KR20200025586A - 사포닌 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 이용한 체내흡수율이 증진된 발효새싹인삼 및 홍삼의 제조방법 - Google Patents

사포닌 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 이용한 체내흡수율이 증진된 발효새싹인삼 및 홍삼의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사포닌 생물전환능을 갖는 신규의 락토바실러스속 및 엔테로코커스속 균주 및 이를 이용한 인삼 발효물의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따라 새롭게 분리된 상기 균주를 수삼, 백삼, 홍삼, 장뇌삼, 산삼, 산삼배양근 등의 인삼에 접종하고 배양할 경우, 진세사이드 Rg2, 진세노사이드 Rg3, 20-진세노나이드 Rg3, 화합물 K, 진세노사이드 Rh1, Rh2, 20-진세노나이드 Rh2 등의 함량이 높은 인삼 발효물을 얻을 수 있다.

Description

사포닌 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 이용한 체내흡수율이 증진된 발효새싹인삼 및 홍삼의 제조방법{Saponin-biotransforming activity and processes for preparing fermented sprout ginseng and sprout red ginseng using the same}
본 발명은 사포닌 생물전환능을 갖는 신규의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM11114P 및 이를 이용한 체내흡수율이 증진된 발효새싹인삼의 제조방법에 관한 것이다.
인삼은 식물 분류학상 오가과 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11종이 알려져 있으며, 대표적인 종으로는 고려 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer), 미국삼(Panax quinquefolium L.), 전칠삼(Panax notoginseng F. H. Chen), 죽절삼(Panax japonicus C. A. Meyer) 등이 있다. 고려 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 아시아 극동 지역(북위 33 ~ 48도 한국, 북만주, 러시아 일부)에 자생하며, 약효가 매우 우수하다. 미국삼(Panax quinquefolium L.)은 미국, 캐나다에 자생 및 재배되며, 전칠삼(Panax notoginseng F. H. Chen)은 중국 운남성 동남부로부터 광서성 서남부 지역에서 야생 또는 재배된다. 또한 죽절삼(Panax japonicus C. A. Meyer)은 일본, 중국 서남부, 네팔에 이르기까지 분포한다
인삼의 주요성분 및 약리작용에 관한 연구가 발표됨에 따라, 자연 건강식품으로 각광을 받고 있으며, 그 수요도 점차 신장 되고 있고, 경제성장과 생활수준의 향상으로 더욱 가속화되어 대중적 자연건강식품으로 널리 애용되고 있다. 또한 인삼은 주로 한국 등 아시아 국가에서 생약의 형태로 정신 의학적, 신경계의 질병 및 당뇨병 등 여러 가지 질병에 대해 사용되어 왔으며, 상기 인삼의 주요 성분인 사포닌은 강장, 강정, 진정, 조혈 및 항고혈압 등에 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다.
일반적으로 인삼은 재배하여 채취한 그대로의 수삼, 수삼을 상온에서 건조시킨 백삼 또는 수삼을 정제수로 세척한 다음 약 98 ~ 100 에서 수증기로 증삼 처리하여 제조되는 홍삼의 형태로 이용되고 있다. 이 중에서 특히 홍삼은 백삼보다 훨씬 약효가 강한 것으로 알려져 있다.
최근에는 이러한 인삼의 약효성분이 인체 내로 용이하게 흡수되도록 하며, 인삼에 극미량으로 존재하는 성분들을 강화시키는 방법으로서 인삼을 장내 미생물 또는 유산균을 이용하여 발효하거나 및 효소를 처리하는 방법 등이 사용되고 있다.
대한민국 특허출원 제1980-4291호는 인삼의 고유 향기 성분을 분리한 인삼 잔박을 효소 분해하여 유기태 질소 농도가 0.2 ~ 0.8 %, 포도당의 생성 함유량이 유산균 발효에 적합한 3% 이상이 되었을 때 유기산으로 pH 3.8 ~ 4.8로 조절한 후 불용성 고분자 단백질과 섬유질을 제거하고 용출액에 유산균을 배양시킨 다음 이에 인삼 고유의 향기 성분을 첨가하는 공정을 포함하는 유산균 인삼 음료의 제조방법을 개시하고 있다. 대한민국 특허공개 제1997-061909호에서는 인삼사포닌의 장내 세균 대사물로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd의 대사 생성물로서 화합물 K, 화합물 Y 및 진세노사이드 Mc을, 또 프로토파낙사 트라이올계 사포닌인 진세노사이드 Rg1 및 진세노사이드-Re의 대사 생성물로서 20(S)-프로토파낙사트라이올을 단리 동정한 것을 개시한 바 있다. 또한, 대한민국 특허등록 제479,803호, 제497,895호, 제517,899호, 제618,171호 등은 인삼 또는 인삼 추출액을 유산균 또는 장내 세균으로 발효시켜, 20-0-◎D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올(화합물 K), 진세노사이드 F, 20(S)-프로토파낙사디올, 20(S)-프로토파낙사트리올 등의 함량이 높은 발효 인삼(즉, 인삼 추출물) 및 그의 제조방법을 개시한 바 있다. 한편, 대한민국 특허등록 제228,510호는 인삼을 110 - 180의 온도에서 0.5 - 20 시간 동안 가열처리하고, 수득된 가공인삼을 알콜, 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 그들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기용매로 추출한 후에 추출물을 크로마토그라피 처리하고 진세노사이드 Rg3 및/또는 Rg5를 분리 수득하는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3 및/또는 Rg5의 제조방법을 개시한 바 있다. 대한민국 특허등록 제228,510호에 따르면, 상기 진세노사이드 Rg3 및/또는 Rg5는 우수한 혈관이완 효과를 갖는 사포닌의 대사산물이다. 그러나, 대한민국 특허등록 제228,510호에 개시된 바에 따라, 진세노사이드 Rg3 및 20-진세노사이드 Rg3의 함량이 높은 인삼 추출물을 제조하는 경우, 열처리 과정에서 생성되는 HMF(Hydroxylmethylfurfual) 등과 같은 발암물질의 생성을 피할 수 없으며, 열 및/또는 산처리 공정에 따라 필연적으로 중화 공정을 거쳐야 하고, 추출정제 과정을 별도로 수행하여야 하므로 직접 식품으로서의 사용이 곤란하다. 또한, 대한민국 특허등록 제479,803호, 제497,895호, 제517,899호, 제618,171호 등에 개시된 바에 따라 유산균 또는 장내 세균으로 인삼을 발효시켜 인삼 추출물을 제조하는 경우, 얻어지는 인삼 추출물 중에 화합물 K, 진세노사이드 Rg3 및 20-진세노사이드 Rg3의 함량이 매우 낮아 혈관이완 효과, 항종양, 및 항암효과를 기대하기가 곤란하다. 또한, 대한민국 특허등록 제789,678호, 제856,790호 및 제866,504호는 신규 미생물 즉, 페디오코거스 속(Pediococcus Sp.) 균주 및 루코노스톡 속(Leuconostoc Sp.) 균주, 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius) M-2 균주(KCTC 11054 BP), 류코노스톡 멘센테로이드스(Leuconostoc mensenteroides) M-3 균주(KCTC 11055 BP), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) M2 균주(KCTC11390BP) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) P2 균주(KCTC11391BP) 등으로 인삼을 발효시켜 진세노사이드 Rg3 의 함량이 높은 발효 인삼의 제조방법을 개시한 바 있다. 그러나, 상기 종래의 제조방법에 따라 인삼을 발효시키더라도, 진세노사이드 Rg3 의 함량이 최대 약 10% 정도로 낮기 때문에, 여전히 만족스럽지 못하다.
상기 화합물 K, 진세노사이드 Rg3, 20-진세노사이드 Rg3는 우수한 혈관이완 효과 뿐만 아니라 항종양 및 항암효과가 우수한 것으로 알려져 있다(Kim et al., Eur. J. Pharmacol. 1999, 367(1):51-57; Kim et al., Arch. Pharm. Res. 2004, 27(4):429-435; Li X. et al., Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2005, 36(2):217-220).
본 발명자들은 혈관이완 효과, 항종양, 및 항암효과가 우수한 것으로 알려져 있는 진세노사이드 Rg3 및 20-진세노나이드 Rg3의 함량이 높은 인삼 발효물을 생성할 수 있는 미생물을 광범위하게 탐색하였다. 그 결과, 전국 각지에서 수집한 분변 및 김치액으로부터 인삼 발효 활성을 가지는 수십종의 미생물을 분리하였으며, 이 중 락토바실러스(Lactobacillus) 속에 속하는 2 종의 균주가 월등히 높은 사포닌 생물전환능을 가짐으로써, 화합물 K, 진세노사이드 Rg3 및 20-진세노나이드 Rg3의 함량이 높은 인삼 발효물을 제조할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 사포닌 생물전환능을 갖는 신규의 락토바실러스 속 및 엔테로코커스 속 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물을 이용한 인삼 발효물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 사포닌 생물전환능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM11114P, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei NS 808) KCCM11115P가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM11114P, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei NS 808) KCCM11115P로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 균주를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 인삼 발효물의 제조방법이 제공된다.
상기 인삼 발효물의 제조방법에 있어서, 상기 인삼은 수삼, 백삼, 또는 홍삼일 수 있다. 또한, 상기 인삼 발효물의 제조방법은 상기 배양 후 얻어진 배양액을 25 ~ 40℃ 에서 12시간 ~ 30일 동안 숙성시키는 단계("숙성 단계")를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 인삼 발효물의 제조방법은 상기 숙성 단계를 수행하여 얻어진 숙성액 또는 상기 숙성액을 원심분리하여 취한 상등액을 농축 또는 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 새롭게 분리된 락토바실러스 속 미생물 즉, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM11114P는 우수한 사포닌 생물전환능을 갖는다. 특히, 상기 미생물을 새싹인삼, 수삼, 백삼, 홍삼, 장뇌삼, 산삼 및 산삼배양근 등의 인삼에 접종하고 배양할 경우, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 화합물 K, 진세노사이드 Rg3 및 △20-진세노나이드 Rg3의 함량이 높은 인삼 발효물을 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1의 제조방법에 따라 제조한 발효인삼 추출물을 경구 투여하였을 때 나타나는 체내흡수율에 따른 활성형 진세노사이드 Rg2, Rh1, Rg3, △20-Rg3의 혈중 사포닌 농도 경시변화 추이를 측정한 결과이다.
도 2는 인삼 추출물의 사포닌을 분석한 HPLC 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 발효인삼의 유효성분인 사포닌을 분석한 HPLC 그래프이다.
본 명세서에서 "새싹인삼 발효물"이라 함은 새싹수삼, 새싹백삼, 새싹홍삼 등의 인삼에 미생물, 특히 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM11114P을 접종하고, 배양하여 얻어진 생성물을 말하며, '발효새싹인삼' 등으로 지칭되기도 한다.
본 발명은 사포닌 생물전환능을 갖는 미생물로서, 우수한 화합물 K, 진세노사이드 Rg3 및 △20-진세노나이드 Rg3 생성능을 갖는 신규의 미생물 즉, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM12303P를 제공한다.
본 발명자들은 전국 각지에서 분변 및 김치액을 수집하였으며, 유산균 분리용 배지(MRS-BCP 배지)를 사용하여 단일 집락을 형성하는 균주들을 분리하였다. 얻어진 균주들을 홍삼 농축액에 가하여 대사 활성을 측정하였으며, 발효 활성을 갖는 수십종의 미생물을 분리하였다. 얻어진 미생물들로부터 사포닌 생물전환능, 특히 화합물 K, 진세노사이드 Rg3 및 △20-진세노나이드 Rg3 생성능이 특히 높은 미생물 2종을 선별하였다. 분리된 2종의 미생물의 16S rRNA 유전자 서열을 분석한 결과, 각각 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는다는 것이 밝혀졌고, 이를 BLAST를 사용하여 상동성을 비교하고 균주의 특성을 분석한 결과, 각각 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM 11114P에 속하는 새로운 균주로 판명되었다. 상기 균주 즉, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM 11114P를 한국미생물보존센터에 2018년 08월 27일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM 11114P를 부여받았다.
본 발명은 또한 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM 11114P로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 균주를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 인삼 발효물의 제조방법을 제공한다. 상기한 바와 같이, 본 발명에 의해 새롭게 분리된 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM 11114P는 우수한 사포닌 생물전환능을 가지며, 특히, 이를 이용하여 인삼을 발효시킬 경우 화합물 K, 진세노사이드 Rg3 및 △20-진세노나이드 Rg3의 함량이 높은 인삼 발효물을 얻을 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 상기 균주의 기질로서 사용하는 인삼은 특별히 한정된 것은 아니며, 인삼 그 자체 및 인삼 가공물을 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 수삼, 홍삼, 홍미삼, 백삼, 미삼, 인삼 열매, 인삼 잎 등을 사용하거나 인삼 추출액 및 인삼 분말 등을 사용할 수 있다. 상기 인삼의 원산지는 제한되지 아니하며, 예를 들어 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼, 베트남인삼 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 상기 인삼은 필요에 따라 통상의 방법으로 멸균시켜 사용할 수도 있다.
또한, 대한민국 특허등록 제497,895호에서 개시하는 건조 분말 형태의 인삼, 산 처리 인삼, 고온처리 인삼 및 가압처리 인삼 등도 사용할 수도 있다. 그러나, 산 처리를 할 경우 배양액의 pH가 낮아져 균주의 활성이 낮아질 수 있으며, 고온으로 처리할 경우 열처리 과정에서 HMF 등의 발암물질이 생성될 수 있으므로, 인삼 또는 인삼 분말을 그대로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 인삼 분말은 적어도 100 메쉬 이상의 입자크기를 갖는 분말이 인삼의 표면적을 증가시켜 미생물의 발효 속도를 높일 수 있다.
인삼을 발효시키는 방법 즉, 균주의 접종 및 배양은 종래의 방법(대한민국 특허등록 제479,803호, 제497,895호, 제517,899호, 제618,171호 등)에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 인삼 분말 또는 인삼의 추출액(예를 들어, 알콜 또는 알콜 수용액 추출액, 열수 추출액 등)을 물에 현탁하여 상기한 균주를 넣고, 20 ~ 50℃ , 바람직하게는 30 ~ 37℃ 에서, 12 시간 ~ 15 일, 바람직하게 24 시간 ~ 5 일 동안 배양함으로써 수행할 수 있다.
상기와 같은 발효 과정을 거침으로써, 인삼 원재료에 함유된 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등이 진세노사이드 Rg3, 20-진세노사이드 Rg3, 화합물 K(Compound K), 진세노사이드 Rh2 등으로 생물전환된다.
본 발명의 제조방법은 상기 배양 후 얻어진 배양액을 25 ~ 40℃ 에서 12시간 ~15일 동안 숙성시키는 단계("숙성 단계")를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 조건에서 숙성 단계를 수행하게 되면, 숙성과 동시에 유산균에 의한 잡균의 멸균도 함께 이루어지게 되며, 또한 진세노사이드 Rg3, 20-진세노사이드 Rg3 함량을 더욱 높일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 얻어지는 인삼 발효물은 별도의 정제를 통하지 않고 직접 식품으로서의 사용이 가능하다. 즉, 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 인삼 발효물은 통상의 방법에 따라 농축시키거나 동결건조하여 분말화하여 그대로 식품에 적용할 수 있다. 즉, 숙성과정을 통하여 얻어진 숙성액을 농축 또는 동결건조한 것을 그대로 식품에 적용 수 있으며, 또는 상기 숙성액을 원심분리하여 취한 상등액을 농축 또는 동결건조하는 단계를 거쳐 얻어진 것을 그대로 식품에 적용할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리 및 동정
(1) 균주 분리
전국 각지로부터 수집한 분변 및 김치액을 4 에 냉장보관하였다. 수집된 분변 및 김치액을 균일하게 교반한 다음, 0.9% 멸균생리식염수를 이용하여 단계적으로 희석하고(10-2, 10-4, 10-6 및 10-8), 유산균 분리용 배지인 MRS(deMan Rogosa Sharpe, Difco TM, Becton Dickinson and Company, USA)-BCP(Bromocresol Purple) 평판배지에 도말하였다. 도말한 배지는 30에서 집락의 형성을 관찰하였으며, 유의한 수준의 집락이 형성될 때까지 24-48시간 동안 배양하였다. 단일 집락으로서 구분 가능한 수준의 희석 농도의 배지에서 원래 배지의 색인 보라색이 균주의 젖산 형성을 통해 노란색의 집락 및 경계를 형성하는 균주 집락을 선별하였다. 선택된 집락들을 다시 MRS-BCP 평판 배지에 계대배양하여 단일 집락임을 다시 확인하고, 단일 집락으로 확인된 균주들에 대해서 대사 활성을 측정하였다.
상기 활성은 얻어진 균주들을 홍삼 농축액에 가하여 대사 활성을 갖는지 여부를 확인함으로써 수행하였으며, 구체적으로는 홍삼농축액(충남 금산소재의 덕원인삼약초영농조합) 1를 취한 후 0.9% 식염수로 적절하게 연속 희석한 다음 MRS 한천(agar)(Difco Laboratories, 덱스트로오즈 20.0g/l; 미트 펩톤(meat peptone) 10.0g/l; 비프 추출물(beef extract) 10.0g/l; 효모 추출물 5.0g/l; 소듐 아세테이트 5.0g/l; 디소듐 포스페이트 2.0g/l; 암모늄 시트레이트 2.0g/l; 트윈 80 1.0g/l; 마그네슘 설페이트 0.1g/l; 망간 설페이트 0.05g/l; 아가(agar) 15g/l)에 도말한 후 30와 37에서 72시간과 48시간 동안 각각 배양하였다.
상기와 같이 대사활성을 측정한 결과, 약 10종의 미생물을 분리하였다. 각각 분리된 미생물을 이용하여 홍삼추출물 10g에 물 90를 가하고, 85 에서 멸균한 다음, 미생물을 약 5 %의 농도로 접종한 후, 37 에서 2일 동안 배양하였다. 얻어진 배양액을 85에서 24 시간 동안 숙성 및 멸균 처리한 다음, HPLC로 진세노사이드를 분석한 결과, 진세노사이드 Rg3 및 20-진세노나이드 Rg3 생성능이 특히 높은 미생물 2종(KW 1861 및 NS 808)을 선별하였다. 상기 미생물 2종은 사람의 장내에서 분리된 균주이다.
(2) 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석에 의한 분리 균주의 동정
분리된 2종의 미생물의 16S rRNA 유전자 서열 분석을 수행하였다. 16S rRNA 유전자 서열 분석은, Lane, D. J. (1991), 16S/23S sequencing. In: Nucleic Acids Techniques in Bacterial Systematics, Eds.: Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. pp. 115-175, John Wiley and Sons, New York 및 Harju, S., et al., 2004, Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab. BMC Biotech. 21:4-8에 개시된 방법에 따라 실시하였다.
상기 2종의 미생물을 MRS 액체 배지 10 에 접종하고 회전식 배양기 내에서 80 rpm, 30에서 2일간 배양하였다. 상기 배양액 1 을 1.5 원심분리 튜브에 넣고 15,000 x g로 5분간 원심분리하였다. 게놈 DNA를 추출하기 위해서 상층액을 제거한 후 튜브에 라이시스 완충액(2 %(v/v) Triton X-100, 1%(w/v) SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl 및 1 mM EDTA; pH 8.0) 200 를 첨가하여 균질한 상태로 만든 뒤, 상기 튜브를 -80 에서 4분간 얼리고, 곧이어 끓는 물에서 다시 2분간 중탕하였다. 이렇게 얼리고 녹이는 과정을 두 차례 수행한 뒤, 30초간 볼텍싱하였다. 그리고 200 의 클로로포름을 넣고 다시 2분간 볼텍싱한 뒤, 4에서 15,000 x g로 5분간 원심분리하였다. 상층액만 분리하여 2 의 RNaseI 용액(mg/ml)을 처리한 후 에탄올 침전법을 이용하여 게놈 DNA를 분리하고 TE 용액 200 에 용해하고, 이를 16S rRNA 유전자를 증폭하는 데에 사용하였다.
상기 미생물의 염색체 DNA로부터 16S rRNA 유전자를 프라이머 8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 서열번호 3)와 1541R(AAGGAGGTGATCCAGCC, 서열번호 4)을 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭을 위한 PCR 프로그램은 다음과 같이 수행하였다. 94에서 5분 동안 반응시킨 다음 94에서 30초, 55에서 40초 및 72에서 1분 30초로 이루어진 사이클을 35회 반복하고 최종 신장 단계로서 72에서 5분간 반응시켰다. 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 산물을 Accu Prep gel 정제 키트(Accu. Chem. Sci. Corp. Westbury, N.Y.)를 사용하여 정제하였다. 이렇게 얻어진 각각의 PCR 증폭 산물을 각각 pPCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, USA)에 도입하고 이 벡터를 이용하여 E. coli DH5a(Real Biotech, Inc., Taiwan)를 형질전환하였다. 유효한 E. coli DH5a 균주를 확인한 후 여기에서 플라스미드를 분리 정제하였다. 이렇게 해서 얻어진 플라스미드인 pM-2 및 pM-3에 있는 16S rRNA의 시퀀싱을 실시하였다. 서열분석 결과, 상기 2종의 미생물, 즉 KW 1861 및 NS 626의 16S rRNA 서열은 각각 서열번호 1 및 2로 확인되었다(각각 1474 bp 및 1455 bp). 상기 유전자 서열을 BLAST를 사용하여 상동성을 분석한 결과, KW 1861 균주는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)에 속하고, NS 808 균주는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)에 속하는 새로운 균주로 판명되었다.
(3) 당 발효능 분석(생화학적 특성 규명)
16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통하여 얻어진 2 종의 미생물, 즉 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM12303P, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei NS 808) KCCM 11115P 균주에 대하여, API 50 CHL 키트(BioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당에 대한 발효 검사를 실시하였고, 그 결과는 표 1 및 표 2와 같다.
분리 균주의 생화학적 특성
No. 측정항목 Lb. casei KW 1861
1 글라이세롤 (Glycerol) -
2 에리스리톨 (Erythritol) -
3 D-아라비노즈 (D-Arabinose) -
4 L-아라비노즈 (L-Arabinose) -
5 D-리보스 (D-Ribose) +
6 D-자일로스 (D-Xylose) -
7 L-자일로스 (L-Xylose) -
8 D-아도니톨 (D-Adonitol) -
9 메틸-◎D-자일로피라노사이드(Methyl-◎D-Xylopyranoside) -
10 D-갈락토스 (D-Galactose) +
11 D-글루코스 (D-Glucose) +
12 D-프록토스 (D-Fructose) +
13 D-만노스 (D-Mannose) +
14 L-소르보스 (L-Sorbose) -
15 L-람노스 (L-Rhamnose) -
16 둘시톨 (Dulcitol) -
17 이노시톨 (Inositol) -
18 D-만니톨 (D-Mannitol) +
19 D-소르비톨 (D-Sorbitol) +
20 메틸-a-D-만노피라노사이드(Methyl-a-D-Mannopyranoside) -
21 메틸-a-D-글루코피라노사이드(Methyl-a-D-Glucopyranoside) -
22 N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine) +
23 아미그달린 (Amygdalin) +
24 아르부틴 (Arbutin) +
25 에스큘린 페릭 시트레이트(Esculin ferric citrate) +
분리 균주의 생화학적 특성
No. 측정항목 Lb. casei KW 1861
26 살리신 (Salicin) +
27 D-셀로비오스 (D-Cellobiose) +
28 D-말토스 (D-Maltose) +
29 D-락토스 (D-Lactose) -
30 D-멜리비오스 (D-Melibiose) -
31 D-사카로스 (D-Saccharose) +
32 D-트레할로스 (D-Trehalose) +
33 이눌린 (Inulin) -
34 D-멜리지토스 (D-Melezitose) +
35 D-라피노스 (D-Raffinose) -
36 아미돈 (전분) (Amidon (starch)) -
37 글라이코겐 (Glycogen) -
38 자일리톨 (Xylitol) -
39 젠티오비오스 (Gentiobiose) +
40 D-투란노스 (D-Turanose) -
41 D-락소스 (D-Lyxose) -
42 D-타가토스 (D-Tagatose) -
43 D-퓨코스 (D-Fucose) -
44 L-퓨코스 (L-Fucose) -
45 D-아라비톨 (D-Arabitol) -
46 L-아라비톨 (L-Arabitol) -
47 포타슘 글루코네이트(Potassium Gluconate) -
48 포타슘 2-케토글루코네이트(Potassium 2-Ketogluconate) -
49 포타슘 5-케토글루코네이트(Potassium 5-Ketogluconate) -
상기 표 1 및 표 2에서 "+"는 당을 이용하여 발효한 것, -는 해당하는 당을 이용하여 발효하지 못한 것을 나타낸다.
(4) 균주기탁
상기에서 분리된 2 종의 균주 즉, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861)을 한국미생물보존센터에 2018년 08월 27일자로 기탁하고, 기탁번호KCCM12303P를 부여받았다.
실시예 2.
고려 인삼 분말 50g에 물 250ml를 가하고, 85℃에서 멸균한 다음, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861)(미생물 기탁번호 KCCM12303P)를 약 5 %의 농도로 접종한 후, 37℃ 에서 2일 동안 교반하면서 배양하였다. 이때, 상기 배양은 인삼 분말의 입자 공극에 배양액을 용이하게 확산시키기 위하여 감압하에서 실시하였다. 얻어진 배양액을 85℃에서 24 시간 동안 숙성 및 멸균처리하였다. 얻어진 숙성액을 75℃ 에서 진공 농축하여 인삼 발효물(즉, 발효인삼)을 제조하였다.
실시예 3.
고려인삼 대신 미국인삼을 사용하고, 균주로서 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861)(미생물 기탁번호 KCCM KCCM12303P)을 사용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 발효인삼을 제조하였다.
실시예 4.
고려인삼 대신 죽절인삼을 사용하고, 균주로서 락토바실러스 에시도필러스을 사용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 발효인삼을 제조하였다.
실시예 5.
고려인삼 대신 히말라야 인삼을 사용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 발효인삼을 제조하였다.
실시예 6.
고려인삼 대신 베트남 인삼을 사용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 발효인삼을 제조하였다.
시험예 1. 진세노사이드 함량 분석
비교예로서 대한민국 특허등록 제479,803호에 개시된 바에 따라, 발효인삼을 제조하였다(비교예 1). 상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 발효인삼의 성분변화를 다음과 같이 측정하였다. 얻어진 인삼 발효물 5 g을 정밀히 달아 100 의 농축플라스크에 취하고, 감압농축 후 수포화 부탄올 50ml를 가하여 환류 냉각기를 붙여 수욕 중에서 70 ~ 80로 약 1시간 가열 추출한 다음 냉각한 후 여과하고 잔류물에 대하여 같은 조작을 계속 2회 반복하였다. 여지는 수포화 부탄올 10 로 세척하고 여액 및 세척액을 합하여 250 분액깔때기에 넣고 물 20 로 잘 진탕시켜 수세하였다. 수포화 부탄올 추출액 전액을 미리 항량으로 한 농축플라스크에 옮겨 수욕 중에서 감압 농축하여 부탄올을 제거한 다음 그 잔류물에 에테르 50 를 넣고 환류냉각기를 붙여 수욕 중에서 36로 30분간 가열하여 탈지시킨 후 에테르를 제거하였다. 얻어진 잔류물에 10배의 메탄올을 가하여 완전히 용해한 다음 필터(0.45 )를 사용하여 여과한 다음 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 진세노사이드 성분을 정량분석하였으며, 그 결과는 다음 표 5와 같다. 상기 HPLC 조건은 다음과 같다.
기구 : Shimadzu Prominence
칼럼 : Gromsil ODS 4.6(i, d) ◎250mm
이동상 A: 아세토니트릴:증류수=15:85
이동상 B: 아세토니트릴:증류수=80:20
유속 : 1.0 /min
검출기 : ELSD(Alltech)
구분 실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예1
진세노사이드 Rb1 0.6 0.5 0.5 2.7
진세노사이드 Rb2 0.3 0.3 0.3 2.2
진세노사이드 Rc 0.2 0.2 0.2 1.9
진세노사이드 Rd 0.1 0.2 0.2 1.3
진세노사이드 Rg3 27.8 28.2 28.3 9.00
△20-진세노사이드 Rg3 30.2 30.4 31.2 10.52
진세노사이드 Rh2 0.8 1.4 1.2 0.4
화합물 K 0.2 0.1 0.2 1.5
시험예 2. 유효 진세노사이드의 생체이용률 측정
실시예 1에서 제조한 인삼 추출물 40 g을 60 ~ 70 kg의 건강한 성인(남자, n=3)에게 1회 경구 투여한 후, 0.25시간, 0.5시간, 1 시간, 2 시간, 4시간, 6 시간, 8시간, 12 시간, 24 시간에 혈액 샘플(5 ㎖)을 취하여, 혈중에 존재하는 사포닌 및 사포닌 대사체를 분석하였다. 시간별로 혈액 5 ㎖를 채혈하여 분석조건은 고체상 추출기(Solid phase extraction)를 이용하여 진세노사이드를 추출 정제한 다음, 메탄올을 가하여 고체상 추출기 흡착제에 흡착된 진세노사이드를 용출시킨 뒤 필터(0.45 ㎛)를 사용하여 여과한 다음 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 진세노사이드 성분을 정량 분석하였다. 혈중 사포닌 유도체들의 경시변화를 측정한 결과는 도 3과 같다.
인삼의 약리성분으로 알려진 사포닌은 배당체구조로 되어 있어 사포닌은 그 자체로 흡수되지 않고 장내 미생물에 의해서 사포닌 대사물(화합물 K, 진세노사이드 F1 등)로 생물전환된 후 체내 흡수율이 증진된다고 알려져 있다(Hasegawa H., J. Pharmacol. Sci., 2004, 95(2):153-157; Tawab M. A. et al., Drug Metab. Dispos., 2003, 31(8):1065-1071.). 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 30분-2시간에 활성형 진세노사이드 Rg2, Rh1, Rg3 및 20 진세노사이드 Rg3 성분이 각각 최대 흡수를 보였으며. 본 발명 인삼추출물(발효인삼)과 인삼 실험군을 비교할 경우, 본 발명에 따른 인삼추출물의 체내흡수율이 30 배 이상 증대된 것을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 미생물의 성장을 억제시키는 인삼추출물에 특이적으로 생육하는 유산균인 락토바실러스 카제이(Lb. casei) KW 1861 을 분리 동정할 수 있다.
또한 본 발명에 따르면 인삼추출물에 특이적으로 생육하는 유산균인 락토바실러스 카제이(Lb. casei) KW 1861을 배양하여, 진세노사이드 Rg1, Rb1 등의 대사산물을 진세노사이드 Rg3, 컴파운드 K, 진세노사이드 F1 등의 성분으로 전환시켜 생체 이용률이 높은 진세노사이드 성분을 함유하고, 인삼 추출물의 항균력을 향상시킨 유산균 발효액, 발효분말, 농축액, 및 발효 생균제를 제조하고, 이를 함유하는 조성물을 제조할 수 있다.
또한 인삼 추출액을 제외한 유산균 배양을 위한 여타 다른 배지 성분이 들어가지 않기 때문에 공정을 단순화할 수 있으며, 첨가물에 의한 제품 함량의 손실도 줄일 수 있다.
락토바실러스(Lactobacillus): Lb.
고성능액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography) : HPLC
진세노사이드(ginsenoside) : G

Claims (5)

  1. 사포닌 생물전환능을 갖는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM 11114P.
  2. 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei KW 1861) KCCM12303P로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 균주를 인삼에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 인삼 발효물의 제조방법.
  3. 제3항에 있어서, 상기 인삼이 수삼, 백삼, 홍삼, 장뇌삼, 산삼 또는 산삼배양근인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 배양 후 얻어진 배양액을 80 ~ 95℃ 에서 12 ~ 48 시간 동안 숙성시키는 단계("숙성 단계")를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제5항에 있어서, 상기 숙성 단계를 수행하여 얻어진 숙성액 또는 상기 숙성액을 원심분리하여 취한 상등액을 농축 또는 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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KR100479803B1 (ko) 2002-04-08 2005-03-30 홍림통산(주) 약효가 증가된 특수가공처리 인삼 추출물을 함유하는뇌졸증의 예방 및 치료를 위한 조성물

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그러나, 대한민국 특허등록 제228,510호에 개시된 바에 따라, 진세노사이드 Rg3 및 20-진세노사이드 Rg3의 함량이 높은 인삼 추출물을 제조하는 경우, 열처리 과정에서 생성되는 HMF(Hydroxylmethylfurfual) 등과 같은 발암물질의 생성을 피할 수 없으며, 열 및/또는 산처리 공정에 따라 필연적으로 중화 공정을 거쳐야 하고, 추출정제 과정을 별도로 수행하여야 하므로 직접 식품으로서의 사용이 곤란하다.
대한민국 특허공개 제1997-061909호에서는 인삼사포닌의 장내 세균 대사물로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd의 대사 생성물로서 화합물 K, 화합물 Y 및 진세노사이드 Mc을, 또 프로토파낙사 트라이올계 사포닌인 진세노사이드 Rg1 및 진세노사이드-Re의 대사 생성물로서 20(S)-프로토파낙사트라이올을 단리 동정한 것을 개시한 바 있다.
또한, 대한민국 특허등록 제789,678호, 제856,790호 및 제866,504호는 신규 미생물 즉, 페디오코거스 속(Pediococcus Sp.) 균주 및 루코노스톡 속(Leuconostoc Sp.) 균주, 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius) M-2 균주(KCTC 11054 BP), 류코노스톡 멘센테로이드스(Leuconostoc mensenteroides) M-3 균주(KCTC 11055 BP), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) M2 균주(KCTC11390BP) 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) P2 균주(KCTC11391BP) 등으로 인삼을 발효시켜 진세노사이드 Rg3 의 함량이 높은 발효 인삼의 제조방법을 개시한 바 있다. 그러나, 상기 종래의 제조방법에 따라 인삼을 발효시키더라도, 진세노사이드 Rg3 의 함량이 최대 약 10% 정도로 낮기 때문에, 여전히 만족스럽지 못하다.
상기 화합물 K, 진세노사이드 Rg3, 20-진세노사이드 Rg3는 우수한 혈관이완 효과 뿐만 아니라 항종양 및 항암효과가 우수한 것으로 알려져 있다(Kim et al., Eur. J. Pharmacol. 1999, 367(1):51-57; Kim et al., Arch. Pharm. Res. 2004, 27(4):429-435; Li X. et al., Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2005, 36(2):217-220).
한편, 대한민국 특허등록 제228,510호는 인삼을 110 - 180의 온도에서 0.5 - 20 시간 동안 가열처리하고, 수득된 가공인삼을 알콜, 헥산, 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 그들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기용매로 추출한 후에 추출물을 크로마토그라피 처리하고 진세노사이드 Rg3 및/또는 Rg5를 분리 수득하는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3 및/또는 Rg5의 제조방법을 개시한 바 있다. 대한민국 특허등록 제228,510호에 따르면, 상기 진세노사이드 Rg3 및/또는 Rg5는 우수한 혈관이완 효과를 갖는 사포닌의 대사산물이다.

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