KR20200014671A - protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현에 의해 야기되는 식물 병원성 질환의 치료 또는 예방에 효과적이며, protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자를 특이적으로 선별하여 상기 식물 병원성 질환의 치료제 개발에 효과적일 수 있는 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법 {A composition for inhibiting phytopathogenic gram-negative bacterium comprising an inhibitor of protocatechuate 3,4-dioxygenase gene as an active ingredient and screening method thereof}
본 발명은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현에 의해 야기되는 식물 병원성 질환의 치료 또는 예방에 효과적이며, protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자를 특이적으로 선별하여 상기 식물 병원성 질환의 치료제 개발에 효과적일 수 있는 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
서로 다른 종에서의 비교 전사체 (comparative transcriptome) 분석은 동식물 및 인간을 위한 새로운 유전체 연구 분야로 각광 받고 있다. 이것은 수백만 년의 진화적 거리에도 불구하고 단일 유기체의 전사체가 다른 종을 포함하는 보편적인 모델로 작용하여, 생명활동의 생리적 반응에 있어 근원적인 기본 원리를 예측할 수 있게 한다는 것이다 지금까지 이러한 비교 전사체 연구는 진핵생물을 기반으로 이루어졌기에, 박테리아 특히 그 중에서도 식물 병원성 박테리아에서는 진행된 바가 없다.
최근 식물 병원성 박테리아에서도 식물 기주 (plant host) 감염 체계를 이해하기 위한, 식물 조직에서의 감염 과정 중 직접적으로 박테리아의 유전자 발현을 모니터링하는 in vivo 전사체에 관한 중요한 몇몇 연구가 진행된 바 있다. 2012년 Jacobs 연구진은 가장 파괴적인 병원성 박테리아로 토마토 (tomato), 담배 (tobacco), 감자 (potato)를 포함하는 많은 식물 기주에 박테리아성 시들음병 (bacterial wilt)을 유발하는 Ralstonia solanacearum GMI1000의 in vivo 전사체를 구축하였으며, 벼의 이삭에 모썩음병 (seedling rot)과 다양한 식물 기주에 박테리아성 시들음병을 유발하는 Burkholderia glumae BGR1의 벼 줄기에서 이루어진 in vivo 전사체 연구가 보고되어져 있다.
최근 protocatechuic acid (이하, PCA)는 항산화제의 기능뿐만이 아니라 항미생물 제제에 관한 몇몇 연구 보고가 존재하며, 동시에 대부분의 식용 식물에 널리 분포하는 유익한 식물성 페놀 화합물로 간주되고 있다. 따라서 PCA가 박테리아의 성장 및 병원성 인자에 미치는 결과들을 고려한다면, 식물 병원성 박테리아에 있어 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 구축은 식물 기주의 방어 기작에 대한 식물 병원성 박테리아의 필수적인 보완책으로 판단 할 수 있을 것이다.
따라서, 전술한 문제점을 보완하기 위해 본 발명가들은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 발현 억제제의 스크리닝 방법의 개발이 시급하다 인식하여, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허공보 제10-1711072호
본 발명의 목적은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현에 의해 야기되는 식물 병원성 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 rotocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자를 특이적으로 선별하여 상기 식물 병원성 질환의 치료제 개발에 효과적일 수 있는 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법 및 상기 식물 병원성 그람음성 세균 감염 진단 키트를 제공한다.
이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 돌연변이 균주인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 엡타머, 항체 또는 천연물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 체계를 저해하여 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물 병원성 그람음성 세균은, Burkholderia glumae BGR, Ralstonia solanacearum GMI1000 또는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
대조군과 비교하여 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 정도는, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 또는 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선되어 측정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 수준을 측정하여 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 감염 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 조성물, 스크리닝 방법 및 진단 키트에서 언급된 모든 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현에 의해 야기되는 식물 병원성 질환의 치료 또는 예방에 효과적이다.
또한, 본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자를 특이적으로 선별하여 상기 식물 병원성 질환의 치료제 개발에 효과적일 수 있다.
도 1은 본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제가 벼 줄기 감염 부위에 치료 효과가 있는지 확인한 도면이다.
도 2는 본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제가 박테리아 성장에 주는 영향을 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 접종했을 때 콜리니 성장에 주는 영향을 확인한 도면이다.
본 발명은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물, 상기 식물 병원성 그람음성 세균 억제제 스크리닝 방법 및 식물 병원성 그람음성 세균 감염 진단 키트를 제공한다.
식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물
본 발명은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 “protocatechuate 3,4-dioxygenase”는
보다 구체적으로, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 돌연변이 균주일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스 뉴클레오타이드는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase mRNA에 상보적이고 protocatechuate 3,4-dioxygenase mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, protocatechuate 3,4-dioxygenase mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기일 수 있고, 바람직하게는 8 내지 60 염기일 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스 뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스 뉴클레오타이드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있으며, 상기 안티센스 뉴클레오타이드는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 안티센스 뉴클레오타이드는 상기 안티센스 뉴클레오타이드의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 상기 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA는 "분리된 것"이며, 이는 자연 상태에 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 siRNA는 화학적 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 상기 siRNA의 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)는 목적유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 말한다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 엡타머, 항체 또는 천연물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어, "펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)"는 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 활성을 이끄는 protocatechuate 3,4-dioxygenase 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드를 의미한다.
본 발명에 사용된 용어, "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교 가능하다. 특히, "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.
본 발명에 사용된 용어, "항체"는 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 체계를 저해하여 억제 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식물 병원성 그람음성 세균은, Burkholderia glumae BGR, Ralstonia solanacearum GMI1000 또는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Burkholderia glumae BGR은 벼의 이삭에 모썩음병(seedling rot)과 다양한 식물 기주에 박테리아성 시들음병을 유발시키는 식물 병원성 그람음성 세균이다.
본 발명에 있어서, 상기 Ralstonia solanacearum GMI1000는 박테리아성 시들음병 (bacterial wilt)을 토마토 (tomato), 담배 (tobacco), 감자 (potato) 등 많은 식물 기주에서 유발시키는 식물 병원성 그람음성 세균이다.
본 발명에 있어서, 상기 Xanthomonas oryzae pv. oryzae는 벼의 잎 조직에서 모썩음병 또는 시들음병을 유발시키는 식물 병원성 그람음성 세균이다.
본 발명에 있어서, 상기 Burkholderia glumae BGR, Ralstonia solanacearum GMI1000 또는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae의 식물 병원성 그람음성 세균은 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자를 공통적으로 포함하고 있으며, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 발현을 억제함으로 식물 병원성 그람음성 세균은 억제되고, 상기 식물 병원성 그람음성 세균에 의한 질병을 치료될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식물 병원성 그람음성 세균에 의한 질병은 불마름병(fire blight), 벼 잎집무늬마름병(sheath blight), 세균성 벼 알마름병(bacterial grain rot), 청고병(verticillium wilt), 벼 흰잎 마름병(bacterial blight) 또는 점무늬병(entomosporium leaf spot)일 수 있으나, 상기 식물 병원성 그람음성 세균에 의해 유발되는 식물의 질병이라면 이에 한정되는 것은 아니다.
protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제 스크리닝 방법
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
대조군과 비교하여 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계.
상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자는 앞서 기재한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어, ‘시험물질’은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 시험물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 또는 천연물 추출물일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 정도는, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 또는 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선되어 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
식물 병원성 그람음성 세균 감염 진단 키트
본 발명은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 수준을 측정하여 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 감염 진단 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immnosorbent assay) 키트, 샌드위치 ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid)키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring)키트 등 이 있으며, 이에 한정되지 않고, mRNA 또는 단백질에 상보적으로 결합하는 방식을 이용한다면 당업자에게 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 상기 조성물, 스크리닝 방법 및 진단 키트에서 언급된 모든 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1. protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 돌연변이 균주 구축
1. core-genome 확인
NCBI FTP 데이터베이스 (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 Burkholderia glumae BGR1(이하, B. glumae), Ralstonia solanacearum GMI1000(이하, R. solanacearum) 및 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (이하, Xoo)의 유전체 정보를 확보하였다. 상기 B. glumae 5,995개 유전자들의 아미노산 서열이 레퍼런스 서열로 사용하였고 R. solanacearum 및 Xoo의 단백질들이 쿼리 서열(query sequence)로 사용하였다. 아미노산 서열비교에는 BlastP 프로그램 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)이 사용하였으며 랜덤 히트 (random hit)의 결과를 방지하기 위해 50% coverage, 50% identity 및 1.0 x 10-5 Evalue의 높은 컷오픈 기준을 적용하였다.
결과적으로, B. glumae 및 R. solanacearum에서는 2,008개의 유전자가 B. glumae 및 Xoo에서는 756개의 유전자가 각각 상동 유전자 (orthologous gene)로 확인되었으며, 상기 유전자 가운데 총 631개의 유전자가 세 식물 병원성 박테리아 B. glumae, R. solanacearum 및 Xoo가 모두 가지고 있는 core-genome으로 확인되었다.
2. in vivo 전사체 확보
상기 식물 병원성 박테리아 B. glumae 및 R. solanacearum의 경우 in vivo 전자체가 보고되어져 있어 NCBI GEO database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)를 통해 다음과 같이 확보하였다. B. glumae RNA-seq 데이터는 in vivo 및 in vitro의 독립적인 3 반복 데이터를 포함하고 있었으며, R. solanacearum은 토마토에서 가장 병징이 확연했던 28 ℃ 배양 조건의 8개의 데이터를 사용하였다.
Xoo의 경우, in vivo 전사체가 보고된 바 없어 in vivo 전자체를 확보하는 과정을 수행하였다. Xoo KACC10331은 PS 배지에서 30 ℃ 및 200 rpm으로 2일 동안 진탕배양을 수행하였고, 계대 배양 후 최종 0.5 OD600의 농도로 조절하였따. 이때, 배양된 Xoo는 vegetative stage 상태의 벼 cv. Dongjin 잎에 leaf-clipping 방법으로 접종하였으며, 접종 된 식물은 10일 동안 온실 (낮: 30℃, 밤: 25℃)에서 재배하였다. 이후, 감염 부위만을 4 ℃ 저온실에서 분쇄 한 뒤 2,000 x g에서 5분 간 4 ℃로 원심 분리하여 Xoo 펠렛 (pellet) 만을 추출하였다. 또한, 추출된 in vivo 펠렛의 동일량의 Xoo를 PS 배지에서 배양시켜 control로써 in vitro 샘플을 준비하였다. In vivo와 In vitro의 샘플 준비는 독립적인 3 반복으로 진행되었다. Xoo pellet으로부터 추출되어진 박테리아 mRNA들은 서울대학교 부속 연구시설인 NICEM에 의뢰 illumina HiSeq2000 장비를 사용하여 RNA-seq 분석을 수행하였다.
3. in vivo 특이적인 차별 발현 유전자 (DEG) 탐색
B. glumae 및 Xoo의 in vivo 특이적인 차별 발현 유전자 (DEG) 탐색을 수행하기 위해, RNA-seq 데이터의 모든 read들을 phred score 28을 기준으로 low quality read들을 제거한 뒤, BWA 프로그램을 이용하여 각각의 레퍼런스 유전체에 mapping 되어졌다. 이미 알고 있는 유전자들의 위치 정보를 바탕으로 mapping된 read들이 counting 되었고, 이는 다시 RPKM (reads per kilobase per million) 방법을 통해 normalization 되어졌다. DEG 탐색에서는 MA plot을 이용 in vivo와 in vitro 두 샘플의 Z score를 추정하고, 이를 two-sided P value로 변환하여 유전체의 차별 발현 여부를 확인하는 DEGseq R 통계 패키지가 사용하였다. 반면 R. solanacearum의 마이크로어레이 (microarray) 데이터는 quantile normalization을 사용 Student’s t-test로 P value를 계산하였다. 최종 in vivo 특이적인 차별 발현 유전자 (DEG) 선별에는 RNA-seq과 마이크로어레이 모두에서 |log2(in vivo/in vitro)| ≥1, adjusted P value (false discovery rate, FDR) <0.05의 공통된 기준이 적용되어졌다. 결과적으로 우리는 세 균주의 전체 유전자 대비 17.76 % 내지 45.84 %의 유전자들이 식물 기주 조건 특이적으로 강하게 발현하고 있다는 것을 확인하였다.
4. 유전자 발현 패턴 비교
상기 B. glumae, R. solanacearum 및 Xoo에 대해 확인된 특이적인 차별 발현 유전자 (DEG) 가운데, pan-genome의 core-genome에 해당하는 유전자들의 발현패턴이 비교하였다.
보다 구체적으로, 상기 세 식물 병원성 박테리아가 모두 가지고 있는 core-genome 641개의 유전자 가운데 28개 유전자가 공통적인 특이적인 차별 발현 유전자 (DEG)로 확인되었다. 흥미롭게도, 상기 28개 유전자 가운데 18개의 co-down-regulated DEG 및 4개의 co-up-regulated DEG가 식물 기주에 특이적으로 상기 세 식물 병원성 박테리아 모두에서 공통적인 발편 패턴을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 상기 4개의 co-up-regulated DEG는 flagellar biosynthesis protein FlhA, 평균 1.97 log2(in vivo/in vitro); C4-dicarboxylate ABC transporter, 2.57; 및 protocatechuate 3,4-dioxygenase subunit beta, 1.83; and 2-methylisocitrate lyase, 1.41에서 매우 높은 발현량을 확인하였다.
5. protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 돌연변이 균주 구축
상기 비교 전사체 분석을 통해 확인 된 4개의 co-up-regulated DEG를 이용하여 실제 식물 병원성 박테리아의 생리에 얼마만큼의 영향을 미치는지를 확인하기 위해 자살 벡터인 pVIK112를 이용 B. glumae의 해당 유전자에 대한 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 돌연변이 균주인 WBIRS23755를 구축하였고, 이를 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제라 명하였다.
실험예 1. 벼 줄기 감염 부위에 치료 효과 확인
상기 실시예 1에서 구축된 본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제가 벼 줄기 감염 부위에 치료 효과가 있는지 확인하기 위해, (a) 일반 벼 줄기와 (b) B. glumae BGR1 및 (c) 본 발명의 억제제를 접종한 감염된 벼 줄기를 7일 동안 상온에서 보관한 후, 그 증상을 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 일반적으로 식물의 감염 등에 심각한 증상을 일으키는 B. glumae BGR1을 접종한 (b)의 경우, 상기 감염에 독성을 나타내어 벼 줄기가 변색되는 것을 확인할 수 있는 반면, 본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 접종한 (c)의 경우 감염되지 않은 일반 벼 줄기(a)와 비교해도 거의 동일한 정도를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제가 벼 줄기 감염의 치료에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있다.
실험예 2. 생리활성 효과 확인
protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 타겟 물질인 protocatechuic acid (PCA)에 관한 B. glumae 및 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 생리활성 효과를 확인하기 위해 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 액체 배양상태에서 박테리아의 OD600 수치를 측정한 결과 초기의 생장에서는 큰 차이를 확인할 수 없었지만, 성장 16시간 후 PCA (1 mg/ml) 포함 조건에서 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제 (OD600 0.706)가 B. glumae BGR1 (OD600 0.841)에 비해 낮은 성장률을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 3. 콜로니 성장 확인
본 발명의 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 접종했을 때 콜리니 성장에 주는 영향을 확인하기 위해 콜로니 성장 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3(A)을 참조하면, 하루 동안 배양한 박테리아를 1.0 x 10-5으로 희석하여 PCA (1 mg/ml)가 첨가 된 고체 배지에 도말하면, 배양 결과 24시간 후 B. glumae BGR1(a)을 도말한 배지에서는 수 백 개의 콜로니들을 관찰할 수 있었지만 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 접종한 배지(b)에서는 어떠한 콜로니도 관찰 할 수 없었다. 더 놀라운 것은 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는 PCA 처리 조건에서 B. glumae의 가장 강력한 병원성 인자인 톡소플라빈 (toxoflavin) 생성이 현저히 감소하였다. 고체 배지에서 B. glumae BGR1의 결과는 톡소플라빈으로 인해 노란색의 색소가 도말된 배지 전체를 가득 채운 것에 비해 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 접종한 배지는 노란색의 색소 대신 짙은 갈색은 띄는 전혀 다른 결과를 나타내었다.
상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 톡소플라빈 감소 결과는 thin-layer chromatography (TLC) 분석을 통해 추가적으로 확인하였으며, 이는 도 3(b)에 나타내었다.
도 3(b)를 참조하면, LB 배지에서만 배양한 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제(b)는 야생형의 B. glumae BGR1 균주(a)와 같이 같은 전개위치에 매우 강한 톡소플라빈의 색소를 관찰할 수 있는 반면 PCA 첨가 조건에서는 확연히 감소된 생성능력을 찾아 볼 수 있었다.
이상 설명으로부터, 본 발명에 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는,
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 돌연변이 균주인 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는,
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는,
    protocatechuate 3,4-dioxygenase 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 엡타머, 항체 또는 천연물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제는,
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 체계를 저해하여 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 식물 병원성 그람음성 세균은,
    Burkholderia glumae BGR, Ralstonia solanacearum GMI1000 또는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물.
  7. protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자를 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    대조군과 비교하여 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제제 스크리닝 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 정도는,
    역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 또는 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선되어 측정하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제제 스크리닝 방법.
  9. protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 수준을 측정하여 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 병원성 그람음성 세균 감염 진단 키트.
KR1020180124520A 2018-08-01 2018-10-18 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물 병원성 그람음성 세균 억제용 조성물 및 상기 protocatechuate 3,4-dioxygenase 유전자 발현 억제제의 스크리닝 방법 KR102111862B1 (ko)

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Brazilian Journal of Microbiology, 2017, 48, 305-313.* *

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