KR20200020463A - Method for producing human neural stem cells from human epidermal cells using placenta derived conditioned medium - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for producing neural stem cells by inducing direct cross-differentiation from human epithelial cells to neural stem cells, utilizing a placenta-derived cell conditioned medium containing cytokines of human placenta-derived cells. The production method comprises the steps of: 1) culturing human epithelial cells in a medium containing a bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitor and a transforming growth factor (TGF) beta signaling inhibitor; and 2) culturing the human epithelial cells cultured in step 1) in a placenta-derived cell conditioned medium containing cytokines of human placenta-derived cells.

Description

태반유래 세포 조건화 배지를 이용하여 인간 상피세포로부터 인간 신경 줄기세포를 생산하는 방법 {Method for producing human neural stem cells from human epidermal cells using placenta derived conditioned medium}Method for producing human neural stem cells from human epidermal cells using placenta derived conditioned medium}

본 발명은 인간 태반유래 세포의 사이토카인을 함유하는 태반유래 세포 조건화 배지를 이용하여 인간 상피세포로부터 신경 줄기세포로의 직접교차분화를 유도함으로써 신경 줄기세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing neural stem cells by inducing direct cross-differentiation from human epithelial cells to neural stem cells using a placental-derived cell conditioned medium containing cytokines of human placental-derived cells.

임상적용이 가능한 세포치료제 생산을 위해서는 공급원이 되는 줄기세포 혹은 전구세포의 고순도, 고효율 체외 배양이 필수적인데, 이때 체외 배양환경이 인체 환경과 유사한 상태에서 대량생산이 이루어져야 임상에서의 효율성 안정성을 보장할 가능성이 높아진다. High-purity, high-efficiency in vitro culture of stem cells or progenitor cells as a source is essential for the production of clinically applicable cell therapies. The chances are high.

최근까지 인간 신경 줄기세포 배양에 대하여 많은 연구들이 진행되어 왔으나, 대부분의 기술들이 동물유래 지지세포를 사용하거나 동물유래 산물을 포함하여 인간 생체환경과 상이한 배양환경을 제공한다. 이러한 동물유래 산물을 포함하는 배지를 이용하는 경우 인간 생체환경과 상이한 배양환경을 제공하기 때문에 임상적용을 위한 세포의 대량생산 시스템에 적합하지 않을 뿐만 아니라, 이종 단백 오염이 발생하는 등 임상적용 측면에서의 윤리성과 안전성을 담보하기가 곤란한 문제점이 있다. Although many studies have been conducted on human neural stem cell culture until recently, most technologies use animal-derived support cells or provide animal-derived culture environments that differ from human living environments. When the medium containing such animal-derived products is used, it provides a culture environment different from that of the human living environment, so it is not suitable for the mass production system of cells for clinical application, and in the aspect of clinical application such as heterologous protein contamination occurs. There is a problem that it is difficult to secure ethics and safety.

이에, 인간 생체 환경과 유사한 배양조건에서 표준화된 신경 줄기세포를 배양 생산할 수 있는 기술의 개발에 대한 관심이 높아지고 있는 실정이다.Thus, there is a growing interest in the development of technology that can culture cultured neural stem cells in a culture condition similar to the human living environment.

한편, 최근 줄기세포 연구 분야에 있어서 분화가 완전히 진행된 체세포에 최소한의 전사인자 조합을 도입하여, 전혀 다른 종류의 특성을 가진 체세포 또는 성체줄기세포(adult stem cells)로의 전환, 즉 직접교차분화(direct reprogramming/direct conversion)시키는 연구가 전세계적으로 이슈가 되고 있다. 직접교차분화란, 임의의 체세포를 모든 세포로 분화가 가능한 유도만능줄기세포로 역분화(reprogramming)시킨 후 다시 하위로 분화(differentiation)시키는 과정을 거쳐야하는 종래의 기술과는 달리, 임의의 체세포를 '직접' 원하는 특정 세포로 전환시키는 기술로서, 금전적 비용 및 노력을 줄일 수 있다는 이점이 있다.On the other hand, in the field of stem cell research, the introduction of minimal transcription factor combinations into somatic cells that have been fully differentiated, the conversion to somatic cells or adult stem cells having completely different characteristics, that is, direct cross-differentiation (direct) Reprogramming / direct conversion research is becoming a global issue. Direct cross-differentiation, unlike the conventional technique that has to go through the process of reprogramming and then differentiation of any somatic cells into induced pluripotent stem cells capable of differentiating into all cells, and then any arbitrary somatic cells As a technique for converting to 'direct' desired specific cells, it has the advantage of reducing monetary costs and effort.

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 인간 태반유래 세포의 사이토카인을 함유하는 태반유래 세포 조건화 배지를 이용하여 인간 상피세포로부터 신경 줄기세포 생산방법을 제공하는 것이다.The present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art, an object of the present invention to provide a neural stem cell production method from human epithelial cells using a placental-derived cell conditioned medium containing cytokines of human placenta-derived cells will be.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem, another task that is not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본 발명의 일 실시예에 따르면, According to one embodiment of the invention,

1) BMP(Bone morphogenic protein) 신호전달 저해제 및 TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 인간 상피세포를 배양하는 단계; 및1) culturing human epithelial cells in a medium comprising a bone morphogenic protein (BMP) signaling inhibitor and a transforming growth factor (TGF) beta signaling inhibitor; And

2) 인간 태반유래 세포의 사이토카인을 함유하는 태반유래 세포 조건화 배지에서 상기 단계 1)에서 배양된 상기 인간 상피세포를 배양하는 단계; 를 포함하는, 신경 줄기세포의 생산방법이 제공된다.2) culturing the human epithelial cells cultured in step 1) in a placental derived cell conditioned medium containing cytokines of human placental derived cells; Including, a method of producing neural stem cells is provided.

일 측에 따르면, 상기 BMP 신호전달 저해제는 Noggin 및 LDN193289일 수 있다.According to one side, the BMP signaling inhibitor may be Noggin and LDN193289.

일 측에 따르면, 상기 TGF 베타 신호전달 저해제는 ALK(activin receptor-like kinase) 수용체 저해제 SB431542일 수 있다.According to one side, the TGF beta signaling inhibitor may be an activin receptor-like kinase (ALK) receptor inhibitor SB431542.

일 측에 따르면, 상기 Noggin 은 50ng/ml 내지 150ng/ml의 농도이고, 상기 LDN193289은 0.1μM 내지 10μM의 농도일 수 있다.According to one side, the Noggin is a concentration of 50ng / ml to 150ng / ml, the LDN193289 may be a concentration of 0.1μM to 10μM.

일 측에 따르면, 상기 SB431542는 1μM 내지 20μM의 농도일 수 있다.According to one side, the SB431542 may be a concentration of 1μM to 20μM.

일 측에 따르면, 상기 단계 1)의 배양은 3일 내지 7일, 상기 단계 2)의 배양은 5일 내지 10일 동안 수행되는 것일 수 있다.According to one side, the culturing of step 1) may be performed for 3 days to 7 days, the culturing of step 2) for 5 days to 10 days.

일 측에 따르면, 상기 태반유래 세포 조건화 배지는, 상기 태반유래 세포 조건화 배지는, 배양액이 첨가된 세포 성장 배지에 인간 태반유래 세포를 노출시켜 사이토카인을 추출하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.According to one side, the placental-derived cell conditioning medium, the placental-derived cell conditioning medium is prepared by a method comprising extracting cytokines by exposing human placenta-derived cells to the cell growth medium to which the culture medium is added Can be.

일 측에 따르면, 상기 인간 태반유래 세포는 인간 융모막판에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포일 수 있다.According to one side, the human placental-derived cells may be placental-derived fibroblast-like cells separated and cultured in human chorionic valve.

일 측에 따르면, 상기 태반유래 세포 조건화 배지는 IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1/TIMP-2, GRO/GRO-a 및 IL-8으로부터 선택되는 1종 이상의 인간 신경 줄기세포 배양 유효 성분을 포함할 수 있다.According to one side, the placental-derived cell conditioning medium is at least one human neural stem cell culture active ingredient selected from IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1 / TIMP-2, GRO / GRO-a and IL-8 It may include.

일 측에 따르면, 상기 태반유래 세포 조건화 배지는 녹아웃 혈청 대체제(KnockOut Serum Replacement)를 더 포함하는 것일 수 있다.According to one side, the placental-derived cell conditioning medium may further comprise a knockout serum replacement (KnockOut Serum Replacement).

본 발명의 신경 줄기세포의 생산 방법은 소분자 화합물을 처리하여 직접교차분화를 유도한 이후 인간 태반유래 세포로부터 유래된 사이토카인을 함유하는 태반유래 세포 조건화 배지에서 신경 줄기세포를 배양함으로써, 특성이 잘 유지된 신경 줄기세포를 생산할 수 있다. The method for producing neural stem cells of the present invention is well characterized by culturing neural stem cells in placental-derived cell conditioned medium containing cytokines derived from human placental derived cells after inducing direct cross-differentiation by treating small molecule compounds. It can produce sustained neural stem cells.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.It is to be understood that the effects of the present invention are not limited to the above effects, and include all effects deduced from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.

도 1은 신경세포를 배양한 배지, 태반유래 세포 조건화 배지 및 녹아웃 혈청대체제(KnockOut Serum Replacement)를 포함하지 않은 태반유래 세포 조건화 배지에서 분비되는 사이토카인을 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 사이토카인 어레이(cytokine array)의 신호 강도를 측정하여 양성 대조군 농도에 따라 표준화 한 그래프이다.
도 3은 사이토카인 어레이의 Heatmap을 나타낸다.
도 4는 인간 상피세포로부터 신경 줄기세포로의 직접교차분화 유도 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 인간 상피세포로부터 신경 줄기세포로의 직접교차분화 유도 과정 동안의 세포의 형태학적 변화를 시간 순서로 나타낸 것이다. Day 0은 직접교차분화 유도를 위한 소분자 화합물을 처리하기 전의 상피세포를 나타내고, Day 4는 소분자 화합물을 처리한 후를 나타낸다. Day 11은 NSC 배지(좌측)와 태반유래 세포 조건화 배지(PCCM, 우측)에서 형성된 신경구를 나타낸다.
도 6은 직접교차분화 유도된 신경 줄기세포의 특성을 확인하기 위해 신경 줄기세포 특이적 표지 인자인 Nestin, PAX6의 발현을 면역 형광 염색법으로 확인한 것이다.Figure 1 shows the comparison of cytokines secreted in cultured neuronal culture medium, placental derived cell conditioned medium and placental derived cell conditioned medium without KnockOut Serum Replacement.
2 is a graph normalized according to the positive control concentration by measuring the signal intensity of the cytokine array (cytokine array).
3 shows a heatmap of a cytokine array.
Figure 4 is a schematic diagram showing the process of direct cross-differentiation induction from human epithelial cells to neural stem cells.
Figure 5 shows the morphological changes of cells during the course of direct cross-differentiation induction from human epithelial cells to neural stem cells in chronological order. Day 0 represents epithelial cells before treatment with small molecule compounds for direct cross-differentiation induction, and Day 4 represents after treatment with small molecule compounds. Day 11 represents neurospheres formed in NSC medium (left) and placental-derived cell conditioned medium (PCCM, right).
Figure 6 confirms the expression of the neural stem cell specific markers Nestin, PAX6 in order to confirm the characteristics of direct cross-differentiation induced neural stem cells by immunofluorescence staining.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, exemplary embodiments will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, various changes may be made to the embodiments so that the scope of the patent application is not limited or limited by these embodiments. It is to be understood that all changes, equivalents, and substitutes for the embodiments are included in the scope of rights.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terminology used herein is for the purpose of description and should not be construed as limiting. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise. In this specification, terms such as "comprise" or "have" are intended to indicate that there is a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described on the specification, and one or more other features. It is to be understood that the present invention does not exclude the possibility of the presence or the addition of numbers, steps, operations, components, components, or a combination thereof.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. Terms such as those defined in the commonly used dictionaries should be construed as having meanings consistent with the meanings in the context of the related art, and shall not be construed in ideal or excessively formal meanings unless expressly defined in this application. Do not.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.In addition, in the description with reference to the accompanying drawings, the same components will be given the same reference numerals regardless of the reference numerals and duplicate description thereof will be omitted. In the following description of the embodiment, if it is determined that the detailed description of the related known technology may unnecessarily obscure the gist of the embodiment, the detailed description thereof will be omitted.

본 명세서에서 사용된 용어 "태반"은 산모의 모체로부터 출산 후 분리되는 태반을 의미한다. 태반은 분리된 후 신속하게 멸균된 용기 및 얼음에 담아 보관될 수 있다. As used herein, the term "placental" refers to the placenta that is separated after birth from the mother's mother. The placenta can be separated and quickly stored in sterile containers and ice.

본 명세서에서 사용된 용어 "조건화 배지(conditioned media)"는 세포에 의해 생산된 유효 성분 또는 세포의 유지 및 생존에 도움이 되는 인자들을 함유함으로써 기능이 변경된 배지를 의미한다.As used herein, the term “conditioned media” refers to a medium whose function has been altered by containing active ingredients produced by the cell or factors conducive to the maintenance and survival of the cell.

본 명세서에서 사용된 용어, "TGF (Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제"는 TGF 베타 신호전달을 억제하는 물질을 의미한다. 여기서, TGF 베타는 생체 내에서 세포의 증식, 분화, 세포사멸, 이동, 세포외기질(ECM)의 생 산 혈관형성, 발생 등 다양한 생리적 과정을 조절하는 물질이다. The term "transforming growth factor (TGF) beta signaling inhibitor" as used herein refers to a substance that inhibits TGF beta signaling. Here, TGF beta is a substance that regulates various physiological processes such as cell proliferation, differentiation, apoptosis, migration, production of extracellular matrix (ECM), and development.

본 명세서에서 사용된 용어, "BMP(Bone morphogenic protein) 신호전달 저해제"는 골 형성 단백질(BMP)의 신호전달을 억제하는 물질을 의미한다. 여기서, 골 형성 단백질(BMP)은 골 형성을 개시하기 전에 연골 세포 및 조골세포로의 중배엽형 세포의 분화를 유도하도록 작용하는 단백질이다.As used herein, the term "BMP (Bone morphogenic protein) signaling inhibitor" refers to a substance that inhibits the signaling of bone morphogenic protein (BMP). Here, bone forming protein (BMP) is a protein that acts to induce differentiation of mesodermal cells into chondrocytes and osteoblasts before initiating bone formation.

본 발명의 일 실시예에 따르면, According to one embodiment of the invention,

1) BMP(Bone morphogenic protein) 신호전달 저해제 및 TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 인간 상피세포를 배양하는 단계; 및1) culturing human epithelial cells in a medium comprising a bone morphogenic protein (BMP) signaling inhibitor and a transforming growth factor (TGF) beta signaling inhibitor; And

2) 인간 태반유래 세포의 사이토카인을 함유하는 태반유래 세포 조건화 배지에서 상기 단계 1)에서 배양된 상기 인간 상피세포를 배양하는 단계; 를 포함하는, 신경 줄기세포의 생산방법이 제공된다.2) culturing the human epithelial cells cultured in step 1) in a placental derived cell conditioned medium containing cytokines of human placental derived cells; Including, a method of producing neural stem cells is provided.

한편, 직접교차분화 유도를 위해 처리된 소분자 화합물인 상기 TGF 베타 신호전달 저해제는 TGF 신호전달을 억제할 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 ALK(activin receptor-like kinase) 수용체 저해제 SB431542를 사용할 수 있고, 상기 BMP 신호전달 저해제는 Noggin 및 LDN193289일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Meanwhile, the TGF beta signaling inhibitor, which is a small molecule compound that is processed to induce direct cross-differentiation, may be used without limitation as long as it is a substance capable of inhibiting TGF signaling. For example, an ALK (activin receptor-like kinase) receptor inhibitor SB431542 It may be used, the BMP signaling inhibitors may be Noggin and LDN193289, but is not limited thereto.

또한, 상기 Noggin 은 50ng/ml 내지 150ng/ml의 농도, 상기 LDN193289은 0.1μM 내지 10μM의 농도로 첨가될 수 있고, 상기 SB431542는 1μM 내지 20μM의 농도로 첨가될 수 있으며, 특히 Noggin 은 90ng/ml 내지 110ng/ml의 농도, LDN193289은 0.3μM 내지 1μM의 농도, SB431542는 8μM 내지 12μM의 농도로 첨가되는 것이 신경 세포로의 분화 효율을 증가시키는데 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우 신경 세포로의 분화가 유도되지 않거나 효율이 감소할 수 있다.In addition, the Noggin is a concentration of 50ng / ml to 150ng / ml, the LDN193289 can be added at a concentration of 0.1μM to 10μM, the SB431542 can be added at a concentration of 1μM to 20μM, in particular Noggin 90ng / ml It is desirable to increase the differentiation efficiency into neurons is added to the concentration of to 110ng / ml, LDN193289 in the concentration of 0.3μM to 1μM, SB431542 in the concentration of 8μM to 12μM, if differentiation into neurons It may not be induced or the efficiency may be reduced.

본 발명의 신경 줄기세포의 생산방법에서, 인간 상피세포를 소분자 화합물이 처리된 배지에서 배양하는 단계 1)의 배양은 3일 내지 7일, 상기 단계 2)의 배양은 5일 내지 10일 동안 수행되는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 단계 1)에서는 신경 세포로의 분화가 유도되지 않거나, 효율이 감소할 수 있고, 단계 2)에서는 신경구(neurosphere) 형성이 일어나지 않을 수 있다.In the method for producing neural stem cells of the present invention, the culture of step 1) for culturing human epithelial cells in a medium treated with small molecule compounds is carried out for 3 days to 7 days, and the step 2) for 5 to 10 days. It is desirable to be. If it is out of the range, step 1) may not induce differentiation into neurons, or efficiency may be reduced, and in step 2) neurosphere formation may not occur.

본 발명의 태반유래 세포 조건화 배지는 인간 태반유래 세포를 배양액이 첨가된 세포 성장 배지에 노출시켜 사이토카인 등의 인간 신경줄기세포 배양 유효 성분을 추출하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.The placental-derived cell conditioned medium of the present invention may be prepared by a method comprising extracting human neural stem cell culture active ingredients such as cytokines by exposing human placental-derived cells to a cell growth medium to which the culture medium is added.

또한, 태반유래 세포 조건화 배지의 제조에 사용되는 배양액은 우태혈청 등이 배제된 통상의 배양액일 수 있으며, 혈청대체제(Serum Replacement), 황산화제 및 항생제를 포함하는　DMEM/F-12인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 20% Knockout Serum Replacer (GIBCO), 0.1 mM β및 1% penicillin-streptomycin (Sigma)가 보충된 DMEM/F-12을 이용할 수 있다.In addition, the culture medium used for the preparation of placental-derived cell conditioned medium may be a conventional culture solution that excludes fetal bovine serum and the like, and preferably is DMEM / F-12 including serum replacement, sulfate agent, and antibiotic. It is not limited to this. More specifically, DMEM / F-12 supplemented with 20% Knockout Serum Replacer (GIBCO), 0.1 mM β and 1% penicillin-streptomycin (Sigma) may be used.

본 발명의 태반유래 세포 조건화 배지에 포함되는 상기 인간 태반유래 세포는 인간 융모막판(chorionic plate)에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포일 수 있다. The human placental-derived cells included in the placental-derived cell conditioned medium of the present invention may be placental-derived fibroblast-like cells separated and cultured in a human chorionic plate.

보다 구체적으로, 상기 태반유래 섬유세포-유사세포는 다음의 과정으로부터 얻을 수 있다:More specifically, the placental fibroblast-like cells can be obtained from the following process:

1) 분리된 융모막판(chorionic plates)를 다지고, 37℃에서 30분간 0.25% trypsin-EDTA (GIBCO-Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양한 후에 이 세포들을 20% fetal bovine serum (FBS; HyClone Laboratories Inc, Logan, UT, 100 U/ml penicillin, 및 100 μg/ml streptomycin을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)에서 37℃5% CO2, 및 95% 습도 조건에서 배양한다. 1) Chop the isolated chorionic plates and incubate in 0.25% trypsin-EDTA (GIBCO-Invitrogen, Carlsbad, Calif.) For 30 minutes at 37 ° C. Incubate at 37 ° C. 5% CO 2 , and 95% humidity in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) with Logan, UT, 100 U / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin.

2) 상기 배지를 세 계대(passage)까지 매 3-4일마다 교환하면서 배양 동안 배지에서 떠오르는 세포 찌꺼기를 제거하고, 그 판에 부착된 태반-유래 섬유세포-유사 세포를 얻는다.2) Remove the cellular debris from the medium during incubation, replacing the medium every three to four days until passage, and obtain placental-derived fibroblast-like cells attached to the plate.

상기 태반유래 세포 조건화 배지는 인간 신경 줄기세포 배양 유효 성분을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 인간 신경 줄기세포 배양 유효성분은 b-FGF, IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1/TIMP-2, 안지오제닌(Angiogenin), IGFBP-2, IL-9, MCP-1, GRO/GRO-a, IGFBP-6, IL-8, 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin), uPAR 일 수 있으며, 바람직하게는 IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1/TIMP-2, GRO/GRO-a, IL-8이다. 본 발명의 조건화 배지는은 이러한 신경 줄기세포 배양 유효 성분을 포함하기 때문에, 보다 효율적으로 신경 줄기세포의 생산을 촉진할 수 있다.The placental-derived cell conditioned medium may include a human neural stem cell culture active ingredient. Specifically, the human neural stem cell culture active ingredient is b-FGF, IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1 / TIMP-2, Angiogenin (Angiogenin), IGFBP-2, IL-9, MCP-1, GRO / GRO-a, IGFBP-6, IL-8, Osteoprotegerin, uPAR, preferably IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1 / TIMP-2, GRO / GRO- a, IL-8. Since the conditioned medium of the present invention contains such neural stem cell culture active ingredients, it is possible to promote the production of neural stem cells more efficiently.

또한, 본 발명의 태반유래 세포 조건화 배지는 녹아웃 혈청 대체제(Knockout Serum Replacement)를 더 포함할 수 있으며, 녹아웃 혈청 대체제(Knockout Serum Replacement)를 포함하는 배지에서 신경 줄기세포를 배양하는 경우, 이를 포함하지 않는 배지보다 줄기세포의 특성이 더 잘 나타나고 유지된다(도 5 및 도 6 참조). In addition, the placental-derived cell conditioned medium of the present invention may further include a knockout serum replacement, and in the case of culturing neural stem cells in a medium containing a knockout serum replacement, the same may not be included. The characteristics of stem cells are better shown and maintained than in medium without the media (see FIGS. 5 and 6).

상술한 바와 같이, 상기 태반유래 세포 조건화 배지는 오직 인간 유래 산물로 구성되므로, 본 발명의 신경 줄기세포의 생산방법은 이종 단백 또는 세포에 의한 오염을 방지할 수 있고, 신경 줄기세포를 고순도, 고효율로 생산할 수 있으며, 본 발명의 신경 줄기세포의 생산방법을 이용하여 생산된 신경 줄기세포를 이용하면 임상에서의 안정성 및 효용성을 향상시킬 수 있다.As described above, since the placental-derived cell conditioned medium is composed only of human-derived products, the production method of the neural stem cells of the present invention can prevent contamination by heterologous proteins or cells, and the neural stem cells have high purity and high efficiency. Can be produced, using the neural stem cells produced using the method of producing neural stem cells of the present invention can improve the stability and efficacy in clinical.

나아가, 상기 신경 줄기세포는 다양한 신경학적 변성 질환, 신경 손상 질환, 예를 들어 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 피크병(Pick's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 외상성 중추 신경계 질환 (traumatic central nervous system diseases) 및 척수 손상 질환 (spinal cord injury disease) 등의 치료에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Furthermore, the neural stem cells can be used for various neurological degenerative diseases, nerve damage diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Pick's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, traumatic It may be used to treat traumatic central nervous system diseases and spinal cord injury diseases, but is not limited thereto.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. The following examples are described for the purpose of illustrating the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.

<실시예 1: 태반유래 세포 조건화 배지의 제조> Example 1 Preparation of Placental Cell conditioned Media >

태반세포를 임신한 지 7주에 치료적인 유산을 받은 건강한 임산부로부터 서면 동의를 받은 후, 제왕절개로의 외과적 수술에 의해 분리된 태반 조직으로부터 얻었다. 태반의 융모막 융모조직으로부터 세포를 분리하고, 분리된 태반세포를 20% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 100 g/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 포함하고 0.1% 젤라틴이 코팅된 플라스크에서 일주일 동안 배양하여 태반유래 세포를 얻었다. GIBCO에서 구입한 DMEM/F-12, 20% Knockout Serum replacement, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 및 1% penicillin streptomycin의 조성으로 구성된 배지에 태반유래 세포를 24시간동안 노출시켜 태반유래 세포 조건화 배지를 제조하였다. Placental cells were obtained from placental tissue isolated by surgical operation with a caesarean section after written consent from a healthy pregnant woman who had a therapeutic miscarriage at 7 weeks of pregnancy. Isolate the cells from the chorionic villus of the placenta and isolate the placental cells with 20% fetal bovine serum (FBS), 100 U / ml penicillin and 100 g / ml streptomycin. Placental cells were obtained by culturing for one week in a flask containing DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) and coated with 0.1% gelatin. Placental-derived cell conditioned medium was prepared by exposing the placental-derived cells for 24 hours to a medium consisting of DMEM / F-12, 20% Knockout Serum replacement, 0.1 mM β-mercaptoethanol, and 1% penicillin streptomycin purchased from GIBCO. .

<실시예 2: 신경 줄기세포 배양 유효성분의 탐색>< Example 2: Exploration of neural stem cell culture active ingredient >

기존의 조건화 배지(Neural Stem Cell Conditioned Medium: NSC CM), 상기 실시예 1에서 제조한 태반유래 세포 조건화 배지(human PlaCenta derived Conditioned Medium: hPCCM), 및 KnockOut Serum Replacement (SR)를 포함하지 않은 태반유래 세포 조건화 배지에서 24시간 동안 Wicell에서 구입한 H9으로부터 유래된 신경 줄기세포를 배양하였다.Placenta-derived without the existing Conditioned Medium (Neural Stem Cell Conditioned Medium: NSC CM), Placenta-derived Cell Conditioned Medium (hPCCM) prepared in Example 1, and KnockOut Serum Replacement (SR) Neural stem cells derived from H9 purchased from Wicell were cultured for 24 hours in cell conditioned medium.

상기 조건화 배지에서 기본으로 사용한 배지(Basal Medium: Neural Stem Cell Medium(NSC medium) 및 DMEM/F12)를 대조군으로 하고, 신경 줄기세포 배양 유효성분을 탐색하기 위해 Ray Biotech의 Human cytokine antibody array kit를 이용하여 배지에서 분비되는 사이토카인을 비교 분석하여 도 1에 나타냈다.The basal medium (Basal Medium: Neural Stem Cell Medium (NSC medium) and DMEM / F12) used as the control medium was used as a control, and the human cytokine antibody array kit of Ray Biotech was used to search for neural stem cell culture active ingredients. The cytokines secreted in the medium were analyzed and shown in FIG. 1.

도 1에 나타낸 바와 같이, dot signal을 이용하여 신경 줄기세포 배양에 필수적인 유효성분의 후보군을 정하였다: b-FGF, IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1/TIMP-2, Angiogenin, MCP-1, GRO/GRO-a, IGFBP-6, IL-6, IL-8, Osteoprotegerin, uPAR.As shown in FIG. 1, a candidate group of active ingredients essential for neural stem cell culture was selected using a dot signal: b-FGF, IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1 / TIMP-2, Angiogenin, MCP- 1, GRO / GRO-a, IGFBP-6, IL-6, IL-8, Osteoprotegerin, uPAR.

그 다음, 앞서 얻은 dot signal의 강도를 측정하여 양성 대조군의 농도에 따라 표준화하고(도 2), 그래프로 나타내어 신호 강도를 비교하였으며, Heatmap을 통해 사이토카인이 많이 발현되는 정도를 시각화 하였다(도 3). Heatmap에서 발현량이 많은 사이토카인은 붉은색, 적은 사이토카인은 초록색으로 나타냈다.Next, the intensity of the dot signal obtained above was measured and normalized according to the concentration of the positive control group (FIG. 2), and the signal intensity was compared by graphically comparing the signal intensity and visualizing the degree of cytokine expression through the heatmap (FIG. 3). ). In the heatmap, the cytokine with high expression was red and the cytokine with little was green.

도 2 및 도 3에 나타낸 결과를 통해, 최종적으로 신경 줄기세포 배양에 필수적인 유효성분을 IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1/TIMP-2, GRO/GRO-a, IL-8로 정하였다.Through the results shown in FIGS. 2 and 3, finally, the active ingredients essential for neural stem cell culture were determined as IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1 / TIMP-2, GRO / GRO-a, IL-8. .

<실시예 3: 직접교차분화 유도를 이용한 신경 줄기세포 생산>< Example 3: neural stem cell production using direct cross-differentiation induction >

인간 상피세포(Primary Dermal Fibroblasts, ATCC # PCS-201-012)에 10uM SB 431542 hydrate (Sigma # S4317), 100ng Recombinant Human Noggin (R&D # 6057), 0.5uM LDN193189 hydrochloride (Sigma # SML0559)을 처리하여 4일 동안 배양한 다음, 인간 상피세포를 상기 실시예 1에서 제조한 태반유래 세포 조건화 배지로 옮겨 신경구(neurosphere)을 형성하도록 7일 동안 배양하여 신경 줄기세포를 유도하였다.Primary Dermal Fibroblasts (ATCC # PCS-201-012) were treated with 10uM SB 431542 hydrate (Sigma # S4317), 100ng Recombinant Human Noggin (R & D # 6057), 0.5uM LDN193189 hydrochloride (Sigma # SML0559). After culturing for one day, the human epithelial cells were transferred to the placental-derived cell conditioned medium prepared in Example 1, and cultured for seven days to form a neurosphere to induce neural stem cells.

<실시예 4: 신경 줄기세포의 형태학적 변화 관찰> Example 4 Observation of Morphological Changes of Neural Stem Cells

상기 실시예 3에 기재된 방법으로 수행된 직접교차분화 유도 과정 동안의 신경 줄기세포의 형태학적 변화를 관찰하여 도 5에 나타냈다. 대조군은 Neurobasal medium, 2% B27 supplement, 1% MEM NEAA, 1% GlutaMAX, 100ng bFGF의 조성을 가지는 NSC 배지에서 형성된 신경구로 하였다.The morphological changes of neural stem cells during the direct cross-differentiation induction process performed by the method described in Example 3 were observed and shown in FIG. 5. The control group consisted of neurospheres formed in NSC medium containing Neurobasal medium, 2% B27 supplement, 1% MEM NEAA, 1% GlutaMAX, and 100ng bFGF.

도 5를 참고하면, Day0은 소분자화합물을 처리하기 전 상피세포의 모습으로 배양 디쉬에 부착하여 증식하고 있는 모습이며, 소분자화합물을 처리하여 세포의 모습이 변화되는 것을 Day4에서 확인할 수 있다. 다음으로, free-floating clusters배양을 실시하여 각각 NSC배지와 PCCM에서 신경구를 형성하여 신경줄기세포를 유도한 모습을 Day11에서 확인할 수 있다.Referring to Figure 5, Day0 is the appearance of epithelial cells before processing the small molecule compound is attached to the culture dish and proliferated, it can be seen in Day4 that the appearance of the cell is changed by processing the small molecule compound. Next, day 11 can be confirmed by inducing neural stem cells by forming free-floating clusters and forming neurospheres in NSC medium and PCCM, respectively.

이를 통해, NSC 배지에서 형성된 신경구에 비해 태반유래 세포 조건화 배지에서 형성된 신경구의 크기가 크며 더 우수한 형태학적 특성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.Through this, it was confirmed that the size of neurospheres formed in placental-derived cell conditioned medium is larger than the neurospheres formed in NSC medium and exhibited better morphological characteristics.

<실시예 5: 신경 줄기세포 특성 유지 확인>< Example 5: Confirming maintenance of neural stem cell characteristics >

상기 실시예 3에 기재된 방법을 이용하여 생산된 신경 줄기세포가 그 특성을 유지하는지 확인하기 위해, 면역 형광 염색법을 이용하여 신경 줄기세포에 특이적인 표지 인자들의 발현을 확인하였다. 대조군으로는 WiCell Research에서 구입한 H9_NSC(배아 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포)를 이용하였다.In order to confirm whether the neural stem cells produced using the method described in Example 3 retains its properties, the expression of labeling factors specific for neural stem cells was confirmed using immunofluorescence staining. As a control, H9_NSC (neural stem cells derived from embryonic stem cells) purchased from WiCell Research was used.

먼저, 면역 형광 염색을 위해cover slip에 세포를 배양을 하고, 신경줄기세포 특이적 마커인 Nestin과 PAX6의 발현을 면역 형광 염색법으로 측정하였다. 구체적으로, 70-80%의 세포가 성장하면10분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정시킨 후 10분 동안 0.1% 트라이톤 X100를 세포에 침투시키고 1차 항체인 Nestin (Abcam #ab22035)과 PAX6 (Abcam # ab195045)을 1:1000으로 희석하여 처리한 다음 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 처리하고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 처리하여 암조건에서 5분 동안 방치한 후 형광 현미경으로 관찰하였다.First, cells were cultured on a cover slip for immunofluorescence staining, and expression of nestin and PAX6, which are neural stem cell specific markers, was measured by immunofluorescence staining. Specifically, when 70-80% of the cells were grown, 4% paraformaldehyde was fixed for 10 minutes, and then 0.1% Triton X100 was infiltrated into the cells for 10 minutes, and the primary antibodies Nestin (Abcam # ab22035) and PAX6 were used. (Abcam # ab195045) was diluted 1: 1000 and incubated overnight at 4 ° C. The next day, the secondary antibody was treated at room temperature for 1 hour, and treated with 4 ', 6-diimidino-2-phenylindole (DAPI), which was allowed to stand for 5 minutes under dark conditions, followed by fluorescence microscopy.

도 6에 나타낸 바와 같이, 태반유래 세포 조건화 배지에서 배양된 신경 줄기세포는 배아 줄기세포로부터 유래된 신경 줄기세포 및 대조군 배지에서 배양된 신경 줄기세포에 비해 신경 줄기세포 특이적인 인자인 Nestin과 PAX6을 더 강하게 발현하는 것을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 6, the neural stem cells cultured in placental-derived cell conditioned medium compared to the neural stem cells derived from embryonic stem cells and the neural stem cells cultured in the control medium. It was confirmed to express more strongly.

상기의 실시예에서 나타난 결과는 직접교차분화 유도를 위한 소분자 화합물 처리 이후 태반유래 세포 조건화 배지에서 신경 줄기세포를 배양할 경우, 신경 줄기세포의 형태 및 신경 줄기세포의 특성을 안정적으로 유지할 수 있음을 시사한다.The results shown in the above examples indicate that when culturing neural stem cells in placental-derived cell conditioned medium after treatment with small molecule compounds for direct cross-differentiation induction, it is possible to stably maintain the morphology and characteristics of neural stem cells. Suggest.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.Although the embodiments have been described with reference to the accompanying drawings, those skilled in the art may apply various technical modifications and variations based on the above. For example, the described techniques may be performed in a different order than the described method, and / or the described components may be combined or combined in a different form than the described method, or replaced or substituted by other components or equivalents. Appropriate results can be achieved.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.Therefore, other implementations, other embodiments, and equivalents to the claims are within the scope of the following claims.

Claims (10)

1) BMP(Bone morphogenic protein) 신호전달 저해제 및 TGF(Transforming growth factor) 베타 신호전달 저해제를 포함하는 배지에서 인간 상피세포를 배양하는 단계; 및
2) 인간 태반유래 세포의 사이토카인을 함유하는 태반유래 세포 조건화 배지에서 상기 단계 1)에서 배양된 상기 인간 상피세포를 배양하는 단계; 를 포함하는, 신경 줄기세포의 생산방법.
1) culturing human epithelial cells in a medium comprising a bone morphogenic protein (BMP) signaling inhibitor and a transforming growth factor (TGF) beta signaling inhibitor; And
2) culturing the human epithelial cells cultured in step 1) in a placental derived cell conditioned medium containing cytokines of human placental derived cells; Containing, method of producing neural stem cells.
제1항에 있어서,
상기 BMP 신호전달 저해제는 Noggin 및 LDN193289인, 신경 줄기세포의 생산방법.
The method of claim 1,
The BMP signaling inhibitors are Noggin and LDN193289, the production method of neural stem cells.
제1항에 있어서,
상기 TGF 베타 신호전달 저해제는 ALK(activin receptor-like kinase) 수용체 저해제 SB431542인, 신경 줄기세포의 생산방법.
The method of claim 1,
The TGF beta signaling inhibitor is an activin receptor-like kinase (ALK) receptor inhibitor SB431542, method of producing neural stem cells.
제2항에 있어서,
상기 Noggin 은 50ng/ml 내지 150ng/ml의 농도이고, 상기 LDN193289은 0.1μM 내지 10μM의 농도인, 신경 줄기세포의 생산방법.
The method of claim 2,
The Noggin is a concentration of 50ng / ml to 150ng / ml, the LDN193289 is a concentration of 0.1μM to 10μM, the production method of neural stem cells.
제3항에 있어서,
상기 SB431542는 1μM 내지 20μM의 농도인, 신경 줄기세포의 생산방법.
The method of claim 3,
The SB431542 is a concentration of 1μM to 20μM, method of producing neural stem cells.
제1항에 있어서,
상기 단계 1)의 배양은 3일 내지 7일, 상기 단계 2)의 배양은 5일 내지 10일 동안 수행되는 것인, 신경 줄기세포의 생산방법.
The method of claim 1,
The culturing of step 1) is 3 days to 7 days, the culturing of step 2) is carried out for 5 days to 10 days, the production method of neural stem cells.
제1항에 있어서,
상기 태반유래 세포 조건화 배지는, 배양액이 첨가된 세포 성장 배지에 인간 태반유래 세포를 노출시켜 사이토카인을 추출하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인, 신경 줄기세포의 생산방법.
The method of claim 1,
The placental-derived cell conditioning medium is produced by the method comprising the step of extracting cytokines by exposing human placental-derived cells to the cell growth medium to which the culture solution is added, a method for producing neural stem cells.
제1항에 있어서,
상기 인간 태반유래 세포는 인간 융모막판에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포인, 신경 줄기세포의 생산방법.
The method of claim 1,
The human placental-derived cells are placental-derived fibroblast-like cells isolated and cultured from human chorionic lamellae, producing a neural stem cell.
제1항에 있어서,
상기 태반유래 세포 조건화 배지는IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1/TIMP-2, GRO/GRO-a 및 IL8으로부터 선택되는 1종 이상의 인간 신경 줄기세포 배양 유효 성분을 포함하는 것인, 신경 줄기세포의 생산방법.
The method of claim 1,
The placental-derived cell conditioning medium comprises one or more human neural stem cell culture active ingredients selected from IGFBP-2, MCP-1, TIMP-1 / TIMP-2, GRO / GRO-a, and IL8 Stem cell production method.
제1항에 있어서,
상기 태반유래 세포 조건화 배지는 녹아웃 혈청 대체제(KnockOut Serum Replacement)를 더 포함하는 것인, 신경 줄기세포의 생산방법.

The method of claim 1,
The placental-derived cell conditioned medium further comprises knockout serum replacement (KnockOut Serum Replacement), a method of producing neural stem cells.

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