KR20190140440A - 안티센스를 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

안티센스를 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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데이비드 더블유 앤드루스
더글라스 씨 후퍼
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토마스 제퍼슨 유니버시티
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Abstract

본 개시는 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1R)에 대해 지시되는 안티센스(AS) 핵산을 사용하는 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. AS는 환자에게 전신적으로 투여되거나, 자가 암 세포 백신을 생성하도록 사용될 수 있다. 실시양태에서, AS는 종양 세포 및 유효량의 AS를 포함하는 이식 가능한 조사되는 바이오확산 챔버에 제공된다. 챔버는 조사되고 대상체의 복부에 이식되며 종양을 윈위적으로 공격하는 면역 반응을 자극한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 많은 상이한 종류의 암, 예컨대 교모세포종을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

안티센스를 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 각각 "안티센스를 사용하여 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물"이란 명칭의 미국 가특허 출원 번호 62/469,003(2017년 3월 9일 출원) 및 62/629,972(2018년 2월 13일 출원)에 대해 우선권을 주장하며, 이들 각각의 개시는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 개시는 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체(IGF-1R)에 대해 지시된 안티센스 핵산을 사용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시는 또한 종양 세포 및 IGF-1R에 대해 지시된 안티센스 핵산을 포함하는 적어도 하나의 이식 가능한 조사된 바이오확산(biodiffusion) 챔버(미국 특허 번호 6,541,036 및 PCT/US2016/026970 참조, 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)로 대상체를 치료함으로써 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 설명
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 포맷 카피(파일명: IMVX_005_02WO_SeqList.txt, 기록일: 2018년 3월 8일, 파일 크기: 12 킬로바이트).
암 요법의 진전에도 불구하고, 악성 신경아교종, 특히 다형성 교모세포종 및 많은 다른 암에 대한 예후는 여전히 열악하다. 예컨대, 화학요법, 외부 빔 방사선 및 근접요법과 같은 표준 치료법의 변형은 무진행 생존 및 전체 생존 모두에서 약간의 개선만을 제공한다. 면역요법 시험은, 비록 이론적으로는 유망하지만, 고형 종양에 의해 야기되는 문제를 다루지 못하였다. 신경아교종 치료의 경우, 국립암연구소는 연간 약 28,000건의 발병률을 추산하며, 이는 재발성 신경아교종 환자가 포함되면 50,000건 이상으로 증가한다. 따라서, 당해 분야에서는 암, 특히 뇌의 암에 대한 새롭고 개선된 치료법을 얻을 필요가 있다.
본 개시는 인슐린 유사 성장 인자 수용체-1(IGF-1R)를 표적하는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(AS-ODN)가 본원에 기술된 치료 접근법에 사용되는 경우 대상체에서 암을 치료하는 반응을 효과적으로 자극한다는 것을 입증한다. 특정 측면에서, 방법은 가가 암 세포 백신의 일부로서 단독으로 또는 임의적으로 전신 투여와 함께 환자에서 암을 치료하는 데 효과적이다. 바람직한 접근법에서, 본원에 개시된 방법은 단독요법으로서, 즉 화학요법의 부재 및 방사선 요법의 부재 하에 효과적인 암 요법을 제공한다.
실시양태에서, 본 개시는 조사된 종양 세포 및 조사된 인슐린 유사 성장 인자 수용체-1 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(IGF-1R AS ODN)를 포함하는, 종양을 앓는 대상체로 이식하기 위한 바이오확산 챔버를 제공한다. 실시양태에서, 종양 세포는 대상체의 절제 부위로부터 제거된다.
실시양태에서, 본 개시는 조사된 IGF-1R AS ODN 및 조사되고 부착력이 풍부하고 세절된(morselized) 종양 세포를 포함하는 확산 챔버를 제공하며, 여기서 바이오확산챔버는 세포에 대해서는 불투과성이고 IGF-1R AS ODN에 대해서는 투과성이 막을 포함한다.
실시양태에서, 종양 세포는 내시경 디바이스를 사용하여 절제 부위로부터 제거된다. 추가의 실시양태에서, 종양 세포는 조직 모실레이터(morselator)를 사용하여 절제 부위로부터 제거된다. 다른 실시양태에서, 조직 모실레이터는 고정형 외부 캐뉼라 내에 고속 왕복형 내부 캐뉼라를 포함한다. 외부 캐뉼라는 측면 개구를 포함하고, 추가로 종양 세포는 전자적으로 제어되는 가변 석션에 의해 측면 개구로 당겨진다. 실시양태에서, 조직 모실레이터는 절제 부위에서 열을 발생하지 않는다. 추가의 실시양태에서, 종양 세포는 바이오확산 챔버에 배치되기 전 네스틴 발현에 대해 농축된다. 일부 실시양태에서, 챔버의 이식은 대상체에서 종양의 재성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 챔버의 이식은 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월 또는 적어도 36개월 동안 종양의 재성장을 억제한다.
추가의 실시양태에서, 본 개시는 종양 세포를 IGF-1R AS ODN의 존재 하에 바이오확산 챔버에 배치하는 단계 및 바이오확산 챔버를 조사하는 단계를 포함하고, 종양 세포는 절제 부위에서 열을 발생하지 않는 조직 모실레이터를 사용하여 대상체의 절제 부위로부터 제거되는 것인, 종양을 앓는 대상체로 이식하기 위한 바이오확산 챔버를 제조하는 방법을 제공한다. 전형적으로, 다수의 챔버가 사용된다. 예컨대, 약 10개 챔버 또는 약 20개 챔버. 유리하게는 최적의 항종양 반응은 20개 챔버가 이식되는 경우 챔버 내의 세포수가 약 750,000개 내지 약 1,250,000개, 예컨대 약 1,000,000/챔버일 때 얻어진다.
일부 실시양태에서, 조직 모실레이터는 내시경 디바이스이다. 추가의 실시양태에서, 조직 모실레이터는 고정형 외부 캐뉼라 내에 고속 왕복형 내부 캐뉼라를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 외부 캐뉼라는 측면 개구를 포함하고, 종양 세포는 전자적으로 제어되는 가변 석션에 의해 측면 개구로 당겨진다.
실시양태에서, 본 개시는 하나 이상의 바이오확산 챔버를 대상체로 이식하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 바이오확산 챔버는 조사된 세포 및 조사된 인슐린 유사 성장 인자 수용체-1 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(IGF-1R AS ODN)를 포함하고, 종양 세포는 절제 부위에서 열을 발생하지 않는 조직 모실레이터를 사용하여 대상체의 절제 부위로부터 제거되는 것인, 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
도 1a-1g는 대표적인 바이오확산 챔버를 도시한다. 도 1a. 구성 부품; 도 1b. 조립된 챔버; 도 1c. 챔버를 밀봉하는 PMMA 포트 플러그; 도 1d. 폴리비닐리딘 플루오라이드 듀라포어(Durapore) 막의 현미경사진; 도 1e. 실제 챔버의 오버헤드 및 측면도; 도 1f. 및 도 1g. 외식 후 듀라포어 막의 H & E 염색된 파라핀 절편; 도 1f. 인간 시험 14379-101로부터의 외식된 포스페이트 완충된 식염수 대조군 챔버; 도 1g. 인간 시험 14379-101로부터의 외식된 백신 챔버.
도 2a-2c는 I상 시험에서 대상체의 생존 메트릭스를 도시한다(IND 14379-101, NCT01550523). 도 2a. 시험에서 환자의 전체 생존; 도 2b. 2개의 생존 코호트를 갖는 프로토콜 생존. 9명의 환자는 질환 진행으로 사망하였으며, 1명은 대뇌내 출혈로 사망하였으며, 2명은 패혈증으로 사망하였다. 전체 프로토콜 생존율은 더 긴 생존 코호트(N=4) 및 더 짧은 생존 코호트(N=8)에 대해 각각 48.2주 및 9.2주였다(log-rank = .014). 도 2c. 1명의 중증의 림프구감소증 이상치와 3명의 비-질환-관련된 사망을 제외한 선형 회귀는 프로토콜 생존과 등록시 림프구 수 사이의 높은 상관관계를 보였다(R2 = .8, p = .0028).
도 3a-3d는 연관된 생리학적 측정과 함께 방사선촬영 반응을 도시한다. 도 3a. 짧은 생존 코호트로부터의 환자 이미징의 예. 환자 TJ11: A-D; 환자 TJ10: E-H. A, E: 수술 전 T1-가돌리늄-증진된 축상 이미지; G: T1-가돌리늄-증진된 관상 이미지; C: 수술 전 축상 FLAIR 이미지. B, D, F, H: 각각 수술 후 3개월의 이미지. 도 3b. 더 긴 생존 코호트로부터의 환자 이미징의 예. 환자 TJ06: A-D; 환자 TJ09: E-H. A, E: 수술 전 T1-가돌리늄-증진된 축상 이미지; C, F: 수술 전 축상 FLAIR 이미지. B, D, F, H: 각각 수술 후 3개월의 이미지. 도 3c. 더 긴 생존 코호트에서 종양의 상대적 대뇌 혈액량 대 겉보기 확산 계수 사이의 관계; ADC와 rCBV 사이에 높은 상관관계가 있다(R2 = .96, p = .0005). 도 3d. 짧은 생존 코호트에서 종양의 상대적 대뇌 혈액량 대 겉보기 확산 계수 사이의 관계.
도 4a-4c는 생존 코호트에 의한 외식된 챔버의 검사를 도시한다. 도 4a. 외식된 챔버는 생존 세포 없이 구조적으로 온전하였다. C-p 및 C-v 챔버 둘 다로부터의 막의 외부 표면은 CD15+ 및 CD163+ 세포로 코팅되었으며, C-v 막에서 극적으로 증가된 수를 가졌다; 도 4b. 생존 코호트들 사이의 챔버 내 인자 분석은, 더 긴 코호트에서는 VEGF, PDGF-α, IL-11, CCL5, MCP-3 및 MIP-1d의 상당한 챔버 상승을 보였으며, 짧은 코호트에서는 NSE, 오스테오넥틴 및 YKL40를 포함하는 많은 가용성 암 마커가 상당히 상승되었다. 독립적으로 혼합물 판별 분석으로 이들 코호트 차이를 확인하였다; 도 4c. 코호트 둘 다에 대해, 신경아교종 대식세포 동원과 연관된 2개의 케모킨이 C-v에서 다른 측정 가능한 공급원보다 상당히 낮았다. 페리오스틴 및 CCL2 둘 다의 수준이 혈청 또는 SN(종양 세포 상청액) 값보다 상당히 낮았으며, 이는 챔버에서 이들 케모킨을 생성하는 세포의 제거를 제시한다.
도 5a-5e는 PBMC 및 사이토카인의 백신접종 후 수준을 도시한다. 치료 후 기간에 백신접종 후 면역 이펙터 세포 이동 및 사이토카인/케모킨 이동의 일련의 측정. 더 긴 생존 코호트, (환자 TJ03, TJ14, TJ06, TJ09); 짧은 생존 코호트의 예, 환자 TJ13(모든 다른 짧은 생존 코호트에 대해, 도 6을 참조). 줄: 도 5a. 백신접종 후 일련의 PBMC 수; 도 5b. 백신접종 후 PBMC 아집단 퍼센트의 일련의 평가, 도 5c. CCL21 및 CXCL12의 일련의 수준; 도 5d. 절대 CD14+CD16- 대식세포 수와 MCP-1(CCL2)과의 관계; 수술 후 도 5b에서의 대식세포 수준 및 CCL2 스파이크와의 상관관계에 주목. CCl2 수준은 짧은 생존 코호트에서 상당히 높게 유지되었다(도 6 참조); 도 5e. 백신접종 후 추정적 TH-1 반응의 스케일링된 비교(TNF-α x 2; CXCL9 x 350; CXCL10 x 80). 유의한 상관관계가 하기와 같이 주목되었다: TNF-α 스파이크는 코호트 둘 다에 대해 CCL2 스파이크와 높은 상관관계가 있었다(R2 = .99, p = .003). 짧은 코호트에서는 보이지 않는(p = .78), CD14+16- 세포에서 상당한 즉각적인 수술기주위 감소가 있었다(p = .008). 더 긴 코호트 경우에서만, CD4와 CXCL12 사이에 유의한 상관관계가 있었다(R2 = .62, p < .0001). 또한, 총 단핵구 수와 CD14+16- 단핵구 수준 사이에 높은 상관관계가 주목되었으며(도 5B 및 5D, R2 = .8, p < .0001), 순환 T 세포와 단핵구 수 사이에 역관계가 더 긴 생존 코호트에서 주목되었으며(도 5) 짧은 생존 코호트에서는 유의한 차이가 없었다(도 6).
도 6a-6e는 짧은 코호트 환자(환자 TJ01, TJ01, TJ07, TJ08, TJ10, TJ11, TJ12)에서 백신접종 후 PBMC 및 사이토카인 수준을 도시한다. 열: 도 6a. 백신접종 후 일련의 PBMC 수; 도 6b. 백신접종 후 PBMC 아집단 퍼센트의 일련의 평가(T-세포; B-세포; 단핵구); 도 6c. CCL21 및 CXCL12의 일련의 수준; 도 6d. 절대 CD14+CD16- 대식세포 수와 MCP-1(CCL2)과의 관계. CCl2 수준은 긴 생존 코호트와 비교하여 짧은 생존 코호트에서 상당히 높게 유지되었다. 도 6e. 백신접종 후 추정적 TH-1 사이토카인 반응의 스케일링된 비교(TNF-α x 2; CXCL9 x 350; CXCL10 x 80). IFN-g도 도시된다.
도 7a-7h는 백신접종 후 특정한 종양-촉진 단핵구 세포 집단의 손실을 도시한다. 실질적인 종양 퇴행이 3개월에 걸쳐 관찰되었다. 도 7a. TME IGF-1R+ 세포에 대한 단상 경향(서열 척도); 초기 진단부터 백신접종까지의 매칭된 짝의 경우(N=5), 유의한 차이가 없음; 백신부터 부검까지의 매칭된 짝(N=4)은 IGF-1R+ 세포에서 상당한 감소를 나타낸다(p = .003). 도 7b. 초기 진단부터 백신 및 부검까지 평가 가능한 파라핀 절편을 갖는 2명의 환자(환자 TJ06 및 TJ10)에서 IGF-1R 양성 세포. 도 7c. 진단부터 재발까지 상당한 증가(비주기적인 5개의 400x 필드/치료 단계/환자; 좌측 플롯, 매칭된 짝 *p < .0001, N=6)에 이어 백신접종 후 재발부터 부검까지 상당한 손실(우측 플롯, 매칭된 짝 *p < .0001, N=4)을 갖는 TME CD163 M2 대식세포에 대한 이상(biphasic) 경향. 도 7d. 초기 진단부터 백신 및 부검까지 평가 가능한 파라핀 절편을 갖는 동일한 2명의 환자(환자 TJ06 및 TJ10)에서 CD163+ 세포; 백신 대 재발에서 CD163의 증가(매칭된 짝, p = .052)에 이어 부검 대 백신에서 TME CD163 M2 대식세포의 상당한 감소(매칭된 짝, *p = .001). 도 7e. 수술 시 기록된 말초 CD163 단핵구와 CD163 TAM 수준 사이의 짧은 생존 코호트에서의 유의한 상관관계(R2 = .80, p = .02). 도 7f. 더 긴 코호트에서 말초와 TAM CD163 세포 사이의 비유의적인 상관관계. 도 7g. 파라핀 절편으로부터 형광 면역조직화학 광현미경사진. A, C: 백신접종 전 2차 외과 절제술의 환자 TJ10 및 B, D; 부검 시; E-H: 표준 치료 후 재-절제술을 받은 교모세포종 환자로부터 입수한 부검 표본; I, J: 비치료되고 우연히 발견된 사후 교모세포종. 도 7h. 초기 진단부터 부검까지의 TJ06에서의 치료 반응에 대한 시간 경과. 표준 치료 후 증가와 백신접종 후 부검까지 감소를 갖는 TME에서 CD163 세포의 이상 발생. CD163 TAM의 손실은 종양에서 rCBV 및 ADC 값 둘 다의 증가와 연관된다. 각각의 백신접종 후 혈청 니트레이트 수준이 급등하며 수반되는 rCBV/ADC 증가와 연관된다.
도 8a-8d는 연구 대상체로부터의 사이토카인 또는 혈청에 의한 미성숙 단핵구의 분화를 도시한다. 도 8a. M2 사이토카인으로 단핵구의 분극화(polarization) 후 IGF-1R의 상향조절. M1 대식세포는 IGF-1R을 상향조절하지 않는다(***p = .0004).　도 8b. 재료 및 방법에 기술된 대식세포 분극화 프로토콜에 따라 IGF-1R AS ODN으로 처리 후 단핵구 서브세트 분포의 차이. 유동 세포측정은 IGF-1R AS ODN이 M2 대식세포의 제거를 선택적으로 표적한다는 것을 보여준다.　도 8c.　프로토콜 환자 혈청은 미성숙 단핵구를 IGF-1R 및 PD-L1을 공동발현하는 CD163+ 표현형을 분화시킨다. IGF-1R AS ODN은 이 대식세포 집단을 용량 의존적 방식으로 100배 농도 범위에 걸쳐 녹다운시킨다. 모든 값은 평균 형광 강도이다. 각각의 환자 혈청의 공동인큐베이션에 대한 이중 측정, 평균 비교.　　***p < .0001, **p = .0001, *p = .0002,　◆◆◆p　= .0003, ◆◆p　= .0009, ◆p　= .009,　
Figure pct00001
　= .0018,
Figure pct00002
　= .026.　　　도 8d. 도 8c의 수단의 요약.
도 9a-9d는 제1 중간 분석에서의 표준 치료와 비교하여 무진행 생존 및 전체 생존 둘 다에서 상당한 개선이 있었음을 도시한다. 도 9a. 표준 치료(SOC)와 비교되는 전체 연구 코호트의 무진행 생존(PFS); 검은 점선은 95% 신뢰 구간이다; 도 9b. 전체 생존(OS). 두 경우 모두 SOC가 95% CI 아래로 떨어지며, 상당한 개선을 반영한다; 도 9c. 중간 분석에서 생존 코호트에 의한 PFS; 도 9d. 중간 분석에서 생존 코호트에 의한 OS.
도 10a-10d는 1b상 연구의 요약 및 이전 시험과 시험 내 코호트들 사이의 인터페론-감마 수준의 비교를 도시한다. 도 10a. 새로 진단된 백신 코호트에서 백신접종 후 증가하는 IFN-γ의 경향(p = .06); 도 10b. 새로 진단된 백신 코호트에서 중앙값 IFN-γ의 상당한 증가(p = .02); 도 10c. 20개 챔버 코호트에서 IFN-γ 수준의 상당한 증가, ***p < .0001, **p <.006, *p < .02; 도 10d. 시간에 따른 바이오확산 챔버로부터 표지된 IGF-1R AS ODN의 확산 속도.
도 11a-11j는 나이브(naive) 마우스 모델에서 향염증 사이토카인 생성에 대한 완전히 제형화된 바이오확산 챔버(조사 및 외인적으로 첨가된 AS ODN 둘 모두)의 효과를 도시한다. GL261 세포 단독; 2 μg IGF-1R AS ODN의 첨가, 5 Gy의 X-조사로의 GL261 세포의 조사를 갖는 부분적 제형; 또는 완전히 제형화된 자가 백신(GL261, 2 μg IGF-1R AS ODN 및 5 Gy of 감마-방사선조사)으로 채워진 이식 후 24시간에 외식된 마우스 챔버 내용물의 루미넥스(Luminex) 분석; 도 11a. G-CSF GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0117; 도 11b. IL-1a, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .008; 도 11c. IL-1b, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0067; 도 11d. IL-2, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0002; 도 11e. IL-9, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0413; 도 11f. IL-10, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0001; 도 11g. IL-12(p40), GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .001; 도 11h. IL-13, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0065; 도 11i. IL-15, GL261-AS-irr 대 GL261- irr p < .0013; 도 11j. M- CSF, GL261-AS-irr 대 PBS p = .007. 나타내지 않은 시험된 다른 것: IL-6, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0836; GM-CSF, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0854; lix, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0001; kc, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0112; TNF-a, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0082; VEGF, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p <.0004; lif, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0140; IL-7, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0038; IL-12(p70) GL261-AS-irr 대 GL261-irr p < .0120; IFN-γ, GL261-AS-irr 대 GL261-irr p <.0290.
도 12는 IGF-1R AS ODN에 의한 2개의 정상 대상체(암 및 명)로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PMC)의 수지상 세포(DC) 활성화에 대한 적정 곡선을 도시한다; NOBEL 안티센스 750 μg 대 NOBEL 센스 75 μg, 7.5 μg, DWA 안티센스 750 μg, 7.5 μg, 대조군,***p < .0009; NOBEL 안티센스 75 μg 대 NOBEL 센스, DWA 안티센스 7.5 μg.
도 13a-13b는 백신접종된 마우스로부터 유래하는 T 세포를 사용하는 완전히 제형화된 챔버의 내용물로부터의 시험관내 T 세포 반응을 도시한다. 도 13a. 챔버로부터 회수된 항원으로 프라이밍된 DC로의 향염증 T 세포 반응; 항원 없음 대비 완전 제형에 대해 **p < .01; 엑소솜 대비 완전 제형에 대해 *p < .03; 도 13b. 챔버로부터 회수된 항원으로 펄싱된 DC로의 향염증 T 세포 반응; 항원 없음 대비 완전 제형에 대해 **p < .005; 엑소솜 대비 완전 제형에 대해 *p < .007.
도 14a-14d는 NOBEL 안티센스 용량 적정에 대한 이상 반응의 개략도이다.
도 15a-15b는 6명의 상이한 신경아교종 환자로부터 유래된 혈청으로부터의 밤샌 인큐베이션에 기인한 3명의 정상 대상체로부터의 동종이계 단핵구의 M2 분극화를 도시한다. 대조군은 혈청과 함께 인큐베이션되지 않았다. 1000배 희석 곡선은 100 pg의 NOBEL 안티센스로부터 1 μg에서의 상당한 녹다운까지 PDL-1(도 15a) 및 CD163(도 15b)을 공동발현하는 M2 대식세포의 감소를 나타내었다. 각각의 그래프에서의 선은 그랜드(grand) 평균이다. 1 μg의 NOBEL 대 비처리 ***p< .0002.
도 16은 외식된 백신 챔버 사이토카인 수준 대 외식된 PBS 대조군 챔버의 비교를 도시한다. ***p, .005; ***p < .01; ***p < .02; **p < .03; *p < .05.
도 17은 옆구리 신경아교종 종양 성장의 억제에 대한 전신적 IGF-1R AS-ODN의 이상 반응을 도시하는 용량-반응 곡선이다. 106개의 GL261 세포를 C57BL/6 마우스의 옆구리에 이식하고, 20일 후 순환 CD16 양성 세포가 전형적으로 관찰되기 기간 전에, 마우스에 단일 0.75 mg(네모) 또는 0.075 mg(세모) 용량의 NOBEL IGF-1R AS-ODN을 복강내로 주사하였다. 이어서, 마우스를 종양 발달에 대해 추적하였다. 백신접종되지 않은 마우스(동그라미)는 대조군으로 사용되었다.
도 18은 전신적 IGF-1R AS-ODN 처리가 순환하는 M2 단핵구의 축적을 억제하였음을 도시하는 유동 세포측정 데이터이다. 데이터는 CD163을 발현하는 세포 수의 히스토그램으로 표현되며(우측 피크), 여기서 "비히클" 표시된 하나의 라인은 PBS(비히클)로 처리된 종양-이식된 마우스를 나타내고 "AS-ODN" 표시된 다른 라인은 NOBEL IGF-1R AS-ODN로 처리된 이식된 마우스를 나타낸다. 이들 라인은 도에 주석이 달려 있다.
도 19는 옆구리에 신경아교종 세포가 이식되고 NOBEL IGF-1R AS-ODN 또는 PBS(비히클)로 처리된 마우스에서 종양 발생을 도시한다. 처리된 그룹과 비처리된 그룹 사이의 종양 발생률은 상당히 상이하였다(* = p < 0.05).
도 20은 옆구리에 신경아교종 세포가 이식되고 NOBEL IGF-1R AS-ODN으로 또는 없이 처리된 Tbet 결핍 마우스에서 종양 발생을 도시한다. 그룹들 사이의 종양 발생률은 상당히 상이하였다(* = p < 0.05).
도 21a, 21b 및 21c는 백신접종 후 시간 경과에 따라(수술 후 14-42일) 일련의 혈액 채혈로부터 수집된 환자 혈청에서 향염증 사이토카인 수준(pg/ml)을 도시한다. 향염증 사이토카인의 상당한 용량 의존적 증가가 환자 혈청에서 관찰되었다. 도 21d, 21e 및 21f는 종양 조직의 습윤 중량 수율과 대상체에 의한 사이토카인 수율 사이의 관계(다항식 최적 피트)를 도시한다. 처리 후 세포가 20개 챔버에 분포될 때 3 그램의 습윤 중량 수율의 조직이 가장 높은 사이토카인 수율을 생성하였다.
도 22는 대표적인 완전히 제형화된 바이오확산 챔버의 개략도이다. 챔버가 환자에게 이식될 때, 안티센스 분자 및 종양 항원은 챔버의 다공성 막을 통해 확산되어, 종양-특이적 면역 반응, 감소된 M2 분극화 및 M2+ 세포수의 감소를 이끈다.
도 23은 대표적인 면역화 방법의 개략도이다. 환자가 제1 라운드의 백신접종에 적절하게 반응하지 않는 경우, 절차는 임의적으로 필요에 따라 때때로 다른 치료와 병행하여 여러번 반복된다.
도 24a 및 25b는 뇌 종양을 갖는 인간 환자에서 치료 의향 그룹(N=30)에서 각각 중앙값 무진행 생존(P-FS) 및 중앙값 전체 생존(OS)을 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선이다. (중간 분석은 상기 도 9에 도시되어 있다.) 백신접종된" 집단은 이식되는 20개의 챔버로 처리되고, 각각의 챔버는 2 μg NOBEL을 함유한다. "SoC" 집단은 과거 데이터를 사용하여 표시된다(N=76). 데이터는 전체적으로 암의 진행 없이 실질적으로 증가된 생존을 나타낸다.
도 25a 및 25b는 백신접종 그룹 및 표준 치료(SoC) 그룹 각각에서 동일한 성별 및 중앙값 나이를 비교하는 무진행 생존 및 전체 생존을 나타내는 카플란-마이어 곡선이다. 데이터는 전체적으로 암의 진행 없이 실질적으로 증가된 생존을 나타낸다.
도 26a 및 26b는 치료에서 탈퇴하고 다른 원인으로 사망한 5명의 환자를 제외했을 때의 무진행 생존 및 전체 생존을 나타내는 카플란-마이어 곡선이다.
도 27a 및 27b는 표준 치료(SOC) 프로토콜을 완료하지 않은 9명의 환자를 제외했을 때의 무진행 생존 및 전체 생존을 나타내는 카플란-마이어 곡선이다.
도 28a, 28b, 28c, 28d는 높은 백신 코호트에서의 세포 수율에 기초하여 유도된 IFN-γ 반응을 도시한다. 데이터는 챔버 내 세포수에 기초하는 최적 IFN-γ 방출을 나타낸다. 도 28a 및 28b에 대해, 세포 수율은 수백만개의 세포로 도시된다. IFN-γ는 평균 형광 강도(MFI)로 도시된다. 이들 데이터는 각각의 챔버가 2 μg의 NOBEL를 함유하는 20-챔버 코호트부터의 것이다. 데이터는 다항식 피트(입방체)로 제시된다. 도 28c 및 20db는 각각 최대 20,000,000개 세포까지의 세포수 수율 대 평균 및 피크 IFNγ 반응 사이의 실질적인 선형 관계를 나타내는 도 28a 및 b의 데이터를 추출한 것이다. 여기에서 데이터는 pg/ml로 제시된다.
도 29a, 29b 및 29c는 캡슐화 전 IGF-1R 안티센스 사전 인큐베이션과 관련하여 챔버 제형에 대한 IFN-γ T 세포 반응을 도시한다. 도 29a는 종양 항원에 대한 T-세포 반응을 평가하기 위한 프로토콜을 도시한다. 도 29b의 경우, 항원은 생체내 임상 챔버 피려다임에 따라 제조되었다. 약 1,000,000개의 생체외 GL261 종양 세포를 챔버에 단독으로 또는 지시된 안티센스 농도와 함께 주사하고, 밤새 PBS에 둔 챔버에서 인큐베이션하였다. 다음날, 챔버 내용물을 추출하고, 나이브 수지상 세포를 펄싱하는 데 사용하였다. 안티센스로 밤새 처리되지 않은 챔버 내용물을 지시된 양의 NOBEL과 함께 수지상 세포에 첨가하였다. 수지상 세포를 또한 대조를 위해 나이브하게 두었다. 항원으로 밤새 펄싱한 후, 수지상 세포를 수집하고, 사이토카인 IFNγ에 대한 ELIPSPOT 검출 항체로 코팅된 세포 배양 플레이트에서 면역화된 동물로부터의 T 세포와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 코팅된 플레이트를 처리하고 전개시켜 각각의 개별 항원에 대해 반응된 IFNγ-생성 T-세포의 수를 열거하였다. 도 29b의 데이터는 종양 항원은 GL261 세포 + 안티센스를 함유하는 챔버로부터 회수된 물질에서는 검출되었으나, 세포 단독으로 배양된 챔버로부터의 물질에서는 비록 안티센스가 수지상 세포(DC)가 펄싱될 때 물질에 첨가되더라도 검출되지 않았음을 나타낸다. 데이터는 챔버에서 신경아교종 세포와 함께 안티센스가 면역자극 종양 항원을 생성하는 데 필요하다는 것을 나타낸다. 도 29c의 경우, GL261 세포를 페트리 접시에 플레이팅하고, 4 mg NOBEL/1,000,000개 세포와 함께 밤새 처리하거나 처리하지 않은 채로 두었다. 이어서, 세포를 수집하고, 1,000,000개 세포 및 2μg NOBEL/챔버로 챔버에 배치하였다. 이어서, 챔버를 밤새 PBS 중에서 인큐베이션하고, 다음날 내용물을 추출하였다. 이어서, 수지상 세포를 챔버 내용물로 펄싱하고, IFNγ 분비를 상술된 바와 같이 측정하였다. 데이터는, 안티센스와 함께 GL261 세포의 밤샌 처리가, IFNγ를 생성하는 종양-면역 T 세포수의 증가로 검출되는 바와 같이, 이들 세포에 의해 생성되는 항원의 양을 증진시킨다는 것을 나타낸다.
도 30a, 30b, 30c 및 30d는 마우스 모델에서 효능에 대한 네스틴 발현의 영향 수준을 도시한다. 도 30a는 높은 네스틴 수준이 IGF-1R 안티센스 처리 후 개선된 생존과 연관된다는 것을 나타낸다. 마우스의 옆구리에 높은 또는 낮은 네스틴 단백질 수준을 발현하는 GL261 세포 및 4 mg 안티센스를 함유하는 챔버를 이식하였다. 대조군은 안티센스 첨가 없이 높은 네스틴 발현 세포만 수령하였다. 챔버를 옆구리에 24시간 두었다. 이어서, 면역 반응을 수 주 동안 발생시키고, 챔버 이식 후 35일째에 마우스를 두개내로 챌린지하였다. 면역화된 마우스 및 비면역 대조군을 챌린지 후 생존에 대해 모니터링하였다. 도 30b는 높은 네스틴 수준이 더 우수한 임상 질환 스코어와 연관된다는 것을 나타낸다. 데이터는 치료 코호트에 의해 완전히 제형화된 챔버로 백신접종 후 정위 모델에서 뇌 종양 진행과 관련된 점수화된 이환율을 나타낸다. 도 30c 및 도 30d는 높은 네스틴 발현 수준과 연관된 GL261 세포에 대한 항체의 증가된 생성을 나타낸다. 도 30c는, 실험 마우스로부터의 혈청으로, GL261 세포에 대한 항체 반응성에 대해 시험된, 챔버 후 28일/두개내 이식 전 세포 ELISA 검정을 나타내며; 혈청을 마우스로부터 채혈된 전혈로부터 단리하였다. 혈청을 ELISA 검정으로 GL261 세포에 대한 전체 IgG 반응성에 대해 시험하였다. 도 30d는, 실험 마우스로부터의 혈청을 사용하여, GL261 세포에 대한 항체 반응성에 대해 시험된, 두개내 챌린지 후 35일/챔버 외식 후 71일로부터의 세포 ELISA 데이터를 나타낸다.
정의
본원에서 정의되지 않은 모든 용어는 그들의 일반적인 당업계 인식 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수형태의 용어는 문맥 상 명백하게 달리 요구하지 않는 한 단수 및 복수의 지시 대상체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 숫자 값 앞에 있는 경우, 값 플러스 또는 마이너스 10% 범위를 나타낸다. "약 100"은 90과 110을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가"는 동일한 개체로부터 입수한 세포 또는 조직을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자가 암 세포 백신"은 개체로부터 종양 세포를 단리하고 이들 종양 세포를 생체 외에서 처리함으로써 부분적으로 생성되는 치료제를 지칭한다. 이어서, 세포는 종양 세포가 단리된 개체로 재투여된다. 실시양태에서, 자가 암 세포 백신은 종양 세포 이외에 추가의 성분, 예컨대 버퍼 및/또는 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. 실시양태에서, "자가 암 세포 백신"은 종양 세포 및 하나 이상의 추가의 성분을 함유하는 바이오확산 챔버를 지칭할 수 있다. 특정 측면에서, "자가 암 세포 백신"은 본원에서 "완전히 제형화된 바이오확산 챔버"로도 지칭되는 "완전히 제형화된 챔버"일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "완전히 제형화된" 또는 "완전히 제형화된 바이오확산 챔버"는, 챔버에 캠슐화 전에 제1 양의 IGF-1R AS ODN으로 처리되거나 처리되지 않을 수 있는, 자가 종양 세포 및 종양 미세환경(TME)에 포함되는 다른 세포를 포함하는 바이오확산 챔버이다. 세포는 제2 양의, 예컨대 적어도 2 μg의 IGF-1R AS ODN의 외인성 첨가와 함께 캡슐화되고, 이어서 5 Gy의 감마-방사선으로 조사된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소분자"는 핵산, 펩티드, 단백질 및 다른 화학 물질(예컨대, 세포에 의해 생성되는 사이토카인 및 성장 호르몬)은 포함하지만, 세포, 엑소솜 또는 미세소포는 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "IGF-1R 발현을 표적하는"또는 "IGF-1R 발현을 표적한다"는 IGF-1R에 결합하도록 디자인된 서열을 갖는 안티센스 핵산을 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전신 투여"는 대상체의 신체 전반을 통해 물질의 전달을 달성하는 것을 지칭한다. 전형적인 전신 투여 경로는 비경구 투여, 경피 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여 및 근육내 투여를 포함한다.
다른 투여 경로는 경구 투여, 비강 투여, 국소 투여, 안내 투여, 협측 투여, 설하 투여, 질 투여, 간내 투여, 심장내 투여, 췌장내 투여, 흡입에 의한 투여 및 이식 펌프를 통한 투여를 포함한다.
안티센스 분자
안티센스 분자는 왓슨(Watson) 및 크릭(Crick) 염기쌍 규칙에 의해 mRNA의 표적된 상보적 서열에 결합함으로써 작용하는 핵산이다. 표적 mRNA의 해독은 하이브리드화가 상보적 나선들 사이에 발생하는 경우 능동적 및/또는 수동적 메카니즘에 의해 억제된다. 수동적 메카니즘에서, mRNA와 외인성 뉴클레오티드 서열 사이의 하이브리드화는 리보좀 복합체가 메시지를 판독하는 것을 방지하는 듀플렉스 형성을 이끈다. 능동적 메카니즘에서, 하이브리드화는 RnaseH의 결합을 촉진하여 RNA는 파괴하나 안티센스는 또 다른 상보적 mRNA 표적과 하이브리드화하도록 그대로 둔다. 메카니즘 중 어느 하나 또는 둘 다는 악성 표현형에 기여하거나 이를 지탱하는 단백질의 해독을 억제한다. 치료제로서, 안티센스 분자는 훨씬 더 선택적이고, 그 결과 기존 약물보다 더 효과적이고 덜 독성적이다.
본원에 개시된 방법 및 조성물은 암을 치료하기 위해 안티센스 분자의 사용을 수반한다. 전형적으로, 안티센스 분자는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(AS-ODN)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 분자는 변형된 포스페이트 백본을 포함한다. 특정 측면에서, 포스페이트 백본 변형은 안티센스를 뉴클레아제 분해에 더 내성이도록 한다. 특정 실시양태에서, 변형은 록킹된 안티센스이다. 다른 실시양태에서, 변형은 포스포로티오에이트 연결이다. 특정 측면에서, 안티센스는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결을 함유한다. 특정 실시양태에서, 포스포로티오에이트 연결은 뉴클레아제 내성을 부여하여 이의 반감기를 증가시킴으로써 안티센스 분자를 안정화시킨다. 일부 실시양태에서, 안티센스는 부분적으로 포스포로티오에이트-연결될 수 있다. 예컨대, 최대 약 1%, 최대 약 3%, 최대 약 5%, 최대 약 10%, 최대 약 20%, 최대 약 30%, 최대 약 40%, 최대 약 50% 최대 약 60%, 최대 약 70%, 최대 약 80%, 최대 약 90%, 최대 약 95% 또는 최대 약 99%의 안티센스가 포스포로티오에이트-연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스는 완전히 포스포로티오에이트-연결된다. 다른 실시양태에서, 포스포로티오에이트 연결이 포스포디에스테르 연결과 교대할 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스는 적어도 하나의 말단 포스포로티오에이트 모노포스페이트를 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 분자는 하나 이상의 CpG 모티프를 포함한다. 다른 실시양태에서, 안티센스 분자는 CpG 모티프를 포함하지 않는다. 특정 측면에서, 하나 이상의 CpG 모티프는 메틸화된다. 다른 측면에서, 하나 이상의 CpG 모티프는 메틸화되지 않는다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG 모티프는 안티센스 분자가 대상체에 투여되는 경우 선천적 면역 반응을 유도한다. 일부 측면에서, 선천적 면역 반응은 메틸화되지 않은 CpG-함유 안티센스 분자가 Toll 유사 수용체(TLR)에 결합함으로써 매개된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 분자는 적어도 하나의 말단 변형 또는 "캡"을 포함한다. 캡은 5' 및/또는 3'-캡 구조일 수 있다. 용어 "캡" 또는 "말단-캡"은 (말단 리보뉴클레오티드와 관련하여) 올리고뉴클레오티드의 어느 한 말단에서의 화학적 변형을 포함하고, 5' 말단의 마지막 2개의 뉴클레오티드와 3' 말단의 마지막 2개의 뉴클레오티드 사이의 연결에서의 변형을 포함한다. 캡 구조는 표적 서열 또는 세포 조직과의 분자 상호작용을 손상시키지 않으면서 엑소뉴클레아제에 대한 안티센스 분자의 내성을 증가시킬 수 있다. 이러한 변형은 시험관내 또는 생체내에서 그들의 증가된 효능에 기초하여 선택될 수 있다. 캡은 5'-말단(5'-캡)에 또는 3'-말단('-캡)에 존재할 수 있거나 양쪽 말단에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 5'- 및/또는 3'-캡은 독립적으로 포스포로티오에이트 모노포스페이트, 어베이직(abasic) 잔기(모이어티), 포스포로티오에이트 연결, 4'-티오 뉴클레오티드, 카보사이클릭 뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트 연결, 역( inverted) 뉴클레오티드 또는 역 어베이직 모이어티(2'-3' 또는 3'-3'), 포스포로디티오에이트 모노포스페이트 및 메틸포스포네이트 모이어티로부터 선택된다. 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결(들)은 캡 구조의 일부인 경우 일반적으로 5' 말단의 2개의 말단 뉴클레오티드와 3' 말단의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이에 위치된다.
비람직한 실시양태에서, 안티센스 분자는 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1R)의 발현을 표적한다. IGF-1R는 인슐린 수용체와 70% 상동성을 공유하는 티로신 키나제 세포 표면 수용체이다. 이의 리간드(IGF-I, IGF-II 및 인슐린)에 의해 활성화되는 경우, 이는 증식, 전환 및 세포 생존을 포함하는 광범위한 세포 기능을 조절한다. IGF-1R은 정상적인 성장을 위한 절대적인 요건은 아니나, 악성 조직에서 발생할 수 있는 앵커리지 독립적 조건에서의 성장에 필수적이다. 종양에서 IGF-1R의 역할에 대한 검토가 문헌(Baserga et al., Vitamins and Hormones, 53:65-98 (1997), 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 제공된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 분자는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체, 예컨대 IGF-1R의 DNA 또는 RNA에 대해 지시되는 올리고뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 안티센스는 IGF-1R에 대해 지시되는 데옥시뉴클레오티드이다(IGF-1R AS ODN). IGF-1R의 전장 코딩 서열은 서열번호 19로 제공된다(예컨대, 그 전체가 참조로 본원에 포함되는 PCT/US2016/26970을 참조한다).
특정 실시양태에서, 안티센스 분자는 RNA 또는 DNA를 포함하는 IGF-1R 신호 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. IGF-1R의 신호 서열은 30개 아미노산 서열이다. 다른 실시양태에서, 안티센스 분자는 RNA 또는 DNA를 포함하는 IGF-1R 신호 서열의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 안티센스 분자는 RNA 또는 DNA를 포함하는 IGF-1R의 코돈 1-309에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 안티센스 분자는 RNA 또는 DNA를 포함하는 IGF-1R의 코돈 1-309의 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 적어도 약 5개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 15개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 25개 뉴클레오티드, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 적어도 약 35개 뉴클레오티드, 적어도 약 40개 뉴클레오티드, 적어도 약 45개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 50개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 22개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 측면에서, IGF-1R AS ODN은 약 18개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 18℃에서는 2차 구조를 형성하나 약 37℃에서는 2차 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 약 18℃에서 또는 약 37℃에서 2차 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 어떠한 온도에서도 2차 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 37℃에서 2차 구조를 형성하지 않는다. 특정 실시양태에서, 2차 구조는 헤어핀 루프 구조이다.
일부 측면에서, IGF-1R AS ODN은 서열번호 1의 뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 서열번호 1 또는 이의 단편에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98% 또는 100% 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결을 포함한다.
특정 측면에서, IGF-1R AS ODN은 서열번호 1로 이루어진다. NOBEL은 포스포로티오에이트 백본을 갖는 18-mer 올리고데옥시뉴클레오티드이고, IGF-1R 유전자의 코돈 2 내지 7에 상보적인 서열이다. 따라서, NOBEL은 IGF-1R에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오티드(IGF-1R AS ODN)이다. 5' 말단에서 IGF-1R 유전자의 상보적 서열로서 유도되는 NOBEL 서열은 하기와 같다:
5' -TCCTCCGGAGCCAGACTT- 3'.
NOBEL은 안정한 저장 수명을 가지며, 이의 포스포로티오에이트 백본으로 인해 뉴클레아제 분해에 내성이다. NOBEL의 투여는 당업자에게 공지된 올리고데옥시뉴클레오티드의 도입과 연관된 임의의 표준 방법으로 제공될 수 있다. 유리하게는, NOBEL을 포함하는 본원에 개시된 AS ODN은 독성이 거의 없이/전혀 없이 투여될 수 있다. 마우스 시험(꼬리 정맥으로 40 μg)에 기초하여 약 2g/kg(스케일링됨)의 수준에서도 독성 문제를 나타내지 않았다. NOBEL은 당업자에게 공지된 통상적인 절차에 따라 제조될 수 있다.
안티센스 분자, 예컨대 서열번호 1의 NOBEL 서열은 또한 미국 특허 번호 9,744,187(그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 하나 이상의 p-에톡시 백본 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안티센스 분자의 핵산 백본은 적어도 하나의 p-에톡시 백본 연결을 포함한다. 예컨대, 최대 약 1%, 최대 약 3%, 최대 약 5%, 최대 약 10%, 최대 약 20%, 최대 약 30%, 최대 약 40%, 최대 약 50% 최대 약 60%, 최대 약 70%, 최대 약 80%, 최대 약 90%, 최대 약 95% 또는 최대 약 99%의 안티센스 분자가 p-에톡시-연결될 수 있다. 연결의 나머지는 포스포디에스테르 연결 또는 포스포로티오에이트 연결 또는 이의 조합일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드에서 50% 내지 80%의 포스페이트 백본 연결은 p-에톡시 백본 연결이며, 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드에서 20% 내지 50%의 포스페이트 백본 연결은 포스포디에스테르 백본 연결이다.
다양한 IGF-1R 안티센스 서열은 NOBEL 서열의 다중-양상 효과 중 일부 또는 전체에서 생물활성이다. 18-mer NOBEL 서열은 IGF-1R 수용체 하향조절 활성 및 TLR 작용제 활성 둘 다를 가지며, 마우스에서 추가의 실험은, 두 활성 모두가 생체내 항종양 면역 활성에 필요하다는 것을 제시한다. AS ODN 분자는 항종양 활성을 갖는 반면, 상보적 센스 서열은 CpG 모티프를 또한 가짐에도 불구하고 그렇지 않다.
특정 실시양태에서, 안티센스의 서열은 표 1에 나타낸 바와 같은 서열번호 1-14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 안티센스는 서열번호 1-14 중 하나 이상에 대해 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스는 서열번호 1-14 중 하나 이상에 대해 80% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스는 서열번호 1-14 중 하나 이상에 대해 70% 서열 동일성을 갖는다.
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특정 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 서열번호 1-14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 서열번호 1-14 중 어느 하나 또는 이의 단편에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98% 또는 100% 동일성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 안티센스 분자는 세포에서 IGF-1R 경로의 다운스트림에 있는 유전자의 발현을 하향조절한다. 특정 측면에서, 다운스트림 유전자는 헥소키나제(Hex II)이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 분자는 세포에서 하우스키핑 유전자의 발현을 하향조절한다. 일부 측면에서, 하우스키핑 유전자는 L13이다.
특정 측면에서, IGF-1R AS ODN은 화학적으로 합성된다. 특정 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 고체상 유기 합성에 의해 제조된다. 일부 측면에서, IGF-1R AS ODN의 합성은 플로우 쓰루(flow-through) 기술을 이용하여 밀폐된 화학적 컬럼 반응기가 장착된 합성기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체 상의 각각의 합성 사이클 순서는 다수의 단계로 이루어지며, 이는 전장 IGF-1R AS ODN이 얻어질 때까지 순차적으로 수행된다. 특정 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 액체 형태로 저장된다. 다른 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 저장 전 동결건조된다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 IGF-1R AS ODN은 사용 전 물에 용해된다. 다른 실시양태에서, 동결건조된 IGF-1R AS ODN은 사용 전 유기 용매에 용해된다. 다른 실시양태에서, 동결건조된 IGF-1R AS ODN은 약제학적 조성물로 제형화된다. 일부 측면에서, 약제학적 조성물은 액상 약제학적 조성물이다. 다른 측면에서, 약제학적 조성물은 고형 약제학적 조성물이다. 추가의 안티센스 핵산은 또한 미국 공개 번호 2017/0056430(그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
자가 암 세포 백신
도입
면역요법은 현재 하나의 공통된 세포 항원으로 혈액 악성을 표적하는 데 사용된다. 불행하게도, 고형 종양은 훨씬 더 복잡하며, 식별할 수 없는 수의 종양-특이적 표적을 갖는 악성 상태로의 유전적 변화의 후성적 진행을 나타낸다. 더욱 도전적인 것으로서, WHO 진단 암 그룹 내에서 종양 표현형에 대한 현저한 변형이 존재한다. 자가 세포 백신은 모든 이러한 변형 및 모든 이러한 표적을 포함하고 고형 종양 암에 대한 이상적인 대상체-특이적 면역요법을 나타낸다. 그러나, 자가 암 세포 백신은 일련의 계대가 종양 표현형을 변경시켜 종양-특이적 항원의 어레이를 감소시키므로 일차 세포 배양물로부터는 유도될 수 없다. 이는 또한 각각의 계대에서 불가능한 로트-방출 정성화를 필요로 할 것이다. 본 개시는, 도 22에 도시되는 바와 같이, 새로 절제된 세절된 종양 세포를 플레이팅하고 이를 24시간 내에 데포(depot) 항원으로서 재이식함으로써 이들 우려를 제거한다. 특정 측면에서, 본원에서 달성되는 우수한 결과는 본원에 기술된 다른 특정 사항 중에서 적합한 수의 세포가 챔버(들)에 존재하게 하는 것을 보장함으로써 얻어진다.
이전의 연구는 자가 종양 세포 대신에 항원 제시 세포의 사용을 통해 자가 세포 백신을 디자인하였다. 이 패러다임에서, 대상체의 단핵구는 처리 전(pre-treatment) 혈장 백혈구분반술로부터 수집되고 생체외에서 자가 수지상 세포(DC)로 분화된다. 이어서, 수지상 세포는 DC 활성화/성숙을 유도하는 대상체의 종양 조 용해물과 함께 제시되고, 이후 시점에서 종양 항원으로 교차-프라이밍되는 성숙된 수지상 세포가 DC 백신으로서 대상체에 주사된다. 그러나, 생체외 분화는 단지 생체내에서만 발생하는 다수의 주요 자극 성분을 놓친다. 또한, 혈액 전구체로부터 DC의 분화는 고가의 설비에서 노동 집약적인 세포 처리와 함께 광범위한 시험관내 조작을 필요로 한다. 본 개시는 내인성 DC 성숙 과정 및 적절한 면역 반응의 발달을 촉진하는 면역조절 및 면역자극 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(AS-ODN)를 제공함으로써 이들 우려를 제거한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 치료학적 유효 시간 동안 환자에게 이식되는, 환자로부터 유래되는 분산된 종양 세포 및 조사된 안티센스 분자를 포함하는 바이오확산 챔버를 제공한다. 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 조사된 종양 세포, 안티센스 및 바이오확산 챔버의 조합은 국소 면역 반응을 자극하고 M2 세포를 감소 또는 제거시키고 면역계의 악화를 방지함으로써 반응을 증진시키도록 함께 작용하는 것으로 생각된다.
따라서, 본 개시는 새로 절제된 종양 세포 및 IGF-1R AS ODN을 포함하는 조사된 이식 가능한 바이오 확산 챔버가 암 면역요법을 위한 효과적인 대상체-특이적 자가 세포 백신으로서 안전하게 작용한다는 것을 나타낸다. 따라서, 대상체에서 종양 세포를 선택적으로 표적하는 면역 반응을 장착하기 위해 청구된 이식 가능한 바이오확산 챔버의 사용은 암, 특히 GBM을 치료하기 위한 새롭고 중요한 접근법을 제공한다.
바이오확산 챔버
대표적인 확산 챔버는 2개의 단부인 제1 단부 및 제2 단부를 갖는 챔버 배럴을 포함한다. 실시양태에서, 바이오확산 챔버는 다공성의 세포-불투과성 막, 예컨대 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation)에 의해 제조된 듀로포어(Duropore) 막에 의해 어느 한 측면이 캡핑된 작은 고리이다. 임의적으로, 단부 중 하나는 다공성 막을 사용하여 밀봉하기 위해 하나의 단부만을 열어둔 채 챔버 바디의 일부로서 닫힐 수 있다. 막은 강하고 유연하며 화학적 처리를 견딜 수 있는 플라스틱, 테플론, 폴리에스테르 또는 임의의 불활성 물질로 제조될 수 있다. 챔버는 임의의 물질, 예컨대, 이로 제한됨이 없이, 플라스틱, 테플론, 루사이트, 티타늄, 플렉시글래스 또는 인간에게 무독성이고 잘 용인되는 임의의 불활성 물질로 제조될 수 있다. 또한, 챔버는 멸균을 견뎌낼 수 있어야 한다. 일부 측면에서, 확산 챔버는 사용 전에 에틸렌 옥사이드로 멸균된다. 다른 적합한 챔버는 미국 가출원 번호 62/621,295(2018년 1월 24일 출원), 미국 특허 번호 6,541,036, PCT/US16/26970 및 미국 특허 번호 5,714,170(그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 막은 소분자의 통과는 허용하나 세포는 통과시키지 않는다(즉, 세포는 챔버를 떠나거나 들어갈 수 없다). 일부 측면에서, 막의 세공의 직경은 핵산 및 다른 화학물질(예컨대, 세포에 의해 생성되는 사이토카인)은 챔버 외부로의 확산을 가능하게 하지만, 챔버와 챔버가 이식되는 대상체 사이의 세포의 통과는 허용하지 않는다. 본 개시에 유용한 바이오확산 챔버는, 챔버가 챔버와 대상체 사이의 인자의 교환 및 통과를 허용한다면, 챔버와 챔버가 이식되는 대상체 사이의 세포의 통과를 허용하지 않는 어떠한 챔버도 포함한다. 따라서, 특정 측면에서, 세공 크기는 챔버 내외로 부피가 100 μm3 초과인 물질의 통과를 막는 컷-오프를 갖는다. 일부 실시양태에서, 막의 세공은 약 0.25 μm 또는 그 보다 작은 직경을 갖는다. 예컨대, 세공은 약 0.1 μm의 직경을 가질 수 있다(도 1을 참조한다). 특정 측면에서, 세공은 직경 0.1 μm 내지 0.25 μm의 범위이다. 문헌(Lange, et al., J. Immunol., 1994, 153, 205-211 and Lanza, et al., Transplantation, 1994, 57, 1371-1375, 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)을 또한 참조한다. 이 세공 직경은 챔버 내로 또는 챔버 외부로 세포의 통과를 방지한다. 특정 실시양태에서, 확산 챔버는 0.1 μm 세공-크기 친수성 듀라포어 막(Millipore, Bedford, Mass.)을 갖는 14 mm 루사이트 고리로 구성된다.
특정 실시양태에서, 바이오확산 챔버는 IGF-1R AS ODN이 챔버 외부로 확산하는 것을 가능하게 하는 막을 포함한다. 일부 실시양태에서, IGF-1R AS ODN의 약 50%가 약 12시간 내에 챔버의 외부로 확산하고, IGF-1R AS ODN의 약 60%가 약 24시간 내에 챔버의 외부로 확산하고, IGF-1R AS ODN의 약 80%가 약 48시간 내에 챔버의 외부로 확산하고, 및/또는 IGF-1R AS ODN의 약 100%가 약 50시간 내에 챔버의 외부로 확산한다.
예시적인 접근법에서, 바이오확산 챔버를 어셈블링하기 위해, 제1 다공성 막은 접착제 및 압력을 사용하여 제1 확산 챔버의 일측에 부착되어 단단한 밀봉을 생성한다. 제2 다공성 막은 제2 확산 챔버 고리에 유사하게 부착된다. 막은 더 단단한 밀봉을 제공할 수 있는 고무 개스킷으로 제자리에서 고정될 수 있다. 확산 챔버 고리는 밤새(최소 8시간) 방치하여 건조시킨다. 이어서, 제1 확산 챔버 고리 및 제2 확산 챔버 고리를 접착제를 사용하여 서로 부착하고 밤새(최소 8시간) 방치하여 건조시킨다. 바람직한 실시양태에서, 제1 챔버 고리 및 제2 챔버 고리 연결 공정은 2 디클로로에탄을 용매로서 사용하여 2개의 고리 사이의 부착을 촉진시키는 것을 포함한다. 예컨대, 2개의 다공성 막을 도시하는 도 22를 도시한다. 대안적 접근법에서, 챔버는 다공성 막을 함유하는 단지 일측만을 가질 수 있다.
챔버의 배럴 부분에는, 일단 챔버가 이식되면 대상체의 신체의 외부로부터 접근되는 캡에 의해 커버될 수 있는 하나 이상의 개구(예: 포트)가 제공되어, 확산 챔버가 재충전될 수 있게 한다. 개구는 오염 없이 대상체를 손상시키지 않으면서 내용물의 다수의 순차적인 샘플링을 가능하게 하여, 대상체에 수행되는 이식 절차의 수를 상당히 감소시킨다. 환자에 이식하기 전, 하나 이상의 개구는 본 왁스, 예컨대 PMMA로부터 제조되는 포트 플러그 또는 캡으로 밀봉될 수 있다. 캡은 나사식 자동-밀봉 고무일 수 있으며 개구에 장착될 수 있다. 일부 구성에서, 확산 챔버는 2개 이상의 주입 개구 또는 포트를 함유할 수 있다. 챔버 내용물의 샘플링은 대상체 신체 외부의 캡을 제거하고 일반적인 바늘 및 주사기를 삽입하여 개구에 접근함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 챔버는 제거 디바이스를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 디바이스는 환자로부터 챔버의 제거를 용이하게 한다.
실시양태에서, 챔버는 종양 항원이 치료적 숙주 면역 반응을 촉진하기 위해 챔버 외부로 확산되도록 디자인된 항원 데포로서 작용한다. 외인성 IGF-1R AS ODN 및 생체외 조사는 향염증 반응을 촉진한다. 이 제형은 임상적 및 방사선촬영적 개선, 프로토콜에서 연장된 생존과 연관되며, 종양 면역 효과를 유도 또는 증진시키는 것으로 해석되는 외인성 활성 약제학적 성분(API) 및 방사선을 포함하는 신규 자가 세포 백신을 나타낸다. 또한, 낮은 농도의 IGF-1R AS ODN의 첨가는 향염증 반응에 중요하다(도 12).
특정 실시양태에서, 본 개시는 (a) 종양 세포; 및 (b) 유효량의 안티센스 분자를 포함하는 암을 앓는 대상체로 이식하기 위한 바이오확산 챔버를 제공한다. 다른 실시양태에서, (a) 종양 세포 및 유효량의 안티센스 핵산을 포함하는 바이오확산 챔버를 얻는 단계; (b) 바이오확산 챔버 및 내용물을 조사하는 단계; 및 (c) 조사된 바이오확산 챔버를 치료학적 유효 시간 동안 대상체로 이식하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
특정 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 바이오확산 챔버에 약 0.5 μg 내지 약 10 μg의 양으로 존재한다. 특정 측면에서, IGF-1R AS ODN은 약 1 μg 내지 약 5 μg/챔버 또는 약 2 μg 내지 4 μg/챔버 범위의 양으로 존재한다. 구체적인 측면에서, IGF-1R AS ODN은 약 2 μg/챔버의 양으로 존재한다. 구체적인 측면에서, IGF-1R AS ODN은 약 4 μg/챔버의 양으로 존재한다. 이론에 구애됨이 없이, 이들 수준은 대상체에서 M2 면역자극 반응을 피하면서 대상체에서 증진된 Th1 반응을 촉진하는 것으로 생각된다.
특정 실시양태에서, 종양 세포는 챔버에 캡슐화하기 전 IGF-1R AS ODN으로 처리되지 않는다. 그러나, 전형적으로, 종양 세포는 챔버에 캡슐화하기 전 IGF-1R AS ODN로 처리된다. 세포를 캡슐화전(pre-encapsulation) 처리하기 위한 시간은 다양할 수 있다. 예컨대, 종양 세포는 캡슐화하기 직전 최대 약 4시간 동안, 최대 약 6시간 동안, 최대 약 8시간 동안, 최대 약 12시간 동안 또는 최대 약 18시간 동안 생체외에서 처리될 수 있다. 전형적으로, 종양 조직은 생체외에서 약 12시간 내지 약 18시간 동안 캡슐화전 처리될 수 있다. 편리하게, 세포는 최대 밤새 지속되는 전처리 후 캡슐화될 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 캡슐화전 처리는 종양 항원의 생성을 자극하는 데 있어 바람직한 역할을 하는 것으로 생각된다.
캡슐화전 처리에 사용되는 IGF-1R AS ODN의 양은 약 1 mg 내지 8 mg/1,000,000개 세포, 예컨대, 약 2 mg 내지 약 6 mg/1,000,000개 세포, 약 3 mg 내지 약 5 mg/1,000,000개 세포의 범위일 수 있다. 전형적으로, 캡슐화전 처리에 사용되는 IGF-1R AS ODN의 양은 약 4 mg/1,000,000개 세포이다.
일부 실시양태에서, 종양 세포의 생체외 처리를 위한 IGF-1R AS ODN은 약 적어도 2 mg/ml 내지 적어도 약 5 mg/ml 범위의 양으로 사용된다. 특정 측면에서, IGF-1R AS ODN은 적어도 4 mg/ml의 농도로 사용된다. 구체적인 실시양태에서, IGF-1R AS ODN은 4 mg/ml의 농도로 사용된다.
특정 실시양태에서, 종양 세포를 생체외에서 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN 및 챔버에 존재하는 IGF-1R AS ODN은 동일하다. 다른 실시양태에서, 종양 세포를 생체외에서 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN 및 챔버에 존재하는 IGF-1R AS ODN은 상이하다. 특정 실시양태에서, 종양 세포를 생체외에서 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 적어도 약 5개 뉴클레오티드, 적어도 약 10개 뉴클레오티드, 적어도 약 15개 뉴클레오티드, 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 25개 뉴클레오티드, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 적어도 약 35개 뉴클레오티드, 적어도 약 40개 뉴클레오티드, 적어도 약 45개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 50개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 종양 세포를 생체외에서 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 22개 뉴클레오티드 길이이다. 특정 측면에서, 종양 세포를 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 약 18개 뉴클레오티드 길이이다.
특정 실시양태에서, 종양 세포를 생체외에서 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 18℃에서는 2차 구조를 형성하나 약 37℃는 2차 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시양태에서, 종양 세포를 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 약 18℃에서 또는 약 37℃에서 2차 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시양태에서, 종양 세포를 생체외에서 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 어떠한 온도에서도 2차 구조를 형성하지 않는다. 다른 실시양태에서, 종양 세포를 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 37℃에서 2차 구조를 형성하지 않는다. 특정 실시양태에서, 2차 구조는 헤어핀 루프 구조이다.
일부 측면에서, 종양 세포를 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 서열번호 1의 뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 세포를 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 서열번호 1 또는 이의 단편에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 98% 또는 100% 동일성을 가질 수 있다. 특정 측면에서, 종양 세포를 처리하기 위해 사용되는 IGF-1R AS ODN은 서열번호 1이다.
종양 세포를 일정 기간 동안 AS-ODN으로 처리한 후, AS-ODN은 제거되며 새로운 AS-ODN이 챔버에 첨가되고, 이어서 대상체로 이식 전에 조사된다. 특정 측면에서, 바이오확산 챔버는 약 1 Gy, 약 2 Gy, 약 4 Gy, 약 5 Gy, 약 6 Gy, 약 10 Gy 또는 최대 약 15 Gy 양의 감마 방사선조사로 처리된다. 특정 측면에서, 방사선 용량은 약 5 Gy 이하이다. 다른 측면에서, 방사선 용량은 적어도 약 5 Gy이다. 일부 측면에서, 방사선 용량은 5 Gy이다. 특정 실시양태에서, 바이오확산 챔버는 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 적어도 5회 조사될 수 있다. 일부 실시양태에서, 챔버는 대상체로 이식하기 전 약 24시간 미만에 조사된다. 다른 실시양태에서, 챔버는 대상체로 이식하기 전 약 24시간에 조사된다. 다른 실시양태에서, 챔버는 대상체로 이식하기 전 적어도 약 24시간에 조사된다. 다른 실시양태에서, 챔버는 대상체로 이식하기 전 약 48시간 미만에 조사된다. 다른 실시양태에서, 챔버는 대상체로 이식하기 전 적어도 약 48시간에 조사된다.
종양 세포는 전형적으로 이식 전에, 예컨대 방사선에 의해 사멸되지만, 세포는 사멸될 필요가 없으며 실제로 항원 방출을 촉진시키기 위해 세포를 살아있는 상태로 유지하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 세포는 이식 전 조사되지 않을 수 있다. 그러나, 안전 상, 살아 있는 종양 세포가 대상체로 방출되는 것을 방지하는 것이 바람직하다.
종양 세포는 다양한 수로 확산 챔버에 배치될 수 있다. 특정 실시양태에서, 약 1 x 104 내지 약 5 x 106개의 종양 세포가 각각의 확산 챔버에 배치된다. 다른 실시양태에서, 약 1 x 105 내지 약 1.5 x 106개의 종양 세포가 확산 챔버에 배치된다. 다른 실시양태에서, 약 5 X 105 내지 1 x 106개의 종양 세포가 챔버에 배치된다. 대상체가 사용될 수 있다. 우리는 종양 세포의 수가 대상체의 항종양 반응에 영향을 끼칠 수 있고 목적하는 결과를 얻을 기회를 증가시키기 위해 적합한 범위가 선택되어야 한다는 것을 발견하였다. 도 28은 20개 챔버로 이식된 환자로부터의 데이터를 나타내며, 면역 반응에 대응하는 세포 수율(1,000,000개 세포)을 나타낸다. 항종양 면역 반응은 챔버에서 약 750,000 내지 약 1,250,000개 세포의 범위에서 최적이며, 약 1,000,000개 세포/챔버에서 피크이다. 조사된 종양 세포를 함유하는 다수의 챔버가 투여되며, 최적 면역을 유지하기 위해 챔버당 세포수는 바람직하게는 범위 내로 유지된다. 바람직하게는, 종양 세포는 온전하고 본원에서 기술되는 바와 같이 자가분해되거나 달리 손상되지 않는다.
특정 실시양태에서, 챔버에서 세포 대 AS ODN의 비를 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 특정 측면에서, 챔버는 약 2 μg의 AS ODN 및 750,000 내지 1,250,000개의 세포, 예컨대 1,000,000개의 세포를 함유할 수 있다. 따라서, 세포 대 AS ODN의 비는 약 3.75 x 105 내지 약 6.25 x 105개 세포/μg AS ODN 범위, 예컨대, 약 5.0 x 105개 세포/μg일 수 있다. 따라서, 20개의 챔버를 수용하는 전형의 환자에서, 총 AS ODN 용량은 약 40 μg이다.
전형적으로, 투여는 본원에 기술된 바와 같이 챔버에 존재할 것이다; 그러나, 특정 측면에서, 조사된 세포 및 IGF-1R AS ODN은 챔버 또는 또 다른 용기에 물리적으로 함께 함유되지 않으면서 대상체에 공동투여될 수 있다. 이러한 접근법의 특정 방법에서, 따라서 조사된 세포 및 IGF-1R AS ODN은 대상체의 생리에 의해 제한되는 신체에서 분산, 확산 또는 대사된다. 따라서, 특정 측면에서, 예컨대 사용을 위한 종양 세포는 챔버에 대해 본원에 기술된 바와 같이 제조되고 IGF-1R AS ODN과 함께 투여될 수 있지만, 투여는 물리적 용기 내에 함유되지 않을 수 있다. 이러한 투여는 전형적으로 근육내이다.
챔버를 위한 종양 조직 준비
자가 백신접종에 사용하기 위한 종양 세포는 대상체로부터 수술로 제거된다. 실시양태에서, 종양 세포는 조직 모실레이터를 사용하여 환자로부터 제거된다. 추출 디바이스는 바람직하게는 고정형 외부 캐뉼라 내의 고속 왕복형 내부 캐뉼라 및 전자적으로 제어되는 가변 석션을 조합한다. 외부 캐뉼라는 1.1 mm, 1.9 mm, 2.5 mm 또는 3.0 mm의 직경 및 10 cm, 13 cm 또는 25 cm의 길이를 갖는다. 기기는 또한 무딘 데시케이터 단부로부터 0.6 mm 떨어진 측면-입구 절단부 및 흡인 개구에 의존한다. 제거될 조직으로 개구의 조심스러운 전방 압력 및 흡인의 조합은 목적하는 조직을 측면 개구로 당겨 내부 캐뉼라의 왕복 절단 작용을 통해 제어되고 정확한 조직 절제를 가능하게 한다. 주요 특징은 회전 블래이드가 부재하다는 것이다; 이는 의도하지 않은 조직을 개구로 당기는 것을 피한다. 적합한 디바이스의 예는, 직접, 현미경 또는 내시경 시각화와 함께 연조직의 제거에 사용될 수 있는 최소 침습 수술 시스템인 Myriad® 조직 흡인기(NICO Corporation® Indianapolis, IN)이다. 셰이빙된 조직을 흡인하고, 수집 챔버에 모아, 멸균 조직 트랩에 수집한다. 멸균 조집 트랩에서 조직을 수집하는 동안, 혈액은 제제로부터 제거된다. 바람직하게는, 멸균 트랩은 트랩의 바닥에 수집 접시 및 트랩에 접근을 제공하는 스템을 함유한다. 트랩 구조는 또한 트랩으로부터 조직 제거를 용이하게 하기 위해 트랩으로부터 제거 가능한 내부 국자형 구조를 함유할 수 있다.
바람직하게는, 모실레이터는 절제 부위에서 또는 이의 샤프트를 따라 열을 발생시키지 않으며, 조직 제거를 위해 초음파 에너지를 필요로 하지 않는다. 따라서, 특정 실시양태에서, 종양 조직은 세절된 종양 조직(즉, 열 없이, 임의적으로, 초음파 처리 없이, 측면-입구 절단부에 의해 수득되는 종양 셰이빙된 조직)이다. 유리하게는, 흡인기-추출 및 세절된 조직은 다른 방법에 의해 제거된 조직보다 높은 생존력을 갖는다. 추출 공정은 부분적으로 제거 동안 종양 세포를 높은 온도에 노출시키는 것을 제한하는 것에 기인하여 더 높은 종양 세포 생존력을 유지하는 것으로 믿어진다. 예컨대, 본원에서의 방법은 제거 동안 종양 세포를 25℃보다 높은 온도에 노출시키지 않는다. 따라서, 세포는 체온, 즉 약 37℃보다 높은 온도에 노출되지 않는다.
대상체로부터 입수한 종양 조직의 양은 다양할 수 있다. 바람직하게는, 환자로부터 입수한 습윤 종양 조직의 양은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 그램 또는 적어도 4 그램이다. 조직은 멸균 조직 트랩으로부터 제거되고, 큰 조직 단편을 해체하도록 멸균 피펫으로의 피펫팅에 의해 분해된다. 이어서, 분해된 세포 현탁물은 혈청-함유 배지 중의 멸균 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅되고, 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이션된다. 이 플레이팅 단계는 부착에 의해 목적하는 기능적 세포를 농축시키는 역할을 하며, 또한 제제로부터 파편을 제거하는 것을 돕는다. 따라서, 본원에 기술된 처리에 사용되는 종양 세포는 바람직하게는 종양 조직으로부터의 부착성 세포로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다.
예정된 인큐베이션 시간(예컨대, 6, 12, 24 또는 48시간) 후, 세포는 플레이트로부터 제거된다. 세포는 스크래핑에 의해, 화학적 방법(예컨대, EDTA)에 의해 또는 효소적 처리(예컨대, 트립신)에 의해 제거된다. 세포는 하나 이상의 확산 챔버에 배치된다. 일부 실시양태에서, 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 확산 챔버 사이에 분할된다. 종종, 20개 챔버가 사용된다. 일부 실시양태에서, 각각의 확산 챔버는 동일한 세포수를 함유한다. 일부 실시양태에서, 제1 확산 챔버는 제2 챔버보다 많은 세포를 함유한다.
일부 실시양태에서, 세포는 챔버에 배치되기 전에 분류된다. 일부 실시양태에서, 세포는 챔버에 배치되기 전에 하나 이상의 세포 마커에 대해 선별됨으로써 농축된다. 선별은, 예컨대 비드를 사용하여 또는 당업자에게 공지된 세포 분류 기술에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 챔버에 배치된 세포는 하나 이상의 마커에 대해 농축된다.
일부 실시양태에서, 치료학적 유효 시간 동안 바이오확산 챔버의 이식은 대상체에서 암의 복귀를 감소시키거나 제거시킨다. 특정 측면에서, 바이오확산 챔버의 이식은 대상체에서 암과 연관된 종양 부피의 감소를 야기한다. 다른 실시양태에서, 치료학적 유효 시간 동안 바이오확산 챔버의 이식은 대상체에서 종양의 제거를 유도한다. 일부 실시양태에서, 챔버의 이식은 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 36개월 또는 무한하게 종양의 재성장을 억제한다.
바이오확산 챔버는 하기의 비제한적 방식으로 대상체에 이식될 수 있다: 피하로, 복강내로 및 두개내로. 특정 실시양태에서, 확산 챔버(들)은 우수한 림프 배출 및/또는 혈관 공급을 갖는 신체의 어셉터 부위, 예컨대 배곧은근집에 이식된다. 다른 실시양태에서, 확산 챔버가 치료를 위해 재사용되고 치료 후에 비워질 수 있도록 리필 챔버가 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 복수의 확산 챔버, 바람직하게는 5 내지 20개의 챔버가 단일 대상체에게 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개 또는 적어도 약 50개의 챔버가 대상체에 이식된다. 일부 실시양태에서, 10-20개의 챔버가 대상체에 이식된다. 바람직하게는, 약 20개의 챔버가 대상체에 이식된다. 특정 실시양태에서, 종양 세포는 각각의 챔버에 동일하게 분할된다.
전형적으로, 챔버는 일정 시간 후 제거된다. 예컨대, 챔버는 약 24시간, 약 48시간, 약 72시간 또는 약 96시간 동안 대상체에게 이식될 수 있다. 약 48시간 동안의 이식은 유익한 치료 결과와 연관된다. 따라서, 바람직한 이식 시간은 약 48시간이다. 특정 실시양태에서, 백신접종 절차는 환자당 1회 수행된다. 다른 실시양태에서, 백신접종 절차는 환자당 다수회 수행된다. 실시양태에서, 백신접종 절차는 단일 환자에서 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 또는 8회 수행된다. 실시양태에서, 백신접종은 소정의 시간 동안 7일마다, 14일마다 또는 28일마다, 또는 1개월마다, 3개월마다 또는 6개월마다 반복된다. 추가의 실시양태에서, 백신접종 절차는 환자에게 암이 없을 때까지 주기적으로 반복된다.
이론에 구애됨이 없이, 바이오확산 챔버의 이식은 챔버부터 확산되는 종양 항원에 대한 면역 반응이 달성되도록 이식 부위에서 또는 근처에서 M2 세포의 제거 또는 감소를 야기하는 것으로 생각된다. 특정 측면에서, 이식 부위에서 M2 세포의 제거 또는 감소는 항원-제시 세포(APC)에 의한 자가 종양 항원의 CD4 T 세포에 대한 증진된 제시를 이끌어 인터페론-감마(IFNγ)의 생성 및 1형 종양 면역의 유도를 이끈다. 특정 측면에서, 종양 항원-특이적 CD4 T 세포에 의한 IFNγ의 생성 및 IGF-1R AS ODN의 항-M2 효과는 1형 항종양 면역 및 종양 성장을 간접적으로 방해하는 순환 및 종양 미세환경으로부터 항-염증 M2 세포의 손실을 추진한다. 일부 측면에서, 종양 항원-특이적 CD4 T 세포에 의한 IFNγ의 생성 및 IGF-1R AS ODN의 항-M2 효과는 종양 세포 및 종양 미세환경(M2 세포)에 대한 이펙터-매개된 손상을 촉발하고 종양 항원을 인식하는 기억 T 세포를 프로그래밍하는 더 긴 과정을 개시한다. 특정 실시양태에서, 항종양 적응 면역 반응은 지속적인 종양 퇴행을 지탱한다.
임의적으로, 챔버에 도입되는 세포는 특정 세포 유형에 대해 농축될 수 있다. 세포골격-연관된 부류 VI 중간 필라멘트(IF) 단백질인 네스틴은 기존에 신경 줄기 세포 마커로서 이의 중요성에 대해 주목되었다. 우리는 특정 뇌 종양 샘플에서 네스틴에 대해 양성인 세포(네스틴+ 세포)가 양성 조직과 비교하여 농축되고 이 연관은 개선된 치료 반응에 대응한다는 것을 발견하였다. 따라서, 특정 측면에서, 대상체의 종양은 네스틴 발현의 정도를 평가하기 위해 생검될 수 있으며, 따라서 특정 측면에서, 챔버 세포는 양성 조직과 비교하여 농축된 네스틴-양성("+") 세포이다. 이론에 구애됨이 없이, 네스틴은 항종양 면역 반응을 생성하는 데 적합하고 유용한 항원과 연관된 마커를 제공하는 것으로 생각된다. 따라서, 챔버에 이식되는 세포는 대상체로부터 추출되는 경우 전체로서 종양 세포 집단과 비교하여 네스틴+ 세포에 대해 농축될 수 있다. 도 30은 반응을 자극하는 데 사용되는 종양 샘플이 네스틴으로 농축되는 경우 얻어지는 증진된 면역 반응을 도시한다.
전신 투여
챔버의 이식에 대한 대안 또는 보충으로, IGF-1R AS ODN이 전신적으로 투여될 수 있다. 따라서, 실시양태에서, IGF-1R AS ODN이 전신 투여를 위한 약제학적 조성물에 제공된다. IGF-1R AS ODN에 추가하여, 약제학적 조성물은, 예컨대 식염수(0.9% 염화나트륨)을 포함할 수 있다. 조성물은 인지질을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 인지질은 생리학적 pH에서 전하를 띄지 않거나 중성 전하를 갖는다. 일부 측면에서, 인지질은 중성 인지질이다. 특정 측면에서, 중성 인지질은 포스파티딜콜린이다. 특정 측면에서, 중성 인지질은 디올레오일포스파티딜 콜린(DOPC)이다. 일부 측면에서, 인지질은 본질적으로 콜레스테롤이 없다.
일부 측면에서, 인지질 및 올리고뉴클레오티드는 약 5:1 내지 약 100:1의 몰비 또는 그 내에서 유도될 수 있는 임의의 비로 존재한다. 다양한 측면에서, 인지질 및 올리고뉴클레오티드는 약 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 또는 100:1의 몰비로 존재한다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드 및 인지질은 올리고뉴클레오티드-지질 복합체, 예컨대 리포솜 복합체를 형성한다. 일부 측면에서, 리포솜의 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 5 마이크론 미만의 직경이다. 다양한 측면에서, 조성물은 추가로 적어도 하나의 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 20을 포함한다. 일부 측면에서, 총 리포솜 안티센스 약물 제품의 적어도 약 5%는 계면활성제로 구성되고, 리포솜의 적어도 약 90%는 3 마이크론 미만의 직경이다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오티드 집단은 리포솜 집단에 통합된다.
일부 측면에서, 약제학적 조성물은 액상 약제학적 조성물이다. 다른 측면에서, 약제학적 조성물은 고형 약제학적 조성물이다.
인간 대상체에 안티센스의 전신 투여를 용량은 약 0.025 g/kg, 약 0.05 g/kg, 약 0.1 g/kg, 약 0.15 g/kg 또는 약 0.2 g/kg일 수 있다. 특정 실시양태에서, 전신 투여를 위한 용량은 0.025 g/kg 내지 0.2 g/kg일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 약 0.2 g/kg이다. 다른 실시양태에서, 용량은 0.004 g/kg 내지 0.01 g/kg이다. 다른 실시양태에서, 용량은 0.01 g/kg 미만이다. 추가의 실시양태에서, 용량은 0.01 g/kg 내지 0.2 g/kg이 아니다. 특정 측면에서, 안티센스는 동결건조된 분말로 공급되고 투여 전에 재현탁된다. 재현탁되는 경우, 안티센스의 농도는 약 50 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 500 mg/ml, 약 1000 mg/ml 또는 이들 양 사이의 범위일 수 있다.
특정 실시양태에서, AS ODN은 수술전, 예컨대 종양 부담을 감소시키기 위해 수술 전에 전신적으로 투여될 수 있다. 예컨대, AS ODN은 수술 전 최대 24시간, 최대 36시간, 최대 48시간 또는 최대 72시간에 투여될 수 있다. 특정 측면에서, 약제학적 조성물은 수술 전 약 48 내지 약 72시간에 투여될 수 있다. 전형적으로, 이러한 상황에서, 투여는 정맥내 볼루스에 의한 것이다.
병용 요법
역사적으로, 암 요법은 방사선으로, 화학요법으로 또는 둘 다로 대상체를 치료하는 것을 수반하였다. 이러한 접근법은 잘-입증된 난제들이 있다. 그러나, 유리하게는, 본원에 개시된 챔버 이식 방법은 단일요법으로 암을 갖는 대상체를 치료하는 데 이용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 화학요법 또는 방사선 요법을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 본원에서 단일요법 접근법에 의해 달성되는 우수한 효과에도 불구하고, 특정 상황 하에서 챔버 방법을 다른 요법, 예컨대, 방사선 요법과 병용하는 것이 유리할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방사선 요법은, 제한 없이, 내부 공급원 방사선 요법, 외부 빔 방사선 요법 및 전신 방사성동위원소 방사선 요법을 포함한다. 특정 측면에서, 방사선 요법은 외부 빔 방사선 요법이다. 일부 실시양태에서, 외부 빔 방사선 요법은, 제한 없이, 감마 방사선 요법, X-선 요법, 세기 조정된 방사선 요법(IMRT) 및 이미지-안내되는 방사선 요법(IGRT)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 외부 빔 방사선 요법은 감마 방사선 요법이다. 방사선은 챔버 이식 전 또는 이식 후, 예컨대 구제 요법으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 이러한 구제 요법 접근법은 암이 복귀된 것으로 결정될 때까지 시행되지 않는다.
따라서, 특정 병용 접근법에서, 본원에 기술된 챔버 방법, 및 전신 방법 및 조성물 둘 다는 동일한 대상체에서 단독으로 또는 방사선 또는 화학요법과 병용하여 사용될 수 있다. 본원에 기술된 병용 접근법에서, 챔버 이식은 바람직하게는 1선 요법으로 이용될 수 있다. 대상체의 면역계가 다른 요법에 의해 억제되어 챔버 이식의 치료 이점을 감소시킬 수 있으므로, 챔버 이식을 먼저 이용하는 것이 바람직하다.
임의적으로, 전신 투여는 챔버 이식 전에 수행될 수 있다. 이러한 접근법은 프라이밍 접근법으로서 대상체 면역계를 증진시키는 데 이용될 수 있다. 프라이밍 접근법은 이전 요법으로 대상체가 손상된 면역계를 갖는 경우 특히 유리할 수 있다.
전신 투여가 병용에 이용되는 경우, AS ODN은 자가 암 세포 백신을 사용하여 환자를 치료하기 전 적어도 2주, 적어도 1주, 적어도 3일 또는 적어도 1일에 전신적으로 투여된다. 다른 실시양태에서, AS ODN은 자가 암 세포 백신, 즉 챔버로 환자를 치료한 후 적어도 1일, 적어도 3일, 적어도 1주 또는 적어도 2주에 전신적으로 투여될 수 있다.
임의적으로, 대상체는 제1 백신접종 후 본원에 기술된 방법을 이용하여 챔버로 재백신접종될 수 있다. 제2 또는 그 초과의 추가 백신접종은 조직 제거 동안 대상체로부터 취하여 저장되는 종양 세포를 사용할 수 있다. 임의적으로, 제2 또는 그 초과의 추가 백신접종은 대상체로부터 제거되고 본원에 기술된 바와 같이 처리된 새로운 종양 조직을 사용할 수 있다. 대상체에 남아 있는 임의의 종양은 동일한 항원을 발현할 수 있으며, 따라서 데포로서 작용하여 재자극을 제공한다. 그러나, 재발 종양은 새로운 항원을 발달시켜 항종양 반응을 자극하는 추가의 옵션을 제공할 수 있다. 후속 백신접종은 1차 치료가 완료되고 종양이 재발된 후 또는 대상체가 1차 치료에 반응하지 않는 경우일 수 있다.
IGF-1R AS ODN으로 치료하기 위한 대상체
적합한 대상체는 암을 갖는 동물이다; 전형적으로 대상체는 인간이다. 뇌암, 예컨대 교모세포종이 본원에 개시된 이 방법으로부터 특히 유익하지만, 상기 방법은 일반적으로 암에 적용된다. 따라서, 본 개시는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하여 암을 치료하는 방법을 제공한다: 신경아교종, 별아교세포종, 간암종, 유방암, 두경부 편평 세포 암, 폐암, 신장 세포 암종, 간세포 암종, 담낭암, 전형적 호지킨 림프종, 식도암, 자궁암, 직장암, 갑상선암, 흑색종, 결장직장암, 전립선암, 난소암 및 췌장암. 구체적인 실시양태에서, 암은 신경아교종이다. 특정 측면에서, 신경아교종은 재발 악성 신경아교종이다. 일부 실시양태에서, 암은 별아교세포종이다. 특정 실시양태에서, 치료 후보자인 대상체는 WHO 등급 II, WHO 등급 III 또는 WHO 등급 IV 종양을 앓는다. 일부 측면에서, 종양은 별아교세포종이다. 특정 실시양태에서, 종양은 등급 II 별아교세포종, AIII(IDH1 R132H 돌연변이체 등급 III 별아교세포종), AIII-G(다형성 교모세포종 별아교세포종의 특징을 갖는 IDH1 야생형 등급 III) 또는 등급 IV 별아교세포종으로부터 선택된다.
등급 IV 별아교세포종은 가장 높은 등급의 신경아교종이며, 교모세포종(GBM)과 동의어이다. 매년 3 또는 4/100,000의 발생률로 GBM은 성인에서 가장 흔한 악성 원발성 뇌 종양이다. 표준 치료 요법- 전형적으로 방사선요법과 테모졸로미드를 사용하는 화학요법의 병용- 이 잘 작용하지 않으며, GBM 환자의 결과는 중앙값 수명이 15-17개월로 좋지 못하다. 유리하게는, 상기 방법은 새로 진단된 뇌암을 치료하는 데 사용될 수 있고, 또한 재발 교모세포종, 예컨대, 이전에 표준 치료 요법으로 치료된 환자에서 재발 교모세포종을 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 특정 측면에서, 대상체는 새로 진단된 GBM 대상체 또는 재발 GBM 대상체일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 이전에 면역억제적인 임의의 치료 접근법으로 치료된 바 없는 것이다. 특정 측면에서, 적격 대상체는 18세 이상이며, 60 이상의 카르노프스키(Karnofsky) 스코어를 갖는다. 임의적으로, 대상체는 이반구형 질환을 갖지 않고/않거나 자가면역 질환을 갖지 않는다.
임의적으로, 치료 후보자인 대상체는 대상체에 대해 종양 생검을 수행함으로써 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 암은 단핵구의 존재에 대해 검정된다. 특정 측면에서, 단핵구는, 제한 없이, CD11b+, CD14+, CD15+, CD23+, CD64+, CD68+, CD163+, CD204+ 또는 CD206+ 단핵구를 포함한다. 종양에서 단핵구의 존재는 면역조직화학을 사용하여 검정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료 후보자인 대상체는 대상체의 총 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45% 또는 약 50% 초과의 CD163+ M2 세포를 나타낸다. 특정 측면에서, 대상체는 대상체의 총 PBMC의 약 20% 초과의 CD163+ M2 세포를 나타낸다.
다른 실시양태에서, 치료 후보자인 대상체는 대상체의 혈청에서 하나 이상의 사이토카인의 존재에 의해 확인된다. 이들 사이토카인은, 제한 없이, CXCL5, CXCL6, 및 CXCL7, IL6, IL7, IL8, IL10, IL11, IFN-γ 및 HSP-7을 포함한다.
다른 실시양태에서, 치료 후보자인 대상체는 대상체의 혈청에서 하나 이상의 성장 인자의 존재에 의해 확인된다. 이들 성장 인자는, 제한 없이, FGF-2, G-CSF, GM-CSF 및 M-CSF를 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이오확산 챔버로의 치료 후보자인 대상체는 특정 세트의 사이토카인의 수준을 측정함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강한 대상체와 비교하여 상승된 수준의 이들 사이토카인을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "건강한 대상체"는 암 또는 임의의 다른 질환을 앓지 않고 바이오확산 챔버로 치료할 필요가 없는 대상체를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 사이토카인은 항종양 면역 반응을 증대시키기 위해 챔버에 첨가될 수 있다. 예컨대, 챔버에 첨가되는 사이토카인은 CCL19, CCL20, CCL21 및 CXCL12 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 순환하는 CD14+ 단핵구는 건강한 대상체와 비교하여 상승된 수준의 CD163을 갖는다. 일부 측면에서, 순환 CD14+ 단핵구 상의 CD163의 수준은 건강한 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배 또는 적어도 약 100배 상승된다. 특정 실시양태에서, 순환 CD14+ 단핵구 상의 CD163의 수준은 건강한 대상체와 비교하여 약 2배 상승된다.
다른 실시양태에서, 치료 후보자인 대상체는 미분화된 단핵구를 M2 세포를 향해 분극화시키는 혈청을 갖는다. 특정 측면에서, 대상체의 혈청의 미분화된 단핵구와의 인큐베이션은 단핵구 상에 CD11b, CD14, CD15, CD23, CD64, CD68, CD163, CD204 및/또는 CD206을 포함하나 이로 제한되지 않는 하나 이상의 세포 표면 마커의 발현을 유도한다. 다른 측면에서 대상체의 혈청의 미분화된 단핵구와의 인큐베이션은 대상체의 혈청과 함께 인큐베이션되지 않은 단핵구와 비교하여 단핵구 상에 하나 이상의 세포 표면 마커의 발현을 상승시킨다. 특정 측면에서, 세포 표면 마커는 CD11b, CD14, CD15, CD23, CD64, CD68, CD163, CD204 및/또는 CD206을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 하나 이상의 표면 마커의 수준은 대상체의 혈청과 함께 인큐베이션되지 않은 미분화된 단핵구와 비교하여 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배 또는 적어도 약 100배 상승된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 표면 마커의 수준은 대상체의 혈청과 함께 인큐베이션되지 않은 미분화된 단핵구와 비교하여 약 2배 상승된다. 대상체의 혈청에 의해 분극화된 단핵구는 FACS를 이용하여 측정될 수 있다.
표적 세포
이론에 구애됨이 없이, AS ODN은 IGF-1R 발현을 하향조절함으로써 대상체 M2 세포를 감소시키고/시키거나 M2 세포로의 세포 분극화를 억제하는 것으로 생각된다. 일부 실시양태에서, M2 세포에서 IGF-1R 발현은 안티센스로 처리되지 않은 세포와 비교하여 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 하향조절된다. M2 세포에서 IGF-1R 발현은 정량적 RT-PCR에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, M2 세포에서 IGF-1R 발현은 1회 용량의 안티센스를 수령한 후 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주 또는 적어도 약 6주 동안 대상체에서 하향조절된 상태로 유지된다.
일부 측면에서, M2 세포에서 IGF-1R 발현의 하향조절은 IGF-1R을 발현하지 않는 세포와 비교하여 대상체에서 M2 세포의 선택적인 감소를 초래한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 M2 세포는 안티센스로 처리되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 감소된다. 다른 실시양태에서, M2 세포 집단은 제거된다. 에컨대, 바이오확산 챔버의 이식 후, M2 세포 집단은 바이오확산 챔버의 이식 전 집단의 약 1%, 약 2%, 약 5% 또는 약 10%일 수 있다. 대상체에서 M2 세포는 FACS를 사용하여 측정될 수 있다. 특정 측면에서, 처리 후 M2 세포는 제거된다; 즉, FACS에 의해 검출가능하지 않다. 다른 측면에서, M2 세포의 감소는 프록시(proxy) 검정을 이용하여 측정될 수 있다; 예컨대, 대상체로부터의 혈청은 M2 세포를 분극화하는 이의 능력을 평가하기 위해 처리 전 및 후에 입수할 수 있다. 본원에 개시된 방법으로 처리 후, M2 세포를 분극화하는 혈청의 능력은 약 80% 내지 약 100%, 약 20% 내지 약 60% 또는 약 10% 내지 약 50% 감소된다.
일부 실시양태에서, M2 세포에서 IGF-1R의 발현을 표적하면 M2 세포가 세포사를 겪게 된다. 특정 실시양태에서, 세포사는 괴사이다. 다른 실시양태에서, 세포사는 아폽토시스이다. 본 개시의 목적 상 아폽토시스는 프로그램된 세포사로 정의되며, 원발성 및 전이성 종양의 퇴행을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 아폽토시스는 무수한 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 광범위한 현상인 프로그램된 세포사이다. 대조적으로, 괴사는 다양한 유해한 조건 및 독성 물질에 대한 세포 반응인 우발적인 세포사이다. 다른 실시양태에서, M2 세포에서 IGF-1R의 발현을 표적하면 M2 세포는 세포 주기 정지를 겪게 된다.
키트
완성된 챔버의 제조는 다수의 부품 및 다수의 단계를 필요로 한다. 본 개시의 또 다른 측면에서, 본원에 개시된 방법을 실시하기 위한 부품을 포함하는 키트가 제공된다. 특정 측면에서, 키트는 한 부분 또는 2개의 절반으로 존재할 수 있는 챔버 바디를 포함한다. 하나 이상의 막, 접착제 및 용매(예컨대, 알콜 또는 2 디클로로에탄)을 포함하는 챔버를 밀봉하기 위한 아이템이 또한 포함될 수 있다. 임의적으로, 막은 밀봉을 만들도록 챔버에 음향적으로 결합될 수 있다. 키트는 안티센스 ODN을 포함한다. 임의적으로, ODN은 2개의 부분으로 분할될 수 있다. 제1 부분은 대상체로부터 수술적 제거 후 세포를 처리하기 위한 것이고, 제2 부분은 대상체로 도입 시 세포와 조합하기 위한 것이다. 다른 임의적인 키트 아이템은 세포를 배양하기 위한 배지 및 배지 내에서 세균 성장을 방지하기 위한 항생제를 포함한다.
임의적으로, 키트 내의 챔버는 챔버에 부착된 아일릿 또는 다른 디바이스를 사용하여 서로에 사전 연결(예컨대, 봉합사에 의해)되고 연결 물질을 수용하도록 구성될 수 있다. 유리하게는, 다수의 챔버를 사전 연결함으로써, 목적하는 수의 챔버가 외과의에 의해 용이하게 도입되고 제거될 수 있다.
실시예
실시예 1
재발 교모세포종을 갖는 환자에서 자가 종양 세포 및 IGF-1R AS ODN으로의 백신접종
기준 및 연구 목표
12명의 대상체가 표준 요법으로부터 실패한 후 치료를 위해 등록되었다. 각각의 환자는 하기 기준을 만족시켰다: 나이 > 18, 카르노프스키(Karnofsky) 성능 스코어 60 또는 더 우수, 및 선택된 외과적 재절제를 막는 동반-병적 상태 없음. 대상체를 종양 면역을 자극하기 위한 목적으로 조사된 자가 종양 세포 및 IGF-1R AS ODN을 함유하는 10개의 바이오확산 챔버의 배곧은근집에의 24시간 이식에 의해 처리하였다. 환자를 안전성, 임상 및 방사선촬영 뿐만 아니라 면역 반응에 대해 모니터링하였다. 연구 목표는 안전성 및 방사선촬영 반응의 평가 뿐만 아니라 면역 기능 및 반응을 조사하는 탐색적 목표를 포함하였다.
[표 1]
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실험 프로토콜
종양 조직을 조직 흡인기(NICO Myriad®)를 사용하여 환자로부터 수술적으로 제거하고 멸균 조직 트랩에 배치하였다. 멸균 조직 트랩을 지정된 BSL-2 시설로 옮기고, 여기서 종양 조직을 처리하고 바이오확산 챔버에 배치하였다. 바이오확산 챔버를 이식 전에 조사하였다.
종양 조직을 적출하는 수술 다음날, 10개의 조사된 바이오확산 챔버를 대상체의 배곧은근집에 이식하였다. 24시간 후, 그들을 제거하였다.
바이오확산 챔버는 수술 시 제거된 자가 종양 세포를 함유하였다. 세포를, 바이오확산 챔버에 첨가하기 전, 밤새(약 12-18시간) 서열 5'- TCCTCCGGAGCCAGACTT- 3'을 갖는 18-mer IGF-1R AS ODN(NOBEL)의 제1 양(4 mg/ml))으로 전처리하였다. AS ODN이 면역조절 특성을 갖는다는 것을 입증하는 데이터에 기반하여, 제2 양(2 μg)의 외인성 NOBEL 안티센스를 챔버(C-v)에 첨가하고, 그후 챔버를 조사하였다. 10개의 챔버를 각각의 환자에 이식하였다. PBS를 함유하는 11개의 대조군 챔버(C-p)를 또한 이식하였다.
방사선학적 평가
일련의 이미징 평가를 필립스 1.5T 및 3T MRI 스캐너 및 GE 1.5T MRI 스캐너 상에서 수행하였다. 통상의 해부학적 MRI 피처는 모든 12명의 환자에서 2명의 신경방사선학자에 의해 평가되었다. 동적 감수성 가중(DSC) MR 관류 및 15-방향 확산 텐서 이미징(DTI)의 생리학적 MRI 기술이 또한 이용되었다. MR 관류 및 DTI 포스트 프로세싱을 노르딕 아이스 워크스테이션(Nordic Ice workstation)(v.2.3.14) 상에서 수행하였다. rCBV를 반대측 정상 백질과 관련하여 계산하였다. 평균 확산 계수(평균 확산도)를 DTI 데이터로부터 계산하였다.
면역학적 평가
혈장 백혈구분반술을 면역 기능의 기선 평가를 위해 수술 1주일 전에 수행하였다. 혈액을 수술 후 7, 14, 28, 42, 56일 및 백신접종 후 3개월마다 입수하였다. 혈장 및 세포 분획물을 원심분리로 분리시키고, 세포를 적혈구 용해 버퍼로 처리하였다. 백혈구를 유동 세포측정법에 의해 정량하거나 -80℃에서 DMSO 중에 저장하였다. 혈청 샘플을 또한 -80℃에서 저장하였다. 유동 세포측정법을 EasyCyte 8HT(Millipore) 및 인간 CD4, CD8, CD11b, CD14, CD16, CD20, CD45, CD56, CD80, CD83 및 CD 86(모두 BD Biosciences로부터의 것임), 및 CD163(R&D Systems)에 특이적인 형광적으로 컨쥬게이션된 mAB를 사용하여 수행하였다. 수집 후 분석을 FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc, Ashland, OR)로 수행하였다. 혈청 사이토카인 인자를 루미넥스 비드 어레이(인간 사이토카인/케모킨 패널 I, II 및 III, Millipor) 및 HCMBMAG/MILLIPLEX 막 캔서 멀티플렉스 검정(emdmillipore.com)을 이용하여 정량하였다. 이는 DKK-1, NSE, 오스테오넥틴, 페리오스틴, YKL-40 및 TWEAK을 포함하는 줄기 세포 기능과 관련된 신경아교종에 대한 6개의 혈청 마커를 포함하였다. 혈청 니트레이트 수준을 그레이스(Greiss) 방법에 따라 검정하였다(Green L.C., et al., 1982, Anal Biochem 126:131-8). T 세포 자극을 이전에 기술된 바와 같이 포르볼 12-미리스테이트, 13 아세테이트(PMA) 및 이노마이신으로 수행하였다(Verbrugge, I., et al., 2012, Cancer Res, 72:3163-74).
종양 세포 상청액(SN) 및 외식된 챔버 내용물 중의 사이토카인/케모킨 수준을 상기 지정된 바와 같이 루미넥스 키트에 의해 분석하였다. 짝지은 백신 및 대조군 챔버로부터의 막을 표준 면역조직병리학적 검사를 위해 파라핀에 포매시켰다.
종양 조직 절편을 GFAP(아교세포 섬유 산성 단백질), IGF-1R, CD163, CD14, VWF(폰 빌레브란트 인자), CD4 및 CD8에 대한 면역조직화학 또는 문헌(Emoto, K., et al., 2005, Histochem Cytochem 53:1311-21)에 기술된 방법을 적응시키는 형광 조직면역화학에 의해 평가하였다. 면역양성 세포를 아페리오(Aperio)로 정량적으로 계수하거나, 저, 중 및 강으로 평가되는 염색 강도 및 초점 또는 확산으로 기술되는 염색 패턴과 함께 0(염색 없음) 내지 6(강력한 확산 염색)의 순서 척도를 이용하여 숙련된 신경병리학자(LCK)에 의해 정성적으로 계수하였다. 사후 부검를 뇌 검사로 제한하였고, 결과를 부검 시 진단된 이전에 치료된 또는 비치료된 교모세포종의 보관(archival) 파라핀 블록과 비교하였다. 나이브 단핵구의 캐노니컬 시험관내 분극화 또는 등록시 시험 대상체로부터 유래된 혈청과 함께 공동-인큐베이션된 나이브 단핵구를 포함하는 혼합 실험 둘 다를 문헌(Harshyne, LA, et al., 2015, Neuro Oncol 18(2):206-15; Solinas, G., et al., 2010, J Immunol 185:642-52)에 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다.
통계 분석
상이한 샘플에서의 정량적 측정치 사이의 통계적 유의성 수준을 p < 0.05와 함께 2-테일드 언페어드 t-시험 또는 매칭된 짝비교 t-시험에 의해 결정하였다. 생존 분석을 카플란-마이어 분석 및 로그 순위 비교에 의해 확립된 유의성에 의해 수행하였다. 혼합 판별 분석을 포함하는 모든 통계 분석을 JMP v. 11 소프트웨어(SAS, North Carolina)로 수행하였다.
안전성 평가 및 임상 과정
하나의 심각한 부작용(SAE)만이 프로토콜(류코페레시스 후 대퇴 정맥 혈전증)과 관련되었다. 9명의 환자는 종양 진행으로 사망하고 3명의 환자는 다른 원인으로 사망하였다. 5명의 부검을 수행하였다.
초기 진단으로부터의 중앙값 전체 생존율은 91.4주였으며(도 2a), 다른 재발 신경아교종 면역요법 시험과 유리하게 비교되었다. 48.2주 및 10주의 2개의 상당히 상이한 프로토콜 코호트가 각각 더 긴 및 더 짧은 생존 코호트로서 확인되었다(도 2b). 하나의 특이값(환자 TJ03)를 제외하고, 우리는 프로토콜 생존과 등록 시 림프구감소증 정도 사이의 유의한 상관관계를 기록하였다(도 2c). 초기 진단 및 프로토콜 등록에서의 CBC 값의 비교는, 평균 림프구 수가 표준 요법 후 상당히(65%) 떨어졌음을 나타내었다(N=8, p = .012, 짝비교 t-시험).
방사선촬영 반응
통상의 MRI 피처를 2명의 신경방사선학자(K.S.T. 및 A.E.F.)가 검토하고 평가하였다. 더 긴 코호트에서, 더 느린 진행과 함께, 원발 종양 부위에서 감소된 크기의 증진 및 FLAIR 엔벨로프가 관찰되었다. 양 코호트에서 해부학적 반응의 예가 도 3a 및 3b에 도시된다. 생리학적 MRI 측정은 이들 해부학적 관찰을 보강하였다. 순차적 DSC MR 관류를, 임상적 개선과 함께 상대적 대뇌 혈액량(rCBV)가 역설적으로 증가된 3명의 장기 생존자(환자 TJ03, TJ06 및 TJ09))를 포함하는 7명의 환자에서 수행하였다; 그러나, 이 효과는 일시적이었고, rCBV에서 지속적인 감소가 있었다. 순차적인 15 방향 DTI 데이터는, 질병 퇴행과 연관된 종양 세포성의 상실을 반영하는, 병든 반구에서 겉보기 확산 계수(ADC) 값 증가를 보였던 2명의 장기 생존자(환자 TJ03 및 TJ06))를 포함하였다. 우리는 짧은 코호트에서 나타나지 않았던 역설적 rCBV 반응과 증가하는 ADC 사이의 높은 상관관계에 주목하였다(도 3c 및 3d). 더 긴 코호트에서 혈청 니트레이트의 상응하는 수준은 염증 반응이 개시되었을 가능성을 반영하였다(자료 나타내지 않음).
생존 코호트에 의한 외식된 챔버 대 수술전후 혈청의 검사
외식된 챔버는 어떠한 생존 가능한 세포도 없이 구조적으로 온전하였다. C-p 및 C-v 챔버 둘 다로부터의 막의 외부 표면은 CD15+ 및 CD163+ 세포로 코팅되었으나, C-v 막 상에서 수가 극적으로 증가되었다(도 4a).
전체 연구 코호트에 대해, 챔버 가용성 내용물의 분석은 매칭된 수술전후 혈청 수준에 비해 다수의 성장 인자 및 사이토카인/케모킨의 상당한 상승을 나타내었으며, 많은 것이 신경아교종 종양 미세환경(TME)에 대해 잘 기록되어 있다. 78개의 사이토카인/케모킨 중 32개가 혈청 전반에 걸쳐 상당히 상승되었으며, 매칭된 짝 분석은 하기 표 2에서 주목되는 바와 같이 상당한 사이토카인 상승을 나타내었다.
Figure pct00005
Figure pct00006
이들 상승은 캡슐화된 종양 세포에 의해 생성된 사이토카인/케모킨 또는 챔버 내로 확산된 국소 선천성 면역 반응에 의해 생성된 인자로 해석되었다.
생존 코호트들 사이의 챔버 내 인자의 분석은 더 긴 코호트에서 VEGF, PDGF-α, IL-11, CCL5, MCP-3 및 MIP-1d에 대해 상당한 챔버 상승을 나타내었으며, NSE, 오스테오넥틴 및 YKL40을 포함하는 다수의 가용성 암 마커가 짧은 코호트에서 상당히 상승되었다. 독립적으로 혼합물 판별 분석으로 이들 코호트 차이를 확인하였다(도 4b).
양 코호트에 대해, 페리오스틴 및 CCL2 둘 다의 수준은 챔버(C-v)에서 혈청 또는 SN 값보다 상당히 낮았으며, 이는 챔버에서 이들 케모킨을 생성하는 세포가 제거됨을 시사한다(도 4c).
생존 코호트에 의한 백신접종 후 혈청 사이토카인/케모킨 및 PBMC
평가된 78개의 사이토카인/케모킨 중 24개의 수준은 하기 표 3에 나타난 바와 같이 짧은 코호트에 비해 더 긴 코호트로부터의 혈청에서 상당히 높았다.
Figure pct00007
혈청 CCL2의 스파이크가 수술 후 발생하였으나 2명의 환자에서 재수술에서는 없었다. CCL2 수준은 짧은 코호트에서 수술 후 기간 전반에 걸쳐 상당히 더 높게 유지되었다. 이들 수술 후 스파이크는 TNF-α 스파이크와 높은 상관관계가 있었다(도 5 및 6).
실제 CD4 및 CD8 T 세포 수 및 수지상 세포(DC) 수는 더 긴 코호트에서 상당히 더 높았으며, 수술전후 CD14+16- 수는 짧은 코호트에 비해 상당히 더 낮았다. 더 긴 코호트에서만 CD4와 DC 세포 사이 및 CD4와 CXCL12 사이에 유의한 상관관계가 있었다. 14일에 더 긴 생존 대상체로부터의 PBMC는 짧은 코호트보다 PMA 및 이노마이신으로 자극 후 IFNγ를 포함하여 상당히 더 높은 Th-1 사이토카인 생성을 나타내었다(자료 나타내지 않음). 백신접종 후 T 세포, 단핵구 및 향염증 케모킨/사이토카인의 순환 수준 사이의 조정된 변화가 4명의 대상체 중 3명에서 나타났다. 가장 높은 상관관계는 총 단핵구 수와 CD14+16- 단핵구 수준 사이에서 주목되었다(도 5b 및 5d). 순환 T 세포와 단핵구 수 사이의 역 관계가 또한 더 긴 코호트에서 주목되었으며(도 5), 짧은 코호트에서는 유의한 차이가 없었다(도 6). 면역억제 세포 집단과 향염증 세포 집단 사이의 예측 가능한 상호 관계 및 단핵구-케모킨 관계는 더 긴 코호트에서 더 많은 면역 적합성을 제시하였다.
파라핀 절편의 검사
부검을 통한 외과적 중재로부터의 파라핀 절편은 백신접종 후 TME를 관찰하는 것을 가능하게 하는 4가지 경우에서의 분석에 이용 가능하였다. 우리는 시험 부검을 재수술 및 비치료된 GBM 환자로부터의 부검과 비교하였다(도 7). 면역염색은 형광 면역조직화학에 의해 확증된 매칭된 짝에서 백신접종 후 IGF-1R 양성 세포의 상당한 감소를 나타내었다(도 7a 및 7g). 재발 또는 비치료된 신경아교종 부검에 대한 정성적 비교는, 부검 인공물로서의 임의의 세포 손실 우려를 감소시키는, 둘 다에서 풍부한 CD163 TAM 및 IGF-1R+ 세포를 나타내었다(도 7g).
CD163 TAM은 초기 수술 및 부검 둘 다에 대한 매칭된 비교에서 재발 시 피크였다(도 7c 및 7g). 환자 TJ06 및 TJ10은 모든 치료 단계를 통해 평가 가능한 샘플로 이러한 경향을 지지하였다(도 7b 및 7d). TJ06의 경우, CD163 세포는 제2 백신접종 후 떨어졌고, 부검을 통해 지속되었다. 이 감소는, 각각의 백신 후 증가되는 rCBV 및 ADC 값 및 혈청 니트레이트 수준과 역으로 상관관계가 있었다(도 7f를 참조).
말초 단핵구와의 연관성을 탐구하면서, 짧은 코호트에서 말초 CD163+ 단핵구와 CD163 TAM 사이에서 강한 상관관계가 주목되었으며(도 7e), 더 긴 코호트에서는 나타나지 않았다(도 7f),
우리는 어느 코호트에서도 백신접종 후 TME에서 T 세포 집단의 출현을 보지 못하였다.
대상체 혈청의 미분화된 단핵구와의 공동인큐베이션
환자에서 순환 CD163+ 단핵구의 생성을 탐구하기 위해, 우리는 먼저 각각 정규의 M1 및 M2 사이토카인인 IFN-γ 및 IL-4로 나이브 단핵구를 분극화하였다. 우리는 단지 M2 분극화와 함께 IGF-1R의 상향조절을 관찰하였다(도 8a). M2 분극화된 CD163+ 집단은 IGF-1R AS ODN과 함께 인큐베이션하는 경우 선택적으로 녹다운되었다(도 8b).
이어서, 우리는 나이브 단핵구를 모든 연구 대상체로부터 입수한 혈청과 함께 공동인큐베이션하고, IGF-1R 및 PDL-1 둘 다를 공동발현하는 CD163+ 세포의 출현을 기록하였다(도 8c). IGF-1R AS ODN으로 처리하는 경우, IGF-1R, PD-L1 및 CD163를 발현하는 세포는 도 8d에 요약된 병렬 및 용량 의존적 방식으로 상당히 녹다운되었다(도 8c).
고찰
수정된 자가 세포/챔버-기반 다형성 교모세포종(GBM) 백신접종 시험은 어떠한 유의한 안전성 문제도 제기하지 않았다.
우리는 이 백신 패라다임에 대해 상이한 반응을 갖는 2개의 상당히 상이한 생존 코호트를 확인하였다. 도 5 및 6을 참조한다. 더 긴 코호트 대상체는 통상적으로 수술 및 백신접종 후 상승된 수준의 종양-특이적 항체 이소형 및 IgG1, IgG3, IL12, CXCL10, CXCL12, CCL7, CCL19 및 CCL21을 포함하는 일반적으로 Th1 면역과 연관된 사이토카인/케모킨을 나타내었다. 상승된 수준의 이들 사이토카인/케모킨은 짧은 코호트에서는 나타나지 않았다. 따라서, 일반적으로 Th1 면역과 연관된 사이토카인/케모킨(예: IgG1, IgG3, IL12, CXCL10, CXCL12, CCL7, CCL19, CCL21)의 수준은 생존을 예측하고 추가 치료 전략을 알리기 위해 수술/백신접종 후 평가될 수 있다. 흥미롭게, CCL21 및 CXCL12는 CpG 애주번트와 시너지 효과를 나타내고 백신접종 패러다임에서 DC의 이동 및 T 세포 자극 능력을 증진시킨다. 또한, 더 긴 코호트에서 GM-CSF, IL-6, Flt-3L 및 SCF의 현저한 상승은 DC 증식을 증진시키며, 백신접종 후 pDC의 상당한 75% 증가에 기여할 수 있다. CD4 세포의 상당한 상승 및 D4 세포, pDC 및 사이토카인 CXCL12 사이의 상관관계는 또한 면역 시냅스 동안 CXCL12에 의해 촉진되는 T 세포 증식의 성공적 유도를 제시한다.
짧은 생존 코호트의 환자는 전형적으로 백신접종 전에 더 긴 치료 과정을 겪어 림프구감소증을 이끈다. 따라서, 백신접종은 정상 림프구 수준을 갖는 환자, 즉 비-림프구감소증 환자에게 투여되는 경우 가장 효과적이다. 치료 유도된 림프구감소증 및 더 낮은 CD4:CD8 비는 또한 테모졸라미드에 기인할 수 있었다(표준 치료는 수반된 테모졸라미드와 함께 등각 방사선에 이어 수술 후 6주에 개시되는 유지 테모졸라미드을 포함하였다). 더 긴 전체 생존의 결과는 T 세포 고갈로 이끄는 종양 항원에 대한 만성 노출 및 지속적인 신경아교종 억제 신호를 포함할 것이다. 마찬가지로, 단핵구/대식세포는 백신접종 후 약간의 변동과 함께 명백한 반응성 결여를 가졌지만 말초 CD14+16- 세포와 TAM 사이에 뚜렷한 상관관계를 가졌다. TAM은 CCL2 생성과 연관되었으며, 이 상관관계는 종양 성장을 촉진하는 폐쇄 루프 증폭을 반영할 수 있었다. 이를 지지하여, 짧은 코호트에서 발견된 상승된 혈청 CCL2 수준은 신경아교종 환자에서 중간엽 유전자 발현 프로필 및 불량한 예후와 연관되었다.
외식된 챔버는 캡슐화된 TME 및 개시 면역 반응과의 이의 교류에 대한 독특한 스냅샷을 제공하였다. 더 긴 코호트 챔버에서의 사이토카인 상승은 총괄적으로 백신접종이 Th1 반응을 유도하고 이 코호트로부터의 혈청이 Th1 면역과 연관된 종양-특이적 항체 이소형을 함유한다는 것을 나타내었다. 혼합물 판별 분석은 IFN-γ, TNF-α 및 IL12 생산과의 연관성을 확립하였다.
대조적으로, 짧은 코호트 챔버는 표준 요법 후 신경아교종 줄기 세포(GSC)-연관된 내성의 출현을 반영하는 암 마커의 더 큰 상승을 가졌다. 하나의 눈에 띄는 예외는 짝지은 혈청 값과 비교하여 모든 챔버에서 극적으로 낮았던 페리오스틴 수준이었다. 신경아교종에서 종양-촉진 세포 집단은 TAM 및 GSC를 포함하며, 전자는 동일한 주변혈관 틈새에서 후자를 지지하고(Zhou, W., et al., 2015, Nat Cell Biol 17:170-82), 둘 다 치료를 위한 전략적 표적을 나타낸다. GSC-분비된 페리오스틴에 의해 동원되는 M2 대식세포는 종양 성장에서 중요한 역할을 하며, 이들의 제거는 치료적 이점을 가질 것이다. 처리된 종양 세포를 함유하는 챔버에서 페리오스틴 수준의 감소는 이 인자 자체를 분비하는 GSC가 IGF-1R AS ODN에 대한 표적임을 제시한다.
특히, 기존의 면역억제(표준 치료에 따른 이전 치료에 기인함)에도 불구하고, 우리는 12명의 환자 중 4명의 환자에서 백신접종 후 향염증 반응에 의해 지지되는 방사선촬영적 및 임상적 개선을 기록하였다. 이들 환자는 또한 프로토콜 상에서 상당한 생존 이점을 가졌다. 이 생존 차이를 더 탐구하면서, 우리는 더 긴 코호트에서 더 높은 수준의 면역 접합성에 주목하였다.
백신접종 후 IGF-1R 감소는 일부 대상체에서 더 긴 프로토콜 생존과 연관되었다. 어떠한 특정 이론에도 구애됨이 없이, IGF-1R+ 세포 집단은 백신접종 패러다임에 의해 이들 개체에서 촉진된 1형 면역 메카니즘의 결과로 녹다운될 수 있다.
우리가 시험관에서 입증한 바와 같이, IGF-1R AS ODN은 백신 제제에 함유된 CD163+ 세포를 불활성화시킴으로써 그들의 면역조절 인자를 제거하고 1형 면역을 촉진한다. 또한, 백신 챔버 밖으로 확산되는 어떠한 IGF-1R AS ODN도 그것이 도달하는 M2 대식세포에 대해 유사한 효과를 갖는다. 이는 PDL-1, 다른 면역조절 인자, 혈관형성 인자, 영양소 지지 및 종양 침습을 포함하는 다양한 종양-촉진 리간드 및 인자를 발현하는 세포가 표적되는 새로운 플랫폼을 나타낸다.
더 긴 생존 환자 코호트와 짧은 생존 환자 코호트 사이의 방사선촬영 관찰에서의 차이는 백신접종 패러다임이 더 넓은 신경아교종 TME에 대해 영향을 끼친다는 개념에 대한 추가의 지지를 제공한다. 더 높은 rCBV 값은 전형적으로 종양 진행과 연관되며, MR 관류는 더 긴 코호트에서 단지 일시적인 증가를 가졌으며 이는 이전에 기술되지 않은 발견이다. ADC 측정은 종양 진행(낮은 값)을 세포 손실(높은 값)로 해석한 것과 구별하였다. 이 백신접종 패러다임은 IGF-1R 세포 및 CD163+ TAM 집단 둘 다의 손실과 연관되므로, ADC 값 상승이 이를 반영할 수 있다.
요약하면, 우리는 개선된 배합 신경아교종 백신 생성물의 안전성 프로필을 확립하고 임상적 및 방사선촬영적 개선과 연관된 면역 파라미터의 변경을 기록하였다. 종양 성장을 촉진하는 특정 단핵구 세포 집단(예컨대, IGF-1R을 공동발현하는 CD163+ 세포)을 녹다운하는 조건으로, 이 패러다임은 면역 손상을 초래하지 않는 치료 스킴을 제공한다.
결과 요약
프로토콜 치료와 관련된 등급 3 독성은 없었으며, 초기 진단으로부터 전체 중앙값 생존율은 91.4주였다(도 2a). 48.2주("긴") 및 10주("짧은")의 중앙값 생존율을 갖는 2개의 프로토콜 생존 코호트가 확인되었다(도 2b). 더 긴 생존 대상체는 대뇌 혈액량의 일시적 상승 및 일시적 충혈 및 세포 손실로 해석되는 겉보기 확산 계수(ADC) 값의 지속적 상승을 포함하는 이미징 발견을 가졌다. 백신 요법은 종양 미세환경(TME)으로부터 종양-촉진 CD163+ M2 및 IGF-1R+ 세포 집단의 지속적 손실을 초래하였다. CD163+ T 세포의 기원을 탐구하기 위한 시험관내 실험을 수행하였고, 이들 실험은 대상체의 혈청이 IGF-1R 및 PDL-1 둘 다의 상향조절과 함께 미성숙 단핵구를 CD163+ 세포로 분화시킨다는 것을 확증하였다. IGF-1R AS ODN과의 후속 인큐베이션은, 백신 챔버에서 IGF-1R AS-ODN으로 처리된 캡슐화된 TME(종양 미세환경)의 면역원성에 영향을 끼치는 이 M2 집단의 용량 의존적 녹다운을 초래하였다. 백신 패러다임은 유리한 중앙값 생존율로 잘 수용되었다.
실시예 2
교모세포종을 갖는 새로 진단된 대상체의 백신접종
우리는 실패한 표준 치료를 가졌던 재발 악성 신경아교종을 갖는 환자에서 이식된 바이오확산 챔버를 수반하는 제형화된 배합 생성물의 일부로서 전달되는 자가 세포 백신을 수반하는 백신 프로토콜의 생물학적 유효성을 입증하였다.
실시예 2는, 24 또는 48시간 동안 20개의 챔버 및 24 또는 48시간 동안 10개의 챔버를 이식하는 것을 포함하여 새로 진단된 신경아교종 환자에게 백신을 투여하는 것에 대한 반응을 기술한다. 각각의 경우에, 2 μg의 NOBEL을 각각의 경우에 조사 전에 챔버에 첨가하였다. 제1 중간 분석에서의 표준 치료와 비교하여, 무진행 생존 및 전체 생존 둘 다에서 상당한 개선이 있었다(도 9). 이는 백신접종 후 고용량 코호트의 성능으로 인해 가장 두드러졌다. 우리는 우선 재발 치료된 환자와 비교하여 새로 진단된 환자에서 백신접종 후 상당히 더 높은 피크 및 평균 인터페론-감마 수준에 주목하였다. 새로 진단된 신경아교종 환자를 등록하는 시험에서, 우리는 총 혈청 측정치를 측정할 때 각각의 백신 용량의 증가와 함께 IFN-γ의 현저하고 상당한 증가에 주목하였다. 더 긴 이식에 따른 더 높은 인터페론-감마 수준은 안티센스가 바이오확산 챔버 밖으로 확산하는 속도와 대략적으로 상관관계가 있었다.
도 10에 요약된 이들 데이터는 자가 챔버 백신이 새로 진단된 교모세포종 환자에서 항종양 반응을 유도한다는 것을 설명한다. 우리는 또한 증가된 IFNγ 수준이 종양 항원에 대한 환자 반응을 나타낼 수 있고, 그런 경우 항종양 면역 및 개선된 결과의 예측변수일 수 있다는 것에 주목하였다. 마지막으로, 재발 환자에 대비하여 새로 진단된 GBM 환자에서 얻은 더 강력한 반응은 대상체의 면역계의 영향을 설명하며 제1선 요법으로서 환자의 백신접종을 지지한다.
실시예 3
완전히 제형화된 챔버는 더 큰 애주번트성을 갖는다
완전히 제형화된 챔버는 4 mg/ml의 IGF-1R AS ODN으로 이식 6시간 전에 처리된 자가 종양 세포 및 종양 미세환경(TME)에 포함된 다른 세포를 포함한다. 이어서, 처리된 TME를 적어도 2 μg의 IGF-1R AS ODN의 외인성 첨가와 함께 캡슐화하고, 이어서 챔버에 5 Gy의 감사-방사선을 조사한다.
우리는 챔버 수를 증가시켰으며, 이는 각각의 환자에 의해 수용되는 IGF-1R AS ODN의 용량이 이전 연구에 비해 증가되었음을 의미한다. 예컨대, 이식되는 챔버의 2배수는 이식되고 챔버 밖으로 확산될 수 있는 안티센스의 2배량을 초래하며, 이는 AS ODN의 용량이 약 40 μg이며 20개 챔버로 분할된다는 것을 의미한다.
안티센스 서열, 특히 이의 앞뒤역순상동서열의 CpG 모티프, 및 신경아교종 세포와의 직접적 혼합물은 제자리에서 효과적으로 항종양 면역을 개시한다. 특히, 동일한 앞뒤역순상동서열 CpG 모티프를 갖는 센스 서열은 백신 패러다임에서 효과적이지 않다. 추가로, 안티센스 서열은 만족스러운 반응을 갖기 위해 종양 접종물과 직접적으로 혼합되어야 한다. M2 단핵구 분극화를 억제할 IGF-1R AS ODN의 용량은 IGF-1R의 발현을 하향조절하는 데 필요한 용량보다 적어도 10배(order of magnitude) 낮다.
전임상 동물 모델링에서, 우리는 백신접종 후 대뇌 피질에 이식된 동계 GL261 신경아교종 세포를 거부한 C57 B6 마우스로부터의 치료 IFN-γ-생성 CD4 T 세포를 재자극하는 다양한 항원 제제의 효율을 평가하였다. CD4 T 세포를 통상의 접근법을 이용하여 이들 동물의 비장으로부터 단리하고, 다양한 GL261 항원 제제와 인큐베이션된 항원 나이브 마우스로부터의 골수-유래된 수지상 세포에 첨가하였다. 자가 종양 세포, 외인성 안티센스 및 조사를 포함하는 완전히 제형화된 백신 챔버의 가용성 분획으로부터 회수된 항원은 불완전 제형보다 상당히 많은 수의 IFN-γ-생성 CD4 T 세포를 유도하였다.
C57BL/6 마우스의 옆구리로 24시간 동안 이식된 상이한 GL261 제제를 함유하는 챔버의 분석은 또한 완전히 제형화된 챔버가 가장 면역원성이 있다는 증거를 제공한다. IGF-1R AS ODN 및 조사 각각은 단독으로 PBS 대조군을 능가하는 사이토카인 증가를 야기하지만, IGF-1R AS ODN과 배합되는 경우, 32개의 사이토카인 중 16개가 조사 단독을 포함하는 모든 다른 변수에 비해 상당히 상승하였다. 이들 중, 방사선-유도된 향염증 사이토카인 네트웍에 의해 일반적으로 생성되는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하여 적어도 11개의 사이토카인은 염증 반응과 연관된다.
완전히 제형화된 챔버에 대한 향염증 반응은 재발 교모세포종을 갖는 환자에 대한 우리의 제2의 1상 인간 시험에서 입증되었다. 우리는 백신접종 후 뚜렷하게 상이한 생존 코호트에 주목하고, 면역 적합성, 백신접종 후 향염증 반응 및 더 긴 생존(미공개 관찰) 사이의 연관성을 확립하였다. 특히, 우리는 더 긴 코호트에서 백신접종 후 상승된 CD4:CD8 비에 주목했으며, 우리는 아마도 챔버 내의 종양 세포의 조사에 의해 더욱 증가되는 CD4+ 세포를 Th1 표현형을 향하게 하는 국소 TLR9 DC 활성화로 해석하였다.
실시예 4
나이브 마우스에서 완전히 제형화된 챔버
나이브 C57B6 마우스에서, 완전히 제형화된 백신 챔버의 이식은 부분적으로 제형화된 챔버보다 초기 면역 반응을 유도하는 데 상당히 더 효과적이었다. 마우스를 옆구리에서 하나의 챔버로 24시간 동안 백신접종하였다. 챔버 내용물은 내용물 없음(PBD), 부분적으로 제형화된 챔버(GL261 신경아교종 세포 단독, GL261과 AS ODN 또는 GL261과 5Gy의 조사), 및 완전히 제형화된 챔버(GL261, AS ODN 및 조사)로 다양하였다.
도 11에 도시되는 바와 같이, 부분적으로 제형화된 백신 챔버(즉, 종양 세포는 함유하나 안티센스 분자는 함유하지 않는 백신 챔버)로 이식된 마우스에 비해 완전히 제형화된 백신 챔버로 이식된 마우스에서 더 많은 향염증 사이토카인 생성이 있었다.
실시예 5
IGF-1R AS ODN에 의해 정상 샘플에서 용량 의존적 수지상 세포 활성화
2개의 정상 공여자 공급원으로부터의 PBMC를 사용하여 NOBEL 안티센스 및 이전에 사용된 서열(DWA, NOBEL 서열로부터 상류에 있는 18-mer 2개 코돈, 문헌(Andrews et al. (2001) "Results of a pilot study involving the use of an antisense oligodeoxynucleotidedirected against the insulin-like growth factor type I receptor in malignant astrocytomas." J Clin Oncol 19:2189-2200)에 기술됨)에 의한 용량 의존적 DC 활성화를 평가하였다.
PBMC를, NOBEL 안티센스에 대한 센스 서열과 함께, 안티센스 서열과 함께 밤새 인큐베이션하고, 이어서 CD123+, CD68+ 활성화된 DC 집단에 대해 게이팅하는 유동 세포측정법으로 분석하였다. 도 12에 도시되는 바와 같이, NOBEL 안티센스는 비자극된 대조군 또는 NOVEL 센스 서열과 상당히 상이하고 DWA 서열보다 더 효과적인 용량 의존적 DC 활성화를 나타내었다. 이들 데이터는 심지어 다른 IGF-1 AS와 비교하더라도, NOBEL 서열이 특히 효과적임을 설명한다.
실시예 6
백신접종된 마우스로부터 유래되는 T 세포를 사용하는 완전히 제형화된 챔버의 내용물로부터 시험관내 T 세포 반응
우리는 확산 챔버의 작은 세공 크기(100 nm)를 고려할 때, 엑소솜이 이식 동안 챔버 막을 통해 확산되는 종양 항원의 유망한 공급원이라고 가정하였다. GL261 신경아교종 세포 및 IGF-1R AS ODN를 포함하는 옆구리 주사로 백신접종된 C57B6 마우스는 후속 뇌 실질내 종양 챌린지에 대해 완전히 보호되었다. 우리는 하기의 항원 공급원을 사용하여 IFNγ에 대한 Elispot 검정으로 완전히 제형화된 챔버의 내용물에 대해 이들 마우스로부터 유래된 백신접종된 종양 치료 T 세포 면역반응성을 평가하였다: 1/ 조사되고 24시간 동안 마우스 옆구리에 이식된 GL261 세포 및 IGF-1R AS ODN로 로딩된 챔버로부터의 원심분리된 상청액; 2/ 등장성 PBS 배지 중에서 밤새 37℃에서 인큐베이션된 유사하게 제조된 챔버로부터의 원심분리된 상청액; 3/ GL261 세포로부터 제조된 엑소솜. 이들 항원 제제를 종양 항원 나이브 마우스로부터의 수지상 세포에 첨가하고, 이어서 GL261 면역 마우스의 비장으로부터 단리된 CD4 T 세포에 첨가하거나 T 세포에 첨가하기 전에 밤새 인큐베이션하여 항원 프로세싱 및 제시를 가능하게 하였다. T 세포 항원 및 수지상 세포의 24시간 공동배양 후, IFNγ-생성 CD4 T 세포의 수를 Elispot 검정으로 정량하였다. 챔버 내용물을 다양한 희석에서 GL261 엑소솜과 비교하였다. Elispot 결과는, 항원 제시로 검정된 24시간 PBS 인큐베이션으로부터 회수된 챔버 내용물만이 강력한 IFN-γ 반응을 나타내었다. 수지상 세포가 사전 인큐베이션 없이 포함된 이식된 챔버 및 대조군 Elispot 검정은 엑소솜과 유의한 차이를 나타내지 않았다. 이들 데이터는 TME로부터 유래되는 항원이 사실상 엑소솜이 아니며, 종양 세포 및 IGF-1R AS ODN을 함유하는 조사된 챔버에서 가장 풍부하게 생성되며, 이식 동안 소비되며, DC에 의한 항원 제시를 필요로 한다는 것을 나타낸다. 결과가 도 13에 요약되어 있다.
실시예 7
M2 단핵구/대식세포 분극화에 대한 이상 용량 반응
생체내에서 M2 분극화를 억제하는 NOBEL IGF-1R AS-ODN의 최적 용량을 결정하기 위해, C57BL/6 마우스의 옆구리 106개의 GL261 세포를 주사하였다. 20일 후, 마우스에 복강내로 단일 0.75 또는 0.075 mg 용량의 NOBEL IGF-1R AS-ODN을 제공하였다. 이어서, 종양 발생에 대해 마우스를 추적하였다.
생체내 M2 생성에 대한 NOBEL 안티센스의 용량 적정은 역설적 이상 반응을 나타내었다. 용량-추적 적정의 양극단의 용량은 M2 단핵구 녹다운을 초래한 반면, 중간 용량은 실제로 M2 단핵구 생성을 자극하였다. US 2017/0056430에서, 4 mg의 단일 용량이 유사한 실험에서 매우 효과적임을 밝혔다. 본 실험에서는, 0.75 mg의 중간 용량은 예기치 않게 덜 효과적인 반면, 0.075 mg의 단일 용량은 매우 효과적이었다(도 17). 어떠한 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 제한되거나 구속되거나 구애됨이 없이, 우리는 이상 효과가 NOBEL 서열의 면역자극 속성의 결과일 수 있다고 가정한다.
AS ODN에 의한 단핵구 분극화의 억제를 위한 유효 용량은 왓슨-크릭 염기쌍 규칙에 따라 IGF-1R 해독을 하향조절하는 데 필요한 용량보다 상당히 낮다. 특히, 마우스당 0.075 mg 용량과 동등한 시험관내 용량은 이미 IGF-1R을 발현하는 세포에 대해 영향이 없다. 인간 단핵구로의 시험관내 적정 실험은 분극화된 M2 단핵구의 표현형 또는 기능에 영향을 주는 것과 대조적으로 분극화를 방지하기 위한 IGF-1R AS-ODN 처리 능력에 실질적인 차이를 나타낸다.
도 14에 도시되는 바와 같이, 가장 낮은 용량은 가장 높은 용량과 동일한 효능을 달성하며, 이는 NOBEL 안티센스와 M2 생성 사이의 복잡한 역학을 제시한다. DC 활성화에 대한 단상 반응에 기초하여, 이상적 챔버 용량은 최대 DC 활성화의 포인트일 것이다.
실시예 8
NOBEL에 의한 단핵구 분극화 억제를 위한 용량 반응 곡선
우리는 이식된 챔버 밖으로 국소적으로 실현 가능하게 확산되는 총 농도 범위의 수준에 대해 NOBEL 안티센스 적정을 수행하였다.
도 15에 도시되는 바와 같이, 3개의 정상 PBMC 수집물로부터 동종이계 나이브 단핵구를 밤새 교모세포종을 갖는 환자로부터 입수한 6개의 상이한 혈청과 함께 상이한 농도의 IGF-1R 특이적 AS-ODN(NOBEL)의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다. 각각의 칼라 점은 개별 교모세포종 환자로부터의 혈청을 나타낸다. CD163을 포함하는 마커의 발현은 유동 세포측정으로 평가하였다. CD163 발현 수준은 형광 컨쥬게이션된 CD163 항체로 염색된 세포의 평균 형광 지수로 제시된다.
각각의 환자의 혈청은 IGF-1R 및 PDL-1 둘 다의 상향조절로 M0 단핵구를 M2 CD163 표현형으로 분화시켰다. 환자 혈청 없이 배양된 MO 세포(대조군)는 매우 낮은 CD163 수준을 유지한 반면, 혈청 중에서 밤샌 인큐베이션은 이 M2 마커의 발현을 강하게 유도하였다(비처리군). IGF-1R 특이적 AS-ODN의 배양 배지에의 첨가는 용량 의존적 방식으로 CD163의 상승된 발현에 의해 지시되는 바와 같이 M0-M2 분극화를 억제하였다. 우리는 100 pg에서 시작하여 1 μg에서 상당한 억제 수준에 도달하는 하향 추세에 주목하였다. 이들 데이터는 챔버 밖으로 확산하는 과도한 안티센스가 선청성 면역의 초기 단계에서 Th1 반응의 개시를 촉진할 있다는 것을 확증한다.
실시예 9
CL261 신경아교종 세포로 이식된 마우스에서 항-염증 M2 단핵구의 출현 방지
GL261 신경아교종 세포로 이식된 C57BL/6 마우스는 상승된 수의 순환 CD163 발현 M2 단핵구와 병행하여 종양을 발생시킨다. 우리는 신경아교종 세포가 단핵구 모집 및 M2로의 분극화를 초래하는 인자를 생성한다고 가정하였다. 이어서, 이들 세포는 종양 조직을 침투하여 그들의 생성물은 종양 진행을 촉진한다. IGF-1R AS-ODN으로의 전신 치료는 M2 세포의 출현을 방지함으로써 종양 형성을 억제할 수 있다.
C57BL/6 마우스의 옆구리에 106개의 GL261 세포를 이식하고, 20일 후 복강내로 또는 정맥내로 단일 용량의 4 mg NOBEL IGF-1R AS-ODN을 제공하였다. 14일 후 동물로부터 말초 혈액을 입수하고, 순환 단핵구를 CD163 발현에 대해 유동 세포측정으로 평가하였다. 도 18은 CD163을 발현하는 세포 수의 히스토그램을 도시하며(우측 피크), "비히클" 표시된 라인은 PBS 비히클로 처리된 이식된 마우스를 나타내고 "AS-ODN" 표시된 라인은 AS-ODN으로 처리된 이식된 마우스를 나타낸다. 데이터는 CD163+ 세포가 현저히 감소한다는 것을 나타낸다(자료 나타내지 않음). CD204 또는 CD206을 발현하는 세포의 출현이 유사하게 억제되었다(자료 나타내지 않음). 정상의 비이식된 마우스로부터의 말초 혈액은 높은 CD163, CD204 또는 CD206 수준을 갖는 세포를 함유하지 않았다(자료 나타내지 않음).
실시예 10
신경아교종 세포가 옆구리에 이식된 마우스의 전신적 IGF-1R AS-ODN 처리는 종양 발생을 예방한다.
C57BL/6 마우스의 옆구리에 106개의 GL261 세포를 이식하고, 순환 CD163-양성 단핵구가 출현하기 전에 20일 후 복강내로 또는 정맥내로 단일의 4 mg 용량의 NOBEL IGF-1R AS-ODN을 제공하였다. 또 다른 C57BL/6 마우스 그룹에 대조군으로 PBS를 주사하였다. 이어서, 종양 발생에 대해 마우스의 두 그룹 모두를 추적하였다. 도 19에 도시되는 바와 같이, 처리된 그룹과 비처리된 그룹 사이의 종양 발생률은 상당히 상이하였으며(* = p < 0.05), NOBEL-처리된 마우스가 종양이 없는 상태로 남아 있을 가능성이 훨씨 더 높았다.
실시예 11
옆구리 신경아교종 종양 성장의 전신적 IGF-1R AS-ODN 억제는 항종양 면역에 대해 독립적이다.
Tbet는 T-세포 연관된 전사 인자이며, Tbet 결핍 마우스는 항-신경아교종 면역을 개시할 능력이 결여된다. 옆구리 신경아교종 종양 성장의 IGF-1R AS-ODN 억제가 항종양 면역에 대해 독립적인지를 시험하기 위해, C57BL/6 배경의 Tbet 결핍 마우스의 옆구리에 106개의 GL261 세포를 이식하고, 20일 후 복강내로 또는 정맥내로 단일 4 mg 용량의 NOBEL IGF-1R AS-ODN을 제공하였다. 이어서, 종양 발생에 대해 마우스를 추적하였다.
도 20에 도시되는 바와 같이, PBS로 처리된 마우스와 NOBEL IGF-1R AS-ODN으로 처리된 마우스 사이의 종양 발생률은 Tbet 결핍 마우스가 치료적 항-신경아교종 면역을 개시할 능력이 없음에도 불구하고 상당히 상이하였다(* = p < 0.05).
실시예 12
NOBEL로 챔버 내의 네스틴+ 줄기 세포 표적화
우리는 네스틴+ 줄기 세포가 시험관내에서 NOBEL 안티센스에 의해 용량 의존적 방식으로 녹다운될 수 있으며 또한 이들 세포가 자가 세포 백신 후 TME로부터 제거된다는 것을 밝혔다(시험 14379-101, 미공개 관찰). 줄기 세포는 신경아교종 종양 미세환경(TME)의 일부이므로, 이들을 선택적으로 녹아웃시키는 것은 명백한 치료적 이점을 갖는다. 배아 방사상 아교세포를 지지하는 형태로, 이들 세포는 그들의 디자인 및 긴 과정에 의해 뇌 전체에 걸쳐 신경아교종 세포의 배치를 가능하게 하는 스캐폴딩으로서 역할을 할 수 있다. CD163 TAM과 함께 이들을 제거하면 이들 종양의 침습적 특성 및 종양 성장 자체를 역전시킬 수 있다. 챔버에서 표적 가능한 세포로서, 이들 세포로부터의 항원은 기원이 배아이므로 매우 면역원성이고 종양-특이적일 수 있다. 네스틴은 주로 신경 전구체/줄기 세포에서 발현되며, VI형 중간 필라멘트로서 세포질에 위치한다. 또한 신경아교종 줄기 세포의 표면 단백질 및 바이오마커로서 확인되었다. 따라서, 이 집단을 비드-선별하고 농축함으로써 챔버의 향염증 역가를 증가시킬 수 있을 것이다(Jin et al., “Cell surface Nestin is a biomarker for glioma stem cells,” Biochem Biophys Res Commun. 2013 Apr 19;433(4):496-501).
실시예 13
챔버 제형에 대한 조사의 영향
완전히 제형화된 챔버의 제조 동안, 자가 종양 세포(즉 새로 절제된 종양 조직)를 혈청-비함유 배양물에 배치하고, 임의적으로 제1 양의 IGF-1R AS ODN으로 처리하고, 후에 생체외 조사로 처리한다(도 1f 및 1g). 제2 양의 IGF-1R AS ODN을 조사 전에 챔버에 첨가한다.
자가 백신접종은 종양으로부터 떨어진 부위에서 이식 전에 배합 생성물의 조사를 포함하고 우리의 데이터는 종양 퇴행을 갖는 면역 반응을 지지하므로, 이들 데이터는 새로운 압스코팔(abscopal) 효과를 지지한다. 전형적으로, 압스코팔 효과는 표적된 종양의 제자리 방사선 후 항종양 면역의 활성화에 기인하며, 이는 방사선으로부터 떨어진 부위에서 종양 퇴행을 이끈다. 이 특정 제형에서, CpG 모티프를 갖는 외인성 안티센스의 챔버에의 첨가 및 감마-방사선조사에 의한 후속 처리는 기억 T-세포의 활성화, 증식 및 생존에 관여하는 유전자를 상향조절하는 것으로 나타났다. 이러한 제형은 또한 Treg의 생성 및 면역 관용의 유도에 관여되는 유전자의 활성화를 방지한다. 추가로, IGF-1R의 하향조절은 이 표면 수용체를 과발현하는 세포를 방사선증감시킨다. IGF-1R AS ODN과의 공동인큐베이션도 표적된 종양 세포(단지 생체내에서만) 및 종양-연관된 M2 대식세포의 아폽토시스를 촉진한다. 5 Gy로의 조사는 모든 캡슐화된 세포의 죽음을 초래하고 죽어가는 종양 세포로부터 방출되는 종양 항원의 제시를 증가시키는 위험/손상-연관된 분자 패턴(또는 DAMPS)로 공지된 내인성 위험 신호의 방출을 야기한다.
실시예 14
미래의 챔버 제형을 위한 향염증제를 확인하는 수단으로서의 외식된 챔버
데포 항원 디바이스로 적용 후 회수된 외식된 바이오확산 챔버는 또한 전임상 마우스 모델 및 인간 시험에서 확증된 초기 면역 반응을 기록하는 저장소로서 역할을 한다. 적절한 PBS(더미) 챔버 대조군을 사용하는 챔버 내용물의 특징분석은 호스트 면역 반응(더미 대조군을 능가하는 사이토카인/케모킨의 확산) 및 챔버 내 세포에 의한 사이토카인/케모킨/DAMPS의 생성(더미 챔버에서는 검출 불가능) 둘 다에 대한 통찰력을 제공한다. 사이토카인 어레이의 일관된 존재는 미래의 제형에 대한 이들 사이토카인의 외인성 첨가를 알려준다. 예로써, CCL21 및 CXCL은 둘 다 PBS 챔버에 비해 백신 챔버에서 상승되고, CpG 애주번트와 상승작용하고, 백신접종 패러다임에서 DC의 이동 및 T 세포 자극 능력을 증진시킨다. 도 16 및 17을 참조한다. 이들 사이토카인의 챔버 제형에 대한 외인성 첨가는 초기 Th-1 반응을 증진시킨다.
실시예 15
챔버에서 세포 대 IGF-1R AS ODN의 최적 비는 더 높은 사이토카인 값을 이끈다
환자를 각각 조사된 종양 세포 및 AS NOBEL ODN(2 μg)을 함유하는 20개의 챔버로 48시간 동안 백신접종하였다. 각각의 경우에, 환자는 또한 의무적인 토마스 제퍼슨 대학 병원(TJUH) 표준 치료(SOC) 요법을 받았다. 환자를 무진행 생존(P-FS)(즉, 생존하고 암의 발생 또는 완화를 나타내지 않는 환자) 및 특정 시점에서의 전체 생존(OS)를 결정하기 위해 추적하였다. 도 21a-c는 특정 시점에서의 반응을 도시한다. 도 24-27는 환자의 결과를 도시하며, 치료된("백신접종된") 환자 대 과거 표준 치료("SOC") 환자를 비교한다. 챔버에서 세포 대 IGF-1R AS ODN의 최적 비를 결정하기 위해, 우리는 백신접종 후 환자의 혈청에서 향염증 사이토카인 수준을 측정하고 이들 사이토카인 수준을 각각의 환자로부터 제거된 종양 조직의 세포수와 비교하였다.
먼저, 도 21a-c에 도시되는 바와 같이, 향염증 사이토카인에서 상당한 용량 의존적 증가가 환자 혈청에서 관찰되었다. IFN-γ의 전체 수준은 가장 높은 용량 코호트에 대해 상당히 크게 상승되었다. IL12 및 TNFa의 수준도 이 코호트에서 상승되었다.
각각의 환자에 대한 14-42일의 3개의 사이토카인 값 각각을 모으고, IFNγ, IL12 및 TNFa 평균 값에 대해 플로팅하였다. 4 및 5의 유사한 정도 피트를 갖는 2개의 다항식 플롯은 피크 향염증 사이토카인 값을 나타내었다(도 21d-f). 도 24a 및 24b는 치료 의향 그룹 전체에서 무진행 생존 및 전체 생존을 나타내는 카플란-마이어 곡선을 도시한다. 백신접종된 환자에서, 약 35% 이상의 환자가 생존하였으며, 20개월에 무진행이었다. 대조적으로, SoC-처리된 환자의 10% 미만이 20개월에 무진행을 나타내었다. 전체 생존율은 유사하게 크게 개선되어 약 40%의 환자가 25개월에 생존한 반면, SOC-처리는 그 시점에 약 5% 생존을 보인다(도 24b).
도 25a 및 25b는 중앙값 연령이 61.5세이고 여성/남성 수가 12/18이도록 일치된 환자에 대한 생존 데이터를 도시한다. 다시, 데이터는 다양한 시점에서 상당히 개선된 생존을 나타낸다.
시험 동안, 일부 환자는 프로토콜에서 탈퇴하고 다른 환자는 관련이 없는 원인으로 사망하였다. 도 26a 및 26b는 이들 탈퇴된 환자 또는 다른 원인으로 사망한 환자로부터의 데이터가 없는 생존 데이터를 도시한다. 다시, 백신접종된 환자는 상당히 잘 해낸다. 특정 환자는 표준 치료를 완수할 수 없었다. 이들 환자를 배제한 데이터가 도 27a 및 27b에 도시된다. 이들 데이터는 백신접종 접근법이 표준 치료 프로토콜을 따를지 않을 때 효과적임을 확증한다.
도 28a 및 28b는 환자 반응에 대한 세포 수의 용량 효과를 도시한다. IFN-γ 수준은 대상체 반응에 대응한다. 더 높은 IFN-γ 수준은 더 우수한 환자 면역 반응 및 따라서 항종양 반응과 연관된다. 여기서, 우리는 세포의 정확한 적정을 결정함으로써 그 반응을 최적화하였다. 피크 반응은 약 20 마크(mark), 즉 20개 챔버로 나눠지는 20,000,000개 세포이다. 따라서, 피크 반응은 약 1,000,000개 세포/챔버이고, 우수한 반응은 각각 20개 챕버에 나눠지고 이식되는 약 15,000,000 내지 25,000,000개 세포로 얻어진다; 즉, 750,000개 세포 내지 1,250,000개 세포/챔버의 범위이다. 이들 데이터는 최적화된 백신접종 프로토콜의 효율을 증명한다.
실시예 16
네스틴 발현에 대해 농축된 세포 집단으로의 백신접종에 의해 매개되는 증진된 항종양 반응
챔버에서 IGF-1R-처리된 신경아교종 세포에 의한 항원 생성은 챔버 패러다임을 이용하여 면역화된 C57BL/6 마우스로부터 단리된 신경아교종-면역 T 세포를 사용하여 생체외에서 시험되었으며 항원의 존재를 검출하기 위해 유사유전자형 GL261 세포로 두개내 챌린지되었다. 면역 T 세포의 공여자로서 역할을 하는 마우스를 하기와 같이 면역화하였다: GL261 세포 및 안티센스로 채워진 완전히 제형화된 챔버를 24시간 동안 옆구리에 이식하였다. 안티센스 활성에 대한 대조군으로 단지 세포만 있고 안티센스가 없는 챔버를 이식하였다. 마우스를 실험 동안 내내 채혈하고, 혈청을 GL261 세포에 대한 항체 반응성에 대해 시험하였다(도 30c, 30d). 챔버-이식 후 35일에, 마우스에 GL261 세포를 두개내로 정위적으로 챌린지하였다. 별개의 마우스 그룹에 대한 생존 및 임상적 질환 징후를 챌린지 후 적어도 40일 동안 모니터링하였다. 생존 및 임상적 질환 스코어가 각각 도 30a 및 30b에 도시된다.
CD4+ T 세포를 자성 비드를 사용하여 면역화된 마우스의 비장으로부터 단리하였다. 면역 CD4 T 세포에 대한 항원을 제시하는 데 사용되었던 나이브 수지상 세포(DC)를 자가 비면역 C57BL/6 마우스의 골수로부터 단리하였다. DC를 상이한 조건 하에서 밤새 챔버에서 배양된 GL261 세포로부터 회수된 GL261 항원과 함께 밤새 배양하여 펄싱함으로써, 유사한 챔버가 대상체에게 이식될 때 항원 생성과 관련하여 일어나는 일을 반영하였다. 챔버는 GL261 세포 단독 또는 GL261을 포스페이트 완충된 식염수(PBS) 중의 3개의 상이한 용량의 안티센스와 함께 함유하였다. 안티센스 함량 또는 챔버에서 안티센스의 효과가 최적 항원 생성에 책임이 있는지를 결정하기 위해 상이한 용량의 안티센스를 안티센스 없이 배양된 G261 세포로부터의 항원 제제에 첨가하였다. 항종양 세포 면역의 주요 척도인 것으로 믿어지는 IFNγ 생성을, 도 29a에 도시되는 바와 같이, ELISPOT 검정에 의해 정량화되는 반응 세포의 특정 수와 함께, T 세포 활성화에 대한 다양한 항원 제제의 자극 효과를 평가하는 데 사용하였다.
항원 생성을 자극하기 위해, 우리는 생체내 임상적 챔버 패러다임을 따랐다. 약 1,000,000개의 생체외 GL261 종양 세포를 챔버에 단독으로 또는 지시된 안티센스 농도와 함께 주입하고, PBS 중에 배치된 챔버에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 챔버 내용물을 추출하고 나이브 수지상 세포를 펄싱하는 데 사용하였다. 안티센스로 밤새 처리되지 않은 챔버 내용물을 지시된 양의 NOBEL과 함께 수지상 세포에 첨가하였다. 수지상 세포를 또한 대조를 위해 나이브하게 두었다. 항원으로 밤새 펄싱한 후, 수지상 세포를 수집하고, 사이토카인 IFNγ에 대한 ELIPSPOT 검출 항체로 코팅된 세포 배양 플레이트에서 면역화된 동물로부터의 T 세포와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 코팅된 플레이트를 처리하고 전개시켜 각각의 개별 항원에 대해 반응된 IFNγ-생성 T-세포의 수를 열거하였다.
도 29b에 도시되는 바와 같이, 종양 항원은 GL261 세포 + 안티센스를 함유하는 챔버로부터 회수된 물질에서는 검출되었으나, 세포 단독으로 배양된 챔버로부터의 물질에서는 비록 안티센스가 DC가 펄싱될 때 물질에 첨가되더라도 검출되지 않았다. 이는 챔버에서 신경아교종 세포와 함께 안티센스의 존재가 면역자극 종양 항원을 생성하는 데 필요하다는 것을 증명한다.
안티센스로의 밤샌 처리의 영향을 시험하기 위해, 우리는 또한 세포를 챔버에 첨가하기 전에 세포를 4 mg의 안티센스와 함께 인큐베이션하였다. GL261 세포를 페트리 접시에 플레이팅하고, 4 mg NOBEL/1,000,000개 세포와 함께 밤새 처리하거나 처리하지 않은 채로 두었다. 이어서, 세포를 수집하고, 1,000,000개 세포 및 2μg NOBEL/챔버로 챔버에 배치하였다. 이어서, 챔버를 밤새 PBS 중에서 인큐베이션하고, 다음날 내용물을 추출하였다. 이어서, 수지상 세포를 챔버 내용물로 펄싱하고, IFNγ 분비를 상술된 바와 같이 측정하였다.
도 29c에 도시되는 바와 같이, 안티센스와 함께 GL261 세포의 밤샌 처리는, DC가 4 mg 안티센스로 밤새 처리된 GL261 세포로 펄싱될 때 IFNγ를 생성하는 종양-면역 T 세포수의 증가로 검출되는 바와 같이, 이들 세포에 의해 생성되는 항원의 양을 증진시킨다.
네스틴을 발현하는 신경아교종 종양 세포 서브세트가 증진된 면역원성과 연관되는지를 결정하기 위해, 마우스를, 더 높은 단백질 네스틴 수준 대 더 낮은 단백질 네스틴 수준을 초래하는 조건 하에서 성장된 GL261 세포를 함유하는, IMV-001(NOBEL) 안티센스를 갖거나 또는 갖지 않는, 챔버로 면역화시켰다. GL261 신경아교종 세포의 후속 두개내 이식에 대한 장기간 보호(도 30a, 30b) 및 마우스에 의한 GL261 항체 생성(도 30c, 30d)이 평가되었다.
높은 수준의 네스틴 및 안티센스와 함께 GL261 세포를 함유하는 챔버는 안티센스 없이 유사한 세포를 갖는 챔버 또는 안티센스가 포함되는지의 여부에 무관하게 낮은-네스틴 GL261을 갖는 챔버보다 상당히 우수한 면역 보호를 유도하였다. 높은 네스틴 수준을 발현하는 챔버에 포함된 GL261 세포도 낮은 네스틴 수준을 함유하는 것보다 마우스에서 GL261-특이적 항체 생성을 유도하는 데 우수하였다. 그러나, 항체 생성과 관련하여, 안티센스의 포함은 최소한의 영향을 끼쳤다.
참조에 의한 포함
본원에 언급된 모든 특허 및 공개물은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Andrews, David W. Hooper, Douglas C. <120> Methods and Compositions for Treating Cancers Using Antisense <130> IMVX-005/02WO 327398-2026 <150> US 62/629,972 <151> 2018-02-13 <150> US 62/469,003 <151> 2017-03-09 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOBEL phosphorothioate AS ODN <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> May be joined by a phosphorothioate linkage <400> 1 tcctccggag ccagactt 18 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Insulin-like Growth Factor Receptor (IGF-1R) antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) <400> 2 ttctccactc gtcggcc 17 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Insulin-like Growth Factor Receptor (IGF-1R) antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) <400> 3 acaggccgtg tcgttgtc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Insulin-like Growth Factor Receptor (IGF-1R) antisense oligodeoxynucleotide (AS-ODN) <400> 4 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uccugcaugc acucgccguc 120 guggaucaca aaccccucgg agucgcugcu cucggcgcug aggauguugg cgcagaaguc 180 acgguccaca cagcgccagc ccucaaaccu guagguguug ggcgggcagg caggcacaca 240 gacaccggca uaguaguagu ggcggcaagc uacacaggcc gugucguugu caggcgcgcu 300 gcagcugccc aggcacucgg gguggcagca cucauuguuc ucggugcacg cccgcuuccc 360 acacgugcuu gggcacauuu ucuggcagcg guuugugguc cagcagcggu aguuguacuc 420 auuguugaug guggucuucu cacacaucgg cuucuccucc auggucccug gacacagguc 480 cccacauucc uuugggggcu uauuccccac aauguaguua uuggacaccg cauccaggau 540 cagggaccag uccacagugg agagguaaca gaggucagca uuuuucacaa uccugauggc 600 cccccgagua auguuccuca gguuguaaag cccaauaucc uugagauugg ucaucucgaa 660 gaugaccagg gcguaguugu agaagaguuu ccagccgcgg augaccguga gguuggggaa 720 gaggucuccg aggcucucga ggccagccac ucggaacagc agcaaguacu cgguaaugac 780 cgugagcuug gggaagcggu agcugcggua guccucggcc uuggagauga gcaggaugug 840 gagguagccc ucgaucaccg ugcaguucuc caggcgcuuc agcugcugau agucguugcg 900 gaugucgaug ccuggcccgc agauuuc 927 <210> 19 <211> 4104 <212> DNA 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ggaccgtgac 840 ttctgcgcca acatcctcag cgccgagagc agcgactccg aggggtttgt gatccacgac 900 ggcgagtgca tgcaggagtg cccctcgggc ttcatccgca acggcagcca gagcatgtac 960 tgcatccctt gtgaaggtcc ttgcccgaag gtctgtgagg aagaaaagaa aacaaagacc 1020 attgattctg ttacttctgc tcagatgctc caaggatgca ccatcttcaa gggcaatttg 1080 ctcattaaca tccgacgggg gaataacatt gcttcagagc tggagaactt catggggctc 1140 atcgaggtgg tgacgggcta cgtgaagatc cgccattctc atgccttggt ctccttgtcc 1200 ttcctaaaaa accttcgcct catcctagga gaggagcagc tagaagggaa ttactccttc 1260 tacgtcctcg acaaccagaa cttgcagcaa ctgtgggact gggaccaccg caacctgacc 1320 atcaaagcag ggaaaatgta ctttgctttc aatcccaaat tatgtgtttc cgaaatttac 1380 cgcatggagg aagtgacggg gactaaaggg cgccaaagca aaggggacat aaacaccagg 1440 aacaacgggg agagagcctc ctgtgaaagt gacgtcctgc atttcacctc caccaccacg 1500 tcgaagaatc gcatcatcat aacctggcac cggtaccggc cccctgacta cagggatctc 1560 atcagcttca ccgtttacta caaggaagca ccctttaaga atgtcacaga gtatgatggg 1620 caggatgcct gcggctccaa cagctggaac atggtggacg tggacctccc 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Claims (51)

  1. 암을 갖는 대상체로 이식하기 위한 바이오확산 챔버의 제조 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 얻은 종양 세포를 IGF-1R AS ODN의 존재 하에서 바이오확산 챔버로 캡슐화하는 단계로서, 챔버 내의 종양 세포 대 IGF-1R AS ODN의 비는 약 3.75 x 105개:1 μg 내지 약 6.25 x 105개:1 μg의 범위이고, 종양 세포는 조직 모실레이터를 사용하여 대상체로부터 얻은 것인 단계; 및
    (b) 바이오확산 챔버를 조사하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 종양 세포를 챔버 내에 캡슐화하기 전에 종양 세포가 분산되는 것인 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 대상체로부터 제거되는 동안 체온보다 높은 온도에 노출되지 않는 것인 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체로부터 제거되는 동안 37℃보다 높은 온도에 노출되지 않는 것인 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 모실레이터가 멸균 트랩을 포함하는 것인 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 모실레이터가 고정형 외부 캐뉼라 내에 고속 왕복형 내부 캐뉼라를 포함하는 것인 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 외부 캐뉼라가 측면 개구를 포함하고, 추가로 종양 세포가 전자적으로 제어되는 가변 석션에 의해 측면 개구로 흡인되는 것인 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포가 바이오확산 챔버로 배치되기 전에 네스틴 발현에 대해 농축되는 것인 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 챔버 내의 종양 세포가 대상체로부터 얻은 종양 세포와 비교하여 부착성 세포에 대해 농축되는 것인 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 종양 세포가 부착성 세포로 본질적으로 이루어지는 것인 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 챔버로의 캡슐화 전에 IGF-1R AS ODN으로 처리되는 것인 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, IGF-1R AS ODN이 캡슐화 전의 처리 시 1,000,000개 세포당 약 2 mg 내지 약 6 mg으로 존재하는 것인 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, IGF-1R AS ODN이 캡슐화 전의 처리 시 1,000,000개 세포당 약 4 mg으로 존재하는 것인 제조 방법.
  14. 제11항에 있어서, 캡슐화 전 IGF-1R AS ODN으로의 처리가 최대 약 18시간 동안 행해지는 것인 제조 방법.
  15. 제11항에 있어서, 캡슐화 전 IGF-1R AS ODN으로의 처리가 약 12시간 내지 약 18시간 동안 행해지는 것인 제조 방법.
  16. 제1항에 있어서, IGF-1R AS ODN이 서열번호 1의 서열을 갖는 것인 제조 방법.
  17. 제1항에 있어서, 챔버 내의 IGF-1R AS ODN이 약 2 μg으로 존재하는 것인 제조 방법.
  18. 제1항에 있어서, 조사되는 종양 세포가 챔버당 약 750,000개 내지 약 1,250,000개의 범위로 존재하는 것인 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 조사되는 종양 세포가 챔버당 약 1,000,000개로 존재하는 것인 제조 방법.
  20. 제1항에 따른 2개 이상의 바이오확산 챔버를 암을 갖는 대상체로 이식하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 약 10개 내지 약 30개의 바이오확산 챔버가 대상체로 이식되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 약 10개 내지 약 20개의 바이오확산 챔버가 대상체로 이식되는 것인 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 확산 챔버가 약 48시간 동안 대상체로 이식되는 것인 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 뇌암인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 뇌암이 등급 II 별아교세포종, 등급 AIII 별아교세포종, 등급 AIII-G 별아교세포종 및 등급 IV 별아교세포종(다형성 교모세포종)으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 뇌암이 등급 IV 별아교세포종(다형성 교모세포종)인 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법 없이, 방사선 요법 없이 또는 둘 다 없이 수행되는 방법.
  28. 제20항에 있어서, 1차 이식에 이어서 2차 챔버 이식을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 2차 이식이 1차 투여로부터 얻은 종양 세포와 동시에 대상체로부터 얻은 종양 세포를 사용하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 2차 이식이 1차 치료가 완료되고 종양이 재발되거나 1차 치료에 반응하지 않은 후에 대상체로부터 얻은 종양 세포를 사용하는 것인 방법.
  31. 뇌암을 갖는 대상체를 백신접종하는 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 세절된 종양 조직을 얻는 단계;
    (ii) 세절된 조직을 멸균 트랩에 수집하는 단계;
    (iii) 세절된 조직으로부터 부착성 세포를 수거하는 단계;
    (iv) 수거된 세포를 서열번호 1의 서열을 갖는 인슐린 유사 성장 인자 수용체-1 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(IGF-1R AS ODN)와 함께 바이오확산 챔버에 캡슐화하는 단계로서, 챔버는 약 750,000개 내지 약 1,250,000개의 종양 세포를 포함하는 것인 단계;
    (v) 챔버를 조사하는 단계; 및
    (vi) 챔버를 대상체에 이식하는 단계
    를 포함하고,
    뇌암에 대한 면역 반응이 얻어지는 것인 백신접종 방법.
  32. 제31항에 있어서, 부착성 세포를 캡슐화 전 최대 18시간 동안 IGF-1R AS ODN으로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 대상체가 약 48시간 동안 20개의 챔버로 백신접종되는 것인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 챔버 내의 종양 세포 대 AS ODN의 비가 약 3.75 x 105개 세포:1 μg AS ODN 내지 약 6.25 x 105개 세포:1 μg AS ODN의 범위인 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, IGF-1R AS ODN이 약 1 μg 내지 약 5 μg으로 존재하는 것인 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, IGF-1R AS ODN이 약 2 μg으로 존재하는 것인 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포가 체온보다 높은 온도에 노출되지 않는 것인 방법.
  38. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 약 106개의 종양 세포가 챔버 내에 존재하는 것인 방법.
  39. 제31항에 있어서, 뇌암이 등급 II 별아교세포종, 등급 AIII 별아교세포종, 등급 AIII-G 별아교세포종 및 등급 IV 별아교세포종(다형성 교모세포종)으로부터 선택되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 뇌암이 등급 IV 별아교세포종(다형성 교모세포종)인 방법.
  41. 뇌암을 갖는 대상체로 이식하기 위한 바이오확산 챔버로서,
    (a) 조사된 종양 세포; 및
    (b) 조사된 IGF-1R AS ODN
    을 포함하고,
    종양 세포는 대상체의 종양 조직으로부터 얻은 부착성 세포를 포함하고,
    종양 세포는 챔버 내로의 캡슐화 전 인슐린 유사 성장 인자 수용체-1 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(IGF-1R AS ODN)와 함께 사전 인큐베이션되고,
    IGF-1R AS ODN은 서열번호 1의 서열을 갖고,
    챔버 내의 종양 세포 대 IGF-1R AS ODN의 비는 약 3.75 x 105개 세포:1 μg AS ODN 내지 약 6.25 x 105개 세포:1 μg AS ODN의 범위인 바이오확산 챔버.
  42. 제41항에 있어서, IGF-1R AS ODN이 약 1 내지 약 5 μg으로 존재하는 것인 바이오확산 챔버.
  43. 제41항에 있어서, IGF-1R AS ODN이 약 2 μg으로 존재하는 것인 바이오확산 챔버.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 챔버 내의 종양 세포가 대상체로부터 얻은 종양 조직과 비교하여 네스틴 양성 세포에 대해 농축되는 것인 바이오확산 챔버.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 약 106개의 종양 세포가 챔버 내에 존재하는 것인 바이오확산 챔버.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포가 조직 모실레이터를 사용하여 대상체로부터 얻은 것인 바이오확산 챔버.
  47. 제46항에 있어서, 조직 모실레이터가 고정형 외부 캐뉼라 내에 고속 왕복형 내부 캐뉼라를 포함하는 것인 바이오확산 챔버.
  48. 제47항에 있어서, 외부 캐뉼라가 측면 개구를 포함하고, 추가로 종양 세포가 전자적으로 제어되는 가변 석션에 의해 측면 개구로 흡인되는 것인 바이오확산 챔버.
  49. 제46항에 있어서, 조직 모실레이터가 종양 조직을 대상체로 얻을 때 열을 발생시키지 않는 것인 바이오확산 챔버.
  50. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포가 챔버 내에 약 750,000개 내지 약 1,250,000개의 범위로 존재하는 것인 바이오확산 챔버.
  51. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 챔버 내의 종양 세포 대 AS ODN의 비가 약 5.0 x 105개 세포:1 μg인 바이오확산 챔버.
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