KR20200003304A - Hybrid bio ink, manufacturing method thereof, and artificial tissue manufacturing method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 제1 바이오 잉크와 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크를 혼합하여, 생체 적합성이 우수하여 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하고, 물리적 강도가 우수하여 이온 가교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크와 그 제조 방법, 및 이를 이용하여 바이오 3D 프린팅 공정을 통해 인공 조직을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention, by mixing the first bio ink liquefied extracellular matrix of the decellularized tissue and the second bio ink containing alginate or fibrinogen, it is excellent in biocompatibility, which is advantageous for survival, proliferation and differentiation of cells, The present invention relates to a hybrid bio ink, which has excellent physical strength and does not change shape by cells even after ion crosslinking, and a method of manufacturing the same, and a method of manufacturing artificial tissue using the bio 3D printing process using the same.
[과제고유번호] 1711064779[Task unique number] 1711064779
[부처명] 과학기술정보통신부[Department name] Ministry of Science and ICT
[연구관리전문기관] 한국연구재단[Research Management Specialized Institution] Korea Research Foundation
[연구사업명] 세포재생기술개발사업[Research Project Name] Cell Regeneration Technology Development Project
[연구과제명] 미세 혈관 내재형 간 조직 모사체 프린팅 기술 개발[Project name] Development of microvascular internal liver tissue mimic printing technology
[주관기관] 울산과학기술원[Organizer] Ulsan Institute of Science and Technology
[연구기관] 2017.04.01. ~ 2021.12.31.[Research Institute] 2017.04.01. ~ 2021.12.31.
[과제고유번호] 2017R1A2B4010353[Task unique number] 2017R1A2B4010353
[부처명] 이공분야기초연구사업[Department name] Science field basic research project
[연구관리전문기관] 과학기술정보통신부[Research Management Specialized Institution] Ministry of Science and Technology
[연구사업명] 중견연구자지원사업[Name of Research Project] Mid-sized Researcher Support Project
[연구과제명] 3D 바이오 프린팅을 이용한 이질성 간암모델 제작[Project Name] Heterogeneous Liver Cancer Model Using 3D Bioprinting
[주관기관] 한국산업기술대학교[Organization] Korea University of Technology
[연구기간] 2017.03.01 ~ 2019.02.29[Research Period] 2017.03.01 ~ 2019.02.29
바이오 3D 프린팅 기술은, 바이오 프린터, 바이오 잉크, 세포, 성장인자 등을 기반으로 사용자가 원하는 형상을 조형 및 적층하여 특정 형상을 제작할 수 있는 기술을 말한다.The bio 3D printing technology refers to a technology capable of manufacturing a specific shape by forming and stacking a shape desired by a user based on a bio printer, a bio ink, a cell, a growth factor, and the like.
이러한 바이오 3D 프린팅 기술을 이용하여 오가노이드(organoid), 장기유사 칩(organ-on-a-chip), 동물 실험대체를 위한 조직 및 장기 유사체 등과 같이 질병의 치유에 도움을 줄 수 있는 여러 연구들이 활발히 이루어지고 있다.Using this bio 3D printing technology, many studies that can help to heal diseases such as organoids, organ-on-a-chips, tissues and organ analogs for animal replacements Actively done.
특히, 바이오 잉크는, 내재되는 세포들이 생존, 증식 및 분화가 가능하고, 인간의 조직처럼 오랜 시간 동안 특정 형상이나 구조가 유지되어야 하므로, 콜라겐, 피브린겔, 마트리겔, 알지네이트, 젤라틴 등이 포함된 재료가 활용되기도 한다.In particular, bio-inks contain collagen, fibringel, matrigel, alginate, gelatin, etc., because intrinsic cells are capable of survival, proliferation and differentiation, and have to maintain a specific shape or structure for a long time like human tissue. Material is also used.
하지만 다양한 세포들을 인체의 조직처럼 분화시키기 위해서는 다양한 성장인자가 요구되며, 이에 동물의 특정 조직을 탈세포화 및 액상화하고, 세포를 다시 배양시켜 원래의 조직과 유사한 형태로 복원하는 배양 기술이 연구되고 있다.However, different growth factors are required to differentiate various cells as human tissues, and thus, a culture technology for decellularizing and liquefying specific tissues of animals and restoring the cells to a form similar to the original tissues is being studied. .
그러나 앞서 언급된 기존의 바이오 잉크는, 특정 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하지만, 물리적 강도가 약하기 때문에 장기간의 배양 과정 중에서 쉽게 수축되거나 분해될 수 있으며, 오랜 시간 동안 특정 형상 혹은 구조를 유지하기 어려운 문제점을 갖고 있다.However, the above-mentioned conventional bio inks are advantageous for survival, proliferation and differentiation of specific cells, but due to their weak physical strength, they can be easily shrunk or decomposed during long-term culturing process and maintain a specific shape or structure for a long time. It has a difficult problem.
본 발명은, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 제1 바이오 잉크와 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크를 혼합하여, 생체 적합성이 우수하여 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하고, 물리적 강도가 우수하여 이온 가교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크와 그 제조 방법, 및 이러한 하이브리드 바이오 잉크를 사용한 바이오 3D 프린팅 공정을 통해 인공 조직을 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.The present invention, by mixing the first bio ink liquefied extracellular matrix of the decellularized tissue and the second bio ink containing alginate or fibrinogen, it is excellent in biocompatibility, which is advantageous for survival, proliferation and differentiation of cells, The present invention is to provide a hybrid bio ink, a method of manufacturing the same, and a method of manufacturing artificial tissues using a bio 3D printing process using the hybrid bio ink, the physical strength of which does not change shape by cells even after ion crosslinking.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는, 하이브리드 바이오 잉크에 관한 것으로서, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 제1 바이오 잉크; 및 알지네이트 및/또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크;를 포함하며, 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크가 1.5 ~ 9 : 1의 부피비(v/v)로 혼합되는 것이 바람직하다.One embodiment of the present invention for achieving the object as described above relates to a hybrid bio-ink, comprising: a first bio-ink liquefied extracellular substrate of decellularized tissue; And a second bio ink comprising alginate and / or fibrinogen, wherein the first bio ink and the second bio ink are preferably mixed in a volume ratio (v / v) of 1.5 to 9: 1.
상기 조직은, 돼지로부터 유래된 간(liver) 조직을 포함하며, 상기 제1 바이오 잉크는, 상기 탈세포된 조직이 pH 1 ~ 3, 약 15 ~ 25℃의 온도에서 펩신(pepsin)에 의해 소화(digestion)되어 액상화(liquefaction)될 수 있다.The tissue includes liver tissue derived from pigs, wherein the first bio-ink, wherein the decellularized tissue is digested by pepsin at a temperature of pH 1-3, about 15-25 ° C. may be digested and liquefactiond.
구체적으로 상기 제1 바이오 잉크 또는 제2 바이오 잉크는, 배아 유래 섬유아세포, 배아줄기세포에서 유래된 간세포, 인간유래 줄기세포 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 각각 1.5 ~ 4.0 %(wt/v)의 농도인 것이 바람직하다.Specifically, the first bio ink or the second bio ink, may include one or more selected from embryonic-derived fibroblasts, stem cells derived from embryonic stem cells, human stem cells, 1.5 to 4.0% (wt / It is preferable that it is the concentration of v).
한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법에 관한 것으로, 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화시켜 제1 바이오 잉크를 제조하는 단계; 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크를 준비하는 단계; 및 상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1의 부피비(v/v)로 혼합하는 단계;를 포함할 수 있다.On the other hand, another embodiment of the present invention relates to a method for producing a hybrid bio-ink, Decelling step of removing cells from the tissue; Liquefying the extracellular matrix of the decellularized tissue to prepare a first bio ink; Preparing a second bio ink comprising alginate or fibrinogen; And mixing the first bio ink and the second bio ink at a volume ratio (v / v) of 1.5 to 9: 1.
이때, 상기 조직은 돼지로부터 유래된 간(liver) 조직을 포함할 수 있고, 상기 탈세포 단계는, 계면활성제 및 고장용액이 포함된 탈세포 용액을 이용하여 상기 조직의 세포를 제거할 수 있다.In this case, the tissue may include liver tissue derived from pigs, and the decellularization step may remove cells of the tissue using a decellularization solution containing a surfactant and a hypertonic solution.
구체적으로 상기 고장용액은 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, BaCl2 및 NaHCO3을 포함하는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 0.03 내지 1.0 M의 용액인 것이 바람직하고, 상기 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100), Tween 80, SDS(sodium dodecyl sulfate), 소듐 데옥시콜레이트 및 트리톤 X-200(Triton X-200)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.Specifically, the breakdown solution is NaCl, KCl, CaCl 2 , MgCl 2 , It is preferable that the solution of 0.03 to 1.0 M containing any one or more selected from the group containing BaCl 2 and NaHCO 3 , the surfactant is Triton X-100 (Triton X-100), Tween 80, SDS (sodium dodecyl sulfate), sodium deoxycholate and triton X-200 (Triton X-200) is preferably any one or more selected from the group comprising.
또한 상기 제1 바이오 잉크를 제조하는 단계는, 상기 탈세포된 조직의 세포외기질이 pH 1 ~ 3, 약 15 ~ 25℃의 온도에서 펩신(pepsin)에 의해 액상화될 수 있고, 이때 제1 바이오 잉크 및 제2 바이오 잉크는, 각각 1.5 ~ 4.0 %(wt/v)의 농도인 것이 바람직하다.In addition, the step of preparing the first bio ink, the extracellular matrix of the decellularized tissue may be liquefied by pepsin (pepsin) at a temperature of
한편, 본 발명의 또 다른 실시형태는, 인공 조직 제조 방법에 관한 것으로, 상기 하이브리드 바이오 잉크를 사용하여 인공 조직을 프린팅하는 단계; 및 무기염을 사용하여 상기 인공 조직을 겔화(gelation) 및 가교(cross-linking)시키는 고형화(solidification) 단계;를 포함할 수 있다.On the other hand, another embodiment of the present invention relates to a method for manufacturing artificial tissue, comprising: printing artificial tissue using the hybrid bio-ink; And a solidification step of gelling and cross-linking the artificial tissue using an inorganic salt.
이때 상기 무기염은, 칼슘, 망간, 바륨, 코발트, 아연, 구리를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.At this time, the inorganic salt is preferably at least one selected from the group consisting of calcium, manganese, barium, cobalt, zinc, copper.
또한, 상기 고형화 단계는, 열에 의해 콜라겐을 겔화(gelation) 시킨 후, 무기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피브리노겐을 가교(cross-linking)시킬 수 있다.In addition, in the solidification step, after gelling the collagen by heat, it is possible to cross-link alginate or fibrinogen using a solution containing an inorganic salt.
본 발명은, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 제1 바이오 잉크와 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크를 혼합함으로써, 생체 적합성이 우수하여 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하고, 물리적 강도가 우수하여 이온 가교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 효과를 갖는다.The present invention, by mixing the first bio ink liquefied extracellular matrix of the decellularized tissue and the second bio ink containing alginate or fibrinogen, it is excellent in biocompatibility, which is advantageous for survival, proliferation and differentiation of cells, The physical strength is excellent, and the shape is not changed by cells even after ion crosslinking.
뿐만 아니라, 본 발명에 따라 인공 조직을 제조할 때 소요되는 가교 시간이 짧아지며, 본 발명에 따라 제조된 인공 조직의 경우, 세포가 부착 가능한 3차원적인 부착 공간을 포함하는 동시에 세포가 부착할 수 없는 공극을 포함하여 세포 간의 응집이 가능하고, 이에 따라 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리한 효과를 갖는다.In addition, the crosslinking time required to prepare the artificial tissue according to the present invention is shortened, and the artificial tissue prepared according to the present invention includes a three-dimensional attachment space to which the cells can be attached, and at the same time, the cells can be attached. Aggregation between cells is possible, including voids that are absent, thus having a beneficial effect on the survival, proliferation and differentiation of cells.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 바이오잉크의 온도 변화에 따른 점성을 측정한 결과를 경시적으로 나타낸 그래프이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이브리드 바이오 잉크의 함량 변화에 따른 점성을 측정한 결과를 경시적으로 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이브리드 바이오 잉크의 형상 변화를나타낸 도면이다.
도 5 및 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이브리드 바이오 잉크의 함량 변화에 따른 압축강도를 측정한 결과를 경시적으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 조직에서 배양된 세포를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 조직에서 배양된 세포 생존율을 측정한 결과를 경시적으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 조직에서 배양된 세포 증식률을 측정한 결과를 경시적으로 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 조직의 공극을 나타낸 도면이다.1 is a graph showing a result of measuring the viscosity according to the temperature change of the first bio-ink according to an embodiment of the present invention over time.
2 and 3 are graphs showing the results of measuring the viscosity according to the change in the content of the hybrid bio ink according to an embodiment of the present invention over time.
4 is a view showing a change in shape of the hybrid bio ink according to an embodiment of the present invention.
5 and 6 are graphs showing the results of measuring the compressive strength according to the change in the content of the hybrid bio ink according to an embodiment of the present invention over time.
Figure 7 is a view showing the cells cultured in artificial tissue according to an embodiment of the present invention.
8 is a graph showing the results of measuring the cell viability cultured in artificial tissue according to an embodiment of the present invention over time.
9 is a graph showing the results of measuring the cell proliferation rate cultured in artificial tissue according to an embodiment of the present invention over time.
10 is a view showing the voids of the artificial tissue according to an embodiment of the present invention.
이하 본 발명의 바람직한 실시 예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.Before describing in detail through the preferred embodiments of the present invention, the terms or words used in the present specification and claims should not be construed as being limited to the conventional or dictionary meanings, meanings corresponding to the technical spirit of the present invention To be interpreted as
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout this specification, when a part is said to "include" a certain component, it means that it can further include other components, without excluding the other components unless otherwise stated.
이하에서는 본 발명의 하이브리드 바이오 잉크와 그 제조 방법, 및 이를 이용한 인공 조직 제조 방법에 관하여 보다 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, a hybrid bio ink of the present invention, a method for manufacturing the same, and an artificial tissue manufacturing method using the same will be described in more detail.
먼저, 하이브리드 바이오 잉크는, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 제1 바이오 잉크; 및 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크;를 포함하며, 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1 의 부피비(v/v)로 혼합할 수 있다.First, the hybrid bio ink, the first bio ink liquefied the extracellular matrix of the decellularized tissue; And a second bio ink including alginate or fibrinogen; and may mix the first bio ink and the second bio ink in a volume ratio (v / v) of 1.5 to 9: 1.
탈세포된 조직은 조직의 세포외기질을 제외한 나머지 세포 성분을 제거한 조직을 의미한다. 이때 사용되는 조직은, 인간, 돼지, 소, 토끼, 개, 염소, 양, 닭, 말 등의 포유동물로부터 유래된 조직(예를 들어, 간조직, 심장조직, 근육조직 등)일 수 있으나, 본 발명에 사용되는 조직은 간 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하도록 돼지로부터 유래된 간(liver) 조직을 포함하는 것이 가장 바람직하다.Decellularized tissue refers to tissue from which the cellular components are removed except for the extracellular matrix of the tissue. In this case, the tissue used may be tissues derived from mammals such as humans, pigs, cows, rabbits, dogs, goats, sheep, chickens, and horses (eg, liver tissues, heart tissues, muscle tissues), Tissues used in the present invention most preferably include liver tissue derived from pigs to favor survival, proliferation and differentiation of liver cells.
구체적으로, 제1 바이오 잉크는, 탈세포된 조직의 세포외기질이 pH 1 ~ 3, 약 15 ~ 25℃의 온도에서 펩신(pepsin)에 의해 액상화되어, 바이오 프린팅 소재로 쓰이기 위한 적절한 점도(예를 들어, 100 내지 1000 Pa·s)를 갖는 것이 바람직하다. 여기서 펩신은 pH 및 온도 조건에 따라 반응성이 다른 특성을 가지고 있으며, 이로 인해 온도가 15℃ 미만인 경우에는, 펩신(pepsin)의 활성도가 감소하여 원활한 소화(digestion)가 이루어질 수 없고, 25℃를 초과하는 경우에는 펩신(pepsin)의 활성이 지나치게 증가되어, 점도가 낮아져서 바이오 잉크로 사용하기에 부적합하다.Specifically, the first bio-ink, the extracellular matrix of the decellularized tissue is liquefied by pepsin (pepsin) at a temperature of
상술한 바와 같은 제1 바이오 잉크는 적절한 점도로 액상화되어 바이오 프린팅 적성이 우수하며, 탈세포된 조직의 세포외기질을 포함하여 생체 적합성이 뛰어나고, 세포 외 기질 성분인 다양한 단백질과 당단백질 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등을 활용하여 특정 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하다.As described above, the first bio ink is liquefied to an appropriate viscosity, so that the bioprinting aptitude is excellent, and biocompatibility is excellent, including the extracellular matrix of decellularized tissue, and various proteins, glycoproteins, and glycosa, which are extracellular matrix components. Minoglycans (glycosaminoglycan, GAG) and the like is advantageous for the survival, proliferation and differentiation of specific cells.
제2 바이오 잉크는, 알지네이트, 피브리노겐, 카르복실메틸 셀룰로오스, 헤파란황산, 히알루론산, 콜라겐, 덱스트란 등과 같은 천연 고분자 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 알지네이트 또는 피브리노겐 등의 하이드로겔을 포함할 수 있다.The second bio ink may include, but is not limited to, natural polymer materials such as alginate, fibrinogen, carboxymethyl cellulose, heparan sulfate, hyaluronic acid, collagen, dextran, and most preferably, alginate or fibrinogen Hydrogels, and the like.
상기 알지네이트 또는 피브리노겐을 비롯한 하이드로겔은 수분 함량이 높고, 생체 적합성이 뛰어나며, 무기염에 의해 이온 결합하여 가교되기에 기계적 물성이 우수하고, 이에 따라 가교 후에도 세포에 의한 형상의 변화가 없어 바이오 잉크로 사용하기에 적합하다. 또한, 세포가 부착할 수 없는 공극을 제공하여 세포 간에 응집하도록 유도해준다.The hydrogel including alginate or fibrinogen has high moisture content, excellent biocompatibility, and excellent mechanical properties for crosslinking by ionic bonding by inorganic salts, and thus there is no change in shape by cells even after crosslinking. Suitable for use It also provides pores that cells can't attach to, leading to aggregation between cells.
본 발명은 상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1의 부피비(v/v)로 혼합함으로써, 생체 적합성이 뛰어나고, 물리적 강도가 우수하여, 이온 가교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크를 제공할 수 있다.The present invention mixes the first bio ink and the second bio ink in a volume ratio (v / v) of 1.5 to 9: 1, thereby providing excellent biocompatibility, excellent physical strength, and shape change by cells even after ion crosslinking. It is possible to provide a hybrid bio ink that is not.
또한, 본 발명은 상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1의 부피비(v/v)로 혼합함으로써, 제1 바이오 잉크가 세포가 부착할 수 있는 3차원적인 부착 공간을 제공함과 동시에, 제2 바이오 잉크가 세포가 부착할 수 없는 공극을 제공하여 세포 간의 응집을 유도해주는 하이브리드 바이오 잉크를 제공할 수 있다.In addition, the present invention by mixing the first bio ink and the second bio ink in a volume ratio (v / v) of 1.5 ~ 9: 1, thereby providing a three-dimensional attachment space that the first bio ink can be attached to the cells. At the same time, the second bio ink may provide a hybrid bio ink which provides pores to which cells cannot attach, thereby inducing aggregation between cells.
반면, 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크의 혼합 비율이 앞서 언급된 범위를 벗어나게 되어 제1 바이오 잉크가 높은 함량을 갖는 경우, 물리적 강도가 약하고, 가교시간이 길게 되며, 이에 따라 세포에 의해 쉽게 수축 및 분화될 수 있고, 제2 바이오 잉크가 높은 함량을 갖는 경우 세포 친화도가 낮아 세포의 생존, 증식 및 분화가 제한되게 된다.On the other hand, when the mixing ratio of the first bio ink and the second bio ink is out of the above-mentioned range, and the first bio ink has a high content, the physical strength is weak and the crosslinking time is long, thereby making it easy for the cells. It can shrink and differentiate, and if the second bio ink has a high content, the cell affinity is low, thereby limiting the survival, proliferation and differentiation of cells.
일 예로, 제1 바이오 잉크 또는 제2 바이오 잉크는 배아 유래 섬유아세포, 배아줄기세포에서 유래된 간세포, 인간유래 줄기세포 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.For example, the first bio ink or the second bio ink may further include one or more selected from embryonic fibroblasts, stem cells derived from embryonic stem cells, and human stem cells, but is not limited thereto.
또한, 제1 바이오 잉크 및 제2 바이오 잉크는 각각 1.5 ~ 4.0 %(wt/v)의 농도인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 3%(wt/v)의 농도일 수 있다.In addition, it is preferable that the first bio ink and the second bio ink each have a concentration of 1.5 to 4.0% (wt / v), and most preferably, 3% (wt / v).
한편, 본 발명의 다른 실시 형태는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법에 관한 것으로서, 조직에서 세포를 제거하는 탈세포 단계; 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화시켜 제1 바이오 잉크를 제조하는 단계; 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크를 준비하는 단계; 및 상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1 의 부피비(v/v)로 혼합하는 단계;를 포함할 수 있다.On the other hand, another embodiment of the present invention relates to a method for producing a hybrid bio ink, Decelling step of removing cells from the tissue; Liquefying the extracellular matrix of the decellularized tissue to prepare a first bio ink; Preparing a second bio ink comprising alginate or fibrinogen; And mixing the first bio ink and the second bio ink at a volume ratio (v / v) of 1.5 to 9: 1.
탈세포 단계에 사용되는 조직은, 앞서 전술한 바와 같이 인간, 돼지, 소, 토끼, 개, 염소, 양, 닭, 말 등의 포유동물로부터 유래된 조직(예를 들어, 간조직, 심장조직, 근육조직 등)일 수 있으나, 본 발명에 사용되는 조직은 간 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하도록 돼지로부터 유래된 간(liver) 조직을 포함하는 것이 가장 바람직하다.Tissues used in the decellular phase may be tissues derived from mammals such as humans, pigs, cows, rabbits, dogs, goats, sheep, chickens, horses as described above (eg, liver tissues, heart tissues, Muscle tissue, etc.), the tissue used in the present invention most preferably comprises a liver tissue derived from pigs to favor the survival, proliferation and differentiation of liver cells.
일 예로, 돼지로부터 유래된 간(liver) 조직을 증류수와 함께 상온에서 2시간 내외로 교반시켜 세척한 다음, 탈세포 용액을 이용하여 간 조직과 함께 교반하여 조직의 세포 성분을 제거할 수 있다.For example, liver tissue derived from pigs may be washed with distilled water at room temperature with stirring for about 2 hours and then washed with liver tissue using a decellularized solution to remove cellular components of the tissue.
이때 탈세포 용액에 포함된 계면활성제는 SDS(sodium dodecyl sulfate), 소듐 데옥시콜레이트, 트리톤 X-200(Triton X-200) 등의 이온성 계면활성제 또는 트리톤(Triton X-100), Tween 80 등의 비이온 계면활성제 모두 가능하나, 트리톤(Triton X-100)를 사용하는 것이 바람직하며, 이에 따라 세포 외 기질의 다양한 단백질과 당단백질 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등의 손상을 최소화시킬 수 있고, 세포에 포함되어 있는 DNA를 파괴시킬 수 있다.In this case, the surfactant contained in the decellularized solution may be an ionic surfactant such as SDS (sodium dodecyl sulfate), sodium deoxycholate, Triton X-200, or Triton X-100,
그리고 탈세포 용액에 포함된 고장용액은 탈세포 효율을 증가시킬 수 있도록 상기 계면활성제와 함께 사용되며, 일반적인 식염수 농도의 3배 이상의 고장용액을 이용할 수 있고, 조직의 세포 외 기질의 잔존량을 높이기 위해 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, BaCl2 및 NaHCO3을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 0.03 내지 1.0 M 의 용액을 사용하는 것이 바람직하다.And the hypertonic solution contained in the decellularization solution is used together with the surfactant to increase the decellularization efficiency, can use the hypertonic solution more than three times the normal saline concentration, and increase the residual amount of the extracellular matrix of the tissue Preference is given to using a solution of 0.03 to 1.0 M comprising at least one selected from the group consisting of NaCl, KCl, CaCl 2 , MgCl 2 , BaCl 2 and NaHCO 3 .
본 발명의 탈세포 단계를 통해 얻어진 탈세포된 조직은, 세포에 포함되어 있는 DNA를 파괴시킴으로써 조직 내 포함된 DNA 함량이 현저하게 낮아져 체내에 인입시 면역거부 반응을 현저히 저하시킬 수 있을 뿐만 아니라, 세포외기질 성분인 다양한 단백질과 당단백질 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 등을 활용할 수 있어 특정 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하다.The decellularized tissue obtained through the decellularization step of the present invention, by breaking the DNA contained in the cell significantly lowers the DNA content contained in the tissue can not only significantly reduce the immune rejection reaction when introduced into the body, Various proteins, glycoproteins and glycosaminoglycans (GAG), etc., which are extracellular matrix components, can be utilized, which is advantageous for survival, proliferation, and differentiation of specific cells.
한편, 제1 바이오 잉크를 제조하는 단계는, 탈세포 단계를 통해 얻어진 탈세포된 조직의 세포외기질을 특정 온도와 pH 조건 하에서 액상화시켜 적절한 점도를 가진 제1 바이오 잉크를 제조하게 된다.Meanwhile, in the step of preparing the first bio ink, the extracellular matrix of the decellularized tissue obtained through the decellularization step is liquefied under a specific temperature and pH to prepare a first bio ink having an appropriate viscosity.
구체적으로, 상기 제1 바이오 잉크를 제조하는 단계는 탈세포된 조직의 세포외기질이 pH 1 ~ 3, 약 15 ~ 25℃의 온도에서 펩신(pepsin)에 의해 액상화되어, 바이오 프린팅 소재로 쓰이기 위한 적절한 점도(예를 들어, 100 내지 1000 Pa·s)를 갖는 것이 바람직하다. 여기서 펩신은 pH 및 온도 조건에 따라 반응성이 다른 특성을 가지고 있으며, 이로 인해 온도가 15℃ 미만인 경우에는, 펩신(pepsin)의 활성도가 감소하여 원활한 소화(digestion)가 이루어질 수 없고, 25℃를 초과하는 경우에는 펩신(pepsin)의 활성이 지나치게 증가되어, 점도가 낮아져서 바이오 잉크로 사용하기에 부적합하다.Specifically, the step of preparing the first bio ink is the extracellular matrix of the decellularized tissue is liquefied by pepsin (pepsin) at a temperature of
제2 바이오 잉크를 준비하는 단계는, 알지네이트, 피브리노겐, 카르복실메틸 셀룰로오스, 헤파란황산, 히알루론산, 콜라겐, 덱스트란 등과 같은 천연 고분자 물질을 포함하는 제2 바이오 잉크를 준비할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 알지네이트 또는 피브리노겐을 비롯한 하이드로겔을 포함할 수 있다.The preparing of the second bio ink may include preparing a second bio ink including a natural polymer material such as alginate, fibrinogen, carboxymethyl cellulose, heparan sulfate, hyaluronic acid, collagen, dextran, and the like. Most preferably, it may include a hydrogel including alginate or fibrinogen.
상기 제2 바이오 잉크는 천연 고분자 물질을 증류수에 투입한 후 상온에서 교반하여 준비될 수 있다.The second bio ink may be prepared by adding a natural polymer material to distilled water and then stirring the mixture at room temperature.
이후 상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1의 부피비(v/v)로 혼합함으로써 생체 적합성이 뛰어나고, 물리적 강도가 우수하여, 이온 가교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는 하이브리드 바이오 잉크를 제조할 수 있다.Thereafter, the first bio ink and the second bio ink are mixed at a volume ratio (v / v) of 1.5 to 9: 1, so that the biocompatibility is excellent, the physical strength is excellent, and hybrids are not changed in shape by cells even after ion crosslinking. Bio inks can be prepared.
또한, 제1 바이오 잉크가 세포가 부착할 수 있는 3차원적인 부착 공간을 제공함과 동시에, 제2 바이오 잉크가 세포가 부착할 수 없는 공극을 제공하여 세포 간의 응집을 유도해주는 하이브리드 바이오 잉크를 제조할 수 있다.In addition, while the first bio ink provides a three-dimensional attachment space for the cells to attach, the second bio ink provides a void that the cells can not attach to produce a hybrid bio ink that induces aggregation between cells. Can be.
반면, 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크의 혼합 비율이 앞서 언급된 범위를 벗어나게 되어 제1 바이오 잉크가 높은 함량을 갖는 경우 물리적 강도가 약하고, 가교시간이 길게 되며, 세포에 의해 쉽게 수축 및 분화될 수 있고, 제2 바이오 잉크가 높은 함량을 갖는 경우 세포 친화도가 낮아 세포의 생존, 증식 및 분화가 제한되게 된다.On the other hand, when the mixing ratio of the first bio ink and the second bio ink is out of the above-mentioned range, when the first bio ink has a high content, the physical strength is weak, the crosslinking time is long, and the cells shrink and differentiate easily. If the second bio ink has a high content, the cell affinity is low, thereby limiting the survival, proliferation and differentiation of cells.
구체적으로, 제1 바이오 잉크 및 제2 바이오 잉크는, 각각 1.5 ~ 4.0 %(wt/v)의 농도인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 3%(wt/v)의 농도일 수 있다. 이때 상기 제1 바이오 잉크는 다양한 단백질 성분이 포함되어 있어 열에 취약하며, 38℃ 이상의 온도에서 변형되거나 응집, 섬유화 반응이 진행되어 제형이 변성될 수 있으므로, 38℃ 미만의 온도 범위가 유지되도록 적절히 온도를 제어하면서 혼합하는 것이 바람직하며, 적절한 점성을 가질 수 있도록 교반 속도를 제어하면서 혼합하는 것이 적절하다.Specifically, the first bio ink and the second bio ink are preferably 1.5 to 4.0% (wt / v), and most preferably 3% (wt / v). At this time, the first bio-ink is vulnerable to heat because it contains a variety of protein components, since the formulation may be modified by deformation or aggregation and fibrosis reaction at a temperature of 38 ℃ or more, appropriate temperature so as to maintain a temperature range of less than 38 ℃ It is preferable to mix while controlling, and to mix while controlling a stirring speed so that it may have appropriate viscosity.
본 발명의 또 다른 실시 형태로, 앞서 언급한 제조방법으로 제조된 하이브리드 바이오 잉크를 사용한 인공 조직 제조 방법을 들 수 있는데, 본 발명에 따른 인공 조직 제조 방법은, 하이브리드 바이오 잉크를 사용하여 인공 조직을 프린팅하는 단계; 및 무기염을 사용하여 인공 조직을 겔화(gelation) 및 가교(cross-linking)시키는 고형화(solidification) 단계;를 포함한다.As another embodiment of the present invention, an artificial tissue manufacturing method using a hybrid bio ink manufactured by the aforementioned manufacturing method may be used. The artificial tissue manufacturing method according to the present invention may be performed by using a hybrid bio ink. Printing; And a solidification step of gelling and cross-linking artificial tissue using an inorganic salt.
인공 조직을 프린팅하는 단계는, 혼합된 하이브리드 바이오 잉크를 사용하여 3차원 적인 구조인 인공 조직을 프린팅하는 바이오 3D 프린팅 단계을 의미한다. 인공 조직은 예컨대, 오가노이드(organoid), 장기유사 칩(organ-on-on-a-chip), 간 조직, 심장 조직, 뼈 조직 등일 수 있으며, 3D 프린팅 장치를 사용하여 수행될 수 있다.The step of printing artificial tissue means a bio 3D printing step of printing artificial tissue, which is a three-dimensional structure, using a mixed hybrid bio ink. The artificial tissue may be, for example, an organoid, an organ-on-on-a-chip, liver tissue, heart tissue, bone tissue, or the like, and may be performed using a 3D printing device.
다음으로 프린팅된 인공 조직을 무기염을 사용하여 겔화(gelation) 및 가교(cross-linking)시키는 고형화(solidification) 단계를 진행한다. 이때 무기염은, 칼슘, 망간, 바륨, 코발트, 아연, 구리를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 칼슘을 사용하여 인공 조직이 가교 결합을 형성하도록 할 수 있다.Next, the printed artificial tissue is subjected to a solidification step of gelling and cross-linking the inorganic tissue using inorganic salts. In this case, the inorganic salt may be any one or more selected from the group consisting of calcium, manganese, barium, cobalt, zinc, and copper, but is not limited thereto. Most preferably, artificial tissue is crosslinked using calcium. Can be formed.
구체적으로, 상기 고형화 단계는, 열에 의해 콜라겐을 겔화(gelation) 시킨 후, 무기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피브리노겐을 가교(cross-linking)시킴으로써, 프린팅 된 인공 조직이 세포에 의해 형상이 변화되지 않도록 단단한 구조물로 완성될 수 있도록 해준다. 이때 세포는 인공 조직의 종류에 따라 다양하게 변경 가능하며, 세포배양장치를 사용하여 인공 조직에 세포를 배양할 수 있다.Specifically, the solidification step is to gel the collagen by heat, and then to cross-link the alginate or fibrinogen using a solution containing an inorganic salt, the printed artificial tissue is shaped by the cells It can be completed into a rigid structure so that it does not change. In this case, the cells may be variously changed according to the type of artificial tissue, and the cells may be cultured in the artificial tissue using a cell culture device.
상기 고형화 단계는, 무기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피브리노겐을 가교(cross-linking)시킨 후, 열에 의해 콜라겐을 겔화(gelation) 시킬 수도 있으나, 앞서 언급된 바와 같이 열에 의해 콜라겐을 겔화(gelation) 시킨 후, 무기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피브리노겐을 가교(cross-linking) 시키는 것이 가장 바람직하다.The solidification step may cross-link the alginate or fibrinogen using a solution containing an inorganic salt and then gel the collagen by heat, but as mentioned above, the collagen may be gelled by heat ( After gelation, it is most preferable to cross-link alginate or fibrinogen using a solution containing an inorganic salt.
상기 인공 조직은, 제1 바이오 잉크로 인해 세포가 부착할 수 있는 3차원적인 부착 공간을 포함하는 동시에, 제2 바이오 잉크로 인해 세포가 부착할 수 없는 공극을 포함하는 것이 바람직하며, 이에 따라 다수의 세포 간의 응집을 유도하여 세포의 생존, 증식 및 분화를 활발하게 해준다. Preferably, the artificial tissue includes a three-dimensional attachment space to which cells can attach due to the first bio ink, and at the same time includes voids to which cells cannot attach due to the second bio ink. Induces aggregation between cells, thereby promoting survival, proliferation and differentiation of cells.
본 발명에 따라 제조된 하이브리드 바이오 잉크는, 탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화한 제1 바이오 잉크와 알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1 의 부피비(v/v)로 혼합함으로써, 생체 적합성이 우수하여 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리하고, 물리적 강도가 우수하여 이온 가교 후에도 세포에 의해 형상이 변화되지 않는다.Hybrid bio ink prepared according to the present invention, the first bio ink liquefied extracellular matrix of decellularized tissue and the second bio ink containing alginate or fibrinogen in a volume ratio (v / v) of 1.5 ~ 9: 1 By mixing with, the biocompatibility is excellent, which is advantageous for the survival, proliferation and differentiation of cells, and the physical strength is excellent, and the shape does not change by the cells even after ion crosslinking.
뿐만 아니라, 본 발명에 따라 인공 조직을 제조할 때 소요되는 가교 시간이 짧아지며, 본 발명에 따라 제조된 인공 조직의 경우, 세포가 부착 가능한 3차원적인 부착 공간을 포함하는 동시에 세포가 부착할 수 없는 공극을 포함하여 세포 간의 응집이 가능하고, 이에 따라 세포의 생존, 증식 및 분화에 유리한 효과를 갖는다.In addition, the crosslinking time required to prepare the artificial tissue according to the present invention is shortened, and the artificial tissue prepared according to the present invention includes a three-dimensional attachment space to which the cells can be attached, and at the same time, the cells can be attached. Aggregation between cells is possible, including voids that are absent, thus having a beneficial effect on the survival, proliferation and differentiation of cells.
구체적으로, 본 발명의 효과를 극대화하기 위해 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 4 : 1 의 부피비(v/v)로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.Specifically, in order to maximize the effect of the present invention, it is most preferable to mix the first bio ink and the second bio ink in a volume ratio (v / v) of 4: 1.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described. However, the scope of the present invention is not limited to the following preferred embodiments, and those skilled in the art to which the present invention pertains various modifications of the contents described herein within the scope of the present invention. It can be carried out.
[제조예 1][Production Example 1]
제1 바이오 잉크의 제조Preparation of the First Bio Ink
돼지의 간을 1mm 크기로 잘라 여러 개의 절편을 준비한 후, 상기 절편들을 증류수에 투입한 후 교반기를 이용하여 상온에서 2시간 동안 세척하였다. 이후 상기 절편들을 0.5% 트리톤 X-100(Triton X-100), 0.5M의 NaCl 용액을 포함한 탈세포 용액을 사용하여 10℃에서 8시간 동안 탈세포 시켰다. 이때, 상기 탈세포 용액은 매 3시간 마다 바꿔주었다. 다음으로 탈세포된 절편들을 증류수로 교반하여 상온에서 2시간 동안 세척한 후, P.B.S.에 0.1% 과초산(Peracetic acid)이 포함된 소독액으로 상온에서 1시간 동안 교반하여 탈세포된 절편들을 소독하였다. 마지막으로 증류수로 교반하여 상온에서 1시간 동안 세척하여 탈세포된 조직을 제조하였다.After cutting the liver of the pig to 1mm size to prepare several sections, the sections were put in distilled water and washed for 2 hours at room temperature using a stirrer. The sections were then decellularized at 10 ° C. for 8 hours using a decellularization solution containing 0.5% Triton X-100, 0.5M NaCl solution. At this time, the decellular solution was changed every 3 hours. Next, the decellularized sections were stirred with distilled water and washed at room temperature for 2 hours, followed by stirring at room temperature for 1 hour with a disinfectant solution containing 0.1% peracetic acid in P.B.S. to disinfect the decellularized sections. Finally, decellularized tissue was prepared by stirring with distilled water and washing at room temperature for 1 hour.
제조된 탈세포된 조직과 펩신(pepsin)을 용기에 넣은 후, 온도가 20℃, 25℃ 로 일정하게 유지되는 챔버 내부로 투입하여 액상화 시켜 제1 바이오 잉크를 제조하였다.After the prepared decellularized tissue and pepsin (pepsin) in the container, the temperature was 20 ℃, 25 ℃ was added to the inside of the chamber is maintained constant to prepare a first bio ink.
제2 바이오 잉크의 제조Preparation of the Second Bio Ink
알지네이트를 증류수에 투입하고 상온에서 12시간동안 교반하여 제2 바이오 잉크를 제조하였다.Alginate was added to distilled water and stirred at room temperature for 12 hours to prepare a second bio ink.
하이브리드 바이오 잉크의 제조Preparation of Hybrid Bio Inks
25℃ 챔버에서 제조된 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 하기 표 1과 같은 부피 비율(v/v)로 혼합한 후, 페이스트 믹서(paste mixer)를 사용하여 15분간 혼합하여 하이브리드 바이오 잉크를 제조하였다.The first bio ink and the second bio ink prepared in the 25 ℃ chamber is mixed in a volume ratio (v / v) as shown in Table 1, then mixed for 15 minutes using a paste mixer (paste mixer) to the hybrid bio ink Prepared.
[제조예 2] [Production Example 2]
인공 조직 제조Artificial tissue manufacturing
상기 제조예 1에 의해 제조된 하이브리드 바이오 잉크를 3D 프린팅 장치를 이용하여 육면체 형상의 3차원 구조물로 프린팅 한 뒤, 열을 가하여 하이브리드 바이오 잉크를 겔화(gelation)시켰다. 이후, 200mM 농도의 염화칼슘 용액과 함께 30분동안 교반하여 가교시켜 인공 조직을 제조하였다.The hybrid bio ink prepared according to Preparation Example 1 was printed into a three-dimensional structure having a hexahedron shape by using a 3D printing apparatus, and then heat was applied to gel the hybrid bio ink. Then, artificial tissue was prepared by stirring and crosslinking with a calcium chloride solution of 200 mM concentration for 30 minutes.
[실험예 1] 제1 바이오 잉크의 점성 측정 실험Experimental Example 1 Viscosity Measurement Experiment of First Bio-Ink
상기 제조예 1에서 제조된 제1 바이오 잉크의 온도 변화에 따른 점도를 확인하기 위하여, 브룩필드점도계(Brookfield RVDV-3, Brookfield, US)를 이용하여 농도가 2%, 2.5% 및 3%인 제1 바이오 잉크의 점도를 측정하였다.In order to confirm the viscosity according to the temperature change of the first bio ink prepared in Preparation Example 1, using a Brookfield Viscometer (Brookfield RVDV-3, Brookfield, US), the concentration of 2%, 2.5% and 3% 1 The viscosity of the bio ink was measured.
도 1의 결과를 살펴보면, 25℃ 챔버에서 제조된 3% 농도의 제1 바이오 잉크의 경우 가장 높은 점도를 나타내는 것으로 확인되었다.Looking at the results of Figure 1, it was confirmed that the highest viscosity for the first bio ink of 3% concentration prepared in a 25 ℃ chamber.
또한, 동일한 농도의 경우 25℃ 챔버에서 제조된 제1 바이오 잉크는, 20℃ 챔버에서 제조된 제1 바이오 잉크보다 모두 높은 값을 나타내는 것으로 보아, 25℃의 챔버에서 우수한 점도 특성을 나타내는 것으로 여겨진다.In addition, in the case of the same concentration, the first bio ink prepared in the 25 ° C. chamber is considered to exhibit higher values than the first bio ink manufactured in the 20 ° C. chamber, and therefore, is considered to exhibit excellent viscosity characteristics in the chamber at 25 ° C.
[실험예 2] 하이브리드 바이오 잉크의 점성 측정 실험Experimental Example 2 Viscosity Measurement Experiment of Hybrid Bio-Ink
상기 제조예 1에서 제조된 하이브리드 바이오 잉크의 함량 변화에 따른 점도를 확인하기 위하여, 4℃ 에서 브룩필드점도계(Brookfield RVDV-3, Brookfield, US)를 이용하여 비교예 1 내지 4 및 실시예 1 내지 4의 점도를 측정하였으며, 그 결과는 도 2 및 도 3과 같다.In order to check the viscosity according to the change of the content of the hybrid bio ink prepared in Preparation Example 1, using the Brookfield Viscometer (Brookfield RVDV-3, Brookfield, US) at 4 ℃ Comparative Examples 1 to 4 and Examples 1 to The viscosity of 4 was measured, and the results are shown in FIGS. 2 and 3.
도 2의 결과를 살펴보면, 제1 바이오 잉크만 포함된 비교예 1의 경우 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크가 혼합된 실시예 1 내지 4보다 현저히 낮은 점도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.Referring to the results of FIG. 2, it was confirmed that the Comparative Example 1 including only the first bio ink showed a significantly lower viscosity than Examples 1 to 4 in which the first bio ink and the second bio ink were mixed.
하지만, 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크가 혼합된 실시예 1 내지 실시예 4와 비교예 2 내지 4의 경우 제1 바이오 잉크 대비, 제2 바이오 잉크의 함량이 높아질수록 점도가 높아지는 것을 확인할 수 있었다.However, as shown in FIGS. 2 and 3, in the case of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 2 to 4 in which the first bio ink and the second bio ink are mixed, the second bio ink is compared with the first bio ink. It was confirmed that the higher the content, the higher the viscosity.
[실험예 3] 하이브리드 바이오 잉크의 형상 변화 실험Experimental Example 3 Shape Change Experiment of Hybrid Bio-Ink
상기 제조예 2에 의해 제조된 비교예 1 내지 4 및 실시예 2의 형상의 변화를 관찰, 측정하였으며, 그 결과는 도 4와 같다.Changes in the shapes of Comparative Examples 1 to 4 and Example 2 prepared by Preparation Example 2 were observed and measured, and the results are shown in FIG. 4.
도 4를 참조하면, 제1 바이오 잉크만을 포함하는 비교예 1, 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 8:2 의 부피비(v/v)로 혼합한 실시예 2 및 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 5:5의 부피비(v/v)로 혼합한 비교예 2는 형상의 변화가 미미한 반면, 제2 바이오 잉크의 비율이 제1 바이오 잉크의 비율보다 높은 비교예 3, 비교예 4의 경우 형상의 변화가 크게 나타나, 가교 후의 성형성이 보장이 되지 않는 문제가 있었다.Referring to FIG. 4, Comparative Example 1 comprising only the first bio ink, Example 2 and the first bio ink and the first bio ink mixed with the first bio ink and the second bio ink in a volume ratio (v / v) of 8: 2 2 Comparative Example 2 in which the bio ink is mixed at a volume ratio (v / v) of 5: 5 has a slight change in shape, whereas Comparative Example 3 and Comparative Example 4 in which the ratio of the second bio ink is higher than that of the first bio ink In the case of a large change in shape, there was a problem that the formability after crosslinking is not guaranteed.
[실험예 4] 하이브리드 바이오 잉크의 압축강도 측정 실험Experimental Example 4 Compressive Strength Measurement Experiment of Hybrid Bio-Ink
상기 제조예 2에 의해 제조된 비교예 1 내지 4 및 실시예 1 내지 4를 국제규격인 ASTM D 790을 기준으로 압축강도 기기(Instron)을 이용하여 압축강도를 측정하였으며, 그 결과는 도 5 및 도 6과 같다.Comparative Examples 1 to 4 and Examples 1 to 4 prepared by Preparation Example 2 were measured using a compressive strength device (Instron) on the basis of the international standard ASTM D 790, the results are shown in Figure 5 and Same as FIG. 6.
도 5 및 도 6의 결과를 살펴보면, 제2 바이오 잉크의 비율이 높아짐에 따라 압축 강도가 증가하여, 물리적 강도가 우수해지는 것을 확인할 수 있었다.Referring to the results of FIGS. 5 and 6, as the ratio of the second bio ink is increased, the compressive strength increases, and it is confirmed that the physical strength is excellent.
구체적으로, 실시예 1 내지 실시예 4의 경우 11 kPa 미만의 압축 강도로 측정되었으며, 제2 바이오 잉크만을 포함한 비교예 4의 압축 강도는 72.98 kPa로, 상대적으로 높은 압축 강도를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.Specifically, in Examples 1 to 4, the compressive strength of less than 11 kPa was measured, and the comparative example 4 including only the second bio ink had a compressive strength of 72.98 kPa, indicating a relatively high compressive strength. .
[실험예 5] 인공 조직의 세포 생존율, 증식률 실험Experimental Example 5 Cell Viability and Proliferation Rate of Artificial Tissue
비교예 1 내지 2, 실시예 2에 생쥐 배아 유래 섬유아세포(NIH-3T3)을 1x10^7/ml의 비율로 혼합하여 3D 프린팅 장치를 이용하여 프린팅 한 뒤, 열을 가하여 겔화(gelation)시켰다. 이후, 200mM 농도의 염화칼슘 용액과 함께 30분동안 교반하여 가교시켰다. 이후, 37℃의 세포배양장치에서 4일 동안 세포 배양하였으며, 세포 배양 1일차부터 4일차까지의 세포 생존율을 Live/dead cell viability kit(Life Technologies)를 사용하여 평가하고, 세포 증식률을 Cell counting kit(CCK-8, Dojindo)를 통해 평가하여 도 7 내지 도 9에 나타내었다.Mouse embryo fibroblasts (NIH-3T3) in Comparative Examples 1 and 2 and Example 2 were mixed at a rate of 1 × 10 −7 / ml and printed using a 3D printing apparatus, and then gelled by applying heat. Thereafter, the mixture was stirred for 30 minutes with a calcium chloride solution having a concentration of 200 mM and crosslinked. Thereafter, the cells were cultured in a cell culture apparatus at 37 ° C. for 4 days, and cell viability from
도 7 내지 도 8을 참조하면, 제1 바이오 잉크만 포함된 비교예 1, 제1 바이오 잉크의 비율이 제2 바이오 잉크의 비율보다 높은 실시예 2의 세포 생존율은 배양 1일차일 때 각각 90%, 83%로 비교적 높은 값을 보였으며, 배양 4일차일 때 각각 92%, 90%의 값을 나타내 제1 바이오 잉크의 비율이 높아지거나, 배양 기간이 길어질수록 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.7 to 8, the cell viability of Comparative Example 1 containing only the first bio ink and Example 2 in which the ratio of the first bio ink is higher than the ratio of the second bio ink is 90% each on the first day of culture. , 83%, and showed a high value of 92% and 90%, respectively, on the 4th day of culture, indicating that the cell survival rate increased as the ratio of the first bio ink increased or the incubation period increased. .
반면, 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크의 비율(v/v)이 5:5 인 비교예 2의 경우 배양 1일 차일 때의 세포 생존율은 67% 정도이나, 배양 4일 차일 때 62%로 오히려 배양 기간이 길어질수록 세포 생존율이 감소하는 경향을 보였다.On the other hand, in Comparative Example 2 in which the ratio (v / v) of the first bio ink and the second bio ink is 5: 5, the cell viability at the first day of culture was about 67%, but was 62% at the fourth day of culture. Rather, as the incubation period was longer, cell viability tended to decrease.
도 9를 참조하면, 세포 증식률의 경우 또한 제1 바이오 잉크의 비율이 높아질수록 값이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 배양 4일 차일 때 비교예 1의 값은 1.6, 실시예 2의 값은 1.2, 비교예 2의 값은 0.8 로 측정되어 배양 1일 차일 때의 값인 0.3, 0.4, 0.5보다 상대적으로 큰 차이 값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 9, the cell proliferation rate also increased as the ratio of the first bio ink increased. In particular, when the culture was 4 days old, the value of Comparative Example 1 was 1.6, the value of Example 2 was 1.2, The value of Comparative Example 2 was determined to be 0.8, and it was confirmed that the difference value was relatively larger than 0.3, 0.4, and 0.5, which are values at the first day of culture.
[실험예 6] 인공 조직의 공극 관찰 실험Experimental Example 6 Pore Observation Experiment of Artificial Tissue
상기 실험예 5에서 제조된 배양 4일차의 비교예 1 내지 2, 실시예 2의 조직학적인 구조를 확인하기 위해 헤마톡실린(hematoxlyn)과 이오신(eosin)으로 염색한 후, 현미경을 사용하여 공극을 관찰하였다.In order to confirm the histological structures of Comparative Examples 1 and 2 and Example 2 of the
도 10을 참조하면, 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크가 1 : 1 의 부피비(v/v)로 혼합된 비교예 2의 경우, 제1 바이오 잉크가 제2 바이오 잉크보다 높은 비율로 포함된 비교예 1 및 실시예 2에 비해 상대적으로 많은 공극이 관찰되었다. 이 공극은 세포 간에 서로 응집 가능하도록 하는 역할을 하지만, 상대적으로 세포가 부착할 수 있는 3차원적인 부착 공간은 적은 것으로 판단된다.Referring to FIG. 10, in Comparative Example 2 in which the first bio ink and the second bio ink are mixed in a volume ratio (v / v) of 1: 1, the first bio ink is included at a higher ratio than the second bio ink. Relatively more voids were observed compared to Comparative Examples 1 and 2. The pores play a role in allowing cells to aggregate with each other, but relatively small three-dimensional attachment spaces to which cells can attach are considered.
반면에 제1 바이오 잉크만 포함하는 비교예 1의 경우, 공극이 극소량으로 관찰되었으며, 이는 세포가 부착할 수 있는 3차원적인 부착 공간을 제공하나, 세포 간에 서로 응집하는 효과는 적을 것으로 예상된다.On the other hand, in Comparative Example 1 containing only the first bio ink, very small amount of voids were observed, which provides a three-dimensional attachment space for cells to attach, but the effect of aggregation between cells is expected to be small.
제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크가 8 : 2 의 부피비로 혼합된 실시예 2의 경우, 적절한 공극을 포함하는 것으로 관찰되어, 세포간에 서로 응집하는 효과를 갖는 동시에 세포가 부착할 수 있는 3차원적인 부착 공간도 제공할 수 있을 것으로 보여진다.In Example 2, in which the first bio ink and the second bio ink were mixed in a volume ratio of 8: 2, it was observed to include appropriate pores, so that the cells could adhere to each other and had a three-dimensional effect on which cells could adhere. It is also possible to provide a space for attachment.
본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.The present invention is not limited to the above specific embodiments and descriptions, and various modifications can be made by those skilled in the art without departing from the gist of the invention as claimed in the claims. Such variations are within the protection scope of the present invention.
Claims (15)
알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크;를 포함하며,
상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1의 부피비(v/v)로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크.A first bio ink liquefying extracellular matrix of decellularized tissue; And
A second bio ink comprising alginate or fibrinogen;
Hybrid bio ink, characterized in that for mixing the first bio ink and the second bio ink in a volume ratio (v / v) of 1.5 ~ 9: 1: 1.
상기 조직은, 돼지로부터 유래된 간(liver) 조직을 포함하는, 하이브리드 바이오 잉크.The method of claim 1,
Wherein said tissue comprises liver tissue derived from a pig.
상기 제1 바이오 잉크는, 상기 탈세포된 조직의 세포외기질이 pH 1 ~ 3, 약 15 ~ 25℃의 온도에서 펩신(pepsin)에 의해 소화되어 액상화한 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크.The method of claim 1,
The first bio ink is a hybrid bio ink, characterized in that the extracellular matrix of the decellularized tissue is digested by pepsin (pepsin) at a temperature of pH 1 ~ 3, about 15 ~ 25 ℃ liquefied.
상기 제1 바이오 잉크 또는 제2 바이오 잉크는, 배아 유래 섬유아세포, 배아줄기세포에서 유래된 간세포, 인간유래 줄기세포 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크.The method of claim 1,
The first bio ink or the second bio ink, characterized in that it further comprises one or more selected from embryonic-derived fibroblasts, stem cells derived from embryonic stem cells, human stem cells, hybrid bio ink.
상기 제1 바이오 잉크 및 제2 바이오 잉크는, 각각 1.5 ~ 4.0 %(wt/v)의 농도인 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크.The method of claim 1,
The first bio ink and the second bio ink, the hybrid bio ink, characterized in that the concentration of 1.5 to 4.0% (wt / v), respectively.
탈세포된 조직의 세포외기질을 액상화시켜 제1 바이오 잉크를 제조하는 단계;
알지네이트 또는 피브리노겐을 포함하는 제2 바이오 잉크를 준비하는 단계; 및
상기 제1 바이오 잉크와 제2 바이오 잉크를 1.5 ~ 9 : 1의 부피비(v/v)로 혼합하는 단계;를 포함하는 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법.Decellularization step of removing cells from tissue;
Liquefying the extracellular matrix of the decellularized tissue to prepare a first bio ink;
Preparing a second bio ink comprising alginate or fibrinogen; And
And mixing the first bio ink and the second bio ink in a volume ratio (v / v) of 1.5 to 9: 1.
상기 조직은 돼지로부터 유래된 간(liver) 조직을 포함하는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법.The method of claim 6,
Wherein said tissue comprises liver tissue derived from a pig.
상기 탈세포 단계는, 계면활성제 및 고장용액이 포함된 탈세포 용액을 이용하여 상기 조직의 세포를 제거하는 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법.The method of claim 6,
The decellularization step, characterized in that to remove the cells of the tissue using a decellularization solution containing a surfactant and hypertonic solution, a method for producing a hybrid bio ink.
상기 고장용액은 NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, BaCl2 및 NaHCO3을 포함하는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 0.03 내지 1.0 M의 용액인 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법.The method of claim 8,
The hypertonic solution is a solution of a hybrid bio ink, characterized in that from 0.03 to 1.0 M containing any one or more selected from the group containing NaCl, KCl, CaCl 2 , MgCl 2 , BaCl 2 and NaHCO 3 . .
상기 계면활성제는 트리톤 X-100(Triton X-100), Tween 80, SDS(sodium dodecyl sulfate), 소듐 데옥시콜레이트 및 트리톤 X-200(Triton X-200)를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법.The method of claim 8,
The surfactant is at least one selected from the group consisting of Triton X-100, Tween 80, sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium deoxycholate, and Triton X-200 (Triton X-200). A method for producing a hybrid bio ink, characterized in that.
상기 제1 바이오 잉크를 제조하는 단계는, 상기 탈세포된 조직의 세포외기질이 pH 1 ~ 3, 약 15 ~ 25℃의 온도에서 펩신(pepsin)에 의해 액상화되는 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법.The method of claim 6,
In the preparing of the first bio ink, the extracellular matrix of the decellularized tissue is liquefied by pepsin at a temperature of pH 1 to 3 and about 15 to 25 ° C., hybrid bio ink. Method of preparation.
상기 제1 바이오 잉크 및 제2 바이오 잉크는, 각각 1.5 ~ 4.0 %(wt/v)의 농도인 것을 특징으로 하는, 하이브리드 바이오 잉크의 제조 방법.The method of claim 6,
The first bio ink and the second bio ink, the concentration of 1.5 to 4.0% (wt / v), respectively, characterized in that the manufacturing method of the hybrid bio ink.
무기염을 사용하여 상기 인공 조직을 겔화(gelation) 및 가교(cross-linking)시키는 고형화(solidification) 단계;를 포함하는 인공 조직 제조 방법.A hybrid bio ink according to any one of claims 1 to 5; Or printing artificial tissue using a hybrid bio ink prepared by the method according to any one of claims 6 to 12; And
Solidification step of gelling and cross-linking the artificial tissue using an inorganic salt; artificial tissue manufacturing method comprising a.
상기 무기염은, 칼슘, 망간, 바륨, 코발트, 아연, 구리를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 인공 조직 제조 방법.The method of claim 13,
The inorganic salt is artificial tissue manufacturing method of any one or more selected from the group containing calcium, manganese, barium, cobalt, zinc, copper.
상기 고형화 단계는, 열에 의해 콜라겐을 겔화(gelation) 시킨 후, 무기염이 포함된 용액을 사용하여 알지네이트 또는 피브리노겐을 가교(cross-linking)시키는 것을 특징으로 하는, 인공 조직 제조 방법.The method of claim 13,
The solidifying step, after gelling the collagen by heat, and cross-linking alginate or fibrinogen using a solution containing an inorganic salt, artificial tissue manufacturing method.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200044181A (en) * | 2018-10-05 | 2020-04-29 | 주식회사 바이오잉크솔루션 | Composition of bio-ink having improved physical and biological properties |
| KR102196026B1 (en) | 2020-04-06 | 2020-12-29 | 주식회사 티앤알바이오팹 | Manufacturing method of bio-materials from animal tissue, bio-materials from animal tissue manufactured thereby and 3D printing method using the same |
| WO2024014892A1 (en) * | 2022-07-13 | 2024-01-18 | 아주대학교산학협력단 | Fibrocartilage-derived bioink composition, bone graft composition containing same, and manufacturing method therefor |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111420121A (en) * | 2020-04-03 | 2020-07-17 | 苏州大学 | Composite biological ink based on methacrylated hydrogel/nanoclay/acellular matrix and preparation method and application thereof |
| KR102401810B1 (en) * | 2020-09-11 | 2022-05-25 | 주식회사 스페바이오 | A preparation method of extracellular vesicles with cellular spheroid and extracellular vesicles made thereby |
| WO2022153319A1 (en) * | 2021-01-18 | 2022-07-21 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Institute) | A sodium alginate, gelatin, collagen and fibrin (agcf) based bio-ink for the bioprinting of a 3d biogel-based tissue/structure |
| CN112978741B (en) * | 2021-02-02 | 2022-10-14 | 中国科学院上海硅酸盐研究所 | Manganese silicate hollow nanosphere capable of immunoregulation vascularization and preparation method and application thereof |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9442105B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-09-13 | Organovo, Inc. | Engineered liver tissues, arrays thereof, and methods of making the same |
| KR20160115204A (en) * | 2015-03-26 | 2016-10-06 | 포항공과대학교 산학협력단 | Composition for three-dimensional printing, process for preparing the same, and process for preparing three-dimensional construct using the same |
| KR20170001444A (en) * | 2015-06-26 | 2017-01-04 | 아주대학교산학협력단 | The method for preparing bio-ink and its application on 3D printing |
| KR20170012099A (en) * | 2015-07-21 | 2017-02-02 | 주식회사 바이오잉크솔루션스 | Composition of bio-ink having improved physical and biological properties |
| KR20180011607A (en) * | 2016-07-25 | 2018-02-02 | 포항공과대학교 산학협력단 | The method for decellularization of liver, the decellularization material and the 3d bio ink |
| KR20180049712A (en) * | 2016-11-03 | 2018-05-11 | 포항공과대학교 산학협력단 | Wet 3D cell printing using decellularized extracellular matrix |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101826623B1 (en) * | 2015-06-23 | 2018-02-07 | 조선제 | Equipment of fire door |
| US11534527B2 (en) * | 2016-05-03 | 2022-12-27 | T & R Biofab Co., Ltd. | Method for supplying inks for three-dimensional printing, and three-dimensional printing method using same |
-
2018
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9442105B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-09-13 | Organovo, Inc. | Engineered liver tissues, arrays thereof, and methods of making the same |
| KR20160115204A (en) * | 2015-03-26 | 2016-10-06 | 포항공과대학교 산학협력단 | Composition for three-dimensional printing, process for preparing the same, and process for preparing three-dimensional construct using the same |
| KR20170001444A (en) * | 2015-06-26 | 2017-01-04 | 아주대학교산학협력단 | The method for preparing bio-ink and its application on 3D printing |
| KR20170012099A (en) * | 2015-07-21 | 2017-02-02 | 주식회사 바이오잉크솔루션스 | Composition of bio-ink having improved physical and biological properties |
| KR20180011607A (en) * | 2016-07-25 | 2018-02-02 | 포항공과대학교 산학협력단 | The method for decellularization of liver, the decellularization material and the 3d bio ink |
| KR20180049712A (en) * | 2016-11-03 | 2018-05-11 | 포항공과대학교 산학협력단 | Wet 3D cell printing using decellularized extracellular matrix |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200044181A (en) * | 2018-10-05 | 2020-04-29 | 주식회사 바이오잉크솔루션 | Composition of bio-ink having improved physical and biological properties |
| KR102196026B1 (en) | 2020-04-06 | 2020-12-29 | 주식회사 티앤알바이오팹 | Manufacturing method of bio-materials from animal tissue, bio-materials from animal tissue manufactured thereby and 3D printing method using the same |
| WO2024014892A1 (en) * | 2022-07-13 | 2024-01-18 | 아주대학교산학협력단 | Fibrocartilage-derived bioink composition, bone graft composition containing same, and manufacturing method therefor |
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