KR102455288B1 - Methods of converting neurospheres into germline stem cells and uses thereof - Google Patents

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류범용
정상은
구효진
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중앙대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a method for converting neurospheres into germline stem cells and the like, and is completed by developing conditions and a method capable of converting neurospheres containing neural stem cells into germline stem cells. The germline stem cell conversion method according to the present invention is characterized in that neurospheres can be converted into germline stem cells using only environmental changes such as culture conditions without genetic transformation. In particular, it was confirmed that the germline stem cells obtained by the conversion method according to the present invention have normal spermatogenesis ability. Therefore, the present invention is expected to be usefully utilized as a basic technology for the understanding of reproductive biology and the treatment of male infertility.

Description

신경구로부터의 생식선 줄기세포로의 전환방법 및 이의 용도 {Methods of converting neurospheres into germline stem cells and uses thereof}Methods of converting neurospheres into germline stem cells and uses thereof

본 발명은 신경구 (neurospheres)로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a method for converting from neurospheres to germline stem cells and the like.

정자형성 (spematogenesis)이란 남성 배우체 (gametes), 정자 (spermatozoa)를 성숙하게 하는 과정으로, 정자는 남성 수명 전반에 걸쳐 생산된다. 이는 자기-재생 및 분화가 모두 가능한 성체줄기세포인 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells, SSCs)에 의존한다. 정원줄기세포는 설치류의 고환에서 매우 드물게 나타나는 생식선 줄기세포 (germline stem cells, GSCs)로서, 성체 마우스 (mouse)에서는 10,000개 세포 당 2 내지 3개 세포 (Tegelenbosch and de Rooij, 1993), 성체 랫트 (rat)에서는 1,000개 세포 당 2개 세포 (Tegelenbosch and de Rooij, 1993) 정도로 추정된다. 남성 생식에 있어서 정원줄기세포의 중요성은 인식되었지만, 상기와 같이 일반적인 동물 모델에서의 정원줄기세포의 희소성에 의해, 상세히 정원줄기세포 생물학을 연구하기가 어려운 실정이다. 따라서, 정원줄기세포의 정제 및 체외 (in vitro) 배양 방법이 여러 종에서 연구되었다 (Kanatsu-Shinohara et al., 2003; Ryu et al., 2004; Ryu et al., 2005; Kanatsu-Shinohara et al., 2008; Kim et al., 2010; Reding et al., 2010). 또한 정원줄기세포의 줄기세포 기능은 직접 불임 개체의 정소에 정원세포 이식 (spermatogonial transplantation)을 통하여 정자형성 (spermatogenesis) 과정을 겪는 능력에 기초하여 평가될 수 있다.Spematogenesis is the process of maturation of male gametes (gametes), spermatozoa, which are produced throughout a male's lifespan. It relies on spermatogonial stem cells (SSCs), which are adult stem cells capable of both self-renewal and differentiation. Spermocytes are germline stem cells (GSCs) that appear very rarely in the testis of rodents. In adult mice, 2 to 3 cells per 10,000 cells (Tegelenbosch and de Rooij, 1993), adult rats ( In rat), it is estimated to be about 2 cells per 1,000 cells (Tegelenbosch and de Rooij, 1993). Although the importance of garden stem cells in male reproduction has been recognized, it is difficult to study the biology of garden stem cells in detail due to the scarcity of garden stem cells in general animal models as described above. Therefore, methods for purification and in vitro culture of spermatogonial stem cells have been studied in several species (Kanatsu-Shinohara et al., 2003; Ryu et al., 2004; Ryu et al., 2005; Kanatsu-Shinohara et al. ., 2008; Kim et al., 2010; Reding et al., 2010). The stem cell function of spermatogonial stem cells can also be assessed based on their ability to undergo the process of spermatogenesis through spermatogonial transplantation directly into the testis of infertile individuals.

최근 연구는 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPSCs) 및 다능성 세포주 (pluripotent cell line)가 체외 (in vitro 또는 ex vivo)에서 생식세포로 분화 할 수 있음을 보고 하였으며, 특히, 마우스 iPSCs는 미성숙 난자를 닮은 둥근 모양의 iPSCs-유도 형상의 추정 생식세포 (peresumptive germ cells) 및 배아체로 분화할 수 있었다 (Imamura et al., 2010). 또한, 하야시 등은 배반엽상층 (epiblast)-유사 세포를 통하여 마우스에서 배아줄기세포 (embryonic stem cells, ESCs)와 iPSCs로부터 원시 생식세포-유사 세포 (primordial germ cell-like cells)를 생성하기 위한 구체적인 원시 생식세포 (primordial germ cells, PGCs) 경로를 재구성하는 데 필요한 배양 조건을 확인하였으며 (Hayashi et al., 2011; Hayashi et al., 2012), 상기 원시 생식세포-유사 세포는 이식 후 정자형성 과정을 통하여 정상 임프린트 패턴 자손을 생산하였다.Recent studies have reported that induced pluripotent stem cells (iPSCs) and pluripotent cell lines can differentiate into germ cells in vitro or ex vivo . They were able to differentiate into peresumptive germ cells and embryoid bodies with rounded iPSCs-derived shapes resembling immature eggs (Imamura et al., 2010). In addition, Hayashi et al. described a specific method for generating primordial germ cell-like cells from embryonic stem cells (ESCs) and iPSCs in mice through epiblast-like cells. The culture conditions necessary to reconstruct the primordial germ cells (PGCs) pathway were identified (Hayashi et al., 2011; Hayashi et al., 2012), and the primordial germ cell-like cells were subjected to spermatogenesis after transplantation. to produce normal imprint pattern progeny.

상기와 같이 생식선 줄기세포를 유도하는데 사용되는 유도 만능 줄기세포는 각 개체로부터 회수된 체세포를 이용하여 면역거부반응이 없고, 배아줄기세포 연구에서 비난 받았던 생명윤리 문제로부터 보다 자유로운 것처럼 여겨졌다. 하지만 외부 유전자 삽입으로 인한 유도만능줄기세포 게놈의 불안정성에 따른 높은 빈도의 암 발생 문제 및 DNA 돌연변이 가능성이 보고된 바 있으며, 예상과 달리 유도만능줄기세포가 면역반응을 발생시킨다는 연구결과에 따라 이를 개선하기 위한 다른 방안의 필요성이 대두되고 있다. As described above, the induced pluripotent stem cells used to induce germline stem cells do not have immune rejection reactions using somatic cells recovered from each individual, and were considered to be more free from the bioethical problem that was criticized in embryonic stem cell research. However, a high frequency of cancer occurrence and DNA mutations have been reported due to the instability of the induced pluripotent stem cell genome due to the insertion of an external gene. There is a need for other ways to do this.

한편, 신경줄기세포 (neural stem cells) 또는 이를 포함하는 신경구 (neurospheres)가 생식세포로 전환될 수 있는지에 대하여는 알려진 바 없으며, 줄기세포 생물학에 있어 이러한 전환 가능성을 연구하는 것은 매우 중요하다.On the other hand, it is not known whether neural stem cells or neurospheres containing them can be converted into germ cells, and it is very important to study the possibility of such conversion in stem cell biology.

대한민국 등록특허공보 제10-2182513호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2182513

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 신경줄기세포를 포함하는 신경구를 생식선 줄기세포로 전환하기 위한 조건 및 방법을 개발하기 위해 예의 연구한 결과 완성된 것이다.The present invention has been devised to solve the above problems, and has been completed as a result of intensive research to develop conditions and methods for converting neural spheres including neural stem cells into germline stem cells.

따라서, 본 발명의 목적은 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for converting neurospheres into germline stem cells.

본 발명의 다른 목적은 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for conversion from neurospheres to germline stem cells.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 전환 방법에 의해 전환된 생식선 줄기세포를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide germline stem cells transformed by the above transformation method.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical task to be achieved by the present invention is not limited to the tasks mentioned above, and other tasks not mentioned may be clearly understood by those of ordinary skill in the art to which the present invention belongs from the following description. There will be.

본 발명은 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법으로서, The present invention provides a method for converting a neurosphere into a germline stem cell, comprising:

생식선 줄기세포 전환배지에서 지지세포와 함께 신경구를 배양하는 단계를 포함하고,Including the step of culturing neurospheres with support cells in germline stem cell conversion medium,

상기 생식선 줄기세포 전환배지는 성장인자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법을 제공한다.The germline stem cell conversion medium provides a method for converting germline stem cells from neurospheres, characterized in that it contains growth factors.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 신경구는 Musashi1 (Msi1), Nestin, 및 Notch2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질을 발현할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the neurosphere may express one or more proteins selected from the group consisting of Musashi1 (Msi1), Nestin, and Notch2, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 성장인자는 교세포 신경성장인자, GDNF 패밀리 수용체 알파-1, 및 기초 섬유아세포 성장인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the growth factor may be one or more selected from the group consisting of glial nerve growth factor, GDNF family receptor alpha-1, and basal fibroblast growth factor, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생식선 줄기세포 전환배지는 무혈청 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the germline stem cell conversion medium may be a serum-free medium, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 지지세포는 배아섬유아세포 (embryonic fibroblasts)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the support cells may be embryonic fibroblasts, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 지지세포는 Sandos inbred mice (SIM) 6-thioguanine-resistant, ouabain-resistant (STO) 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the support cells may be Sandos inbred mice (SIM) 6-thioguanine-resistant, ouabain-resistant (STO) cells, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 신경구는 3 내지 7주 동안 배양될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the neurosphere may be cultured for 3 to 7 weeks, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 분리된 신경줄기세포를 줄기세포 배양배지에서 배양하여 신경구를 형성하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In another embodiment of the present invention, the method may further include the step of culturing the isolated neural stem cells in a stem cell culture medium to form a neurosphere, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 신경구, 지지세포, 성장인자, 및 무혈청 배지를 유효 성분으로 포함하는 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for conversion from neurospheres to germline stem cells comprising neurospheres, support cells, growth factors, and a serum-free medium as active ingredients.

또한, 본 발명은 신경구, 지지세포, 및 성장인자를 유효 성분으로 포함하는 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 배지 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 무혈청 배지 성분을 더 포함할 수 있다. In addition, the present invention provides a composition for conversion from neurospheres to germline stem cells comprising neurospheres, support cells, and growth factors as active ingredients. The composition includes a medium composition. The composition may further include a serum-free medium component.

또한, 본 발명은 상기 조성물의 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides the use of the composition for conversion from neurospheres to germline stem cells.

또한, 본 발명은 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환용 배지 및/또는 제제 제조를 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.The present invention also provides the use of the composition for the preparation of a medium and/or preparation for the conversion from neurospheres to germline stem cells.

본 발명은 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법 등에 관한 것으로서, 신경줄기세포가 포함된 신경구를 생식선 세포로 전환할 수 있는 조건 및 방법을 개발하여 완성된 것이다. 본 발명에 따른 생식선 줄기세포로의 전환 방법은 유전적 변형 없이, 배양 조건 등 환경적 변화만을 이용하여 신경구를 생식선 줄기세포로 전환시킬 수 있다는 점에 특징이 있다. 특히, 본 발명에 따른 전환 방법으로 생성된 생식선 줄기세포는 정상적인 정자세포 형성능을 갖는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명은 생식 생물학의 이해 및 남성 불임치료를 위한 기반 기술로 유용하게 활용될 것으로 기대된다.The present invention relates to a method for converting a neurosphere into a germline stem cell, and the like, and has been completed by developing conditions and a method for converting a neurosphere containing neural stem cells into a germline cell. The method for converting germline stem cells according to the present invention is characterized in that it can convert neurospheres into germline stem cells using only environmental changes such as culture conditions without genetic modification. In particular, it was confirmed that the germline stem cells produced by the conversion method according to the present invention have normal sperm cell-forming ability. Therefore, the present invention is expected to be usefully utilized as a basis for understanding reproductive biology and treatment of male infertility.

도 1은 본 발명에 따른 신경구로부터 유도-생식선 줄기세포로의 전환을 위한 배양 조건을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 신경줄기세포 및 신경구의 체외 배양 양상을 나타낸 것이다 (×20, Scale bar=100 μm).
도 3은 체외 배양된 신경구에서 신경줄기세포 관련 마커들의 발현을 면역세포화학염색 분석을 통해 관찰한 결과이다 (×40, Scale bar=50 μm).
도 4는 젤라틴 선별 (gelatin selection) 이후 상층 및 하층에서 각각 회수된 생식선 줄기세포를 형광현미경 하 green fluorescent protein (GFP)를 이용하여 관찰한 결과이다 (×10, Scale bar=200 μm).
도 5a는 본 발명에 따른 전환을 위한 배양 환경에서 신경구 세포의 형태학적 변화를 형광현미경 하 GFP를 이용하여 관찰한 결과이다 (이미지 1: ×20, Scale bar=100 μm; 이미지 2 및 3: ×10, Scale bar=200 μm; 이미지 4 내지 6: ×20, Scale bar=100 μm).
도 5b는 신경구세포 (NSC), 생식선 줄기세포 (GSC), 및 유도-생식선 줄기세포 (NGSC)의 증식 양상을 형광현미경 하 GFP를 이용하여 관찰한 결과이다 (×20, Scale bar=100 μm).
도 5c는 신경구세포, 생식선 줄기세포, 및 유도-생식선 줄기세포의 증식율을 비교한 그래프이다.
도 6a는 신경구 세포로부터 유래한 GFP 발현 유도-생식선 줄기세포의 정소 내 이식 후 형광현미경을 이용하여 유도-생식선 줄기세포의 콜로니를 관찰한 결과이다. 이미지 A는 GFP 발현 유도-생식선 줄기세포의 정소 내 이식 2 내지 3개월 후, 마우스로부터 분리된 정소를 나타낸다 (×1.5, Scale bar=2mm). 이미지 B 및 C는 세정관 내 GFP 발현 유도-생식선 줄기세포로부터 형성된 콜로니를 나타낸다 (B: ×8, Scale bar=500 μm; C: ×2, Scale bar=1 mm). 이미지 D는 이식 후 분리된 세정관으로부터 회수된 생식세포 및 정자를 나타낸다 (×40, Scale bar=50 μm).
도 6b는 신경구 세포로부터 유래한 유도-생식선 줄기세포의 정소 내 이식 후 마우스로부터 정소의 동결 절편을 획득하여 형광현미경 하 GFP 발현 양상을 관찰하여 정자 형성 과정을 확인한 결과이다 (×40, Scale bar=50 μm).1 is a schematic representation of the culture conditions for the conversion from neurospheres to induced-gonads stem cells according to the present invention.
2 shows the in vitro culture of neural stem cells and neurospheres (×20, Scale bar=100 μm).
3 is a result of observation of the expression of neural stem cell-related markers in vitro cultured neurospheres through immunocytochemical staining analysis (×40, Scale bar = 50 μm).
4 shows the results of observation of germline stem cells recovered from the upper and lower layers after gelatin selection using green fluorescent protein (GFP) under a fluorescence microscope (×10, Scale bar=200 μm).
Figure 5a is the result of observing the morphological change of neurosphere cells in the culture environment for conversion according to the present invention using GFP under a fluorescence microscope (image 1: × 20, scale bar = 100 μm; images 2 and 3: × 10, Scale bar=200 μm; images 4 to 6: ×20, Scale bar=100 μm).
Figure 5b is the result of observing the proliferation pattern of neurosphere cells (NSC), germline stem cells (GSC), and induced-germline stem cells (NGSC) using GFP under a fluorescence microscope (×20, Scale bar=100 μm) .
Figure 5c is a graph comparing the proliferation rates of neurosphere cells, germline stem cells, and induced-gonads stem cells.
FIG. 6a is a result of observing colonies of induced-gonadal stem cells using a fluorescence microscope after GFP expression-derived neurosphere-derived-germline stem cells were transplanted into the testis. Image A shows testis isolated from a mouse 2 to 3 months after GFP expression induction-transplantation of germline stem cells into the testis (×1.5, Scale bar=2 mm). Images B and C show colonies formed from GFP expression induction-germline stem cells in tubules (B: ×8, Scale bar=500 μm; C: ×2, Scale bar=1 mm). Image D shows the germ cells and sperm recovered from the separated tubules after transplantation (×40, Scale bar=50 μm).
Figure 6b is the result of confirming the spermatogenesis process by observing the GFP expression pattern under a fluorescence microscope by obtaining a frozen section of the testis from a mouse after intra-testis transplantation of induced-gonad stem cells derived from neurosphere cells (×40, Scale bar = 50 μm).

본 발명은 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법 등에 관한 것으로서, 신경줄기세포가 포함된 신경구를 생식선 세포로 전환할 수 있는 조건 및 방법을 개발하여 완성된 것이다.The present invention relates to a method for converting a neurosphere into a germline stem cell, and the like, and has been completed by developing conditions and a method for converting a neurosphere containing neural stem cells into a germline cell.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 생쥐 배아 뇌 조직으로부터 신경줄기세포를 분리하여 성장인자를 포함한 줄기세포 배양배지에서 배양한 결과 신경구가 형성되는 것을 확인하였으며 (실시예 1), 상기 신경구는 신경줄기세포를 포함하는 것으로서 신경줄기세포 특이적 마커를 발현하는 것을 확인하였다 (실시예 2). Specifically, in one embodiment of the present invention, it was confirmed that neurospheres were formed as a result of isolating neural stem cells from mouse embryonic brain tissue and culturing them in a stem cell culture medium containing growth factors (Example 1), the neural stem cells It was confirmed that the expression of a neural stem cell-specific marker as comprising (Example 2).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 신경구를 본 발명에 따른 생식선 줄기세포 전환배지에서 배양한 후 젤라틴 선별을 진행한 결과 형태학적으로 생식선 줄기세포와 유사한 세포를 다량 회수할 수 있었다 (실시예 3). In another embodiment of the present invention, as a result of gelatin selection after culturing the neurospheres in the germline stem cell conversion medium according to the present invention, a large amount of cells morphologically similar to germline stem cells were recovered (Example 3) .

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 신경구를 본 발명에 따른 생식선 줄기세포 전환배지에서 배양한 결과 신경구로부터 전환된 유도-생식선 줄기세포는 정원줄기세포와 유사한 체외 증식 양상을 나타내는 것을 확인하였다 (실시예 4).In another embodiment of the present invention, as a result of culturing the neurospheres in the germline stem cell conversion medium according to the present invention, it was confirmed that the induced-gonadal stem cells converted from the neurospheres exhibited an in vitro proliferation pattern similar to that of spermatogonial stem cells (Execution) Example 4).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 신경구로부터 전환된 유도-생식선 줄기세포를 정자 생산 능력이 결핍된 마우스의 정소에 이식한 결과, 정상적인 정자 형성이 이루어지는 것을 확인하였다 (실시예 5).In another embodiment of the present invention, it was confirmed that normal spermatogenesis was achieved as a result of transplanting induced-gonadstem stem cells converted from neurospheres into the testis of mice lacking the ability to produce sperm (Example 5).

따라서, 본 발명은 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법으로서,Accordingly, the present invention provides a method for converting neurospheres into germline stem cells,

생식선 줄기세포 전환배지에서 지지세포와 함께 신경구를 배양하는 단계를 포함하고,Including the step of culturing neurospheres with support cells in germline stem cell conversion medium,

상기 생식선 줄기세포 전환배지는 성장인자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법을 제공한다.The germline stem cell conversion medium provides a method for converting germline stem cells from neurospheres, characterized in that it contains a growth factor.

본 발명에 있어서, “신경구 (neurospheres)”는 적절한 증식 조건 하에서 신경줄기세포 및 신경전구세포의 결과로서 형성된 부유하는 구체 (sphere)를 형성하는, 신경줄기세포 및 신경전구세포의 세포 응집체 (aggregate)를 의미한다. 본 발명에 있어서, 신경구는 바람직하게는 신경줄기세포를 포함하는 것이다. 즉, 본 발명에 따른 신경구는 바람직하게는 신경줄기세포 특이적 마커인 Msi1, Nestin, 및/또는 Notch2를 발현할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 신경구는 신경줄기세포를 배양 (바람직하게는, 체외 배양) 하여 획득된 것일 수 있다. 이 경우, 본 발명에 따른 신경구는 패시지 (passages)가 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 2 내지 10, 3 내지 10, 4 내지 10, 5 내지 10, 6 내지 10, 7 내지 10, 8 내지 10, 2 내지 9, 3 내지 8, 또는 4 내지 7일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 신경구는 패시지가 10 이하인 것이다. In the present invention, "neurospheres" refers to cell aggregates of neural stem cells and neural progenitor cells that form floating spheres formed as a result of neural stem cells and neural progenitor cells under appropriate proliferative conditions. do. In the present invention, the neurosphere preferably contains neural stem cells. That is, the neurosphere according to the present invention may preferably express neural stem cell-specific markers Msi1, Nestin, and/or Notch2. In the present invention, the neurosphere may be obtained by culturing neural stem cells (preferably, in vitro culture). In this case, the neurosphere according to the present invention has passages 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 2 to 10, 3 to 10, 4 to 10, 5 to 10, 6 to 10, 7 to 10, 8 to 10, 2 to 9, 3 to 8, or 4 to 7, but is not limited thereto. Preferably, the neurosphere according to the present invention has a passage of 10 or less.

본 발명에 있어서, “생식선 줄기세포”는 성체줄기세포 (adult stem cells)의 일종으로, 정원줄기세포 또는 난모세포 전구 줄기세포를 포함한다. 특히, 정원줄기세포는 자가증식 및 분화를 통해 정자를 만들 수 있는 단일 분화능을 갖는 세포를 의미한다. 생식선 줄기세포는 그 수가 매우 적고, 정소 내에서 지지세포 사이의 안전한 곳에 휴지 상태로 존재하며, 지지세포를 포함하는 외부 신호와의 교류에 의해 증식 및 분화가 조절되는 것을 특징으로 한다.In the present invention, "germline stem cells" are a type of adult stem cells, including spermatogonial stem cells or oocyte progenitor stem cells. In particular, spermatogonial stem cells refer to cells with a single differentiation ability capable of producing sperm through self-renewal and differentiation. Germline stem cells are characterized in that the number is very small, they exist in a resting state in a safe place between support cells in the testis, and proliferation and differentiation are regulated by exchange with external signals including support cells.

본 발명에 있어서, “전환 (conversion)”이란 특정 세포가 다른 특징을 갖는 세포로 변화되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 전환은 전환분화 (trans-differentiation) 또는 교차분화를 포함한다. 본 발명에 있어서, “신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환”이란 신경줄기세포 등을 포함한 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 완전한 전환이 유도된 경우뿐만 아니라, 생식선 줄기세포 특이적인 단백질을 발현하는 세포로 전환이 유도된 경우도 포함한다. 상기 생식선 줄기세포 또는 생식세포 특이적인 단백질은, 예를 들면, Lhx1, Pax7, Bmi1, GFRα1, Bcl6b, Etv5, Id4, Piwil2, Ret, Sall4, Thy1, Zbtb16, Sohlh1, Kit, 및/또는 Dazl 유전자 등으로부터 발현되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서, 신경구로부터 전환된 생식선 줄기세포는 “유도-생식선 줄기세포”로 지칭될 수 있다.In the present invention, “conversion” means that a specific cell is changed into a cell having other characteristics. Preferably, the transformation according to the invention comprises trans-differentiation or cross-differentiation. In the present invention, "conversion from neurospheres to germline stem cells" means not only when complete conversion from neurospheres, including neural stem cells, to germline stem cells, is induced, but also conversion to cells expressing germline stem cell-specific proteins. Including induced cases. The germline stem cell or germline-specific protein is, for example, Lhx1, Pax7, Bmi1, GFRα1, Bcl6b, Etv5, Id4, Piwil2, Ret, Sall4, Thy1, Zbtb16, Sohlh1, Kit, and/or Dazl genes, etc. It may be expressed from, but is not limited thereto. In the present invention, germline stem cells converted from neurospheres may be referred to as “derived-gonad stem cells”.

본 발명에 있어서, “배지 (media)”는 당업계에 알려진 세포 배양용 배지라면 제한 없이 포함될 수 있으며, 인위적으로 제조한 배지는 물론 상용화된 배지가 모두 포함된다. 나아가, 본 발명에 따른 배지는 당업계에서 통상적으로 이용 가능한 세포 배양용 배지 첨가물을 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 배지의 구체적인 예로는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 배지는 무혈청 배지, 즉, 혈청 (serum)을 포함하지 않는 배지일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 배지는 마우스 무혈청 배지 (mouse serum free media, mSFM)일 수 있다. 상기 mSFM의 구체적인 조성은 Biol Reprod.　2004 Sep;71(3):722-31 등에 공지되어 있다.In the present invention, "medium" may be included without limitation as long as it is a cell culture medium known in the art, and includes both artificially prepared medium as well as commercialized medium. Furthermore, the medium according to the present invention may include, without limitation, medium additives for cell culture commonly available in the art. Specific examples of the medium include DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), Isocove's Modified Dulbecco's Medium, and the like. Preferably, the medium according to the present invention may be a serum-free medium, that is, a medium free of serum. More preferably, the medium according to the present invention may be mouse serum free media (mSFM). The specific composition of the mSFM can be found in Biol Reprod. 2004 Sep;71(3):722-31 and the like.

본 발명에 있어서, “지지세포 (feeder cells)”란 배아줄기세포의 미분화 상태를 유지하는데 기여하는 영양인자들을 분비하고, 세포 접촉으로 매개되는 미분화 유지기작을 일으키는 세포를 의미한다. 지지세포에서 분비되는 신호전달 물질들은 배아줄기세포의 미분화 유지 또는 분화 개시를 조절하는데 기여한다. 지지세포로부터 분비되는 물질들은 Wnt (Wingless-type MMTV integration site family), BMPs (Bone Morphogenetic Proteins), TGF-β (Transforming Growth Factor-beta), 세포외기질 (extracellular matrix) 등이 있다. 본 발명에 따른 지지세포는 배아섬유아세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 지지세포는 STO 세포, 및 MEF 세포 (mouse embryonic fibroblasts) 등에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 지지세포는 STO 세포이다. In the present invention, the term “feeder cells” refers to cells that secrete nutrient factors contributing to maintaining the undifferentiated state of embryonic stem cells, and cause undifferentiated maintenance mechanisms mediated by cell contact. Signaling substances secreted from support cells contribute to the maintenance of undifferentiated embryonic stem cells or the regulation of differentiation initiation. Substances secreted from support cells include Wingless-type MMTV integration site family (Wnt), Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), Transforming Growth Factor-beta (TGF-β), and extracellular matrix. The support cells according to the present invention may be embryonic fibroblasts. More preferably, the support cells according to the present invention may be selected from STO cells and MEF cells (mouse embryonic fibroblasts), but is not limited thereto. Most preferably, the support cells according to the present invention are STO cells.

본 발명에 있어서, 일정한 배양환경에서 신경구 총 수 (total number) 대비 지지세포의 총 수의 비율은 1 : 0.1 내지 5, 1 : 0.1 내지 4.5, 1 : 0.1 내지 4, 1 : 0.1 내지 3.5, 1 : 0.1 내지 3, 1 : 0.1 내지 2.5, 1 : 0.1 내지 2, 1 : 0.2 내지 5, 1 : 0.2 내지 4.5, 1 : 0.2 내지 4, 1 : 0.2 내지 3.5, 1 : 0.2 내지 3, 1 : 0.2 내지 2.5, 또는 1 : 0.2 내지 2 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the present invention, the ratio of the total number of support cells to the total number of neurospheres in a constant culture environment is 1: 0.1 to 5, 1: 0.1 to 4.5, 1: 0.1 to 4, 1: 0.1 to 3.5, 1 : 0.1 to 3, 1: 0.1 to 2.5, 1: 0.1 to 2, 1: 0.2 to 5, 1: 0.2 to 4.5, 1: 0.2 to 4, 1: 0.2 to 3.5, 1: 0.2 to 3, 1: 0.2 to 2.5, or 1: 0.2 to 2, but is not limited thereto.

또한, 본 발명에 따른 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법에 있어서, 상기 신경구와 지지세포는 혼합된 상태로 배양될 수 있고, 지지세포 층 (layer)의 상단 또는 하단에서 신경구가 배양되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서 신경구는 지지세포 또는 지지세포 층 위에서 배양된다. In addition, in the method for converting a neurosphere to a germline stem cell according to the present invention, the neurosphere and the supporting cell may be cultured in a mixed state, and the neurosphere may be cultured at the top or the bottom of the supporting cell layer. have. Preferably, in the present invention, the neurospheres are cultured on support cells or a layer of support cells.

본 발명에 있어서, “성장인자 (growth factor)”란 세포 증식 및 세포 분화 등을 자극할 수 있는 물질을 의미하며, 일반적으로는 분비 단백질 또는 스테로이드 호르몬에 속한다. 성장인자는 세포 사이의 신호 분자로 작용하여 세포 증식을 촉진한다. 본 발명에 있어서, 성장인자의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 신경세포 성장인자 또는 섬유아세포 성장인자일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 성장인자는 교세포 신경성장인자 (glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF), GDNF 패밀리 수용체 알파-1 (GDNF family receptor alpha-1, GFRα1), 및 기초 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. In the present invention, "growth factor" means a substance capable of stimulating cell proliferation and cell differentiation, etc., and generally belongs to a secreted protein or a steroid hormone. Growth factors act as signaling molecules between cells and promote cell proliferation. In the present invention, the specific type of the growth factor is not limited, but may preferably be a nerve cell growth factor or a fibroblast growth factor. More preferably, the growth factor according to the present invention is glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), GDNF family receptor alpha-1 (GFRα1), and basal fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor, bFGF) may be at least one selected from the group consisting of.

각 성장인자의 처리 농도에는 제한이 없으나, 교세포 신경성장인자의 처리 농도는 1 내지 40 ng/mL, 1 내지 35 ng/mL, 1 내지 30 ng/mL, 1 내지 25 ng/mL, 1 내지 20 ng/mL, 1 내지 15 ng/mL, 1 내지 10 ng/mL, 1 내지 5 ng/mL, 5 내지 40 ng/mL, 10 내지 40 ng/mL, 15 내지 40 ng/mL, 20 내지 40 ng/mL, 25 내지 40 ng/mL, 30 내지 40 ng/mL, 35 내지 40 ng/mL, 15 내지 35 ng/mL, 15 내지 30 ng/mL, 15 내지 25 ng/mL, 15 내지 20 ng/mL, 18 내지 25 ng/mL, 또는 18 내지 22 ng/mL 에서 선택될 수 있다.There is no limitation on the treatment concentration of each growth factor, but the treatment concentration of the glial nerve growth factor is 1 to 40 ng/mL, 1 to 35 ng/mL, 1 to 30 ng/mL, 1 to 25 ng/mL, 1 to 20 ng/mL, 1-15 ng/mL, 1-10 ng/mL, 1-5 ng/mL, 5-40 ng/mL, 10-40 ng/mL, 15-40 ng/mL, 20-40 ng /mL, 25-40 ng/mL, 30-40 ng/mL, 35-40 ng/mL, 15-35 ng/mL, 15-30 ng/mL, 15-25 ng/mL, 15-20 ng/mL mL, 18-25 ng/mL, or 18-22 ng/mL.

또한, GDNF 패밀리 수용체 알파-1의 처리 농도에는 제한이 없으나, 50 내지 300 ng/mL, 50 내지 250 ng/mL, 50 내지 200 ng/mL, 50 내지 180 ng/mL, 50 내지 170 ng/mL, 50 내지 160 ng/mL, 80 내지 300 ng/mL, 90 내지 300 ng/mL, 100 내지 300 ng/mL, 110 내지 300 ng/mL, 120 내지 300 ng/mL, 130 내지 300 ng/mL, 140 내지 300 ng/mL, 80 내지 200 ng/mL, 90 내지 190 ng/mL, 100 내지 180 ng/mL, 110 내지 170 ng/mL, 120 내지 160 ng/mL, 130 내지 160 ng/mL, 또는 140 내지 160 ng/mL 에서 선택될 수 있다.In addition, the treatment concentration of the GDNF family receptor alpha-1 is not limited, but 50 to 300 ng/mL, 50 to 250 ng/mL, 50 to 200 ng/mL, 50 to 180 ng/mL, 50 to 170 ng/mL , 50-160 ng/mL, 80-300 ng/mL, 90-300 ng/mL, 100-300 ng/mL, 110-300 ng/mL, 120-300 ng/mL, 130-300 ng/mL, 140-300 ng/mL, 80-200 ng/mL, 90-190 ng/mL, 100-180 ng/mL, 110-170 ng/mL, 120-160 ng/mL, 130-160 ng/mL, or 140 to 160 ng/mL.

또한, 기초 섬유아세포 성장인자의 처리 농도에는 제한이 없으나, 0.1 내지 5 ng/mL, 0.2 내지 4 ng/mL, 0.3 내지 3 ng/mL, 0.4 내지 2 ng/mL, 0.5 내지 2 ng/mL, 0.6 내지 2 ng/mL, 0.8 내지 2 ng/mL, 0.9 내지 2 ng/mL, 0.1 내지 2 ng/mL, 0.2 내지 1.8 ng/mL, 0.4 내지 1.6 ng/mL, 0.6 내지 1.4 ng/mL, 0.8 내지 1.2 ng/mL, 또는 0.9 내지 1.1 ng/mL 에서 선택될 수 있다.In addition, the treatment concentration of the basal fibroblast growth factor is not limited, but 0.1 to 5 ng/mL, 0.2 to 4 ng/mL, 0.3 to 3 ng/mL, 0.4 to 2 ng/mL, 0.5 to 2 ng/mL, 0.6-2 ng/mL, 0.8-2 ng/mL, 0.9-2 ng/mL, 0.1-2 ng/mL, 0.2-1.8 ng/mL, 0.4-1.6 ng/mL, 0.6-1.4 ng/mL, 0.8 to 1.2 ng/mL, or 0.9 to 1.1 ng/mL.

또한, 본 발명에 있어서 교세포 신경성장인자 : GDNF 패밀리 수용체 알파-1 : 기초 섬유아세포 성장인자의 각 처리 농도 (w/v)의 비율은 1 내지 40 : 1 내지 300 : 1 비율, 5 내지 35 : 50 내지 250 : 1 비율, 10 내지 30 : 100 내지 200 : 1 비율, 15 내지 25 : 120 내지 180 : 1 비율, 15 내지 25 : 130 내지 170 : 1 비율, 17 내지 23 : 140 내지 160 : 1 비율, 18 내지 22 : 145 내지 155 : 1 비율, 또는 20 : 150 : 1 비율에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In addition, in the present invention, the ratio of glial nerve growth factor: GDNF family receptor alpha-1: each treatment concentration (w/v) of basal fibroblast growth factor is 1 to 40: 1 to 300: 1 ratio, 5 to 35: 50 to 250 : 1 ratio, 10 to 30 : 100 to 200 : 1 ratio, 15 to 25 : 120 to 180 : 1 ratio, 15 to 25 : 130 to 170 : 1 ratio, 17 to 23 : 140 to 160 : 1 ratio , 18 to 22: 145 to 155: 1 ratio, or 20: 150: 1 ratio may be selected, but is not limited thereto.

또한, 본 발명에 따른 생식선 줄기세포 전환배지는 사이토카인을 추가로 포함할 수 있다. 사이토카인의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, CXCL12 (C-X-C Motif Chemokine Ligand 12), CSF1 (colony stimulating factor 1), WNTs, GDNF, FGFs, TGFβs, Activins, 및 BMPs 등으로부터 선택될 수 있다.In addition, the germline stem cell conversion medium according to the present invention may further include cytokines. Specific types of cytokines are not limited, but may be selected from CXCL12 (C-X-C Motif Chemokine Ligand 12), CSF1 (colony stimulating factor 1), WNTs, GDNF, FGFs, TGFβs, Activins, and BMPs.

본 발명에 있어서, 신경구는 3 내지 7주, 3 내지 6주, 3 내지 5주, 4 내지 7주, 5 내지 7주, 또는 4 내지 6주; 또는 20 내지 50일, 30 내지 50일, 40 내지 50일, 20 내지 40일, 20 내지 30일, 또는 30 내지 40일 동안 배양되어 생식선 줄기세포로의 전환이 유도될 수 있다. In the present invention, the neurosphere is 3 to 7 weeks, 3 to 6 weeks, 3 to 5 weeks, 4 to 7 weeks, 5 to 7 weeks, or 4 to 6 weeks; Alternatively, the cells may be cultured for 20 to 50 days, 30 to 50 days, 40 to 50 days, 20 to 40 days, 20 to 30 days, or 30 to 40 days to induce conversion to germline stem cells.

본 발명은 또한, 신경구를 생식선 줄기세포 전환배지에서 배양하는 단계 이전에, 분리된 신경줄기세포를 줄기세포 배양배지에서 배양하여 신경구를 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 신경줄기세포는 개체 (인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류)의 뇌 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 신경줄기세포는 배아의 뇌 조직으로부터 분리된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 마우스 배아의 뇌 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 줄기세포 배양배지는 표피생장인자 (epidermal growth factor, EGF), 및 기초 섬유아세포 성장인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 줄기세포 배양배지는 신경구 배양용 배지일 수 있다. The present invention may further include, before the step of culturing the neurospheres in the germline stem cell conversion medium, culturing the isolated neural stem cells in the stem cell culture medium to form the neurospheres. The neural stem cells may be isolated from brain tissue of an individual (human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, and mammal such as cattle). Preferably, the neural stem cells may be isolated from the brain tissue of an embryo, and more preferably, it may be isolated from the brain tissue of a mouse embryo. The stem cell culture medium may include epidermal growth factor (EGF), and basic fibroblast growth factor (bFGF). Preferably, the stem cell culture medium may be a medium for neurosphere culture.

바람직하게는, 상기 줄기세포 배양배지는 EGF를 1 내지 40 ng/mL, 1 내지 35 ng/mL, 1 내지 30 ng/mL, 1 내지 25 ng/mL, 1 내지 20 ng/mL, 1 내지 15 ng/mL, 1 내지 10 ng/mL, 1 내지 5 ng/mL, 5 내지 40 ng/mL, 10 내지 40 ng/mL, 15 내지 40 ng/mL, 20 내지 40 ng/mL, 25 내지 40 ng/mL, 30 내지 40 ng/mL, 35 내지 40 ng/mL, 15 내지 35 ng/mL, 15 내지 30 ng/mL, 15 내지 25 ng/mL, 15 내지 20 ng/mL, 18 내지 25 ng/mL, 또는 18 내지 22 ng/mL의 농도로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Preferably, the stem cell culture medium contains EGF 1 to 40 ng/mL, 1 to 35 ng/mL, 1 to 30 ng/mL, 1 to 25 ng/mL, 1 to 20 ng/mL, 1 to 15 ng/mL, 1-10 ng/mL, 1-5 ng/mL, 5-40 ng/mL, 10-40 ng/mL, 15-40 ng/mL, 20-40 ng/mL, 25-40 ng /mL, 30-40 ng/mL, 35-40 ng/mL, 15-35 ng/mL, 15-30 ng/mL, 15-25 ng/mL, 15-20 ng/mL, 18-25 ng/mL mL, or may contain a concentration of 18 to 22 ng/mL, but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 줄기세포 배양배지는 기초 섬유아세포 성장인자를 1 내지 20 ng/mL, 1 내지 15 ng/mL, 1 내지 13 ng/mL, 5 내지 20 ng/mL, 7 내지 15 ng/mL, 7 내지 13 ng/mL, 8 내지 12 ng/mL, 또는 9 내지 11 ng/mL으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Preferably, the stem cell culture medium contains a basal fibroblast growth factor of 1 to 20 ng/mL, 1 to 15 ng/mL, 1 to 13 ng/mL, 5 to 20 ng/mL, 7 to 15 ng/mL , 7 to 13 ng/mL, 8 to 12 ng/mL, or 9 to 11 ng/mL, but is not limited thereto.

본 발명은 또한, 신경구로부터 전환된 생식선 줄기세포를 확장 (expansion) 시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 확장 시키는 단계는 유도-생식선 줄기세포를 본 발명에 따른 생식선 줄기세포 전환배지에서 추가로 배양하는 단계일 수 있다. 상기 추가 배양은 3 내지 7주, 3 내지 6주, 3 내지 5주, 4 내지 7주, 5 내지 7주, 또는 4 내지 6주; 또는 20 내지 50일, 30 내지 50일, 40 내지 50일, 20 내지 40일, 20 내지 30일, 또는 30 내지 40일 동안 이루어질 수 있으나, 이는 예시일 뿐, 확장 단계의 배양 기간에는 제한이 없다. The present invention may further include the step of expanding the germline stem cells converted from the neurospheres (expansion). The expanding step may be a step of further culturing the induced-gonadal stem cells in the germline stem cell conversion medium according to the present invention. The additional culture may be performed for 3 to 7 weeks, 3 to 6 weeks, 3 to 5 weeks, 4 to 7 weeks, 5 to 7 weeks, or 4 to 6 weeks; Or it may be made for 20 to 50 days, 30 to 50 days, 40 to 50 days, 20 to 40 days, 20 to 30 days, or 30 to 40 days, but this is only an example, and there is no limit to the culture period of the expansion step. .

본 발명은 또한, 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환용 키트를 제공한다. 본 발명은 신경구 내지 신경줄기세포로부터 생식선 줄기세포로 전환시키기 위한 것이라면 구체적인 형태에 제한이 없으며, 생식선 줄기세포의 전환 및 증식을 위한 임의의 성분 및 기기를 제한 없이 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 키트는 신경구, 지지세포, 성장인자, 및 무혈청 배지를 유효 성분으로 포함할 수 있다. The present invention also provides a kit for conversion from neurospheres to germline stem cells. The present invention is not limited to a specific form as long as it is for conversion from neurospheres or neural stem cells to germline stem cells, and may include any component and device for conversion and proliferation of germline stem cells without limitation. Preferably, the kit according to the present invention may include neurospheres, support cells, growth factors, and a serum-free medium as active ingredients.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

[실험방법][Test method]

실험동물laboratory animal

본 발명의 동물실험은 중앙대학교 실험동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며, 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 발행된 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서에 따라 수행되었다. 마우스는 21 ± 2 ℃, 55 ± 10% 습도, 및 12시간의 낮/밤 주기 조건하에서 사육하였다. 실험에 사용한 마우스는 누드마우스 (Nude mouse) 및 C57BL/6-TG-EGFP (C57 GFP)이며, C57 GFP 마우스로부터 신경줄기세포를 포함한 신경구를 분리하여 실험에 이용하였다.The animal experiment of the present invention was approved by the Laboratory Animal Care and Use Committee of Chung-Ang University, and was performed according to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals issued by the National Institutes of Health. Mice were housed under conditions of 21 ± 2 °C, 55 ± 10% humidity, and a 12 hour day/night cycle. The mice used for the experiment were nude mice and C57BL/6-TG-EGFP (C57 GFP), and neurospheres including neural stem cells were isolated from C57 GFP mice and used for the experiment.

면역세포화학염색 분석 (Immunocytochemical Analysis)Immunocytochemical Analysis

세포수준에서 세포 내 특정 마커 단백질의 발현을 관찰하기 위해, 면역세포화학염색법을 실시하였다. 이를 위해, 신경구에 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)를 30분 동안 처리하여 세포를 고정하고, 세포막 투과성을 증가시키기 위해 DPBS에 희석한 0.1% Triton X-100을 실온에서 30분 동안 처리하였다. 상기 과정 후 세포에 5% (w/v) BSA(bovine serum albumin)(Sigma-Aldrich) 용액을 실온에서 30분 동안 처리해 비특이적인 결합을 억제하는 블로킹 (blocking) 과정을 실시하였다. 다음으로, 세포에 확인하고자 하는 단백질에 특이적인 1차 항체로서 Mouse anti-Notch2 (Santa Cruz, sc-518049), Mouse anti-Msi1 (Santa Cruz, sc-135721), Goat anti-Nestin (Santa Cruz, sc-21248) 를 5 % BSA 용액에 희석하여 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날, 세포를 DPBS로 2회 씻어내고 5 % BSA에 1:200으로 희석한 Alexa flour 568 goat anti-mouse (Thermo Fisher Scientific) 또는 Alexa flour 568 donkey anti-goat (Thermo Fisher Scientific) 2차 항체를 실온에서 빛을 차단한 채로 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세포를 DPBS로 다시 2번 씻어준 후 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 희석한 Vectashield 배지로 핵염색을 실시하였다. 이후 염색된 세포를 Nikon TE2000 형광현미경 (Nikon, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan)으로 관찰하여 단백질 발현정도를 평가하였다.In order to observe the expression of specific marker proteins in cells at the cellular level, immunocytochemical staining was performed. For this, the cells were fixed by treating the neurospheres with 4% paraformaldehyde for 30 minutes, and 0.1% Triton X-100 diluted in DPBS was treated at room temperature for 30 minutes to increase cell membrane permeability. After the above process, cells were treated with 5% (w/v) bovine serum albumin (Sigma-Aldrich) solution at room temperature for 30 minutes to perform a blocking process to inhibit non-specific binding. Next, as primary antibodies specific for the protein to be identified in cells, Mouse anti-Notch2 (Santa Cruz, sc-518049), Mouse anti-Msi1 (Santa Cruz, sc-135721), Goat anti-Nestin (Santa Cruz, sc-21248) was diluted in 5% BSA solution and reacted at 4 °C overnight. The next day, the cells were washed twice with DPBS and secondary antibody Alexa flour 568 goat anti-mouse (Thermo Fisher Scientific) or Alexa flour 568 donkey anti-goat (Thermo Fisher Scientific) diluted 1:200 in 5% BSA was added at room temperature. The reaction was carried out for 1 hour while blocking the light. After the reaction, the cells were washed twice again with DPBS, and then nuclear staining was performed with Vectashield medium diluted with DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Thereafter, the stained cells were observed with a Nikon TE2000 fluorescence microscope (Nikon, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan) to evaluate the protein expression level.

젤라틴 선별 (Gelatin selection)Gelatin selection

젤라틴은 정소를 구성하는 체세포인 정소 세포와 친화력을 가진 물질로서, 0.1% 젤라틴 (Gelatin from porcine skin gel strength 300 TypeA, Sigma, G2500)이 코팅된 배양접시는 정소 내 정원줄기세포의 분리 (isolation) 및 순수도증진 (enrichment)을 위해 사용된다. 이에 대한 자세한 설명으로서, 우선 0.1% 젤라틴을 배양접시 바닥에 분주 후, 30분 뒤 젤라틴을 제거함으로서 배양접시에 젤라틴을 코팅한다. 젤라틴이 코팅된 배양접시에 배양액과 세포를 함께 단기간동안 (약 30분), 5% CO2, 37도의 배양기에 배양할 경우, 하층에는 대부분 정소세포가 상층에는 대부분 미분화 정원세포가 위치하게 된다. 따라서 젤라틴 선별은 미분화 정원세포의 회수 및 선별을 위해 사용되는 방법이다. 반면, 신경줄기세포 및 신경세포는 젤라틴과 친화력이 비교적 강하여 배양시 젤라틴이 코팅된 배양접시를 이용하게 된다. 신경구를 생식선 줄기세포로 전환하는 과정에서 전환가능성이 높은 세포군을 선별하기 위해, 신경구의 생식선 줄기세포로의 전환과정 동안 계대배양 직전 젤라틴 선별을 진행하였고, 상층액의 세포를 회수하여 계대배양하였다.Gelatin is a substance that has affinity with testis cells, which are somatic cells that make up the testis, and a culture dish coated with 0.1% gelatin (Gelatin from porcine skin gel strength 300 TypeA, Sigma, G2500) is used for isolation of spermatogonial stem cells in the testis. and for enrichment. As a detailed description of this, first, 0.1% gelatin is dispensed on the bottom of the culture dish, and then the gelatin is removed after 30 minutes to coat the gelatin on the culture dish. When the culture medium and cells are cultured together in a gelatin-coated culture dish for a short period of time (about 30 minutes) in an incubator at 5% CO 2 , 37°C, most testis cells are located in the lower layer and most undifferentiated spermatogonial cells are located in the upper layer. Therefore, gelatin selection is a method used for the recovery and selection of undifferentiated spermatogonial cells. On the other hand, neural stem cells and nerve cells have a relatively strong affinity with gelatin, so that a gelatin-coated culture dish is used during culture. In order to select a cell group with high conversion potential in the process of converting neurospheres into germline stem cells, gelatin selection was performed immediately before subculture during the process of converting neurospheres into germline stem cells, and cells in the supernatant were recovered and subcultured.

정소 내 이식 (Transplantation)Transplantation in the testis

6주령의 수여동물 누드마우스에 부설판 (busulfan)을 복강내 주사하여 내인성 생식세포를 제거하였다. GFP 양성 유도-생식선 줄기세포를 공여세포로 사용하였으며, 50×106 cells/mL의 농도로 정소 내 이식했다. Ketamine (75 mg/kg) 및 medetomidine (0.5 mg/kg)를 이용해 수여동물을 마취시켰다. 공여세포는 원심성 관 (efferent ducts)을 통해 미세주입술로 마우스 고환에 이식했다 (Science. 2002 Jun 21;296(5576):2174-6). 이식 2~3개월 후, 수여 마우스 고환을 회수하고, 백막을 제거하여 세정관 분리를 통해 세포의 콜로니 형성 여부를 분석했다.Endogenous germ cells were removed by intraperitoneal injection of busulfan into 6-week-old nude mice. GFP-positive induced-gonadal stem cells were used as donor cells, and transplanted into the testis at a concentration of 50×10 6 cells/mL. The recipient animals were anesthetized with Ketamine (75 mg/kg) and medetomidine (0.5 mg/kg). Donor cells were implanted into mouse testes by microinjection through efferent ducts (Science. 2002 Jun 21;296(5576):2174-6). Two to three months after transplantation, the testes of the recipient mouse were recovered, the white membrane was removed, and the colony formation of cells was analyzed by separation of the tubules.

동결절편frozen section

유도-생식선 줄기세포의 정소 내 이식 후 2~3개월 뒤 회수된 마우스 고환은 4℃ 냉장고에서 4% 포름알데하이드에 8시간 동안 고정하였고, 고정된 시료는 고정액의 세정 및 치환조작을 위해 4℃ 냉장고에서 30% sucrose에 8시간 동안 처리하였다. 세정작업 후, 동결용 접시에 분주한 동결용 포매제인 OCT compound에 침전하여 -80℃에서 동결하였다. 동결된 조직은 동결절편기를 이용하여 10~20μm의 두께로 절편 후, slide glass를 조속히 절편에 붙였다. Slide glass는 신속하게 건조시킨 후, DPBS로 2 번 세정하여 형광현미경 하 관찰을 실시하였다.Mouse testes recovered 2-3 months after implantation of induced-gonadstem cells into testis were fixed in 4% formaldehyde in a refrigerator at 4°C for 8 hours. in 30% sucrose for 8 hours. After washing, it was precipitated in OCT compound, an embedding agent for freezing, dispensed in a freezing dish and frozen at -80°C. Frozen tissue was sectioned to a thickness of 10-20 μm using a cryosection, and then a slide glass was quickly attached to the section. After the slide glass was dried quickly, it was washed twice with DPBS and observed under a fluorescence microscope.

통계 분석statistical analysis

모든 통계 분석은 GraphPad Prism (버전 5)을 사용하여 수행되었다. 세포 집단 및 처리 조건에 따른 단백질 발현의 정량화는 편도 변화량 분석 (ANOVA) 및 Tukey post-hoc을 사용하여 평가되었으며, P<0.05가 통계적으로 유의하다고 간주하였다.All statistical analyzes were performed using GraphPad Prism (version 5). Quantification of protein expression according to cell population and treatment conditions was evaluated using one-way analysis of variance (ANOVA) and Tukey post-hoc, and P<0.05 was considered statistically significant.

[실시예][Example]

실시예 1. 생쥐 배아 뇌 조직으로부터 회수된 신경줄기세포의 분리 및 이를 포함하는 신경구의 배양Example 1. Isolation of neural stem cells recovered from mouse embryonic brain tissue and culture of neurospheres containing the same

신경줄기세포 분리를 위하여 embryonic day 14.5 (E14.5)의 수컷 C57BL/6-TG-EGFP (C57 GFP) 생쥐 배아를 공여동물로서 이용하였다. 멸균된 수술도구를 이용하여 배아로부터 뇌 조직을 회수하고, 회수된 조직은 DPBS로 두 번 washing 한 후, AccutaseTM 효소를 처리하였다. 효소처리가 덜 된 Debris 제거를 위해 40 μm pore size mesh를 이용하여 단일 세포군을 회수하였다. 회수된 단일 세포군은 성장인자로서 EGF 20 ng/mL와 bFGF 10 ng/mL를 포함하는 NeurocultTM 배지에서 체외 배양하였다. 회수된 신경줄기세포 및 이를 포함하는 신경구의 체외 배양 양상을 확인하기 위해 형광 현미경으로 GFP 발현을 관찰하였다 (도 2).For neural stem cell isolation, male C57BL/6-TG-EGFP (C57 GFP) mouse embryos on embryonic day 14.5 (E14.5) were used as donors. Brain tissue was recovered from the embryo using a sterile surgical tool, and the recovered tissue was washed twice with DPBS and then treated with Accutase TM enzyme. A single cell group was recovered using a 40 μm pore size mesh to remove the less enzyme-treated debris. The recovered single cell group was cultured in vitro in Neurocult TM medium containing 20 ng/mL of EGF and 10 ng/mL of bFGF as growth factors. GFP expression was observed with a fluorescence microscope to confirm the in vitro culture of the recovered neural stem cells and neurospheres containing them (FIG. 2).

실시예 2. 체외 배양된 신경구에서 신경줄기세포 특이적 마커 발현 양상 분석Example 2. Analysis of neural stem cell-specific marker expression patterns in in vitro cultured neurospheres

생식선 줄기세포로의 전환 유도 기법에 사용되는 신경줄기세포의 안정성 및 특성 평가를 위해 면역세포화학법을 이용하여 신경줄기세포 특이적 마커의 발현 양상을 분석하였다. 신경줄기세포 대표마커인 Msi1, Nestin, 및 Notch2에 결합하는 항체를 이용하였으며, 체외 배양된 신경구에서 신경줄기세포 특이마커의 정상적인 발현양상을 관찰하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 체외 배양된 신경구가 정상적으로 GFP를 발현할 뿐만 아니라 줄기세포 마커인 Msi1, Nestin, 및 Notch2를 모두 높은 수준으로 발현하는 것이 확인되었다. 상기 결과는 체외 배양된 신경구가 줄기세포능을 유지하는 신경줄기세포를 포함하고 있음을 뒷받침한다. 즉, 신경줄기세포를 포함하는 신경구의 안정적인 배양기법 및 이의 특성 분석을 위한 기반 기술을 구축하였음을 보여주는 것이다.In order to evaluate the stability and characteristics of neural stem cells used in the technique for inducing conversion to germline stem cells, the expression pattern of neural stem cell-specific markers was analyzed using immunocytochemistry. Antibodies binding to Msi1, Nestin, and Notch2, which are representative neural stem cell markers, were used, and normal expression patterns of neural stem cell-specific markers were observed in in vitro cultured neurospheres. As a result, as shown in FIG. 3 , it was confirmed that in vitro cultured neurospheres normally express GFP as well as express stem cell markers Msi1, Nestin, and Notch2 at high levels. The above results support that the in vitro cultured neurospheres contain neural stem cells that maintain stem cell capacity. That is, it shows that a stable culture method of neurospheres including neural stem cells and a base technology for characterization thereof have been established.

실시예 3. 신경줄기세포를 포함하는 신경구 세포를 활용한 전환 유도 조건 탐색을 위한 gelatin selection 유/무에 따른 전환 효율 검증Example 3. Verification of conversion efficiency according to the presence/absence of gelatin selection for the search for conversion induction conditions using neurosphere cells including neural stem cells

물리적 접근법으로서 세포외 기질 물질 (예를 들어 gelatin, collagen, fibronectin, laminin 등)은 정소로부터 회수된 생식선 줄기세포의 회수율 및 순수도 증진을 위해 이용된다. 특히 gelatin-coated dish를 이용한 gelatin selection은 간단한 사용법으로 접근이 용이하며, 효율이 높아 정원줄기세포의 순수도 증진을 위해 흔히 사용된다. 이를 기반으로 본 기술에서는 유도-생식선 줄기세포의 순수도 증진을 위해 gelatin selection을 진행하였으며, 결과적으로 gelatin selection 후 상층액에서 형태학적으로 생식선 줄기세포와 유사한 세포를 다량 회수할 수 있었다 (도 4). As a physical approach, extracellular matrix materials (eg, gelatin, collagen, fibronectin, laminin, etc.) are used to improve the recovery rate and purity of germline stem cells recovered from testis. In particular, gelatin selection using a gelatin-coated dish is easy to access with a simple method and is often used to improve the purity of garden stem cells due to its high efficiency. Based on this, in this technology, gelatin selection was performed to improve the purity of induced-gonadal stem cells, and as a result, a large amount of morphologically similar cells to germline stem cells were recovered from the supernatant after gelatin selection (Fig. 4). .

실시예 4. 유도-생식선 줄기세포로의 전환을 위한 체외배양 환경조건에서의 체외 증식 양상Example 4. Induction-In vitro proliferation pattern in in vitro culture environment conditions for conversion to germline stem cells

본 발명에서 확립된 배양 환경 조건 (STO feeder, GDNF 20 ng/mL, GFRα1 150 ng/mL, bFGF 1 ng/mL, 및 mSFM)을 이용하여 신경줄기세포의 전환을 유도한 후 신경구 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 전환 과정은 다음과 같다: 신경구의 단일세포 회수 후, 유도-생식선 줄기세포로의 전환을 위해 STO feeder 위에 GDNF 20 ng/mL, GFRα1 150 ng/mL, bFGF 1 ng/mL을 포함한 mSFM과 함께 37℃ 배양기에 1~2주간 배양하였다.Morphological changes of neurosphere cells after inducing the conversion of neural stem cells using the culture environment conditions established in the present invention (STO feeder, GDNF 20 ng/mL, GFRα1 150 ng/mL, bFGF 1 ng/mL, and mSFM) was observed. The conversion process is as follows: After single cell recovery of neurospheres, 37 with mSFM containing GDNF 20 ng/mL, GFRα1 150 ng/mL, and bFGF 1 ng/mL on STO feeder for conversion to induced-germline stem cells. Cultivated in an incubator for 1-2 weeks.

유도-생식선 줄기세포의 증식 양상을 관찰한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 초기에는 신경세포의 대표적인 특징인 신경돌기가 관찰되었으나, 전환이 유도됨에 따라 신경돌기가 감소하여 형태학적으로 생식선 줄기세포와 유사한 세포괴 형성이 관찰되었다. 장기배양을 통해 다른 타입의 세포를 제거함으로써 안정적인 유도-생식선 줄기세포를 확립하였으며, 세포의 형태 (세포괴 형성여부, 세포괴 크기, 및 세포괴 수)가 점점 정원줄기세포와 유사한 양상을 보이는 것을 확인하였다. As a result of observing the proliferative pattern of induction-gonal stem cells, as shown in FIG. 5a , neurites, which are typical features of neurons, were initially observed, but as the conversion was induced, the neurites decreased and morphologically the germline stem cells Cell mass formation similar to that was observed. Stable induced-germline stem cells were established by removing other types of cells through long-term culture, and it was confirmed that the cell morphology (cell mass formation, cell mass size, and cell mass number) gradually showed a pattern similar to that of spermatogonial stem cells.

또한 세포의 증식 양상도 생식선 줄기세포와 유사한 양상을 나타냈다 (도 5b 및 5c). 각 세포군 (신경구세포, 생식선 줄기세포, 유도-생식선 줄기세포)의 일주일 체외 배양 후 회수된 세포 수를 비교한 결과, 신경구 세포는 생식선 줄기세포와 비교하였을 때 5배 높은 증식 양상이 관찰되었다. 유도-생식선 줄기세포는 생식선 줄기세포보다 높은 증식 양상을 나타내긴 하였으나, 그 양상이 신경구 세포보다는 생식선 줄기세포와 더욱 유사했다.In addition, the proliferation pattern of the cells also showed a similar pattern to the germline stem cells (Figs. 5b and 5c). As a result of comparing the number of cells recovered after one week of in vitro culture of each cell group (neurocytes, germline stem cells, and induced-gonad stem cells), a 5-fold higher proliferation pattern was observed in neurosphere cells compared to germline stem cells. Although the induced-gonadal stem cells showed a higher proliferation pattern than the germline stem cells, the pattern was more similar to the germline stem cells than the neurosphere cells.

상기 결과는 본 발명에 따른 전환 조건에서 신경구 세포를 배양하는 경우 신경구 세포의 형태 및 성장 속도가 생식선 줄기세포의 특징을 반영하도록 변경될 수 있음을 보여주며, 이는 신경구-유래 생식선 줄기세포가 생성됨을 의미한다.The above results show that the morphology and growth rate of neurosphere cells can be changed to reflect the characteristics of germline stem cells when neurosphere cells are cultured in the conversion condition according to the present invention, which indicates that neurosphere-derived germline stem cells are produced. it means.

실시예 5. 유도-생식선 줄기세포의 줄기세포 활성도 및 정자형성능 확인Example 5. Confirmation of stem cell activity and spermatogenic performance of induction-gonadal stem cells

생식선 줄기세포의 정소 내 이식 기법은 생식선 줄기세포의 기능적 활성도를 확인할 수 있는 유일한 기법으로, 정소 내 콜로니의 형성 여부를 이식된 세포의 줄기세포적 특성 유지 여부를 검증할 수 있는 지표로 이용할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 유도-생식선 줄기세포 유래 생식세포 및 정자의 형성여부를 검증하기 위해 정소 내 미세세포주입기법 (transplantation)을 실시하였다. C57 GFP+ 유도-생식선 줄기세포를 부설판으로 내인성 생식세포가 제거된 누드 마우스의 정소 내 이식하였다. 즉, 상기 수여동물은 자체적인 정자 형성이 불가능하므로, 이의 정자 형성은 이식 후 공여동물의 줄기세포에 전적으로 의존한다. 이식 2개월 후 수여동물로부터 정소를 회수하여 형광현미경으로 정소 관찰 및 분석을 진행하였다. The testis transplantation technique of germline stem cells is the only technique that can confirm the functional activity of germline stem cells. . Therefore, in order to verify the formation of induced-gonadstem stem cell-derived germ cells and sperm according to the present invention, intra-testis microcell implantation was performed. C57 GFP + induced-germline stem cells were transplanted into the testis of nude mice in which endogenous germ cells were removed with busulfan. That is, since the recipient animal is unable to form sperm by itself, its spermatogenesis is entirely dependent on the stem cells of the donor animal after transplantation. Two months after transplantation, testes were recovered from the recipient animal, and testes were observed and analyzed under a fluorescence microscope.

결과는 도 6a에 나타냈다. 현미경 분석 결과, 정소 내에 C57 GFP를 발현하는 유도-생식선 줄기세포의 콜로니가 생성된 것이 확인되었다 (A, B 및 C). 정소 분석 후 GFP 양성 콜로니를 회수하여, GFP 양성 세정관만 절제하였다. 착상된 유도-생식선 줄기세포 및 이를 기반으로 분화된 생식세포와 정자 (하나의 줄기세포로부터 자가증식 및 분화된 세포집단을 콜로니라 칭한다.)를 절제된 세정관으로부터 포셉을 이용하여 눌러서 빼내었다 (D). 절제된 세정관으로부터 분리된 세포를 현미경 하 관찰한 결과, 유도-생식선 줄기세포로부터 분화된 생식세포에 박혀있는 정자를 관찰하였다 (D). 도 6a의 D는 절제된 세정관으로부터 회수된 분화된 생식세포괴 (오른쪽)와 이에 박혀있는 정자의 꼬리 (왼쪽)를 나타낸다.The results are shown in Figure 6a. As a result of microscopic analysis, it was confirmed that colonies of induced-germline stem cells expressing C57 GFP were generated in the testis (A, B and C). After testis analysis, GFP-positive colonies were recovered, and only GFP-positive tubules were excised. The implanted induced-gonad stem cells and the germ cells and sperm cells differentiated therefrom (a cell population that self-proliferates and differentiates from a single stem cell is called a colony) were removed from the excised tubule by pressing with forceps (D) ). As a result of observing the cells isolated from the excised tubules under a microscope, sperm embedded in germ cells differentiated from induced-gonad stem cells were observed (D). FIG. 6D shows the differentiated germ cell mass recovered from the excised tubules (right) and the tail of the sperm embedded therein (left).

다음으로 유도-생식선 줄기세포 이식 후 회수된 수여동물의 정소의 조직학 표본 분석을 통해, 세정관내 공여세포로부터 유래된 생식선 줄기세포의 착상, 증식 및 분화 양상을 분석하였다 (도 6b). 동결-절편된 조직학 표본을 형광현미경을 통해 분석한 결과, 유도-생식선 줄기세포가 세정관 기저부에 안정적으로 착상되었으며, 정상적인 정자 형성 과정이 수행된 것을 관찰하였다. Next, through the analysis of histological specimens of testes of recipient animals recovered after induced-gonadal stem cell transplantation, the implantation, proliferation and differentiation patterns of germline stem cells derived from donor cells in the tubules were analyzed ( FIG. 6B ). As a result of analyzing the frozen-sectioned histology specimens through a fluorescence microscope, it was observed that the induced-gonad stem cells were stably implanted at the base of the tubules, and the normal spermatogenesis process was performed.

상기 결과는 본 발명에 따른 신경구로부터 전환된 유도-생식선 줄기세포로가 생식선 줄기세포의 특성을 획득함과 동시에 정소 내 정원줄기세포로서의 정상적인 기능적 활성도 (정자 세포 형성)를 보유한다는 것을 보여준다. The above results show that the induced-gonadstem cells converted from the neurospheres according to the present invention acquire the characteristics of germline stem cells and at the same time retain the normal functional activity (sperm cell formation) as spermatogonial stem cells in the testis.

이상에서 살펴본 실시예들은 본 발명에 따른 생식선 줄기세포 전환 방법이 체외 배양 조건의 조절 및 젤라틴 선별만으로 전혀 다른 종류의 세포인 신경구세포로부터 생식선 줄기세포로의 전환할 수 있음을 실증하는 것이며, 나아가 신경줄기세포가 유도-생식선 줄기세포 생산에 유용한 신규 세포 자원으로서의 가능성이 있음을 보여주는 것이다.The above-described examples demonstrate that the germline stem cell conversion method according to the present invention can be converted into germline stem cells from a completely different type of cell, neurosphere cells, only by controlling in vitro culture conditions and selecting gelatin, and furthermore, neural stem cells This demonstrates that the blast cells have potential as novel cellular resources useful for the production of induced-germline stem cells.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.The foregoing description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

Claims (9)

신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법으로서,
신경줄기세포를 줄기세포 배양배지에서 배양하여 신경구를 형성하는 단계; 및
생식선 줄기세포 전환배지에서 지지세포와 함께 신경구를 배양하는 단계를 포함하고,
상기 신경구는 Msi1, Nestin, 및 Notch2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질을 발현하는 것이며,
상기 생식선 줄기세포 전환배지는 무혈청 배지로서 성장인자를 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 성장인자는 교세포 신경성장인자, GDNF 패밀리 수용체 알파-1, 및 기초 섬유아세포 성장인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이며,
상기 지지세포는 배아섬유아세포인 것을 특징으로 하는,
신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법.
A method for converting neurospheres to germline stem cells, comprising:
Forming a neurosphere by culturing the neural stem cells in a stem cell culture medium; and
Including the step of culturing neurospheres with support cells in germline stem cell conversion medium,
The neurosphere expresses one or more proteins selected from the group consisting of Msi1, Nestin, and Notch2,
The germline stem cell conversion medium is a serum-free medium, characterized in that it contains a growth factor, wherein the growth factor is at least one selected from the group consisting of glial nerve growth factor, GDNF family receptor alpha-1, and basal fibroblast growth factor. is,
The support cells are characterized in that the embryonic fibroblasts,
A method for converting neurospheres into germline stem cells.
 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 지지세포는 STO 세포인 것을 특징으로 하는, 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법.
According to claim 1,
The support cells are characterized in that the STO cells, the conversion method from the neurosphere to the germline stem cells.
 제1항에 있어서,
상기 신경구는 3 내지 7주 동안 배양되는 것을 특징으로 하는, 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환 방법.
According to claim 1,
The neurosphere is characterized in that the culture for 3 to 7 weeks, the conversion method from the neurosphere to germline stem cells.
 삭제delete 신경구, 지지세포, 성장인자, 및 무혈청 배지를 유효 성분으로 포함하는 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환용 키트로서,
상기 신경구는 Msi1, Nestin, 및 Notch2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질을 발현하는 것이고,
상기 성장인자는 교세포 신경성장인자, GDNF 패밀리 수용체 알파-1, 및 기초 섬유아세포 성장인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이며,
상기 지지세포는 배아섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 신경구로부터 생식선 줄기세포로의 전환용 키트.A kit for conversion from neurospheres to germline stem cells comprising neurospheres, support cells, growth factors, and a serum-free medium as active ingredients,
The neurosphere expresses one or more proteins selected from the group consisting of Msi1, Nestin, and Notch2,
The growth factor is at least one selected from the group consisting of glial nerve growth factor, GDNF family receptor alpha-1, and basal fibroblast growth factor,
The support cells are characterized in that the embryonic fibroblasts, the kit for conversion from neurospheres to germline stem cells.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050015866A (en) * 2003-08-08 2005-02-21 (주)아비코아생명공학연구소 Method for Culturing Avian Spermatogonial Stem Cells and Avian Spermatogonial Stem Cells Prepared thereby
KR20180082082A (en) * 2017-01-10 2018-07-18 중앙대학교 산학협력단 Method for germline stem cell from hair follicle cells and use thereof
KR102182513B1 (en) 2017-06-30 2020-11-25 인제대학교 산학협력단 Formulation of human derived cardiac stem cell spheroids and application thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050015866A (en) * 2003-08-08 2005-02-21 (주)아비코아생명공학연구소 Method for Culturing Avian Spermatogonial Stem Cells and Avian Spermatogonial Stem Cells Prepared thereby
KR20180082082A (en) * 2017-01-10 2018-07-18 중앙대학교 산학협력단 Method for germline stem cell from hair follicle cells and use thereof
KR102182513B1 (en) 2017-06-30 2020-11-25 인제대학교 산학협력단 Formulation of human derived cardiac stem cell spheroids and application thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Stem Cells Dev.2009 Dec;18(10):1433-1440 *

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