KR20200036824A - 바이오센서의 효소 용액 제조 방법 - Google Patents

바이오센서의 효소 용액 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오센서용 효소 용액에 관한 것으로, 보다 구체적으로 타우린을 포함함으로써 경시 안정성이 현저하게 향상된 바이오센서용 효소 용액 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오센서용 효소 용액은 시간이 흐름에 따른 바이오센서의 품질 저하를 효과적으로 방지할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오센서용 효소 용액은 시간이 흐름에 따라 비특이적으로 환원되는 철이온 함유 매개체를 사용하더라도 바이오센서의 품질을 안정화시킬 수 있고, 이러한 저렴한 매개체를 사용함으로써 비용 절감 효과를 가져온다.

Description

바이오센서의 효소 용액 제조 방법{Method for manufacturing enzyme solution in biosensor}
본 발명은 바이오센서용 효소 용액에 관한 것으로, 보다 구체적으로 경시 안정성이 현저하게 향상된 바이오센서용 효소 용액 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
바이오센서는 생물학적 요소와 물리화학적 탐지기를 결합하여 물질의 성질 등을 조사하는 분석 시스템을 말한다. 바이오센서의 일 예로 혈당측정시스템이 있으며, 이는 혈당측정기, 센서 스트립, 및 채혈디바이스로 구성된다. 혈당측정시스템은 혈액에 존재하는 포도당이 글루코오스 산화효소(glucose oxidase) 또는 글루코오스 탈수소효소(glucoside hydrogenase)와 반응하여 발생한 전자를 수용체(receptor)가 받아, 이를 색, 형광, 또는 전기적 신호 등과 같이 인식 가능한 신호로 변환시킴으로써 혈당 수치를 나타내는 시스템이다.
이러한 혈당측정시스템에는 효소 외에 효소로부터 발생한 전자를 전극까지 원활하고 빠르게 전달하기 위한 매개체(mediator)가 포함된다. 혈당측정시스템에 있어서, 효소와 포도당의 반응으로 인하여 발생한 전자를 매개체가 받은 후 이를 다시 전극이 받는 형태로 혈당을 측정하기 때문에, 매개체의 안정성은 곧 혈당측정시스템과 이를 포함하는 개념인 바이오센서의 품질 안정성으로 이어지는 매우 중요한 요소이다.
종래에 매개체로 통상적으로 이용되고 있는 철이온(Fe2+/Fe3+)을 함유하는 물질은 매개체로서의 전자전달 능력은 뛰어나지만, 불안정성으로 인해 온도, 습도, 또는 시간 등에 의해 많은 제약을 받으며, 비특이적 환원반응으로 인하여 측정값이 증가하는 단점이 있다. 상기 단점을 해결하고자 고안된 방법 중에는 매개체를 안정한 루테늄(Ruthenium) 계열 물질로 바꾸는 방법(대한민국 특허공개 제10-2017-0010698호) 등이 있으나, 이 경우 Fe2+/Fe3+를 함유하는 물질에 비해 많은 비용이 소요되는 문제점이 있다. 또한 글루코오스 탈수소효소(glucose dehydrogenase) 및 루테늄의 느린 전자전달 속도로 인한 문제를 해결하기 위해, 다른 매개체가 추가적으로 필요하므로 품질 및 원가 경쟁력이 낮아질 수 있다. 상기 외에, 혈당측정시스템에 적절한 농도의 효소 안정제를 첨가하는 방법이 있으며, 이러한 효소 안정제로는 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA) 등이 사용될 수 있다.
바이오센서에 사용되는 효소 용액에 있어서, 시간의 지남에 따른 효소의 활성 저해 문제 와 매개체의 비특이적 환원반응 문제가 해결된, 품질 안정성이 장기간 유지될 수 있는 바이오센서용 효소 용액의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 철이온(Fe2+/Fe3+)을 함유하는 매개체를 포함하면서 품질 안정성이 장기간 유지될 수 있는 바이오센서용 효소 용액을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 철이온을 함유하는 매개체를 포함하면서 품질 안정성이 장기간 유지될 수 있는 바이오센서용 효소 용액의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 타우린을 포함하는 바이오센서용 효소 용액 조성물을 제공한다. 본 발명의 발명자들은 바이오센서용 효소 용액에 있어서, 철이온(Fe2+/Fe3+)을 함유하는 매개체의 불안정성을 극복하고, 효소 용액의 활성을 장기간 유지시키기 위해 예의 연구 노력한 결과, 바이오센서용 효소 용액에 타우린을 포함하는 경우 효소 용액의 경시 안정성이 현저하게 향상되는 놀라운 발견을 하여 본 발명을 완성하게 되었다.
종래 기술에 있어서, 바이오센서 내에 포함되는 효소는 시간이 지남에 따라 효소 활성도가 감소되므로, 경시에 따라 측정된 결과 값이 부정확한 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 철이온(Fe2+/Fe3+)을 함유하는 매개체도 시간이 지날수록 비특이적으로 환원되는데, 예를 들어 철이온을 함유하는 매개체를 산화시켜 혈당을 측정하는 혈당측정시스템에서는 혈액 중 포도당 이외의 영향으로 매개체가 환원되어 혈당 측정값이 부정확해지는 문제점이 발생할 수 있다. 즉, 바이오센서용 효소 용액 내에서, 매개체는 시간이 지날수록 비특이적으로 환원되어 측정값이 증가되는 반면, 효소는 시간이 지날수록 활성이 감소되어 측정값이 감소되는 문제가 발생할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 바이오센서용 효소 용액이 타우린을 포함할 때, 시간의 흐름에 따른 매개체의 비특이적 환원에 의한 영향 및 효소 활성의 저해와 같은 문제점이 해결되어, 바이오센서용 효소 용액의 품질 안정성이 장기간 유지되는 놀라운 발견을 하였다.
또한, 본 발명의 발명자들은 타우린을 특정한 함량 범위로 사용하는 경우 효소 용액의 경시 안정성이 현저하게 향상되는 것을 발견하였다. 구체적으로, 본 발명에 있어서, 상기 타우린은 효소 용액 조성물의 총 중량 대비 0.06~0.35 중량%, 바람직하게 0.08~0.3 중량%, 더욱 바람직하게 0.1~0.28 중량%, 가장 바람직하게 0.125~0.25 중량%로 포함될 수 있다. 상기 타우린의 함량이 0.06 중량% 미만일 경우에는 효소의 안정화 효과가 미약하여 측정값 감소가 심하며, 0.35 중량% 초과일 경우에는 매개체의 비특이적 환원으로 인하여 증가되는 측정값을 보상하지 못하여 측정값이 크게 나타나기 때문에 측정값이 부정확한 문제가 발생한다. 본 발명의 바이오센서용 효소 용액 조성물은 상기와 같이 특정한 함량의 타우린을 포함할 때, 효소 활성도 저하 및 매개체 환원으로 인해 측정값이 변동되는 문제를 효과적으로 방지할 수 있으며, 바이오센서용 효소 용액의 경시 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 효소는 산화환원효소일 수 있다. 상기 산화환원효소는 생체의 산화환원반응을 촉진하는 효소를 총칭하는 것으로 글루코스탈수소효소(glucose dehydrogenase, GDH) 또는 글루코스산화효소(glucose oxidase) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 효소는 조성물 내에서 1000~7000 U/mL, 바람직하게 2000~6000, 더욱 바람직하게 3000~5000 U/mL의 활성으로 사용될 수 있다. 상기 효소의 활성도가 1000 U/mL 미만일 경우에는 대상 물질을 검출하기에 효과가 미약할 수 있으며, 시간이 지날수록 효소의 활성이 떨어져 측정값이 감소하는 문제점이 있다. 반면, 상기 효소의 활성도가 7000 U/mL 초과일 경우에는 원자재의 비용이 크게 상승하며, 시간이 지날수록 매개체의 비특이적 환원에 의한 측정값이 증가하는 문제점이 있다.
본 발명의 바이오센서용 효소 용액 조성물은 철이온(Fe2+/Fe3+)을 함유하는 매개체를 포함할 수 있다. 상기 매개체는 효소 반응으로 인하여 생성된 전자를 받아 환원된 후, 전극에 산화 전압이 인가되면 전극표면에서 산화됨으로써 산화 전류를 발생시키는 역할을 한다. 상기 매개체는 철이온(Fe2+/Fe3+)을 함유하는 페로센(Ferrocene) 또는 이의 유도체, 또는 페리시아나이드(ferricyanide)계 화합물 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 철이온을 함유하는 매개체는 조성물 총 중량 대비 2~10 중량%, 바람직하게 3~7 중량%로 사용될 수 있다. 상기 철이온을 함유하는 매개체가 2 중량% 미만이거나, 10 중량% 초과일 경우에는 효소 용액의 안정성 저해, 센서의 정밀도 감소, 또는 선형성 감소 등의 여러 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 바람직하게, 바이오센서용 효소 용액 내에 포함되는 효소의 활성도 및 타우린 함량의 비율은 효소의 활성도 1000~7000 U/mL : 타우린 0.06~0.35 중량%(조성물 총 중량 대비)의 비율로 포함될 수 있다. 바람직하게, 상기 효소 및 타우린의 비율은 효소 활성도 3000~5000 U/mL : 타우린 0.125~0.25 중량%의 비율로 포함될 수 있다. 본 발명의 효소 용액은 효소 및 타우린을 상기와 같은 비율로 포함하는 경우에, 효소 용액의 품질 안정성이 가장 우수하게 장기간 유지될 수 있다.
일 실시예에서, 더욱 바람직하게, 바이오센서용 효소 용액 내에 포함되는 효소, 타우린 및 철이온 함유 매개체의 비율은 효소 활성도 1000~7000 U/mL : 타우린 0.06~0.35 중량% : 매개체 2~10 중량%의 비율로 포함될 수 있다. 바람직하게, 상기 효소, 타우린 및 철이온 함유 매개체의 비율은 효소 활성도 3000~5000 U/mL : 타우린 0.125~0.25 중량% : 매개체 3~7 중량%의 비율로 포함될 수 있다. 본 발명의 효소 용액은 효소, 타우린, 및 매개체를 상기와 같은 비율로 포함하는 경우에, 효소의 안정성 저하 및 매개체의 비특이적 환원에 의해 바이오센서의 측정값이 부정확해져 품질이 저해되는 문제를 가장 효과적으로 해결할 수 있다.
본 발명의 바이오센서용 효소 용액 조성물은 완충 용액을 포함할 수 있다. 본 발명의 효소 용액은 재료 성분들을 완충 용액에 녹여서 제조할 수 있다. 또한, 상기 완충 용액은 효소의 활성을 유지시키고, 산화환원 반응에 영향을 미치는 pH를 일정하게 유지하는 역할을 수행한다. 상기 완충 용액은 인산염(phosphate) 완충 용액 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 바이오센서용 효소 용액 조성물은 상기 효소(예를 들어, 산화환원효소) 외에 추가적으로 조효소를 포함할 수 있다. 상기 조효소는 측정하고자 하고자 물질로부터 전자를 받은 후 매개체에 내주는 역할을 수행할 수 있다. 상기 조효소는 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드(flavin adenine dinucleotide, FAD), 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD) 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 바이오센서용 효소 용액 조성물은 계면활성제를 포함할 수 있으며, 이는 효소 용액이 전극 위에 균일한 두께로 퍼지게 한다. 상기 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100), 폴록사머 407(Poloxamer 407), 트윈-20(tween-20), 플루로닉 F-127 (Pluronic F-127), 및 소듐스테아레이트(sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바이오센서용 효소 용액 조성물은 지지체로서 조성물의 균질한 분산을 돕기 위해 고분자 물질을 포함할 수 있다. 상기 고분자 물질은 아가로즈(agarose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 수용성 셀룰로오즈(cellulose)계 고분자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 타우린을 포함하는 바이오센서용 효소 용액 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 (s1) 완충 용액에 산화환원효소, 타우린, 및 철을 포함하는 매개체를 첨가하는 단계, (s2) 상기 (s1) 단계에서 첨가된 반응물을 용해시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 (s1) 단계는 상기 반응물 외에 조효소, 계면활성제, 및 고분자 물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 제조 방법에서 타우린의 특정한 함량, 또는 기타 첨가물에 관한 내용은 상기 효소 용액 조성물에 관한 내용이 동일하게 적용될 수 있다. 본 발명의 제조 방법을 통해 제조된 바이오센서용 효소 용액 조성물은 경시 안정성이 현저하게 향상되어, 시간이 흐름에 따른 바이오센서의 품질 저하를 효과적으로 방지할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 바이오센서용 효소 용액 조성물을 포함하는 바이오센서 스트립을 제공한다. 일 실시예에서, 상기 바이오센서 스트립은 절연기판; 상기 절연기판 상에 형성되는 작업전극부 및 기준전극부; 상기 작업전극부 및 기준전극부 상에 형성되고 혈액이 들어갈 틈을 제공하는 필름; 상기 작업전극부 및 기준전극부 상에 형성되고 효소 용액을 포함하는 반응부; 및 상기 반응부 위에 형성되는 친수성 필름을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 바이오센서 스트립은 도 1과 같이 하부 절연기판(1)의 전면에 작업전극(2) 및 기준전극(3)이 탄소잉크를 통해 스크린 프린트되어 제작된다. 여기에 혈액이 들어갈 틈을 제공하는 필름(4)이 전극 위에 추가로 부착되며, 효소 반응을 위한 효소 용액(5)이 작업전극(2)과 기준전극(3)을 가로질러 배치된다. 그 다음, 혈액이 모세관 현상으로 잘 흡수되도록 친수성 필름(6)이 효소 용액 위에 배치된다.
본 발명의 바이오센서용 효소 용액 조성물은 효소(산화환원효소) 및 철이온을 함유하는 매개체를 포함하는 모든 종류의 바이오센서 측정 시스템에 적용될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 바이오센서용 효소 용액은 혈당측정 시스템, 또는 혈당측정 장치(스트립)에 사용될 수 있다. 본 발명의 효소 용액은 타우린을 포함함으로써, 혈당 측정용 효소 용액의 안정성을 현저하게 향상시켜, 혈당측정 시스템, 또는 혈당측정 장치의 시간의 흐름에 따른 품질 저하를 효과적으로 방지할 수 있다.
본 발명의 바이오센서용 효소 용액은 타우린을 포함함으로써 효소 용액의 경시 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 시간이 흐름에 따른 바이오센서의 품질 저하를 효과적으로 방지할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오센서용 효소 용액은 시간이 흐름에 따라 비특이적으로 환원되는 철이온 함유 매개체를 사용하더라도 바이오센서의 품질을 안정화시킬 수 있고, 이러한 저렴한 매개체를 사용함으로써 비용 절감 효과를 가져온다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 테스트를 위한 스트립 제작 도면이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에서 타우린 농도에 따라 각각 제작한 스트립의 안정도를 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 일 실시예에서 타우린 농도에 따른 안정도를 다른 방식으로 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예: 혈당 측정용 센서 스트립의 제조
실험에 사용한 센서 스트립은 도 1과 같이, 먼저 하부 절연기판(1)의 전면에 작업전극(2) 및 기준전극(3)을 탄소잉크를 통해 스크린 프린트하였다. 여기에, 혈액이 들어갈 틈을 제공하는 필름(4)이 전극 위에 추가로 부착하였으며, 효소 반응을 위한 효소 용액(5)을 작업전극(2)과 기준전극(3)을 가로질러 배치하였다. 그 다음, 혈액이 모세관 현상으로 잘 흡수되도록 친수성 필름(6)을 효소 용액 위에 배치하여, 혈당 측정용 센서 스트립을 제조하였다.
실험예: 타우린의 농도에 따른 효소 용액의 안정성
실험에 사용한 스트립은 위와 같은 과정을 거쳐 제작하였다. 먼저 완충 용액에 효소(GDH-FAD), 매개체(potassium ferricyanide), 타우린, 계면활성제, 또는 고분자를 각각 용해시켜 스톡 용액으로 제조한 후, 이들을 혼합하여 효소 용액을 제조하였다. 타우린의 농도(중량%)는 각각 0%, 0.063%, 0.125%, 0.188%, 0.25%, 0.313%, 또는 0.375%가 되도록 각각의 효소 용액을 제조하였으며, 타우린 이외의 성분들은 모두 공통적인 농도로 제조되었다. 각각의 효소 용액은 조성물 총 중량 대비 매개체(potassium ferricyanide) 3 중량%, 계면활성제 0.04 중량%, 및 고분자 0.4 중량%를 포함하며, 효소(GDH-FAD)가 5000 U/ml의 활성도로 첨가되었다. 혼합 순서는 계면활성제, 고분자, 타우린, 매개체, 순수 완충 용액, 및 효소 순으로 첨가하여 혼합을 진행하였다. 상기 계면활성제, 고분자, 및 완충 용액은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 화합물을 사용하였다.
제작이 끝난 스트립은 각각의 바이알에 담아 오븐에 입고하였다. 정해진 시간 동안 이를 보관한 후, 동일한 날에 꺼내어 상온화 시간을 충분히 거친 다음, 측정기를 사용해 효소 용액의 안정성을 실험하였다. 오븐 보관 기간은 각각 0일(입고하지 않음), 3일, 7일, 10일, 14일로 진행하였다. 테스트에 사용한 측정기는 인가전압 250 mV를 가지는 것이며, 2초후의 전류를 기록하여 측정결과를 나타내었다. 테스트에 사용한 검체는 저혈당(122 mg/dL), 또는 고혈당(526 mg/dL)의 혈액이다.
검체, 및 스트립 종류(타우린 농도 별)의 조합으로 각 조건에서 10회씩 측정을 진행한 후, 오븐에 입고하지 않은 각각의 타우린 농도 별 스트립의 평균값을 기준으로 하여, 혈당 농도에 대한 전류값의 기울기와 절편값을 측정하고, 측정값을 혈당 수치로 변환하였다. 이후 오븐에 입고하지 않은 스트립의 혈당 수치를 기준으로, 오븐에 입고된 실시예에서 측정값이 변화된 정도를 10회 반복 측정하고 평균값을 도출하였다. 해당 결과를 도 2(저혈당 검체) 및 도 3(고혈당 검체)에 나타내었다. 도 2 및 도 3의 범례는 타우린의 농도를 의미하며, 단위는 용액에 대한 중량%이다. 또한, 도 2 및 도 3의 옅은 붉은 색의 박스는 Bias +/-10% 안쪽임을 의미한다. 고혈당 검체 및 저혈당 검체 모두에서, 붉은 색 박스에 들어간 타우린의 농도 범위는 0.125 중량%, 0.188 중량%, 및 0.25 중량%이었다.
도 4 및 도 5는 같은 결과를 다른 방식으로 도시한 것으로, 타우린의 농도가 0.125~0.25 중량% 범위(푸른색 타원으로 표시)에서 벗어나면 오븐 보관일에 따른 측정값의 편차(bias)가 크게 변화하는 것을 볼 수 있다. 따라서 타우린의 농도 범위 0.125~0.25 중량%는 혈당측정용 스트립의 안정성에 있어서 특별한 유의성을 가지는 수치라고 판단되었다.
1 : 하부 절연기판
2 : 작업 전극
3 : 기준 전극
4 : 필름
5 : 효소 용액
6 : 친수성 필름

Claims (9)

  1. 타우린을 포함하는 바이오센서용 효소 용액 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 철이온(Fe2+/Fe3+)을 함유하는 매개체를 포함하는 바이오센서용 효소 용액 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 타우린은 효소 용액 조성물의 총 중량 대비 0.06~0.35 중량%로 포함되는 바이오센서용 효소 용액 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소는 효소 용액의 부피 대비 1000~7000 U/mL의 활성도로 포함되는 바이오센서용 효소 용액 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 철이온을 함유하는 매개체를 효소 용액 조성물의 총 중량 대비 2~10 중량%로 포함하는 바이오센서용 효소 용액 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 효소, 타우린 및 철이온을 함유하는 매개체의 비율은 효소 활성도 1000~7000 U/mL : 타우린 0.06~0.35 중량% : 매개체 2~10 중량%인 바이오센서용 효소 용액 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바이오센서는 혈당 측정용 센서이며, 상기 효소 용액은 혈당 측정용 효소 용액인 바이오센서용 효소 용액 조성물.
  8. 제1항의 바이오센서용 효소 용액 조성물을 포함하는 바이오센서 스트립.
  9. (s1) 완충 용액에 산화환원효소, 타우린, 및 철을 포함하는 매개체를 첨가하는 단계; 및
    (s2) 상기 (s1) 단계에서 첨가된 반응물을 용해시키는 단계
    를 포함하는 바이오센서용 효소 용액 조성물의 제조 방법.
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