QCL 스펙트럼 결과를 나타낸다. 이들 결과는 정량적 분석이 수행될 수 있는 정도를 입증하여, 다른 경우에는 수득하기 어려운 중요한 정보를 제공한다. 원하는 부형제 조건 하에 단백질의 안정성 및 입체형태를 확인할 수 있는 동시에, 또한 용액 중의 관심 단백질 및 그의 부형제의 농도를 결정할 수 있다. 게다가, 이들 조건 하에 ADC2에 대해 응집체 종은 관찰되지 않았다.
도 13은 다양한 조건 하에서 QCL 현미경을 사용한 43개 실험에 대해 수행된 정규 분포 분석의 결과를 나타낸다. QbD 실험 설정은 324개의 스펙트럼 데이터를 분석하여 다양한 양의 NaCl, 수크로스 및 다양한 비의 2종의 부형제 (즉, NaCl & 수크로스)의 존재 하에 ADC 단편 2의 평가를 나타내도록 하였다.
도 14는 제2 최적 피트 모델 (AIC 모델)을 사용한 ADC2 QCL 현미경검사 스펙트럼 데이터에 대한 예측 프로파일을 포함하는, DOE 단계적 모델 피팅의 결과를 나타낸다.
도 15는 최적 피트 모델 (BIC 모델)을 사용하는 ADC2 QCL 현미경검사 스펙트럼 데이터에 대한 예측 프로파일을 포함하는, DOE 단계적 모델 피팅의 결과를 나타낸다. 결과는 실온 조건 근처에서 ADC2에 대한 최상의 부형제로서 18.5% 수크로스를 제안한다.
도 16a 및 도 16b는 26-28℃의 온도 범위 내에서 HEPES 및 15% 수크로스의 존재 하에 ADC 단편 2에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 16a: 동기성, 도 16b: 비동기성)을 나타낸다. 아미드 I' 및 측쇄 밴드가 1720-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에서 조사되었다. 동기성 플롯 (도 16a) ADC2는 주로 β-시트 및 β-턴 2차 구조를 가지며 응집체 종이 존재하지 않는 것으로 관찰되었다.
도 17은 단백질을 안정화시키는데 있어서 수크로스의 역할을 확인하기 위해 사용된 26℃의 온도 및 pH 6.6에서의 50 mM HEPES, 150mM NaCl, 3 mM KCl 및 15% 수크로스 중 ADC 단편 2에 대한 사건의 순차적 순서를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 26-28 ℃의 온도 범위에서 부형제로서 15% 수크로스 및 HEPES 중 ADC2에 대한 2D IR 공동-분포 분석 플롯 (도 18a: 동기성, 도 18b: 비동기성)을 나타낸다. π-헬릭스 및 β-턴 (힌지 루프)과 함께 측쇄가 저온에서 섭동되었다.
도 19는 D2O 중 ADC 단편 2에 대한 대표적 곡선-피트 분석을 나타내고, 여기서 2D IR 상관관계 분석으로부터 생성된 밴드 할당을 사용하고, 80.4 +/- 1.1%의 단백질이 β-구조를 포함하는 것으로 결정되었다 (또한 표 2 및 3 참조).
도 20a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1400 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 아미드 I, II 및 III 밴드를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 20b 및 도 20c는 도 16a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 20b: 동기성, 도 20c: 비동기성)을 나타낸다.
도 21a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1500 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 아미드 I 및 II 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 21b 및 도 21c는 도 21a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 21b: 동기성, 도 21c: 비동기성)을 나타낸다.
도 22는 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에 H2O 중 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 사건의 순차적 순서를 도시한다.
도 23은 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에 H2O 중 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다.
도 24a, 도 24b, 도 24c, 및 도 24d는 각각 도 21a, 도 21b, 도 21c 및 도 22의 플롯의 재현을 나타내고, 동기성 플롯 2D IR 상관관계 분석 플롯의 오토 피크와 교차하는 수직 파선이 추가되어 있다 (도 24b).
도 25a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1500 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 40 mg/mL의 BSA에 대한 아미드 I 및 II 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 25b 및 도 25c는 도 25a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 25b: 동기성, 도 25c: 비동기성)을 나타낸다.
도 26은 열 응력 (24-60℃) 하에서 H2O 중 BSA 40 mg/mL에 대한 사건의 순차적 순서를 나타낸다.
도 27은 24-60℃의 온도 범위 및 1750-1380 cm-1의 스펙트럼 영역 내의 열 응력 하에 H2O 중 BSA 40 mg/mL에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다.
도 28a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에서 NIST mAb/BSA (1:2, 몰 비율) 혼합물에 대한 아미드 I 및 II 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 28b 및 도 28c는 도 28a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 28b: 동기성, 도 28c: 비동기성)을 나타낸다.
도 29a는 H2O 중에서 24-60℃의 온도 범위 내에서 획득된 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에서 600 mg/mL의 리소자임에 대한 아미드 I 및 II 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다.
도 29b 및 도 29c는 도 29a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 29b: 동기성, 도 29c: 비동기성)을 나타낸다.
도 30은 열 응력 (24-60℃) 하에서 H2O 중 600 mg/mL의 리소자임에 대한 사건의 순차적 순서를 나타낸다.
도 31은 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 및 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역 하에서 H2O 중 600 mg/mL의 리소자임에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다.
도 32a는 트레할로스의 모델을 나타낸다.
도 32b, 도 32c, 도 32d 및 도 32e는 QCLM 저배율 영상을 나타내고, 도 32f는 트레할로스에 대한 동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 나타낸다.
도 33a, 도 33b, 도 33d 및 도 33e는 QCLM 저배율 영상을 나타내고, 도 33c 및 도 33f는 트레할로스에 대한 핵형성 및 결정 성장 사건에 대한 동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 나타낸다.
도 34a는 0.1M 트리스 pH 8.5, 0.5% w/v PEG 5000, 0.8M 타르타르산나트륨칼륨 4수화물의 용액의 분취물 (1 uL)에 대한, 30-38℃의 범위 내에서 2℃ 온도 간격으로 증가하는 온도의 함수로서 단백질 복합체의 하이퍼스펙트럼 영상의 모음을 나타낸다.
도 34b는 도 34a의 샘플에 대한 30-38℃의 범위의 온도 범위 내에서 2℃ 온도 간격으로 획득된 1750-1480 cm-1의 스펙트럼 영역 내의 차트가 오버레이된 QCL IR 스펙트럼을 도시한다.
도 34c 및 도 34d는 도 34a의 샘플에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 34c: 동기성, 도 34d: 비동기성)을 나타낸다.
도 34e는 단백질-펩티드 복합체의 집단 내의 열 응력 하에서의 결정화 동안 주요 과정으로서의 응집 사건을 정리한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다:α-헬릭스 (1655 cm-1), β-시트 (1637 cm-1), 응집 (1611 cm-1), Arg (1578.5 cm-1).
도 35a는 0.1M HEPES pH 7.5, 10% w/v PEG 6000, 5% v/v 2-메틸-2,4-펜탄디올의 결정질 형태에 대하여 30-38℃의 범위 내에서 2℃ 온도 간격으로 증가하는 온도의 함수로서의 순수 재조합 단백질의 하이퍼스펙트럼 영상의 모음을 나타낸다.
도 35b는 도 34a의 샘플의 결정질 형태에 대하여 30-38℃의 범위의 온도 범위 내에서 2℃ 온도 간격으로 획득된 1690-1600 cm-1의 스펙트럼 영역에서의 차트가 오버레이된 QCL IR 스펙트럼을 도시한다.
도 35c 및 도 35d는 도 34a의 샘플의 결정질 형태에 대한 2D IR 상관관계 분석 플롯 (도 35c: 동기성, 도 35d: 비동기성)을 나타낸다.
도 35e는 열 응력 사건 및 결정화 동안의 순수 재조합 단백질의 대표적인 분포 집단을 정리한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타내며, 주로 나선 영역 (1655.0 cm-1) 내 다음 측쇄 모드를 포함한다: His (1606.0 cm-1), Arg (1581.3 cm-1), Glu- (1540.8 cm-1), Tyr (1517.0 cm-1), Trp (1461 cm-1).
도 35f는 용액 중의 도 34a의 샘플에 대한 비동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 나타낸다.
도 35g는 도 34a의 샘플의 결정질 형태에 대한 비동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 도시한다.
도 36은 컴퓨팅 시스템의 예시적인 다이어그램을 나타낸다.
이하의 상세한 설명에서, 특정 세부사항이 본 기술의 이해를 제공하기 위해 기재된다. 그러나, 본 기술이 이들 특정 세부사항의 일부 없이 실시될 수도 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 다른 경우들에서는, 본 기술을 모호하게 하지 않도록 하기 위해, 잘 알려진 구조 및 기술은 상세하게 도시되지 않았다.
단백질은 선형 쇄로 배열되고 인접한 아미노산 잔기의 카르복실 기와 아미노 기 사이의 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어진 큰 유기 화합물이다. 대부분의 단백질은 독특한 3-차원 구조로 폴딩된다. 단백질이 자연적으로 폴딩되는 형상이 그의 천연 상태인 것으로 공지되어 있다. 많은 단백질이 보조없이, 단순히 그의 아미노산의 화학적 특성을 통해 폴딩될 수 있지만, 다른 단백질은 그의 천연 상태로 폴딩되기 위해 분자 샤페론의 도움이 필요하다. 단백질의 구조에는 4가지 별개의 측면이 존재한다:
·1차 구조: 아미노산 서열.
·2차 구조: 수소 결합에 의해 안정화된 규칙적으로 반복하는 국부 구조. 2차 구조가 국부적이기 때문에, 상이한 2차 구조의 많은 영역이 동일한 단백질 분자에 존재할 수 있다.
·3차 구조: 단일 단백질 분자의 전체 형상; 2차 구조들의 서로에 대한 공간적 관계
·4차 구조: 보다 큰 어셈블리 또는 단백질 복합체의 일부로서 기능하는, 상용적으로 이와 관련하여 단백질 서브유닛으로 불리는, 하나 초과의 단백질 분자의 상호작용으로부터 유도되는 형상 또는 구조.
단백질은 완전히 강성인 분자는 아니다. 이러한 구조 수준 이외에도, 단백질은 자신의 생물학적 기능을 수행하면서 여러 관련 구조 사이에서 변화할 수 있다. 이러한 기능적 재배열과 관련하여, 이들 3차 또는 4차 구조는 통상적으로 "입체형태"로 지칭되고, 이들 사이의 전이는 입체형태적 변화로 지칭된다.
단백질 응집은 산업적 생물공정 전반에 걸쳐 일반적인 현상으로 간주되는 미스폴딩된 강성 단백질 그룹화를 특징으로 한다. 응집은 1차적인 단백질 분해 형태로 간주되며, 이는 종종 단백질의 면역원성 및 생물활성의 손실을 초래한다. 단백질 응집은 비정상적 질환 상태, 예컨대 알츠하이머 및 파킨슨 질환에서 단백질 약물의 생산, 안정성 및 전달에 이르는 범위의 매우 다양한 생의학적 상황에서 매우 중요하다. 사실상 무정형 또는 원섬유일 수 있는 단백질 응집은 2가지 상이한 메카니즘 중 하나에 의해 시작될 수 있다: A) 부분적으로 폴딩된 중간체가 응집을 위한 직접적인 전구체인 자기-응집, 및 B) 한 단백질의 응집이 다른 단백질에 의해 매개되는 이종-응집.
단백질 응집체의 형성은 산업적 응용에서 중요한데, 이는 단백질-기반의 약물 또는 시판 효소의 생산에 큰 영향을 줄 수 있어 생산 수율을 크게 저하시키기 때문이다. 생물제제 및 바이오시밀러 산업은 단백질 치료제를 포함하는 복합 약물의 연구, 개발, 및 제조에 관련된다. 연구 및 개발 효율은 바람직하지 않게 낮을 수 있고, 이는 단백질 치료제의 높은 소모율로 인해 약물 개발 비용을 증가시킨다. 단백질 치료제 개발의 비용은 후기 단계에서의 실패시 상당하게 영향을 받는다. 연구 및 개발 비용을 낮추는 한 가지 방법은 연구 및 개발 단계에서 조기에 단백질 치료제 후보의 일련의 평가를 수행하는 것이다. 치료 단백질의 특징화를 연구 및 개발 단계에서 조기에 다양한 제제화 조건 및 스트레스원 하에 수행함으로써, 치료제 후보의 예측 프로파일을 생성하여 단백질 응집의 위험성을 평가한다. 이러한 접근법은 개발가능성 평가로서 정의되어 있다. 이러한 평가는 추가 개발을 위한 단백질 치료제 후보를 선택하는 것과 같은 의사 결정에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다. 단백질 응집이 일어나는 경우, 단백질 치료제는 전형적으로 감소된 효능을 가지며, 면역 반응을 도출할 수 있다. 심한 경우에, 이러한 면역 반응은 치명적일 수 있다.
혼합물 중 응집체를 결정하기 위한 여러 방법이 과거에 제안되었다. 이러한 이전 방법은 특정한 단백질 또는 펩티드에 대해 설계되고/거나 외래 프로브의 첨가를 필요로 하고, 따라서 생물학적 분자의 클래스에 대한 보편적인 적용을 수반하는 일반화된 방법을 나타내지 않는다. 프로브의 도움을 받는 UV-Vis 분광분석법과 같은 여러 분광학적 기술이 사용되어 왔으며, 형광 분광분석법도 내부 또는 외인성 프로브를 또한 사용한다. 유사하게, 근 UV 원형 이색성 ("CD")이 사용되었지만, 이는 바로 부근에 있는 응집체의 검출에 제한되고, 밴드 확장의 출현에 의해 단백질 응집을 검출하는데 핵 자기 공명 ("NMR")이 사용될 수 있다. 또한, 관심 단백질이 충분히 큰 몰 흡광 계수를 갖는다면, 올리고머화의 정도를 식별하는데 침강 분석을 사용할 수도 있다. 크로마토그래피 기술, 예컨대 크기 배제는 또한 단백질 응집체의 존재를 검출할 수 있었다. 그러나, 이러한 기술은 외인성 프로브의 사용을 필요로 할 수 있고, 다량의 단백질은 시간 소모적이며, 어느 것도 응집의 메카니즘을 결정할 수 없다.
단백질 응집의 문제는 복잡하고, 빈번하게 구별하기 어려운 여러 상이한 화학적 및/또는 연산적 과정을 수반한다. 응집은 응력 유도될 수 있고, 교반, 산화, 탈아미노화 및 온도 변화와 같은 물리적 또는 화학적 변화를 수반한다. 심지어 pH, 염 조건, 단백질 농도 또는 제제화 조건에서의 약간의 변화도 단백질 응집을 유도할 수 있다. 또한, 응집은 생산 수율 저하, 단백질 치료제의 효능의 손실, 및 면역원성 위험과 관련한 안전성 우려를 초래한다. 응집을 평가하기 위해 현재 이용가능한 기술은 응집 과정에 수반되는 모든 인자, 예컨대 응집의 크기, 정체, 메카니즘 및 정도, 및 단백질 치료제의 용액 중 안정성을 다루지는 못한다. 응집체 또는 미립자의 크기를 다루기 위한 여러 기술이 개발되었지만, 이들은 정체를 결정하지 못한다. 다른 기술은 응집체의 크기 및 정체를 결정할 수 있지만, 응집의 정도를 결정할 수 없다. 단백질에 존재하는 아미노산 측쇄는 단백질의 안정성에 중요한 기여자이다. 그러나, 측쇄에서 관찰된 약한 화학적 상호작용과 단백질의 2차 구조의 안정성 사이의 관계는 고처리량 공정에서 상용 벤치 기기를 사용하여 결정할 수 없다.
단백질 치료제의 안정성은 또한 약물 개발에 중요하고, 단순히 단백질의 열 전이 온도를 식별하는 것으로는 완전히 특징화될 수 없다. 단백질 치료제의 안정성을 이해하고 다루기 위해 보다 큰 수준의 이해가 필요하다. 예를 들어, 1) 관심 단백질 내의 도메인의 상대적 안정성, 2) 아미노산 측쇄가 도메인의 안정성에 기여하는 방식, 3) 아미노산 측쇄가 응집 메카니즘에 관여하는지의 여부, 및 4) 부형제가 단백질 치료제의 특정 도메인 내의 중요한 영역 내에서 약한 상호작용 (예를 들어, 아미노산 측쇄 내의 약한 상호작용)을 안정화시킬 수 있는지를 이해하는 것이 유익할 것이다. 단백질 응집 메카니즘을 결정하는데 중요한 파라미터를 이해하는 데에 격차가 존재한다.
현재 상업적으로 입수가능한 기술들을 직교적으로 사용하는 경우, 이용가능한 기술의 민감성에서의 차이가 문제이다. 일반적으로, 이러한 기술은 단백질 치료제의 크기, 순도 및 안정성을 결정하는 것에 초점을 맞추며, 로트-대-로트 일관성을 달성하기 위해 제제 중 단백질 응집체 또는 미립자의 존재 또는 부재를 평가한다.
단백질 치료제의 개발가능성을 더 잘 평가하기 위해, 또한 생성물 완전성, 효능 및 안전성을 유지하고 보증하는데 필요한 비교가능성 평가를 위해 사용될 수 있는 기술이 필요하다. 이러한 과정은 미국 식품의약품국 ("FDA") 센터 약물 평가 ("CDER") 부서 및 다른 관련 규제 기관에 의해 생성물 완전성, 효능 및 안전성을 보증하는데 충분한 것으로 승인받을 필요가 있을 것이다.
생물제약 산업에서 단백질 응집 문제를 해결하는 것은, (1) R&D 비용 감소, (2) 증가된 생성물 수율 및 이에 따른 그의 공급 및 수요 보장, (3) 철회 위험의 저하, (4) 증가된 FDA 승인율, (5) 개발 기간 감소 및 (6) 결과적인 그의 가치 증가로 이어질 것이다. 또한, 특히 암 및 만성 질환 예컨대 류마티스 관절염, 크론병 및 신경변성 장애의 치료를 다루고 따라서 환자의 삶의 질을 개선시키기 위한 새로운 단백질 치료제의 파이프라인이 준비된다.
본 기술의 측면은 단일 실험으로 단백질 치료제 또는 다른 화학물질의 안정성 및 응집의 크기, 정체, 메카니즘 및 정도를 결정하기 위한 신속하고, 정확하며, 재현가능한 기술을 제공한다. 본 기술의 측면은 상이한 단백질 치료제 후보물질의 비교가능성 평가 및 단백질 치료제 후보의 개발가능성 평가를 다룬다. 상기 데이터는 파일럿 규모에서의 발견, 연구 및 개발 또는 제조를 위한 또는 품질 관리 및 보증 목적을 위한 단백질, 중합체, 유기 물질, 무기 물질의 분류 및 화학적 특징화를 위해 사용될 수 있다. 또한 단백질 치료제의 저장 및 전달 동안의 안정성 평가를 위해서도 사용될 수 있다.
본원에 기재된 연산적 방법 및 시스템은 단백질에 대한 기존의 분석에 비해 상당한 개선을 제공한다. 본원에 기재된 연산적 방법 및 시스템은 여러 장비의 사용을 필요로 하지 않으면서 효율적이고 의미있는 분석을 용이하게 하는 형태로 데이터를 생성하고 저장한다. 따라서, 본원에 기재된 연산적 방법 및 시스템은 후보 약물의 평가를 위한 스펙트럼 데이터 분석의 효율을 개선시킬 수 있다.
본 기술의 측면은 단백질 치료제의 응집의 정도 및 메카니즘에 대한 본질적인 정보를 제공하기 위한 2차원 상관 분광분석법 ("2DCOS") 및 2차원 공동-분포 분광분석법 ("2DCDS")의 사용을 포함한다. 본원에 기재된 방법은 단백질 내의 구조적 모티프 또는 도메인의 안정성을 확인하는 정보를 제공하는 내부 프로브로서의 측쇄 모드의 분석을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 설계 품질 ("QBD")을 준수하는 실험 설계 ("DOE") 접근법을 통해 고처리량-개발가능성 및 비교가능성 평가 ("HT-DCA")에서 유용한 것으로 나타났다.
일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 단백질-단백질 상호작용 ("PPI") 또는 단백질-거대분자 상호작용 (단백질-지질 상호작용, 단백질 DNA 또는 단백질-RNA 상호작용 또는 단백질 약물 상호작용)을 결정하기 위해 또한 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 유기 용액, 중합체, 겔, 나노구조 또는 작은 액정 등의 분석을 위해 사용될 수 있다.
도 1a는 크기 배제 크로마토그래피 ("SEC")의 결과를 나타내고, 도 1b는 시차 주사 열량측정법 ("DSC")의 결과를 나타내고, 도 1c는 동적 광 산란 ("DLS")의 결과를 나타낸다. 이들 기술은 응집의 크기, 정체 및 정도를 결정할 수 있지만, 어느 것도 응집 메카니즘을 규정할 수는 없다. 응집 메카니즘을 이해하는 것은 면역원성의 위험성이 거의 없거나 또는 전혀 없이 의도된 대로 작용할 자신의 가능성을 보증하는 단백질 약물을 개발하는 데에 필수적이다.
일부 실시양태에 따르면, 예를 들어 도 2에 도시된 바와 같이, 생물공정의 상이한 부분들로부터의 수성 또는 동결건조될 수 있는 샘플을 푸리에 변환 적외선 (ATR 또는 투과) 분광분석법 ("FT-IR")에 의해 모니터링하고, 응집체 조사를 위해 2DCOS를 사용하여 분석한다. 라만 분광분석법, 양자 캐스케이드 레이저 흡수, 싱크로트론 소스 푸리에 변환 적외선 현미경검사 및/또는 그의 조합과 같은 다른 유형의 분석이 사용될 수 있다. 응집체가 발견되면, 그 결과를 확립된 데이터베이스와 비교하는 것을 포함할 수 있는 평가 절차를 시작할 수 있고, 결과에 따라 생물공정에서 사용된 프로토콜을 변형 또는 변화시킬 수 있다. FT-IR 분광분석법은 제한된 조작으로, 그리고 외인성 프로브를 사용하지 않으면서, 단백질 응집체의 결정시에 높은 정도의 유연성 및 속도를 가능하게 한다. 예시적인 방법은 2DCOS와 조합된 FT-IR 분광분석법을 포함할 수 있고, 이는 응집체의 존재를 결정할 수 있고, 응집 메카니즘의 결정을 가능하게 하여, 다시 실행가능한 단백질을 생성할 수 있도록 단백질의 파이프라인 제조 공정에서의 보정을 허용한다. 또 다른 예시적인 방법은 2DCOS와 조합된 양자 캐스케이드 레이저 현미경검사를 포함할 수 있고, 이는 응집체의 존재를 결정할 수 있고, 응집 메카니즘의 결정을 가능하게 하여, 다시 실행가능한 단백질을 생성할 수 있도록 단백질의 파이프라인 제조 과정에서의 보정을 허용한다. 게다가, 단백질의 열 전이를 또한 결정할 수 있고, 확립된 실행가능한 단백질과 비교하기 위한 2DCOS 플롯을 작성할 수 있고, 이는 목적 단백질 생성물의 품질 관리, 안정성 및 실행가능성을 가능하게 할 수 있다. 게다가, 샘플 제조 및 데이터 분석의 용이성은 이러한 방법의 자동화를 가능하게 한다.
FT-IR 분광분석법은 입체형태적 변화 및 응집에 민감하다. 이 기술은 단백질, 펩티드 및 펩토이드 응집 정도의 정성적 및 정량적 분석을 가능하게 한다. 2DCOS의 사용은 추가 분석을 가능하게 하고, 응집 과정과 관련된 메카니즘적 정보를 제공한다. 이 방법은 다음과 같은 기술들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 투과 FT-IR 분광분석법, 감쇠 전반사 ("ATR") FT-IR 분광분석법, 2DCOS 분석, 및/또는 2DCDS 분석.
투과 FT-IR 현미경검사 또는 QCL 현미경검사에서, 샘플 제조는 적절한 완충제 중에서 순수한 단백질, 펩티드 또는 펩토이드를 사용하는 것을 수반할 수 있다. 샘플을 동결건조시키고, D2O에 재현탁시킬 수 있다. 단백질 용액을 슬라이드와 커버 사이에 적용하고 밀봉하여 용매 증발을 방지할 수 있다. 슬라이드는 슬라이드 홀더에 설치될 수 있다. 적절한 완충제 (PBS 또는 HEPES)를 사용하는 유사한 절차를 참조를 위해 사용하였다. 슬라이드와 밀접하게 접촉하게 위치된 온도 프로브를 사용하여 샘플의 온도를 기록한다. 시간 경과에 따른 온도 구배가 사용될 수 있고, 획득된 스펙트럼 데이터는 열전쌍 계면을 통해 자동으로 수신된다. 스펙트럼 분석 동안, 아미드 I 밴드의 절반 높이에서의 전체 폭 (FWHH)을 온도의 함수로서 결정하여 전이 온도를 확립할 수 있다.
감쇠 전반사(ATR) FT-IR 분광분석법은 수소/중수소 교환 연구, 적정 실험 및 재구성된 막 단백질의 배향의 결정에 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 단백질은 반복된 동결건조 및 D2O 중 샘플의 재용해에 의해 완전히 교환될 수 있다. 완전 교환된 단백질 샘플 및 완충제는 필름으로서 독립적으로 확산될 수 있으며 여기서 완충제는 참조물로서 간주된다. 전형적으로, D2O 중의 단백질 샘플을 ATR 결정 상에 확산시키고 건조 공기 퍼지를 사용하여 건조시킨다. 후속 스펙트럼은 단백질 샘플 및 존재하는 경우에 단백질의 응집된 형태를 나타낼 것이다.
일부 실시양태에 따르면, 스펙트럼 데이터는 임의의 적합한 방법, 예컨대 하나 이상의 상기 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다. 분석될 분자는 원하는 경우에 용질, 예컨대 물 또는 D2O를 사용하여 용액으로 제공될 수 있다. 용액 중의 분석될 분자의 농도는 바람직하게는 용질 (예를 들어, 물) 또는 샘플의 다른 성분으로부터의 임의의 신호에 비해 분자로부터의 강한 신호를 제공하는 범위 (즉, 적합한 신호 대 잡음 비)를 갖고, 이는 본원에 기재된 바와 같은 추가 분석을 용이하게 할 수 있다. 전형적으로, 목적하는 신호 대 잡음 비를 제공하는 단백질 또는 펩티드 분자의 농도는 단백질 또는 펩티드의 크기와 관련되고 그에 비례한다. 바람직한 농도는 분석을 위해 적절한 신호 대 잡음 비를 제공한다. 예를 들어, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 샘플은 용질 (예를 들어, 물 또는 D2O) 또는 샘플의 다른 성분에 기인하는 스펙트럼을 차감할 필요 없이 관심 분자에 대한 스펙트럼의 분석을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 약 150kD의 IgG 또는 다른 단백질의 경우, 샘플은 단백질을 약 50 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 농도로 함유할 수 있다. 단백질의 양은 관심 단백질의 크기에 비례하여 이 범위로부터 달라질 수 있고, 예를 들어, 약 67kD인 BSA는 용액 중에서 약 25 mg/mL 내지 약 75 mg/mL의 농도로 분석될 수 있다. 샘플은 경로 길이를 갖는 셀에 제공될 수 있다. 경로 길이는 D2O의 경우 더 길고 (예를 들어, 30-50 μm, 바람직하게는 약 40 μm), 물의 경우 더 짧을 (예를 들어, 4-12 μm) 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 스펙트럼 분석은 예를 들어 도 3에 예시된 바와 같은 단계에서 수행될 수 있다. 도 3에 예시된 과정은 도 2에 예시된 "2DCOS/2DCDS 분석" 단계의 적어도 일부로서 수행되는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 단백질 샘플은 (열적, 화학적, 압력 또는 음향적으로) 섭동되어 진동 스펙트럼에서의 동적 변동을 유도한다. 단계 310에서, 미가공 스펙트럼 데이터를 수집 및/또는 분석할 수 있다. 스펙트럼 데이터는 규칙적인 온도 간격으로 순차적 방식으로 획득할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 데이터는 기준선 보정될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 스펙트럼 데이터를 사용하여 응집된 형태의 단백질, 펩티드 또는 펩토이드의 존재를 결정할 수 있다. 이를 위해, 제1 스펙트럼을 후속 스펙트럼으로부터 차감하여 동적 스펙트럼을 생성한다. 단계 320에서, 공분산 (차이) 스펙트럼은 모든 후속 스펙트럼으로부터 제1 스펙트럼 (24℃)의 차감에 의해 생성될 수 있다. 결과적으로, 공분산 (차이) 스펙트럼은 양의 피크 및 음의 피크를 포함하며; 이들은 또한 서로 동일 위상에 있는 것 및 위상차를 갖는 것으로 지칭된다.
특히, 본원에 기재된 과정은 스펙트럼 데이터로부터 물 또는 다른 참조물 (예를 들어, 용질)의 수동 차감을 필요로 하지 않는다. 이러한 수동 차감은 단백질 스펙트럼 분석에서 종종 발생하는 고도로 주관적인 단계이다. 대신에, 본원에 기재된 과정은 관심 샘플의 섭동을 기초로 하여 차이 스펙트럼 데이터 세트를 생성한다. 이어서, 그의 산출물을 추가 분석을 위해 사용할 수 있다. 아미드 I 밴드와 함께 중첩되는 물 밴드를 갖는 제1 스펙트럼을 모든 후속 스펙트럼으로부터 차감함으로써, 물의 스펙트럼 기여도는 자동으로 차감된다.
단계 330에서, 2D IR 상관 기술을 적용하여 동기성 플롯 (단계 340) 및 비동기성 플롯 (단계 350)을 생성할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼 데이터는 고속 푸리에 변환 ("FFT")시켜 복소 행렬을 생성하고, 이 복소 행렬로부터 교차 상관을 통해 강도 행렬이 수득되고, 동기성 및 비동기성 플롯이 생성된다. 이들 플롯을 생성하는 기술은 본원에서 보다 상세하게 논의될 것이다.
동기성 플롯은 섭동 동안 발생하는 강도 변화를 나타낸다. 이 플롯의 대각선 상에는 스펙트럼 전반에 걸쳐 변화되는 피크 또는 밴드 (오토 피크로서 공지됨)가 있다. 대각선 밖에는 오토 피크 사이의 상관관계, 즉 관찰된 2차 구조 변화 사이의 관계를 나타내는 크로스 피크가 있다. 동기성 플롯은 동일 위상 피크 강도 변화들 또는 이동들을 관련시키기 위해 사용될 수 있다.
동기성 상관 스펙트럼에서, 대각선 위치에서의 오토 피크는 스펙트럼 신호의 섭동-유도 동적 변동의 정도를 나타낸다. 크로스 피크는 2개의 상이한 파수에서의 스펙트럼 신호의 동시적 변화를 나타내고, 이는 강도 변동의 커플링된 또는 관련된 기원을 시사한다. 크로스 피크의 부호가 양인 경우, 상응하는 파수에서의 강도는 함께 증가 또는 감소된다. 상기 부호가 음이면, 하나는 증가하는 반면, 다른 것은 감소한다.
비동기성 플롯은 사건의 순서를 결정하고 따라서 단백질의 응집 메카니즘을 결정하는데 사용되는 크로스 피크만을 포함한다. 비동기성 플롯은 위상차 피크 강도 변화들 또는 이동들을 관련시키기 위해 사용될 수 있다.
비동기성 상관 스펙트럼에서, 신호 변동의 일부 푸리에 주파수 성분에 대하여 강도가 서로 위상차를 두고 변하는 경우에만 크로스 피크가 발생한다. 파수 v 2 에서의 강도 변화가 파수 v 1 보다 먼저 일어나면, 크로스 피크의 부호는 양이다. 파수 v 2 에서의 강도 변화가 파수 v 1 보다 후에 발생하는 경우, 크로스 피크의 부호는 음이다. 상기 부호 규칙은 동기성 플롯으로 번역된 동일한 비동기성 크로스 피크 위치가 음의 영역 (Φ(v 1 , v 2 ) < 0)에 들어가면 역전된다.
2D IR 상관관계는 2차원으로 피크를 확산시킴으로써 넓은 밴드, 예컨대 아미드 I 및 II 밴드의 기저 피크의 스펙트럼 분해능을 증진시킨다. 이들 플롯은 사실상 대칭적이고, 논의 목적을 위해, 분석에 대해 상부 삼각형을 참조할 것이다. 동기성 플롯 (340에 도시됨)은 2개의 유형의 피크를 포함한다: (a) 대각선 상의 양의 피크들인 오토 피크, 및 (b) 양 또는 음일 수 있는 대각선 밖의 피크들인 크로스 피크. 비동기성 플롯 (350에 도시됨)은 독점적으로, 위상차 피크들을 관련시키는 크로스 피크로 구성된다. 그 결과, 이 플롯은 더 큰 스펙트럼 분해능 증진을 드러낸다. 하기 규칙이 분자 사건의 순서를 확립하기 위해 적용될 수 있다:
I.
비동기성 크로스 피크(v 2 )가 양인 경우, v 2 는 v 1 보다 먼저 섭동된다(v 2 → v 1 ).
II.
비동기성 크로스 피크(v 2 )가 음인 경우, v 2 는 v 1 보다 후에 섭동된다. (v 2 ← v 1 ) .
III.
동기성 크로스 피크 (대각선 밖의 피크, 도 3에 도시되지 않음)가 양인 경우, 사건의 순서는 독점적으로 비동기성 플롯 (규칙 I 및 II)을 사용하여 확립된다.
IV.
동기성 플롯이 음의 크로스 피크를 포함하고 상응하는 비동기성 크로스 피크가 양인 경우, 순서는 역전된다.
V.
동기성 플롯이 음의 크로스 피크를 포함하고 상응하는 비동기성 크로스 피크가 음인 경우, 순서는 유지된다.
v 2 축에서 관찰되는 각각의 피크에 대해 사건의 순서가 확립될 수 있다. 각 사건에 대한 순서를 요약하는 표를 제공할 수 있다. 단계 360에서, 사건 플롯의 순차적 순서가 각각의 사건의 순서를 정리한 표를 이용하여 생성된다. 각각의 스텝 (사건) 상부에는 크로스 피크 v 2 의 분광학적 정보가 있고, 각각의 스텝의 하부에는 이들이 온도의 함수로서 섭동되는 순서로 각각의 사건에 대한 상응하는 피크 할당 또는 생화학적 정보가 있다. 예가 본원에서 제공된다.
2차원 상관 분광분석법 ("2DCOS") 분석을 이용하여 복합 밴드, 예컨대 아미드 I 밴드를 분해할 수 있다. 2DCOS 분석의 예는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,268,628에 기재되어 있다. 통상의 기술자는 2DCOS 분석에서 사용하기에 적합한 알고리즘을 기술하는 문헌 [Isao Noda, "Two-dimensional co-distribution spectroscopy to determine the sequential order of distributed presence of species", Journal of Molecular Structure, Vol. 1069, pp. 51-54]을 참조할 수 있다.
2DCOS의 전개의 개요는 다음과 같다. 관찰된 스펙트럼 강도에서의 변화를 유도하는 외부 섭동의 영향 하에 측정된 시스템에 대해 개별적으로 샘플링된 스펙트럼의 세트 를 수득할 수 있다. 스펙트럼 변수 (여기서, j = 1,2, ..., n)는 예를 들어, 파수, 주파수, 산란각 등일 수 있고, 다른 변수 (여기서, k = 1,2,...,m)는 적용된 섭동, 예를 들어 시간, 온도 및 전위의 효과를 나타낸다. 와 사이의 명확하게 규정된 관찰 간격 동안 수득된 순차적으로 샘플링된 스펙트럼 데이터 세트만이 2DCOS 분석을 위해 사용될 것이다. 단순성을 위해, 여기서 파수 및 시간을 사용하여 2개의 변수를 지정하지만, 다른 물리적 변수의 사용도 또한 유효한 것으로 이해된다.
2D 상관 분광분석법에서 사용된 동적 스펙트럼은 하기와 같이 명확하게 정의된다:
여기서, 는 시스템의 기준 상태의 스펙트럼이다. 기준 상태의 선험적 지식이 부재한 경우, 기준 스펙트럼은 또한 와 사이의 관찰 간격에 걸쳐 시간-평균 스펙트럼으로서 설정될 수 있다.
이러한 특정한 기준 스펙트럼의 선택으로, 관찰 간격 내의 동적 스펙트럼의 부분은 본질적으로 평균 중심(mean-centered) 스펙트럼과 동등해진다. 동기성 및 비동기성 2D 상관 스펙트럼 및 는 다음에 의해 주어진다.
동기성 스펙트럼 는, 섭동 변수 에 따라 2개의 상이한 파수 및 에서 관찰되는 스펙트럼 강도의 조화된 또는 동시적 변화를 나타낸다. 동기성 상관 강도의 부호는 2개의 파수에서 측정된 스펙트럼 강도가 대부분 증가 또는 감소하는 동일한 방향으로 변화하는 경우 양이 된다. 다른 한편, 하나가 증가하고, 다른 것이 감소하는 경우, 의 부호는 음이 된다.
비동기성 스펙트럼 은 스펙트럼 강도의 위상차 또는 순차적 변화를 나타낸다. 이면, 2개 파수 및 에서의 스펙트럼 강도의 변동이 완전히 동기화된다. 및 의 부호가 동일한 경우, 에서 관찰된 전체 스펙트럼 강도 변동은 주로 에서의 강도 변동보다 먼저 발생한다. 부호가 상이한 경우, 순서는 역전된다. 마지막으로, 인 경우, 강도 변동의 순차적 순서는 결정될 수 없다. 2D 상관 스펙트럼은 스펙트럼 강도 변동의 순차적 순서만을 제공하고, 스펙트럼 신호의 원인이 되는 종의 분포된 존재의 순서를 제공하는 것은 아님을 강조하는 것이 중요하다.
다시 도 3을 참조하면, 단계 370에서, 공동-분포 상관관계 플롯은 용액 중 단백질 집단 분포 (80% 역치)의 섭동된 영역을 제공한다.
2차원 공동-분포 분광분석법 ("2DCDS") 분석을 사용하여 용액 중에 있는 단백질 분자의 집단 및 이들 단백질의 상이한 집단이 거동하는 방법을 분석할 수 있다. 통상의 기술자는 2DCDS 분석에서 사용하기에 적합한 알고리즘을 기술하는 문헌 [Isao Noda, "Two-dimensional co-distribution spectroscopy to determine the sequential order of distributed presence of species", Journal of Molecular Structure, Vol. 1069, pp. 54-56]을 참조할 수 있다.
수학식 (2)에 의해 주어지는 시간-평균 스펙트럼 으로, 의 관찰 간격 동안 순차적으로 수득된 m 시간 의존성 스펙트럼 의 세트에 대하여, 특성 (시간) 지수는 다음과 같이 정의된다.
다시 한번, 여기서 사용된 시간은 적용된 섭동의 대표적인 변수에 대한 일반적인 설명을 의도하며, 따라서 이는 실험 조건에 특정하게 선택된, 임의의 다른 적절한 물리적 변수, 예컨대 온도, 농도 및 압력으로 대체될 수 있는 것으로 이해된다. 특성 시간 은 과 사이의 관찰 간격에 의해 경계지어진 시간 축을 따른 스펙트럼 강도 의 분포 밀도의 제1 모멘트 (시간 축의 원점에 대함, 즉, )이다. 이는 시간에 걸쳐 분포된 관찰된 스펙트럼 강도에 대한 무게 중심의 위치에 상응한다.
동기성 공동-분포 강도 는 시간 축을 따른 2개의 별개의 스펙트럼 강도의 분포의 공존 또는 중첩의 척도이다. 대조적으로, 비동기성 공동-분포 강도 는 2개 스펙트럼 신호 분포의 차이의 척도이다. 용어 "공동-분포"는 2개의 별개의 분포의 비교를 나타내며, 이 메트릭은 2개의 변동의 비교를 기초로 하는 "상관관계"의 개념으로부터는 구별된다.
수학식 6, 7 및 9를 조합함으로써, 비동기성 공동-분포 스펙트럼에 대한 표현은 다음과 같이 주어진다.
비동기성 공동-분포 스펙트럼에서, 그리고 양의 부호를 갖는 크로스 피크, 즉 의 경우, 에서의 스펙트럼 강도의 존재는 의 것에 비교하여 시간 축을 따라 주로 더 앞선 단계에 분포된다. 다른 한편, 의 경우, 순서가 역전된다. 의 경우에, 시간 경과에 따라 2개 파수에서 관찰되는 스펙트럼 강도의 평균 분포는 유사하다. 동기성 공동-분포 피크의 부호는 항상 양이고, 이는 분포 패턴의 중첩 정도의 명백한 정성적 척도를 넘어선 동기성 스펙트럼의 정보 내용을 다소 제한한다.
2DCDS는 단백질에서 응집의 메카니즘의 요소를 제공할 수 있거나, 또는 가중 방식으로 조사되는 임의의 과정을 제공할 수 있다. 2DCDS를 사용하여, 섭동 (예를 들어, 시간, 온도, 농도, 압력 등) 변수 축을 따라 종의 분포된 존재의 서열을 직접적으로 제공할 수 있다. 이 기술은 중간체 종의 존재를 직접 식별하기 위해 2DCOS 분석을 증강시키는 상보적 도구로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 섭동-의존성 스펙트럼은 관찰 간격 동안 순차적으로 수득된다. 스펙트럼 변동으로부터 2D 상관 스펙트럼 (동기성 스펙트럼 및 비동기성 스펙트럼)이 유도된다. 동기성 공동-분포 강도는 섭동 축을 따라 2개의 별개의 스펙트럼 강도의 분포의 공존 또는 중첩으로서 측정된다. 비동기성 공동-분포 강도는 두 스펙트럼 신호의 분포의 차이로서 측정된다. 양의 부호를 갖는 크로스 피크, 즉 Δ(v 1 , v 2 ) > 0의 경우, v 1 에서의 스펙트럼 강도의 존재는 v 2 의 것에 비교하여 시간 축을 따라 주로 더 앞선 단계에 분포된다. 다른 한편, Δ(v 1 , v 2 ) < 0의 경우, 순서가 역전된다. Δ(v 1 , v 2 ) 0의 경우에, 시간 경과에 따라 2개 파수에서 관찰되는 스펙트럼 강도의 평균 분포는 유사하다.
2DCOS 분석 사이의 차이는 섭동 과정 및 샘플에 대한 그의 효과로 인한 경로의 평균 수치 평균(mean average) 설명을 제공하는 반면, 2DCDS 분석은 섭동 과정 동안 분자 (단백질) 집단에서 가중 요소를 제공한다. 2DCOS 및 2DCDS의 결과는 섭동으로 인해 스펙트럼 데이터에서 변화하는 요소들의 직접적이고 단순화된 설명이다.
일부 실시양태에 따르면, 예를 들어 도 4에 도시된 바와 같이, 데이터 분석을 수행하기 위한 시스템은 적어도 본원에 기재된 방법의 기능을 수행하기 위해 도시된 구성요소를 포함할 수 있다. 획득된 데이터는 분석을 위해 프로세서를 포함한 하나 이상의 컴퓨팅 유닛에 제공될 수 있다. 데이터의 분석을 수행하거나 관리하기 위한 모듈이 제공될 수 있다. 이러한 모듈은 상관관계 분석 모듈, 시각 모델 발생기 모듈 및/또는 인간 상호작용 모듈을 포함할 수 있다. 모듈은 서로 통신할 수 있다. 일부 실시양태에서, 모듈은 소프트웨어 (예를 들어, 서브루틴 및 코드)로 구현될 수 있다. 예를 들어, 모듈은 메모리 및/또는 데이터 저장소에 저장될 수 있고, 프로세서에 의해 실행될 수 있다. 일부 측면에서, 모듈 중 일부 또는 모두는 하드웨어 (예를 들어, ASIC(Application Specific Integrated Circuit), FPGA(Field Programmable Gate Array), PLD(Programmable Logic Device), 제어기, 상태 머신, 게이티드 로직(gated logic), 이산 하드웨어 구성요소, 또는 임의의 다른 적절한 디바이스), 펌웨어, 소프트웨어, 및/또는 그의 조합으로 구현될 수 있다. 본 기술의 다양한 측면에 따른 이들 모듈의 추가적인 특색 및 기능이 본 개시내용에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시양태에 따르면, 예를 들어 도 5에 도시된 바와 같이, 획득된 데이터를 검증 및 준비하는 방법이 수행될 수 있다. 데이터의 유형을 식별하고 검증한다. 검증에 기초하여, 데이터는 전환 및/또는 저장되거나 또는 사용자에게 오류를 디스플레이하고 거부될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 예를 들어 도 6에 도시된 바와 같이, 획득된 데이터를 분석하는 방법이 수행될 수 있다. 데이터의 유형은 역치와 비교하여 적절한 신호 대 잡음 비로 검증된다. 검증에 기초하여, 데이터를 분석하거나 분석 전에 평활화 필터 과정에 적용할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 예를 들어 도 6에 도시된 바와 같이, 기준선 상관관계를 적용하는 것, 피크를 위치확인하는 것, 데이터 윈도우를 계산하는 것, 상관관계를 계산하는 것, 공동-분포를 계산하는 것, 및/또는 섭동 상관관계를 계산하는 것을 포함하는 작업에서 데이터가 분석될 수 있다.
데이터 조작은 미립자 및 용액의 구별을 위한 관심 영역 (ROI)의 자동 인식을 포함할 수 있다. 미립자의 집단 분포를 확인하기 위해 미립자의 크기 및 수를 결정할 수 있다. S/N 비 결정, 기준선 보정, 수증기 함량 결정 및 연구되는 스펙트럼 영역 내의 관심 요소의 신호 강도 결정과 같은 데이터 조작을 순응도를 보장하기 위해 수행할 수 있다. 통계적 분석을 위한 데이터 출력은 특히 실험 설계 접근법을 사용하여 단순화될 수 있다. 관심 요소의 강도 및 스펙트럼 위치는 쉼표로 구분된 파일 (*.csv)로서 출력될 수 있다. 공분산, 또는 동적 스펙트럼 데이터 세트는 관심 샘플의 섭동을 기초로 생성될 수 있고, 그의 출력은 추가 분석을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 데이터 출력은, 비교가능성 평가에 대한 다른 생물분석 결과들과의 병합을 용이하게 하며 섭동 유형, 부형제, 단백질 치료제, 단백질 농도, 온도, 획득 날짜, 및/또는 생물분석 기술에 의해 소싱된 포맷으로 제공될 수 있다. 이러한 접근법은 유사한 조건 하에 수행되는 모든 실험에 대해 통계적 분석을 수행할 수 있게 한다. 보다 중요하게는, DOE 분석의 결과는 최종 보고를 위해 준비된 독립형 문서일 것이고, 의사 결정을 가능하게 할 것이다.
일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 공분산 또는 동적 스펙트럼 데이터에 상관 함수를 적용하여 2개의 플롯 (동기성 및 비동기성)을 생성할 수 있고, 이 알고리즘은 2D IR 상관 분광분석법으로 지칭된다. 동기성 플롯에서 수득된 바와 같이 서로 동일 위상에 있는 스펙트럼 데이터에서의 변화 (예를 들어, 피크 강도)가 상관될 수 있다. 스펙트럼 데이터에서 변하는 요소가 결정될 수 있다. 스펙트럼 데이터에서의 전체적인 가장 큰 강도 변화를 결정할 수 있다. 스펙트럼 데이터에서의 전체적인 가장 작은 강도 변화가 결정될 수 있다. 단백질 및 펩티드의 경우 아미드 밴드와 같은 넓은 밴드에서 기저 스펙트럼 기여도의 최소 수를 곡선 피팅 분석을 위해 결정할 수 있고, 이는 2차 구조 조성의 결정을 가능하게 한다. 연구되는 스펙트럼 영역의 분해능은 특히 스펙트럼의 넓은 밴드에 대해 증진될 수 있다.
비동기성 플롯에서 수득된 바와 같이 서로 위상차를 갖는 스펙트럼 데이터에서의 변화 (예를 들어, 피크 강도)가 상관될 수 있다. 비동기성 플롯은 또한 단백질 거동을 분자적으로 상세히 설명하는 사건의 순서를 포함한다. 플롯의 상세한 평가를 수행하여 사건 순서를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 조합하여, 이 과정은 자동화될 수 있다. 결합 분산 함수가 공분산 또는 동적 스펙트럼 데이터에 적용되어 병합된 비동기성 플롯을 생성할 수 있고, 이는 사건의 순서를 결정하기 위해 직접적으로 해석될 수 있다. 대안적으로, 이 방법은 복잡한 설명인 단백질의 분자 거동의 설명에 대해 상기 해석을 검증하기 위해 사용될 수 있다. 곡선-피팅 루틴에 대한 추가의 정보, 곡선-피팅 루틴에 대한 수 위치 및 강도 정보의 입력은 또한 분석된 샘플에서 단백질의 2차 구조 조성 및 단백질 응집된 종의 정도를 산출하는 자동화된 과정일 수 있다. 2D IR 상관관계 플롯으로부터의 강도 정보는 산화 생성물, 예컨대 탈아미노화의 정량적 결정을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 탈아미노화는 측쇄를 기초로 검출될 수 있다. 이러한 분석은 후보 약물 선택을 위해 또는 단백질 설계 단계 동안에 사용될 수 있다. 기계 학습 접근법은 상관되고 해석되어야 할 필요가 있는 속성의 복잡성에 대한 장기간 해결책으로서 구현될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 예를 들어 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이, 획득된 데이터의 분석은, 단백질 응집 연구에 관하여 통계적으로 유효하고 매우 많은 정보를 제공하는 포괄적인 해결책을 제공하기 위해 단계적으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 도 7a 및 도 7b에 도시된 과정은 도 3에 도시된 과정의 응용을 나타낼 수 있다. QCL 적외선 현미경검사의 결과 (도 7a의 좌측 상부)가 도시되어 있고, H→D(수소→중수소) 교환된 전장 IgG (150KDa)에 대한 저온 5℃ (더 큰 최대값을 가짐) 및 고온 90℃ (더 작은 최대 값을 가짐)에서의 초기 및 최종 QCL 스펙트럼이 1700-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에 도시된다. 아미드 I' (1700-1600 cm-1, 주로 펩티드 결합 카르보닐 스트레칭 모드에 기인함) 및 측쇄 (표 1에 정의된 1600-1500 cm-1) 밴드에서의 차이가 관찰된다.
표 1: D2O 중 내부 프로브로서의 아미노산
모든 후속 스펙트럼으로부터 저온에서의 초기 스펙트럼을 차감함으로써, 온도 증가로 인한 스펙트럼 변화가 드러나고 (단백질 거동의 변화를 드러냄), 이는 공분산 스펙트럼 데이터로서 지칭되지만, 또한 상용적으로 차이 스펙트럼으로도 지칭된다. 이어서, 교차 상관 함수를 이들 스펙트럼 변화에 적용하여 관찰된 피크 사이의 관계를 결정한다. 단백질 샘플의 섭동으로 인해 관찰된 결과적인 피크들 사이의 상관관계를 제공하는 동기성 및 비동기성 플롯인 2개의 플롯을 생성하였다. 이들 플롯은 풍부한 분자적 정보 및 단백질의 거동을 설명하는 분자 사건의 순차적인 순서를 제공한다. 응집 피크와 함께, 오토 피크 (대각선 상의 피크)를 포함하는 동기성 플롯 (도 7a의 좌측 하부)이 도시되어 있다. 이 다이어그램은 단백질에서 가장 큰 강도 변화를 나타내고, 보다 낮은 강도 변화를 갖는 2개의 추가의 오토 피크가 관찰된다. 이들 피크 사이의 관계는, 양 또는 음이고 대각선 상에서 관찰된 상이한 오토 피크 사이의 관계 (즉, 초기 스펙트럼의 차감으로 인한 강도 변화)를 제공하는 크로스 피크 (대각선 밖의 피크)의 관찰을 기초로 결정된다. 이러한 가상적인 경우에서, 관찰된 관계는 단백질의 나선형 2차 구조를 수반하는 응집 사건을 초래하고, 이는 또한 이러한 나선형 모티프에서 발견되어 단백질의 응집 과정을 위한 내부 프로브로서 작용하는 티로신 잔기의 존재에 의해 검증된다. 따라서, 티로신 피크는 응집 중인 단백질의 영역을 규정한다. 2DCOS 분석은 이전에는 다른 직교 기술, 예컨대 SEC, DSC 및 DLS로는 입수할 수 없는 가치있는 상세한 분자 정보를 제공한다. QCL로부터 수득된 결과는 고도로 재현가능하고, 통계를 사용하여 엄격하게 시험되었다. QCL 적외선 스펙트럼 영역은 고도로 선택적이고 민감성이어서, 단백질 입체형태적 변화뿐만 아니라 20개 아미노산 중 6개의 측쇄 진동 모드의 동시 연구를 허용한다 (표 1 참조).
실시예 1
3개의 항체 약물 접합체 단편에 대해 개발가능성 및 비교가능성 평가를 수행하였다 (도 8a 및 도 8b). 분석은 총 47회 실험을 수반하였다. QCL 현미경을 사용하여 43개의 DOE 조건의 영상 획득을 수행하였고, 이 중 16개는 pH 6.6 및 T = 24-30℃에서 HEPES 완충 용액 중 ADC0, ADC1 & ADC2로 명명된 3개의 ADC 단편의 비교를 수반하였다. ADC2은 연구된 조건 하에서 응집체가 없는 것으로 결정된 반면, ADC1은 일부 응집체 종을 갖지만, 28℃로 가열되었을 때 응집체는 용액으로 되돌아갔다 (도 9a 및 도 9b). 더욱이, ADC0 후보는 응집체 종이 존재하였었지만, 온도 증가에 따라 응집체 종의 존재가 증가하였다. 이들 응집체 종은 ADC0인 것으로 결정되었다. 2DCDS 분석을 사용하여 ADC1에 대해 유사한 결과가 발견되었다(도 10).
또한, 응집체가 없는 ADC2의 스펙트럼 분석을 실온 부근에서 (T = 24-26℃) 다양한 부형제 (수크로스 및 NaCl)의 존재 하에 수행하였다 (도 11a 및 도 11b). QCL 영상 내에서 박스로 표시된 상이한 관심 영역 (ROI)을 선택함으로써 분석의 재현성을 결정하는 유용성을 부가하고 (도 11a), 영상은 분광학적으로 오프라인으로 분석되었다 (도 11b). 수크로스 부형제는 1420-1520 cm-1에서 보여진다. 또한, 아미드 I' 및 측쇄 밴드 (1520-1700 cm-1)가 도시되어 있고, 따라서 기술의 높은 민감성 및 선택성이 입증된다. 추가의 증거는 도 12a 내지 도 12c에 나타나 있다. 분석적으로, 부형제 및 단백질 치료제 둘 다를 직접적으로 검출하는 능력은, 각각의 제제에서 부형제의 존재의 검증을 허용하기 때문에, 생물제약 산업에서 높은 가치가 있다. HT-DCA 플랫폼은 통계적 분석뿐만 아니라 샘플 내의 구성성분의 고도로 가치있는 분자 정보에 요구되는 정확도 및 재현성 둘 다를 제공할 것이다.
516 스펙트럼 및 정규 분포 분석의 완전 요인 설계를 다양한 조건 하에 QCL 현미경 (QCL)을 사용하여 43개 실험에 대해 수행하였다. QbD 실험 설정은 324개의 스펙트럼 데이터를 분석하여 다양한 양의 NaCl, 수크로스 및 2종의 부형제 (즉, NaCl 및 수크로스)의 다양한 비의 존재 하에 ADC2의 평가를 나타내도록 하였다. 샘플 크기는 표준 편차에 따라 n=8-12인 것으로 결정되었다. 하기 ADC2로 수행된 개발가능성 및 비교가능성 평가는 26℃ 및 28℃에서 15, 30 및 60 % 수크로스에서 수득된 결과의 요약이다. 부형제로서 다양한 농도 (325, 350 및 400 mM)의 NaCl 및 수크로스와 NaCl의 다양한 비에 대해 유사한 결과가 얻어졌다. 전형적으로, 수득된 결과는 0.8 초과의 p 값으로 수렴하였다 (도 13). 분포 분석 이후, 단계적으로 모든 모델 피팅을 사용하여 DOE 통계적 평가가 수행되었고, AIC & BIC 모델 (도 14, 도 15)에서 ADC2에 대해 18.5% 수크로스가 최상의 부형제라는 동일한 결과에 도달하는 결론을 얻었다.
HT-DCA 플랫폼의 QCL 스펙트럼 분석 능력은 단백질 치료제의 추가의 분자 분석 및 안정성 결정을 제공한다. 이러한 유형의 분석은 매우 많은 정보를 제공하여, 단백질 치료제 후보의 최적 설계를 가능하게 한다. 2가지 유형의 상관관계 분석 (2DCOS 분석 및 2DCDS 분석)을 수행하여 용액 중 단백질 치료제의 거동에 관한 정보를 제공한다.
2D IR 상관관계 플롯의 개념 분석을 단백질의 적외선 스펙트럼에 적용하였다. 아미드 I' 및 측쇄 밴드는 넓고, 다수의 기저 기여도로 구성되며, 기여도는 펩티드 결합 내의 카르보닐 스트레치인 것이든 또는 그 이웃하는 환경 및 약한 상호작용에 대한 정보를 주는 측쇄 진동 모드인 것이든 입체형태적으로 민감하다. 이러한 정보를 추출하기 위해, 모든 후속 스펙트럼으로부터 참조 스펙트럼을 차감함으로써 공분산 스펙트럼이 생성된다. 예를 들어, 단백질 열 변성 연구 (온도 섭동)에서, 저온에서의 초기 스펙트럼이 차감에 사용될 것이다. 생성된 공분산 스펙트럼은 온도 증가로 인한 강도 변화를 포함한다. 이어서, 상관 함수를 데이터 세트에 적용하고, 이로써 증가된 분해능 하에 2개의 별개의 그래프 형태로 공분산 스펙트럼에서 관찰된 강도 변화를 관련시킬 것이다. 이들 플롯은 고도로 중첩된 밴드를 분해하고, 단백질의 가장 유연성인 영역을 확립하고, 단백질 내의 응집 메카니즘을 해독하고 단백질-표적 상호작용을 확립할 수 있다. 2D IR 상관관계 플롯은 동기성 및 비동기성 플롯으로 명명된다. 이들 플롯은 사실상 대칭적이고, 해석 목적을 위해 각각의 플롯의 상부 절반을 참조한다. 동기성 플롯은 오토 피크로서 공지된 대각선 상의 양의 피크를 갖는다. 오토 피크는 전체 스펙트럼 데이터 세트에 대해 관찰된 전체적인 강도 변화를 포함한다. 변화의 크기를 식별하고, 이를 사용하여 단백질 영역이 섭동으로 인해 가질 수 있는 유연성 또는 감수성을 결정할 수 있다. 이들 피크의 위치 및 수를 사용하여 아미드 I' 및 측쇄 밴드에 대한 기저 스펙트럼 기여도를 결정하였다 (표 2 참조).
표 2: 15% 수크로스를 갖는 HEPES 완충제 용액 중의 ADC2에 대한 밴드 할당의 요약
동기성 플롯은 또한 크로스 피크로서 공지된 대각선 밖의 피크를 갖는다. 이들 크로스 피크는 오토 피크들의 관계를 결정한다. 동기성 플롯에서 관찰되는 크로스 피크는 서로 동일 위상에 있는 강도 변화로 인한 것이다. 강도가 점증적으로 변화하거나 또는 그 반대의 경우인 2개의 피크를 고려할 수 있고, 이들 2개의 오토 피크는 그들의 상호 관계를 나타내는 수반되는 크로스 피크를 가질 것이다 (도 16a 및 도 16b).
비동기성 플롯은 대각선 상에 피크를 포함하지 않지만, 증진된 스펙트럼 분해능을 부여한다. 생성된 크로스 피크는, 공분산 스펙트럼에서의 강도가 서로 위상차를 두고 변화하며 결과적으로 상세한 정보를 제공하는 피크로 인한 것이다. 이들 중에는, 열 섭동으로 인한 분자 사건의 순차적인 순서가 있다. 비동기성 플롯에서의 크로스 피크는 양 또는 음이고, 순차적 순서를 결정할 수 있다. 일반적으로, 크로스 피크의 부호가 두 플롯에서 양이면, 비동기성 플롯에 정의된 순서가 유지된다. 따라서, 양의 크로스 피크는 v2보다 먼저 v1이 발생함을 의미한다. 이 해석은 동기성 플롯에서의 동일한 크로스 피크가 또한 양인 것을 필요충분 조건으로 하여 참으로 지정된다. 그러나, 크로스 피크의 부호가 두 플롯 모두에서 상이할 때, 순서는 역전된다.
이를 도 16a 및 도 16b의 플롯에 적용하면, 비동기성 플롯에서의 크로스 피크는 (1652, 1632)에서 양인 것으로 밝혀졌다. 1652 cm-1 (v1) 피크는 1632 cm-1 (v2)보다 먼저 섭동된다. 분자 해석은 π-헬릭스가 단백질 내의 역평행 β-시트보다 먼저 섭동된다는 것일 것이다 (표 2). 유사하게, β-턴 (힌지 루프, 1670.3 cm-1)은 역평행 β-시트보다 먼저 섭동된다. 게다가, 이들 플롯을 사용하여 용액 중의 ADC2를 수크로스가 어떻게 안정화하는지를 결정하였다. 측쇄와 수크로스 사이의 수소 결합은 β-턴 (힌지 루프)을 안정화시키고, 따라서 또한 β-시트를 안정화시켰다. 보다 중요하게는, 관심 단백질 단편에서 발생하는 분자 변화가 도 17에 도시된다.
온도 섭동이 실온 부근으로 제한되었지만, 분석은 측쇄와 그의 수성 환경 및 부형제 (수크로스) 사이의 H-결합 상호작용의 결정을 여전히 허용한다. 또한, 이러한 상호작용은 ADC2의 2차 구조를 안정화시켰다.
2DCDS 분석은 소정 온도 범위 내에서 단백질 용액의 역학 및 입체형태적 역학의 분포의 평가에 유용한 것으로 밝혀졌고, 현재의 경우 온도 범위는 HEPES 완충제 중에서 15% 수크로스의 존재 하에 ADC2에 대해 단지 26-28℃ 정도로 작았다 (도 18a 및 도 18b). 비동기성 공동-분포 플롯의 해석은 2D IR 상관관계와 비교할 때 간단하다. 플롯 사이의 크로스 피크 부호의 비교는 필요하지 않다. 양의 크로스 피크의 경우, v1은 v2보다 먼저 발생하는 것으로 결정될 수 있다. 더욱이, 음의 크로스 피크의 경우는, v2 가 v1보다 먼저 발생하는 것으로 결정될 수 있다.
이러한 단백질에 대해서는 응집이 관찰되지 않았다. 비동기성 플롯 (도 18b)을 참조하면, 힌지 루프라고도 지칭되는 β-턴 (1660 cm-1) 및 음으로 하전된 아스파르테이트 (1553 cm-1)와, 용액 중의 상기 단백질에서의 글루타메이트 (1543 cm-1) 잔기 사이에 상호의존성이 관찰된다. 이러한 결과는 ADC2의 β-턴 모티프 내의 그의 위치와 일치한다. 2DCOS 분석 및 2DCDS 분석은 ADC2 및 ADC2에 대한 수크로스의 안정화 효과에 대한 분자 수준에서의 완전한 설명을 허용한다 (도 16a-도 18b). 요약하면, ADC2에서의 주요 안정화 특색은 아르기닌과 인근 아스파르테이트 잔기 사이에서 관찰된 염-가교 상호작용에 의한 힌지 루프의 것이었다. 염-가교 상호작용의 파괴는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 도입된 제2 디술피드 가교에 의해 방지되었다. 추가의 안정화는 부형제로서 수크로스를 포함하는 제제화 조건에 의해 달성되었다. 구체적으로, 15% 수크로스는 또한 이들 동일한 잔기와의 H-결합에 의한 안정화를 제공하였다.
표 3: 26℃에서의 ADC 단편 2의 2차 구조 조성을 설명하는 곡선-피트 결과의 요약.
도 19는 표 3에 나타낸 결과에 상응하는 플롯을 나타낸다.
실시예 2
H2O 중에 국립 표준 기술 연구소 (National Institute of Standards & Technology) 참조물 8671 (RM8671) 로트 번호 14HB-D-002, 인간화된 IgG1κ 모노클로날 항체 (NIST mAb)를 포함하는 샘플이 본원에 기재된 방법에 따른 분석을 위해 연구되었다. QCL 현미경을 사용한 데이터 획득을 위해 샘플을 CaF2 슬라이드의 셀에 첨가하였다. 적용된 섭동은 4℃ 온도 간격을 갖는 24-60℃의 온도 범위 이내의 온도였다. 4cm-1에서 4x 배율 대물렌즈를 사용하여 QCL IR 스펙트럼 데이터를 획득하였고, 데이터는 매 0.5 cm-1마다 코딩되고 기준선 보정되었다.
NIST mAb 표준물은 IgG1κ 단백질이다. 항체의 중쇄 (서열식별번호: 5) 및 경쇄 (서열식별번호: 6)의 아미노산 서열을 하기에 제시한다.
샘플에 대한 아미노산 측쇄의 할당은 표 4 및 5에 제공된다.
표 4: H2O 중의 NIST mAb에 대한 중 아미노산 측쇄의 할당
표 5: H2O 중 NIST mAb에 대한 경 아미노산 측쇄의 할당
도 20a에 제시된 바와 같이, 1750-1400 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 50 mg/mL의 NIST mAb의 QCL 스펙트럼이 H2O 중에서 24-60 ℃의 온도 범위 내에서 획득되었다. 도 20a는 아미드 I, II 및 III 밴드를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼 데이터 동기성 (도 20b) 및 비동기성 (도 20c)에 기초하여, 2D IR 상관관계 분석 플롯을 생성하였다. 중첩하는 H2O 흡광도가 아미드 I 밴드에서 관찰되었으며 아미드 II 및 III 밴드에서는 그렇지 않았으며, 이는 분석에 충분한 단백질 농도가 달성되었음을 시사한다. 본 개시내용의 실시양태에 따라 적용되는 방법은 사용자에 의한 H2O의 주관적 조작 또는 참조물 차감의 필요성을 제거한다.
도 21a에 제시된 바와 같이, 1750-1500 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 50 mg/mL의 NIST mAb의 QCL 스펙트럼이 H2O 중에서 24-60 ℃의 온도 범위 내에서 획득되었다. 도 21a는 아미드 II 및 III 밴드 둘 다를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다. 이는 스펙트럼 데이터 동기성 (도 21b) 및 비동기성 (도 21c) 플롯에 기초한다. 아미드 I 밴드와 II 밴드 사이의 상관관계가 확립된다. 비동기성 플롯의 사용을 통해 증진된 분해능이 달성된다.
H2O 중의 50 mg/mL의 NIST mAb의 피크 할당이 표 6에 제공된다.
표 6: H2O 중의 50 mg/mL의 NIST mAb의 피크 할당 요약
24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에서의 H2O 중의 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 사건의 순차적 순서가 도 22에 도시되어 있다. 1635.5 cm-1는 1692 cm-1 β-턴의 섭동으로 인해 역평행 β-시트가 할당되고, 두 진동 모드는 가장 안정하다. 또한, 1618 cm-1는 이러한 작업을 기초로 60℃에서 열적으로 유도된 단백질 응집에 할당된다. 1652 cm-1은 α-헬릭스에 할당될 수 있다.
H2O 중의 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 사건의 순차적 순서가 표 7에서 제공된다.
표 7: H2O 중의 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 사건의 순차적 순서 요약
도 23은 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에서의, H2O 중의 50 mg/mL의 NIST mAb에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다. 24-60℃의 온도 범위에서 NIST mAb(50 mg/mL)내의 열 응력 및 스펙트럼 영역 1760-1380 cm-1. 이 플롯은 용액 중 단백질의 집단에서 가장 흔한 반응을 제공한다. 따라서, 50 mg/mL의 NIST mAb의 경우에, 그의 열 응력은 염-가교 상호작용을 통해 Arg와 함께 글루타메이트의 섭동과 관련된 것으로 추정되었다. 글루타메이트는 His 잔기에 H-결합되고, 이들 잔기는 α-헬릭스 및 β-시트 내에 위치한다.
도 24a 내지 도 24d는 (A) 오버레이 미가공 스펙트럼 데이터, 2D IR 상관관계, (B) 동기성 및 (C) 비동기성 플롯 및 (D) 공동-분포 비동기성 플롯 내의 관계를 제공하는 자동화 분석의 예를 나타낸다. 동기성 플롯 내의 오토 피크 (도 24b에 제시된 대각선 상의 양의 피크) 절대 강도 값에 기초하여, 자동화된 분석 동안 수직 파선이 제공된다.
실시예 3
H2O 중 소 혈청 알부민 ("BSA")을 포함하는 샘플을 본원에 기재된 방법에 따른 분석에 대해 연구하였다. QCL 현미경을 사용하는 데이터 획득을 위해 샘플을 CaF2 슬라이드의 셀에 첨가하였다. 적용된 섭동은 4℃ 온도 간격을 갖는 24-60℃의 온도 범위 이내의 온도였다. 4cm-1에서 4x 배율 대물렌즈를 사용하여 QCL 스펙트럼 데이터를 획득하였고, 데이터는 매 0.5 cm-1마다 코딩되고 기준선 보정되었다.
하기는 분석된 BSA의 아미노산 서열이다.
DTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLTSSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA (서열식별번호: 7)
샘플에 대한 아미노산 측쇄의 할당을 표 8에 제공한다.
표 8: H2O 중의 BSA에 대한 아미노산 측쇄의 할당
도 25a에 제시된 바와 같이, 1750-1500 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 40 mg/mL의 BSA의 QCL 스펙트럼이 H2O 중에서 24-60 ℃의 온도 범위 내에서 획득되었다. 도 25a는 아미드 I 및 II 밴드를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼 데이터 동기성 (도 25b) 및 비동기성 (도 25c)에 기초하여, 2D IR 상관관계 분석 플롯을 생성하였다. 아미드 I 밴드와 II 밴드 사이의 상관관계가 확립된다. 비동기성 플롯의 사용을 통해 증진된 분해능이 달성된다. 또한, 동기성 플롯 내의 최고 강도 오토 피크는 이러한 구상 단백질에 대한 나선형 섭동으로 인한 것이다. 또한, 응집은 관찰되지 않았다.
40 mg/mL의 BSA의 피크 할당이 표 9에 제공되어 있다.
표 9: 40 mg/mL의 BSA의 피크 할당의 요약
24-60 ℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에서의 40 mg/mL의 BSA에 대한 사건의 순차적 순서가 도 26에 도시되어 있다. 40 mg/mL의 BSA에 대한 사건의 순차적 순서가 또한 표 10에 제공된다.
표 10: 40 mg/mL의 BSA에 대한 사건의 순차적 순서의 요약
리신 (1530.0 및 1525.5 cm-1)과의 염 가교 상호작용에 관여하는 나선 영역 (1653.9 cm-1) 내에 위치하는 아스파르테이트 (1567 cm-1) 및 글루타메이트 (1584 cm-1)가 처음에 섭동되고; 이어서 β-시트 (1629.6 cm-1), 그후 역평행 β-시트 (1629.6 cm-1) 내의 티로신 (1518 cm-1) 및 히스티딘 (1606.5 cm-1) 및 β-턴 (1698 cm-1)이 섭동된다. 마지막으로 고온에서, β-턴 (1684.0 cm-1)에 근접하게 위치된 글루타메이트 (1560 cm-1) 및 아스파르테이트 (1576.4 cm-1)와의 아르기닌을 수반하는 염 가교 상호작용이 섭동된다.
도 27은 1750-1380 cm-1의 스펙트럼 영역 및 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에서의 H2O 중의 BSA 40 mg/mL에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다. BSA 40 mg/mL의 경우에, 그의 열 응력은 β-턴 및 나선 영역 내의 글루타메이트의 섭동과 관련이 있었다.
실시예 4
H2O 중 NIST mAb 및 BSA의 혼합물을 포함하는 샘플을 본원에 기재된 방법에 따른 분석에 대해 연구하였다. QCL 현미경을 사용하는 데이터 획득을 위해 샘플을 CaF2 슬라이드의 셀에 첨가하였다. 적용된 섭동은 4℃ 온도 간격을 갖는 24-60℃의 온도 범위 이내의 온도였다. 4cm-1에서 4x 배율 대물렌즈를 사용하여 QCL 스펙트럼 데이터를 획득하였고, 데이터는 매 0.5 cm-1마다 코딩되고 기준선 보정되었다.
도 28a에 제시된 바와 같이, 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에서의 NIST mAb/BSA(1:2, 몰 비율) 혼합물의 QCL 스펙트럼이 H2O 중에서 24-60 ℃의 온도 범위 내에서 획득되었다. 도 28a는 아미드 I 및 II 밴드를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼 데이터 동기성 (도 28b) 및 비동기성 (도 28c)에 기초하여, 2D IR 상관관계 분석 플롯을 생성하였다. 전체적으로 동기성 플롯 윤곽은 NIST mAb 및 BSA 순수 성분 둘 모두에 대해 구별가능한 특색을 나타내었다.
NIST mAb/BSA의 피크 할당이 표 11에 제공된다.
표 11: NIST mAb/BSA의 피크 할당 요약
실시예 5
H2O 중의 리소자임을 포함하는 샘플을 본원에 기재된 방법에 따른 분석에 대해 연구하였다. 맞춤형 CaF2 슬라이드 셀을 H2O 중의 샘플에 대한 7 μm 경로-길이와 함께 사용하였다. 적용된 섭동은 4℃ 온도 간격을 갖는 24-60 ℃의 온도 범위 내의 온도였다. 4cm-1에서 4x 배율 대물렌즈를 사용하여 QCL IR 스펙트럼 데이터를 획득하였고, 데이터는 매 0.5 cm-1마다 코딩되고 기준선 보정되었다.
하기는 분석된 리소자임의 아미노산 서열이다.
KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL (서열식별번호: 8)
샘플에 대한 아미노산 측쇄의 할당을 표 12에 제공한다.
표 12: H2O 중 리소자임에 대한 아미노산 측쇄의 할당
도 29a에 제시된 바와 같이, 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역에서 600 mg/mL의 리소자임의 QCL 스펙트럼이 H2O 중에서 24-60 ℃의 온도 범위 내에서 획득되었다. 도 29a는 아미드 I 및 II 밴드를 나타내는 오버레이 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼 데이터 동기성 (도 29b) 및 비동기성 (도 29c)에 기초하여, 2D IR 상관관계 분석 플롯을 생성하였다. 단백질의 나선형 영역과 β-턴 사이의 상관관계는 열 응력으로 인해 확립될 수 있다. 또한, 동기성 및 비동기성 플롯 둘 다에서 관찰된 상관관계에 의해 확립된 바와 같이 글루타메이트, 아스파르테이트 및 아르기닌, 리신, 히스티딘 잔기 사이의 약한 상호작용이 리소자임의 안정성에 중요하다. 이 단백질에 대해서는 응집이 관찰되지 않았다.
600 mg/mL에서 리소자임의 피크 할당이 표 13에 제공되어 있다.
표 13: 600 mg/mL의 리소자임의 피크 할당 요약
24-60 ℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에서 600 mg/mL의 리소자임에 대한 사건의 순차적 순서가 도 30에 도시되어 있다. 40 mg/mL의 BSA에 대한 사건의 순차적 순서가 또한 표 14에 제공된다.
표 14: 600 mg/mL의 리소자임에 대한 사건의 순차적 순서 요약
티로신 (1514.6 cm-1) 및 리신 (1526.9 cm-1)이 처음에 섭동되고, 이어서, 아르기닌 (1628.7 cm-1), 그 후 β-시트 (1637.2 cm-1), 그 후 β-시트 내의 글루타메이트 (1536.8 cm-1), 이어서 나선 영역 (1647.0 cm-1) 내에 위치된 글루타메이트 (1556 cm-1) 및 β-턴 (1698.0 cm-1 및 1683.8 cm-1), 이어서 힌지 루프 (1660.5 cm-1) 내의 글루타메이트 (1547.8 cm-1), 그 후 아스파르테이트 (1566.1, 1672.3 cm-1) 및 아마도 N-말단 단부 부근에 위치된 H-결합 상호작용에 의해 아스파르테이트와 상호작용하는 단일 히스티딘 (1596.6 cm-1), 그리고, 마지막으로 모두 (1666.6 cm-1)에 할당된 Arg, Asn, Gln이 섭동되었다. 응집은 관찰되지 않았다.
도 31은 24-60℃의 온도 범위 내의 열 응력 및 1750-1500 cm-1의 스펙트럼 영역 하에서 H2O 중 600 mg/mL의 리소자임에 대한 비동기성 2D IR 공동-분포 분석 플롯을 나타낸다. 리소자임 (600 mg/mL)의 경우에, 그의 열 응력은 힌지 루프 내에 위치한 티로신, 및 β-턴 및 나선 영역에 또는 그 근처에 위치한 리신 및 글루타메이트의 섭동과 관련되었다.
실시예 6
수성 매질 중 60%(w/v) 용액으로서 고도로 순수한 시판 트레할로스 2수화물을 포함하는 샘플을 본원에 기재된 방법에 따른 분석을 위해 연구하였다. QCL 현미경을 사용하는 데이터 획득을 위해 샘플을 CaF2 슬라이드의 셀에 첨가하였다. 적용된 섭동은 4℃ 온도 간격을 갖는 24-60 ℃의 온도 범위 이내의 온도이고, 평형 시간으로서 5분을 허용하였다. 저배율 대물렌즈 및 영상 영역 2 mm 및 픽셀 크기 4.3 μm을 사용하여 영상화를 수행하였다.
도 32a 내지 도 32f에 도시된 바와 같이, 유리 전이 온도 미만의 다양한 온도에서 60% 트레할로스 용액의 저배율 영상이 획득되었다. 스펙트럼 데이터에 기초하여, 동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 생성하였다 (도 32e). 전형적인 넓은 피크는 트레할로스 디사카라이드로부터 유래된 것으로 관찰되었다.
도 33a는 핵형성 및 초기 결정 형태의 분석을 나타낸다. 도 33a 및 도 33b에 도시된 바와 같이, 60% 트레할로스 용액의 저배율 영상이 유리 전이 온도 근처의 다양한 온도에서 획득되었다. 스펙트럼 데이터에 기초하여, 동기성 2D IR 상관관계 분석 플롯을 생성하였다 (도 33c). 주요 변화는 트레할로스의 핵형성으로부터 결정 형태로의 전이로 인한 대각선 상에서의 양의 오토 피크로 관찰되었다. 도 33b (도 33d 내지 도 33f)는 주로 1400-1200 cm-1 스펙트럼 영역 내에서의 피크 협소화 효과 및 CH2 시저링(scissoring) 같은 진동 모드 내의 더 큰 섭동에 의해 관찰되는 바와 같은 결정 성장 및 탈수 증거의 분석을 나타낸다. 동기성 플롯 내의 오토 피크로부터 관찰된 바와 같이, 1450 cm-1에서의 진동은 가장 큰 변화를 가졌다.
실시예 7
0.1M 트리스 pH 8.5, 0.5% w/v PEG 5000, 0.8M 타르타르산나트륨칼륨 4수화물을 포함하는 샘플을 본원에 기재된 방법에 따른 분석을 위해 연구하였다. QCL 현미경을 사용하는 데이터 획득을 위해 샘플을 CaF2 슬라이드의 셀에 첨가하였다. 적용된 섭동은 2℃ 온도 간격을 갖는 30-38℃의 범위 내의 온도이고, 평형 시간으로서 4분을 허용하였다.
도 34a는 증기 확산 결정화 동안 실제 현적 스크린(hanging drop screen)의 분취물(1uL)의 30-38℃의 온도 범위 및 2℃의 온도 간격의 하이퍼스펙트럼 영상의 모음을 나타낸다. 단백질 복합체 또는 혼합물에 대해 1750-1480 cm-1의 MID IR 스펙트럼 영역에서 4분 동안의 온도 평형 기간 후에 영상을 획득하였다. 0.1M 트리스 pH 8.5, 0.5% w/v PEG 5000, 0.8M 타르타르산나트륨칼륨 4수화물 결정화 조건에서의 응집체 및 미세결정이 제시되어 있다. 달리 무정형 결정으로 생각될 수 있는 성장을 나타내는 온도의 함수로서 관심 영역(ROI)을 강조하고 모니터링한다.
도 34b는 차트가 오버레이된 QCL IR 스펙트럼을 도시한다. QCL IR에 의한 시각화 및 관심 대상의 검사의 유효성이 제시되고, 여기서 증가하는 온도의 함수로서 강도의 감소로 관찰되는 넓은 아미드 I 밴드의 존재는 이것이 단백질이라는 것을 확인한다.
이어서, QCL IR 스펙트럼에 도 34c (동기성) 및 도 34d (비동기성)에 제시된 2D IR 상관관계 분석이 적용되고, 이는 온도의 함수로서 성장하는 HSI ROI 내의 대상이 실제로, 동기성 플롯의 1620 cm-1에서의 두드러진 오토 피크로 인해 단백질 응집체라는 것을 드러내며, 결과적으로 프로브 또는 염료를 사용하지 않고 단백질의 단백질 결정화 과정의 평가에 대한 전례없는 통찰력을 제공한다. 채널 설계를 통한 유동을 갖는 마이크로칩과는 대조적으로, 분석에 사용된 슬라이드는 채널을 통한 유동을 포함하지 않았고, 이에 의해 막힘 가능성을 피하였다.
단백질-펩티드 복합체 결정화의 분취물을 그대로 분석하였다. 또한, 단백질도 펩티드도 동위원소 표지되지 않았다. 열 응력 하에서 획득된 HSI는 온도 증가의 함수로서 성장하는 응집체의 증거를 제공하였지만 (T=30-38℃), 2DCOS 분석의 가치는 응집 과정에 관여하는 분자 성분의 식별이다. 단백질 또는 펩티드에 독점적인 중요한 밴드 할당을 수행하였다. H2O에서 관찰된 백본 진동 모드가 다음과 같이 할당되었다: β-턴 (1692.3 cm-1), 힌지 루프 (1664.3 cm-1), α-헬릭스 (1657.0 cm-1), β-시트 (1637.5 cm-1), 및 응집 (1611.0 cm-1). 또한, 내부 프로브로서 작용하거나 섭동되는 약한 상호작용의 정보를 제공하는 측쇄 모드는 다음과 같이 할당되었다: Arg (1583.7 cm-1), Asp- (1578.5 cm-1), 및 Glu- (1547.0 cm-1). 1708 cm-1에서의 Phe 측쇄 모드는 단백질에 독점적이고, His (1600.3 cm-1)는 펩티드에 독점적이다.
30-38℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에 도 34a 내지 도 34e의 단백질-펩티드 복합체의 결정화를 위한 사건의 순차적 순서가 표 15에 제시된다.
표 15: 단백질-펩티드 복합체에 대한 사건의 순차적 순서의 요약
단백질은 응집 과정과 관련된 짧은 β-시트 단편 (1637 cm-1)을 함유하는 한편 히스티딘 (His) 측쇄 모드 (1600 cm-1)는 펩티드에 독점적이고, 이는 또한 이 과정에 수반된다. 구체적으로, 펩티드는 펩티드의 중간에 위치하는 3개의 직렬 His 잔기를 갖고, 펩티드에 대한 내부 프로브로서 기능한다. 본원에 기재된 규칙에 따른 2DCOS 비동기성 및 동기성 플롯의 분석은 도 35c에 대해 표 15에 또한 요약된 다음의 사건의 순차적인 분자 순서를 생성한다: 염 가교 상호작용과 연관된, Glu- (1547.0 cm-1), Asp- (1578.5 cm-1) 및 Arg (1583.7 cm-1)를 수반하는 약한 상호작용이 처음에 섭동되고, 이어서, α-헬릭스 (1657.0 cm-1), 및 그후 응집 과정 (1611.0 cm-1)에 관여하는 β-시트 (1637.5 cm-1), 이어서, 펩티드 내의 His 잔기 (1600.3 cm-1)가 섭동된다. 이는 또한 펩티드가 응집 과정에 관여한다는 것을 제시하고; 이어서, 힌지 루프 (1664.3 cm-1), 이어서 β-턴 (1692.3 cm-1), 및 마지막으로 β-턴 내에서 단백질에서 독점적으로 발견되는 Phe 잔기 (1708 cm-1)가 이어진다.
도 34e에 나타낸 바와 같이, 용액 중 단백질-펩티드 복합체 집단의 거동을 결정하기 위해, 선택된 단백질-펩티드 복합체 결정화 스크린을 또한 2DCDS에 의해 분석하였다. 분석은 β-시트 (1637.5 cm-1)를 수반하도록 응집 사건 (1611 cm-1)과 연관된 단백질-펩티드 복합체의 대부분을 지원한다. 또한, α-나선 (1657.0 cm-1) 성분의, Arg (1583.7 cm-1) 측쇄 모드와의 관계가 응집 과정 동안 열 응력에 의해 섭동된 것으로 나타났다.
실시예 8
순수한 재조합 단백질을 현적 결정화에 적용하고, 관심있는 현적의 스크리닝 분취물을 빼내어, 조립된 맞춤 슬라이드 셀 내에 미리 정해진 웰 내에 배치하고, HSI 획득을 위해 QCLM 상에 배치하였다. 도 35a에 나타낸 바와 같이, 0.61 NA, 4.6 um 픽셀 분해능 및 2 mm x 2 mm 영상 영역 (FOV)을 갖는 저배율 대물렌즈를 사용하여 2℃의 온도 간격을 갖는 30 내지 38 ℃의 온도 범위 내에서 HSI 데이터를 수집하였다.
미세결정을 관찰하고, 추가의 검사를 위해 관심 영역을 선택하였다. 다시 한번, 그의 결정 스크리닝 트레이로부터의 이동된 분취물을 30-38℃의 온도 범위 내에서 2 ℃ 증분 간격으로 열 응력 처리하였다. 4분의 온도 평형 후에 HSI 데이터를 수집하였다. 어두운 영역은 열적으로 응력을 받은 단백질 미세결정이다.
도 35b는 차트가 오버레이된 QCL IR 스펙트럼을 나타낸다. 도 35b에는 아미드 I 밴드의 감소된 강도 (1690-1600 cm-1)로부터 관찰되는 바와 같은 부분적 언폴딩을 갖는 아미드 I 및 II 밴드의 QCL IR 오버레이가 있다. QCL IR 스펙트럼은 증진된 SNR을 나타내고, 이는 그의 결정화 용액 0.1M HEPES pH 7.5, 10% w/v PEG 6000, 5% v/v 2-메틸-2,4-펜탄디올 내의 이러한 미세결정의 검사를 가능하게 한다. 도 35c (동기성) 및 도 35d (비동기성)에 제시된 생성된 2D IR 상관관계 플롯은 열 응력 동안 용액 중 단백질과 현저하게 유사하고, 이는 미세결정에서일지라도 그의 거동이 용액 중의 그의 거동과 거의 동등함을 시사한다.
결정화 동안 순수한 재조합 단백질의 분취물을 결정화 스크린 용액 중에 있는 그대로 분석하였다. 열 응력 하에서 획득된 HSI는 T=30-38℃의 온도 범위에서 열적 응력을 받는 미세결정의 증거를 제공하였지만, 2DCOS 분석의 가치는 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 단백질성 성질의 결정의 식별 및 결정화된 단백질이 본원에서 추가로 논의되는 바와 같이 용액 중 단백질과 유사하게 거동한다는 것의 확인이다. 밴드 할당은 β-턴 (1687.0 cm-1), 310-헬릭스 (1675.0 cm-1), α-헬릭스 (1655.0 cm-1), 및 β-시트 (1637.5 cm-1)에 할당된 H2O 중의 백본 진동 모드와 연관되도록 결정되었다. 또한, 내부 프로브로서 작용하는 측쇄 모드가 다음에 할당되었다: 파라-치환된 방향족 측쇄 모드에 대한 Phe (1725.5 및 1709.5 cm-1), His (1606.0 cm-1), Arg (1581.3 cm-1), Asp- (1556.0 cm-1), Glu- (1540.8 cm-1), Tyr (1517.0 cm-1), 및 Trp (1461.0 cm-1).
30-38℃의 온도 범위 내의 열 응력 하에 도 35a 내지 도 35e의 단백질-펩티드 복합체의 결정화를 위한 사건의 순차적 순서가 표 16에 제시된다.
표 16: 단백질-펩티드 복합체에 대한 사건의 순차적 순서의 요약
이러한 분석은 본원에 기재된 규칙에 따른 2DCOS 동기성 및 비동기성 플롯을 기초로 한다: 열 섭동은 N-말단 단부에 위치한 Trp 잔기 (1461.0 cm-1)에서 개시되고, 이어서, β-시트 (1637.5 cm-1), 그후, C-말단 단부 부근에 위치된 His 잔기 (1606.0 cm-1), 그 후, Arg 잔기 (1581.3 cm-1), 이어서, 나선 영역 α-헬릭스 (1655.0 cm-1) 및 310-헬릭스 (1675.0 cm-1), 그후 β-턴 (1687.0 cm-1), 이어서 측쇄 모드 Asp- (1556.0 cm-1), 파라-치환된 방향족 측쇄 모드에 대한 Phe (1725.5 및 1709.5 cm-1), Glu- (1540.8 cm-1) 및 마지막으로 Tyr (1517.0 cm-1)이 이어진다.
도 35e에 제시된 바와 같이, T=30-38℃의 온도 범위에서 용액 내의 단백질 미세결정 집단의 거동을 결정하기 위해 결정화 동안 순수 재조합 단백질을 후속적으로 2DCDS에 의해 분석하였다. 열적 스트레스원은 Tyr 잔기 (1517 cm-1)에 할당된 크로스 피크의 강도 변화로부터 보여지는 바와 같이 단백질의 중간 부분이 더 큰 정도로 섭동되게 하였다. 또한, 용액 중 단백질 대부분 내에서 그의 α-나선 단편 (1655.0 cm-1), C-말단 단부 근처에 위치된 단일 His 잔기 (1606.0 cm-1) 및 N-말단 단부 내에 위치된 Trp (1461.0 cm-1)이 섭동되었다. 마지막으로, 염-가교 상호작용에 관여하는 것으로 추정되는 측쇄 모드, 예컨대, Arg (1581.3 cm-1), Asp- (1556.0 cm-1), 및 Glu- (1540.8 cm-1)도 또한 섭동되었다.
도 35f 및 도 35g에 도시된 바와 같이, (1) 용액 중 (도 35f; T= 24-60 ℃) 및 (2) 결정화 (도 35g; T=30-38℃)에 대한 열 응력 동안의 순수한 재조합 단백질에 대한 2DCOS 비동기성 플롯은 유사한 크로스 피크 패턴을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 단백질의 거동이 유사하다는 것을 시사한다. 이러한 관찰은 강도 및 피크 위치의 유사한 변화로 인한 것이다. 용액 조건 및 온도 범위가 상이함에도 불구하고, 단백질은 유사한 방식으로 거동하고, 따라서 미세결정 내의 단백질이 용액 중 단백질을 대표함을 시사한다.
도 36은 컴퓨팅 디바이스 (예를 들어, 도 4)를 구현하는 예시적인 컴퓨터 시스템을 예시하는 블록도이다. 특정 실시양태에서, 컴퓨터 시스템(1900)은 전용 서버 내에서 또는 다른 엔티티 내로 통합되어, 또는 다수의 엔티티에 걸쳐 분산되어, 하드웨어 또는 소프트웨어 및 하드웨어의 조합을 사용하여 구현될 수 있다.
컴퓨터 시스템(1900)은 정보를 통신하기 위한 버스(1908) 또는 다른 통신 메카니즘, 및 정보를 처리하기 위해 버스(1908)와 결합된 프로세서(1902)를 포함한다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템(1900)은 하나 이상의 프로세서(1902)로 구현될 수 있다. 프로세서(1902)는 범용 마이크로프로세서, 마이크로컨트롤러, 디지털 신호 프로세서(Digital Signal Processor)(DSP), 주문형 집적 회로(Application Specific Integrated Circuit)(ASIC), 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(Field Programmable Gate Array)(FPGA), 프로그램 가능 로직 소자(Programmable Logic Device)(PLD), 제어기, 상태 머신(state machine), 게이티드 로직(gated logic), 이산 하드웨어 컴포넌트(discrete hardware component), 또는 정보의 계산 및/또는 다른 조작을 수행할 수 있는 임의의 다른 적합한 엔티티일 수 있다.
컴퓨터 시스템(1900)은 하드웨어 이외에도, 포함된 메모리(1904), 예컨대 프로세서(1902)에 의해 실행될 정보 및 명령어들을 저장하기 위해 버스(1908)에 결합되는, 랜덤 액세스 메모리(RAM), 플래시 메모리, 판독-전용 메모리(ROM), 프로그램 가능 읽기 전용 메모리(PROM), 소거 가능 PROM(EPROM), 레지스터들, 하드 디스크, 이동식 디스크(removable disk), CD-ROM, DVD, 및/또는 임의의 다른 적합한 저장 디바이스 내에 저장된, 해당 컴퓨터 프로그램에 대한 실행 환경을 생성하는 코드, 예를 들어, 프로세서 펌웨어, 프로토콜 스택, 데이터베이스 관리 시스템, 운영 체제, 또는 그것들 중 하나 이상의 조합을 구성하는 코드를 포함할 수 있다. 프로세서(1902) 및 메모리(1904)는 특수 목적 로직 회로에 의해 보완되거나 그에 포함될 수 있다.
명령어들은 메모리(1904) 내에 저장될 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 따라, 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 제품들, 즉, 컴퓨터 시스템(1900)에 의한 실행을 위해, 또는 컴퓨터 시스템의 동작을 제어하기 위해 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 인코딩된 컴퓨터 프로그램 명령어들의 하나 이상의 모듈들 내에 구현될 수 있고, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 데이터-지향형 언어들(예를 들어, SQL, dBase), 시스템 언어들(예를 들어, C, 오브젝티브-C, C++, 어셈블리), 아키텍처 언어(예를 들어, 자바, .NET) 및/또는 애플리케이션 언어들(예를 들어, PHP, Ruby, Perl, Python)과 같은 컴퓨터 언어들을 포함한다. 명령어들은 또한 어레이 언어들, 양태-지향적(aspect-oriented) 언어들, 어셈블리 언어들, 저작 언어들(authoring languages), 명령줄 인터페이스 언어들(command line interface languages), 컴파일형 언어들, 동시 언어들(concurrent languages), 중괄호(curly-bracket) 언어들, 데이터플로우 언어들, 데이터 구조형 언어들, 서술형 언어들(declarative languages), 에소테릭 언어들(esoteric languages), 확장 언어들, 제4 세대 언어들, 기능적 언어들, 대화형 모드 언어들, 인터프리트형 언어들, 반복성 언어들, 리스트-기반 언어들, 작은 언어들(little languages), 로직-기반 언어들, 머신 언어들, 매크로 언어들, 메타 프로그래밍 언어들, 멀티패러다임 언어들, 수치해석, 비-영어-기반 언어들, 객체-지향 클래스-기반 언어들, 객체-지향 프로토타입 기반 언어들, 오프-사이드(off-side) 규칙 언어들, 절차적 언어들, 반영 언어들(reflective languages), 규칙-기반 언어들, 스크립팅 언어들, 스택-기반 언어들, 동기적 언어들(synchronous languages), 문법 처리 언어들(syntax handling languages), 비주얼 언어들, 워스(wirth) 언어들, 및/또는 xml-기반 언어들과 같은 컴퓨터 언어들로 구현될 수 있다. 메모리(1904)는 또한 프로세서(1902)에 의해 실행되는 명령어들의 실행 동안의 임시 변수 또는 다른 중간 정보를 저장하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 논의된 컴퓨터 프로그램은 반드시 파일 시스템 내의 파일에 상응할 필요는 없다. 프로그램은 다른 프로그램들 또는 데이터(예를 들어, 마크업 언어 문서에 저장된 하나 이상의 스크립트)를 보유하는 파일의 일부분에, 문제의 프로그램에 전용된 단일 파일에, 또는 다수의 통합 파일(coordinated file)(예를 들어, 하나 이상의 모듈, 서브프로그램(subprogram), 또는 코드 부분(portion of code)을 저장하는 파일)에 저장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 하나의 컴퓨터 또는 한 사이트에 위치되거나 다수의 사이트들에 걸쳐 분산되어 있고 통신 네트워크에 의해 상호접속된 다수의 컴퓨터들 상에서 실행되도록 배치될 수 있다. 본원에 설명되는 과정들 및 로직 흐름들은 입력 데이터를 운용하고 출력을 생성하는 것에 의해 기능들을 실행하는 하나 이상의 컴퓨터 프로그램을 실행하는 하나 이상의 프로그램 가능한 프로세서들에 의해 실행될 수 있다.
컴퓨터 시스템(1900)은 정보 및 명령어들을 저장하기 위해 버스(1908)에 결합된 자기 디스크 또는 광학 디스크와 같은 데이터 저장 디바이스(1906)를 더 포함한다. 컴퓨터 시스템(1900)은 입력/출력 모듈(1910)을 통해 다양한 디바이스(예를 들어, 디바이스(1914 및 1916))에 결합될 수 있다. 입력/출력 모듈(1910)은 임의의 입력/출력 모듈일 수 있다. 예시적인 입력/출력 모듈들(1910)은 데이터 포트(예를 들어, USB 포트), 오디오 포트 및/또는 비디오 포트를 포함한다. 일부 실시양태들에서, 입력/출력 모듈(1910)은 통신 모듈을 포함한다. 예시적인 통신 모듈은 이더넷 카드, 모뎀 및 라우터와 같은 네트워킹 인터페이스 카드를 포함한다. 특정 측면에서, 입력/출력 모듈(1910)은 입력 디바이스(1914) 및/또는 출력 디바이스(1916)와 같은 복수의 디바이스들에 접속하도록 구성된다. 예시적인 입력 디바이스들(1914)은 사용자가 컴퓨터 시스템(1900)에 입력을 제공할 수 있게 하는 키보드 및/또는 포인팅 디바이스(예를 들어, 마우스 또는 트랙볼)를 포함한다. 촉각 입력 디바이스, 시각 입력 디바이스, 오디오 입력 디바이스, 및/또는 브레인-컴퓨터 인터페이스 디바이스와 같은 다른 종류의 입력 디바이스들(1914)이 또한 사용되어 사용자와의 상호작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 사용자에게 제공된 피드백은 임의의 형태의 감각 피드백(예를 들어, 시각 피드백, 청각 피드백, 및/또는 촉각 피드백)일 수 있고, 사용자로부터의 입력은, 음향, 발화(speech), 촉각, 및/또는 뇌파 입력을 포함하는 임의의 형태로 수신될 수 있다. 예시적 출력 디바이스(1916)는 사용자에게 정보를 디스플레이하기 위한 음극선관(CRT) 또는 액정 디스플레이(LCD) 모니터와 같은 디스플레이 디바이스들을 포함한다.
특정 실시양태들에 따르면, 클라이언트 디바이스 및/또는 서버는 프로세서(1902)가 메모리(1904)에 포함된 하나 이상의 명령어들의 하나 이상의 시퀀스들을 실행하는 것에 응답하여 컴퓨터 시스템(1900)을 사용하여 구현될 수 있다. 이러한 명령어들은, 데이터 저장 디바이스(1906)와 같은 다른 머신-판독가능 매체로부터 메모리(1904) 내로 판독될 수 있다. 메인 메모리(1904)에 포함된 명령어들의 시퀀스들의 실행은 프로세서(1902)로 하여금 본원에 기재된 프로세스 단계들을 수행하게 한다. 다중-프로세싱 구성에서의 하나 이상의 프로세서는 또한 메모리(1904)에 포함된 명령어들의 시퀀스들을 실행하는 데도 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고정-배선 회로가 본 개시내용의 다양한 측면들을 구현하기 위해 소프트웨어 명령어들 대신에 또는 그들과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 측면들이 하드웨어 회로 및 소프트웨어의 임의의 특정 조합으로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 설명되는 주제의 다양한 측면들은 백엔드 컴포넌트(예를 들어 데이터 서버)를 포함하거나, 미들웨어 컴포넌트(예를 들어 애플리케이션 서버)를 포함하거나, 프론트엔드 컴포넌트(예를 들어 사용자가 본 명세서에서 설명되는 본 발명의 구현과 상호작용할 수 있게 하는 그래픽 사용자 인터페이스 및/또는 웹 브라우저를 갖는 클라이언트 컴퓨터)를 포함하거나, 하나 이상의 그러한 백엔드, 미들웨어 또는 프론트엔드 컴포넌트의 임의의 조합을 포함하는 컴퓨팅 시스템에서 구현될 수 있다. 시스템(1900)의 컴포넌트들은 디지털 데이터 통신의 임의의 형태 또는 매체(예를 들어, 통신 네트워크)에 의해 상호접속될 수 있다. 통신 네트워크들의 예들은 근거리 네트워크 및 광역 네트워크를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "머신-판독가능 저장 매체" 또는 "컴퓨터 판독가능 매체"는 실행을 위해 명령어들을 프로세서(1902)에 제공하는 데 참여하는 임의의 매체 또는 매체들을 지칭한다. 그러한 매체는 비-휘발성 매체, 휘발성 매체, 및 전달 매체를 포함한 많은 형태를 취할 수 있지만, 그것들로 제한되지는 않는다. 비-휘발성 매체는, 예를 들면 데이터 저장 디바이스(1906)와 같은 광 또는 자기 디스크를 포함한다. 휘발성 매체들은, 메모리(1904)와 같은 동적 메모리를 포함한다. 전달 매체들은, 버스(1908)를 포함하는 와이어들을 포함하는 동축 케이블들, 구리 와이어, 및 광 섬유들을 포함한다. 일반적인 형태의 머신-판독가능 매체들은 예를 들어 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, DVD, 임의의 다른 광학 매체, 천공 카드, 종이 테이프, 구멍의 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 매체, RAM, PROM, EPROM, 플래시 EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 또는 컴퓨터가 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 머신-판독가능 저장 매체는 머신-판독가능 저장 디바이스, 머신-판독가능 저장 기판, 메모리 디바이스, 머신-판독가능 전파된 신호를 달성하는 물질의 조성, 또는 이들 중 하나 이상의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로세서"는 하나 이상의 프로세서를 포함할 수 있고, "모듈"은 하나 이상의 모듈을 포함할 수 있다.
본 기술의 측면에서, 머신-판독가능 매체는 명령어를 갖는 인코딩되거나 저장되는 컴퓨터-판독가능 매체이고, 명령어와 나머지 시스템 사이의 구조적 및 기능적 관계들을 정의하는 컴퓨팅 요소이며, 이는 명령어의 기능성이 실현되는 것을 허용한다. 명령어는, 예를 들어, 시스템에 의해 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능할 수 있다. 명령어들은 예를 들어 코드를 포함하는 컴퓨터 프로그램일 수 있다. 머신-판독가능 매체는 하나 이상의 매체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, 단어 "모듈"은 하드웨어 또는 펌웨어로 구현되는 로직, 또는 예를 들어 C++와 같은 프로그래밍 언어로 작성되는, 가능하게는 진입 및 출구 포인트들을 갖는 소프트웨어 명령어들의 집합을 지칭한다. 소프트웨어 모듈은 컴파일되어, 동적 링크 라이브러리 내에 설치된 실행가능 프로그램으로 링크될 수 있거나, BASIC과 같은 해석 언어로 작성될 수 있다. 소프트웨어 모듈들은 다른 모듈들 또는 그들 자체로부터 호출가능할 수 있고/있거나, 검출된 사건들 또는 인터럽트들에 응답하여 호출될 수 있다는 점이 이해될 것이다. 소프트웨어 명령어들은 펌웨어, 예컨대 EPROM 또는 EEPROM에 내장될 수 있다. 하드웨어 모듈들은 연결된 로직 유닛들, 예컨대 게이트들 및 플립플롭들로 구성될 수 있고/있거나, 프로그램가능 유닛들, 예컨대 프로그램가능 게이트 어레이들 또는 프로세서들로 구성될 수 있다는 점이 더 이해될 것이다. 본원에 기재된 모듈들은 바람직하게는 소프트웨어 모듈들로서 구현되지만, 하드웨어 또는 펌웨어로 표현될 수 있다.
모듈은 더 적은 수의 모듈로 통합될 수 있다고 고려된다. 하나의 모듈은 또한 다수의 모듈로 분리될 수 있다. 기재된 모듈은 하드웨어, 소프트웨어, 펌웨어 또는 그의 임의의 조합으로서 구현될 수 있다. 또한, 기재된 모듈은 유선 또는 무선 네트워크 또는 인터넷을 통해 접속된 상이한 위치들에 상주할 수 있다.
일반적으로, 프로세서들은 예로서, 본원에 기재된 바와 같이 동작하는 데이터 및 명령어를 나타내는 컴퓨터, 프로그램 로직, 또는 다른 기판 구성을 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 다른 실시양태에서, 프로세서는 제어기 회로, 프로세서 회로, 프로세서, 범용 단일 칩 또는 멀티칩 마이크로프로세서, 디지털 신호 프로세서, 임베디드 마이크로프로세서, 마이크로컨트롤러 등을 포함할 수 있다.
게다가, 일 실시양태에서, 프로그램 로직은 하나 이상의 컴포넌트로서 유리하게 구현될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 컴포넌트는 유리하게는 하나 이상의 프로세서 상에서 실행하도록 구성될 수 있다. 컴포넌트들은 소프트웨어 또는 하드웨어 컴포넌트, 모듈 예컨대 소프트웨어 모듈, 객체-지향 소프트웨어 컴포넌트, 클래스 컴포넌트 및 태스크 컴포넌트, 프로세스 방법, 기능, 속성, 프로시저, 서브루틴, 프로그램 코드 단편, 드라이버, 펌웨어, 마이크로코드, 회로, 데이터, 데이터베이스, 데이터 구조, 표, 어레이, 및 변수를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본원에 개시된 실시양태는 다음을 포함한다:
A. 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 나타내는 데이터를 처리하기 위한 방법으로서, 이 방법은 적용된 섭동과 관련하여 화합물의 스펙트럼 데이터를 획득하는 단계; 2차원 상관관계 (2DCOS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 상관관계 플롯을 생성하는 단계; 동기성 상관관계 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하는 단계; 및 크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하는 단계를 포함한다.
B. 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 나타내는 데이터를 처리하기 위한 시스템으로서, 이 시스템은 적용된 섭동과 관련하여 화합물의 스펙트럼 데이터를 수득하도록 구성되는 데이터 획득 모듈; 및 상관관계 분석 모듈을 포함하고, 상관관계 분석 모듈은 2차원 상관관계 (2DCOS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 상관관계 플롯을 생성하고; 동기성 상관관계 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하고; 크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하도록 구성된다.
C. 명령어를 포함하는 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체로서, 상기 명령어는 하나 이상의 컴퓨터에 의해 실행될 때, 하나 이상의 컴퓨터로 하여금 적용된 섭동과 관련하여, 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 스펙트럼 데이터를 획득하고, 2차원 상관관계 (2DCOS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 상관관계 플롯을 생성하고; 동기성 상관관계 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하고; 크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하게 한다.
D. 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 나타내는 데이터를 처리하기 위한 방법으로서, 이 방법은 적용된 섭동과 관련하여 화합물의 스펙트럼 데이터를 획득하는 단계; 2차원 공동-분포 (2DCDS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 비동기성 공동-분포 플롯을 생성하는 단계; 비동기성 공동-분포 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하는 단계; 및 크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하는 단계를 포함한다.
E. 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 나타내는 데이터를 처리하기 위한 시스템으로서, 이 시스템은 적용된 섭동과 관련하여 화합물의 스펙트럼 데이터를 수득하도록 구성되는 데이터 획득 모듈; 및 상관관계 분석 모듈을 포함하고, 상관관계 분석 모듈은 2차원 공동-분포 (2DCDS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 비동기성 공동-분포 플롯을 생성하고; 비동기성 공동-분포 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하고; 크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하도록 구성된다.
F. 명령어를 포함하는 비일시적 컴퓨터-판독가능 매체로서, 상기 명령어는 하나 이상의 컴퓨터에 의해 실행될 때, 하나 이상의 컴퓨터로 하여금 적용된 섭동과 관련하여, 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 스펙트럼 데이터를 획득하고, 2차원 공동-분포 (2DCDS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 비동기성 공동-분포 플롯을 생성하고; 비동기성 공동-분포 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하고; 크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하게 한다.
실시양태 A, B, C, D, E 및 F 각각은 하기의 추가의 요소들 중 하나 이상을 임의의 조합으로 가질 수 있다:
요소 1:
상기 식별된 피크 강도를 사용하여 강도 변화가 관찰되는 온도 범위를 결정하는 것.
요소 2:
상기 응집 과정의 강도 한계를 규정하고, 각각의 강도 값과 상기 한계 내의 가장 큰 강도 값 사이의 비에 의해 규정되는 상기 강도 한계 내의 각각의 강도 값에 대한 분율 값을 결정하는 것.
요소 3:
응집 과정에 존재하는 각각의 피크에 대해 상기 한계에 의해 규정된 바와 같은 초기 및 최종 분율 값을 식별하고; 적어도 상기 초기 및 최종 분율 값에 기초하여 응집의 양을 결정하는 것.
요소 4:
결정화의 특성이 화합물의 핵형성으로부터 결정 형태로의 전이에 기초하는 것.
요소 5:
결정화의 특성을 결정하는 것이 결정화의 특성을 적용된 섭동과 관련하여 스펙트럼 강도의 분포된 존재의 순서와 비교하는 것을 포함하는 것.
요소 6:
결정화의 특성을 결정하는 것이 핵형성 사건의 조건을 결정하는 것을 포함하는 것.
요소 7:
결정화의 특성을 결정하는 것이 화합물과 그의 환경과의 감소된 수소 결합 상호작용을 검출함으로써 결정화로 인한 탈수 사건을 평가하는 것을 포함하는 것.
요소 8:
결정화의 특성을 결정하는 것이 화합물 내의 진동 모드를 결정하는 것을 포함하는 것.
요소 9:
크로스 피크를 사용하는 것이, 2개의 파수 v1 및 v2에 대해, 2개의 파수에 상응하는 크로스 피크가 양의 값을 갖는지 여부를 결정하고; 크로스 피크가 양의 값을 갖는 경우, v1에서의 스펙트럼 강도의 존재가, v2에서의 스펙트럼 강도의 존재가 분포되는 간격보다 더 낮은 적용된 섭동의 간격 내에 분포된다고 결정하는 것을 포함하는 것.
요소 10:
크로스 피크를 사용하는 것이, 2개의 파수 v1 및 v2에 대해, 2개의 파수에 상응하는 크로스 피크가 음의 값을 갖는지 여부를 결정하고; 크로스 피크가 음의 값을 갖는 경우, v2에서의 스펙트럼 강도의 존재가, v1에서의 스펙트럼 강도의 존재가 분포되는 간격보다 더 낮은 적용된 섭동의 간격 내에 분포된다고 결정하는 것을 포함하는 것.
요소 11:
스펙트럼 데이터가 FT-IR 스펙트럼 데이터인 것.
요소 12:
비동기성 공동-분포 플롯에서 비동기성 공동-분포 강도가 2개의 스펙트럼 신호의 분포에서의 차이로서 표현되는 것.
요소 13:
적용된 섭동이 시간, 온도, 농도 또는 압력인 것.
요소 14:
2차원 공동-분포 (2DCDS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 공동-분포 플롯을 생성하는 것.
요소 15:
동기성 공동-분포 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 동기성 공동-분포 피크를 식별하는 것.
요소 16:
동기성 공동-분포 피크를 사용하여, 적용된 섭동에 대하여 스펙트럼 강도에 대한 분포 패턴의 중첩 정도를 결정하는 것.
요소 17:
동기성 공동-분포 피크를 사용하는 것이, 2개의 파수 v1 및 v2에 대해, 2개의 파수에 상응하는 동기성 공동-분포 피크가 범위 내에 있는지를 결정하는 것을 포함하는 것.
요소 18:
2차원 상관관계 (2DCOS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 상관관계 플롯 및 비동기성 상관관계 플롯을 생성하는 것.
요소 19:
동기성 상관관계 플롯에서, 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 양의 크로스 피크를 식별하는 것.
요소 20:
스펙트럼 데이터의 식별된 피크 강도를 사용하여 화합물의 응집의 양을 결정하는 것.
요소 21:
화합물의 응집의 양을 적용된 섭동과 관련하여 스펙트럼 강도의 분포된 존재의 순서와 비교하는 것.
요소 22:
스펙트럼 데이터를 획득하는 것이 화합물을 함유하는 샘플에 대해 QCL 적외선 분광분석법을 수행하는 것을 포함하는 것.
요소 23:
미립자 및 용액을 구별하기 위해 관심 영역을 인식하는 것.
요소 24:
미립자의 집단 분포를 확인하기 위해 미립자의 크기 및 수를 결정하는 것.
요소 25:
스펙트럼 데이터를 분석하여 신호 대 잡음 비를 검증하고, 기준선 보정을 수행하고, 수증기 함량을 결정하고 및/또는 스펙트럼 영역 내에서 신호 강도를 결정하는 것.
요소 26:
샘플의 섭동에 기초하여 공분산 또는 동적 스펙트럼 데이터를 생성하는 것.
요소 27:
동기성 플롯에서 수득된 바와 같은 서로 동일 위상에 있는 스펙트럼 데이터 내의 피크 강도들을 포함하는 변화들을 상관시키는 것.
요소 28:
스펙트럼 데이터에서 변화하는 요소를 결정하는 것.
요소 29:
스펙트럼 데이터에서 전체적인 가장 큰 강도 변화를 결정하는 것.
요소 30:
스펙트럼 데이터에서 전체적인 가장 작은 강도 변화를 결정하는 것.
요소 31:
밴드에서 기저 스펙트럼 기여도의 최소 수를 결정하고, 곡선 피팅 분석을 수행하고, 샘플의 2차 구조 조성물을 결정하는 것.
요소 32:
스펙트럼 데이터의 분해능을 증진시키는 것.
요소 33:
비동기성 플롯에서 수득된 바와 같은 서로 위상차를 갖는 스펙트럼 데이터 내의 피크 강도들을 포함하는 변화들을 상관시키는 것.
요소 34:
화합물 내 아미노산 측쇄의 탈아미노화의 존재 및/또는 정도를 결정하는 것.
요소 35:
화합물 내의 도메인의 안정성을 결정하는 것.
요소 36:
디스플레이를 위한 하나 이상의 플롯을 생성하기 위한 시각적 모델 발생기.
요소 37:
인간 인터페이스를 포함하는 인간 상호작용 모듈.
요소 38:
데이터 획득 모듈이 양자 캐스케이드 레이저 현미경을 포함하는 것.
상기 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본원에 설명된 다양한 구성을 실시하는 것을 가능하게 하도록 제공된다. 본 기술은 다양한 도면 및 구성을 참조하여 구체적으로 설명되었지만, 이들은 단지 예시를 위한 것이고, 본 기술의 범주를 한정하는 것으로서 취해져서는 안된다는 것이 이해되어야 한다.
본 기술을 구현하기 위한 다수의 다른 방식이 존재할 수도 있다. 본원에 설명된 다양한 기능 및 요소는 본 기술의 범주로부터 벗어나지 않고 개시된 것들과는 상이하게 분할될 수도 있다. 이들 구성의 다양한 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 즉시 명백할 것이고, 본원에 규정된 일반적인 원리는 다른 구성에 적용될 수도 있다. 따라서, 다수의 변경 및 변형이 본 기술의 범주로부터 벗어나지 않고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 본 기술에 대해 이루어질 수도 있다.
개시된 과정의 단계들의 특정 순서 또는 계층은 예시적인 접근법의 예시라는 것이 이해된다. 설계 선호도에 기초하여, 과정의 단계들의 특정 순서 또는 계층은 재배열될 수도 있다는 것이 이해된다. 단계들의 몇몇은 동시에 수행될 수도 있다. 첨부된 방법 청구범위는 샘플 순서의 다양한 단계들의 요소를 제시하고, 제시된 특정 순서 또는 계층에 한정되도록 의도된 것은 아니다.
본원에 사용될 때, 임의의 항목들을 분리하기 위해 용어 "및" 또는 "또는"을 갖고, 일련의 항목들에 선행하는 구문 "~중 적어도 하나"는 목록의 각각의 멤버(즉, 각각의 아이템)보다는 전체로서 목록을 수식한다. 어구 "적어도 하나"는 열거된 각각의 항목 중 적어도 하나의 선택을 필요로 하지 않으며, 오히려, 상기 어구는 항목들 중 어느 하나의 적어도 하나, 및/또는 항목들 중 임의의 조합 중 적어도 하나, 및/또는 각각의 항목 중 적어도 하나를 포함하는 의미를 허용한다. 예로서, 어구 "A, B, 및 C 중 적어도 하나" 또는 "A, B 또는 C 중 적어도 하나"는 각각 단지 A, 단지 B, 또는 단지 C; A, B, 및 C의 임의의 조합; 및/또는 각각의 A, B, 및 C 중 적어도 하나를 지칭한다.
"상부", "하부", "전방", "후방" 등과 같은 용어는 본 개시내용에 사용될 때, 일반적인 중력 기준 프레임보다는, 임의적인 기준 프레임을 참조하는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 상부면, 하부면, 정면 및 후면은 중력 기준 프레임에서 상향으로, 하향으로, 대각선으로 또는 수평으로 연장할 수도 있다.
더욱이, 용어 "구비한다", "갖는다" 등이 상세한 설명 또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어는 "포함한다"가 청구항 내의 전환 어구로서 이용될 때 해석되는 바와 같이 용어 "포함한다"와 유사한 방식으로 포함적인 것으로 의도된다.
단어 "예시적인"은 본원에서 "예, 실례 또는 예시로서 기능하는 "을 의미하도록 사용된다. 본원에 "예시적인" 것으로서 설명된 임의의 실시양태는 반드시 다른 실시양태에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 해석되는 것은 아니다.
단수형의 요소의 언급은 구체적으로 언급되지 않으면, "하나 및 단지 하나"를 의미하도록 의도된 것은 아니고, 오히려 "하나 이상"을 의미한다. 남성 대명사(예를 들어, 그)는 여성 및 중성(예를 들어, 그녀 및 그)을 포함하고, 그 반대도 마찬가지이다. 용어 "여러"은 하나 이상을 나타낸다. 밑줄친 및/또는 이탤릭체로 나타낸 표제 및 부표제는 단지 편의상 사용된 것이고, 본 기술을 한정하지 않고, 본 기술의 설명의 해석과 관련하여 언급된 것은 아니다. 관련 기술분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있거나 이후에 공지될 본 개시내용 전반에 걸쳐 설명된 다양한 구성의 요소에 대한 모든 구조 및 기능적 등가물은 본원에 참조로서 명시적으로 합체되어 있고, 본 기술에 의해 포함되도록 의도된다. 더욱이, 이러한 개시내용이 상기 설명에서 명시적으로 언급되어 있는지 여부에 무관하게 본원에 개시된 어느 것도 공중에게 헌정되도록 의도된 것은 아니다.
본 기술의 특정 측면 및 실시양태가 설명되었지만, 이들은 단지 예로서 제시된 것이고, 본 기술의 범주를 한정하도록 의도된 것은 아니다. 실제로, 본원에 설명된 신규한 방법 및 시스템은 그 사상으로부터 벗어나지 않고 다양한 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 첨부된 청구범위 및 이들의 등가물은 본 기술의 범주 및 사상 내에 있는 이러한 형태 또는 변형을 커버하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> PROTEIN DYNAMIC SOLUTIONS LLC
<120> METHOD AND SYSTEM FOR ANALYSIS OF CRYSTALS AND CRYSTALLIZATION
<130> 098210-0024
<140>
<141>
<150> 62/518,376
<151> 2017-06-12
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 1
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys His His
100 105 110
His His His His Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
115 120 125
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 2
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
1 5
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 3
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys His His His His His His Gly Asp Tyr
100 105 110
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
115
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 4
Pro Ser Val Phe Cys Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
85 90 95
Cys Thr Ile Ser Lys Ala Lys His His His His His His Gly Asp Tyr
100 105 110
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
115
<210> 5
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 5
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 6
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 583
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 7
Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val Lys Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser His Ala Gly Cys Glu Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Glu Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu
100 105 110
Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala
115 120 125
Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg
130 135 140
His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr
145 150 155 160
Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys Gln Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys
165 170 175
Leu Leu Pro Lys Ile Glu Thr Met Arg Glu Lys Val Leu Thr Ser Ser
180 185 190
Ala Arg Gln Arg Leu Arg Cys Ala Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg
195 200 205
Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys
210 215 220
Ala Glu Phe Val Glu Val Thr Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val
225 230 235 240
His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg
245 250 255
Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Asp Asn Gln Asp Thr Ile Ser Ser
260 265 270
Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys
275 280 285
Ile Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala Ile Pro Glu Asn Leu Pro Pro Leu
290 295 300
Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu
305 310 315 320
Ala Lys Asp Ala Phe Leu Gly Ser Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg
325 330 335
His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr
340 345 350
Glu Ala Thr Leu Glu Glu Cys Cys Ala Lys Asp Asp Pro His Ala Cys
355 360 365
Tyr Ser Thr Val Phe Asp Lys Leu Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gln
370 375 380
Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Asp Gln Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr
385 390 395 400
Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val Arg Tyr Thr Arg Lys Val Pro Gln
405 410 415
Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val
420 425 430
Gly Thr Arg Cys Cys Thr Lys Pro Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr
435 440 445
Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu
450 455 460
Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu
465 470 475 480
Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr
485 490 495
Val Pro Lys Ala Phe Asp Glu Lys Leu Phe Thr Phe His Ala Asp Ile
500 505 510
Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu
515 520 525
Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu Lys
530 535 540
Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala
545 550 555 560
Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Val
565 570 575
Ser Thr Gln Thr Ala Leu Ala
580
<210> 8
<211> 129
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
Lysozyme sequence
<400> 8
Lys Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu Ala Ala Ala Met Lys Arg His Gly
1 5 10 15
Leu Asp Asn Tyr Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp Val Cys Ala Ala
20 25 30
Lys Phe Glu Ser Asn Phe Asn Thr Gln Ala Thr Asn Arg Asn Thr Asp
35 40 45
Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Leu Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp Cys
50 55 60
Asn Asp Gly Arg Thr Pro Gly Ser Arg Asn Leu Cys Asn Ile Pro Cys
65 70 75 80
Ser Ala Leu Leu Ser Ser Asp Ile Thr Ala Ser Val Asn Cys Ala Lys
85 90 95
Lys Ile Val Ser Asp Gly Asn Gly Met Asn Ala Trp Val Ala Trp Arg
100 105 110
Asn Arg Cys Lys Gly Thr Asp Val Gln Ala Trp Ile Arg Gly Cys Arg
115 120 125
Leu
Claims (42)
- 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 나타내는 데이터를 처리하는 방법이며,
적용된 섭동과 관련하여 화합물의 스펙트럼 데이터를 획득하는 단계;
2차원 상관관계 (2DCOS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 상관관계 플롯을 생성하는 단계;
동기성 상관관계 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하는 단계; 및
크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 결정화의 특성은 화합물의 핵형성으로부터 결정 형태로의 전이에 기초하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 결정화의 특성을 결정하는 단계는 결정화의 특성을 적용된 섭동과 관련하여 스펙트럼 강도의 분포된 존재의 순서와 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 결정화의 특성을 결정하는 단계는 핵형성 사건의 조건을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 결정화의 특성을 결정하는 단계는 화합물과 그의 환경과의 감소된 수소 결합 상호작용을 검출함으로써 결정화로 인한 탈수 사건을 평가하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 결정화의 특성을 결정하는 단계는 화합물 내의 진동 모드를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 식별된 피크 강도를 사용하여 강도 변화가 관찰되는 온도 범위를 결정하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 응집 과정의 강도 한계를 규정하는 단계, 및 각각의 강도 값과 상기 한계 내의 가장 큰 강도 값 사이의 비에 의해 규정되는 상기 강도 한계 내의 각각의 강도 값에 대한 분율 값을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 응집 과정에 존재하는 각각의 피크에 대해 상기 한계에 의해 규정된 바와 같은 초기 및 최종 분율 값을 식별하는 단계; 및 적어도 상기 초기 및 최종 분율 값에 기초하여 응집의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 나타내는 데이터를 처리하는 시스템이며,
시스템은
적용된 섭동과 관련하여 화합물의 스펙트럼 데이터를 획득하도록 구성되는 데이터 획득 모듈; 및
상관관계 분석 모듈을 포함하고,
상관관계 분석 모듈은
2차원 상관관계 (2DCOS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 상관관계 플롯을 생성하고;
동기성 상관관계 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하고;
크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하도록 구성되는 것인 시스템. - 제10항에 있어서, 디스플레이를 위한 하나 이상의 플롯을 생성하기 위한 시각적 모델 발생기를 더 포함하는 시스템.
- 제10항에 있어서, 인간 인터페이스를 포함하는 인간 상호작용 모듈을 더 포함하는 시스템.
- 제10항에 있어서, 데이터 획득 모듈은 양자 캐스케이드 레이저 현미경을 포함하는 것인 시스템.
- 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 나타내는 데이터를 처리하는 방법이며,
적용된 섭동과 관련하여 화합물의 스펙트럼 데이터를 획득하는 단계;
2차원 공동-분포 (2DCDS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 비동기성 공동-분포 플롯을 생성하는 단계;
비동기성 공동-분포 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하는 단계; 및
크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 제14항에 있어서, 크로스 피크를 사용하는 단계는
2개의 파수(v 1 및 v 2 )에 대해, 2개의 파수에 상응하는 크로스 피크가 양의 값을 갖는지 여부를 결정하는 단계, 및
크로스 피크가 양의 값을 갖는 경우, v 1에서의 스펙트럼 강도의 존재가, v 2에서의 스펙트럼 강도의 존재가 분포되는 간격보다 더 낮은 적용된 섭동의 간격 내에 분포된다고 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제14항에 있어서, 크로스 피크를 사용하는 단계는
2개의 파수(v 1 및 v 2 )에 대해, 2개의 파수에 상응하는 크로스 피크가 음의 값을 갖는지 여부를 결정하는 단계, 및
크로스 피크가 음의 값을 갖는 경우, v 2에서의 스펙트럼 강도의 존재가, v 1에서의 스펙트럼 강도의 존재가 분포되는 간격보다 더 낮은 적용된 섭동의 간격 내에 분포된다고 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제14항에 있어서, 스펙트럼 데이터가 FT-IR 스펙트럼 데이터인 방법.
- 제14항에 있어서, 비동기성 공동-분포 플롯에서 비동기성 공동-분포 강도는 2개의 스펙트럼 신호의 분포에서의 차이로서 표현되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 적용된 섭동이 시간, 온도, 농도 또는 압력인 방법.
- 제14항에 있어서,
2차원 공동-분포 (2DCDS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 공동-분포 플롯을 생성하는 단계;
동기성 공동-분포 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 동기성 공동-분포 피크를 식별하는 단계; 및
동기성 공동-분포 피크를 사용하여, 적용된 섭동에 대하여 스펙트럼 강도에 대한 분포 패턴의 중첩 정도를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제14항에 있어서, 동기성 공동-분포 피크를 사용하는 단계는, 2개의 파수(v 1 및 v 2)에 대해, 2개의 파수에 상응하는 동기성 공동-분포 피크가 범위 내에 있는지를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서,
2차원 상관관계 (2DCOS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 동기성 상관관계 플롯 및 비동기성 상관관계 플롯을 생성하는 단계;
동기성 상관관계 플롯에서, 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 양의 크로스 피크를 식별하는 단계; 및
스펙트럼 데이터의 식별된 피크 강도를 사용하여 화합물의 응집의 양을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제22항에 있어서, 화합물의 응집의 양을 적용된 섭동과 관련하여 스펙트럼 강도의 분포된 존재의 순서와 비교하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 스펙트럼 데이터를 획득하는 단계는 화합물을 함유하는 샘플에 대해 QCL 적외선 분광분석법을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 미립자 및 용액을 구별하기 위해 관심 영역을 인식하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 미립자의 집단 분포를 확인하기 위해 미립자의 크기 및 수를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 스펙트럼 데이터를 분석하여 신호 대 잡음 비를 검증하는 단계, 기준선 보정을 수행하는 단계, 수증기 함량을 결정하는 단계 및/또는 스펙트럼 영역 내에서 신호 강도를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 샘플의 섭동에 기초하여 공분산 또는 동적 스펙트럼 데이터를 생성하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 동기성 플롯에서 수득된 바와 같은 서로 동일 위상에 있는 스펙트럼 데이터 내의 피크 강도들을 포함하는 변화들을 상관시키는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 스펙트럼 데이터에서 변화하는 요소를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 스펙트럼 데이터에서 전체적인 가장 큰 강도 변화를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 스펙트럼 데이터에서 전체적인 가장 작은 강도 변화를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 밴드에서 기저 스펙트럼 기여도의 최소 수를 결정하는 단계, 곡선 피팅 분석을 수행하는 단계, 및 샘플의 2차 구조 조성을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 스펙트럼 데이터의 분해능을 증진시키는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 비동기성 플롯에서 수득된 바와 같은 서로 위상차를 갖는 스펙트럼 데이터 내의 피크 강도들을 포함하는 변화들을 상관시키는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 화합물 내 아미노산 측쇄의 탈아미노화의 존재 및/또는 정도를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 화합물 내의 도메인의 안정성을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 결정질 상태의 및/또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 나타내는 데이터를 처리하는 시스템이며,
시스템은
적용된 섭동과 관련하여 화합물의 스펙트럼 데이터를 획득하도록 구성되는 데이터 획득 모듈; 및
상관관계 분석 모듈을 포함하고,
상관관계 분석 모듈은
2차원 공동-분포 (2DCDS) 분석을 적용하여 화합물에 대한 비동기성 공동-분포 플롯을 생성하고;
비동기성 공동-분포 플롯에서 화합물의 응집과 연관된 오토 피크와 상관되는 크로스 피크를 식별하고;
크로스 피크를 사용하여 화합물의 결정화의 특성을 결정하도록 구성되는 것인 시스템. - 제38항에 있어서, 디스플레이를 위한 하나 이상의 플롯을 생성하기 위한 시각적 모델 발생기를 더 포함하는 시스템.
- 제38항에 있어서, 인간 인터페이스를 포함하는 인간 상호작용 모듈을 더 포함하는 시스템.
- 제38항에 있어서, 데이터 획득 모듈은 양자 캐스케이드 레이저 현미경을 포함하는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제9항 및 제14항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 비-결정질 생리학적 상태에서 동일한 화합물의 동일한 특성을 나타내는 데이터를 처리하는 단계 및 결정질 상태의 또는 결정화를 겪는 화합물의 특성을 비-결정질 생리학적 상태의 화합물의 특성과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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