KR20190130237A - 발효 유사세라마이드, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 미생물을 이용한 이의 제조방법 - Google Patents

발효 유사세라마이드, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 미생물을 이용한 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물성오일을 기질로 사용하여 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P)에 의하여 생산된 발효물을 제공하며, 상기 발효물에는 발효 유사세라마이드, 발효 유화물질, 불포화지방산 등이 포함되어있고, 그 외 다양한 대사산물이 존재할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 발효를 통하여 오일 내 용해도가 향상된 유사 발효세라마이드를 제공함으로써 피부 외용제 또는 화장료 조성물에 고농도로 용이하게 적용시킬 수 있다. 또한, 유화 안정성, 산화 안정성을 향상시킴으로써 피부세포 독성을 감소시킬 수 있고, 저장성을 향상시킬 수 있다. 또한, 피부 친화력이 높아 보습력을 향상시킬 수 있으며 피부 건조증, 아토피 등과 같은 피부질환을 개선시키고, 주름개선, 피부노화 방지 등에 유용하게 적용할 수 있다.

Description

발효 유사세라마이드, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 미생물을 이용한 이의 제조방법{PSEUDOCERAMIDE, COSMETIC COMPOSITION COMPRISING THEREOF AND PREPARATION METHOD THEREOF USING MICROORGANISM}
본 발명은 발효 유사세라마이드 및 미생물을 이용하여 발효 유사세라마이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 발효 유사 세라마이드를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부는 유해미생물, 물리적 손상, 자외선 등의 외부환경으로부터 신체를 보호하는 피부 장벽으로서의 역할을 수행한다. 또한, 체온과 피부 내 함수량 등을 조절하는 역할을 한다.
피부의 각질층은 세라마이드(ceramide), 콜레스테롤(cholesterol), 지방산 등의 지질복합체로 세포 간 박판(intercellular lamellae) 구조로 이루어져 있다. 세포막을 구성하는 지질의 큰 부류 중 스핑고지질(sphingolipid)은 스핑고신(sphingosine)을 함유하고 있으며, N-아실스핑고신(N-acylsphingosine)을 세라마이드라고 한다.
스핑고지질은 동물, 식물, 효모 및 스핑고모나스(Sphingomonas)를 포함하는 세균으로부터 광범위하게 생성된다. 스핑고지질의 생합성은 세린 팔미토일 트랜스퍼라아제(serine palmitoyltransferase, SPT)에 의하여 전구체인 지방산 CoA 중 하나인 팔미토일 CoA(palmitoyl CoA, C16:0)와 세린(serine)의 축합과정으로 인한 3-케토스핑가닌(3-ketosphinganine)의 생성으로부터 시작된다. SPT는 스핑고지질 생합성을 조절하는 주요 단계의 효소로 알려져 있으며, 주로 기질인 포화지방산의 농도에 의해 효소활성이 결정되어 스핑고지질의 생합성 정도를 조절하게 된다(Hanada K: Serine palmitoyltransferase, a key enzyme of sphingolipid metabolism. Biochim Biophys Acta 1632:16-30, 2003). 생성된 3-케토스핑가닌(3-ketosphinganine)은 케토스핑가닌 환원효소(ketosphinganine reductase)에 의하여 스핑가닌(sphinganine)으로 형성되고 세라마이드 합성효소(ceramide synthase)에 의하여 디하이드로세라마이드(dihydroceramide)가 형성된다. 이어서, 디하이드로 세라마이드 불포화효소(dihydroceramide desaturase)에 의하여 세라마이드(ceramide)가 형성되며 복합 스핑고지질(complex sphingolipids)의 전구체로서의 역할을 하게 된다.
세라마이드로부터 생성되는 스핑고지질 대사체에는 세라마이드 1-인산염(ceramide 1-phosphate), 글루코실세라마이드(glucosylceramide), 스핑고신(sphingosine) 등이 있으며, 이 중 스핑고미엘린 합성효소(sphingomyelin synthase)에 의하여 생성되는 스핑고미엘린(sphingomyelin, SM)과 세라마이드에 대하여 많은 연구가 집중되어 왔다. 일반적으로 세라마이드의 생합성은 신생합성 경로와 스핑고미엘린으로부터 생성되는 스핑고미엘리나아제(sphingomyelinase) 경로가 있다.
피부 내 각질층에 이러한 세라마이드가 부족할 경우 피부건조증, 아토피, 건선과 같은 피부 질환을 야기시키는 것으로 알려져있다.
종래에는 세라마이드를 피부 내에 충족시키기 위하여 천연 세라마이드나 유사 세라마이드 합성물로 개발하여 피부 외용제로 사용할 수 있도록 개발하려는 노력이 계속되고 있다. 그러나, 천연 세라마이드는 고가이며, 용해도가 낮기 때문에 화장품 제형에 고농도로 사용하기에 어려움이 있다. 그렇기 때문에 실질적으로 피부에 효능을 나타낼 수 있는 농도를 적용시키기에는 어려운 실정이다.
동물성 오일 중 마유(horse fat)는 말의 지방조직에서 추출한 기름으로 화장품 원료로 사용되고 있다. 마유는 포화지방산, 불포화 지방산이 사람과 유사하게 분포되어 있어 인체 피부와 매우 친화적이다. 또한, 항염, 보습, 항균, 피부장벽보호, 화상치료 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
마유의 주요 구성 지방산은 포화지방산으로서 팔미트산(palmitic acid) 26~34%, 스테아르산(stearic acid) 3.5~6.1%, 미리스트산(myristic acid) 2.7~5.0%와 단일 불포화지방산으로서 올레산(oleic acid) 33~36%, 팔미톨레산(palmitoleic acid) 4.8~5.8%와 다가 불포화지방산으로서 리놀레산(linoleic acid) 5.7~12.2%, α-리놀레산(α-linoleic acid) 3.2~6.7% 정도를 함유하고 있다. 이와 같이, 마유는 다른 동물성 오일에 비하여 비교적 불포화 지방산이 다량 함유되어 있으며, 특이적으로 식이 불포화지방산으로서 팔미톨레산(palmitoleic acid)과 리놀레산(linoleic acid)이 포함되어 있다.
그러므로 본 발명에서는 사람의 피부와 친화성이 높은 마유와, 빠른 생장률과 자연친화적, 무독성이라는 장점을 지닌 효모를 이용하여 피부에 유용한 지방산, 유사세라마이드, 유화물질 등의 여러가지 복합체를 제조시킬 수 있는 방법 및 제제에 대한 생산 기술을 주제로 하였다.
본 발명은 미생물을 이용하여 발효 유사세라마이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 방법에 따라 제조되는 발효 유사세라마이드에 관한다.
또한, 상기 발효 유사세라마이드를 포함하는 화장료 조성물에 관한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,
Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P, 한국생명공학연구원, 2017.08.17.) 미생물을 활성화시키는 종균배양 단계;
상기 종균배양시킨 미생물 및 동물성 오일을 발효시키는 1차 종균발효 단계;
상기 1차 종균발효물을 계대배양시키는 2차 종균발효 단계 및
상기 2차 종균발효물을 계대배양시키는 본 발효 단계를 포함하는, 발효 유사 세라마이드 제조방법을 제공한다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone) 및 글루코스(glucose)를 포함하고,
상기 1차 종균발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 글루코스(glucose), NH4Cl 및 동물성 오일을 포함하고,
상기 2차 종균발효 단계에서 사용하는 배지는 글리세린(glycerin)을 포함하고,
상기 본 발효 단계에서 사용하는 배지는 동물성 오일, NH4Cl, K2HPO4, KH2PO4 및 MgSO4.7H2O을 포함할 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계, 1차 및 2차 종균발효 단계는 15 내지 35℃의 호기 조건에서 10 내지 30시간 동안 진행되는 것이고,
상기 본 발효 단계는 15 내지 35℃의 호기 조건에서 상기 미생물의 정지기 시점까지 발효시키는 것일 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 정지기 시점까지 발효시키는 단계는 48 내지 100시간 동안 발효시키는 것일 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 본 발효 단계 후 발효물을 정치시켜 상층과 하층을 분리하여 하층을 폐기하고, MgSO4를 첨가하여 교반 후 원심분리하여 미생물 및 수분을 제거하는 단계 및
친화크로마토그라피 컬럼에 규산마그네슘을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물이 제거된 오일을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기와 같은 방법에 따라 제조되는 발효 유사세라마이드를 제공한다.
일구현예에 따르면, 상기 발효 유사세라마이드의 산화질소 생성량은 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 처리한 대조군에 비하여 10 내지 80% 감소할 수 있다.
또한, 콜라겐의 생성을 10 내지 50% 증가시킬 수 있다.
또한, 경피수분 손실을 10 내지 80% 감소시킬 수 있다.
또한, 피부 각질 생성을 10 내지 70% 감소시킬 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 상기와 같은 발효 유사세라마이드를 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 상기 화장료 조성물은 조성물 총 충량에 대하여, 상기 발효 유사세라마이드를 0.0001 내지 20% 포함할 수 있다.
기타 본 발명에 따른 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명은 용해도가 향상된 유사 세라마이드를 제공함으로써 피부 외용제 또는 화장료 조성물에 고농도로 적용시킬 수 있다. 또한, 유화 안정성, 산화 안정성을 향상시킴으로써 피부세포 독성을 감소시킬 수 있고, 보관성을 향상시킬 수 있다. 또한, 발효 유사세라마이드는 천연 세라마이드의 제형상의 한계점을 개선시킬 수 있다. 구체적으로, 천연 세라마이드는 고가이며, 용해도가 낮아 예를 들어 화장품 등의 제형에 고농도로 사용하기에 문제점이 있는데, 이러한 문제점은 천연 세라마이드를 발효 유사세라마이드로 대체함으로써 개선할 수 있다. 그러므로, 제제 또는 제품의 보습력을 향상시킴으로써 피부 건조증, 아토피 등과 같은 피부질환을 개선시키고, 주름개선, 피부노화 등의 기능을 향상시킬 수 있다.
도 1은 시간에 따른 미생물 균체량을 나타내는 그래프이다.
도 2는 비교예 및 실시예에 따른 제제를 육안으로 관찰한 사진이다.
도 3은 TLC 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 MTT 실험에 따른 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 오일의 농도에 따른 산화질소 생성량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 경피 수분 손실도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 피부 내 수분 보유량 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 구현예에 따른 발효 유사 세라마이드, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 미생물을 이용한 이의 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
세라마이드는 피부의 각질층을 구성하는 가장 주요한 지질 성분으로 알려져 있으며, 피부를 보호하는 피부 보호막이라고 불린다. 세라마이드는 수분의 증발을 억제하고, 수분과 결합함으로써 피부의 수분을 유지시키는 기능있으며, 피부의 대사기능을 수행하는데 있어서 최적의 환경을 제공해준다. 즉, 세라마이드가 부족하면 피부 건조증이나 피부장벽 붕괴와 같은 문제점이 발생한다. 그러므로, 세라마이드를 피부에 도포하면, 수분의 증발을 억제시키고, 손상된 피부장벽을 빠르게 복원시킬 수 있다. 또한, 세라마이드는 피부질환을 완화시키고, 주름개선 및 항노화의 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로 건강한 피부를 유지시키는데 도움을 줄 수 있다.
이러한 세라마이드의 장점을 유지시키면서 경제성 및 용해성 등의 단점을 보완하기 위하여 본 발명은, 발효 유사 세라마이드를 제공한다.
일구현예에 따르면, 본 발명에 따른 발효 유사 세라마이드는 미생물에 의하여 발효된 동물성 오일에 포함되는 물질을 의미할 수 있으며, 구체적으로 예를 들어 피토세라마이드(phytoceramdie), 팔미토일 세라마이드(palmitoyl ceramide), 스테아로일 세라마이드(stearoyl ceramide) 등을 포함할 수 있다.
상기 발효 유사 세라마이드는 미생물을 이용하여 동물성 오일을 발효시킴으로써 생성된다. 구체적으로, 상기 미생물은 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P, 한국생명공학연구원, 2017.08.17.)을 사용한다. 칸디다 봄비콜라(Candida bombicola)는 유화물질을 생성할 수 있는 미생물로, 계면활성제와 같은 첨가제의 사용 없이도 오일에 대한 유화율 및 혼화율을 향상시키는 데에 중요한 작용을 함으로써, 피부 흡수력 및 제형 안정성 등을 향상시킬 수 있으므로 친환경적이며 세포에 독성을 최소화시키는 역할을 할 수 있다.
일구현예에 따르면, 동물성 오일은 스쿠알란, 밍크유, 난황유, 타조유, 에뮤유, 마유 등을 포함할 수 있다.
발효 유사 세라마이드를 제조하기 위하여 종균배양단계, 1차 종균발효 단계, 2차 종균발효 단계 및 본 발효 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P, 한국생명공학원구원, 2017.08.17.) 미생물을 활성화시키는 종균배양 단계;
상기 종균배양시킨 미생물 및 동물성 오일을 발효시키는 1차 종균발효 단계;
상기 1차 종균발효물을 계대배양시키는 2차 종균발효 단계 및,
상기 2차 종균발효물을 계대배양시키는 본 발효 단계를 포함하는, 유사 세라마이드 제조방법을 제공한다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone) 및 글루코스(glucose)를 포함할 수 있다. 종균배양 단계에서는 동물성 오일을 첨가하지 않은 기본 배지를 사용함으로써 미생물의 생장에 있어서 대사를 최적화시킬 수 있고, 균체를 최대화시켜 대사산물의 생산 수율을 향상시키고자 하였다.
또한, 상기 1차 종균발효 단계에서 사용하는 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 글루코스(glucose), NH4Cl 및 동물성 오일을 포함할 수 있다.
또한, 상기 2차 종균발효 단계에서 사용하는 배지는 글리세린(glycerin)을 포함할 수 있다. 2차 종균발효 단계에서는 1차 종균발효 단계에 사용된 배지에 포함되어 있던 글루코스를 글리세린으로 대체시킨 배지를 사용함으로써 미생물이 기질을 더욱 효과적으로 이용할 수 있도록 하였고, 발효에 의하여 생산되는 2차 대사산물을 유지시키고 생산 수율을 향상시키고자 하였다.
또한, 상기 본 발효 단계에서 사용하는 배지는 동물성 오일, NH4Cl, K2HPO4, KH2PO4 및 MgSO4.7H2O을 포함할 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 본 발효 단계에서의 배지 조성은 탄소원으로 글리세린(glycerin) 10%, 마유 50%, 질소원으로 NH4Cl 5% 및 무기질을 포함함으로써 동물성 오일 발효 배지를 최적화할 수 있다. 본 발효 단계에서는 탄소원의 함량을 증가시키고, 질소원을 제한시킴으로써 대수기 이후 질소원이 고갈되는 환경에서 미생물이 탄소원을 유지로 전환시킬 수 있도록 유도하고자 하였다.
일구현예에 따르면, 상기 종균배양 단계, 1차 및 2차 종균발효 단계는 각각 예를 들어, 15 내지 35℃, 예를 들어 20 내지 30℃, 예를 들어 25 내지 30℃의 호기 조건에서 예를 들어, 10 내지 30시간, 예를 들어 20 내지 30시간 동안 진행될 수 있다.
또한, 상기 본 발효 단계는 예를 들어, 15 내지 35℃, 예를 들어 20 내지 30℃, 예를 들어 25 내지 30℃의 호기 조건에서 상기 미생물의 정지기(Stationary phase) 시점까지 발효시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 미생물의 정지기 시점까지 발효시키는 것은 48 내지 100시간, 예를 들어 72 내지 100시간, 예를 들어 90 내지 100시간 동안 발효시키는 것을 의미할 수 있다. 구체적으로, 미생물의 성장곡선 중 정지기 시점에서는 배지의 질소원이 고갈됨에 따라 미생물이 탄소원을 이용함으로써 2차 대사산물이 생산될 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 본 발효 단계 후 정제 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 수분 및 미생물을 제거하기 위하여, 본 발효 후 발효물을 정치시켜 상층에 위치하는 오일 층과 하층에 위치하는 배지 및 불순물 층을 분리하여 하층을 폐기시키고, MgSO4를 첨가하여 교반한 후 원심분리기를 이용하여 잔존 불순물 및 수분을 제거시킨 오일을 수득할 수 있다.
또한, 본 발효 후 발효물의 지방산 및 불순물의 정제를 위하여, 크로마토그라피(chromatography) 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 친화크로마토그라피 컬럼(affinity chromatography column)에 규산마그네슘(magnesium silicate)을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물 등을 흡착, 여과시킬 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기한 방법에 따라 제조되는 발효 유사 세라마이드는 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide)를 처리한 대조군에 비하여 산화질소 생성량을 10 내지 80%, 예를 들어 15 내지 60% 감소시킴으로써 염증을 억제시킬 수 있다.
일구현예에 따르면, 상기 발효 유사 세라마이드는 예를 들어, 콜라겐 생성을 10 내지 50%, 예를 들어 20 내지 40% 증가시킬 수 있다.
또한 예를 들어, 경피수분 손실을 10 내지 80%, 예를 들어 20 내지 50%, 감소시킬 수 있다.
또한 예를 들어, 피부 각질 생성을 10 내지 70%, 예를 들어 20 내지 50% 감소시킬 수 있다.
일구현예에 따르면, 발효 유사세라마이드를 제공함으로써 사용감, 주름개선, 노화방지, 보습, 피부장벽 개선 등의 기능을 향상시킨 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 화장료 조성물은 예를 들어, 조성물 총 중량에 대하여 발효 유사 세라마이드를 세포 독성이 없는 수준으로 첨가할 수 있으며, 구체적으로 예를 들어, 0.0001 내지 20%, 예를 들어, 0.0001 내지 10%, 예를 들어, 0.0001 내지 5% 함량으로 첨가할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
비교예 1: 비발효 동물성 오일 제조
발효시키지 않는 동물성 오일로서 마유를 사용하였다. 마유는 수분과 불순물 등을 포함하고 있기 때문에, 규산마그네슘 5%를 투입하여 70℃에서 150rpm으로 30분간 교반한 다음, 여과하여 지방산과 불순물을 제거하였다. 그리고 수분 제거를 위하여 상기 여과시킨 마유에 마그네슘 설페이트 2%를 투입하여 70℃에서 150rpm으로 30분간 교반한 후 여과하여 최종적으로 발효시키지 않은 마유를 제조하였다.
실시예 1 내지 8: 동물성 발효 오일 제조
종균배양
Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P, 한국생명공학원구원, 2017.08.17.) 균주를 배지 1L에 접종하여 28℃, 150rpm, 1NL/min(1vvm)의 호기 조건에서 24시간 동안 1차 종균배양를 진행하여 냉동보관된 균주를 활성화시켰다. 사용한 배지는 미생물의 균체성장 및 대사과정을 최적화하기 위하여 이스트 추출물(yeast extract) 3g/L, 말트 추출물(malt extract) 3g/L, 펩톤(peptone) 5g/L, 글루코스(glucose) 10g/L, 증류수 979g/L(pH 6.2) 조성으로 하였다.
1차 종균발효
상기 종균배양시킨 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P, 한국생명공학원구원, 2017.08.17.) 균주를 배지 총 중량에 대하여 1% 농도로 접종시키고, 28℃, 300rpm, 10NL/min(1vvm)의 호기 조건으로 발효를 진행하였다. 사용한 배지는 미생물의 균체성장 및 대사과정을 최적화하기 위하여 이스트 추출물(yeast extract) 3g/L, 말트 추출물(malt extract) 3g/L, 펩톤(peptone) 5g/L, 글루코스(glucose) 10g/L, NH4Cl 1g/L, 마유 50g/L, 증류수 928g/L 조성으로 하였다.
2차 종균발효
글루코스(glucose) 10g/L를 글리세린(glycerin) 20g/L로 대체한 것을 제외하고 상기 1차 종균발효 배지와 동일한 조성의 배양액 10L에 1차 종균발효물을 계대배양하여 28℃, 300rpm, 10NL/min(1vvm)의 호기 조건으로 24시간 동안 2차 종균발효를 진행하였다.
본 발효
상기 2차 종균발효 배양액을 하기 표 1과 같은 조성의 배양액 100L에 계대배양하여 28℃, 300rpm, 100NL/min(1vvm)의 호기 조건에서 미생물의 정지기 시점까지, 즉, 96시간 동안 본 발효를 진행하였다.
구분 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4
본발효 Glucose 10g/L Glucose 10g/L Glucose 10g/L Glucose 10g/L
마유 300g/L 마유 300g/L 마유 300g/L 마유 300g/L
Yeast extract 5g/L Malt extract 5g/L Peptone 5g/L NH4Cl 5g/L
K2HPO4 1g/L K2HPO4 1g/L K2HPO4 1g/L K2HPO4 1g/L
KH2PO4 2g/L KH2PO4 2g/L KH2PO4 2g/L KH2PO4 2g/L
MgSO.7H2O 0.5g/L MgSO.7H2O 0.5g/L MgSO.7H2O 0.5g/L MgSO.7H2O 0.5g/L
증류수 433g/L 증류수 433g/L 증류수 433g/L 증류수 433g/L
구분 실시예5 실시예6 실시예7 실시예8
본발효 Glycerin 10g/L Glycerin 10g/L Glycerin 10g/L Glycerin 10g/L
마유 300g/L 마유 300g/L 마유 300g/L 마유 300g/L
Yeast extract 5g/L Malt extract 5g/L Peptone 5g/L NH4Cl 5g/L
K2HPO4 1g/L K2HPO4 1g/L K2HPO4 1g/L K2HPO4 1g/L
KH2PO4 2g/L KH2PO4 2g/L KH2PO4 2g/L KH2PO4 2g/L
MgSO.7H2O 0.5g/L MgSO.7H2O 0.5g/L MgSO.7H2O 0.5g/L MgSO.7H2O 0.5g/L
증류수 433g/L 증류수 433g/L 증류수 433g/L 증류수 433g/L
도 1은 Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P, 한국생명공학원구원, 2017.08.17.)의 시간에 따른 미생물 균체량을 나타낸 그래프이며, 도 1을 참고로 하여 미생물의 본 발효 시간 조건을 결정할 수 있다.
정제
미생물 등을 제거하기 위하여, 상기 본 발효 후 발효물을 정치시켜 상층의 오일과 하층의 배지 및 불순물로 분리시킨 후, 하층을 모두 폐기하였고, 수분을 제거하기 위하여 MgSO4 20g/L를 첨가하여 교반하였다. 교반 2시간 후 연속형 원심분리기 장비를 이용하여 미생물 균체, MgSO4, 오일층에 잔존해 있던 불순물 및 수분이 제거된 오일을 수득하였다.
또한, 지방산 및 불순물을 제거하기 위하여, 주문제작한 직경 45파이, 길이 2M의 친화 크로마토그래피 컬럼(aAffinity chromatography column) 내부에 규산마그네슘(magnesium silicate)를 충진제로 사용하였고, 30L/hour의 유량으로 지방산 및 불순물을 흡착 및 여과하였다.
비교예 1 및 실시예 8에 따른 제제를 육안으로 관찰한 사진을 도 2에 나타내었으며, 도면에서 확인할 수 있는 바와 같이 비교예 1의 제제는 혼탁한 반면, 실시예 8의 제제는 투명한 것을 확인할 수 있다.
실시예 9: 로션 제제
하기 표 2의 조성에 따라 외용 로션제를 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 2의 1번 원료에 2번을 투입한 후 분산 및 점증시켜 A상을 준비하였다. 3번 내지 6번 원료를 별도 용기에 순서대로 투입 및 혼합하여 B상을 준비한 후 A상에 투입 및 교반하였다. 7 내지 10번 원료를 별도 용기에 투입하고, 60~70℃로 가온하여 완전용해시켜 C상을 준비하였다. C상을 상기 A상과 B상 반응 용기에 투입 및 교반하였다. 그리고 11번 원료를 A상, B상 및 C상을 혼합시킨 용기에 투입하여 균일하게 용해 및 혼합한 후 30℃까지 냉각시키고, 숙성시켰다.
구분 번호 원료명 중량 (%)
A 1 정제수 51.7
2 1% 카르복실비닐폴리머 수용액 20
B 3 다이프로필렌글라이콜 6
4 부틸렌글라이콜 10
5 방부제 0.4
6 잔탄검 0.2
C 7 실시예 8 3
8 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 3
9 세테아릴알코올 1.5
10 피이지-8비즈왁스 2
- 11 트리에탄올아민 0.2
합계 100
실시예 10: 에센스 제제
하기 표 3의 조성에 따라 외용 에센스 제제를 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 3의 1번 원료에 2번을 투입한 후 분산 및 점증시켜 A상을 준비하였다. 3 내지 5번 원료를 별도 용기에 순서대로 투입 및 혼합하여 B상을 준비한 후 A상에 투입 및 교반하였다. 6번 원료를 A상과 B상을 혼합시킨 용기에 투입하고, 60~70℃로 가온하여 교반하였다. 7번 원료를 A상, B상 및 6번 원료를 혼합시킨 용기에 투입하고, 60~70℃로 가온하여 교반하였다. 8 내지 9번 원료를 별도 용기에 투입하고, 60~70℃로 가온하여 완전 용해시켜 C상을 준비하였다. 상기 혼합시킨 용기에 C상을 투입 및 교반하였다. 그리고, 10번, 11번 및 12번 원료를 순서대로 투입 및 교반한 후 30℃까지 냉각시키고, 숙성시켰다.
구분 번호 원료명 중량 (%)
A 1 정제수 75.5
2 카보머 0.3
B 3 글리세린 6.0
4 부틸렌글라이콜 10.0
5 방부제 0.4
- 6 히아루론산 1% 솔루션 0.5
- 7 피이지/피피지-17/6코폴리머 1.0
C 8 실시예 8 3.0
9 하이드로제네이트레시틴 0.5
- 10 디메치콘 2.0
- 11 피이지-60하이드로제네이티드캐스터오일 0.5
- 12 트리에탄올아민 0.3
합계 100
실시예 11: 크림 제제
하기 표 4의 조성에 따라 외용 크림제를 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 4의 1번 원료에 2번을 투입한 후 분산 및 점증시켜 A상을 준비하였다. 3번 내지 6번 원료를 별도 용기에 순서대로 투입 및 혼합하여 B상을 준비한 후 A상에 투입 및 교반하였다. 7 내지 9번 원료를 별도 용기에 투입하고, 60~70℃로 가온하여 완전용해시켜 C상을 준비하였다. C상을 상기 A상과 B상 반응 용기에 투입 및 교반하였다. 그리고 10 및 11번 원료를 순서대로 A상, B상 및 C상을 혼합시킨 용기에 투입하여 균일하게 용해 및 혼합한 후 30℃까지 냉각시키고, 숙성시켰다.
구분 번호 원료 중량 (%)
A 1 정제수 50.7
2 1% 카르복실비닐폴리머 수용액 20
B 3 글리세린 6
4 부틸렌글라이콜 10
5 방부제 0.4
6 잔탄검 0.2
C 7 실시예 8 5
8 글리세릴스테아레이트/피이지-100스테아레이트 3
9 세테아릴알코올 1.5
- 10 스테아릭애씨드 0.2
- 11 트리에탄올아민 2.0
합계 100
실험예 1: 산화 안정성 평가
오일에 대한 산화 안정성을 평가하기 위하여 산가를 측정하였으며, 산가 측정은 식품공전의 산가시험법 규격에 따라 진행하였다. 삼각 플라스크에 각각의 오일 5g을 취한 후, 에탄올-에테르 혼액(1:2, v/v) 100ml을 넣어 오일을 녹이고, 여기에 1% 페놀프탈레인(phenolphthalein) 용액 100㎕을 넣어 섞은 뒤 엷은 홍색이 될 때까지 0.1N 에탄올성 수산화칼륨용액으로 적정하였다. 오일 대신 증류수를 사용하여 공시험을 진행하였다.
계산식은 다음과 같다.
산가 = (5.611×a×f)/s
s=시료의 채취량
a=0.1N KOH용액의 소비량(ml)
f=0.1N KOH용액 역가
그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
구분 mg KOH/g
비교예 1 0.97
실시예 1 1.02
실시예 2 1.10
실시예 3 1.12
실시예 4 1.05
실시예 5 1.00
실시예 6 1.02
실시예 7 1.01
실시예 8 1.09
비교예 1은 산가 값이 0.97mg KOH/g이므로, 본 발명에 따른 실시예 1 내지 8에 따른 오일은 발효 전 오일에 비하여 산가 값이 1 내지 1.2배 증가한 것을 확인할 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 동물성 오일의 발효 후, 산가에 영향이 없으며, 이로 인하여 산화 안정성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
실험예 2: 마유세라마이드 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 분석
실리카겔 TLC플레이트(TLC Silica gel 60, Merck; 5cm × 6.5cm)에 표준물질(Ceramide 3B, Evonik, Germany)과 실시예 8을 각각 1 ul 점적하고 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol), 아세톤(acentone)(12:0.5:0.2, v/v)을 포함하는 이동상으로 전개하였다. 자연 건조된 플레이트에 에탄올과 혼합된 10% 황산을 분무하고 100℃에서 가열하여 스팟을 시각화하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었으며, 실시예 8에서 표준물질인 세라마이드와 비슷한 위치에 스팟(spot)이 나타나는 것을 확인할 수 있고, 불포화지방산 및 글라이코리피드류 및 중성지방 스팟을 함께 확인할 수 있다.
실험예 3: 세포 독성 평가
실시예 8에 따른 사람섬유아세포에 대한 독성을 검증하기 위하여 MTT 실험을 하였다. 먼저, 사람섬유아세포인 HDF세포를 24 well cultureplate에 3×104 cells/well 농도로 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 배양하였다. 세포를 DMEM배지에서 2시간 혈청기아(serum starvation)시킨 후, 실시예 8을 농도별(0-0.5%)로 처리하여 24시간 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위하여 배양액을 모두 제거하고 MTT시약을 처리하여 2시간 동안 배양하였다. 형성된 포마잔(formazan)을 DMSO로 용해하여 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. MTT 시험법은 미토콘드리아의 환원효소가 수용성인 MTT시약을 불수용성인 포마잔(formazan)으로 환원시키는 것을 원리로 하여 생세포를 계수하는 시험법으로 세포 생존율, 세포 독성, 세포 증식율 등을 측정하는 시험법 중 하나이다. MTT 시험법에 따른 결과는 도 4에 나타내었으며, 실시예 8을 농도별로 처리하였을 때, 0.5%까지 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있다.
실험예 4: 콜라겐 생성량 측정
비교예 1 및 실시예 8의 콜라겐 합성 효과를 비교하기 위하여, 각각의 시료의 농도가 0.01%, 0.05%가 되도록 사람 섬유아세포 배양 배지에 처리하고, 상기 배지를 1일 동안 배양한 후에, 배양액을 취하여 측정에 사용하였다. PICP EIA kit(procollagen type I c-peptide enzyme immuno assay kit)를 사용하였으며, 합성된 콜라겐 양은 분광광도계를 이용하여 450nm에서 측정하였다. 콜라겐의 생합성 정도는 대조군(무혈청 배지)에 대한 상대적인 합성 정도로 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
시료 콜라겐 생성 증가율 (%)
0.01% 0.05%
비교예 1 10.2 14.8
실시예 8 23.1 39.5
표 6에 나타난 바와 같이, 실시예 8은 20 내지 40%의 콜라겐 합성 증가율을 나타냄을 확인할 수 있다.
실험예 5: 항염증 평가
실시예 8에 따른 오일의 항염증 효과를 평가하기 위하여 산화질소(nitric oxide) 생성 저해능을 측정하였다. 산화질소는 면역세포에서 생성되어 외부 혹은 내부 유해물질에 대항하여 면역 시스템을 조절하는 화학분자로 알려져 있다. 마우스 유래의 대식세포주인 Raw264.7 세포를 12 well cultureplate에 5×104 cells/well 농도로 24시간 배양하고 2시간 동안 각각의 오일을 농도 별(0-0.5%)로 처리한 후, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS) 0.1㎍/ml를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액을 수득하여 3,000rpm, 5분 원심분리하고, 상층액 100ul를 griess시약(1% sulfanilamide와 0.1% N-(1-naphthyl)ethylene diamine dihydrochloride 혼합용액) 100ul와 혼합하여 빛을 차단한 상태로 15분 동안 반응시켰다. 생성된 반응물은 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 450nm 흡광도에서 측정하였다. 또한, 산화질소 생성량은 NaNO2를 사용하여 정량하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, LPS 처리 후 산화질소가 약 10배 높게 생성되었으며, 실시예 8의 농도에 따라 산화질소 생성량이 63.7% 저해된 것을 확인할 수 있다.
실험예 6: 항균력 평가
여드름을 형성하는 세균류인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes, P. acnes)는 혐기적 조건일 때 모낭과 피지선에서 과도하게 증식하여 염증을 유발하는 균으로 알려져 있다. 또한 아토피를 악화시키는 황색포도상구균 Staphylococcus aureus(S.aureus)에 대한 항균력을 조사하였다.
실시예 8의 항균 효능을 평가하기 위하여 디스크 확산법(disc diffusion method)을 이용하였다. 실험 전, P.acnes 균주를 액체 RC배지(reinforced clostridium medium)에 배양하여 1×105 CFU/ml 농도인 균 배양액을 만들었다. S.aureus 균주는 TS(Tryptic Soy broth)배지에 배양하여 1×106 CFU/ml 농도인 균 배양액을 만들었다. 각각의 균주는 배양액 0.1 ml을 Agar배지에 도말하여 직경 6 mm인 원형 여과지를 배지에 올리고, 실시예 8을 농도 별(0-0.5%)로 30ul씩 적신 후 48시간동안 배양하였다. P.acnes 균주는 혐기적 조건(5% H2, 95% N2; 37℃)에서 배양하고, S.aureus 균주는 호기적 조건(37℃)에서 배양하였다. 항균력은 원형 여과지 주변으로 형성된 생육 저해환(diameter of clear zone)을 관찰 및 측정함으로써 평가하였다. 그 결과는 하기 표 7 및 8에 나타내었다.
P.acnes 농도 (%) 생육 저해환 지름(mm)
실시예 8 0 0.1
0.125 0.7
0.25 1.6
0.5 3.7
S.aureus 농도 (%) 생육 저해환 지름(mm)
실시예 8 0 0.1
0.125 1.2
0.25 2.2
0.5 4.6
표 7 및 8에 나타난 바와 같이, 생육 저해환은 농도에 따라 크기가 증가하였으며, 구체적으로 0.5%에서 각각 약 3.2 mm 및 4.6mm의 생육 저해환이 형성되어 여드름 균과 황색포도상구균에 대한 항균 활성이 증가됨을 확인하였다.
실험예 7: 피부장벽 손상 복구 평가
손상된 피부장벽 복구 시험은 8명의 지원자를 대상으로 테이프 스트리핑(tape-striping)법으로 시험한 것으로서 전박 부위에 전용 테이프로 피부에 붙였다 떼어 붙이는 것을 15~20회 정도 반복하여 각질층에 손상을 주었다. 그 후, 실시예 9의 로션 제제를 도포하였고, 동일한 처방으로 비교예(정제마유)를 첨가한 로션 제제와 무첨가군을 각각 동일량으로 피부에 도포한 후, 24시간이 경과함에 따른 경피수분 증발량 값을 측정하여, 손상된 피부 각질층의 회복력을 확인하였다. 측정 기기는 Teawameter TM300(Courage &Khazaka, Germany)를 사용하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 테이핑에 의하여 피부장벽에 손상을 가한 경우에는 경피수분 증발량이 증가하였고, 실시예 8을 포함하는 시료를 도포한 경우에는 경피수분 손실량이 감소하는 것으로 나타나므로, 본 발명에 따른 제제는 피부장벽을 복구하는 것으로 판단되었다.
실험예 8: 피부 보습력 증진
비교예와 실시예 9의 로션제제에 대하여 피부 보습력을 비교 평가하기 위하여 8명의 지원자들을 대상으로 시간이 경과함에 따른 각질층의 수분 보유량을 측정하였다. 평가방법으로는 Corneometer CM825(Courage &Khazaka, Germany)를 이용하여 시료 도포 전 후 각질층의 수분 보유량을 측정하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다. 도면에서 확인할 수 있는 바와 같이, 도포 전의 수분 보유량을 기준으로 도포 후 12시간일 때, 비교예보다 실시예 9를 도포한 경우의 피부 내 수분 보유량이 50%정도 높았으며, 24시간 동안 지속력이 뛰어난 것을 알 수 있다.
실험예 9: 피부 각질개선 평가
피부각질 개선 시험은 피험자 8명을 대상으로 하였으며, 실시예 9의 로션제제를 1회 도포한 피험자 안면부의 도포 전, 후를 비교시험하였다. 평가방법은 Corneofix(Courage &Khazaka, Germany)를 이용하였으며, 시료를 사용하기 전과 후에 채취한 각질에 대한 Visioscan(Courage &Khazaka, Germany)양의 변화를 표 9에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이, 비교예를 도포한 대조부위보다 실시예 9를 도포한 시험부위에서, 시료 도포 후의 각질지수가 도포 전에 비하여 크게 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 실시예에 따른 시험시료가 일시적인 피부 각질 개선 효과를 가지고 있는 것으로 판단하였다.
구분 측정 값 개선율 (%)
도포 전 도포 후
대조부위
(비교 시료도포)		 19.39 13.4 30.89
시험부위(실시예9 시료도포) 19.42 8.3 57.26
상기와 같은 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따르면, 미생물에 의하여 발효된 발효 마유는 피부에 유용한 불포화 지방산, 유사 세라마이드, 유화제 등의 여러가지 복합체의 생성을 증가시킬 수 있다. 또한, 제제의 산화 안정성을 증가시키고, 세포에 대한 독성 없이 미백, 항염증 등의 기능을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 또한, 임상학적으로도 피부장벽복구, 주름개선, 거칠음 개선, 보습, 자극완화, 아토피 피부염 개선 등의 기능을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 안정적으로 화장품 제형에 적용시킬 수 있는 조성물을 제공하여 피부학적 효능을 극대화시킬 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 또한, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. Candida bombicola UA-06(기탁번호: KCTC18592P, 한국생명공학연구원, 2017.08.17.) 미생물을 활성화시키는 종균배양 단계;
    상기 종균배양시킨 미생물 및 동물성 오일을 발효시키는 1차 종균발효 단계;
    상기 1차 종균발효물을 계대배양시키는 2차 종균발효 단계 및,
    상기 2차 종균발효물을 계대배양시키는 본 발효 단계를 포함하는, 발효 유사세라마이드 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 종균배양 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone) 및 글루코스(glucose)를 포함하고,
    상기 1차 종균발효 단계에서 사용하는 배지가 이스트 추출물(yeast extract), 말트 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 글루코스(glucose), NH4Cl 및 동물성 오일을 포함하고,
    상기 2차 종균발효 단계에서 사용하는 배지가 글리세린(glycerin)을 포함하고,
    상기 본 발효 단계에서 사용하는 배지가 동물성 오일, NH4Cl, K2HPO4, KH2PO4 및 MgSO4.7H2O을 포함하는 것인, 발효 유사세라마이드 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 종균배양 단계, 1차 및 2차 종균발효 단계가 각각 15 내지 35℃의 호기 조건에서 10 내지 30시간 동안 진행되는 것이고,
    상기 본 발효 단계가 15 내지 35℃의 호기 조건에서 상기 미생물의 정지기 시점까지 발효시키는 것인, 발효 유사세라마이드 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 정지기 시점까지 발효시키는 단계가 48 내지 100시간 동안 발효시키는 것인, 발효 유사세라마이드 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 본 발효 단계 후 발효물을 정치시켜 상층과 하층을 분리하여 하층을 폐기하고, MgSO4를 첨가하여 교반 후 원심분리하여 미생물 및 수분을 제거하는 단계 및,
    친화크로마토그라피 컬럼에 규산마그네슘을 충진제로 사용하여 지방산 및 불순물이 제거된 오일을 회수하는 단계를 포함하는 것인, 발효 유사세라마이드 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조되는 발효 유사세라마이드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유사 세라마이드의 산화질소 생성량이 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 처리한 대조군에 비하여 10 내지 80% 감소하는 것인, 발효 유사세라마이드.
  8. 제6항에 있어서,
    콜라겐의 생성을 10 내지 50% 증가시키는 것인, 발효 유사세라마이드.
  9. 제6항에 있어서,
    경피수분 손실을 10 내지 80% 감소시키는 것인, 발효 유사세라마이드.
  10. 제6항에 있어서,
    피부 각질 생성을 10 내지 70% 감소시키는 것인, 발효 유사세라마이드.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 발효 유사세라마이드를 함유하는 화장료 조성물.
  12. 제6항에 있어서,
    조성물 총 충량에 대하여, 상기 발효 유사세라마이드를 0.0001 내지 20% 포함하는 것인, 화장료 조성물.
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KR102098871B1 (ko) * 2019-12-02 2020-04-08 주식회사 유나이티드엑티브 역미셀을 형성하는 발효유화제를 이용한 안티인플라메이징 조성물
KR20210067858A (ko) * 2019-11-29 2021-06-08 주식회사 유나이티드엑티브 고순도 발효계면활성제 조성물 및 그 제조방법

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