KR20190126182A - aNK 및 IL-12 조성물 및 방법 (ANK AND IL-12 COMPOSITIONS AND METHODS) - Google Patents

aNK 및 IL-12 조성물 및 방법 (ANK AND IL-12 COMPOSITIONS AND METHODS) Download PDF

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KR20190126182A
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패트릭 순-시옹
케이반 니아지
피터 시엘링
아담 라자르
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난트셀, 인크.
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Abstract

고려되는 치료 조성물 및 방법은 감작화된 유전자 변형 NK 세포 및 재조합 IL-12의 공동 투여에 관한 것이며, 유전자 변형 NK 세포는 바람직하게는 IL-2에 대한 항시적 노출에 의해 감작화되고, IL-12는 재조합 바이러스로부터 발현되거나, IL-12-항체 접합체로 제공된다. 이러한 처리는 감작화된 NK 세포에 의한 IFNγ 분비를 증가시키고, 유리하게는 또한 NKG2D의 발현을 증가시킨다.

Description

aNK 및 IL-12 조성물 및 방법 (ANK AND IL-12 COMPOSITIONS AND METHODS)
본 출원은 2017년 3월 27일에 출원된 본 발명자들의 공동 계류중인 미국 가출원 제62/477,232호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 분야는 자연 살해 세포 및 면역 자극성 사이토카인, 특히 활성화된 NK 세포 및 IL-12를 사용한 암 치료 및 방법이다.
배경 기술의 기재내용은 본 발명을 이해하는 데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본 명세서에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나, 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 명시되거나, 암묵적으로 언급된 임의의 공개 문헌이 선행 기술임을 인정하는 것이 아니다.
본 명세서의 모든 공개 문헌 및 특허 출원은 각각의 개별 공개 문헌 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 포함된 참조문헌에서의 용어의 정의 또는 사용이 본 명세서에 제공된 용어의 정의와 일치하지 않거나 상반되는 경우, 본 명세서에 제공된 용어의 정의가 적용되며, 참조문헌의 용어의 정의는 적용되지 않는다.
더욱 최근에, 유전자 변형 NK 세포에 의한 세포-기반 암 치료는 특히 NK92 유도체, 예컨대 활성화된 NK 세포(aNK 세포), 높은 친화도 CD16 수용체(haNK) 또는 키메라 항원 수용체(taNK 세포)를 갖는 유전자 변형 NK 세포가 사용된 경우, 긍정적인 치료 결과로 인해 주목받고 있다. 이러한 세포-기반 치료는 개념적으로 매력적이지만, 종양 미세 환경 및 다른 환자-특이적 인자는 종종 세포 독성 활성을 감소시킬 것이므로, NK92 세포에서 세포 독성을 조절하기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔다.
인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-12(IL-12)는 T 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하여 변형되지 않은 면역 세포를 자극함으로써 강한 항 종양 효과를 유도하는 것으로 공지된 사이토카인이다. 사이토카인은 T 세포의 증식, NK 세포에 의한 인터페론-γ(IFN-γ)의 생성 및 궁극적으로 세포 용해 활성을 자극하지만, IL-2 및 IL-12에 의한 자극 효과의 규모 및 스펙트럼은 상이하다(예를 들어, 문헌[J. Leukoc. Biol. 58: 225-233; 1995] 참조). IL-2는 증식 및 세포 용해 활성의 더 강력한 자극 인자이지만, IL-12는 변형되지 않은 활성화된 T 세포 및 NK 세포로부터의 IFN-γ의 더 강력한 유도 인자이다. IFN-γ mRNA는 IL-2 및 IL-12에 의해 공동 자극된 NK 세포에서 증가된 안정성을 갖는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Molecular and Cellular Biology, Mar. 2002, p. 1742-1753] 참조). 그러나, 시험관내에서 사용되는 IL-2 및 IL-12 농도는 생체내에서 획득 가능하거나, 심지어 적절한 수준을 반드시 반영할 필요는 없다. 실제로, IL-2의 IL-2 전신 투여는 비교적 높은 독성 및 모세관 누출 증후군과 관련되나, IL-12의 투여로 인해 여러 건의 사망 사례가 발생하였다. 더욱이, 다양한 사이토카인에 대한 1차 NK 세포의 반응은 NK 세포 종양 세포인 NK92 세포의 반응과 반드시 동일할 필요는 없다.
따라서, 세포 기반 치료제, 특히 NK 세포가 임상적으로 안전한 방식으로 자극되는 NK 세포 기반 치료제를 사용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 여전히 필요한 실정이다.
본 발명의 대상은 바람직하게는 생체내에서 발현되거나, 항체 접합된 IL-2에 대한 항시적 노출 및 추가의 IL-12 노출에 의한 NK 세포 활성화, 및 특히 aNK 세포 및 다른 유전자 변형 NK92 유도체의 활성화의 방법 및 다양한 조성물에 관한 것이다. 따라서, 사전에 조건을 형성시킨 세포는 실질적인 IFN-γ 분비를 나타냈고, aNK 세포가 제공된 환자에 IL-2 및 IL-12를 생체내 투여함으로써 발생할 수 있는 전신 독성을 방지하였다. 더욱이, 이렇게 활성화된 NK 세포는 증가된 NKG2D 발현을 나타냈으며, 이는 선천적 세포 독성을 추가로 증대시켰다.
본 발명의 대상의 일 양태에서, 본 발명자들은 유전자 변형 NK 세포를 자극하는 방법으로서, 유전자 변형 NK 세포를 IL-2에 항시적으로 노출시킴으로써, 유전자 변형 NK 세포를 IL-12에 감작화시키는 단계, 및 감작화된 세포를 IL-12에 노출시켜, 감작화된 세포에 의한 인터페론 감마(IFNγ) 분비를 자극하는 또 다른 단계를 포함하는 방법을 고려한다. 가장 통상적으로, 감작화된 세포를 IL-12에 노출시키는 단계는 또한 NKG2D의 발현을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 NK 세포는 aNK 세포이고, 유전자 변형 NK 세포는 적어도 100, 또는 적어도 200, 또는 적어도 500, 또는 적어도 1,000 IU/ml의 농도에서 IL-2에 항시적으로 노출된다. 추가로, IL-2는 페길화된 IL-2일 수 있는 것으로 고려된다. 대안적으로, 유전자 변형 NK 세포는 또한 IL-2의 세포내 발현에 의해 IL-2에 항시적으로 노출될 수 있다. 따라서, 고려되는 유전자 변형 NK 세포는 또한 haNK 세포를 포함한다.
IL-12는 재조합 바이러스에 감염된 세포로부터 발현될 수 있으며, 재조합 바이러스는 IL-12를 인코딩하는 서열 절편을 포함한다. 이러한 경우에, 또한, 재조합 바이러스는 종양 및 환자 특이적 항원, 종양 관련 항원 및 종양 특이적 항원 중 적어도 하나를 인코딩하는 제2 서열 절편을 포함하는 것으로 고려된다. 대안적으로 또는 추가적으로, IL-12는 바람직하게는 암 세포에 결합하는 항체에 연결될 수 있다. 유전자 변형 NK 세포를 시험관내에서 IL-2에 노출시키고, 감작화된 세포를 환자에 투여하고/하거나, 감작화된 세포를 시험관내에서 IL-12에 노출시키고, 감작화된 세포를 환자에 투여하는 것이 추가로 고려된다.
따라서, 본 발명의 대상의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 또한, 감작화된 유전자 변형 NK 세포를 암으로 진단된 개체에 투여하는 단계로서, 유전자 변형 NK 세포를 IL-2에 대한 항시적 노출에 의해 감작화시키는 단계; IL-12 항체 접합체 또는 IL-12를 인코딩하는 재조합 바이러스를 개체에 투여하여, 감작화된 유전자 변형 NK 세포에 의해 인터페론 감마(IFNγ) 분비를 자극하는 또 다른 단계를 포함하는 암 치료 방법을 고려한다. 통상적으로, 재조합 바이러스로부터 발현된 IL-12 또는 IL-12 항체는 또한 NKG2D의 발현을 증가시킬 것이다. NK 세포, IL-2, IL-12 및 투여 방법과 관련하여, 상기에서 언급된 것과 동일한 고려 사항이 적용된다.
따라서, 또 다른 관점에서 볼 때, 본 발명자들은 또한 암의 면역 요법에 사용하기 위한 감작화된 유전자 변형 NK 세포를 고려하고, 유전자 변형 NK 세포는 IL-2에 대한 항시적 노출에 의해 감작화되며, 면역 요법은 IL-12 항체 접합체 또는 IL-12를 발현하는 재조합 바이러스를 사용한다. 가장 통상적으로, 이러한 세포는 aNK 세포이며, 이는 페길화된 IL-2 또는 IL-2의 세포내 발현에 의한 적어도 100 IU/ml IL-2에 대한 항시적 노출에 의해 감작화될 수 있다. 따라서, 적합한 유전자 변형 NK 세포는 또한 haNK 세포를 포함한다. 적합한 재조합 바이러스는 종양 및 환자 특이적 항원, 종양 관련 항원 및 종양 특이적 항원 중 적어도 하나를 인코딩하는 서열 절편을 추가로 포함할 수 있고/있거나, 면역 요법은 IL-12 항체 접합체를 사용할 수 있으며, 항체는 바람직하게는 암 세포에 결합한다.
본 발명의 대상의 또 다른 양태에서, 본 발명자들은 또한 포유류에서 NK 세포 또는 CD8+ T 세포의 활성을 증가시키는 방법을 고려한다. 바람직한 방법은 포유류의 세포를 복수의 재조합 바이러스 입자로 감염시키는 단계를 포함하고, 각 바이러스 입자는 재조합 바이러스 입자에 감염된 세포에서 IL-12의 발현을 유도하는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, IL-12를 인코딩하는 재조합 핵산 절편을 포함한다. 가장 통상적으로, 복수의 재조합 바이러스 입자는 바이러스(통상적으로 적어도 1010개 또는 1011개의 바이러스 입자)에 감염된 포유류에서 감염된 세포에서 다량의 IL-12의 발현을 유도함으로써, NK 세포 또는 CD8+ T 세포에서 NKG2D의 발현을 증가시키기에 충분한 것이다. 본 발명의 대상에 제한되는 것은 아니나, 통상적으로, 재조합 바이러스 입자는 유전자 변형 아데노바이러스 Ad5 [E1-, E2b-] 입자인 것이 바람직하다. 적절한 경우, 세포를 감염시키는 단계를 시험관내에서 수행할 수 있으며, 그 후 감염된 세포를 환자에 투여한다. 적합한 NK 세포는 동종이계 NK92 유도체 세포(예를 들어, aNK 세포, haNK 세포, taNK 세포)를 포함하는 것으로 고려된다. 더욱이, 이러한 방법은 NK 세포 및 T 세포의 NKG2D-기반 세포 독성을 증가시키는 약제학적 제제(예를 들어, IL-15, IL-2, 독소루비신 또는 글루텐 펩타이드 단편)를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명의 대상의 다양한 목적, 특징, 양태 및 이점은 참조 번호가 동일한 경우 동일한 구성요소를 나타내는 첨부 도면과 함께 다음의 바람직한 구현예의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1a 및 도 1b는 IL-2에 대해 사전에 항시적으로 노출되지 않은 경우, IL-12 자극에 반응시 aNK 세포에서의 IFNγ 분비의 부재를 나타내는 예시적인 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 IL-2에 대해 사전에 항시적으로 노출된 경우, IL-12 자극에 반응시 haNK 세포에서의 고수준의 IFNγ 분비를 나타내는 예시적인 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 IL-2에 대해 사전에 항시적으로 노출되지 않은 경우(도 3a) 및 IL-2에 대해 항시적으로 노출된 경우(도 3b), IL-12 자극에 반응시 aNK/haNK 세포에서의 고수준의 IFNγ 분비를 나타내는 예시적인 그래프이다.
도 4는 다양한 샘플에서 IL-12 발현을 나타내는 SDS-PAGE의 예시적인 사진이다.
도 5a 및 도 5b는 Ad5[E1-,E2b-]-IL-12에 감염된 비인간 영장류(NHP)의 중량(도 5a) 및 체온(도 5b)을 도시하는 그래프이다.
도 6은 Ad5[E1-,E2b-]-IL-12에 감염된 비인간 영장류의 혈청 IL-12 수준을 도시하는 그래프이다.
본 발명자들은 현재, NK 세포, 특히 유전자 변형 NK92 세포가 IL-12 노출에 반응하여 효과적으로 자극되어, IFNγ를 분비할 수 있고, 이에 따라 세포 독성 및 NK 세포 활성을 촉진할 수 있고, 증가된 MHC-I/II 발현을 통해 항원 제시 세포에서 항원 제시를 증가시키며, Th1 반응에 대한 면역 반응을 편중시킴을 발견하였다. 특히, 하기에서 상세하게 논의되는 바와 같이, 다양한 NK92 세포를 IL-2를 함유하는 배양 배지에서 미리 증식시키고, 배양 배지를 주기적으로, 통상적으로 (세포 밀도에 따라) 2일 내지 3일마다 교체한다. 그러나, 이들 세포는 IL-12에 반응하지 못한다. 예상외로, IL-2가 항시적 또는 연속적인 방식으로 동일한 세포에 공급된 경우, 세포는 IL-12 신호전달에 감작화되고, 유의한 양의 IFNγ를 생성하며, 증가된 세포 독성을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 IL-2와 관련하여 용어 "항시적 노출" 또는 "항시적으로 노출되는"은 세포 또는 세포내에서 생물학적 활성 IL-2 농도(또는 IL-2 자극)의 변화가 48시간 동안 20% 이하만큼 변동되는 연속(또는 반 연속) 방식으로 생물학적 활성 IL-2가 공급되거나 생성되는 것을 의미한다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포 또는 세포내에서 생물학적 활성 IL-2 농도(또는 IL-2 자극)의 변화는 48시간 동안 15% 이하, 또는 48시간 동안 10% 이하, 또는 48시간 동안 7% 이하, 또는 48시간 동안 5% 이하, 또는 48시간 동안 1% 이하만큼 변동될 것이다.
IL-2에 대한 항시적 노출을 IL-2에 대한 자연 노출과 더 밀접하게 유사하도록 하여, IL-12에 대한 노출에 의해 야기되는 IL-12에 대한 지속적 감작화 및 IFNγ 분비가 유발될 것으로 여겨진다. 이와 달리, 배양 배지가 2일 내지 3일마다 교체되는 통상적인 NK-92 세포 배양에서와 같이 간헐적 방식으로 NK-92 세포를 IL-2에 노출시키면, 아마도 배양 배지의 혈청 성분(통상적으로 말 혈청 및 소 태아 혈청)에 존재하는 혈청 단백질에 의한 결합 또는 혈청 프로테아제에 의한 단백질 분해에 의해, 생물학적 활성 IL-2의 불활성화 및/또는 분해가 야기될 수 있다. 결과적으로, 임의의 이론이나 가설에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 본 발명자들은 통상적인 NK-92 세포 배양 조건이 NK-92 세포의 성장을 지원하지만, NK-92 세포를 IL-12에 감작화시키는 세포 신호전달 및 IL-12 의존적 IFNγ 분비뿐만 아니라, (비-IL-12 자극 세포와 비교하여) NKG2D의 증가된 발현을 지원하지는 못하는 간헐적 또는 '단속적' IL-2 신호전달을 촉진한다고 생각한다.
하기에 더욱 상세히 나타낸 바와 같은 이들 발견을 기반으로 하여, 본 발명자들은 세포를 IL-2에 항시적으로 노출시킴으로써, NK-92 세포 및 그의 유도체를 IL-12에 감작화시키고, IL-12 의존적 IFNγ 분비를 야기하고, NKG2D의 발현을 증가시킬 수 있다고 상정하였다. 예를 들어, 일 구현예에서, 항시적 노출은 IL-2를 배양 배지에 연속 또는 반 연속적으로 첨가하여 생물학적 활성 IL-2의 농도를 실질적으로 일정하게 유지함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 배지 중 생물학적 활성 IL-2의 농도는 48시간 동안 15% 이하, 또는 48시간 동안 10% 이하, 또는 48시간 동안 7% 이하, 또는 48시간 동안 5% 이하, 또는 48시간 동안 3% 이하만큼 변동되는 것으로 상정된다. 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, IL-2의 생물학적 활성은 공지된 절차, 예를 들어 CTLL-2 세포 증식 분석을 사용하여 정량화될 수 있다(문헌[J Immunol Methods. 2009 Aug 31; 348(1-2): 83-94]).
IL-2의 연속 또는 반 연속 첨가는 연동 펌프 또는 계량 주입기의 사용을 포함하여 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 차선적인 바람직한 양태에서, IL-2의 연속 또는 반 연속 첨가는 빈번한 방식의(예를 들어, 2시간마다, 4시간마다, 8시간마다 등) 배지 교체에 의해 수행될 수 있다. 다회 또는 연속 첨가가 바람직하지 않은 경우, 본 발명자들은 또한 비교적 느린 방식으로 IL-2를 방출하는 제형을 사용하여 항시적 노출이 달성될 수 있는 것으로 상정한다. 예를 들어, IL-2의 지연 방출(또는 단백질 결합 및/또는 프로테아제 분해에 대한 증가된 안정성)은 NKTR-214(Nektar Therapeutics; 455 Mission Bay Blvd South; San Francisco, CA 94158)에서 공지된 IL-2의 페길화에 의해 수행될 수 있다. 여기서, 페길화된 IL-2는 시간이 지남에 따라 PEG 사슬을 방출하여, 생물학적 활성 IL-2를 생성하는 생물학적 활성 IL-2의 전구약물 형태인 것으로 여겨진다(문헌[PLoS One.　2017 Jul 5;12(7):e0179431]). 유리하게는, 이러한 페길화된 IL-2는 전신 투여될 수 있으며, 따라서 생체내에서 NK/NK92 세포 및 그의 유도체의 IL-2에 대한 항시적 노출을 가능하게 하면서, 동시에 IL-2의 전신 부작용을 감소시키거나, 심지어는 완전히 방지한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 항체 접합 IL-2는 예상컨대 혈청 단백질에 대한 결합이 감소하고, 혈청 프로테아제에 의한 단백질 분해가 감소함으로써, 증가된 안정성을 나타내므로, 이러한 접합체를 사용하여 항시적 노출이 달성될 수 있음에 주목해야 한다. 다시 한번, 이러한 항체-약물 접합체는 유리하게는 생체내에서 환자에 투여 가능할 것이다. 이 구현예에서, 그러나(NKTR-214와 달리), IL-2의 전달 및 NK 세포의 활성화는 위치가 고려되는 한, 높은 특이성 및 선택성으로 가능하다. 예를 들어, 이러한 항체-약물 접합체는 환자 및 종양 특이적이거나(즉, 종양 네오에피토프), 암 관련되거나 암 특이적이거나 종양 미세 환경에서 통상적으로 발견되는 괴사 조직에 특이적인 종양 마커를 표적화할 수 있다. 물론, 이러한 항체-약물 접합체의 항체 부분은 완전한 IgG 항체 또는 그의 임의의 적합한 단편(예를 들어, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 등)일 수 있음을 이해해야 한다.
쉽게 이해될 수 있는 바와 같이, 이러한 항체-약물 접합체는 (예를 들어, 이황화 결합 또는 하이드로존(hydrozone), 또는 단백질 분해 부위 등을 통해) 절단 가능하거나 (예를 들어, 말레이미드-변형 PEG를 통해) 절단 불가능한 링커를 사용한 화학적 접합에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 접합은 또한 중쇄 또는 경쇄(또는 그의 단편)의 N 또는 C 말단이 링커 부분 및 IL-2를 프레임 내 인코딩하도록 변형된 재조합 클로닝을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 종양 세포의 성분, 링커 및 IL-2 부분에 결합하는 항체 부분을 갖는 키메라 재조합 단백질이 제조될 수 있다. 특히, IL-2와의 예시적인 항체-약물 접합체는 하기에 더욱 상세히 제시된 바와 같이 유의한 활성을 유지하였다.
IL-2의 특정 형태에 관계없이, 일반적으로, NK/NK92 세포 및 이들의 유도체의 IL-2(및 변형된 형태의 IL-2)에 대한 항시적 노출은 약 10 IU/ml 내지 50 IU/ml, 또는 약 50 IU/ml 내지 150 IU/ml, 또는 약 150 IU/ml 내지 300 IU/ml, 또는 약 300 IU/ml 내지 500 IU/ml, 또는 약 500 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 또는 이를 초과하는 농도일 것으로 여겨진다(CTLL-2 증식 분석에 의해 결정되는 바와 같음). 더욱이, 일반적으로, IL-2 농도는 적어도 제한된 시간 동안 실질적으로 일정하게 유지되는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 통상적으로, 생물학적 활성 IL-2의 농도는 72시간 동안 또는 60시간 동안 또는 48시간 동안 또는 36시간 동안 또는 24시간 동안 또는 18시간 동안 IU/ml의 변화 %로 측정되는 바와 같이, 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만, 또는 7% 미만, 또는 5% 미만, 또는 3% 미만으로 변동하는 것이 바람직하다. 따라서, 상이한 관점에서 볼 때, 생물학적 활성 IL-2의 적절한 농도는 전체 세포 배양에 걸쳐 50 IU/ml 내지 70 IU/ml, 또는 70 IU/ml 내지 100 IU/ml, 또는 100 IU/ml 내지 120 IU/ml, 또는 120 IU/ml 내지 150 IU/ml, 또는 150 IU/ml 내지 200 IU/ml, 또는 200 IU/ml 내지 230 IU/ml, 또는 230 IU/ml 내지 250 IU/ml, 또는 250 IU/ml 내지 280 IU/ml, 또는 이를 초과하여 유지될 것이다.
또 다른 고려되는 양태에서, NK/NK92 세포 및 이들의 유도체의 IL-2에 대한 항시적 노출은 또한 각각의 세포에서 재조합 IL-2의 세포내 발현에 의해 달성될 수 있다. 가장 바람직하게는, 세포내 발현은 일정한 발현 수준을 달성하기 위해 항시적으로 활성인 프로모터로부터 유도되고, 분비되지 않는 형태(즉, 유출 신호 서열이 부재하고, 내부 원형질 또는 세포질 보유 서열을 포함할 수 있음)로 발현된다. 이러한 세포내 발현은 외부 제공 IL-2에 대한 항시적 노출과 동일한 기능적 영향을 세포에 제공하는 것으로 여겨진다. 실제로, 하기에 더욱 상세하게 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 NK92 세포 또는 유도체가 IL-2를 발현하고, 이를 세포내에 보유하도록 유전자 조작된 경우, 이러한 세포는 예상외로, IFNγ 분비 및/또는 NKG2D의 증가된 발현에 의해 측정되는 바와 같이, IL12 자극에 감작화된 것으로 나타났다. 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, IL-2의 재조합 발현 및 세포내 보유는 다수의 방식으로 수행될 수 있으며, 이러한 모든 방법은 본 명세서에 사용하기에 적합한 것으로 고려된다(예를 들어, 문헌[Oncotarget 2016 Dec 27; 7(52): 86359-86373] 참조). 여러 이점들 중에서도 특히, 이러한 재조합 세포는 동일한 환자 IL-2를 투여할 필요없이 환자에 생체내 투여될 수 있음에 주목해야 한다. 이렇게 변형된 세포는 IL-12에 감작화되어, IL-12 자극에 의해 IFNγ를 분비할 것이다. 실제로, IL-2에 대한 항시적 노출(외부 또는 내부)에 의한 감작화는 유의한 양의 IFNγ를 제공하였으며, 특히 또한 이렇게 자극된 세포에서 NKG2D 발현이 유의하게 증가하였으므로, 이는 동시에 면역 요법과 관련하여, 치료 효과를 제공하는 것으로 생각된다.
NK 세포와 관련하여, 모든 NK 세포는 본 명세서에 사용하기에 적합한 것으로 여겨지며, 따라서 환자로부터의 자가 NK 세포(예를 들어, 전혈로부터 단리되거나, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 전구체 또는 줄기세포로부터 배양됨) 및 다양한 동종이계 NK 세포를 포함하는 것으로 고려된다. 그러나, 본 발명의 대상의 바람직한 양태에서, NK 세포는 하나 이상의 바람직한 특성을 획득하도록 유전자 조작되고, 특히 NK-92 세포 및 그의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 적합하게 유전자 조작된 NK 세포는 적어도 하나의 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR)의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형된 NK-92 유도체를 포함하며, 이는 그러한 세포가 (억제의 부재 또는 감소를 통해) 항시적으로 활성화되도록 할 것이다.
NK-92 세포는 비교적 많은 수의 활성화(예를 들어, NKp30, NKp46, 2B4, NKGD, CD28) 수용체를 발현하는 일반적이지 않은 수용체 발현 프로파일을 나타낸다. 이와 달리, NK-92 세포는 또한 소수의 억제 수용체(예를 들어, NKGA/B, 낮은 수준의 KIR2DL4, ILT-2)를 발현하고, 정상 NK 세포에서 복제 발현되는 살해 억제 수용체(KIR)의 대부분이 부재한다. 또한, NK-92는 종양 괴사 인자(TNF)-슈퍼패밀리 구성원 FasL, TRAIL, TWEAK, TNF-알파를 포함하는 추가의 세포 독성 효과기 분자뿐만 아니라, 퍼포린(perforin)-그랜자임(granzyme) 세포 용해 경로에 관여하는 분자의 비교적 높은 수준을 발현하며, 이는 대체 메커니즘을 통한 사멸능을 시사한다. 더욱이, NK-92 세포는 또한 NK 사멸과의 관련성이 불분명한 면역 효과기 세포 조절에 관여하는 다른 분자(CD80, CD86, CD40L, TRANCE)를 발현한다.
더욱이, 적합한 NK 세포는 MHC 클래스 I 분자와의 상호작용을 감소시키거나 제거하도록 돌연변이된 하나 이상의 변형된 KIR을 가질 수 있다. 물론, 하나 이상의 KIR이 또한 결실될 수 있거나, (예를 들어, miRNA, siRNA 등을 통해) 발현이 억제될 수 있음에 유의해야 한다. 가장 통상적으로, 하나 초과의 KIR이 돌연변이되거나 결실되거나 침묵화될 것이며, 특히 고려되는 KIR은 짧거나 긴 세포질 꼬리를 갖는 2개 또는 3개의 도메인을 갖는 것을 포함한다. 다른 관점에서 보면, 변형되거나 침묵화되거나 결실된 KIR은 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, 및/또는 KIR3DS1을 포함할 것이다. 이렇게 변형된 세포는 당 업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이러한 세포는 또한 NantKwest(URL www.nantkwest.com 참조)로부터 aNK 세포(활성화된 자연 살해 세포)로서 상업적으로 입수할 수 있다.
본 발명의 대상의 또 다른 바람직한 양태에서, 유전자 조작된 NK 세포는 또한 고친화도 Fcγ 수용체(CD16)를 발현하도록 변형된 NK-92 유도체일 수 있다. Fcγ 수용체의 고친화도 변이체의 서열은 당 업계에 널리 공지되어 있고(예를 들어, 문헌[Blood 2009 113:3716-3725] 참조), 생성 및 발현의 모든 방식이 본 명세서에 사용하기에 적합한 것으로 여겨진다. 이러한 수용체의 발현은 환자의 종양 세포(예를 들어, 네오에피토프), 특정 종양 유형에 특이적이거나(예를 들어, her2neu, PSA, PSMA 등), 암과 관련된(예를 들어, CEA-CAM) 항체를 사용하여 종양 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 것으로 여겨진다. 유리하게는, 이러한 항체는 상업적으로 입수 가능하며, (예를 들어, Fcγ 수용체에 결합된) 세포와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 세포는 또한 NantKwest로부터 haNK 세포(고 친화도 자연 살해 세포)로서 상업적으로 입수할 수 있다.
본 발명의 대상의 추가의 양태에서, 유전자 조작된 NK 세포는 또한 키메라 T 세포 수용체를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 키메라 T 세포 수용체는 종양 관련 항원, 종양 특이적 항원 및 암 네오에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 scFv 부분 또는 다른 엑토도메인(ectodomain)을 가질 것이다. 상기에 언급된 바와 같이, NK 세포를 이러한 키메라 T 세포 수용체를 발현하도록 유전자 조작하는 다수의 방식이 존재하며, 모든 방식은 본 명세서에서 사용하기에 적합한 것으로 여겨진다. 대안적으로, 이러한 세포는 또한 NantKwest로부터 taNK 세포('표적-활성화된 자연 살해 세포')로서 상업적으로 입수할 수 있다.
세포가 암 관련 항원 또는 (예를 들어, CAR의 발현을 통해) 암 관련 항원에 특이적인 항체에 대해 친화도를 갖도록 조작되는 경우, 모든 공지된 암 관련 항원이 사용하기에 적합한 것으로 여겨지는 것으로 고려된다. 예를 들어, 암 관련 항원은 CEA, MUC-1, CYPB1 등을 포함한다. 마찬가지로, 세포가 암 특이적 항원 또는 암 특이적 항원에 특이적인 항체에 대해 친화도를 갖도록 조작되는 경우, 모든 공지된 암 특이적 항원이 사용하기에 적절한 것으로 여겨지는 것으로 고려된다. 예를 들어, 암 특이적 항원은 PSA, Her-2, PSA, 브라큐리(brachyury) 등을 포함한다. 세포가 암 네오에피토프 또는 암 네오에피토프에 대해 특이적인 항체에 대해 친화도를 갖도록 조작되는 경우, 네오에피토프를 확인하는 모든 공지된 방식이 적절한 표적으로 유도할 것으로 고려된다. 예를 들어, 이렇게 획득된 체학적 정보의 동시 비교를 통한 종양 생검(또는 림프 생검 또는 전이 부위의 생검) 및 매칭된 정상 조직(즉, 동일한 환자로부터의 비-질병 조직)의 전체 게놈 분석에 의해 제1 단계에서 네오에피토프를 환자 종양으로부터 확인할 수 있다. 따라서 그 후 확인된 네오에피토프를 환자의 HLA 유형과 매칭되도록 추가로 필터링하여, 네오에피토프의 항원 제시 가능성을 증가시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 이러한 매칭은 가상환경 실험으로 수행될 수 있다. 추가로, 본 명세서에서 고려되는 모든 NK 세포는 또한 분비되지 않는 IL-2(예를 들어, ER 구획 내에 보유됨)를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다.
IL-12와 관련하여, 일반적으로 IL-12는 당 업계에 널리 공지된 프로토콜을 사용하여 비경구 및 전신 투여될 수 있는 것으로 여겨진다. 더욱이, IL-12는 또한 상기 IL-2 항체 접합체에 대해 이미 기재된 바와 같이, 항체-약물 접합체로서 체내의 특정 부위에 특이적으로 투여될 수 있다. 유리하게는, 특정 부위로의 이러한 투여는 면역 자극이 필요한 위치(예를 들어, 암 또는 괴사 조직, 종양 미세 환경 등)로 자극된 NK 세포의 IFNγ 분비에 집중될 것이다. 그러나, 추가로 고려되는 양태에서, IL-12는 자가 환자 세포 또는 동종이계 면역 면역능 세포(예를 들어, NK 세포, NK92 유도체, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포, 수지상 세포, 대식세포 등)로 형질감염될 수 있는 재조합 발현 시스템으로부터 발현되는 것으로 여겨지며, 이는 하기에 더 상세히 추가로 기재되는 바와 같다. 이러한 재조합 시스템은 또한 IL-12 이외의 단백질, 특히 하나 이상의 종양 또는 암 특이적 항원, 및/또는 공동 자극 분자 및/또는 체크포인트 억제 인자를 인코딩하는 하나 이상의 서열 부분을 포함할 수 있다. 유리하게는, 면역능 세포가 재조합 IL-12를 생성하는 경우, 면역능 세포와 상호작용하는 자극된 NK 세포는 IFNγ 분비를 통해 면역능 세포에 추가적 활성화를 제공할 수 있음에 유의해야 한다.
예를 들어, 본 명세서에서 사용하기 위해 특히 고려되는 발현 시스템은 다양한 바이러스 형질감염 시스템, 가장 바람직하게는 아데노바이러스 또는 다른 약제학적으로 허용 가능한 발현 시스템, 예컨대 아데노 연관, 렌티바이러스 및 레트로바이러스 발현 시스템을 포함한다. 추가로, 적합한 대안적 발현 시스템은 효모 및 인위적 염색체 발현 시스템, 및 심지어, 게놈 편집 기법을 사용하여 숙주 세포의 게놈에 장착된 재조합 발현 카세트를 포함하는 것으로 고려된다. 그러나, 본 발명의 대상의 특히 바람직한 양태에서, 발현 시스템은 아데노바이러스 시스템, 특히 면역원성이 감소된 아데노바이러스 시스템이다. 예를 들어, 적합한 아데노바이러스 시스템은 E1 및 E2b 유전자가 결실된 Ad5를 포함한다. 대부분의 바이러스가 또한 추가의 적재를 가능하게 하므로, IL-12 다음에 발현될 수 있는 단백질은 암 관련 항원, 종양 및 환자 특이적 네오에피토프(모두 바람직하게는 환자와 관련하여 HLA가 매칭되고/되거나, 환자의 MHC-I 및/또는 MHC-II 제시 경로로 유도됨)를 포함한다. 더욱이, 적합한 발현 시스템으로부터 발현될 수 있는 것으로 추가로 고려되는 추가적 단백질은 하나 이상의 공동 자극 분자(예를 들어, B7.1(CD80), B7.2(CD86), ICAM-1(CD54), ICOS-L, LFA-3(CD58), 4-1BBL, CD30L, CD40, CD40L, CD48, CD70, CD112, CD155, GITRL, OX40L, TL1A 등) 및/또는 하나 이상의 체크포인트 억제제(예를 들어, CTLA-4(CD152) 또는 PD-1(CD 279)에 결합하는 단백질 또는 펩타이드)를 포함한다. 발현을 위한 추가적 단백질은 또한 다양한 면역 자극성 사이토카인, 특히 IL-2(특히, 상기에서 이미 기술된 바와 같이 형질감염된 세포내에 IL-2가 보유되는 경우), IL-15 및 IL-15 과작용제(예를 들어, ALT-803)를 포함한다.
본 명세서에서 고려되는 발현 시스템의 서열 요소의 특정 배열과 관련하여, IL-12는 강력한 항시적 프로모터(예를 들어, SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK, CAGG 프로모터)로부터 발현되는 것이 일반적으로 바람직하나, 특히, 유도 조건이 종양 미세 환경에서 통상적인 경우에 유도성 프로모터가 또한 본 명세서에 사용하기에 적합한 것으로 고려된다. 예를 들어, 유도성 프로모터는 저산소증에 감응성인 프로모터 및 TGF-β 또는 IL-8에 감응성인 프로모터(예를 들어, TRAF, JNK, Erk 또는 다른 반응성 요소 프로모터를 통함)를 포함한다. 다른 예에서, 적합한 유도성 프로모터는 테트라사이클린-유도성 프로모터, 믹소바이러스(myxovirus) 내성 1(Mx1) 프로모터 등을 포함한다. 추가 발현 요소가 존재하는 경우, 이는 동일한 프로모터로부터 공동 발현될 수 있고, 따라서 예를 들어, 내부 리보솜 진입(IRES) 부위를 갖는 단일 전사체를 생성할 수 있거나, 단일 유전자 전사체, 탠덤 미니유전자, 또는 발현에 적합한 임의의 다른 배열로서 하나 이상의 개별 프로모터로부터 전사될 수 있다.
추가로 고려되는 양태에서, 특히 바이러스 발현 시스템이 고려되는 경우, 바이러스 시스템은 복제 불능이고, 숙주 세포가 진입에 적합한 수용체를 갖는 것이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 바이러스가 아데노바이러스 또는 콕사키 바이러스(coxsackie virus)인 경우, 수용체는 통상적으로 CAR 수용체이며, 이는 본래 존재하거나, 숙주 세포에서 재조합 핵산으로부터 발현될 수 있다. 한편, IL-12의 발현을 위한 재조합 핵산이 선형 또는 원형 '네이키드(naked)' 핵산(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA)인 경우, 통상적인 형질감염이 통상적으로 바람직하다(예를 들어, 리포펙션, 전기천공, 소노포레이션(sonoporation), 탄도학적 전달 등).
환자, 동종이계 세포 또는 환자 세포에의 재조합 바이러스의 투여는 통상적으로 혈청에서 검출 가능한 IL-12를 생성시키는 양으로, 바람직한 양은 통상적으로 10 pg/ml 내지 1000 pg/ml의 범위이다. 예를 들어, 적합한 검출 가능한 혈청 농도는 적어도 10 pg/ml, 적어도 25 pg/ml, 적어도 50 pg/ml, 적어도 100 pg/ml, 또는 적어도 250 pg/ml일 것이다. 그러나, 정확한 양은 일반적으로 MOI, 감염된 세포의 수, 프로모터의 강도 등에 따라 상이할 것이다. 따라서, 특정 혈청 농도는 적절한 선택 및/또는 바이러스 입자의 양, 감염된 세포의 수, 프로모터의 선택 등에 의해 획득될 수 있음을 인식해야 한다. 예를 들어, 바이러스가 Ad5이고, 프로모터가 CMV 프로모터인 경우, 통상적으로 적어도 108개, 더욱 통상적으로 적어도 109개, 훨씬 더욱 통상적으로 1010개 및 가장 통상적으로 1011개의 바이러스 입자가 적어도 1회, 더욱 통상적으로 2회, 또는 치료 효과를 위해 필요한 바에 따라 다회 투여될 것이다. 그러나, IL-2 자극된 NK 세포가 발현되거나 그외에 투여된 IL-12와 동시에 존재하도록 투여는 공동 투여인 것이 일반적으로 고려된다. 예를 들어, IL-2 자극된 NK-92 유도체(예를 들어, aNK 세포, haNK 세포 및 taNK 세포)를 IL-12, IL-12 인코딩 바이러스 또는 IL-12 항체 접합체와 공동 투여함으로써, 자극된 세포로부터의 IFNγ 분비를 증가시키거나, 이러한 세포에서 NKD2D 발현을 증가시킬 수 있다. 추가로, 본 명세서에서 고려되는 치료는 또한 종양 조직에서 NKG2D 리간드의 발현을 추가로 유도하기 위해 (규칙적) 저 투여량 화학요법/방사선 조사를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 대상의 또 다른 양태에서, 이렇게 자극된 NK 세포는 통상적으로 투여 단위당 104개 내지 1011개의 세포, 더욱 통상적으로 105개 내지 109개의 세포를 갖는 멸균 주사용 조성물로 제형화된 약제학적 조성물에 사용될 수 있다. 적절한 경우, 이들 세포는 투여 후 추가 번식을 방지하기 위해 적합한 방사선 투여량으로 조사될 수 있다. 그러나, 대안적 제형이 또한 본 명세서에 사용하기에 적합한 것으로 고려되고, 모든 공지된 투여 경로 및 방식이 본 명세서에서 고려된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 약제학적 조성물 또는 약물의 "투여"라는 용어는 약제학적 조성물 또는 약물의 직접 및 간접 투여 둘 모두를 지칭하며, 약제학적 조성물 또는 약물의 직접 투여는 통상적으로 건강 관리 전문가(예를 들어, 의사, 간호사 등)에 의해 수행되나, 간접 투여는 (예를 들어, 종양 내 주사, 주입, 경구 전달, 국소 전달 등을 통한) 직접 투여를 위해, 건강 관리 전문가에 약제학적 조성물 또는 약물을 제공하거나 이용 가능하게하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명자들은 특히, 항시적으로 자극된 자연 살해 세포 및 IL-12가 공동 투여되는 암 치료 방법을 고려하며, IL-12는 NK 세포에서 NKG2D 발현을 증가시키는 투여량으로 투여된다. 가장 통상적으로, 상기에 기재된 바와 같이, IL-12는하기에서 예시로 기재되는 바와 같이, IL-12를 인코딩하는 재조합 핵산으로 형질감염된 (숙주 또는 동종이계) 세포의 발현을 통해 공동 투여되는 것이 일반적으로 바람직하다. 마찬가지로, 추가의 특히 바람직한 방법은 포유류에서 NK 세포 또는 CD8+ T 세포의 활성을 증가시키는 방법을 포함한다. 이러한 방법에서, 재조합 바이러스 입자로 감염된 세포에서 IL-12의 발현을 유도하는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 IL-12를 인코딩하는 재조합 핵산 절편을 각각 포함하는 복수의 재조합 바이러스 입자로 포유류를 감염시킨다. 가장 통상적으로, 재조합 바이러스 입자의 수는 바이러스에 감염된 포유류에서 감염된 세포에서 다량의 IL-12의 발현을 유도함으로써, NK 세포 또는 CD8+ T 세포에서 NKG2D의 발현을 증가시키기에 충분한 것이다.
고려된 방법은 IFNγ 분비 이외에 다양한 세포, 특히 NK 세포, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 면역능 세포에서 NKD2D 표면 발현을 증가시키는 것으로 생각되므로, 추가로, 이러한 처리는 또한 NKG2D 리간드 발현 및 제시를 증가시키는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 바람직한 처리는 저 투여량의 화학요법 및/또는 저 조사량의 방사선 요법을 포함하며, 이는 통상적으로, 최대 내성 투여량의 50% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하의 투여량에서 수행된다. 더욱이, 이러한 저 투여량 처리는 바람직하게는 규칙적 방식으로, 예를 들어 격일 또는 3일마다, 또는 수주 동안 매주 1회 등으로 수행될 것이다.
실시예
IL-12 자극에 반응시 IFN-γ 생성: IL-2에 대해 항시적으로 노출되지 않은 aNK 세포를 인간 재조합 IL-12, 및 선택된 쥣과동물 재조합 IL-12-Ab 접합체(도 1a), 또는 인간 재조합 IL-12, 및 선택된 인간 재조합 IL-12-Ab 접합체(도 1b)와 함께 밤새 배양하였다. 2.5x105개의 세포를 5% 인간 혈청을 함유하는 24웰 플레이트 X-Vivo 10에 시딩하여 세포를 배양하였다. 이어서 세포 배양 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 인간 IFN-γ를 측정하였다. 도 1a 및 도 1b의 그래프로부터 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 다양한 형태의 IL-12에 대한 노출은 유의한 임의의 IFNγ 분비를 유도하지 않았다.
추가의 실험 세트에서, haNK 세포(즉, 고친화도 CD16을 발현하고, IL-2를 세포내에 보유하는 aNK 세포 유도체)를 인간 재조합 IL-12, 및 선택된 쥣과동물 재조합 IL-12-Ab 접합체(도 2a), 또는 인간 재조합 IL-12, 및 선택된 인간 재조합 IL-12-Ab 접합체(도 2b)와 함께 밤새 배양하였다. 2.5x105개의 세포를 5% 인간 혈청을 함유하는 24웰 플레이트 X-Vivo 10에 시딩하여 세포를 배양하였다. 이어서 세포 배양 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 인간 IFN-γ를 측정하였다. 놀랍게도, IL-2의 세포내 발현을 통한 항시적인 IL-2 노출은 도 2a 및 도 2b의 그래프로부터 쉽게 알 수 있는 바와 같이 aNK 세포를 IL-12 신호전달에 감작화시켰다. 실제로, 다양한 형태의 IL-12에의 노출은 쥣과동물 및 인간 IL-12 둘 모두에서 유의한 IFNγ 분비를 유도하였다. 예상한 바와 같이, 인간 IL-12는 쥣과동물 IL-12보다 haNK 세포에서 다소 더 강한 IFNγ 분비를 생성하였다.
도 3a는 IL-2에 항시적으로 노출되지 않은 aNK 세포 및 IL-2에 항시적으로 노출된 haNK 세포에 대한 데이터를 비교하여 도시한 것이다. 또 다른 실험에서, 본 발명자들은 IL-2 발현 카세트의 안정한 혼입에 의해 aNK 세포를 변형시켰다(고친화도 CD16 변이체를 발현하지 않는 NK-92MI 세포를 형성함). 도 3b의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 이렇게 변형된 NK 세포는 IL-12 신호전달에 반응하여, IFNγ를 분비할뿐만 아니라, 예상치 못한 다량의 IFNγ(200 ng/ml 부근에서 최대)를 분비하였다. NK92-MI 생성: NK-92 세포를 입자-매개 유전자 전달에 의해 레트로바이러스 MFG-hIL-2 벡터에서 인간 IL-2 cDNA로 형질감염시켰다. 형질감염은 안정적이었다. NK-92 및 이러한 유도체 세포주 NK-92MI는 다음 특징을 나타내었다: CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45, CD54 및 CD56에 대해 양성인 표면 마커, 밝게 표시됨; CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23, CD34 및 HLA-DR에 대해 음성인 표면 마커.
Ad5 [E1-, E2b-] 벡터에서 IL-12의 발현: 인간 IL-12의 유전자를 Ad5 [E1-, E2b-] 바이러스 벡터 백본에 삽입하였다(예를 들어, 문헌[J Virol.　1998 Feb;72(2):926-33]). 인간 세포(A549)를 Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12 재조합 바이러스로 감염시켜 IL-12의 발현을 확인하였고, Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12로 감염된 인간 세포에서의 IL-12의 발현이 도시되어 있는 도 4에서 볼 수 있는 웨스턴 블롯 분석으로 IL-12 생성을 확인하였다. 더욱 구체적으로, A549 세포를 Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12로 1000의 MOI에서 감염시키고, IL-12 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다. 재조합 IL-12를 양성 대조군으로 사용하였고, 감염되지 않은 A549 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 샘플은 도 4에 다음 순서로 시각화되어 있다: A. 100ng IL-12 참조 물질, B. 50ng IL-12 참조 물질, C. 25ng IL-12 참조 물질, D. 음성, E. Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12 용해물(10 uL), F. Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12 용해물(17 uL), G. Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12 용해물(25 uL).
Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12의 생체내 투여: 4개의 비인간 영장류(NHP)의 뒷다리에 1x1011 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12 및 4x1011 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-gag/pol/nef/env(5x1011 VP)로 2주 간격으로 2회 면역화시켰다. 인간 체중이 60 kg이고, NHP의 평균 중량이 3.9 kg이라고 가정하면, 이들 NHP에서의 5 x 1011 VP/투여량은 NHP 대 인간 대비하여 인간에서 7.7 x 1012 VP/투여량에 상응한다. 치료로 인한 부작용을 모니터링하기 위해, 동물의 중량 및 체온을 포함하여, 임상 관찰 결과를 기록하였다. Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12 및 Ad5 [E1-, E2b-]-gag/pol/nef/env의 투여 후, 도 5a에 도시된 바와 같이 동물에서 임의의 중량 손실이 나타나지 않거나, 도 5b에 도시된 바와 같이 발열 반응이 나타나지 않았다. 여기서, 각 라인은 각각의 동물을 나타낸다. 화살표는 동물에 Ad5 [E1-, E2b-] 처리가 투여된 날을 나타낸다. 또한 사타구니와 겨드랑이 림프절을 검사하였으며, 이는 연구 과정 동안 정상 유지되었다. 이들 데이터는 Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12가 심지어 매우 높은 투여량에서도 부작용없이 다른 벡터 전이유전자와 동시에 제공될 수 있음을 나타낸다. Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12로 처리된 NHP에서 정량적 ELISA에 의해 IL-12의 혈청 수준을 측정하였고, 예시적인 결과가 도 6에 도시되어 있다. 더욱 구체적으로, 4마리의 붉은털 원숭이의 뒷다리에 1x1011 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-IL-12 및 4x1011 VP의 Ad5 [E1-, E2b-]-gag/pol/nef/env(5x1011 VP)를 2주 간격으로 2회 투여하였다. 혈청 중 IL-12의 수준을 정량적 ELISA에 의해 측정하였다. 날짜는 샘플을 검사한 시점을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 특정 구현예를 기재하고 청구하기 위해 사용된 구성요소의 양, 농도, 반응 조건 등과 같은 특성을 나타내는 수치는 일부 경우 용어 "약"에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 기재된 설명 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치에 의한 매개변수는 특정 구현예에 의해 획득하고자 하는 적절한 특성에 따라 변동될 수 있는 근사치이다. 일부 구현예에서, 수치에 의한 매개변수는 기록된 유효 자릿수의 수에 비추어, 통상적인 반올림법을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 구현예의 광범위를 나타내는 수치 범위 및 매개변수가 근사치이기는 하나, 특정 실시예에 제시된 수치는 가능한 한 정확한 값으로 기록되어 있다. 본 발명의 일부 구현예에 제시된 수치는 각각의 시험 측정시 필연적으로 발생하는 표준 편차로부터 유발되는 특정 오차를 포함할 수 있다. 문맥상 반대로 지시되지 않는 한, 본 명세서에 제시된 모든 범위는 그의 한계치를 포함하는 것으로 해석되어야 하고, 열린 한계치의 범위는 상업적으로 실행되는 값을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 마찬가지로, 문맥상 반대로 지시되지 않는 한, 모든 값의 목록은 중간 값을 포함하는 것으로 고려되어야 한다.
본 명세서의 설명 및 하기의 청구범위 전반에 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")의 의미는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 또한, 본 명세서의 설명에 사용되는 바와 같이, 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, "내(in)"의 의미는 "내" 및 "상(on)"을 포함한다. 더욱이, 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 용어 "~에 연결된"은 직접 연결(서로 연결된 2개의 요소가 서로 접촉하는 것) 및 간접 연결(적어도 하나의 추가 요소가 2개의 요소 사이에 위치하는 것)을 모두 포함하려는 것이다. 따라서 용어 "~에 연결된" 및 "~와 연결된"은 동의어로 사용된다.
본 명세서에서 본 발명의 개념을 벗어나지 않고, 이미 기재된 것 이외의 더 많은 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 명백하다. 따라서, 본 발명의 대상은 첨부된 청구범위의 범위를 제외하고는 제한되지 않아야 한다. 더욱이, 본 명세서 및 청구범위 둘 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가장 넓은 가능한 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "~를 포함하다" 및 "~를 포함하는"은 비 배타적인 방식으로 요소, 성분 또는 단계를 지칭하는 것으로 해석하여, 지칭된 요소, 성분 또는 단계가 존재하거나 사용되거나, 명시적으로 지칭되지 않은 다른 요소, 성분 또는 단계와 조합될 수 있음을 나타낸다. 본 명세서의 청구범위가 A, B, C .... 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 적어도 하나를 지칭하는 경우, 그러한 군에서 단지 하나의 요소만이 필요하고, A + N 또는 B + N 등이 아니라는 맥락으로 해석되어야 한다.

Claims (41)

  1. 유전자 변형 NK 세포를 자극하는 방법으로서,
    유전자 변형 NK 세포를 IL-2에 항시적으로 노출시킴으로써, 유전자 변형 NK 세포를 IL-12에 감작화시키는 단계; 및
    감작화된 세포를 IL-12에 노출시켜, 감작화된 세포에 의한 인터페론 감마(IFNγ) 분비를 자극하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 감작화된 세포를 IL-12에 노출시키는 단계는 NKG2D의 발현을 증가시키는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 aNK 세포인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 적어도 100 IU/ml IL-2에 항시적으로 노출되는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, IL-2는 페길화(pegylation)된 IL-2인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 IL-2의 세포내 발현에 의해 IL-2에 항시적으로 노출되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 haNK 세포인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, IL-12는 재조합 바이러스에 감염된 세포로부터 발현되고, 재조합 바이러스는 IL-12를 인코딩하는 서열 절편을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 재조합 바이러스는 종양 및 환자 특이적 항원, 종양 관련 항원 및 종양 특이적 항원 중 적어도 하나를 인코딩하는 제2 서열 절편을 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, IL-12는 항체에 연결되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항체는 암 세포에 결합하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포를 시험관내에서 IL-2에 노출시키고, 감작화된 세포를 환자에 투여하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 감작화된 세포를 시험관내에서 IL-12에 노출시키고, 감작화된 세포를 환자에 투여하는, 방법.
  14. 암을 치료하는 방법으로서,
    감작화된 유전자 변형 NK 세포를 암으로 진단된 개체에 투여하는 단계로서, 유전자 변형 NK 세포는 IL-2에 대한 항시적 노출에 의해 감작화되는 단계; 및
    IL-12 항체 접합체 또는 IL-12를 인코딩하는 재조합 바이러스를 개체에 투여하여, 감작화된 유전자 변형 NK 세포에 의해 인터페론 감마(IFNγ) 분비를 자극하는 단계
    를 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 재조합 바이러스로부터 발현된 IL-12 또는 IL-12 항체는 NKG2D의 발현을 증가시키는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 aNK 세포인, 방법.
  17. 제14항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 적어도 100 IU/ml IL-2에 항시적으로 노출되는, 방법.
  18. 제14항에 있어서, IL-2는 페길화된 IL-2인, 방법.
  19. 제14항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 IL-2의 세포내 발현에 의해 IL-2에 항시적으로 노출되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 haNK 세포인, 방법.
  21. 제14항에 있어서, IL-12 항체 접합체를 투여하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 항체는 암 세포에 결합하는, 방법.
  23. 제14항에 있어서, 재조합 바이러스는 종양 및 환자 특이적 항원, 종양 관련 항원 및 종양 특이적 항원 중 적어도 하나를 인코딩하는 서열 절편을 포함하는, 방법.
  24. 제14항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포를 시험관내에서 IL-2에 노출시키고, 감작화된 세포를 환자에 투여하는, 방법.
  25. 제14항에 있어서, 감작화된 세포를 시험관내에서 IL-12에 노출시키고, 감작화된 세포를 환자에 투여하는, 방법.
  26. 암의 면역 요법에 사용하기 위한 감작화된 유전자 변형 NK 세포로서, 유전자 변형 NK 세포는 IL-2에 대한 항시적 노출에 의해 감작화되고, 항시적 노출은 (a) 배양 배지에 IL-2를 연속 또는 반 연속적으로 첨가하여 생물학적 활성 IL-2의 농도를 실질적으로 일정하게 유지하거나 (b) IL-2의 세포내 발현에 의해 수행되며, 면역 요법은 IL-12 항체 접합체 또는 IL-12를 발현하는 재조합 바이러스를 사용하는 감작화된 유전자 변형 NK 세포.
  27. 제26항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 aNK 세포인, 감작화된 세포.
  28. 제26항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 적어도 100 IU/ml IL-2(200/500/1,000)에 대한 항시적 노출에 의해 감작화되는, 감작화된 세포.
  29. 제26항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 페길화된 IL-2에 의해 감작화되는, 감작화된 세포.
  30. 제26항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 IL-2의 세포내 발현에 의해 감작화되는, 감작화된 세포.
  31. 제30항에 있어서, 유전자 변형 NK 세포는 haNK 세포인, 감작화된 세포.
  32. 제26항에 있어서, 재조합 바이러스는 종양 및 환자 특이적 항원, 종양 관련 항원 및 종양 특이적 항원 중 적어도 하나를 인코딩하는 서열 절편을 추가로 포함하는, 감작화된 세포.
  33. 제26항에 있어서, 면역 요법은 IL-12 항체 접합체를 사용하는, 감작화된 세포.
  34. 제33항에 있어서, 항체는 암 세포에 결합하는, 방법.
  35. 포유류에서 NK 세포 또는 CD8+ T 세포의 활성을 증가시키는 방법으로서,
    포유류 세포를 복수의 재조합 바이러스 입자로 감염시키는 단계로서, 각각의 바이러스 입자는 재조합 바이러스 입자로 감염된 세포에서 IL-12의 발현을 유도하는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 IL-12를 인코딩하는 재조합 핵산 절편을 포함하는 단계
    를 포함하고;
    NK 세포는 aNK 세포, haNK 세포, 및 taNK 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 동종이계 NK92 유도 세포이며;
    복수의 재조합 바이러스 입자는 바이러스에 감염된 포유류에서 감염된 세포에서 다량의 IL-12의 발현을 유도함으로써, NK 세포 또는 CD8+ T 세포에서 NKG2D의 발현을 증가시키기에 충분한, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 재조합 바이러스 입자는 유전자 변형 아데노바이러스 Ad5 [E1-, E2b-] 입자인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 세포를 감염시키는 단계를 시험관내에서 수행하고, 감염된 세포를 환자에 투여하는, 방법.
  38. 제35항에 있어서, NK 세포는 haNK 세포인, 방법.
  39. 제35항에 있어서, NK 세포 및 T 세포의 NKG2D 기반 세포 독성을 증가시키는 약제학적 제제를 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 약제학적 제제는 IL-15, IL-2, 독소루비신 또는 글루텐 펩타이드 단편인, 방법.
  41. 제35항에 있어서, 세포를 적어도 1011개의 바이러스 입자로 감염시키는, 방법.
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