KR20200007980A

KR20200007980A - 중동 호흡기 증후군 및 중증 급성 호흡기 증후군 바이오마커 및 mers 치료제 개발 후보 화합물

Info

Publication number: KR20200007980A
Application number: KR1020200000045A
Authority: KR
Inventors: 조한준
Original assignee: 조한준
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2020-01-22

Abstract

본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 예후 진단용 마커와 치료제로에 관활용할 수 있는 화학 화합물들의 관한 것으로, 중증 급성 호흡기 증후군 환자에서, 본 발명의 특이적인 유전자와 융합 유전자의 변이와 환자의 진행 예측 또는 본 발명의 유전자와 융합 유전자의 변이와 호흡기 증후군의 발병율이 각각 연관성이 있으므로, 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 발병 가능성에 초점을 맞춘 예후를 예측하는데 본 발명의 유전자 변이체와 프라이머를 마커로 사용할 수 있다.

Description

중동 호흡기 증후군 및 중증 급성 호흡기 증후군 바이오마커 및 MERS 치료제 개발 후보 화합물 {Mideast respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome biomarkers and candidate compounds for the development of MERS cure}

본 발명은 메르스 및 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 진단용 마커 및 이를 포함하는 호흡기 증후군 환자의 예후 진단용 키트, 및 SARS(severe acute respiratory syndrome) 혹은 MERS(Mideast respiratory syndrome) 호흡기 증후군 환자의 진단용 마커를 이용하여, 호흡기 증후군의 치료 전략 결정 및 치료제 개발을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 중동호흡기증후군(Middle East Respiratory Syndrome, MERS)은 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV) 감염에 의해 생기는 급성호흡기 질환에 관한 것으로, 지난 2012년 9월 영국 보건국(Health Protection Agency of the UK, HPA)에서 처음 신부전 증상을 동반한 급성호흡기 증후군 환자로부터 신종 코로나 바이러스 감염을 확인하고 이를 세계보건기구(World Health Organization, WHO)에 보고하면서 전 세계에 알려졌다. 이 후, 사우디아라비아를 비롯한 아라비아 반도 국가들을 중심으로 지속적으로 환자가 보고되었으며 세계보건기구는 동 질환을 중동호흡기증후군(MERS)이라 공식발표(2013.5.13) 하였다

최초 환자 발생 이후, 중동호흡기증후군은 사우디아라비아를 중심으로 한 중동지역 국가 외 프랑스, 이탈리아, 그리스 등 유럽 일부 국가와 아프리카 튀니지, 아시아 말레이시아, 필리핀, 그리고 최근 미국, 네덜란드 등으로 확산되어 2014년 5월 16일까지 총 19개 국가에서 총 621명의 환자 및 188명(치명률 약 30%)의 사망자가 보고되었다. 이 중 사우디아라비아와 아랍에미리트에서 발생한 환자 수가 전체 환자의 93%(578명)를 차지하고 있으며 최근 두 지역의 환자 발생이 급격히 증가하고 있어 전 세계의 우려가 높아지고 있다. 2014년 4월부터 현재까지 총 414명의 환자가 발생하였으며(사우디아라비아 348명, 아랍에미리트 50명), 이집트, 예맨, 레바논 등 아라비아 반도 내 국가와 그리스, 네덜란드, 말레이시아, 필리핀, 미국 등 중동지역 이외의 국가에서도 확진 환자가 보고되었다. 중동호흡기증후군 환자들의 성비는 남:여 7:1로 남자가 더 많으며, 평균 연령은 48.5세인 것으로 나타났다. 증상은 주로 발열, 기침, 호흡곤란 등의 호흡기 증상과 급성 신부전, 림프구 감소증, 혈소판 감소증을 동반하기도 하며, 당뇨, 암 등 기저질환을 가지고 있거나 면역기능 저하나 고령자의 경우 예후가 불량한 것으로 알려져 있다. 중동호흡기증후군은 아직까지 예방용 백신과 치료제(항바이러스제)가 개발되지 않아 증상에 따라 대증 치료를 시행한다. 현재까지 대부분의 확진환자들은 중동지역 여행 등 아라비아반도 지역과의 직간접적인 연관이 있거나, 의료기관 등에서 확진환자와의 접촉력이 있는 것으로 조사되었고, 박쥐, 낙타 등 동물과의 연관성에 대한 연구결과도 보고되고 있으나, 아직까지 명확한 중동호흡기증후군(MERS)의 감염원과 감염경로는 확인되지 않았다. 몇 년전 대한민국 및 전 세계적으로 중동호흡기증후군 환자가 급증함에 따라, 세계보건기구는 중동호흡기증후군에 대한 위험도를 평가하기 위해 2014년 5월 13일, '제 5차 국제보건규약 비상위원회(The Fifth Meeting of the IHR Emergency Committee)'를 소집하였다. 전화회의 방식으로 개최된 본 위원회에는 비상위원회 위원 및 전문가들, 그리고 2013년 12월부터 환자가 발생한 13개 국가들(이집트, 그리스, 요르단, 쿠웨이트, 레바논, 말레이시아, 오만, 필리핀, 카타르, 사우디아라비아, 아랍에미리트, 미국, 예맨)의 관계 기관들이 참여하였다. 그리고 5월 14일, 위원회는 현재까지의 정보를 바탕으로 중동호흡기증후군으로 인한 공중보건학적 심각성은 증가하였으나, 지역사회에서 지속적인 사람 간 전파(Stained human-to-human transmission)에 대한 증거가 없어 현재의 상황이 국제적으로 우려가 되는 공중보건위기상황(Public Health Emergency of International Concern, PHEIC)은 아니라는 결과를 발표하였지만, 이에 대한 예방 혹은 치료제는 미비한 실정이다. 2015년 메르스 사태로 인하여, 대한민국 질병관리본부는 해외 중동호흡기증후군 발생 동향과 국가별 대응상황 등을 예의주시하면서, 국내 환자발생 상황에 대비해 공항, 항만을 통한 입국 검역을 강화하고, 의료기관의 환자발생 감시체계를 지속적으로 가동하는 한편, 중동호흡기증후군 환자 진단을 위한 실험실 진단체계를 구축하였으며, 초기 감염병 환자 격리치료가 가능한 입원치료격리병상 가동태세 준비 등 신종감염병으로 인한 국내 공중보건 위기상황 발생을 막기 위해 노력하였고 앞으로도 그러한 노력을 계속적으로 진행하고 있다. 또한, 중동지역 파견 산업근로자, 교민 및 해외 여행객 등을 대상으로 중동지역에서의 중동호흡기증후군 감염 예방 수칙 안내 등의 홍보 활동을 인천공항과 인터넷 홈페이지를 통해 수행되고 있다. 중동호흡기증후군 유행과 관련하여 세계보건기구는 사우디아라비아 등 환자발생 국가에 대한 여행이나 무역의 제한을 권고하고 있지는 않고있다. 더불어, 일반적인 「호흡기질환 감염예방수칙」을 잘 지키는 것이 무엇보다 중요하다. 하지만, 병이 발병했을 때에 대한 치료 방법은 매우 미비한 실정이다. 이러한 이유로 SARS 및 MERS 같은 급성 호흡기 증후군의 진단 편의와 호흡기 증후군 발병 후 치료 가능성을 체크할 수 있는 마커의 개발이 필요하다. 특허문헌 1에는 호흡기 증후군의 검출 또는 진단에 사용되는 마커로서, 뉴클레오캡시드를 인식하는 항체 및 그의 용도가 개시되어 있다. 급성 호흡기 증후군 비롯한 호흡기 질환을 진단하기 위한 마커가 개발되고 있으나, 치료제 개발 후보 물질 특히 급성 호흡기 증후군 환자의 치료 가능성을 제시하거나 특정 유전자의 특징적인 발현의 연관성에 대해서는 아직까지 연구가 이루어지지 않은 실정이다. 본 발명자는 중동 호흡기 증후군 및 중증 급성 호흡기 증후군 바이오마커 및 MERS 치료제 개발 후보 화합물 을 개발하여, 이를 진단하거나, 호흡기 증후군 환자에 대한 치료제 개발 후보 화합물을 발굴하여, 치료 전략을 결정하기 위해서, 중증 호흡기 증후군 환자의 예후에 긍정적인 영향을 미치고, 이를 진단하고 치료할 수 있는 마커의 개발의 필요성에 착안하여 중증 급성 호흡기 증후군 환자에서 발견되는 특징적인 유전자 발현 차이 및 그 변이와 치료제 개발 여부의 연관성에 대해서 연구하였으며, 연구로 인한 결과물의 발견을 통한 발명을 하였다.

한국 등록특허 제1593641호

중증 급성 호흡기 증후군 환자에 대한 적합한 치료적 전략을 적용하기 위해서는, 호흡기 증후군 환자의 예후를 예측하고 및 치료 전략 결정하는데 정보를 제공해 줄 수 있는 마커의 개발 및 치료 후보 화합물의 발굴이 필요하다. 본 발명은 호흡기 증후군 환자의 발병 여부에 기반하여, 호흡기 증후군 환자의 치료 전략 결정에 도움을 주는 마커를 제공하는 것을 과제로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 핵심은 특이적인 마커를 검출할 수 있는 호흡기 증후군 환자의 발병 여부에 따른 호흡기 증후군 치료의 효과 차이의 예측 또는 호흡기 증후군 환자의 진단과 치료를 위해 필요한 정보를 제공하는 키트를 제공하며, 상기 호흡기 증후군 특이적 마커는 EIF1AX 로 이루어진 유전자상징물 로부터 선택되는 적어도 하나를 암호화하는 유전자의 RNA 발현 및 유전자 변이다. 본 발명의 다른 측면은, 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 상기 시료 DNA를 상기 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 증폭 결과로부터 발병 특이적 마커의 유무를 확인하는 단계; 발병 특이적 마커가 확인된 호흡기 증후군 환자에 임의의 호흡기 치료 후보 물질을 처리하거나, 임의의 방법으로 치료하는 단계; 및 임의의 호흡기 치료 후보 물질 또는 임의의 치료 방법이 호흡기를 개선하거나, 치료할 경우 발병 특이적 마커가 확인된 발병이 가능한 호흡기 증후군 환자에 적합한 치료 후보 물질 또는 치료 방법으로 채택하는 단계;를 포함하는 호흡기 증후군 환자의 발병 여부에 따른 호흡기 치료 효과의 차이를 판정하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 측면은 호흡기 증후군 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 상기 시료 DNA를 청구항 1의 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 결과로부터 발병 특이적 마커의 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 호흡기 증후군 환자의 발병에 따른 호흡기의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 발굴한 호흡기 증후군 환자 특이적 유전자인 EIF1AX로 구성된 유전자 상징물들에서 선택되는 적어도 하나의 융합 유전자의 변이와 발현 양상이 호흡기 증후군 환자에 발병과 연관성이 있으므로, 상기 유전자의 특이적인 여부를 확인함으로써 호흡기 증후군 환자의 발병에 따른 호흡기 치료 효과의 차이 및 예후 차이를 예측할 수 있다.

아울러, 본 발명에서 발굴한 유전자인 EIF1AX로 구성된 유전자 군에서 선택되는 하나의 유전자의 발현 및 특징적인 분석과, 호흡기 증후군이 발병된 환자에서 호흡기 증후군 환자의 치료 전략 결정 또는 상기 유전자의 변이와 호흡기의 발병율이 각각 연관성이 있으므로, 호흡기 증후군 환자의 예후를 예측하는데 본 발명의 유전자를 마커로서 사용할 수 있다. 다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1 내지 도 7 이를 지지하는 유전자 및 GEO 데이터 세트에서, 해당 유전자에 변이가 있는 호흡기 증후군 환자에서 선택되는 유전자의 특징을 나타내는 열지도와 융합 유전자들의 네트워크 그림 및 화합물에 대한 열지도이다.

본 명세서에 있어서, 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 호흡기 증후군 환자에서 발병 특이적인 발현을 나타내는 EIF1AX 유전자 및 EIF1AX 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트

본 발명의 일 측면은 EIF1AX(Gene bank accession number: NM_001412.3)로 구성된 유전자 상징에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 및 RNA 발현 특이적 변이를 검출할 수 있는 호흡기 증후군의 예후 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 한 구현 예에서, 하기의 유전자 변이 중에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 변이를 검출할 수 있는 호흡기 증후군의 예후 및 진단과 치료 키트를 제공한다:

서열번호 1의 아미노산 서열로 나타내는 EIF1AX 를 암호화하는 유전자의 변이의 발현 특이성 본 발명에서 용어,‘진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 본 발명의 목적상, 중증 급성 호흡기 증후군 발병 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 치료에 따른 해당 개체의 발병, 병리 등급 발달, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 유전자의 변이를 이용하는 경우, 개체의 시료를 활용하는 것에서 변이 여부를 확인함으로써 해당 개체의 호흡기 증후군의 발병 여부뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 예후가 좋을 것인지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다. 본 발명에서 용어 ‘예후’란 암이나 중증 질환과 같은 신생물 질환의 예를 들어 발병, 재발, 전이성 확산 및 약물 내성을 비롯한 기인성 사망 또는, 진행 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 중증 급성 호흡기 증후군의 예후를 예측하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 고위험도를 예측하는 것이다. 본 발명에서 용어 ‘중증 급성 호흡기 증후군’은 통상적인 감기와는 다른 병원성 바이러스인 코로나 바이러스로 인해 전파되는 질환으로 일반적인 감기와는 다르고 독감보다 더 강하여, 급격하게 호흡기의 파괴를 일으키는 질환을 의미한다. 본 발명에서 용어 ‘유전자’ 및 이의 변형물은 폴리펩티드 사슬 생성에 관여한 DNA 조각을 포함하며; 이는 코딩 부위 이전 및 이후의 부위, 예를 들면 프로모터 및 3'-미번역 부위를 각각 포함할 뿐 아니라, 개별적인 코딩 단편(엑손) 사이의 개입 서열(인트론)을 포함한다. 상기 유전자의 돌연변이는 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들면, 절단형(truncating) 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이(또는 과오 돌연변이), 넌센스(nonsense) 돌연변이, 프레임 시프트(frame shift) 돌연변이, 인프레임(in-frame) 돌연변이(또는 해독틀내 돌연변이), 스플라이스 돌연변이 및 스플라이스 사이트(splice_region) 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 가질 수 있다. 상기 프레임 시프트 돌연변이는 프레임 시프트 삽입(frame shift insert, FS ins) 돌연변이 및 프레임 시프트 결실 돌연변이(frame shift delete, FS del) 중 적어도 하나일 수 있다. 상기 인-프레임 돌연변이는 인-프레임 삽입(in-frame insertion, IF ins) 돌연변이 및 인-프레임 결실(in-frame delete, IF del) 돌연변이 중 적어도 하나일 수 있다. 폴리펩티드 서열에서의 돌연변이와 관련하여 용어 "X#Y"는 본 기술 분야에서 자명하게 인식되는 것으로, 여기서 "#"은 폴리펩티드의 아미노산 번호와 관련하여 돌연변이 위치를 나타내고, "X"는 야생형 아미노산 서열의 그 위치에서 발견되는 아미노산을 나타내며, "Y"는 그 위치에서의 돌연변이체 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, EIF1AX 폴리펩티드와 관련하여 표기 "R14W"는 야생형 EIF1AX 서열의 아미노산 번호 14에는 아르기닌이 존재하고, 아르기닌이 돌연변이체 EIF1AX 서열에서 트립토판으로 대체되었음을 나타낸다. 상기 유전자들의 돌연변이는 하기와 같다: 서열번호 1로 나타내는 EIF1AX의 아미노산 서열에서, R14W, N116S, I61L 및 D127N

로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 돌연변이이고,

상기 유전자의 돌연변이를 이용하여 호흡기 증후군의 예후를 진단하기 위한 분석 방법으로 RT-PCR, 직접 핵산 서열분석 방법, 마이크로 어레이가 사용될 수 있으며, 본 발명의 유전자의 돌연변이를 이용하여 돌연변이의 존재를 확인할 수 있는 방법이라면 제한없이 적용할 수 있다. 한 실시 양태에서, 돌연변이의 존재는 엄격한 조건 하에 각 유전자의 돌연변이의 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 항-(각 유전자의 돌연변이) 항체 또는 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 핵산 프로브는 검출가능하게 표지된다. 또 다른 실시양태에서, 표지는 면역형광 표지, 화학발광 표지, 인광 표지, 효소 표지, 방사성 표지, 아비딘/비오틴, 콜로이드성 금 입자, 착색 입자 및 자기 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이의 존재는 방사성면역 검정, 웨스턴블롯 검정, 면역형광 검정, 효소면역 검정, 면역침전 검정, 화학발광 검정, 면역조직화학 검정, 도트 블롯 검정, 슬롯 블롯 검정 또는 유동 세포측정 검정에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이의 존재는 RT-PCR에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이의 존재는 핵산 서열분석에 의해 결정된다. 본 발명에서 용어 ‘폴리뉴클레오티드’는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 연구소들에 의해 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는 이중-가닥일 수도 있거나 또는 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 의도된 용어와 같은 ‘폴리뉴클레오티드’이다. 또한, 이노신과 같은 비통상적 염기 또는 삼중수소화 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 정의된 바와 같은 용어 ‘폴리뉴클레오티드’에 포함된다. 일반적으로, 용어 ‘폴리뉴클레오티드’는 비변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기술을 비롯한 다양한 방법에 의해, 그리고 세포 및 유기체 내의 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다.

상기 돌연변이를 검출할 수 있는, 즉 호흡기 증후군의 발병 예후 진단용 프라이머 세트는 하기와 같다:

EIF1AX의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 및 서열번호 7 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 세트;

상기와 같이 제작된 본 발명의 키트는 기존의 일반적인 유전자의 돌연변이 검색 방법에 비하여 시간과 비용이 절감되어 매우 경제적이다. SSCP(Single Strand Conformational Polymorphism), PTT(Protein Truncation Test), 클로닝(cloning), 직접 염기서열 분석(direct sequencing) 등과 같은 기존의 유전자 돌연변이 검색 방법을 이용하여 한 유전자를 모두 검사하려면 평균적으로 수 일 내지 수개월이 소요된다. 또한, 차세대 염기서열분석법(next generation sequencing: NGS)을 통해서 유전자의 돌연변이를 검사할 수 있지만 비용이 높다는 문제점이 있었다. 돌연변이를 SSCP, 클로닝, 직접 염기 서열 분석, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 등의 기존 분석방법에 의해 검사하는 경우 검사 완료까지 약 한달 가량이 소요되는 반면, 본 발명의 키트를 이용하면 시료 DNA가 준비되어 있을 경우 약 10 내지 11시간 내에 결과를 얻을 수 있고, 칩 하나에 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트가 함께 집적되어 있기 때문에 기존의 방법에 비해 시간뿐만 아니라 비용까지 절감할 수 있다. 기존의 방법에 비해 매 실험 당 평균 절반 이하의 시약비가 소모되므로 연구자의 인건비까지 감안하였을 때 더욱 큰 비용의 절감 효과를 기대할 수 있게 된다.

2. 중증 급성 호흡기 증후군 발병 특이적인 발현을 나타내는 EIF1AX 유전자를 이용한 호흡기 증후군의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법

본 발명의 다른 측면은 호흡기 증후군 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 상기 시료 DNA를 청구항 1의 호흡기의 예후 진단용 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 결과로부터 유전자 변이 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 호흡기의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기‘중증 급성 호흡기 증후군 환자의 예후 진단용 키트’에 대한 설명은 ‘ 1. 호흡기 증후군 환자에서 발병 특이적인 발현을 나타내는 EIF1AX 유전자 및 EIF1AX 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트 ’에 기재한 바와 동일하므로 구체적인 설명을 생략한다.

본원에서 사용되는 용어 ‘샘플’은 환자로부터 수득한 임의의 생물학적 표본을 포함한다. 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 적혈구, 백혈구(예를 들어 말초 혈액 단핵구), 유관액, 복수, 늑막 유출물(pleural efflux), 수유관액(nipple aspirate), 림프액(예를 들어 림프절의 파종성 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변(즉, 배설물), 가래, 기관지 세척액, 눈물, 미세 바늘 흡인물(예를 들어 무작위 유선 미세 바늘 흡인에 의해 수확된), 임의의 기타 체액, 조직 샘플(예를 들어 종양 조직) 예컨대 종양 생검(예를 들어 천자 생검) 또는 림프절(예를 들어 감시 (sentinel) 림프절 생검), 조직 샘플(예를 들어 종양 조직), 예를 들면 종양의 수술적 절제, 및 이의 세포 추출물을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 전혈 또는 이의 일부 성분, 예를 들면 혈장, 혈청 또는 세포 펠렛이다. 다른 구현예에서, 샘플은 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 전혈 또는 이의 세포 분획물로부터 고형 종양의 순환 세포를 단리함으로써 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 예를 들어 대장암과 같은 고형 종양으로부터의 포르말린 고정된 파라핀 포매 (FFPE) 종양 조직 샘플이다.

특정 구현 예에서, 샘플은 중증 급성 호흡기 증후군을 갖는 대상으로부터 수득한 인체유래물로부터 제조된 추출물이다. 용어 ‘환자’는 통상 인간을 포함할 뿐 아니라 다른 동물, 예를 들어 다른 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 발병을 예측할 수 있다.

본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 샘플에서 본 발명의 유전자의 돌연변이의 존재를 분석함으로써 대상 시료를 가진 개체가 급성 호흡기 증후군 대해 어떤 예후를 가지는지를 확인할 수 있다. 또한 이러한 방법은 예후가 좋다고 알려진 유전자의 발현이 존재하지 않는 실험군의 개체의 발현 차이를 비교함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에서 예후가 좋다고 알려진 개체란 중증 호흡기 증후군이 발병한 후에 발병, 감염력, 2차 감염 및 사망 등의 이력이 없는 개체를 의미한다. 중증 호흡기 증후군이 의심되는 개체의 샘플이란 병원성 바이러스가 이미 발생하였거나 발생할 것으로 예상되는 개체 또는 조직의 시료로써, 그 예후를 진단하고자 하는 대상 시료를 의미한다.

상기 EIF1AX 에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 상징물에서 유전자 변이가 확인되는 경우, 상기 대상체의 병원성 바이러스 감염이 양호하지 않을 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에 있어서, EIF1AX 유전자에서 변이가 발생한 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 경우 해당 유전자에 변이가 발생하지 않은 중증 급성 호흡기 증후군 환자에 비해서 저발현 현상이 나타났다(표 1 참조).

실시예에 있어서, 상기 EIF1AX 유전자에서 선택되는 RNA 저발현 현상이 확인되는 경우 변이가 발생한 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 경우 해당 유전자에 발현율이 높은 중증 급성 호흡기 증후군 환자에 비해서 발병하는 것을 볼 수 있었다(표 1 참조). 상기 EIF1AX 유전자에서 선택되는 RNA 저발현 현상이 확인되는 경우, 상기 대상체의 호흡기 증후군의 발병율이 높은 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시예에 있어서, EIF1AX 유전자에서 저발현이 발생한 호흡기 증후군 환자의 경우 해당 유전자 변이가 발생하지 않은 급성 호흡기 증후군 환자에 비해서 호흡기의 발병율이 높았다(표 1 참조).

이와 같이, 본 발명의 유전자 EIF1AX 에서 호흡기 증후군에 대한 예후를 진단가능하다는 내용에 대해서는 아직까지 밝혀진 바 없다. 또한, EIF1AX 유전자에서 발현 차이가 상이할 수 있는 점에 대해서도 보고된 바 없다. 본 발명자는 상기 유전자 변이체를 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 예후를 진단할 수 있는 진단 표지자로 사용할 수 있는 점을 최초로 규명하였다.

본 발명의 호흡기의 발병 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법은 호흡기 증후군 환자의 생존율을 높이거나, 또는, 발병율을 낮추는데 사용될 수 있다. 본 발명의 중증 급성 호흡기 증후군의 예후 진단에 대한 방법을 통해, 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 발병율을 예측할 수 있었고, 중증 호흡기 증후군 환자에 적합한 치료제 개발에 활용할 수 있는 화합물을 발굴하였다(표 2 참조). 뿐만 아니라, 치료법 선택에 있어 정보를 제공할 수 있어, 중증 급성 호흡기 증후군에 관한 치료적 전략을 효율적으로 설계할 수 있다(표1 내지 3 참조). 이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

유전 정보 및 임상 정보의 확보

먼저, 본 발명의 유전자 EIF1AX를 호흡기 증후군의 마커로서 활용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, ilincs(http://www.ilincs.org/), NCBI GEO dataset(GDS1028)로부터 유전 정보와 임상 정보가 모두 확보되어 있는 중증 급성 호흡기 증후군 환자 14명의 데이터를 입수하여 분석에 이용하였다.

하기 표 1 및 표 3 내지의 유전자의 RNA 발현 변화량 및 치료제 개발 EIF1AX

약물 후보군 유전자의 변이된 위치 표 1 및 표 3에 나타낸다. 대조군 환자를 4명으로 하였고 발병한 환자 10명을 사건 발생으로 정의하여, 중증 급성 호흡기 증후군의 발병으로 정하였다. 상기 유전자 EIF1AX 에서의 발현 변이 발생이 호흡기 증후군에 의한 질환 고위험도 예측 또는 호흡기 증후군의 발병과 상호 관련성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 약물 검출표를 만들고, 미국 약물 검출 데이터베이스(ilincs)에서 0.05 미만의 P-value를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 또한, 기계학습에서 특징적인 유전자들의 융합 유전자들의 Connectivity Map signatures에서 SARS 환자 데이터 세트의 특징적인 연관성 있는 약물들과 상기 유전자 EIF1AX의 SARS 환자와 대조군과 다른 발현 차이에 P-value를 구하였다.

State	EIF1AX RNA expression
Normal	1043.9
Normal	880.2
Normal	936.5
Normal	938.3
SarsPatient	219.4
SarsPatient	262.8
SarsPatient	470.5
SarsPatient	259.8
SarsPatient	453.3
SarsPatient	252.3
SarsPatient	212.7
SarsPatient	135.6
SarsPatient	445.4
SarsPatient	325.1

EIF1AX and fusion genes-SARS Related Compound	similarity score	p-value	q-value	Z-score	combined score
BRD-K04534322	0.1735	1.3E-12	6.9E-09	-1.77	20.98
RG-13022	0.1735	7.57E-13	6.48E-09	-1.67	20.19
GANT-58	0.1735	2.89E-12	9.52E-09	-1.66	19.11
BRD-K37883585	0.1735	1.3E-12	6.9E-09	-1.78	21.21
BRD-K35004659	0.1633	1.98E-11	3.86E-08	-1.74	18.64
cladribine	0.1633	3.87E-11	5.53E-08	-1.7	17.68
raltitrexed	0.1633	1.64E-10	0.000000159	-1.65	16.13
pifithrin-mu	0.1531	2E-10	0.000000178	-1.65	16.04
HU-211	0.1531	1.82E-10	0.000000169	-1.76	17.18
BRD-K85051645	0.1531	2.54E-10	0.000000205	-1.72	16.51
NTNCB	0.1531	1.21E-10	0.000000123	-1.81	17.91
BRD-K67414432	0.1531	9.98E-11	0.00000011	-1.8	18.03
podophyllotoxin	0.1531	7.17E-10	0.000000426	-1.75	16.03
indirubin	0.1531	4.7E-10	0.000000334	-1.61	15.01
BRD-K41431262	0.1429	1.29E-09	0.000000691	-1.8	15.99
BRD-K88622704	0.1429	2.79E-09	0.00000126	-1.7	14.53
thiotepa	0.1429	1.45E-09	0.000000758	-1.67	14.75
BRD-K76938712	0.1429	7.4E-09	0.00000262	-1.68	13.67
benzoxiquine	0.1429	3.29E-09	0.00000139	-1.63	13.85
BML-ST330	0.1429	3.11E-09	0.00000136	-1.73	14.75
calmidazolium	0.1429	2.87E-09	0.00000126	-1.76	15.02
rucaparib	0.1429	7.78E-09	0.00000271	-1.63	13.24
scopolamine	0.1429	1.68E-09	0.000000855	-1.81	15.85
NU-7026	0.1327	1.45E-08	0.0000046	-1.65	12.91
BRD-K13794505	0.1327	2.04E-08	0.00000568	-1.7	13.08
LE-300	0.1327	5.28E-09	0.00000201	-1.83	15.16
isotretinoin	0.1327	3.07E-08	0.00000768	-1.78	13.4
BRD-K85660637	0.1327	1.89E-08	0.00000554	-1.8	13.88
EMF-csc-9	0.1327	1.94E-08	0.00000554	-1.78	13.71
ZSTK-474	0.1327	4.22E-08	0.00000961	-1.71	12.63
ISOX	0.1327	5.23E-08	0.0000115	-1.64	11.97
WYE-354	0.1327	3.56E-08	0.00000856	-1.74	12.94
ilomastat	0.1327	9.91E-09	0.00000326	-1.81	14.47
fludroxycortide	0.1327	2.51E-08	0.00000659	-1.62	12.28
WZ-7043	0.1224	8.03E-08	0.0000167	-1.8	12.79
K784-3391	0.1224	0.000000244	0.0000357	-1.71	11.31
BRD-K16541732	0.1224	0.000000181	0.0000306	-1.73	11.64
acetyl-farnesyl-cysteine	0.1224	0.000000398	0.0000496	-1.78	11.39
17-hydroxyprogesterone-caproate	0.1224	0.000000129	0.0000249	-1.79	12.35
BRD-K99633092	0.1224	0.000000342	0.0000444	-1.67	10.8
cladribine	0.1224	0.00000025	0.0000363	-1.69	11.17
genistein	0.1224	7.83E-08	0.0000164	-1.8	12.81
fludarabine	0.1224	6.88E-08	0.0000146	-1.82	13.03
dichlorobenzamil	0.1224	0.000000168	0.0000293	-1.78	12.04
BRD-K33116223	0.1224	0.000000161	0.0000286	-1.79	12.15
CAY-10415	0.1224	0.000000164	0.0000289	-1.74	11.81
SKF-86002	0.1224	0.00000032	0.0000422	-1.59	10.35
BRD-K23657553	0.1224	4.02E-08	0.0000093	-1.82	13.45
BRD-K97951054	0.1224	0.000000381	0.0000479	-1.69	10.86
BRD-K88622704	0.1224	7.06E-08	0.000015	-1.74	12.41

Gene	Accession Number	Protein Change	Mutation Type	Copy #	COSMIC	Chromosome	Start Pos	End Pos	Ref	Var
EIF1AX	NM_001412.3	R14W	Missense	Diploid	1	X	20156717	20156717	T	A
		N116S	Missense	Diploid	1	X	20148716	20148716	T	C
		I61L	Missense	Diploid	1	X	20153879	20153879	T	G
		D127N	Missense	Diploid	1	X	20148684	20148684	C	T

iLINCs에서 확인한 결과, 본 발명의 유전자 EIF1AX에 변이가 발생한 경우, P-value가 0.05 미만으로 발병과 연관성이 있는 것으로 확인되었다.

이와 같이, 중증 급성 호흡기 증후군 환자에서 특이적으로 발현 차이가 발생한 유전자에 따라서 해당 EIF1AX 유전자의 변이와 약물의 상관관계의 의미가 있다는 것을 알 수 있었다. 실시예 2에는 유전자 변이가 GEO 데이터 세트에서 매우 유의한 상관관계가 있었던 본 발명의 유전자에 분석 결과를 나타낸다.

중증 급성 호흡기 증후군 발병 특이적 마커로서의 활용 가능성 확인

상기 실시예 1에서 확보된 14명의 대상 환자를 무병 환자(4명)과 발병 환자(10명)으로 분류하고, 비교 분석을 실시하였다. 전체 호흡기 증후군 환자 14명 중에서 발병 환자는 10명으로 72.4%를 차지하였다. 실시예 1에서 확보한 임상 정보 (발병 여부, GEO 데이터 세트에서 관련성을 나타낸 열지도)을 토대로 발병 여부를 조사한 결과 EIF1AX 유전자의 RNA 발현량이 500 이하로 감소되어 있는 공통점을 발견하여, 그에 따른 바이오마커 특이성이 결정되는 것을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 EIF1AX 유전자의 발현에 특이적인 변이가 있는 경우에 전체 모집단 대조군 보다 EIF1AX 유전자의 중앙값이 중증 급성 호흡기 증후군 환자들에게서 낮은 편인 것을 알 수 있었다. 본 발명의 EIF1AX 유전자 변이가 있는 경우에 발병 가능성과 관련된 데이터 세트에서 EIF1AX 유전자 열지도가 피어슨 상관계수에서 의미가 있음을 알 수 있었다. EIF1AX 유전자는 도 2의 열지도에서 알 수 있듯이 중증 급성 호흡기 증후군 환자가 대조군에 비해서 발현률이 낮은 것으로 확인되었다. 따라서, EIF1AX 유전자에 저발현이 있을 때에 호흡기 증후군에 의한 나쁜 예후 및 발병 확률이 높아지므로 상기 EIF1AX 유전자의 변이가 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 발병 및 진단 예측 마커로서 유의함을 알 수 있다.

위 결과를 통해서, 중증 급성 호흡기 증후군 환자 중 본 발명의 EIF1AX 유전자에 저발현 현상이 나타나는 변이가 있는 경우 발병율이 증가하는 것을 알 수 있으므로, 본 발명의 유전자 EIF1AX 에 변이가 있는지 여부를 통해 중증 급성 호흡기 증후군의 예후, 특히 고 위험성 여부 또는 병리등급적인 진행 여부를 예측할 수 있음을 알 수 있다. 표 4는 본 발명의 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 나타낸다.

Gene	Fwd' primer	Rev' primer	서열번호
EIF1AX	ATCAGTCTGCTTTAACAAATTGCATTCAT	TCAAACTGGATTTGTTTCTCACATAGC	2
EIF1AX	TGTCCCATGTTCTTAAAATTAATGGATGTTAGG	AGGAATGCTCTTATGATGAAACTTTGAGT	3
EIF1AX	AAATCCATAGTTCCTTCACCTAACCAG	ACGGTGAGATTTGATTGTTTATTCAATATGAGA	4
EIF1AX	AAACATAAATCCCTGGGATACCTAGC	TTGATTGTTACTCTGGAATTTCTTGATTCTTC	5
EIF1AX	TCCAAAAATGAAGTCCATGGACAGTTA	GACAGTTTTATGTGGACTTTAAGTTGCTG	6
EIF1AX	GGAAGGAAAAAGGGTCACTGC	CCTCCAGCACCTACTTGGTC	7

제작된 프라이머 세트로 돌연변이 검출이 가능한 것은 현재 국내의 중증상기에호흡기 증후군 발병 환자 시료를 구하기 어려우므로, 웹 데이터 베이스에서 확인한 것을 바탕으로 프라이머를 디자인하였다.

gene	Differential expression	P-value
EIF1AX	1.741	6.30E-05

Perturbagen	Concentration	CellLine	zScore	p-value
Crotamiton	19.6uM	MCF7	2.9991	0.0788
PHA-00767505E	10uM	MCF7	3.1318	0.02215

표 5 내지 표 6은 EIF1AX의 발현 특이성이 GEO 데이터 세트 GDS1028에 GDS_7261에서 특징적인 발현율에 대한 P-Value를 나타낸 값이며, 약물 2가지는 약물 데이터 베이스에서 나타나지 않는 화합물들 중 본 발명에 토대 연구에서

진행한 기계학습으로 추출된 융합 유전자들의 Connectivity Map signatures에서 신규성을 지난 약물 2가지이다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 제안하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> CHO, Han-Jun <120> Mideast respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome biomarkers and candidate compounds for the development of MERS cure <130> P-20201 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 62 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly Thr Thr Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Gly Gly Ala Ala Thr Gly Cys Thr Cys Thr Thr Ala Thr Gly 35 40 45 Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Ala Gly Thr 50 55 60 <210> 2 <211> 56 <212> DNA_RNA <213> homo sapiens <220> <223> primer <400> 2 atcagtctgc tttaacaaat tgcattcatt caaactggat ttgtttctca catagc 56 <210> 3 <211> 62 <212> DNA_RNA <213> homo sapiens <220> <223> primer <400> 3 tgtcccatgt tcttaaaatt aatggatgtt aggaggaatg ctcttatgat gaaactttga 60 gt 62 <210> 4 <211> 56 <212> DNA_RNA <213> homo sapiens <220> <223> primer <400> 4 atcagtctgc tttaacaaat tgcattcatt caaactggat ttgtttctca catagc 56 <210> 5 <211> 58 <212> DNA_RNA <213> homo sapiens <220> <223> primer <400> 5 aaacataaat ccctgggata cctagcttga ttgttactct ggaatttctt gattcttc 58 <210> 6 <211> 56 <212> DNA_RNA <213> homo sapiens <220> <223> primer <400> 6 tccaaaaatg aagtccatgg acagttagac agttttatgt ggactttaag ttgctg 56 <210> 7 <211> 41 <212> DNA_RNA <213> homo sapiens <220> <223> primer <400> 7 ggaaggaaaa agggtcactg ccctccagca cctacttggt c 41

Claims

EIF1AX를 암호화하는 유전자 변이 및 발현 특이적인 적어도 하나의 EIF1AX 유전자의 상징물을 검출할 수 있는 SARS 및 MERS의 예후 진단을 위한 진단용 키트와 상기 표2 및 6에 제시한 화합물들로 개발된 치료제.
청구항 1에 있어서, 서열번호 1로 나타내는 EIF1AX의 아미노산 서열에서, R14W, N116S, I61L 및 D127N로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 미스센스 변이이고, 이러한 미스센스 변이로부터 선택되는 적어도 하나의 특징적인 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 예후 진단을 위한 프라이머 세트를 포함하는 SARS 및 MERS의 예후 진단을 위한 진단용 키트.
청구항 1에 있어서, EIF1AX의 돌연변이 검출을 위한 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7 을 나타내는 염기서열 쌍으로 이루어진; 서열번호들을 포함하는 적어도 하나의 SARS 및 MERS의 예후 진단을 위한 프라이머 세트를 포함하는 SARS 및 MERS의 예후 진단을 위한 진단용 키트.
SARS 및 MERS 환자의 샘플로부터 시료 DNA를 준비하는 단계; 상기 시료 DNA를 청구항 1의 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 예후 진단용 키트를 이용하여 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 결과로부터 변이 유무를 확인하는 단계;를 포함하는 호중증 급성 호흡기 증후군의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 방법은 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 발병 및 진행 예후를 예측하는 중증 급성 호흡기 증후군 환자의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 EIF1AX 유전자에서 선택되는 적어도 하나의 유전자에서 특이적인 저발현 변이가 확인되는 경우, 상기 대상체의 고위험군 진행성을 나타내며, 환자 상태가 양호하지 않은 것으로 판단하는 단계;를 더 포함하는 중증 급성 호흡기 증후군의 예후 진단을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.