KR20190124129A

KR20190124129A - 겐티스산 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR20190124129A
Application number: KR1020190010675A
Authority: KR
Inventors: 김한영; 이혜숙
Original assignee: 애경산업(주)
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2019-11-04
Also published as: KR102120981B1

Abstract

본 발명은 겐티스산을 이용한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 하기의 화학식 1로 표현되는 겐티스산 유도체에 관한 것이다. 본 발명에 의한 겐티스산 유도체는 생체 친화성이 높고, 피부 주름 개선 효능을 보다 안정적으로 유지할 수 있다.
<화학식 1>

Description

겐티스산 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제 조성물{Gentisic acid derivative, method for production thereof and external skin composition containing the same}

본 발명은 피부주름 개선 소재로 활용할 수 있는 겐티스산 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 끊임없이 변화하게 된다. 피부 노화는 크게 자연 노화와 외적 노화로 구분되며, 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면, 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적 노화현상이 바로 주름형성이다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

상기 기질 금속단백질 분해 효소는 활성화 자리에 아연을 가지는 금속단백질 분해 효소 계열로 세포 외 기질에서 구조단백질을 형성하는 막 콜라겐(membrane collagen), 아그리칸(aggrecan), 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 같은 단백질을 분해하고 재구성하는 효소이다.

피부 주름 개선에 효과적이라고 알려진 물질로는 아데노신, 레티노인산(retinoic acid) 등이 있으나, 아데노신은 임상에서의 효능이 미미하고, 레티노인산은 가임여성에게 사용할 수 없고, 홍반 등 자극의 우려가 높다.

한편, 펩타이드는 생체친화적이며 매우 높은 활성을 가지기 때문에 차세대 신소재로 화장품 및 의약품 업계에서 많은 연구를 진행하고 있다. 하지만 상기 펩타이드는 인체 내에 가장 많은 효소 중의 하나인 프로테아제에 매우 쉽게 분해되는 특성을 가지기 때문에 그 효능을 유지하기가 어렵다. 이를 해결하기 위해 펩타이드의 일부를 변형하여 분해의 속도를 늦추는 방법이 많이 활용되고 있으며 일반적으로 N 말단에 acetyl 그룹 등을 도입한 형태가 제시되고 있다(Pharm. Res., 10, 1268, (1993); Int. J. Cancer, 83, 326, (1999)).

본 발명의 목적은 피부 주름 생성과 관련이 있는 효소인 콜라게나제(collagenase) 또는 엘라스타제(elastase)의 활성부위(active site)에 작용하는 펩타이드를 적용하여 보다 효과적으로 피부주름 개선 효능을 나타낼 뿐만 아니라 상기 펩타이드의 피부주름 개선 효능을 안정적으로 지속시킬 수 있는 겐티스산 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 양상은, 하기 화학식 1로 표현되는 겐티스산 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

<화학식 1>

(상기 화학식 1에서, X는 2 내지 6개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고, 상기 아미노산은 Pro, Gly, Leu, Arg, Ala 및 Asp 중 1종 이상이며, Y는 상기 펩타이드의 C-말단 부분이며, OH 또는 NH₂ 이다.)

본 발명은 펩타이드의 N말단에 항산화력이 높은 겐티스산을 도입하여 생체 내에서의 안정성을 향상시킴과 동시에 효능 향상을 기대할 수 있다. 본 발명의 화합물은 생체 내에서 펩타이드의 피부주름 개선 효능을 안정적으로 지속시켜 우수한 피부주름 개선 효과를 제공하면서 생체 친화성이 높아 안전하게 인체에 적용할 수 있는 겐티스산 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 콜라겐 생성 증가능, 콜라게나제 활성 억제능 및 엘라스타네 활성 억제능으로 인한 피부주름 개선에 효과적이다.

본 발명의 조성물은 피부에 자극이 적고, 펩타이드 성분을 포함하여 인체에 안전하며 장기간 사용하여도 부작용이 없다.

본 발명의 조성물은 다양한 제형으로 제형화가 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 겐티스산 유도체인 Gentisic-PG-OH의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 겐티스산 유도체인 Gentisic-PG-OH의 MALDI-TOF 분석결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 겐티스산 유도체인 Gentisic-GL-OH의 HPLC 분석결과를 나타낸다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 겐티스산 유도체인 Gentisic-GL-OH의 MALDI-TOF 분석결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 천연유래물질에 주름개선 기작을 가진 펩타이드가 도입된 겐티스산 유도체를 제공한다.

상기 겐티스산 유도체는 피부주름 개선 기작을 가진 펩타이드의 N-말단에 천연유래물질이 도입되어 생체 내에서 펩타이드의 분해를 억제하여 펩타이드의 안정성을 높이고, 지속적인 피부주름 개선 효능을 제공할 수 있다. 상기 겐티스산 유도체는 하기의 화학식 1로 표현될 수 있다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, X는 2 내지 6개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고, 상기 아미노산은 Pro, Gly, Leu, Arg, Ala 및 Asp 중 1종 이상이며, Y는 상기 펩타이드의 C-말단 부분이며, OH 또는 NH₂ 이다. NH₂는 펩타이드의 C-말단이 -CONH₂의 구조로 전환된 것을 의미한다.

겐티스산(Gentisic acid)의 카르복시기와 상기 펩타이드의 N-말단이 결합된 겐티스산 유도체이다. 상기 겐티스산 유도체는 펩타이드를 포함하여 생체친화성이 높고, 펩타이드의 N 말단에 겐티스산을 도입하여 펩타이드 소재가 가지는 효능을 더욱 향상시킬 수 있도록 설계한 것이다.

펩타이드(peptide)는 아미노산의 중합분자로 통상적으로 100개 이상의 아미노산의 중합체는 단백질로 분류된다. 펩타이드 결합은 카르복시기(-COOH)와 아민기(-NH₂) 사이에서 물 분자가 빠져나가고 아미드(-CONH-) 형태를 이루는 결합이다. 즉, 펩타이드는 단백질을 구성하는 기본 단위인 아미노산이 2개 이상 아미드 결합으로 연결된 형태의 화합물을 말하며, 보통 2 내지 50개의 아미노산이 결합하여 이룬 중합체로서, 분자량은 100,000 이하이다. 구성 아미노산의 수가 2, 3, 4 등의 펩타이드는 그 수에 따라서 각각 디펩타이드(dipeptide), 트리펩타이드(tripeptide), 테트라펩타이드(tetrapeptide) 등이라고 한다. 약 10개 이하의 아미노산 중합체를 올리고펩타이드(oligopeptide)라고 하며, 그 이상의 다수 아미노산이 아미드 결합으로 연결된 것을 폴리펩타이드라고 한다.

펩타이드를 이루는 기본 단위가 되는 아미노산은 아민기과 카르복시기 및 다양한 잔기를 가지고 있어 생물학적 활성을 지니고 있는 분자이다. 아미노산의 잔기는 크게 소수성과 친수성으로 나눌 수 있는 데 탄화수소 사슬이나 고리를 갖는 아미노산은 소수성을 띠게 된다. 대표적으로 20종류 -페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 세린(S), 트레오닌(T), 아스팔틱산(D), 아스파라진(N), 글루타믹산(E), 글루타민(Q), 라이진(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H), 시스테인(C), 메티오닌(M), 프롤린(P), 글라이신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 아이소류신(I)), 입체적으로는 L- 및 D-구조가 각각 있다. 또한 대표적인 20개의 아미노산 이외에도 베타알라닌, 사르코신, 노르발린, 노르류신, 오르니씬, 알파-아미노아디픽산, N-메틸류신, N-메틸페닐알라닌, 페닐글리신, 피페콜릭산, 4-케토피페콜릭산, 베타-하이드록시-류신, 베타-메틸 아스팔틱산, 베타-머캅토발린, 란씨오닌, 디하이드로알라닌, 디하이드로부티린 등 단백질에서 발견되지 않는 아미노산도 여러 종류가 있다. 이 중 본 발명의 일 실시예로써 상기 화학식 1의 X를 구성하는 아미노산은 프롤린(P), 글라이신(G), 류신(L), 아르기닌(R), 알라닌(A) 및 아스팔틱산(D)이 바람직하다.

상기 겐티스산 유도체는 피부 주름 생성에 영향을 미치는 효소 콜라게나제(collagenase)와 엘라스타제(elastase)의 활성부위(active site)와 결합하여 작용하는 펩타이드 서열 PLGL 또는 YYRADA을 단축하거나 순서 변경 및 유사한 아미노산으로 대체한 펩타이드를 제조하여 적용한 것이다. 상기 펩타이드는 인체를 구성하는 근간이 되기 때문에 생체친화성이 높을 뿐 아니라 우수한 활성도를 나타낼 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 콜라게나제(collagenase)와 엘라스타제(elastase)의 활성부위에 작용하여 보다 효과적으로 콜라게나제 혹은 엘라스타제의 발현을 저해하여 우수한 주름개선 효능을 제공할 수 있다.

상기 펩타이드는 상기 화학식 1에서, 펩타이드의 C-말단에 Y가 도입된 X로 표시된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표현되는 화합물이 될 수 있다.

<화학식 2>

본 발명에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은 Gentisic-PG-OH로 표현된다.

<화학식 3>

본 발명에 있어서, 상기 화학식 3의 화합물은 Gentisic-GL-OH로 표현된다.

또한, 본 발명에 따르면 펩타이드 합성단계, 유기물의 도입단계 및 유리단계를 포함하는 겐티스산 유도체의 제조방법을 제공한다.

상기 펩타이드 합성단계(A)는 고체상 합성 방법으로 펩타이드를 제조한다. 상기 고체상 합성방법은 펩타이드 합성에 널리 이용되는 방법으로, 본 발명에서는 합성 조건에 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 반응식 1 또는 2에 따라 제조될 수 있다.

반응식 1 및 반응식 2에 따라 상기 단계를 포함하는 겐티스산 유도체의 제조방법은 각각 아래와 같다.

[반응식 1]

반응식 1)아미노산의 C-말단에 OH기를 유지하기 위해서 지지체로서 2-CTC 레진(2-클로로트라이틸 클로라이드 레진)을 이용하는 반응

[반응식 2]

반응식 2)아미노산의 C-말단에 NH₂를 도입하여 -CONH₂를 형성하기 위해서 링크 아미드 링커(Rink amide linker)가 도입되어 있는 폴리스티렌 계열의 레진을 이용하는 반응

예를 들어, 반응식 1 및 반응식 2를 참조하면, 상기 반응식에서 R은 아미노산의 다양한 곁가지를 나타내고, 상기 X는 아미노산 2~6개로 이루어진 펩타이드이다. 상기 합성 공정은 부반응을 방지하기 위해 Fmoc으로 아민이 보호된 아미노산과 지지체를 결합시약 내에서 반응시킨다. 다음으로, 세척 및 여과 과정을 거친 후 상기 Fmoc 보호기를 제거한다. 이러한 합성 공정은 원하는 펩타이드를 형성하기 위해서 아미노산을 투입하여 반복적으로 진행된다.

상기 결합시약은 레진 및 반응 조건에 따라서 BOP, HOBt 및 DIEA 중 1종 이상을 적용할 수 있고, Fmoc 보호기의 제거는 20 % 피페리딘(peperidine)/NMP를 이용할 수 있다.

상기 유기물의 도입단계(B)는 결합시약 내에서 상기 제조된 펩타이드의 N-말단에 천연 유래 물질을 결합시킨다. 겐티스산의 카르복시기와 펩타이드의 N-말단이 결합하여 겐티스산 유도체를 형성한다. 상기 결합시약은 상기 언급한 바와 같다.

상기 유리단계(C)는 상기 유기물의 도입단계 이후에 트리플루오로아세트산(reagent K, Trifuloroacetic acid)을 이용한 유리반응으로 레진에 결합된 펩타이드를 분리한다.

상기 방법으로 획득된 겐티스산 유도체는 통상적으로 알려진 방법으로 세척, 정제 및 건조 등이 더 이루어질 수 있다.

또한 본 발명에 따르면 상기 겐티스산 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 피부외용제 조성물을 제공한다.

상기 피부주름 개선용 피부외용제 조성물은 상기 겐티스산 유도체를 0.000001 내지 30 중량%, 구체적으로는 0.001 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 겐티스산 유도체가 0.000001 중량% 미만으로 포함되는 경우 피부주름 개선 효과가 미미할 수 있으며, 30 중량%를 초과하여 포함되는 경우 제형의 안정성이 저하될 수 있다.

상기 피부외용제 조성물은 화장품 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장품 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 로션, 에센스, 영양크림, 아이크림, 화운데이션, 마스크팩, 팩트 등의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화장품 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부외용제 조성물 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

각 제형에 의한 피부외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들을 기타 피부외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이는 본 발명의 설명을 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.

<제조예 1> Gentisic-PG-OH 제조

2-CTC 레진(2-클로로트라이틱 클로라이드 레진)(치환율: 1mmol/g) 1g을 반응기에 가하고 N-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone, NMP) 용매에서 2시간 동안 팽윤시켜준 뒤, 20% 피페리딘(piperidine)/N-메틸피롤리돈을 가하여 30분 반응하여 레진의 Fmoc 보호기를 제거한다. 용액을 제거한 뒤, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈을 레진이 들어있는 반응기에 다시 가하고 1시간 동안 반응시켜 준다. 다시 용액을 제거한 뒤, 레진을 N-메틸피롤리돈, 메탄올, 디클로로메탄(Dichloromethane, DCM)으로 각각 3회 세척한 뒤, 마지막에 N-메틸피롤리돈으로 다시 세척하여 잉여의 반응용액을 제거한다.

반응기에 Fmoc-Gly를 297mg(치환기의 2당량), BOP reagent 442mg(아미노산 시약과 동량), 1-히드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt) 135mg(아미노산 시약과 동량), 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine, DIEA) 142mg(아미노산 시약의 1.1 당량)을 가하고 N-메틸피롤리돈 10mL을 가한 뒤, 3시간 동안 반응시켰다.

반응기의 용액을 모두 제거하고 레진을 N-메틸피롤리돈, 메탄올, 디클로로메탄으로 각각 3회 세척한 뒤, 마지막에 N-메틸피롤리돈으로 다시 세척하였다. 세척이 완료된 레진에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈을 가하고 앞서 설명한 방법과 동일한 반응을 진행하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 뒤에 이어서 Fmoc-Pro을 같은 방법으로 레진에 도입하였다.

프롤린(Proline, Pro, P)-글라이신(Glycine, Gly, G)이 도입된 레진에 겐티스산 (Gentisic acid) 180mg(치환기의 2당량), BOP reagent 442mg(아미노산 시약과 동량), 1-히드록시벤조트리아졸 135mg(아미노산 시약과 동량), 디이소프로필에틸아민 142mg(아미노산 시약의 1.1 당량)을 가하고 N-메틸피롤리돈 10mL을 가한 뒤, 24시간 동안 반응시켰다. 반응의 종결은 Kaiser's ninhydrin test를 이용하여 확인하였다.

상기와 같이 2-CTC 레진 위에서 제조된 Gentisic-Pro-Gly을 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)을 포함한 Reagent K를 이용하여 알려진 방법(Synthetic Peptides: A User's Guide(G.A. Grant, ed.), W.H. Freeman and Company, New York, 1992)으로 레진에서 분리하였다. 분리된 펩타이드 유도체는 에테르(cold ether)를 이용하여 침전시킨 후, 0℃에서 원심분리하여 용액과 분리하였다. 분리된 펩타이드 유도체는 동일 조건에서 에테르(cold ether)를 20mL 가하여 원심분리하는 과정을 3회 반복하여 불순물을 제거하였다. 원심분리가 끝난 펩타이드 유도체를 24시간 동결 건조하여 순도 98.897 %의 최종 생성물 약 100 mg을 얻었다.

최종 생성물의 존재를 HPLC 분석과 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry) 분석을 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 1 내지 도 2에 나타내었다.

<제조예 2> Gentisic-GL-OH 제조

반응기에 Fmoc-Leu를 297mg(치환기의 2당량), BOP reagent 442mg(아미노산 시약과 동량), 1-히드록시벤조트리아졸(1-Hydroxybenzotriazole, HOBt) 135mg(아미노산 시약과 동량), 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine, DIEA) 142mg(아미노산 시약의 1.1 당량)을 가하고 N-메틸피롤리돈 10mL을 가한 뒤, 3시간 동안 반응시켰다.

반응기의 용액을 모두 제거하고 레진을 N-메틸피롤리돈, 메탄올, 디클로로메탄으로 각각 3회 세척한 뒤, 마지막에 N-메틸피롤리돈으로 다시 세척하였다. 세척이 완료된 레진에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈을 가하고 앞서 설명한 방법과 동일한 반응을 진행하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 뒤에 이어서 Fmoc-Gly을 같은 방법으로 레진에 도입하였다.

글라이신(Glycine, Gly, G)-루신(Leucine, Leu, L)이 도입된 레진에 겐티스산 (Gentisic acid) 180mg(치환기의 2당량), BOP reagent 442mg(아미노산 시약과 동량), 1-히드록시벤조트리아졸 135mg(아미노산 시약과 동량), 디이소프로필에틸아민 142mg(아미노산 시약의 1.1 당량)을 가하고 N-메틸피롤리돈 10mL을 가한 뒤, 24시간 동안 반응시켰다. 반응의 종결은 Kaiser's ninhydrin test를 이용하여 확인하였다.

상기와 같이 2-CTC 레진 위에서 제조된 Gentisic-Pro-Gly을 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)을 포함한 Reagent K를 이용하여 알려진 방법(Synthetic Peptides: A User's Guide(G.A. Grant, ed.), W.H. Freeman and Company, New York, 1992)으로 레진에서 분리하였다. 분리된 펩타이드 유도체는 에테르(cold ether)를 이용하여 침전시킨 후, 0℃에서 원심분리하여 용액과 분리하였다. 분리된 펩타이드 유도체는 동일 조건에서 에테르(cold ether)를 20mL 가하여 원심분리하는 과정을 3회 반복하여 불순물을 제거하였다. 원심분리가 끝난 펩타이드 유도체를 24시간 동결 건조하여 순도 98.522 %의 최종 생성물 약 100 mg을 얻었다.

최종 생성물의 존재를 HPLC 분석과 MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry) 분석을 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 3 내지 도 4에 나타내었다.

<실험예 1> 세포 내 콜라겐 생성량 측정 실험

Human Dermal Fibroblasts (HDFs) 세포를 이용하여 세포 내 콜라겐 생성량 증가 효과를 측정하였다. HDFs 세포를 1% Antibiotic-Antimycotic, 10% FBS를 함유하는 DMEM/F12 3:1 혼합 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO₂배양기(HERAcell 150i, Thermo, USA) 내에서 배양하였다. HDFs 세포를 24-well plate에 5×10⁴cells/well로 접종하여 24시간 배양한 뒤 50 μM로 희석한 원료를 포함한 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 상층액을 취하여 배지 중 유리된 procollagen의 양을 Procollagen Type I C-Peptide (PIP) ELISA Kit을 이용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 콜라겐 생성 정도는 총 단백질량으로 보정하여 평가하였고, 양성대조군은 L-ascorbate (151 μM)를 이용하여 비교하였다. 단백질량은 표준용액으로 BSA를 사용하여 Bradford 방법에 따라 정량하였다. BSA는 0, 2, 5, 10, 20 μg/mL로 증류수에 단계적으로 희석하고 0.98 mL의 Bradford reagent에 각 농도의 BSA 용액을 20 μL씩 넣고 5분간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA standard curve를 구하였다. 같은 방법으로 24-well plate에 배양한 HDFs의 세포 용해액의 흡광도를 측정하고 BSA standard curve를 이용하여 단백질량을 산출하였다. 음성대조군은 시료를 첨가하지 않은 반응액을 사용하였다. 음성대조군에 대한 세포 내 콜라겐 생성량 증가 효과의 실험 결과를 표 1에 나타내었다.

		콜라겐 생성 증가율 (%)
실시예 1	Gentisic-PLGL-OH	13
실시예 2	Gentisic-PG-OH	49.9
실시예 3	Gentisic-GL-OH	33.2
실시예 4	Gentisic-LGL-OH	5.6
실시예 5	Gentisic-GLP-OH	3.2
실시예 6	Gentisic-RADA-NH₂	12.3
실시예 7	Gentisic-LG-OH	13.3
실시예 8	Gentisic-AR-OH	23
실시예 9	Gentisic-PDLDA-NH₂	8.3
비교예 1	PLGL	-24.45
비교예 2	YYRADA	-8.37
비교예 3	Gentisic-Y-OH	2
비교예 4	Gentisic-P-OH	-3.2
비교예 5	Gentisic-YW-OH	-7.5
비교예 6	Gentisic-YP-OH	-4.1
비교예 7	L-ascorbate (151 μM)	147

상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 겐티스산 유도체의 콜라겐 생성 효과는 펩타이드 단독에 비해 우수한 결과를 나타내었다. 또한 바람직한 아미노산인 프롤린(P), 글라이신(G), 류신(L), 아르기닌(R), 알라닌(A) 및 아스팔틱산(D) 중 2 내지 6개로 이루어진 경우, 다른 아미노산과 혼재된 경우보다 우수한 콜라겐 생성 증가율(%)을 보이는 것을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 본 발명의 피부외용제 조성물은 콜라겐을 효과적으로 촉진함으로써 피부의 주름 개선에 효과가 있음을 기대할 수 있었다.

<실험예 2> 세포 내 콜라게나제(MMP-1) 활성 억제 실험

Human Dermal Fibroblasts (HDFs) 세포를 24-well plate에 5×10⁴cells/well로 접종하여 24시간 배양하였다. 배양 후 콜라게나제의 활성을 유도하기 위하여 HBSS로 교환하여 UVA (6.3 J/cm²)를 조사하고 50 μM로 희석한 원료를 포함한 배지로 교환한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 콜라게나제의 활성은 MMP-1 Human ELISA Kit를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. MMP-1 활성은 총 단백질량으로 보정하여 평가하였고, 양성대조군으로는 Epigallocatechin gallate (EGCG) (5 μM)를 이용하여 비교 하였다. 단백질량은 표준용액으로 BSA를 사용하여 Bradford 방법에 따라 정량하였다. BSA는 0, 2, 5, 10, 20 μg/mL로 증류수에 단계적으로 희석하고 0.98 mL의 Bradford reagent에 각 농도의 BSA 용액을 20 μL씩 넣고 5분간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA standard curve를 구하였다. 같은 방법으로 24-well plate에 배양한 HDFs의 세포 용해액의 흡광도를 측정하고 BSA standard curve를 이용하여 단백질량을 산출하였다. 음성대조군은 시료를 첨가하지 않은 반응액을 사용하였다. 음성대조군에 대한 세포 내 콜라게나제(MMP-1) 활성 억제 효과의 실험 결과를 표 2에 나타내었다.

		콜라게나제(MMP-1) 활성 억제율 (%)
실시예 1	Gentisic-PLGL-OH	3.4
실시예 2	Gentisic-PG-OH	39.6
실시예 3	Gentisic-GL-OH	42
실시예 4	Gentisic-LGL-OH	38.4
실시예 5	Gentisic-GLP-OH	28.4
실시예 6	Gentisic-RADA-NH₂	13.3
실시예 7	Gentisic-LG-OH	14.8
실시예 8	Gentisic-AR-OH	16
실시예 9	Gentisic-PDLDA-OH	40.1
비교예 1	PLGL	-16.76
비교예 2	YYRADA	-22.31
비교예 3	Gentisic-Y-OH	-7.3
비교예 4	Gentisic-P-OH	2
비교예 5	Gentisic-YW-OH	-12.8
비교예 6	Gentisic-YP-OH	2.2
비교예 7	Epigallocatechin gallate (EGCG) (5 μM)	78

상기의 결과로부터 본 발명의 겐티스산 유도체의 콜라게나제(MMP-1) 활성 억제 효과는 펩타이드 단독에 비해 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 바람직한 아미노산인 프롤린(P), 글라이신(G), 류신(L), 아르기닌(R), 알라닌(A) 및 아스팔틱산(D) 중 2 내지 6개로 이루어진 경우, 다른 아미노산과 혼재된 경우보다 우수한 콜라게나제(MMP-1) 활성 억제율(%)을 보이는 것을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 본 발명의 피부외용제 조성물은 콜라게나제(MMP-1) 활성을 효과적으로 억제함으로써 피부 주름 개선을 기대할 수 있다.

<실험예 3> 엘라스타제(elastase) 활성 억제 실험

Human Dermal Fibroblasts (HDFs) 세포를 100 mm 배양 접시에 5×10⁴cells/dish로 접종하여 배양하였고, 배양된 세포는 0.1% Triton X-100 * 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0) 용액을 넣어 용해하였으며, 이 세포 용해액을 4 ℃에서 10,000 rpm 으로 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 이를 엘라스타제를 포함하는 효소액으로 사용하였다. 엘라스타제 효소액을 정량하여 96-well plate에 100 ㎍씩 넣고 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0) 완충액을 넣어 80 μL가 되도록 하였다. 시험원료는 완충액에 희석하여 10 μL씩 첨가하고 엘라스타제의 기질인 succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanyl p-nitroanilide(STANA) 10 mM 용액을 각 well 당 10 μL씩 넣고 37 ℃ (오븐기, JSOF-150, JSR, Korea)에서 90분 동안 반응시킨 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 엘라스타제 활성을 평가하였다. 양성대조군으로는 Phosphoramidon (10 μM)을 이용하여 비교하였다. 음성대조군에 대한 엘라스타제(elastase) 활성 억제 효과의 실험 결과를 표 3에 나타내었다.

		엘라스타제(elastase) 활성 억제율 (%)
실시예 1	Gentisic-PLGL-OH	15
실시예 2	Gentisic-PG-OH	19.4
실시예 3	Gentisic-GL-OH	20.5
실시예 4	Gentisic-LGL-OH	17
실시예 5	Gentisic-GLP-OH	18.2
실시예 6	Gentisic-RADA-NH₂	17
실시예 7	Gentisic-LG-OH	13.3
실시예 8	Gentisic-AR-OH	18
비교예 1	PLGL	4.3
비교예 2	YYRADA	3.8
비교예 3	Gentisic-Y-OH	4
비교예 4	Gentisic-P-OH	5.6
비교예 5	Gentisic-YW-OH	5.2
비교예 6	Gentisic-YP-OH	6.2
비교예 7	Phosphoramidon (10 μM)	81

상기의 결과로부터 본 발명의 겐티스산 유도체의 엘라스타제(elastase) 활성 억제 효과는 펩타이드 단독에 비해 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 또한 바람직한 아미노산인 프롤린(P), 글라이신(G), 류신(L), 아르기닌(R), 알라닌(A) 및 아스팔틱산(D) 중 2 내지 6개로 이루어진 경우, 다른 아미노산과 혼재된 경우보다 우수한 엘라스타제(elastase) 활성 억제율(%)을 보이는 것을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 본 발명의 피부외용제 조성물은 엘라스타제(elastase) 활성을 효과적으로 억제함으로써 피부 주름 개선을 기대할 수 있다.

<실험예 4> 세포독성실험

세포 생존율은 MTT의 원리를 이용하여 분석하였다. Human Dermal Fibroblasts (HDFs) 세포를 24-well plate에 5×10⁴cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양한 뒤 원료를 포함한 배지로 교환한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 0.5% MTT 용액을 각 well에 100 μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO를 500 μL씩을 넣고 10분간 흔들어 준 다음 570 nm (BioTek, USA)에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료를 첨가하지 않은 반응액을 사용하였다. 각 시료액에 의한 세포 생존율은 하기 수학식 1에 따라 계산하고 측정 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

(수학식 1)

세포생존율 (%) = A / B X 100

A : 시료의 흡광도

B : 음성대조군의 흡광도

		세포생존율 (%)
실시예 2	Gentisic-PG-OH (10 μM)	103.5
	Gentisic-PG-OH (25 μM)	100.5
	Gentisic-PG-OH (50 μM)	99.06
실시예 3	Gentisic-GL-OH (10 μM)	100.01
	Gentisic-GL-OH (25 μM)	101.76
	Gentisic-GL-OH (50 μM)	100.67

표 4의 결과로부터 본 발명의 겐티스산 유도체의 세포독성은 매우 낮다는 것을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 피부외용제 조성물은 피부에 안전할 것으로 판단된다.

<실험예 5> 피부자극 실험

피부에 대한 자극 정도를 평가하기 위하여 피부첩포시험(Human patch test)을 시행하였다. 피부첩포시험은 20세 이상의 정상인 20명을 대상으로 실시하였으며, 시료를 0.01% 0.1%, 1%, 10% 수용액으로 만든 다음 핀 챔버(Finn chamber)를 이용하여 48시간 동안 상박 안쪽 부위에 부착한 뒤 제거한 후에 첫 판독을 하고, 72시간이 경과한 후에 2차 판독을 시행하여 피부 반응 결과를 판정하였다. 평가기준과 자극지수의 계산 및 그 결과를 표 5 및 표 6에 나타내었다.

반응	가중치	평가기준
-	0.0	무반응
±	0.5	의심되는 양성 반응
+	1.0	약양성반응
++	2.0	강양성반응
+++	3.0	극양성반응

(수학식 2)피부자극지수 = Σ(가중치 X 반응인 수)/(최고 가중치 X 총 피험자 수) × 100

		피부자극지수	자극정도
실시예 2	Gentisic-PG-OH 0.01%	0.0	무자극
	Gentisic-PG-OH0.1%	0.0	무자극
	Gentisic-PG-OH1%	0.0	무자극
	Gentisic-PG-OH10%	0.0	무자극
실시예 3	Gentisic-GL-OH 0.01%	0.0	무자극
	Gentisic-GL-OH 0.1%	0.0	무자극
	Gentisic-GL-OH1%	0.0	무자극
	Gentisic-GL-OH 10%	0.4	무자극

실험 결과, 본 발명의 겐티스산 유도체는 피부에 대하여 무자극인 것으로 나타났으며, 피부외용제의 원료로 사용 시 피부에 자극이 없을 것으로 판단된다.

<실험예 6> 고온 안정성 시험

고온 보관 조건에 의한 겐티스산 유도체의 분해 유무를 확인하기 위하여 안정성 시험을 시행하였다. 고온 보관 안정성 시험은 시료를 0.5 % 농도로 희석하여 43 ℃ 조건에서 4주간 보관한 뒤 HPLC 분석을 통해 피크 면적을 구하였다. 시료의 함량 %는 하기 수학식 3에 따라 계산하고, 실험결과는 하기 표 7에 나타내었다.

(수학식 3)

시료의 함량 % = A / B × 100

A : 고온 테스트 후 시료의 피크 면적

B : 고온 테스트 전 시료의 피크 면적

	초기 대비 함량 %
Gentisic-PG-OH	96.7
Gentisic-GL-OH	98.2
PG	45
GL	36.2

상기의 결과로부터 겐티스산 유도체는 펩타이드 단독보다 안정성이 우수하다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 7> 피부 주름개선 효과 측정

하기 표 8의 조성으로 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 4의 크림 조성물을 제조하였다(단위: 중량%).

성분명	함량 (중량%)
성분명	실시예 1	실시예 2	실시예 3	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4
Gentisic-PG-OH	0.01	-	-	-	-	-	-
Gentisic-GL-OH	-	0.01	-	-	-	-	-
Gentisic-RADA-NH₂	-	-	0.01	-	-	-	-
Gentisic-Y-OH	-	-	-	0.01	-	-	-
Gentisic-P-OH	-	-	-	-	0.01	-	-
Gentisic-YW-OH	-	-	-	-	-	0.01	-
Gentisic-YP-OH	-	-	-	-	-	-	0.01
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
스테아린산	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
자기유화형 모노스테아린산 글리세린	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
프로필렌 글리콜	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
스테아릴글리시레티네이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
바셀린	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
산화방지제	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
향료	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
방부제	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

본 발명의 겐티스산 유도체의 사용 시 인체의 피부 주름개선 효과를 알아보기 위하여 30대 이상 여성을 대상으로 인체적용시험을 실시하였다. 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 4에서 제조한 크림을 그룹 당 10명씩으로 하여 1일 2회 아침 세안 후와 저녁 세안 후, 4주 동안 사용하게 하였다.

사용 전과 사용 후의 피부 주름개선 정도는 전안촬영시스템(facial stage DM-3(Moritex, 일본))을 이용하여 측정하였고, 분석 프로그램을 이용하여 4주 경과후의 주름 면적 변화량을 구해 효과를 비교하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.

(수학식 4)

주름 면적 변화량 = 사용 전 주름 면적 - 4주 사용 후 주름 면적

	주름 면적 변화량 (mm²)
실시예 1	12.3
실시예 2	11.4
실시예 3	11
비교예 1(Gentisic-Y-OH)	-3.2
비교예 2(Gentisic-P-OH)	2.5
비교예 3(Gentisic-YW-OH)	-3.8
비교예 4(Gentisic-YP-OH)	4

이하, 상기 실험예의 결과를 근거로 하여, Gentisic-PG-OH를 이용한 여러 제형 예를 조성하여 하기 표 10 내지 19와 같이 제시한다. 그러나, 이들 제형 예는 본 발명을 설명 하기 위한 것으로, 본 발명의 제형이 이들 제형 예에만 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다. Gentisic-GL-OH을 이용한 제형 예 또한 동일하게 이용될 수 있다.

<제형예 1> 유연화장수 (skin toner)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
에탄올	5.0
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르	0.5
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

<제형예 2> 수렴화장수(astrigent)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
글리세린	3.0
구연산	0.1
에탄올	10.0
폴리옥시에틸렌올레일에테르	1.0
소르비톨	2.0
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

<제형예 3> 로션(에멀젼)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	8.0
스쿠알란	10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄	2.0
트리에탄올아민	1.5
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이트	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
아르기닌	0.1
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

<제형예 4> 에센스 (essence)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
솔비톨	8.0
폴리옥시에틸렌글리콜 1500	6.0
에탄올	5.0
글리세린	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
폴리옥시에틸렌올레일 알코올 에테르	1.0
올리브유	0.3
히아루론산	0.2
산화방지제	적량
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

<제형예 5> 젤 (gel)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
에탄올	10.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.3
트리에탄올아민	0.3
산화방지제	적량
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

<제형예 6> 연고제 (ointment)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
세토스테아릴알코올	2.0
자기유화형 모노스테아린산	2.0
스테아린산	1.0
밀납	4.0
스쿠알란	7.0
모노스테아린 글리세린	3.0
모노스테아린산 소르비탄	1.0
폴리솔베이트 80	3.0
글리세린	5.0
프로필렌글리콜	4.0
향료	적량
바세린	잔량

<제형예 7> 크림 (cream)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
글리세린	5.0
스테아린산	8.0
스쿠알란	5.0
자기유화형 모노스테아린산 글리세린	2.5
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄	1.5
프로필렌 글리콜	4.0
스테아릴글리시레티네이트	0.2
바세린	2.0
산화방지제	적량
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

<제형예 8> 비누 (soap)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
야자유 지방산	1.0
이산화티탄	0.3
에틸렌디아민 테트라초산 디나트륨	0.1
향료	적량
색소	적량
비누칩 베이스	잔량

<제형예 9> 팩

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
알란토인	0.2
에탄올	5.0
노닐페닐에테르	0.3
나트륨카르복시메틸셀룰로오스	0.2
폴리비닐알코올	13.0
색소	적량
향료	적량
정제수	잔량

<제형예 10> 바디클렌져 (body cleanser)

성분명	함량 (중량%)
Gentisic-PG-OH	0.01
소디움라우레스설페이트	10
코코아미도프로필베타인	2
코코넛디에탄올아마이드	2
폴리쿼터니움-7	0.3
향료	정량
방부제	정량
정제수	잔량

본 발명에 있어서, 상기 표 10 내지 19와 같이 Gentisic-PG-OH 또는 Gentisic-GL-OH을 이용한 여러 제형을 조성한 겐티스산 유도체는 주름개선 기작을 가진 펩타이드의 N 말단에 천연 유래 물질이 도입되어 생체 내에서 펩타이드의 분해를 억제하여 펩타이드의 안정성을 높이고, 지속적인 주름개선 활성을 제공하며, 우수한 피부주름 개선 효능을 나타낼 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표현되는 것을 특징으로 하는 겐티스산 유도체.

<화학식 1>
Gentisic-X-Y

(상기 화학식 1에서, X는 PG(Pro-Gly) 또는 GL(Gly-Leu)이고, Y는 상기 펩타이드의 C-말단 부분이며, OH 이다)
제1항의 겐티스산 유도체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 피부외용제 조성물.
제2항에 있어서,
상기 겐티스산 유도체는 상기 조성물 100 중량%에 대해 0.000001 중량% 내지 30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 피부외용제 조성물.
제2항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 약제학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 약제학적 조성물이 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 중 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 약제학적 조성물.
제2항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 화장품 조성물이 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 로션, 에센스, 영양크림, 아이크림, 화운데이션, 마스크팩 및 팩트 중 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장품 조성물.