KR20200004138A

KR20200004138A - 산양삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증성 조성물

Info

Publication number: KR20200004138A
Application number: KR1020180077210A
Authority: KR
Inventors: 엄유리; 박광훈; 전권석; 김만조; 정진부
Original assignee: 대한민국(산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2018-07-03
Publication date: 2020-01-13
Also published as: KR102126846B1

Abstract

본 발명은 산양삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 산양삼 추출물은 NF-κB와 MAPK의 활성을 조절함으로써, iNOS와 COX-2의 발현량을 억제시키고, 염증성 사이토카인의 분비와 NO(nitric oxide)의 생성을 억제함으로써 염증성 질환을 예방 또는 개선하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산양삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증성 조성물{Composition for anti-inflammatory containing Wild-simulated ginseng extract}

본 발명은 산양삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증은 박테리아, 바이러스 및 곰팡이와 같은 다양한 병원균으로부터 인체를 보호하기 위한 타고난 면역 반응으로 간주되어 왔다^{[3, 37]}. 염증은 다양한 병원균에 대한 숙주 방어 기전으로 생각되지만, 염증 반응은 염증성 /자가 면역 질환, 신경 퇴행성 질환 및 암과 같은 다양한 질병의 발병에서 주요 원인인 만성 염증을 유도한다^{[8, 11, 16]}. 따라서, 염증의 억제는 암, 당뇨병, 신경 질환자가 면역 질환 및 관절염과 같은 염증 매개 인간 질환의 예방을 위한 중요한 표적으로 간주되어왔다.

인삼은 한국, 일본, 중국의 수많은 인류 질병 예방에 유용한 허브로 널리 사용되고 있다^{[2, 6]}. 인삼은 면역 증강, 기억력 증강, 항 염증 효과, 항산화 효과, 혈소판 응집 억제 효과, 갱년기 장애 개선, 대사 에너지 유도 등 다양한 약리학 적 활동을 하는 것으로 알려져 있다^{[17, 18, 32, 35]}. 산양삼(Wild-simulated Ginseng, WCG)은 산림청 고시에 의해 차광막과 같은 인위적인 시설을 사용하지 않고 산지에서 재배하는 삼으로 정의되고 있다^[4]. 인삼과 마찬가지로 산양삼은 여러 가지 약리학적 특성 때문에 한약재로 사용되어왔다^[4]. 그러나 산양삼의 약리학적 연구는 인삼 연구에 비해 불충분하다.

본 발명에서는 인삼과 산양삼의 항염증 활성을 비교한 후 산양삼 추출물의 항 염증 활성과 관련된 잠재적인 기전을 규명하고자 하였다.

본 발명의 목적은 산양삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 산양삼 추출물을 유효성분으로 포함하여 시험관 내(in vitro) 세포의 염증 활성의 억제 방법을 제공하는 데 있다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산양삼 추출물(Wild-simulated ginseng)을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 산양삼(Wild-simulated ginseng) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 염증 활성 인자 발현을 억제하는데 유효한 산양삼 추출물과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 세포의 염증 활성의 억제 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 산양삼 추출물이 NF-κB 와 MAPK 활성 조절을 통해 iNOS, COX-2의 발현을 감소시키고, 염증성 사이토카인의 분비를 억제하며, NO(nitric oxide)의 생성을 억제할 수 있음을 확인하였는바, 산양삼 추출물이 NF-κB 및 MAPK와 연관된 다양한 질병, 즉 염증성 질환에 대한 잠재적인 치료제로 활용될 수 있다.

도 1은 LPS로 자극된 대식세포에서 고년근 산양삼(WCG-O) 추출물, 저년근 산양삼(WCG-Y) 추출물 및 인삼(G) 추출물의 NO(도 1a) 및 PGE2(도 1b) 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 LPS로 자극된 대식세포에서 산양삼 추출물에 의한 NO, PGE2, iNOS 및 COX-2 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 LPS로 자극된 대식세포에서 산양삼 추출물에 의한 COX-2 단백질 분해 유도 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 LPS로 자극된 대식세포에서 산양삼 추출물에 의한 TNF-α 및 IL-1β의 발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 LPS로 자극된 대식세포에서 산양삼 추출물에 의한 IκB-α 분해 억제 효과 및 NF-κB 활성화 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 LPS로 자극된 대식세포에서 산양삼 추출물에 의한 MAPK/ATF2 신호전달 억제 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 측면에서, 본 발명은 산양삼 추출물(Wild-simulated ginseng)을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서의 용어, "염증성 질환"이란 염증유발인자 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-1(interleukin-1), IL-6(interleukin-6), 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

본 발명에서의 용어, "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 염증질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 염증질환의 발달을 저지시킴,

(2) 염증질환의 확산을 예방함,

(3) 염증질환을 경감시킴,

(4) 염증질환의 재발을 예방함 및

(5) 염증질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 산양삼 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 산양삼으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 산양삼 조 추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.

상기 산양삼으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 이에 제한되지 않으나, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정), n-헥산 및 에틸아세테이트 용매를 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 산양삼 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 산양삼 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 산양삼 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 산양삼 추출물은 1) NO(nitric oxide) 및 PGE2(prostaglandin E2)의 생성 억제; 2) TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 IL-1β(interleukin 1 beta) 분비를 억제; 3) iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase 2)의 활성 억제; 및 4) NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 및 인산화된 MAPK(Mitogen-activated protein kinases)의 활성 억제 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 특성을 가질 수 있다.

즉, 상기 약학 조성물은 LPS 매개 신호전달 억제에 관여하며, 구체적으로 염증 유발 인자인 NF-κB 경로, 인산화된 MAPK의 활성화를 저해하여 항염증 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는, 상기 약학 조성물은 세포질의 IκB-a가 핵 안으로 이동하는 것을 억제하는 것을 확인하였고, NF-κB 경로와 관련된 염증성 인자인 COX-2, IL-1β, TNF-α 등을 억제하는 것을 확인하여, 결과적으로 염증 질환을 억제하는 효과를 달성한다.

상기 약학적 조성물은 피부염, 아토피 피부염, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 홍채염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 췌장염, 위염, 크론병, 염증성 장질환, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루프스, 섬유근통, 건선, 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증 질환에 대하여 항염증 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 하나 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 산양삼(Wild-simulated ginseng) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 산양삼 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 산양삼 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 염증 활성 인자 발현을 억제하는데 유효한 산양삼 추출물과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 세포의 염증 활성의 억제 방법을 제공할 수 있으며, 상기 염증 활성 인자 발현의 억제는 TNF-α, IL-1β, iNOS, COX-2의 발현을 억제하여 NF-κB와 MAPK 경로 활성화를 억제하며, 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 생성을 억제하는 효과를 통해 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 상기 시험관(in vitro)내에서 LPS에 의해 염증 활성이 유도된 세포에서의 염증 활성을 억제하는 방법은 상기 세포를 배양하는 배지에 상기 산양삼 추출물을 직접 처리하거나, 또는 상기 산양삼 추출물을 유효성분으로 하는 조성물을 배양 배지에 처리하는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 실험재료 및 방법

1-1. 실험재료

세포 배양을 위한 Dulbecco 's Modified Eagle 배지 (DMEM) / F-12 1:1 수정 배지 (DMEM / F-12) 는 Lonza (Walkerville, MD, USA)에서 구입하고, 리포 폴리 사카라이드 (LPS)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, iNOS, COX-2, IκB-α, phospho-IκK-α/β, p65, phospho-ERK1/2, ERK1/2, phospho-p38, p38, phospho-JNK, JNK, ATF2 및 β-액틴에 대한 항체는 Cell Signaling (Bervely, MA, USA)에서 구입 하였다.

1-2. 추출물의 제조

고년근 산양삼(WCG-O, 13 년근 뿌리), 저년근 산양삼(WCG-Y, 7 년근 뿌리) 및 인삼 (G, 5 년근 뿌리)은 국립산림과학원 산림약용자원연구소에서 제공하였고 산양삼은 전라북도 무주에 위치한 재배지에서 굴취된 시료였으며 인삼은 충청북도 금산에서 굴취한 시료를 사용하였다. 건조된 산양삼(WCG-O, WCG-Y) 과 인삼(G) 5g을 70 % 에탄올 100ml로 72 시간 동안 실온에서 진탕하면서 추출 하였다. 72 시간 후, 에탄올 가용 분획을 여과하고 진공 증발기를 사용하여 약 30 ml 부피로 농축 한 후 동결 건조시켰다. 에탄올 추출물은 사용하기 전까지 냉장고에 보관 하였다.

1-3. 세포 배양 및 처리

마우스 세포주 인 RAW264.7을 한국 세포주 은행 (서울, 한국)에서 구입하여 10 % 소태아혈청 (FBS), 100 U/㎖ 페니실린 및 스트렙토 마이신 100 ㎍/㎖ 를 첨가한 DMEM / F-12에서 성장시켰다. 세포를 37 ℃, 5% CO₂의 가습 분위기 하에서 유지 하였다. WCG-O, WCG-Y 및 G를 1XPBS에 용해시킨 후 세포에 처리 하였다. 1ХPBS는 비히클로 사용하였다.

1-4. 대식세포에서 NO(Nitric Oxide)의 분비량 측정

RWA264.7 세포를 96- 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포 / 웰로 밤새 도말하였다. 세포는 지시된 농도로 WCG-O, WCG-Y 또는 G로 6 시간 동안 전처리 한 후 18 시간 동안 LPS (1μg/ml)와 함께 처리 하였다. NO 수준은 Griess 분석법으로 측정하였다. 간단히 말하면, 100㎕의 세포 배양 상등액을 Griess 시약 (Sigma Aldrich) 100㎕와 혼합한 다음, 실온에서 15 분 동안 인큐베이션 하였다. 15 분 후, 540 nm에서 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 흡광도 값을 평가 하였다.

1-5. 대식세포에서 프로스타글란딘 E ₂ (PGE ₂ ) 측정

RWA264.7 세포를 96-웰 플레이트에서 1Х10⁵ 세포/웰로 밤새 도말 하였다. 세포를 지시된 농도로 WCG-O, WCG-Y 또는 G로 6 시간 동안 전처리 한 후 18 시간 동안 LPS (1μg/ml)와 함께 처리 하였다. PGE2 수준은 Prostaglandin E2 ELISA Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 제품 절차에 따라 측정 하였다.

1-6. 세포질과 핵 분획의 분리

세포 추출액 키트 (Active Motif, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포질 및 핵 분획물을 제조 하였다. 간략하게, RAW264.7 세포를 1 x 저온 완충액으로 수확하고 4 ℃에서 15 분 동안 배양 하였다. 세척액(detergent)을 첨가한 후 10 초 동안 볼텍싱(voltexing) 한 후, 세포를 14,000g에서 1 분간 4 ℃에서 원심 분리하고 상등액 (세포질 분획물)을 수집하여 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관 하였다. 세포 펠릿은 핵분획 채취에 사용되었다. 세포 펠릿을 위 아래로 피펫팅(pipetting)하여 완전한 용해 완충액으로 재현탁 시키고 4 ℃에서 30 분 동안 진탕 배양 하였다. 30 분 후, 핵 현탁액을 14,000g에서 10분간 4 ℃에서 원심 분리하고, 추가 분석을 위해 상등액 (핵 분획물)을 -80 ℃에서 보관 하였다.

1-7. SDS-PAGE와 웨스턴 블랏(Western blot) 측정

처리 후, 세포를 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 프로테아제 억제제 혼합물(Sigma-Aldrich)과 포스파타제 억제제 혼합물(Sigma-Aldrich)이 보충된 방사선면역침강 분석 (radioimmunoprecipitation assay, RIPA) 완충액(Boston Bio Products, Ashland, MA, USA)에 용해시키고 15,000 Х rpm으로 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리시켰다. 단백질 농도는 비신코니닉산(bicinchoninic acid, BCA) 기반 단백질 분석법 (Pierce, Rockford, IL, USA)으로 측정 하였다. 단백질을 SDS-PAGE에서 분리하고 PVDF 막 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)에 옮겼다. 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 0.05 % Tween 20 (TBS-T)을 함유하는 Tris- 완충 식염수 중 5 % 탈지 분유로 비특이적 결합을 위해 차단시킨 다음, 5% 탈지 분유에서 특이적인 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. TBS-T로 3 회 세척 한 후, 실온에서 1 시간 동안 호스라디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP) - 컨쥬게이트 된 면역글로불린 G (Ig G)로 배양하고 ECL 웨스턴 블롯팅 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)로 화학 발광을 검출하고 폴라로이드 필름으로 시각화 하였다.

1-8. 역전사 효소 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)

처리 후 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 준비하고 cDNA 합성을 위하여 Verso cDNA Kit (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 총 RNA (1μg)를 역전사 시켰다. PCR은 PCR Master Mix Kit (Promega, Madison, WI, USA) 및 iNOS, COX-2, cyclin D1, IL-1β, TNF-α 및 GAPDH에 대한 하기의 마우스 프라이머를 사용하여 수행되었다: 마우스 iNOS : 포워드 5'-ttgtgcatcgacctaggctggaa-3 '및 리버스 5'-gacctttcgcattagcatggaagc-3', 마우스 COX-2 : 포워드 5'-gtactggctcatgctggacga-3 '및 리버스 5'-caccatacactgccaggtcagcaa-3', 마우스 IL-1β : 포워드 5'-ggcaggcagtatcactcatt 3 '및 리버스 5'-cccaaggccacaggtattt-3', 마우스 TNF-α : 포워드 5'-tggaactggcagaagaggca-3 '및 리버스 5'-tgctcctccacttggtggtt-3', GAPDH : 포워드 5'-ggactgtggtcatgagcccttcca-3 '및 리버스 5'-actcacggcaaattcaacggcac-3'. PCR 결과는 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 가시화되었다.

1-9. 일시적인 형질 감염 및 루시퍼라제 활성

루시퍼라제 활성에 대한 일시적인 형질 감염은 PolyJet DNA 형질전환시약 (SignaGen Laboratories, Ijamsville, MD, USA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행되었다. 세포를 2Х10⁵세포/웰 의 농도로 12-웰 플레이트에 도말(seeding)하였다. 밤새 성장시킨 후, NF-κB 루시퍼라제 구조물(Addgene, Cambridge, MA, USA) 1 μg 및 0.1 μg의 pRL-null 벡터를 함유하는 플라스미드 혼합물을 24 시간 동안 형질 감염시켰다. 처리 후, 세포를 1 x 루시퍼라제 용해 완충액에서 수확하고, 루시퍼라제 활성을 이중 루시퍼라제 분석 키트 (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 pRL-null 루시퍼라제 활성에 대해 표준화 하였다.

1-10. 통계 분석

모든 데이터는 평균±SEM (평균의 표준 오차)으로 표시하였다. 통계 분석은 단방향 ANOVA와 Dunnett test로 수행되었다. * P <0.05 의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

2. 실험결과

2-1. 고년근 산양삼, 저년근 산양삼 및 인삼과의 항 염증 효과 비교

고년근 산양삼(WCG-O), 저년근 산양삼(WCG-Y) 및 인삼(G)의 항 염증 효과를 비교하기 위하여 NO 및 PGE2 생산 억제 효과를 확인한 결과, 도 1a와 도 1b에 나타난 바와 같이 고년근 산양삼과 저년근 산양삼의 NO 및 PGE2 생산 억제 효과가 인삼 보다 높은 것을 확인할 수 있었다. 인삼보다 산양삼에서 항염증 활성이 높게 나타났지만, 고년근 산양삼과 저년근 산양삼의 활성차이는 크지 않은 것을 고려하여 고년근 산양삼을 추가 연구 대상으로 선정하였다.

2-2. 산양삼의 iNOS의 억제 및 COX-2의 발현을 통한 NO 및 PGE 2 생성 억제 효과 확인

WCG-O가 NO 및 PGE2 생산에 영향을 주는지 확인하기 위하여 RAW264.7 세포를 WCG-O로 6 시간 동안 전처리 한 다음 18 시간 동안 LPS로 동시 처리 하였다. 도 2a 및 도 2b에 도시된 바와 같이, WCG-O의 처리는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 NO 및 PGE2 생산을 의존적으로 감소시켰다.

NO 및 PGE 2 생산은 각각 iNOS 및 COX-2에 의해 조절되기 때문에, NO 및 PGE2의 억제가 iNOS 및 COX-2 발현의 하향 조절에 기인하는지 확인하였다. 도 2C 및 2D에 나타낸 바와 같이, LPS 단독으로 처리한 세포에서 단백질 및 mRNA 수준에서 iNOS 및 COX-2의 과발현이 관찰되었다. 그러나 WCG-O 처리는 단백질과 mRNA 수준에서 iNOS와 COX-2의 LPS 매개 과발현을 차단하여 WCG-O에 의한 iNOS와 COX-2 단백질의 조절이 전사 조절의 결과일 수 있음을 나타낸다.

도 2D에서, WCG-O에 의한 COX-2 단백질의 수준 변화가 COX-2 mRNA의 수준 변화보다 더 현저하다는 것을 관찰하였으며, 이는 WCG-O가 COX-2 단백질 안정성에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다. 이 가설을 증명하기 위해 LPS로 미리 자극된 세포에서 24 시간 동안 COX-2 단백질 수준에 대한 WCG-O의 효과를 시험했다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, COX-2 단백질 수준의 감소는 WCG-O 처리 6 시간 후부터 나타났다. 또한 MG132는 프로테아좀 억제제로서, LPS로 미리 자극된 세포에서 WCG-O에 의한 COX-2 단백질의 발현 저해를 24 시간 동안 차단하여 WCG-O가 COX-2 프로 테아좀 분해를 유도 할 수 있음을 나타낸다(도 3b).

2-3. 산양삼의 IL-1β 및 TNF-α 발현 억제효과 확인

WCG-O가 NO와 PGE2의 생성을 억제한다는 사실을 확인하였지만 WCG-O가 다양한 염증성 자극에 중요한 역할을 하는 interleukin-1β(IL-1β)와 종양괴사인자(TNF-α)와 같은 전 염증성 사이토카인의 발현에 영향을 미친다는 것을 추가로 조사하였다. RAW264.7 세포를 WCG-O로 6 시간 동안 전처리 한 후 18 시간 동안 LPS(1μg/ml)와 함께 처리 하였다. 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, LPS 처리 단독으로 IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현이 현저하게 증가하는 반면, WCG-O 를 전 처리하면 IL-1β 및 TNF-α mRNA의 LPS 매개 과발현을 농도 의존적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

2-4. 산양삼의 NF-κB 활성화 억제 효과 확인

NF-κB 신호 전달 경로는 NO, PGE2, iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-1β와 같은 염증성 매개체와 관련되는 것으로 보고되었다^[20]. NF-κB 활성화는 IκB-α의 분해 및 후속 p65 핵 전좌에 기인한다^[21]. 따라서, 먼저 WCG-O가 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 IκB-α 분해에 영향을 주는지 조사했다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, LPS를 단독 처리하면 IκB-α가 하향 조절 되었지만, WCG-O는 IκB-α의 LPS- 매개 하향 조절을 차단 하였다. IκB-α의 인산화가 그것의 분해에 필수적이기 때문에, IκB-α의 인산화에 대한 WCG-O의 효과가 결정되었다. 그 결과, LPS 만 처리한 RAW264.7 세포에서 IκB-α의 과발현 상태가 관찰되었다. 그러나, WCG-O가 존재하면 IκB-α의 LPS- 매개 인산화를 약화시켰다(도 5b).

다음으로, WCG-O가 IκK-α/β의 인산화를 억제하는지 여부를 조사하여 IκB-α의 인산화가 IκK 활성화에 기인한다고 보고되었기 때문에 WCG-O가 IκK-α/β 활성에 영향을 주는지 조사했다. 도 5C에 도시 된 바와 같이, WCG-O가 LPS 처리 단독에 비해 IκK-α/β의 인산화를 억제한다는 것을 확인하였다.

마지막으로 WCG-O가 p65 핵 축적을 차단하는지 여부를 시험하여 IκB-α의 IκK- 매개 인산화를 억제함으로써 IκB-α 분해에 대한 WCG-O의 저해 효과가 p65 핵 전좌에 기여하는지를 조사했다. 도 5d에 나타낸 바와 같이, WCG-O가 없는 LPS는 p65 핵 축적을 유도 하였다. 그러나, WCG-O의 존재는 NF-κB 활성화의 억제를 초래하는 LPS- 매개 p65 핵 축적을 차단 하였다 (도 5E).

이러한 결과는 WCG-O가 IκB-α의 IκB 매개 인산화에 의해 유도된 IκB-α 분해의 억제를 통해 p65 핵 축적을 차단함으로써 NF-κB 활성화를 억제할 수 있음을 나타낸다.

2-5. 산양삼의 MAPK 활성화를 억제효과 확인

NF-κB 신호전달경로에서, 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (mitogen-activated protein kinases, MAPK) 신호전달경로는 각종 염증 매개체의 생산에 관여하는 것으로 보고되었다^[13]. 따라서 WCG-O가 ERK 1/2, p38 및 JNK의 인산화에 영향을 미치는지 조사했다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, WCG-O가 LPS 처리 단독에 비해 ERK 1/2, p38 및 JNK의 인산화를 저해한다는 것을 관찰하였고, 이는 WCG-O가 MAPK 활성화를 억제 할 수 있음을 나타낸다. MAPK 활성화는 염증 매개체의 생성과 관련된 전사 인자 2 (ATF2) 활성화의 핵 축적을 촉진하는 것으로 알려져 있다^[36]. 또한, 도 6b에 도시된 바와 같이, LPS 처리 만이 핵에 ATF2를 축적하는 반면, WCG-O는 ATF2 핵 축적을 억제하는 것을 확인 하였다. 이러한 결과는 WCG-O에 의한 MAPK 활성화의 저해가 WCG-O의 항 염증 효과를 나타내는 ATF2 핵 축적의 완화에 기여할 수 있음을 나타낸다.

결과고찰

산양삼(WCG)은 품질 및 약리 활성 면에서 인삼보다 좋은 것으로 보고되었다 ^[34]. 대표적으로 WCG는 인삼보다 더 큰 항암 효과를 나타냈다^{[12, 19]}. 따라서 임상 적용을 위한 WCG의 이용이 증가되었다 ^[34]. 그러나 WCG의 과학적 약리 효능은 여전히 불충분하다. 본 연구에서는 WCG의 항 염증 효과와 인삼의 효과를 비교하고 WCG-O의 잠재적 항 염증 기전을 연구 하였다.

정상적인 생리 조건 하에서 산화 질소 (NO)는 항염 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 NO는 비정상 상황에서 염증성 질환의 발병 기전에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 따라서, NO 생산의 억제는 염증 질병의 치료에 잠재적인 치료적 진보로 간주되었다^[28]. NO와 마찬가지로 프로스타글란딘 E2 (Prostaglandin E2, PGE2)는 정상적인 생리적 조건 하에서 항 염증 반응의 주성분으로 자리 잡고 있다^[27]. 그러나, PGE2는 염증성 질환에서 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase)의 생산을 유도함으로써 조직 손상에 관여하는 것으로 보고되어왔다^[5]. 또한, PGE2 는 만성 염증성 질환 중 하나 인 류마티스 관절염의 병인에 기여한다^[24]. 따라서 PGE2 생산 억제제는 인간의 염증성 질환의 치료에 사용되어왔다^[24].

본 연구에서는 기존의 고년근 산양삼(WCG-O), 저년근 산양삼(WCG-Y) 및 인삼 (G)이 NO 및 PGE2 생산에 미치는 영향을 평가하여 소염 활성을 비교하였다. WCG-O와 WCG-Y는 NO와 PGE2 생산 억제 효과에 있어서 차이가 없지만, WCG-O 및 WCG-Y의 NO 및 PGE2 생산 억제 효과는 G보다 높은 것을 확인하였다. 또한, WCG-O가 NO 및 PGE2 의 생산을 농도 의존적으로 약화 시킨다는 것을 확인하였다.

NO 생산은 내피산화질소 합성 효소(eNOS), 신경 산화 질소 합성 효소 (nNOS) 또는 유도성 산화질소 합성효소 (iNOS)에 의해 조절 될 수 있다^[1]. NOS 중 eNOS와 nNOS는 낮은 생리적 생산을 유도하는 반면, iNOS는 더 많은 NO를 생성한다^[1]. iNOS 매개의 과도한 NO는 전-염증성 효과(pro-inflammatory effects)를 일으킨다^[7]. 염증의 주요 중재자인 PGE2 는 사이클로옥시게나아제 (cyclooxygenase, COX) -1 또는 -2에 의해 생성된다. 조직에서 구성적으로 발현되는 COX-1은 항상성 프로 스타노이드(prostanoid) 생합성에 관여하는 것으로 보고되었다. 그러나 COX-2는 염증 반응과 관련이 있다^{[10, 29]}. WCG-O에 의한 NO와 PGE₂ 생산의 저해가 iNOS와 COX-2 발현의 조절에 기인 하는지 여부를 조사했다. WCG-O는 단백질 및 mRNA 수준 모두에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제한다는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 WCG-O에 의한 NO 및 PGE2 생산의 감쇠가 iNOS 및 COX-2 발현의 하향 조절의 결과 일 수 있음을 나타낸다.

흥미롭게도 COX-2 단백질 수준이 WCG-O가 mRNA 수준보다 WCG-O에 의해 더 유의하게 감소한다는 사실을 관찰했다. 이는 WCG-O가 COX-2 단백질 안정성에 영향을 줄 수 있다는 가설을 보여준다. 사실, COX-2 발현은 전사, 번역 및 번역 후 수준에서 조절 될 수 있으며 COX-2의 전사 조절이 보고되었다^[33]. 또한 COX-2 단백질 수준은 ubiquitination dependent proteasomal degradation에 의해 조절될 수 있다고 보고되었다^{[22, 23, 26]}. WCG-O에 의한 COX-2 프로테아좀 분해의 증명에서, 프로테아좀 억제제로서의 MG132의 존재가 WCG-O에 의한 COX-2 단백질 수준의 하향 조절을 약화시키는 것을 관찰했다. 이 데이터는 WCG-O가 COX-2 프로 테아좀 분해를 유도할 수 있음을 나타낸다. 따라서, WCG-O가 COX-2 분해를 유도하는 잠재적 기작을 밝혀야 한다.

염증의 핵심 조절자인 사이토카인은 만성 염증에 관여하는 것으로 보고있다^[31]. 각종 사이토카인, 종양괴사인자 (TNF-α) 및 인터루킨 1β (IL-1β)가 주요 전-염증성 사이토카인에 포함되어 있다^[31]. IL-1β는 만성 염증성 질환에서 상향 조절되는 것으로 관찰되었고 TNF-α는 염증성 질환의 병리학에 관여하는 것으로 알려져 있다^[31]. 따라서, 이들 사이토카인의 하향 조절은 소염제에 대한 중요한 기능 중 하나로 간주되어 왔다. 본 발명은 WCG-O가 효과적으로 TNF-α와 IL-1β의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다.

NF-κB 신호 전달은 친 염증 신호전달경로 중 하나로서 잘 알려져 있다^[20]. NF-κB 활성화는 류마티스 관절염, 동맥 경화증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 천식, 염증성 장 질환 및 궤양성 대장염과 같은 다양한 염증 질환의 발병에 관여한다^[30]. NF-κB는 항염증제의 개발을 위한 분자 표적으로 간주되어왔다^[15]. 염증 자극 하에서 활성 IκK는 IκB-α를 인산화시킨다. 인산화 된 IκB-α는 유비퀴틴 화되어 26S 프로테아좀에 의해 분해된다. IκB-α 분해 후 세포질 NF-κB는 핵으로 이동하고 핵 NF-κB는 표적 유전자에 결합하여 염증 유발 유전자의 전사를 일으킨다^[30]. 본 발명은 WCG-O가 IκK-α/β의 활성화 및 IκB-α의 분해를 억제함으로써 p65 핵 축적 및 NF-κB 활성화를 억제한다는 것을 보여 주었다. 이러한 결과는 WCG-O가 염증 반응에서 NF-κB 신호 전달의 억제를 통해 항 염증 활성을 낼 수 있음을 나타낸다.

NF-κB 신호 전달과는 별도로, ERK 1/2, p38 및 JNK를 포함한 MAPK 경로가 염증 반응의 중요한 기전으로 여겨지고 있다^[25]. 최근 MAPK가 NF-κB 활성화와 관련이 있다고 보고 되었다^[9]. WCG-O는 NF-κB 경로의 억제를 통한 염증 반응을 억제했기 때문에 MAPK 신호 전달 단백질의 활성 형태의 인산화를 조사한 후 WCG-O가 ERK 1/2, p38 및 JNK의 인산화를 유의하게 억제한다는 것을 관찰했다. 이러한 결과는 WCG-O가 MAPK 활성화 차단을 통해 염증 반응을 완화시킬 수 있음을 나타낸다.

또한, MAPK는 ATF2(activating transcription factor 2) 매개의 duawmd 매개체 생성에 관여하는 것으로 보고되었다^[36]. 염증성 자극 하에서, 활성화 된 MAPK는 ATF-2의 트레오닌 -69 또는 -71의 인산화를 유도하고, 이어서 인산화 된 ATF2는 핵으로 전위된다. 핵 ATF-2는 표적 유전자에 결합하여 전 염증 유전자의 전사를 일으킨다[36]. WCG-O가 MAPK 활성화를 억제했기 때문에 핵 ATF2 수준이 결정되었고 WCG-O가 ATF2 핵 축적을 억제한다는 것을 확인하였다.

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Claims

산양삼(Wild-simulated ginseng) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산양삼 추출물은 물 및 C1 ~ C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산양삼 추출물은 NO(nitric oxide) 및 PGE2(prostaglandin E2)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 생성을 억제하는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산양삼 추출물은 TNF-α(Tumor necrosis factor alpha) 및 IL-1β(interleukin 1 beta)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산양삼 추출물은 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase 2)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 활성을 억제하는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산양삼 추출물은 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 및 인산화된 MAPK(Mitogen-activated protein kinases)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 활성을 억제하는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 피부염, 아토피 피부염, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 홍채염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 췌장염, 위염, 크론병, 염증성 장질환, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루프스, 섬유근통, 건선, 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 및 다발성 경화증으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
산양삼(Wild-simulated ginseng) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물.
LPS 처리를 통해, 염증 활성이 유도된 세포를, 염증 활성 인자 발현을 억제하는데 유효한 산양삼 추출물과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 세포의 염증 활성의 억제 방법.