KR20200000315A - Apparatus and method for measuring deformability of red blood cells - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 적혈구 변형성 측정장치 및 측정방법에 관한 것으로서, 구체적으로 적혈구의 막 커패시턴스를 이용하여 적혈구의 변형성을 효과적으로 측정할 수 있는 적혈구 변형성 측정 장치 및 특정 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a red blood cell deformability measuring apparatus and a method, and more particularly, to a red blood cell deformability measuring apparatus and a specific method which can effectively measure the deformability of red blood cells using the membrane capacitance of red blood cells.
우리 인체를 구성하고 있는 조직의 세포들이 살아가기 위해서는 각 세포에 영양분과 산소가 공급되어야 된다. 이러한 물질 전달 기능을 혈액이 담당하고 있으며, 질량 전달을 효과적으로 해주기 위해 아주 미세한 모세 혈관을 혈액이 지나게 된다. 일반적으로 모세혈관의 크기는 2∼5 ㎛이고 적혈구는 그 크기가 평균 7∼8㎛이므로 모세 혈관의 직경이 피 속에 있는 혈구의 크기보다 작다. 이 때문에 혈구들이 자기보다 작은 모세 혈관 속으로 지나 갈 수 있도록 그 형태를 변형시켜야 한다. 혈액을 구성하는 물질들 중에서 적혈구는 거의 50% 정도의 부피를 차지하고 있다. 이러한 적혈구들의 탄력성이 줄어들 경우에는 혈액이 모세 혈관을 지나 갈 수 없게 되어 모세 혈관이 막히게 되고 이에 따라 주위의 세포가 죽게 되어 신장염, 허혈, 심지어 시력을 잃어버리게 된다. 특히 이러한 적혈구는 낮은 세포질 점성, 높은 표면적과 부피 비율 및 충분히 유연한 막을 포함하는 몇 가지 요소에 의해 크게 변형될 수 있고 이러한 높은 변형성 때문에, 적혈구는 크기가 적혈구의 직경보다 더 작은 모세관 네트워크를 통해 통과하는 능력을 갖는다. 그러나, 혈액 질환은 적혈구 변형성을 현저하게 감소시키는 원인이 된다. 낮은 변형성은 모세 혈관에서 혈류를 방해하거나 막게 되는데, 이는 최후에 장기기능 저하를 이끌고, 이에 겸상 적혈구 빈혈증, 당뇨 등의 심혈관계 질환과 연관되는 것으로 알려져 있다. 전혈 점도(whole blood viscosity)에 영향을 주는 많은 결정 인자, 예를 들어 헤마토크리트, 적혈구 변형성, 응집, 침강, 혈장 점도 등이 있다. 그 중에서도 주어진 샘플 부피에 대한 적혈구의 부피비로 정의되는 헤마토크리트(적혈구 용적률)는 전혈 점도에 영향을 미치는 가장 두드러진 생물 물리학적 지표이다. 그리고 적용된 힘에 의해 모양을 변화시키는 능력에 의해 정의되는 적혈구 변형성은 전혈 점도의 이차 결정 요인이다. In order for the cells of the tissues that make up our bodies to live, nutrients and oxygen must be supplied to each cell. Blood is responsible for this mass transfer function, and blood passes through very fine capillaries to make mass transfer effective. In general, the size of capillaries is 2 to 5 ㎛ size and red blood cells average 7 to 8 ㎛ size, so the diameter of capillaries is smaller than the size of blood cells in the blood. Because of this, the blood cells must be modified in shape so that they can pass into smaller capillaries. Of the blood constituents, red blood cells make up almost 50% of the volume. When the elasticity of these red blood cells is reduced, the blood cannot pass through the capillaries, which causes the capillaries to be blocked, thereby killing the surrounding cells, which causes nephritis, ischemia, and even vision loss. In particular, these erythrocytes can be greatly modified by several factors, including low cytoplasmic viscosity, high surface area and volume ratios, and sufficiently flexible membranes, and because of this high deformability, red blood cells pass through a capillary network whose size is smaller than the diameter of the red blood cells. Have the ability. However, blood diseases cause a significant reduction in erythrocyte deformability. Low deformity impedes or blocks blood flow in capillaries, which eventually leads to decreased organ function, which is known to be associated with cardiovascular diseases such as sickle cell anemia and diabetes. There are many determinants that affect whole blood viscosity, such as hematocrit, erythrocyte deformability, aggregation, sedimentation, plasma viscosity, and the like. Among them, hematocrit, defined as the volume ratio of red blood cells to a given sample volume, is the most prominent biophysical indicator that affects whole blood viscosity. And erythrocyte deformability, defined by the ability to change shape by applied force, is the secondary determinant of whole blood viscosity.
병리학적 관점에서 이들은 당뇨병의 위험 인자가 될 수 있다. 일반적으로 당뇨병 환자의 혈중 인슐린 농도가 높으면 적혈구 전구 세포의 증식이 촉진된다. 그 이후, 헤마토크리트를 의미하는 적혈구 수가 증가한다. 반면에 고인슐린혈증이나 인슐린 저항성에 의한 대사 증후군은 세포의 산화적 스트레스를 증가시킨다. 적혈구의 경우, 그의 막은 산화적 스트레스에 의해 손상되어 적혈구의 변형성이 악화된다. 결과적으로, 전혈 점도는 이 두 현상으로 인해 상승하고, 증가된 점도는 제2유형 당뇨병과 관련 있다고 보고되어 있다.From a pathological point of view they can be a risk factor for diabetes. In general, high blood insulin levels in diabetics promote the proliferation of erythrocyte progenitor cells. Thereafter, the number of red blood cells, meaning hematocrit, increases. On the other hand, metabolic syndrome caused by hyperinsulinemia or insulin resistance increases the oxidative stress of cells. In the case of red blood cells, their membranes are damaged by oxidative stress, which deteriorates the deformability of red blood cells. As a result, whole blood viscosity is reported to rise due to these two phenomena, and increased viscosity is reported to be associated with
적혈구의 변형성을 측정하기 위해 레이저 회절 측정법을 기반으로 변형성을 측정하기 위한 거시적 규모의 장비가 있다. 현미경으로는 접촉 방식이나 비 접촉 방식으로 분류된다. 접촉 방법의 경우, 단일 적혈구는 원자력 현미경 검사 (AFM) 를 위한 마이크로피펫 또는 캔틸리버에 의해 접촉된다. 적혈구의 음압 또는 표면 분포에 대응하는 단일 적혈구의 흡인 속도는 변형성 측정을 위해 제공될 수 있다. 비접촉 방법의 경우, 이들은 또한 측정에 사용된 샘플의 유형에 따라 분류된다. 단일 적혈구의 경우, 단일 적혈구의 광학 족집게 또는 회절 패턴을 사용하여 변형된 형상이 변형성 측정을 위해 측정될 수 있다. 다른 한편, 희석된 혈액 샘플로부터 나온 신장된 적혈구의 이미지가 직접 분석될 수 있다. 그리고 마이크로 채널을 통과하는 희석된 혈액 샘플에서 적혈구에 의한 전류 변화를 전극을 이용하여 측정한다. 변화하는 전류 신호의 정도는 적혈구의 변형성을 의미한다. 최근에는 헤마토크리트가 높은 혈액 샘플 (4-50%)의 경우 여과-기반 방법이 개발되었다. 마이크로채널 어레이를 사용함으로써 혈류의 평균 속도의 시간 변화를 모니터링함으로써 변형성을 예측할 수 있다. 그리고, 랏쳇(ratchet)-유사 여과 구조는 진동 흐름 하에서 변형성에 기초하여 적혈구를 분류할 수 있다. 여과 방법은 적혈구의 변형성을 측정하기 쉽지만 적혈구의 변형성 뿐만 아니라 백혈구, 대형 파편, 적혈구 응집체와 같은 다른 요소의 영향을 받을 수 있다. 그리고 그것은 신뢰할 수 있는 측정을 위해 불필요한 물질을 배제하기 위한 샘플 준비가 필요하다는 것을 의미한다 (도 1 참조).To measure the deformability of erythrocytes, there is a macroscopic instrument for measuring deformability based on laser diffraction. The microscope is classified into a contact method or a non-contact method. In the case of the contact method, single erythrocytes are contacted by micropipette or cantilever for atomic force microscopy (AFM). Aspiration rates of a single red blood cell corresponding to the negative pressure or surface distribution of the red blood cells can be provided for the determinant measurement. For non-contact methods, they are also classified according to the type of sample used for the measurement. In the case of single erythrocytes, the shape modified using optical tweezers or diffraction patterns of a single erythrocyte can be measured for deformability measurements. On the other hand, images of elongated red blood cells from diluted blood samples can be analyzed directly. And the current change by red blood cells in the diluted blood sample passing through the micro channel is measured using an electrode. The degree of changing current signal means red blood cell deformability. Recently, filtration-based methods have been developed for hematocrit-rich blood samples (4-50%). By using a microchannel array, deformability can be predicted by monitoring the time change of the average rate of blood flow. And a ratchet-like filtration structure can classify erythrocytes based on deformability under vibratory flow. Filtration methods are easy to measure the deformability of red blood cells but may be affected by red blood cell deformability as well as other factors such as white blood cells, large debris and red blood cell aggregates. And that means that sample preparation is needed to rule out unwanted material for reliable measurements (see FIG. 1).
따라서, 측정 결과의 정확성이 높으면서 측정 방법도 편리하여 매우 효과적이고 임상 적용에 실용적인 적혈구 변형성 측정 방법 및 측정 장치가 요구된다.Therefore, there is a need for a red blood cell deformability measuring method and measuring device that is highly effective and convenient for clinical application while having high accuracy of measurement results.
본 발명은 측정 결과의 정확성이 높으면서 측정 방법도 편리하여 매우 효과적이고 임상 적용에 실용적인 적혈구 변형성 측정 방법 및 측정 장치를 제공하고자 한다.The present invention aims to provide a method and apparatus for measuring red blood cell deformability that is highly effective and convenient for clinical application while having high accuracy of measurement results.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a method for measuring erythrocyte deformability comprising measuring a degree of change in membrane capacitance (CPE) of erythrocytes.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계는 제1 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계와, 상기 제1 전단 속도와 상이한 제2 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. According to an embodiment of the present invention, measuring the degree of change in membrane capacitance (CPE) of the red blood cells of the present invention comprises measuring the membrane capacitance of the red blood cells at a first shear rate, and the first Measuring the membrane capacitance of erythrocytes at a second shear rate that is different from the shear rate.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 제1 전단 속도는 0 /s 초과 100 /s 미만이고 상기 제2 전단 속도는 100 /s 이상 10000 /s 미만인 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the invention, the first shear rate of the present invention is characterized in that more than 0 / s less than 100 / s and the second shear rate is more than 100 / s less than 10000 / s.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 제1 전단 속도는 10 /s이고 상기 제2 전단 속도는 500 /s 인 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the invention, the first shear rate of the present invention is characterized in that 10 / s and the second shear rate is 500 / s.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계 이전에, 혈액을 원심분리하여 적혈구를 분리하는 단계와 상기 분리된 적혈구에 경화 화학 물질을 처리하는 단계를 포함하고, 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계 이후에, 상기 두 전단 속도에서의 막 커패시턴스의 변화율을 계산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to an embodiment of the present invention, the method of the present invention, before the step of measuring the change in the membrane capacitance (CPE) of the red blood cells, centrifuging blood to separate the red blood cells and the separated red blood cells And treating the cure chemicals, and after measuring the degree of change in membrane capacitance (CPE) of red blood cells, calculating a rate of change of membrane capacitance at the two shear rates. It features.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법의 경화 화학 물질은 글루타르알데하이드, 디아미드(diamide) 또는 이들 모두인 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the invention, the curing chemicals of the process of the invention are characterized in that they are glutaraldehyde, diamide or both.
본 발명은 또한 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 막 커패시턴스 측정부를 포함하는 적혈구 변형성 측정 장치를 제공한다.The present invention also provides an apparatus for measuring red blood cell deformability including a membrane capacitance measuring unit for measuring membrane capacitance of red blood cells.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부는 한 쌍의 전극이 간격을 두고 위치하여 샘플의 통과 채널을 형성한 인쇄 기판 회로(PCB)이고, 상기 장치는 PDMS 블록과, 상기 인쇄 기판 회로의 채널과 동일한 형상의 구멍을 갖는 양면 테이프로서, 상기 인쇄 기판 회로 및 PDMS 블록 사이에 위치하는 양면 테이프를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the invention, the film capacitance measurement unit of the device of the present invention is a printed circuit board (PCB) in which a pair of electrodes are spaced apart to form a pass channel of the sample, the device is a PDMS block, A double-sided tape having a hole having the same shape as the channel of the printed circuit board, characterized in that it further comprises a double-sided tape located between the printed circuit board and the PDMS block.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부의 단면적은 0.01 ~ 5 x 0.001 ~ 2 mm2 인 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the invention, the cross-sectional area of the film capacitance measurement section of the device of the invention is characterized in that from 0.01 to 5 x 0.001 to 2 mm 2 .
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 한 쌍의 전극의 전극간 간격은 0.01 ~ 3 mm 인 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the invention, the interelectrode spacing of the pair of electrodes of the device of the invention is characterized in that from 0.01 to 3 mm.
본 발명은 또한 상술한 적혈구 변형성 측정 장치를 사용하여 적혈구 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for measuring red blood cell deformability comprising measuring the red blood cell membrane capacitance using the device for measuring red blood cell deformability.
본 발명은 혈액의 임피던스 스펙트럼을 분석하기 위한 장치를 사용하여 적혈구 변형성을 효과적으로 측정할 수 있다.The present invention can effectively measure erythrocyte deformability using a device for analyzing the impedance spectrum of blood.
본 발명에 따른 변형성 측정에는 적혈구 막의 커패시턴스가 사용된다. 본 발명에 따른 변형성 측정 방법에 따르면 전혈이 샘플 범주에 포함되므로 희석과 같은 샘플 준비는 필요하지 않고, 또한 단일 적혈구 또는 희석 혈액 샘플의 결과와 비교하여 전혈의 결과가 더 대표적인 것으로 여겨진다. The capacitance of the red blood cell membrane is used for the deformability measurement according to the present invention. According to the strain measurement method according to the present invention, since whole blood is included in the sample category, sample preparation such as dilution is not necessary, and the result of whole blood is considered to be more representative compared to the result of a single red blood cell or diluted blood sample.
따라서, 이를 통해 측정 결과의 정확성이 높으면서 측정 방법도 편리하여 매우 효과적이고 임상 적용에 실용적인 적혈구 변형성 측정 방법 및 측정 장치를 얻을 수 있다.Therefore, through this, it is possible to obtain a highly efficient and practical erythrocyte deformability measuring method and measuring apparatus that are highly accurate and convenient in measuring methods.
도 1은 적혈구 변형성 측정의 종래 방법에 관한 도면이다.
도 2는 a) 본 발명에 따른 적혈구 변형성 측정을 위한 전기적 장치 구성에 관한 도면, b) 상기 전기적 장치 내 PCB 채널과 전극의 확대도, c) 본 발명에 따라 제조된 장치의 사진이다.
도 3은 LabVIEW에 의한 적혈구 변형성 측정의 예시이다. 그래프의 Y 축에 표시된 최대 거리에 따라 피팅 타원 (파란색)이 적혈구의 윤곽 (노란색)과 잘 일치하면 코드는 장축 (X), 보조 축 (Y) 및 변형 지수 (DI)를 제공한다. 또한, 적혈구가 더 변형되고 늘어날 때 변형 지수 (DI)는 0.979에서 0.525로 감소한다. 피팅 타원이 윤곽과 잘 일치하지 않으면 이 경우는 수행되지 않는다.
도 4는 전혈의 임피던스 스펙트럼 및 등가 회로 모델에 기초한 핏팅 곡선이다. 비선형 곡선 핏팅에 의해, 혈액 회로 모델의 구성 요소; 혈장 저항, 세포질의 저항, 막 커패시턴스(CPE)은 전혈의 임피던스 스펙트럼으로부터 추출될 수 있다.
도 5는 적혈구 막의 분자 구성의 모식도이다. 적혈구가 변형되기 시작하면 안키린과 스펙트린이 일시적으로 분리되고, 일단 적혈구가 원래 모양이 되면 두 개의 단백질은 재부착된다.
도 6 중 (A)는 정상 및 비정상 샘플의 변형 지수로서, 정상 샘플의 경우 변형 지수 (0.59 - 0.61)가 비슷한 수준이지만, 비정상 샘플의 경우 변형 지수는 정상 샘플에 비해 증가한다. 또한 화학 경화 정도에 따라 변형 지수가 0.66에서 0.81로 증가한다. (B)는 정상 및 비정상 샘플의 ΔCPE로서, 정상 샘플의 ΔCPE 값은 유사 (-80.1 ~ -81.3 %)하고 비정상 샘플의 ΔCPE 값은 감소한다 (-74.5 ~ -50.1 %). (C)는 변형 지수와 ΔCPE 사이의 선형 관계로서, ΔCPE는 변형 지수와 상관 관계가 있음을 알 수 있다.
도 7 중 (A)는 다양한 변형 지수를 갖는 혈액 샘플의 점도 측정으로서, 변형 지수 0.65, 0.77 및 0.88 인 혈액 샘플에 대한 혈액 점도는 마이크로 점도계에 의해 측정된다. 높은 변형 지수에 대한 혈액 점도는 뉴턴 유체 점도 처럼 전단 속도에 의존하지 않는다. (B)는 혈액 샘플의 흐름 지속성 지수로서, 세 샘플에 대한 흐름 지속성 지수는 고 변형 지수에 대해 6.4에서 4.8 cP로 감소한다. (C)는 혈액 샘플의 흐름 거동 지수로서, 세 샘플에 대한 흐름 거동 지수는 고 변형 지수에 대해 0에 가깝다 (-0.109 내지 -0.051). 이는 고 변형 지수의 적혈구는 고 전단 속도에서 잘 변형될 수 없기 때문이다.1 is a diagram of a conventional method for measuring red blood cell deformability.
2 is a) a view of the configuration of an electrical device for measuring red blood cell deformability according to the present invention, b) an enlarged view of the PCB channel and the electrode in the electrical device, c) is a photograph of the device manufactured according to the present invention.
3 is an illustration of erythrocyte deformability measurement by LabVIEW. According to the maximum distance indicated on the Y axis of the graph, if the fitting ellipse (blue) matches the contour of the red blood cells (yellow) well, the code gives the major axis (X), the minor axis (Y) and the index of deformation (DI). In addition, the strain index (DI) decreases from 0.979 to 0.525 as the red blood cells are further deformed and stretched. This case is not performed if the fitting ellipse does not agree well with the contour.
4 is a fitting curve based on the impedance spectrum and equivalent circuit model of whole blood. By nonlinear curve fitting, components of the blood circuit model; Plasma resistance, cytoplasmic resistance, membrane capacitance (CPE) can be extracted from the impedance spectrum of whole blood.
5 is a schematic diagram of the molecular structure of the red blood cell membrane. When the red blood cells begin to deform, the ankyrin and spectrin are temporarily separated, and once the red blood cells are back in shape, the two proteins reattach.
(A) of FIG. 6 is a strain index of normal and abnormal samples, in which the strain index (0.59-0.61) is similar for the normal sample, but the strain index increases for the abnormal sample compared to the normal sample. In addition, the strain index increases from 0.66 to 0.81 depending on the degree of chemical hardening. (B) is the ΔCPE of normal and abnormal samples, where the ΔCPE values of normal samples are similar (-80.1 to -81.3%) and the ΔCPE values of abnormal samples are reduced (-74.5 to -50.1%). (C) is a linear relationship between the strain index and ΔCPE, it can be seen that ΔCPE has a correlation with the strain index.
(A) in FIG. 7 is a viscosity measurement of blood samples having various strain indices, and blood viscosity for blood samples having strain indices 0.65, 0.77 and 0.88 is measured by a microviscometer. Blood viscosity for high strain indices is not as dependent on shear rate as Newtonian fluid viscosity. (B) is the flow persistence index of the blood sample, where the flow persistence index for the three samples decreases from 6.4 to 4.8 cP for the high strain index. (C) is the flow behavior index of the blood sample, where the flow behavior index for the three samples is close to zero for the high strain index (-0.109 to -0.051). This is because erythrocytes with high strain indices cannot deform well at high shear rates.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법 및 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 막 커패시턴스 측정부를 포함하는 적혈구 변형성 측정 장치를 제공하는 것을 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.The present invention for achieving the above object is an erythrocyte including a erythrocyte deformability measuring method comprising the step of measuring the degree of change of membrane capacitance (CPE) of erythrocytes and a membrane capacitance measurement unit for measuring the membrane capacitance of erythrocytes It is characterized by providing a strain measuring device. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명은 적혈구의 막 커패시턴스의 변화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법을 제공한다. 상기 적혈구의 막 커패시턴스는 전기적 방법에 의하여 측정할 수 있으며, 이는 구체적으로 혈액의 임피던스 데이터를 측정하기 위한 장치를 사용하여 측정할 수 있다. The present invention provides a method for measuring red blood cell deformability comprising measuring a degree of change in the membrane capacitance of red blood cells. The membrane capacitance of the red blood cells can be measured by an electrical method, which can be measured using a device for measuring impedance data of blood.
상기 적혈구의 막 커패시턴스의 변화는 일례로 적혈구의 전단 속도 변화에 따른 변화일 수 있다. 따라서, 상기 적혈구의 막 커패시턴스의 변화 정도는 제1 전단 속도에서의 막 커패시턴스 (CPEr1) 대비 제2 전단 속도에서의 막 커패시턴스 (CPEr2)의 변화 정도를 백분율로 나타낼 수 있다. (식 1 참조)The change in the membrane capacitance of the erythrocytes may be, for example, a change due to a change in shear rate of the erythrocytes. Thus, the film changes in the capacitance level of the red blood cells may be indicative of the degree of change in membrane capacitance (CPE r2) at a second shear rate compared to the film capacitance (CPE r1) at a first shear rate, expressed as a percentage. (See Equation 1)
[식 1] [Equation 1]
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 적혈구의 막 커패시턴스의 변화 정도를 측정하는 단계는 제1 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계와, 상기 제1 전단 속도와 상이한 제2 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 측정하는 단계를 포함한다.According to one embodiment of the invention, the step of measuring the change in the membrane capacitance of the red blood cells of the present invention comprises the steps of measuring the membrane capacitance of the red blood cells at the first shear rate, and the second shear different from the first shear rate Measuring the membrane capacitance of the red blood cells at the rate.
한편, 일반적으로 적혈구는 전단 속도가 약 100 /s 일 때 변형되기 시작하기 때문에, 상기 적혈구의 변형성 측정을 위해 수행하는 막 커패시턴스의 변화 비교는 적혈구의 변형이 되기 전 및 후를 비교하는 것이 바람직하다. On the other hand, since the red blood cells generally start to deform when the shear rate is about 100 / s, it is preferable to compare the change in membrane capacitance performed to measure the deformability of the red blood cells before and after the red blood cells are deformed. .
따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 적혈구의 전단 속도가 100 /s 미만인 경우의 막 커패시턴스(CPEr1)과 100 /s 이상인 경우의 막 커패시턴스(CPEr2)의 변화 정도를 비교할 수 있고, 구체적으로 제1 전단 속도는 0 /s 초과 100 /s 미만이고 상기 제2 전단 속도는 100 /s 이상 10000 /s 미만이고, 더 구체적으로 제1 전단 속도는 0.01 /s 내지 50 /s 이고 제2 전단 속도는 200 /s 내지 1000 /s이고, 가장 구체적으로는 제1 전단 속도는 10 /s이고 제2 전단 속도는 500 /s 인 경우의 막 커패시턴스의 변화 정도를 측정하여 비교할 수 있다.Therefore, according to one embodiment of the present invention, the method of the present invention changes the membrane capacitance (CPE r1 ) when the erythrocyte shear rate is less than 100 / s and the change in the membrane capacitance (CPE r2 ) when 100 / s or more. Comparable, specifically, the first shear rate is greater than 0 / s less than 100 / s and the second shear rate is at least 100 / s less than 10000 / s, more specifically the first shear rate is 0.01 / s to 50 / s and the second shear rate is 200 / s to 1000 / s, most specifically, the first shear rate is 10 / s and the second shear rate is 500 / s can be measured by comparing the degree of change in the membrane capacitance have.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 혈액을 원심분리하여 적혈구를 분리하는 단계, 상기 분리된 적혈구에 경화 화학 물질을 처리하는 단계, 제1 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스(CPEr1)을 측정하는 단계, 제2 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스(CPEr2)을 측정하는 단계를 측정하는 단계 및 상기 두 전단 속도에서의 막 커패시턴스의 변화율(%)을 계산하는 단계를 포함한다. According to one embodiment of the present invention, the method of the present invention comprises the steps of separating the red blood cells by centrifuging the blood, treating the separated chemicals with the red blood cells, membrane capacitance of the red blood cells at a first shear rate (CPE) r1 ), measuring the membrane capacitance of red blood cells (CPE r2 ) at the second shear rate, and calculating the percent change in membrane capacitance at both shear rates. .
즉, 본 발명의 적혈구 변형성 측정 방법은 전혈을 사용하여 분석할 수 있지만, 전혈로부터 통상적인 방법을 사용하여 적혈구를 분리하여 분석을 위한 혈액 샘플을 준비할 수 있다. 일례로 막 커패시턴스 측정을 위해 혈액을 원심분리를 수행하여 적혈구를 분리하는 단계를 수행할 수 있다. That is, the erythrocyte deformability measuring method of the present invention may be analyzed using whole blood, but blood samples for analysis may be prepared by separating erythrocytes from whole blood using conventional methods. For example, centrifugation of blood may be performed to separate red blood cells for measuring membrane capacitance.
또한, 본 발명의 적혈구 변형성 측정 방법은 분리된 적혈구에 경화 화학 물질을 처리할 수 있다. 상기 사용될 수 있는 경화 화학 물질에는 글루타르알데하이드, 디아미드(diamide) 등이 사용될 수 있고, 구체적으로 글루타르알데하이드일 수 있다. In addition, the erythrocyte deformability measuring method of the present invention can treat the cured chemicals on the isolated erythrocytes. As hardening chemicals that may be used, glutaraldehyde, diamide, and the like may be used, and specifically, glutaraldehyde may be used.
본 발명은 또한 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 막 커패시턴스 측정부를 포함하는 적혈구 변형성 측정 장치를 제공한다. 본 발명의 적혈구 변형성 측정 장치는 구체적으로 일정하게 로드한 샘플(일례로 혈액)에 대한 임피던스 데이터를 측정하기 위한 전기적 임피던스 측정 또는 전기적 임피던스 토모그래피(EIT) 장치를 활용할 수 있다. 이러한 장치는 신호 공급원, 신호 검출기 및 컴퓨터를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 신호 공급원은 입력 신호로서 전류를 제공하고, 상기 신호 검출기는 출력 신호로서 전압을 검출할 수 있다. 또는, 상기 신호 공급원은 입력 신호로서 전압을 제공하고, 상기 신호 검출기는 출력 신호로서 전류를 검출할 수 있다.The present invention also provides an apparatus for measuring red blood cell deformability including a membrane capacitance measuring unit for measuring membrane capacitance of red blood cells. The red blood cell deformability measuring apparatus of the present invention may specifically use an electrical impedance measurement or electrical impedance tomography (EIT) device for measuring impedance data on a sample (eg, blood) that is constantly loaded. Such devices may include signal sources, signal detectors, and computers. In one example, the signal source provides a current as an input signal and the signal detector can detect a voltage as an output signal. Alternatively, the signal source may provide a voltage as an input signal and the signal detector may detect current as an output signal.
상기 입력 신호는 공급원을 사용하여 전극을 통해 상기 물질에 인가되고 동일 또는 다른 전극에 존재하는 상기 결과값인 출력 신호는 상기 검출기를 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 과정은 입력 신호의 다른 주파수 동안 반복된다. 예를 들어, 상기 전기 신호는 주파수 의존 전기적 임피던스 데이터를 상기 물질에 대해 얻도록 하기 위해, 0 Hz(직류 전류) 내지 100 MHz 사이의 많은 주파수에서 상기 신호 공급원에 의해 인가될 수 있다.The input signal is applied to the material through an electrode using a source and the output signal which is the resultant value present on the same or different electrodes can be measured using the detector. This process is repeated for different frequencies of the input signal. For example, the electrical signal may be applied by the signal source at many frequencies between 0 Hz (direct current) and 100 MHz in order to obtain frequency dependent electrical impedance data for the material.
상기 임피던스 측정을 위해 사용되는 상기 전극의 분리는 상기 물질이 분석되어지는 해상도 또는 스케일을 결정한다. 상기 전기적 임피던스 측정값은 예상되는 기대 스케일(예를 들어, 마이크로-미터 또는 밀리미터 범위)에서 얻어질 수 있다. 상기 기대 스케일의 일 예로서, 혈액세포일 수 있다. 연속적으로 상기 얻어진 전기적 임피던스 데이터는 상기 물질에 대한 복수 개의 전기적 임피던스 특성을 결정하기 위해 가정된 전기적 모델의 전달 함수를 사용하여 분석될 것이다. 상기 사용된 전기적 모델은 상기 임피던스 측정의 해상도/스케일에 의존적일 수 있다.The separation of the electrodes used for the impedance measurement determines the resolution or scale at which the material is analyzed. The electrical impedance measurement can be obtained at the expected expected scale (eg, micro-meter or millimeter range). An example of the expected scale may be blood cells. Subsequently the obtained electrical impedance data will be analyzed using the transfer function of the hypothesized electrical model to determine a plurality of electrical impedance characteristics for the material. The electrical model used may be dependent on the resolution / scale of the impedance measurement.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부는 한 쌍의 전극이 간격을 두고 위치하여 샘플의 통과 채널을 형성한 인쇄 기판 회로(PCB)이다.According to one embodiment of the invention, the film capacitance measurement part of the device of the invention is a printed circuit board (PCB) in which a pair of electrodes are spaced apart to form a pass channel of a sample.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부의 단면적은 0.01 ~ 5 x 0.001 ~ 2 mm2 일 수 있고, 구체적으로 0.1 ~ 3 x 0.01 ~ 1 mm2 일 수 있고, 더 구체적으로 2 x 0.5 mm2 일 수 있다. 상기 단면적의 넓이가 너무 좁으면 측정에 사용되는 혈액의 양이 줄어들어 측정된 막 커패시턴스가 가지는 대표성이 낮아질 수 있다.According to one embodiment of the invention, the cross-sectional area of the film capacitance measurement part of the device of the present invention may be 0.01 to 5 x 0.001 to 2 mm 2 , specifically 0.1 to 3 x 0.01 to 1 mm 2 , more specifically By 2 x 0.5 mm 2 . If the width of the cross-sectional area is too narrow, the amount of blood used for the measurement is reduced, so that the representativeness of the measured membrane capacitance may be lowered.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 한 쌍의 전극의 전극간 간격은 0.01 ~ 3 mm 일 수 있고, 구체적으로 0.1 ~ 1 mm 일 수 있고, 더 구체적으로 0.8 mm 일 수 있다. 상기 단면적의 넓이가 너무 넓으면 동일한 전단 속도 (예를 들면, 500 /s) 획득을 위해 소모되는 혈액 샘플의 양이 증가할 수 있다. According to one embodiment of the invention, the inter-electrode spacing of the pair of electrodes of the device of the invention may be 0.01 to 3 mm, specifically 0.1 to 1 mm, more specifically 0.8 mm. If the area of the cross-sectional area is too wide, the amount of blood sample consumed for obtaining the same shear rate (eg 500 / s) may increase.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 PDMS 블록, 유리 슬라이드(glass slide) 등을 더 포함한다. 이를 통해 상기 인쇄 기판 회로의 한면 또는 양면 모두를 덮을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the device of the present invention further comprises a PDMS block, a glass slide, and the like. This may cover one or both sides of the printed circuit board.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 인쇄 기판 회로의 채널과 동일한 형상의 구멍을 갖는 양면 테이프를 인쇄 기판 회로 및 PDMS 블록 사이에 포함한다.According to one embodiment of the present invention, the apparatus of the present invention includes a double-sided tape having a hole of the same shape as the channel of the printed circuit board between the printed circuit board and the PDMS block.
이하, 도 2를 참조하여 본 발명의 일 구현예에 따른 적혈구 변형성 측정 장치를 설명한다.Hereinafter, an apparatus for measuring red blood cell deformability according to an embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 2.
도 2A에 도시된 것처럼, 본 발명의 장치는 적혈구의 막 커패시턴스를 측정할 수 있는 막 커패시턴스 측정부인 한 쌍의 전극을 포함하는 PCB, 그 위 아래를 덮는 테이프 및 상기 양 테이프를 각각 덮는 PDMD 바닥과 PDMS 뚜껑으로 구성된다. 상기 막 커패시턴스 측정부인 한 쌍의 전극은 간격을 두고 위치하여 혈액 샘플의 통과 채널을 형성하고 있으며, 상기 테이프는 상기 혈액 샘플의 통과 채널과 동일한 형상의 채널을 가져서 PCB를 덮더라도 샘플의 통과 채널의 상부는 테이프로 직접 덮히지 않는다. 상기 채널의 양 끝에는 원형의 저장부가 형성되어 있어 준비한 혈액 샘플을 넣을 수 있으며, 이 때 혈액은 한 방향으로 흐르면서 상기 채널에서 단면적을 통과하여 막 커패시턴스를 측정한다. As shown in Fig. 2A, the device of the present invention includes a PCB including a pair of electrodes, a membrane capacitance measurement unit capable of measuring the membrane capacitance of red blood cells, a tape covering the top and bottom thereof, and a PDMD bottom covering the both tapes, respectively; It consists of a PDMS lid. The pair of electrodes, which are the membrane capacitance measurement unit, are spaced apart to form a passage channel of the blood sample, and the tape has a channel having the same shape as the passage channel of the blood sample so that the tape covers the PCB. The upper part is not directly covered with tape. Circular reservoirs are formed at both ends of the channel to accommodate the prepared blood sample. At this time, the blood flows in one direction and passes through the cross-sectional area in the channel to measure the membrane capacitance.
구체적으로 상기 혈액 샘플은 소자의 좌측 원형 입구단을 통해 주입된 후, 내부의 채널을 통과한 뒤 우측 출구단으로 배출된다. 혈액 샘플이 담긴 주사기는 주사기 펌프 (syringe pump)를 이용해 주입하게 되는데, 이 때 혈액 샘플의 전단 속도는 소자 내부 채널의 단면적과 혈액 샘플의 주입 유량을 바탕으로 결정된다. 일반적으로 소자 내부 채널의 단면적은 능동적인 변경이 불가능하기 때문에, 혈액 샘플의 주입 유량을 변경함으로써 전단 속도를 조절할 수 있다. Specifically, the blood sample is injected through the left circular inlet end of the device, and then passes through the internal channel and is discharged to the right outlet end. The syringe containing the blood sample is injected using a syringe pump. The shear rate of the blood sample is determined based on the cross-sectional area of the device internal channel and the flow rate of the blood sample. In general, since the cross-sectional area of the device internal channel cannot be changed actively, the shear rate can be controlled by changing the injection flow rate of the blood sample.
도 2B에 도시된 것처럼, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부는 한 쌍의 전극을 포함하는 PCB로 구성된다. 임피던스를 측정하는 상기 한 쌍의 전극은 소자 내부 채널의 벽면에 마주보는 형태로 위치하고, 상기 한 쌍의 전극은 임피던스 분석기 (impedance analyzer)와 직접 연결되고, 한 쌍의 전극 사이에 위치한 혈액 샘플의 임피던스를 측정한다. 일례로, 상기 측정부의단면적의 넓이는 2.0 x 0.5 mm2이고 두 전극 사이의 간격은 0.8 mm이고, 혈액의 임피던스 스펙트럼을 주파수 1kHz 내지 5 MHz에서 측정하고, 이 때 사용되는 주파수의 개수 (임피던스 데이터 개수)는 총 801 개 (데이터 포인트)이다. As shown in Figure 2B, the film capacitance measurement of the device of the present invention consists of a PCB comprising a pair of electrodes. The pair of electrodes for measuring the impedance is located in the form facing the wall of the channel inside the device, the pair of electrodes are directly connected to the impedance analyzer (impedance analyzer), the impedance of the blood sample located between the pair of electrodes Measure In one example, the area of the measuring unit is 2.0 x 0.5 mm 2 and the distance between the two electrodes is 0.8 mm, the impedance spectrum of the blood is measured at a frequency of 1kHz to 5 MHz, the number of frequencies used (impedance data Number) is a total of 801 data points.
본 발명은 또한 상술한 적혈구 변형성 측정 장치를 사용하여 적혈구 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for measuring red blood cell deformability comprising measuring the red blood cell membrane capacitance using the device for measuring red blood cell deformability.
이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these are only intended to describe the present invention in more detail, but the scope of the present invention is not limited thereto.
[실시예 1] Example 1
적혈구 및 적혈구 변형성 측정 장치는 한 쌍의 전극과 PDMS 블록이 있는 PCB로 구성된다. 이전에는 PCB 및 PDMS 블록이 액상 에폭시로 접합되어 있다. 그러나, 이는 전극 표면을 쉽게 덮어 제조 과정에서 채널 부분으로 몰래 들어간다. 그 대신, 채널 형태의 구멍이 있는 양면 테이프가 절단 플로터 기계를 사용하여 준비된다. 이전 방법에 비해 훨씬 쉽고 신뢰할 수 있는 방법이다. 이 장치의 단면적은 2.0 x 0.5 mm2이고 두 전극 사이의 간격은 0.8 mm 이다 (도 2 참조).Erythrocytes and erythrocyte deformability measuring devices consist of a PCB with a pair of electrodes and a PDMS block. Previously, the PCB and PDMS blocks were bonded with liquid epoxy. However, it easily covers the electrode surface and sneaks into the channel portion during manufacturing. Instead, double-sided tape with holes in the form of channels is prepared using a cutting plotter machine. It is much easier and more reliable than the previous method. The cross-sectional area of the device is 2.0 x 0.5 mm 2 and the distance between the two electrodes is 0.8 mm (see Figure 2).
샘플 준비를 위해 적혈구와 혈장을 원심 분리를 통해 분리하여 다양한 헤마토크리트 수준의 샘플을 준비한다. 변형성 측정을 위해, 경화 화학 물질 (글루타르알데하이드 용액, H2O 내 25 중량%, 시그마 알드리치, 미국)을 첨가하여 적혈구 막의 강성을 조절한다. 일단 적혈구가 원심 분리 (4,000 rpm, 6분) 에 의해 전혈로부터 분리되면, PBS(인산완충식염수) 중의 적혈구 현탁액이 제조된다. 그리고 0 - 0.5 % 농도 범위의 글루타르알데하이드를 현탁액에 넣고 90 분간 그대로 둔다. 다시 원심 분리 후, 현탁액으로부터 화학 처리된 적혈구를 얻을 수 있었다. 마지막으로 화학적으로 처리된 적혈구는 적혈구 용적률을 목표로 하여 혈장에 혼합된다.For sample preparation, red blood cells and plasma are separated by centrifugation to prepare samples of various hematocrit levels. For strain measurements, curing chemistry (glutaraldehyde solution, 25% by weight in H 2 O, Sigma Aldrich, USA) is added to control the stiffness of the erythrocyte membrane. Once red blood cells are separated from whole blood by centrifugation (4,000 rpm, 6 minutes), a red blood cell suspension in PBS (phosphate buffered saline) is prepared. Glutaraldehyde in the concentration range of 0-0.5% is placed in the suspension and left for 90 minutes. After centrifugation again, chemically treated red blood cells were obtained from the suspension. Finally, the chemically treated red blood cells are mixed into the plasma with the aim of red blood cell volume fraction.
임피던스 분석기 (IM 3570, HIOKI, 일본)는 1 kHz ~ 5 MHz의 주파수에서 혈액의 임피던스 스펙트럼을 획득하는 데 사용된다. 그리고 혈액의 등가 회로 모델에 따라 세포질, 혈장 및 적혈구 막의 전기적 특성을 추출하기 위해 임피던스 스펙트럼의 곡선 피팅을 위한 소프트웨어 (Zview, Scribner, NC, 미국)가 사용된다.Impedance analyzers (IM 3570, HIOKI, Japan) are used to acquire the impedance spectrum of blood at frequencies from 1 kHz to 5 MHz. And software for fitting curves of the impedance spectrum (Zview, Scribner, NC, USA) is used to extract the electrical properties of the cytoplasm, plasma and erythrocyte membranes according to the equivalent circuit model of blood.
적혈구 변형성 평가를 위한 실험실 기준 시스템이 준비되었다. 이미지 획득을 위해 광학 현미경 (IX71, 올림푸스, 일본)과 고속 카메라 (MotionPro X3, Redlake 미국)가 사용된다. 마이크로 채널 내부를 흐르는 적혈구의 이미지 시퀀스는 고속 카메라를 통해 얻어진다. 이미지 분석을 위해 LabVIEW 코드는 관심 영역(region of interest, ROI)에 배치된 적혈구의 윤곽을 인식한다. 마이크로 채널의 단면적의 높이가 2μm이므로, 상기 마이크로 채널 내 적혈구는 흐름 방향만 따라 변형되는 것으로 제안된다. 따라서, 타원형 적혈구의 장축과 단축의 비율로 정의되는 변형 지수 (DI)가 계산될 수 있으며 이는 0에서 1까지의 숫자이다. DI가 0에 가까울수록 그것은 변형 가능하다는 것을 의미한다. 다른 한편, 적혈구는 DI가 1에 가까울 때 변형할 수 없다. 기준 시스템에서, 임의의 형태의 적혈구의 윤곽이 강도 프로파일에 따라 검출될 수 있다. 그런 다음, 적혈구의 윤곽선에 맞는 타원이 DI를 계산하기 위해 제공된다. 자동화된 LabVIEW 코드를 사용하여 지속적으로 수행된다 (도 3 참조).A laboratory reference system for evaluating erythrocyte deformability was prepared. An optical microscope (IX71, Olympus, Japan) and a high speed camera (MotionPro X3, Redlake USA) are used for image acquisition. An image sequence of red blood cells flowing inside the microchannel is obtained through a high speed camera. For image analysis, the LabVIEW code recognizes the outline of red blood cells placed in a region of interest (ROI). Since the height of the cross-sectional area of the microchannel is 2 μm, it is proposed that the red blood cells in the microchannel deform only along the flow direction. Thus, the strain index (DI), defined as the ratio of the long axis and short axis of elliptical red blood cells, can be calculated, which is a number from 0 to 1. The closer DI is to zero, it means that it is deformable. Erythrocytes, on the other hand, cannot modify when DI is close to one. In the reference system, the contour of any form of red blood cells can be detected according to the intensity profile. Then, an ellipse that fits the contours of the red blood cells is provided to calculate the DI. It is continuously performed using automated LabVIEW code (see Figure 3).
[실시예 2] Example 2
일반적으로, 전혈의 단순화된 등가 회로에는 세 가지 성분, 세포질의 저항 (Ri), 혈장의 저항 (Rp) 및 막 커패시턴스 (membrane capacitance, CPE)이 있다 (도 4 참조). In general, the simplified equivalent circuit of whole blood has three components, cytoplasmic resistance (Ri), plasma resistance (Rp) and membrane capacitance (CPE) (see FIG. 4).
적혈구 변형성 측정의 경우, 막 커패시턴스의 변화 정도가 적혈구 변형 정도와 관련이 있다고 가정한다. 적혈구 막에는 적혈구 변형에 중요한 역할을 하는 안키린 (ankyrin)과 스펙트린 (spectrin)이 있다 (도 5 참조). 이들이 변형에 의해 가역적으로 부착되고 분리될 수 있기 때문에, 적혈구 막의 두께는 변형에 의해 변한다. 즉, 적혈구 커패시터의 형상은 변형에 의해 변화한다. 기하학적 변화는 커패시턴스의 변화를 가져오므로 커패시턴스의 변화는 적혈구의 변형과 관련이 있다. 이러한 의미에서, CPE(constant phase element, 막 커패시턴스)가 사용된다. 일반적으로 적혈구 막은 균일하지 않은 특성으로 인해 이상적인 축전기가 아니다. 따라서 CPE는 순수 커패시터 대신 널리 사용된다. 이 장치를 사용함으로써, 변형 및 변형되지 않은 상태의 적혈구에 대한 CPE의 차이를 따랐다.For erythrocyte deformability measurements, it is assumed that the degree of change in membrane capacitance is related to the degree of erythrocyte deformity. The erythrocyte membranes are ankyrin and spectrin that play an important role in erythrocyte transformation (see FIG. 5). Since they can be reversibly attached and detached by deformation, the thickness of the erythrocyte membrane changes by deformation. That is, the shape of the red blood cell capacitor changes by deformation. Since geometric changes result in changes in capacitance, the change in capacitance is related to the deformation of red blood cells. In this sense, CPE (constant phase element, film capacitance) is used. In general, red blood cell membranes are not ideal capacitors due to their non-uniform nature. Therefore, CPE is widely used instead of pure capacitors. By using this device, the difference in CPE for red blood cells in the modified and unmodified state was followed.
[식 2][Equation 2]
. 
일반적으로 적혈구는 전단 속도가 약 100 /s 일 때 변형되기 시작한다. 따라서, 변형된 적혈구에 대해 500 /s의 전단 속도가 선택된다. 적혈구 침강의 영향을 배제하기 위해 정적 조건 대신에 전단율 10 /s를 사용한다. 그리고, 전기적 방법으로 얻은 적혈구의 변형성을 실험실에서 만들어진 기준 시스템과 비교하여 이미지 분석을 통해 적혈구의 변형성을 평가할 수 있다.In general, red blood cells begin to deform when the shear rate is about 100 / s. Thus, a shear rate of 500 / s is selected for the modified red blood cells. To rule out the effects of erythrocyte sedimentation, a shear rate of 10 / s is used instead of static conditions. In addition, the deformability of the red blood cells may be evaluated through image analysis by comparing the deformability of the red blood cells obtained by the electrical method with a reference system made in a laboratory.
[실시예 3] Example 3
다음 표에서 설명한 바와 같이 6 개의 표본에 대한 변형 색인은 실험실에서 작성한 참조 시스템으로 얻는다. 정상 샘플의 경우 변형 지수 (deformation index, DI)는 동일한 수준이다(0.59 - 0.61). 그러나 비정상 샘플의 경우 변형 지수가 정상 샘플보다 높다. 또한 화학 경화 정도에 따라 증가한다.As described in the following table, the strain indices for the six samples are obtained from a laboratory-created reference system. For normal samples, the deformation index (DI) is the same level (0.59-0.61). However, for abnormal samples, the strain index is higher than for normal samples. It also increases with the degree of chemical curing.
번호Stark
number
(정상/비정상)Classification
(normal abnormal)
전기적 방법의 경우 정상 및 비정상 샘플에 대해 식 (2)에 의해 정의된 ΔCPE가 측정된다. CPE는 전단 속도에 따라 감소하므로, ΔCPE는 음의 값을 나타낸다. 정상 샘플의 경우, 거의 동일한 수준 (-80.1 내지 -81.3%) 이다. 비정상 샘플의 경우, ΔCPE의 등급은 정상 샘플보다 작다. 또한 경화 화학 물질의 농도 (-74.5 내지 -50.1%)에 따라 감소한다. 감소된 ΔCPE는 적혈구 변형의 정도가 화학적 경화의 정도에 따라 점점 작아지는 것을 반영한다. 그 후, 전기적 방법에서 ΔCPE와 이미지 분석으로부터 얻은 변형 지수 사이에 선형 상관 관계가 있음을 알 수 있다. 도 6(C)의 피팅 곡선을 사용함으로써, 변형 지수는 전기적 방식으로 추정될 수 있다 (도 6 참조).For the electrical method, the ΔCPE defined by equation (2) is measured for normal and abnormal samples. Since CPE decreases with shear rate, ΔCPE shows a negative value. For normal samples, they are about the same level (-80.1 to -81.3%). For abnormal samples, the grade of ΔCPE is less than for normal samples. It also decreases with concentration of curing chemicals (-74.5 to -50.1%). Reduced ΔCPE reflects the degree of erythrocyte deformation becoming smaller with the degree of chemical hardening. It can then be seen that there is a linear correlation between ΔCPE and the strain index obtained from the image analysis in the electrical method. By using the fitting curve of FIG. 6C, the strain index can be estimated in an electrical manner (see FIG. 6).
적혈구 변형성인 전혈 점도에 영향을 미치는 결정 인자의 효과를 증명하였다. 그리고, 흐름 지속성 지수 (k, Flow consistency indices)와 흐름 거동 지수 (n, Flow behavior indices) 인 power law 모델의 계수를 이용하여 정량적으로 검증하였다. 흐름 지속성 지수(k)는 매우 낮은 전단 속도에서의 점도를 나타낸다. 흐름 거동 지수 (n)는 점도의 전단 의존성 거동의 정도를 의미한다.The effect of determinants affecting the red blood cell deformable whole blood viscosity was demonstrated. And it was verified quantitatively by using coefficients of power law model which is flow consistency index (k) and flow behavior index (n). The flow persistence index (k) represents the viscosity at very low shear rates. The flow behavior index (n) means the degree of shear dependent behavior of the viscosity.
다양한 변형 지수 (0.65, 0.77 및 0.88)를 갖는 샘플의 전혈 점도가 측정된다. 경화된 적혈구 (파란색과 녹색 동그라미)는 주어진 전단 속도 조건에서 정상 적혈구만큼 (빨간색 원) 변형될 수 없기 때문에, 고 전단 속도 (~ 1,000 /s)에서 점도가 경화된 적혈구에 상대적으로 높다. 흐름 거동 지수 (n)에 대해, 경화된 적혈구를 갖는 샘플은 뉴톤 유체의 점도의 경우인 제로에 가까워진다 (도 7 참조).Whole blood viscosities of samples with various strain indices (0.65, 0.77 and 0.88) are measured. Cured erythrocytes (blue and green circles) cannot be transformed as normal erythrocytes (red circles) at a given shear rate condition, so that at high shear rates (~ 1,000 / s), the viscosity is relatively high for cured erythrocytes. For the flow behavior index (n), the sample with cured erythrocytes approaches zero, which is the case for the viscosity of the Newtonian fluid (see FIG. 7).
이를 통해, 적혈구 변형성인 전혈 점도에 영향을 미치는 결정 요인을 단일 장치에서 측정한다. CPE인, 세포질, 혈장 및 막 커패시턴스의 전기 저항은 전기 임피던스 분광법을 통해 두 가지 결정 요인을 측정하는 데 활용된다. 장치 자체에 관해서는 제작 절차가 이전 버전보다 더 신뢰할 수 있다. 또한, 적혈구 변형성에 대한 정보를 제공할 수 있고,ΔCPE와 이미지 분석의 변형 지수와의 상관 관계를 보여준다. 마지막으로, 적혈구 변형성의 효과는 두 가지 결정 인자에 다양한 조건을 가짐으로써 입증된다.This determines the determinants affecting red blood cell deformable whole blood viscosity in a single device. The electrical resistance of the CPE, cytoplasm, plasma and membrane capacitance, is used to measure two determinants through electrical impedance spectroscopy. As for the device itself, the fabrication procedure is more reliable than the previous version. It can also provide information about erythrocyte deformability and show the correlation between the ΔCPE and the strain index of the image analysis. Finally, the effect of erythrocyte deformability is demonstrated by having various conditions on two determinants.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.In the above, the applicant has described the preferred embodiments of the present invention, these embodiments are only one embodiment for implementing the technical spirit of the present invention, any modifications or modifications as long as the technical spirit of the present invention is implemented. Should be interpreted as being within the scope.
Claims (11)
상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계는,
제1 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계와, 상기 제1 전단 속도와 상이한 제2 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 방법.The method of claim 1,
Measuring the degree of change in the membrane capacitance (CPE) of the red blood cells,
Measuring the membrane capacitance of erythrocytes at a first shear rate, and measuring the membrane capacitance of erythrocytes at a second shear rate that is different from the first shear rate; How to measure.
상기 제1 전단 속도는 0 /s 초과 100 /s 미만이고 상기 제2 전단 속도는 100 /s 이상 10000 /s 미만인 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 방법.The method of claim 2,
The first shear rate is greater than 0 / s less than 100 / s and the second shear rate is greater than 100 / s less than 10000 / s red blood cell deformability measuring method.
상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계 이전에, 혈액을 원심분리하여 적혈구를 분리하는 단계와 상기 분리된 적혈구에 경화 화학 물질을 처리하는 단계를 포함하고,
상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계 이후에, 상기 두 전단 속도에서의 막 커패시턴스의 변화율을 계산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 방법.The method of claim 2,
Before measuring the degree of change in membrane capacitance (CPE) of the red blood cells, centrifuging the blood to separate the red blood cells and comprising the step of treating the erythrocytes with the curing chemicals,
And after calculating the degree of change in membrane capacitance (CPE) of the red blood cells, calculating a rate of change of the membrane capacitances at the two shear rates.
상기 장치는 PDMS 블록과,
상기 인쇄 기판 회로의 채널과 동일한 형상의 구멍을 갖는 양면 테이프로서, 상기 인쇄 기판 회로 및 PDMS 블록 사이에 위치하는 양면 테이프
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 장치.The method of claim 7, wherein the film capacitance measurement unit is a printed circuit board (PCB) in which a pair of electrodes are spaced apart to form a pass channel of the sample,
The apparatus comprises a PDMS block,
A double-sided tape having a hole having the same shape as a channel of the printed circuit board, the double-sided tape located between the printed circuit board and the PDMS block
Erythrocyte deformability measuring device further comprising a.
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