KR20190119027A - Method and apparatus of isolating stromal cells from biological tissue without using phosphatase - Google Patents

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Abstract

One embodiment of the present invention relates to a method of isolating stromal cells from a biological tissue without using an enzyme, and an apparatus thereof, wherein spontaneous migration of stromal cells in a biological tissue is induced so that the stromal cells are moved outside the biological tissue. Induction of the spontaneous migration of stromal cells is conducted when the biological tissue is attached to an attachment member of a material, to which the biological tissue can be attached. Induction of the spontaneous migration of stromal cells is conducted in a culture medium in which the stromal cells can survive. Accordingly, it is possible to resolve problems related to costs and time required to control toxicity of an enzyme, concerns about heterologous viruses, and instability caused by usage of an enzyme including a component extracted from gastric juice of a heterologous animal. In addition, it is possible to separate the stromal cells from the biological tissue without using the enzyme, wherein the stromal cells separated from the biological tissue are in a natural state relatively intact without any damage, thereby improving separation efficiency.

Description

효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS OF ISOLATING STROMAL CELLS FROM BIOLOGICAL TISSUE WITHOUT USING PHOSPHATASE}METHOD AND APPARATUS OF ISOLATING STROMAL CELLS FROM BIOLOGICAL TISSUE WITHOUT USING PHOSPHATASE}

본 발명은 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치로서, 상세하게는 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치에 관한 것이다.The present invention relates to a method and apparatus for separating stromal cells from living tissue, and more particularly, to a method and apparatus for separating stromal cells from living tissue without using an enzyme.

동물의 생체조직 속에 존재하는 기질세포를 생체조직에서 분리하는 방법에는 효소를 사용하는 방법과 효소를 사용하지 않는 방법이 있다.Separation of stromal cells in animal tissues from animal tissues can be performed using enzymes or without enzymes.

효소를 사용하여 동물의 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법은 초기 분리 단계에서 효소를 사용하는 방법 또는 수확이나 계대(subculture) 단계에서 효소를 사용하는 방법이 있다.Methods for separating stromal cells from animal tissue using enzymes include using enzymes at the initial stage of separation or using enzymes at harvest or subculture stages.

생체조직에서 기질세포를 분리하는 초기 단계에서는, 생체조직에서 기질세포를 감싸며 강하게 붙어있는 콜라겐(collagen) 조직들을 콜라게나아제(collagenase)와 같은 효소를 사용함으로써 생체조직에서 기질세포를 녹여내고, 이와 같이 녹여낸 기질세포에서 효소를 세척한 후 기질세포를 얻게 된다. 그러나 이 경우에는 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점이 발생하게 된다.In the early stages of separating stromal cells from biological tissues, the collagen tissues that bind and bind strongly to the stromal cells in the biological tissues are dissolved by using enzymes such as collagenase to dissolve the stromal cells in the biological tissues. After washing the enzyme from the dissolved stromal cells to obtain the stromal cells. In this case, however, there are problems such as toxicity and cost of enzymes, processing time, and concern for heterologous viruses.

생체조직에서 기질세포를 분리하는 위 초기 단계에서 분리된 기질세포를 배양기에서 증식하는 경우, 세포 밀도(confluency)가 높아져 계대를 해야 할 때에는, 트립신(trypsin)과 같은 효소를 사용함으로써 계대를 하게 된다. 그러나 이때 사용되는 효소는 이종 동물의 위액에서 추출된 성분이어서 안정성이 떨어지는 문제점이 발생하게 된다.In the early stages of separating stromal cells from biological tissues, when the stromal cells are grown in an incubator, they are passaged by using an enzyme such as trypsin when the cell density is increased and the passage is necessary. . However, the enzyme used at this time is a component extracted from the gastric juice of a heterologous animal, which causes a problem of low stability.

효소를 사용하지 않고 동물의 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법은, 초기 분리 단계에서는, 초음파나 레이저 또는 강한 음압 등을 이용하여 생체조직을 미세하게 절단함으로써 콜라겐을 파괴하고 원심분리를 통해 기질세포를 분리하게 된다. 그러나 이 경우에는 기질세포가 콜라겐으로부터 떨어져 온전하게 분리될 확률이 극히 낮고 기질세포의 손상이 커져서 효소를 사용하는 방법에 비해 수율이 5% 미만이며 공정이 복잡하게 되는 문제점이 있다.The method of separating stromal cells from animal tissues without using enzymes, in the initial separation step, breaks down collagen by finely cutting biological tissues using ultrasonic waves, lasers, or strong negative pressure, and then removes stromal cells through centrifugation. Will be separated. In this case, however, the probability of stromal cells being completely separated from collagen is extremely low, and the damage of stromal cells is increased, resulting in a process yield that is less than 5% and complicated in the process compared to the method of using an enzyme.

효소를 사용하지 않고 동물의 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법은, 수확 또는 계대 단계에서는, 분리된 기질세포를 배양 증식하기 위하여 비중이 다른 마이크로 비드 표면에 세포를 증식하고, 이와 같이 세포가 증식된 마이크로 비드들을 액체와 함께 혼합하는 것을 반복하여 마이크로 비드들을 서로 충돌시킴으로써 이탈되어 나오는 세포를 수거하거나 또는 평면에 기질세포를 배양 증식한 후 스크레이퍼(scraper)로 기질세포를 긁어내게 된다. 그러나 이 경우에는 마이크로 비드가 구형이므로 상호 충돌과정에서 마이크로 비드 표면에 증식된 세포가 이탈되는 효과를 극대화 할 수 없고 스크레이퍼로 긁어내어 이탈되는 세포의 수가 많지 않음은 물론 긁어내는 과정에서 세포가 손상될 염려가 있는 문제점이 있다.In the method of separating stromal cells from animal tissue without using an enzyme, at the harvesting or passaging stage, cells are grown on the surface of microbeads with different specific gravity to culture and proliferate the separated stromal cells. Mixing the microbeads with the liquid is repeated to collide the microbeads with each other to collect the escaped cells or to culture and proliferate the stromal cells on a plane, and then scrape the stromal cells with a scraper. However, in this case, since the microbeads are spherical, the effect of the cells proliferating on the surface of the microbeads in the collision process cannot be maximized, and the number of cells that are scraped off with a scraper is not large, and the cells can be damaged during the scraping process. There is a problem with concern.

한편, 지방조직과 같은 생체조직을 배양시킨 것은 배양액에 뜨는 특성이 있는 점을 이용하여 배양액이 가득 채워진 용기에 지방조직을 넣음으로써 배양액에 떠서 배양용기의 상부 내측면에 배양된 지방조직이 부착되도록 유도한다. 그러나 이 경우 배양된 지방조직이 부착되는 면은 평면으로 되어 있어서 배양된 지방조직이 부착되는 면을 극대화 할 수 없고 배양 효율을 극대화 할 수 없는 문제점이 있게 된다.On the other hand, the culture of biological tissues such as adipose tissue is characterized by floating in the culture medium by placing the adipose tissue in a container filled with culture medium so that the cultured adipose tissue adheres to the upper inner surface of the culture vessel by floating in the culture medium. Induce. However, in this case, the surface to which the cultured adipose tissue is attached has a problem that the surface to which the cultured adipose tissue is attached cannot be maximized and the culture efficiency cannot be maximized.

대한민국 공개번호 제10-2015-0114947호 공개특허공보Republic of Korea Publication No. 10-2015-0114947

본 발명이 해결하고자 하는 주요 과제는, 효소를 사용하지 않고 미세하게 절단한 생체조직을 배양액에 넣고 생체조직에서 콜라겐으로 둘러싸인 기질세포가 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)에 의해 생체조직의 외부로 이동하도록 유도함으로써, 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점과 이종 동물의 위액에서 추출된 성분을 갖는 효소를 사용하는 것으로 인한 불안정성의 문제점을 해소함과 동시에 생체조직으로부터 기질세포를 효소를 사용하지 않고 손상 없이 상대적으로 온전한 자연 상태의 기질세포로 분리하여 분리효율을 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.The main problem to be solved by the present invention is to put microstructures cut finely without enzymes into the culture medium and induce stromal cells surrounded by collagen in the tissues to move out of the tissues by spontaneous migration. This eliminates the problems of enzyme toxicity, cost, processing time, and concerns about heterologous viruses and instability caused by using enzymes extracted from gastric juice from heterologous animals, while encouraging stromal cells from biological tissues. It is to provide a method and apparatus that can be separated into stromal cells in a relatively intact natural state without damage to improve the separation efficiency.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 주요 과제는, 배양액 내에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 기질세포를 생체조직에서 효과적으로 스크레이핑(scraping)함으로써, 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점과 이종 동물의 위액에서 추출된 성분을 갖는 효소를 사용하는 것으로 인한 불안정성의 문제점을 해소함과 동시에 생체조직으로부터 기질세포의 분리효율을 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.Another main problem to be solved by the present invention, by scraping the stromal cells migrated out of the biological tissue in the tissue by spontaneous migration in the culture medium, the toxicity and cost of the enzyme, processing time, heterogeneous It provides a method and apparatus that can improve the separation efficiency of stromal cells from biological tissues while at the same time eliminating the problems such as concerns about viruses and the instability caused by using enzymes having components extracted from the gastric juice of heterologous animals. will be.

위 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용하고, 기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부착부재 상에 생체조직이 부착된 상태에서 이루어며, 기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 기질세포가 생존할 수 있는 배양액 내에서 이루어는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.One embodiment of the present invention for solving the above problems, as a method for separating stromal cells from biological tissue without using an enzyme, induces spontaneous migration of stromal cells of the biological tissue (spontaneous migration) in vivo tissue Induction of spontaneous migration of stromal cells is carried out in the state where biological tissue is attached on an attachment member of a material capable of attaching biological tissue, and induction of spontaneous migration of stromal cells is performed. It provides a method characterized in that is made in the culture medium that can survive.

본 실시례에 있어서, 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 생체조직을 미세하게 절단하는 것을 더 포함할 수 있다.In the present embodiment, it may further comprise finely cutting the biological tissue so that at least a portion of the stromal cells exposed to the outside between the collagen surrounding the stromal cells in the biological tissue.

본 실시례에 있어서, 부착부재의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리하는 것을 더 포함할 수 있고, 기질세포의 분리는 부착부재에 부착된 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 이루어질 수 있다. In the present embodiment, it may further comprise separating the stromal cells moved to the outside of the attachment member in the biological tissue, separation of the stromal cells may be made by applying a physical force to the stromal cells attached to the attachment member.

본 실시례에 있어서, 생체조직의 외부로 이동된 기질세포에 가하는 물리적 힘은 배양액 내에서 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 배양액과 함께 난류 운동시킴으로써 발생하는 힘일 수 있다.In this embodiment, the physical force applied to the stromal cells moved out of the biological tissue may be a force generated by turbulent movement of the stromal cells moved out of the biological tissue in the culture with the culture.

본 실시례에 있어서, 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 것을 더 포함할 수 있다.In this embodiment, it may further comprise collecting the stromal cells isolated from the biological tissue.

위 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, (1) 생체조직을 미세하게 절단하는 것; (2) 미세하게 절단된 생체조직을 배양액 내에서 그 생체조직이 부착될 수 있는 소재의 부착부재 상에 부착시키는 것; (3) 부착부재 상에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것; 및 (4) 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 부착부재에서 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention for solving the above problems, a method for separating stromal cells from living tissue without using an enzyme, (1) to finely cut the living tissue; (2) attaching the finely cut biological tissue onto the attachment member of the material to which the biological tissue can be attached in the culture medium; (3) inducing spontaneous migration of stromal cells on the attachment member to move the stromal cells out of the living tissue; And (4) separating the stromal cells migrated out of the biological tissue from the attachment member.

본 실시례에 있어서, (1)의 생체조직은 그 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단될 수 있다.In this embodiment, the biological tissue of (1) can be minutely cut so that at least a portion of the stromal cells are exposed to the outside between collagen surrounding the stromal cells in the biological tissue.

본 실시례에 있어서, (4)의 기질세포의 분리는 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배열된 복수의 부착부재들을 배양액의 난류 운동에 의해 서로 충돌시켜 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 이루어질 수 있다.In this embodiment, the separation of the stromal cells of (4) is made by applying a physical force to the stromal cells by colliding a plurality of attachment members arranged with the stromal cells moved out of the biological tissue by turbulent movement of the culture medium Can be.

본 실시례에 있어서, (5) 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 것을 더 포함할 수 있다.In this embodiment, (5) may further comprise collecting the stromal cells separated from the biological tissue.

본 실시례에 있어서, (2) 내지 (4)를 순서대로 반복할 수 있다.In this embodiment, (2) to (4) can be repeated in order.

본 실시례에 있어서, 생체조직, 배양액 및 부착부재로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나를 교체한 후에 (2) 내지 (4)를 순서대로 반복할 수 있다.In this embodiment, after replacing at least one selected from the group consisting of biological tissue, culture medium and the attachment member (2) to (4) can be repeated in order.

위 실시례들에 있어서, 생체조직은 피부, 지방, 연골, 점막, 혈관, 인대, 심장, 뇌, 태반, 제대, 양막, 근육 및 말초신경으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.In the above embodiments, the biological tissue may include at least one selected from the group consisting of skin, fat, cartilage, mucosa, blood vessels, ligaments, heart, brain, placenta, umbilical cord, amniotic membrane, muscle and peripheral nerves.

위 실시례들에 있어서, 배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 및 소태아혈청(fetal bovine serum)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. In the above embodiments, the culture medium may include at least one selected from the group consisting of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) and fetal bovine serum.

위 과제를 해결하기 위한 본 발명의 또다른 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 장치로서, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 부착부재를 구비하고, 부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 가지거나 또는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 것을 특징으로 하는 장치를 제공한다.Another embodiment of the present invention for solving the above problems, as an apparatus for separating stromal cells from biological tissue without using an enzyme, by attaching the biological tissue in the culture medium to induce spontaneous migration of stromal cells of the biological tissue Provided with an attachment member for moving the stromal cells to the outside of the biological tissue, the attachment member having a smaller average specific gravity than the culture medium or having a larger average specific gravity than the culture medium.

본 실시례에 있어서, 부착부재가 배양액보다 더 작은 평균비중을 경우에, 그 부착부재는, 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.In the present embodiment, when the attachment member has a smaller average specific gravity than the culture medium, the attachment member is made of polypropylene, polyethylene, polyurethane, extracellular matrix (ECM), collagen (collagen). ), Polydioxanone, polycaprolactone, poly (L-lactide), PLGA (poly (lactic-co-glycolic acid)), PLA (poly (lactic acid)), It may include at least one selected from the group consisting of PGA (pterolyglutamic acid), hyaluronic acid (hyaluronic acid) and silicon.

본 실시례에 있어서, 부착부재가 배양액보다 더 큰 평균비중을 경우에, 그 부착부재는, 테프론(teflon), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리에틸렌(polyethylene), 프탈레이트(phthalate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.In the present embodiment, when the attachment member has a larger average specific gravity than the culture medium, the attachment member is made of teflon, polycarbonate, polyethylene, phthalate, polystyrene, Polyurethane, extracellular matrix (ECM), collagen, polydioxanone, polycaprolactone, poly (L-lactide), PLGA (poly (lactic-co) -glycolic acid)), PLA (poly (lactic acid)), PGA (pterolyglutamic acid), hyaluronic acid (hyaluronic acid) and may include at least one selected from the group consisting of silicon.

본 실시례에 있어서, 부착부재는 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단된 생체조직을 부착시키는 것일 수 있다.In this embodiment, the attachment member may be to attach the micro-tissue cut tissue so that at least a portion of the stromal cells exposed to the outside between the collagen surrounding the stromal cells in the biological tissue.

본 실시례에 있어서, 부착부재는, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시킬 뿐만 아니라, 이와 같이 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리시키는 것일 수 있다.In the present embodiment, the attachment member attaches biological tissues in a culture medium, induces spontaneous migration of stromal cells of the biological tissues, thereby moving the stromal cells to the outside of the biological tissues, May be isolated from the tissue.

본 실시례에 있어서, 부착부재는, 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배열되는 영역을 이루는 본체와, 본체에서 외측으로 연장되어 본체의 두께보다 더 얇은 두께로서 타 부착부재에 배열된 기질세포를 스크레이핑(scraping)할 수 있는 형상을 갖는 스크레이핑부를 구비하는 것일 수 있다.In this embodiment, the attachment member is a main body constituting the region where the stromal cells moved out of the biological tissue by spontaneous migration is arranged, and extends outward from the main body to a thinner than the thickness of the main body to the other attachment member It may be provided with a scraping portion having a shape capable of scraping the arranged stromal cells (scraping).

본 실시례에 있어서, 스크레이핑부는 그 횡단면의 코너부가 형성하는 각도가 예각을 이루는 것일 수 있다.In the present embodiment, the scraping part may be an acute angle of the angle formed by the corner portion of the cross section.

본 실시례에 있어서, 배양액과 생체조직 및 부착부재를 내부에 수용하는 용기를 더 구비하는 것일 수 있다.In this embodiment, it may be further provided with a container for accommodating the culture solution and biological tissue and the attachment member therein.

본 실시례에 있어서, 용기는 배양액과 생체조직 및 부착부재가 수용되는 공간을 형성하며 회전에 의한 원심분리가 가능하도록 형성된 경사부를 갖는 것일 수 있다.In this embodiment, the container may have a inclined portion that forms a space in which the culture solution, the biological tissue and the attachment member are accommodated, and is capable of centrifugation by rotation.

본 실시례에 있어서, 용기는 정회전과 역회전에 의한 배양액의 난류를 유도할 수 있는 것일 수 있다.In this embodiment, the container may be one capable of inducing turbulence of the culture solution by the forward rotation and reverse rotation.

본 실시례에 있어서, 용기는 생체조직은 투과되지 않고 배양액은 투과되며 용기가 정지된 상태에서 배양액에 잠기는 위치에 배열되어 배양액에 뜨는 생체조직이 배양액에 뜨는 것을 차단하는 차단막을 더 구비하는 것일 수 있다. In this embodiment, the container may be further provided with a barrier membrane which is arranged in a position in which the biological tissue is not permeated, the culture fluid is permeated and submerged in the culture medium while the container is stopped to prevent the biological tissue floating on the culture medium from floating on the culture medium. have.

본 실시례에 있어서, 용기는 원심력이 최대인 위치에 형성되어 생체조직에서 분리된 기질세포를 원심력에 의해 수렴시키는 수렴부를 갖는 것일 수 있다.In this embodiment, the container may have a converging portion which is formed at the position where the centrifugal force is maximum and converges the stromal cells separated from the biological tissue by the centrifugal force.

본 실시례에 있어서, 용기는 수용 공간에서 수렴부까지의 경로 상에 위치하여 원심력에 의한 기질세포의 이동을 허용하고 생체조직 및 부착부재의 이동을 차단하는 필터를 더 구비하는 것일 수 있다.In this embodiment, the container may be further provided with a filter which is located on the path from the accommodation space to the convergence part to allow the movement of the stromal cells by centrifugal force and block the movement of the living tissue and the attachment member.

본 실시례에 있어서, 용기는 수렴부에 형성되어 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 기질세포 배출부를 더 구비하는 것일 수 있다.In this embodiment, the container may be further provided with a stromal cell discharge portion formed in the converging portion to discharge the stromal cells converged on the converging portion to the outside.

본 실시례에 있어서, 용기는 외부에서 수용 공간으로 연장되어 배양액을 주입하거나 배출시키는 배양액 관통관을 더 구비하는 것일 수 있다.In this embodiment, the container may further include a culture solution through-tube extending from the outside to the receiving space to inject or discharge the culture solution.

본 실시례에 있어서, 용기는 내부 소독을 위한 가스를 주입시키는 가스 주입부를 더 구비하는 것일 수 있다.In the present embodiment, the container may further include a gas injection unit for injecting gas for internal disinfection.

본 발명의 주요 효과는, 효소를 사용하지 않고 미세하게 절단한 생체조직을 배양액에 넣고 생체조직에서 콜라겐으로 둘러싸인 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외측면으로 이동하도록 유도함으로써, 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점과 이종 동물의 위액에서 추출된 성분을 갖는 효소를 사용하는 것으로 인한 불안정성의 문제점을 해소함과 동시에 생체조직으로부터 기질세포를 효소를 사용하지 않고 손상 없이 상대적으로 온전한 자연 상태의 기질세포로 분리하여 분리효율을 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공할 수 있는 것이다.The main effect of the present invention, by inserting the finely cut biological tissue in the culture medium without the use of enzymes to induce stromal cells surrounded by collagen in the biological tissue to move to the outer surface of the biological tissue by spontaneous migration, It solves the problems of cost, processing time, concern about heterologous virus, and instability caused by using enzymes extracted from gastric juice of heterologous animals and without damaging stromal cells from biological tissue without using enzyme. It is possible to provide a method and apparatus that can be separated into relatively intact natural stromal cells to improve the separation efficiency.

본 발명의 다른 주요 효과는, 배양액 내에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외측면으로 이동한 기질세포를 생체조직에서 효과적으로 스크레이핑(scraping)함으로써, 효소의 독성과 비용, 처리 시간, 이종 바이러스에 대한 우려 등의 문제점과 이종 동물의 위액에서 추출된 성분을 갖는 효소를 사용하는 것으로 인한 불안정성의 문제점을 해소함과 동시에 생체조직으로부터 기질세포의 분리효율을 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공할 수 있는 것이다.Another main effect of the present invention is to effectively scrape the stromal cells that migrated to the outer surface of the tissue by spontaneous migration in the culture tissue, thereby reducing the toxicity, cost, processing time and heterologous virus of the enzyme. It is possible to provide a method and apparatus which can solve the problems of concern and the instability caused by using enzymes extracted from gastric juice of heterologous animals and improve the separation efficiency of stromal cells from biological tissues. will be.

도 1은 생체조직에서 기질세포가 뻗어 나온 이미지를 나타내는 사진이다.
도 2는 크로믹 봉합사에 붙은 지방세포의 이미지를 나타내는 사진이다.
도 3은 부착부재 상에서 생체조직의 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 것을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 4는 다른 형태의 부착부재 상에서 생체조직의 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 것을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 5는 부착부재 상에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 기질세포가 다른 부착부재에 의해 스크레이핑되는 것을 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 6은 배양액과 생체조직 및 부착부재가 수용된 용기 내에서 각 층으로 배열된 상태를 나타내는 도면이다.
도 7은 용기 내의 배양액과 생체조직 및 부착부재가 원심분리된 상태를 나타내는 도면이다.
도 8은 용기 내의 생체조직으로부터 분리된 기질세포가 배양액과 함께 수렴부에 수렴된 상태를 나타내는 도면이다.1 is a photograph showing an image from which stromal cells extend from living tissue.
2 is a photograph showing an image of fat cells attached to a chromic suture.
3 is a view schematically showing that the stromal cells of the biological tissue on the attachment member moved out of the biological tissue by spontaneous migration.
4 is a view schematically showing that stromal cells of biological tissue migrated out of biological tissue by spontaneous migration on other types of attachment members.
5 is a view schematically showing that stromal cells migrated out of biological tissue by spontaneous migration on an attachment member are scraped by another attachment member.
Figure 6 is a view showing a state arranged in each layer in a container containing the culture medium, biological tissue and the attachment member.
7 is a view showing a state in which the culture medium and the biological tissue and the attachment member in the container is centrifuged.
8 is a view showing a state in which the stromal cells separated from the biological tissue in the container converged to the convergent part together with the culture solution.

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명한다. 이러한 설명은 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 이해할 수 있도록 하기 위하여 예시적으로 제공되는 것으로서 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로, 본 발명의 범위가 이하의 설명에 의해 한정되는 것은 아니다.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Specific contents for carrying out the invention will be described. These descriptions are provided by way of example so that those skilled in the art can understand the specific contents for carrying out the invention can be modified in various other forms, the scope of the present invention is It is not limited by the description of.

1. 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법1. How to separate stromal cells from living tissue without using enzyme

본 방법은 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용하는 것을 특징으로 한다. This method is a method for separating stromal cells from living tissue without using an enzyme, characterized in that it is used to induce spontaneous migration of stromal cells of living tissue to move the stromal cells out of the living tissue. .

생체조직은 피부, 지방, 연골, 점막, 혈관, 인대, 심장, 뇌, 태반, 제대, 양막, 근육 및 말초신경으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.The biological tissue may include at least one selected from the group consisting of skin, fat, cartilage, mucous membrane, blood vessel, ligament, heart, brain, placenta, umbilical cord, amniotic membrane, muscle, and peripheral nerve.

생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션은 생체조직 내에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐(collagen)을 뚫고 기질세포가 자발적으로 외부로 이동하는 것을 의미한다. 이러한 기질세포의 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직에서 계속 기질세포가 뻗어 나온 이미지는 예시적으로 도 1에 나타나 있는 바와 같다.Spontaneous migration of stromal cells of biological tissues means that the stromal cells spontaneously migrate through the collagen surrounding the stromal cells in the biological tissues. An image of stromal cells continuously extending from a living tissue by spontaneous migration of such stromal cells is illustrated in FIG. 1.

이러한 기질세포의 자발적인 마이그레이션에 의해 기질세포가 생체조직의 외부로 이동하는 것은 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하기 위한 매우 중요한 특성이 될 수 있다. 본 발명은 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용함으로써 효소를 사용하지 않고도 생체조직에서 기질세포를 분리할 수 있는 방법을 제공한다.The movement of stromal cells out of biological tissues by spontaneous migration of these stromal cells may be a very important characteristic for separating stromal cells from biological tissues without the use of enzymes. The present invention provides a method for separating stromal cells from living tissue without using an enzyme by inducing spontaneous migration of stromal cells of living tissue to move the stromal cells out of the living tissue.

기질세포의 자발적 마이그레이션은 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부재에 생체조직을 부착시킨 상태에서 더욱 효과적으로 이루어질 수 있다. 예컨대, 예시적으로 도 2에 나타나 있는 바와 같이, 크로믹 봉합사(chromic catgut)에 지방조직이 부착된 때에 지방세포의 자발적 마이그레이션에 의해 지방조직 외부로 지방세포가 이동하여 붙어 있을 수 있다. 이와 같이 기질세포의 자발적 마이그레이션은 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부재에 생체조직을 부착시킨 상태에서 유도됨으로써 기질세포의 자발적 마이그레이션을 더욱 효과적으로 유도할 수 있고 이에 의해 생체조직에서 기질세포를 더욱 효과적으로 분리할 수 있게 된다. 여기서 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부재는 다양한 부재가 될 수 있다. 예컨대, 크로믹 봉합사와 동일한 소재의 부재가 될 수 있다. Spontaneous migration of stromal cells can be more effective in a state in which the living tissue is attached to the absence of a material that can attach the living tissue. For example, as shown in FIG. 2, when the adipose tissue is attached to a chromic catgut, the adipocytes may be attached to the outside of the adipose tissue by spontaneous migration of the adipose cells. As such, spontaneous migration of stromal cells is induced in the state in which biological tissue is attached to the absence of a material capable of attaching biological tissue, thereby inducing spontaneous migration of stromal cells more effectively, thereby more effectively inducing stromal cells in living tissue. It can be removed. Here, the member of the material capable of attaching the biological tissue may be various members. For example, it may be a member of the same material as the chromic suture.

기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 기질세포가 생존할 수 있는 배양액 내에서 이루어지는 것이 바람직하다. 이에 의해 생체조직 외부로 이동한 기질세포를 배양액과 함께 분리함으로써 기질세포를 손상되지 않게 수집하여 배양할 수 있게 된다.Induction of spontaneous migration of stromal cells is preferably performed in a culture medium in which stromal cells can survive. As a result, the stromal cells that have migrated to the outside of the living tissue are separated together with the culture medium, so that the stromal cells can be collected and cultured intact.

배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 및 소태아혈청(fetal bovine serum)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.The culture may include at least one selected from the group consisting of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) and fetal bovine serum.

배양액은 생체조직과 평균비중이 같은 것을 사용함으로써 배양액에 전체적으로 생체조직이 분포되도록 하여 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동한 기질세포를 배양액과 함께 효율적으로 분리할 수 있게 된다.In the culture medium, the same specific gravity as the biological tissue is used to distribute the biological tissue throughout the culture medium so that the stromal cells moved out of the biological tissue by spontaneous migration can be efficiently separated with the culture medium.

만일 기질세포의 자발적 마이그레이션이 배양액 내에서 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부재에 생체조직을 부착시킨 상태에서 이루어진다면, 배양액은 부착부재 및 생체조직과 평균비중이 같은 것을 사용하거나 또는 부착부재 및 생체조직보다 평균비중이 더 큰 것을 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 이 경우에는 배양액 내에서 부착부재 및 생체조직은 전체적으로 분포되거나 또는 배양액의 수면 근처에 부착부재 및 생체조직이 분포됨으로써 부착부재에 생체조직이 접촉할 가능성이 더욱 커져서 부착부재에 생체조직이 더욱 효과적으로 부착되고 기질세포의 자발적 마이그레이션이 더욱 효과적으로 유도될 수 있기 때문이다.If the spontaneous migration of the stromal cells is made in the state in which the biological tissue is attached to the absence of a material capable of attaching the biological tissue in the culture, the culture medium may use the same weight as the attachment member and the biological tissue, or It is preferable to use a larger average specific gravity than biological tissue. In this case, the attachment member and the living tissue are distributed in the culture medium as a whole or the attachment member and the living tissue are distributed near the surface of the culture medium, so that the living tissue is more likely to come into contact with the attachment member. This is because they adhere effectively and spontaneous migration of stromal cells can be induced more effectively.

생체조직은 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단된 상태로 부착부재에 부착되는 것이 더욱 바람직하다. 이에 의해 생체조직에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 더욱 잘 유도하여 생체조직에서 기질세포를 더욱 효율적으로 분리할 수 있기 때문이다. 이때 이러한 생체조직의 절단은 레이져 등을 이용하여 이루어질 수 있다.More preferably, the biological tissue is attached to the attachment member in a state in which the tissue is finely cut so that at least a part of the stromal cells are exposed to the outside between collagen surrounding the stromal cells. This is because the spontaneous migration of the stromal cells in the living tissue is better induced, thereby more efficiently separating the stromal cells from the living tissue. At this time, the cutting of the biological tissue may be made using a laser or the like.

기질세포의 자발적 마이그레이션에 의해 기질세포가 생체조직의 외부로 이동된 후에는 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 기질세포를 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 예컨대, 배양액 내에서 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 후에는 기질세포를 배양액과 함께 난류 운동시킴으로써 기질세포에 물리적 힘을 가하여 기질세포를 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 만일 배양액 내에서 부착부재 상에서 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 경우에는, 부착부재를 배양액과 함께 난류 운동시킴으로써 부착부재 상의 기질세포에 물리적 힘을 가하거나 또는 복수의 부착부재를 배양액과 함께 난류 운동시켜 서로 충돌시킴으로써 부착부재 상의 기질세포에 더 강한 물리적 힘을 가하여 기질세포를 생체조직에서 효율적으로 분리할 수 있게 된다.After stromal cells are moved out of the living tissue by spontaneous migration of the stromal cells, the stromal cells can be separated from the living tissue by applying a physical force to the stromal cells. For example, after stromal cells are moved out of the biological tissue by spontaneous migration in the culture medium, the stromal cells can be separated from the biological tissue by applying physical force to the stromal cells by turbulent movement of the stromal cells with the culture medium. If the stromal cells are moved out of the biological tissue by spontaneous migration in the culture medium in the culture medium, the physical force is applied to the stromal cells on the adhesion member by applying a turbulent motion of the adhesion member along with the culture medium or a plurality of attachment members are removed. By turbulent motion with the culture and collided with each other, it is possible to effectively separate the stromal cells from the biological tissue by applying a stronger physical force to the stromal cells on the attachment member.

기질세포는 생체조직에서 분리된 후에는 외부로 수집된다. 이와 같이 수집된 기질세포는 배양액 내에서 배양 또는 계대 배양을 통해 증식될 수 있다. 만일 기질세포가 배양액 내에서 생체조직으로부터 분리된다면, 기질세포는 배양액과 함께 수집될 수 있어서 더욱 효율적으로 분리 및 배양 또는 계대 배양할 수 있게 된다.Stromal cells are collected externally after they have been separated from living tissue. The collected stromal cells can be proliferated by culturing or passage in culture. If the stromal cells are separated from the biological tissue in the culture, the stromal cells can be collected with the culture so that they can be isolated and cultured or passaged more efficiently.

2. 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 장치2. A device for separating stromal cells from living tissue without using enzymes

본 장치는 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 장치로서, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 부착부재를 구비하는 것을 특징으로 한다.This device is a device for separating stromal cells from living tissue without using an enzyme, and attaching the living tissue in a culture medium to induce spontaneous migration of stromal cells of living tissue to move the stromal cells out of the living tissue. Characterized in having a.

부착부재의 소재는 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키도록 다양하게 이루어질 수 있다. 예컨대, 부착부재는 생체조직을 안정적으로 또는 효율적으로 부착시키기 위하여 생체조직과 동일하거나 유사한 소재로 이루어질 수 있다. 만일 부착부재의 표면의 적어도 일부에 생체조직을 부착시킨 상태에서 부착부재를 배양액 내에 배열시키게 되면, 배양액 내에 분포된 생체조직은 동일한 조직이 부착된 부착부재의 표면에 더욱 용이하게 부착될 수 있게 된다. The material of the attachment member may be variously attached to the living tissue in the culture medium to induce spontaneous migration of the stromal cells of the living tissue to move the stromal cells out of the living tissue. For example, the attachment member may be made of the same or similar material as the living tissue to stably or efficiently attach the living tissue. If the attachment member is arranged in the culture medium while the living tissue is attached to at least a part of the surface of the attachment member, the biological tissue distributed in the culture medium can be more easily attached to the surface of the attachment member to which the same tissue is attached. .

부착부재의 형상은 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키도록 다양하게 이루어질 수 있다. 예시적으로 도 3에 나타나 있는 바와 같이 부착부재(110)는 미세하게 절단된 다수의 생체조직(120)이 부착되고 부착된 다수의 생체조직(120)의 기질세포(130)가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직(120)의 외부로 이동되어 배열되는 영역을 이루는 표면을 갖는 본체(111)로 이루어질 수 있다. 이를 위하여 부착부재(110)는 전체적으로 납작한 입방체의 형상으로 이루어질 수 있다. 예시적으로 도 3에 나타나 있는 부착부재(110)는 사각 입방체의 형상으로 이루어져 있으나, 이에 한정되지 않고 부착부재는 원 입방체, 삼각 입방체, 오각 입방체 등 다양한 형상으로 이루어질 수 있다.The shape of the attachment member may be variously attached to the living tissue in the culture medium to induce spontaneous migration of the stromal cells of the living tissue to move the stromal cells out of the living tissue. For example, as shown in FIG. 3, the attachment member 110 is attached to a plurality of microorganisms 120 that are microscopically cut and attached to the stromal cells 130 of the plurality of biological tissues 120 by spontaneous migration. The body 111 may have a surface that forms an area that is moved and arranged outside of the biological tissue 120. To this end, the attachment member 110 may be formed in the shape of a flat cube as a whole. For example, the attachment member 110 illustrated in FIG. 3 may be configured in the shape of a rectangular cube, but the present disclosure is not limited thereto, and the attachment member may be formed in various shapes such as a circle cube, a triangular cube, and a pentagonal cube.

부착부재(110)의 두께(t)는 미세하게 절단된 다수의 생체조직(120)이 부착되고 배양액의 난류 운동에 견딜 수 있는 강성을 갖도록 두껍고 동시에 배양액의 난류 운동에 의해 원활하게 움직일 수 있도록 얇게 이루어지는 것이 바람직하다.The thickness t of the attachment member 110 is thick so that a plurality of microorganisms 120 which are finely cut are attached and have a rigidity that can withstand the turbulent motion of the culture solution, and at the same time, the thickness t can be smoothly moved by the turbulent motion of the culture solution. It is preferable to make.

만일 부착부재의 표면의 적어도 일부에 요철 형상이 형성되면, 생체조직이 부착부재의 표면과 접촉하는 면적이 커져서 더욱 용이하게 부착될 수 있게 된다.If an uneven shape is formed on at least a part of the surface of the attachment member, the area in which the biological tissue is in contact with the surface of the attachment member is increased, so that it can be attached more easily.

부착부재의 비중은 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키도록 다양하게 이루어질 수 있다. The specific gravity of the attachment member may be variously attached to induce the spontaneous migration of the stromal cells of the biological tissue by attaching the biological tissue in the culture medium to move the stromal cells to the outside of the biological tissue.

만일 생체조직이 배양액보다 평균비중이 더 작아서 배양액의 수면 근처에 대부분 분포하게 된다면, 부착부재는 배양액보다 평균비중이 더 작게 되도록 하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 이 경우에는 부착부재도 생체조직과 마찬가지로 배양액의 수면 근처에 대부분 분포하게 되므로, 부착부재가 생체조직과 접촉할 가능성이 더 커지게 되어서 부착부재 상에 생체조직이 부착될 가능성이 더 커지게 되기 때문이다. 따라서 이 경우에는 생체조직의 기질세포가 부착부재 상에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동할 가능성이 더 커지게 된다. If the biological tissue has a smaller average specific gravity than that of the culture medium and is distributed mostly near the water surface of the culture medium, it is preferable that the attachment member has a smaller average specific gravity than the culture medium. In this case, since the attachment member is mostly distributed near the surface of the culture medium like the living tissue, the attachment member is more likely to come into contact with the living tissue, so that the living tissue is more likely to adhere to the attachment member. Because it becomes. Therefore, in this case, the stromal cells of the biological tissue are more likely to move out of the biological tissue by spontaneous migration on the attachment member.

부착부재가 배양액보다 평균비중이 더 작게 되는 경우, 부착부재는, 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.When the attachment member has a smaller average specific gravity than the culture medium, the attachment member may be made of polypropylene, polyethylene, polyurethane, extracellular matrix (CCM), collagen, polydioxanone ( polydioxanone, polycaprolactone, poly (L-lactide), PLGA (poly (lactic-co-glycolic acid)), PLA (poly (lactic acid)), PGA (pterolyglutamic acid), hyaluronic acid It may include at least one selected from the group consisting of lonic acid (hyaluronic acid) and silicon.

만일 생체조직이 배양액보다 평균비중이 더 커서 배양액의 저면 근처에 대부분 분포하게 된다면, 부착부재는 배양액보다 평균비중이 더 크게 되도록 하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 이 경우에는 부착부재도 생체조직과 마찬가지로 배양액의 저면 근처에 대부분 분포하게 되므로, 부착부재가 생체조직과 접촉할 가능성이 더 커지게 되어서 부착부재 상에 생체조직이 부착될 가능성이 더 커지게 되기 때문이다. 따라서 이 경우에는 생체조직의 기질세포가 부착부재 상에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동할 가능성이 더 커지게 된다.If the biological tissue has a larger average specific gravity than the culture medium and is distributed mostly near the bottom of the culture medium, it is preferable that the attachment member has a larger average specific gravity than the culture medium. In this case, since the attachment member is mostly distributed near the bottom of the culture medium as in the living tissue, the attachment member is more likely to come into contact with the living tissue, so that the living tissue is more likely to adhere to the attachment member. Because it becomes. Therefore, in this case, the stromal cells of the biological tissue are more likely to move out of the biological tissue by spontaneous migration on the attachment member.

부착부재가 배양액보다 평균비중이 더 크게 되는 경우, 부착부재는, 테프론(teflon), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리에틸렌(polyethylene), 프탈레이트(phthalate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.If the attachment member has a higher average specific gravity than the culture medium, the attachment member is made of teflon, polycarbonate, polyethylene, phthalate, polystyrene, polyurethane, and ECM. (Extracellular Matrix), collagen, polydioxanone, polycaprolactone, poly (L-lactide), PLGA (poly (lactic-co-glycolic acid)), PLA (poly (lactic acid)), PGA (pterolyglutamic acid), hyaluronic acid (hyaluronic acid) and may include at least one selected from the group consisting of silicon.

만일 생체조직이 배양액과 평균비중이 동일하여서 배양액의 전체에 분산되어 분포하게 된다면, 부착부재는 배양액과 평균비중이 동일하도록 하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 이 경우에는 부착부재도 생체조직과 마찬가지로 배양액의 전체에 분산되어 분포하게 되므로, 부착부재가 생체조직과 접촉할 가능성이 더 커지게 되어서 부착부재 상에 생체조직이 부착될 가능성이 더 커지기 때문이다. 따라서 이 경우에는 생체조직의 기질세포가 부착부재 상에서 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동할 가능성이 더 커지게 된다.If the biological tissue is equal to the culture medium and the average specific gravity is dispersed and distributed throughout the culture medium, it is preferable that the attachment member is equal to the culture medium and the average specific gravity. In this case, since the attachment member is distributed and distributed throughout the culture medium as well as the biological tissue, the attachment member is more likely to come into contact with the biological tissue, so that the biological tissue is more likely to adhere onto the attachment member. to be. Therefore, in this case, the stromal cells of the biological tissue are more likely to move out of the biological tissue by spontaneous migration on the attachment member.

부착부재에 부착되는 생체조직은 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단된 생체조직인 것이 바람직하다. 이에 의하여 기질세포의 자발적 마이그레이션이 더 잘 유도되어 기질세포가 생체조직에서 더 잘 분리될 수 있기 때문이다.The biological tissue attached to the attachment member is preferably a biological tissue finely cut so that at least a portion of the stromal cells are exposed to the outside between collagen surrounding the stromal cells in the biological tissue. This is because spontaneous migration of the stromal cells is better induced, so that the stromal cells can be separated from the biological tissues better.

부착부재는, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것뿐만 아니라, 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리시키는 것일 수 있다. 이에 의하여 부착부재는 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동하는 것뿐만 아니라, 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 생체조직에서 분리되는 것도 촉진할 수 있게 된다.The attachment member adheres to the living tissue in the culture medium, induces spontaneous migration of the stromal cells of the living tissue, thereby moving the stromal cells out of the living tissue, as well as moving the stromal cells out of the living tissue by spontaneous migration. It may be to separate from the tissue. As a result, the attachment member may promote not only the stromal cells moving out of the biological tissue by spontaneous migration, but also the separation of the stromal cells transferred out of the biological tissue from the biological tissue.

부착부재가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리시키는 것은 다양하게 이루어질 수 있다.Separation of the stromal cells, which are attached to the outside of the living tissue by spontaneous migration from the living tissue, may be variously performed.

예컨대, 부착부재는 부착부재 상에서 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 스크레이핑(scraping)하는 역할을 할 수 있다. 이에 의하여 기질세포는 물리적 힘을 받아 생체조직에서 분리되어 배양액 내로 이동하게 된다. 이를 위하여 예시적으로 도 4에 나타나 있는 바와 같이 부착부재(210)는 생체조직(220)이 부착되고 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직(220)의 외부로 이동된 기질세포(230)가 배열되는 영역을 이루는 본체(211) 이외에, 본체(211)에서 외측으로 연장되어 본체(211)의 두께(t)보다 더 얇은 두께로서 타 부착부재에 배열된 기질세포를 스크레이핑(scraping)할 수 있는 형상을 갖는 스크레이핑부(212)를 더 구비할 수 있다. 이러한 스크레이핑부(212)는 그 횡단면의 코너부가 형성하는 각도가 90도보다 작은 예각으로 이루어질 수 있다. 이러한 스크레이핑부(212)에 의해 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직(220)에서 분리되어 생체조직(220)의 외측면에 또는 부착부재(210) 상에 배열되어 있는 기질세포(230)를 생체조직(220) 또는 부착부재(210)에서 쉽게 분리하여 배양액 내부로 이동시킬 수 있게 된다. 예시적으로 도 5에 나타나 있는 바와 같이 제1 부착부재(210) 상에서 생체조직(220)에서 분리되어 생체조직(220)의 외측면에 또는 부착부재(210) 상에 배열되어 있는 기질세포(230)는, 배양액의 난류 운동과 함께 난류 운동을 하는 인접하는 제2 부착부재(210')와 충돌하는 과정에서 제2 본체(211')의 두께(t')보다 더 얇은 두께를 갖고 외측으로 연장된 제2 스크레이핑부(212')에 의해 쉽게 스크레이핑됨으로써 생체조직(220) 또는 부착부재(210)에서 쉽게 분리되어 배양액 내부로 이동할 수 있게 된다. 제1 스크레이핑부(212)도 다른 부착부재 상에 배열되어 있는 기질세포를 스크레이핑하는 역할을 한다. 제1 스크레이핑부(212)와 제2 스크레이핑부(212')는 각각 제1 본체(211)의 두께(t)와 제2 본체(211')의 두께(t')보다 더 작은 두께를 갖도록 그 횡단면의 코너부의 각도(A)(A')가 90도보다 작은 예각을 이루고 있다. 다만, 스크레이핑부의 형상은 예시적으로 도 4 및 도 5에 나타나 있는 형상으로 한정되지 않으며 부착부재 상에 배열된 기질세포를 분리할 수 있는 다른 다양한 형상을 가질 수도 있다.For example, the attachment member may serve to scrape stromal cells moved out of the biological tissue on the attachment member. As a result, the stromal cells are separated from biological tissues under physical force and moved into the culture medium. For example, as shown in FIG. 4, the attachment member 210 may be a region in which the stromal cells 230 moved to the outside of the biological tissue 220 are arranged by attaching the biological tissue 220 and spontaneous migration. In addition to the main body 211 to form a shape that extends outward from the main body 211 to be scraper (scraping) the stromal cells arranged on the other attachment member with a thickness thinner than the thickness (t) of the main body 211 It may further include a scraping unit 212 having. The scraping portion 212 may be formed at an acute angle of less than 90 degrees formed by the corner portion of the cross section. The scraping unit 212 is separated from the biological tissue 220 by spontaneous migration, and the stromal cells 230 arranged on the outer surface of the biological tissue 220 or on the attachment member 210 are separated from the biological tissue ( 220) or can be easily separated from the attachment member 210 to be moved into the culture medium. For example, as shown in FIG. 5, the stromal cells 230 separated from the biological tissue 220 on the first attachment member 210 and arranged on the outer surface of the biological tissue 220 or on the attachment member 210. ) Extends to the outside with a thickness thinner than the thickness t 'of the second body 211' in the process of colliding with the adjacent second attachment member 210 'that performs the turbulent motion along with the turbulent motion of the culture medium. By being scraped easily by the second scraping part 212 ′, it is easily separated from the biological tissue 220 or the attachment member 210 to be moved into the culture medium. The first scraping portion 212 also serves to scrape stromal cells arranged on another attachment member. The first scraping portion 212 and the second scraping portion 212 ′ each have a thickness smaller than the thickness t of the first body 211 and the thickness t ′ of the second body 211 ′. The angle A (A ') of the corner | angular part of the cross section is made into the acute angle smaller than 90 degree so that it may have. However, the shape of the scraping portion is not limited to the shape shown in Figure 4 and 5 illustratively may also have a variety of other shapes that can separate the stromal cells arranged on the attachment member.

본 장치는 배양액과 생체조직 및 부착부재를 내부에 수용하는 용기를 더 구비할 수 있다.The apparatus may further include a container for accommodating the culture solution, the biological tissue and the attachment member therein.

용기는 배양액과 생체조직 및 부착부재가 수용되는 공간을 구비한다. 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 용기(350)는 배양액(340)과 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)가 수용될 수 있는 수용공간(351)을 구비할 수 있다. 다만, 수용공간(351)은 이에 한정되지 않고 배양액(340)과 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)가 수용될 수 있는 다양한 형상을 가질 수 있다.The container has a space in which the culture medium, the biological tissue and the attachment member are accommodated. For example, as shown in FIG. 6, the container 350 may include an accommodation space 351 in which the culture medium 340, the biological tissue 320, and the attachment member 310, 311 may be accommodated. However, the accommodation space 351 is not limited thereto and may have various shapes in which the culture solution 340, the biological tissue 320, and the attachment member 310, 311 may be accommodated.

수용공간(351)은 회전에 의한 원심분리가 가능하도록 형성된 경사부(352)를 갖고 있으며, 위쪽으로 갈수록 반경이 커지는 원형 횡단면을 갖는다. 수용공간(351)의 상부는 덮개(353)로 덮여 있다. 덮개(353)는 수용공간(351)에 수용된 배양액(340)과 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)가 외부로 누출되지 않도록 하는 기능을 한다. 나아가, 덮개(353)는 용기(350)의 정회전과 역회전에 의한 배양액(340)의 난류 운동으로 인해 배양액(340)이 외부로 누출되는 것을 차단하는 기능을 한다. 덮개(353)는 수용공간(351)의 경사부(352)와 반대되는 경사를 갖는 경사부를 가지며 위쪽으로 갈수록 반경이 작아지는 원형 횡단면을 갖는 것이 회전에 의한 원심분리에 유리할 수 있다.The accommodation space 351 has an inclined portion 352 formed to allow centrifugal separation by rotation, and has a circular cross section in which a radius thereof increases. The upper portion of the receiving space 351 is covered with a cover 353. The cover 353 functions to prevent the culture solution 340 and the living tissue 320 and the attachment member 310 and 311 accommodated in the accommodation space 351 from leaking to the outside. In addition, the cover 353 serves to block leakage of the culture solution 340 to the outside due to the turbulent motion of the culture solution 340 due to the forward and reverse rotation of the container 350. The cover 353 may have an inclined portion having an inclined portion opposite to the inclined portion 352 of the accommodation space 351 and have a circular cross section in which a radius thereof becomes smaller toward the upper portion, and may be advantageous for centrifugation by rotation.

용기는 어느 한 방향으로의 정회전과 반대 방향으로의 역회전을 반복하여 수용공간 내부의 배양액의 난류를 유도할 수 있다. 이러한 배양액의 난류에 의하여 생체조직 및 부착부재도 난류 운동을 하게 된다. 이에 따라 부착부재 상에 부착된 생체조직에서 자발적 마이그레이션에 의하여 생체조직의 외부로 이동함으로써 부착부재 상에 배열되어 있는 기질세포가 생체조직 또는 부착부재로부터 분리되어 배양액 내부로 분리된다. 또한, 용기는 어느 한 방향으로 회전하여 배양액 내부에 분포된 기질세포에 원심력을 가함으로써 기질세포를 생체조직 및 부착부재와 분리시켜 배양액과 함께 수집할 수 있게 한다.The vessel may induce turbulence of the culture solution in the receiving space by repeating the forward rotation in either direction and the reverse rotation in the opposite direction. Turbulent movement of the biological tissue and the attachment member is caused by the turbulence of the culture. Accordingly, by moving to the outside of the biological tissue by spontaneous migration in the biological tissue attached on the attachment member, the stromal cells arranged on the attachment member are separated from the biological tissue or attachment member and separated into the culture medium. In addition, the container rotates in one direction to apply the centrifugal force to the stromal cells distributed in the culture medium to separate the stromal cells from the biological tissue and the attachment member to be collected with the culture solution.

용기는 그것이 정지된 상태에서 수용공간 내부의 배양액에 잠기는 위치에 배열되어 있는 차단막을 더 구비할 수 있다. 차단막은 배양액보다 평균비중이 더 작아서 배양액에 뜨는 생체조직이 배양액의 수면 위로 뜨는 것을 차단함으로써 생체조직이 부착부재와 접촉하여 부착부재에 부착할 수 있게 한다. 이를 위하여 차단막은 생체조직은 투과되지 않고 배양액은 투과되는 관통공을 구비한다. 이러한 차단막의 관통공을 통해서는 부착부재가 투과되지 않게 된다.The container may further include a barrier membrane arranged in a position where the container is immersed in the culture solution inside the receiving space while it is stopped. The barrier membrane has a smaller average specific gravity than the culture medium, so that the biological tissue floating in the culture medium is prevented from floating on the surface of the culture medium so that the biological tissue can contact and adhere to the attachment member. To this end, the barrier membrane has a through hole through which the biological tissue is not permeated and the culture fluid is permeated. The attachment member does not penetrate through the through hole of the blocking membrane.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 차단막(360)은 용기(350)가 정지된 상태에서 수용공간(351) 내부의 배양액(340)의 수면보다 아래의 수면 근방과 같이 배양액(340)에 잠기는 위치에 배열된다. 차단막(360)에는 복수의 관통공이 형성되어 있는데, 이러한 관통공은 배양액(340)은 투과되지만 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)는 투과되지 않도록 조절된 크기를 갖는다. 차단막(360) 하부의 배양액(340) 내부로 주입된 생체조직(320)은 배양액(340)보다 평균비중이 작은 경우 차단막(360)에 의해 차단되어 배양액(340)의 수면 위로 뜨지 않고 차단막(360) 하측 근방에 모이게 된다. 차단막(360) 하부의 배양액(340) 내부로 주입된 부착부재(310)(311) 중에서 배양액(340)보다 평균비중이 작은 부착부재(311)는 차단막(360)에 의해 차단되어 배양액(340)의 수면 위로 뜨지 않고 차단막(360)의 하측 근방에 모이게 된다. 만일 생체조직(320)이 부착부재(311)보다 평균비중이 작을 경우에는 부착부재(311)는 생체조직(320)이 모인 층의 하측에 모이게 된다. 따라서 생체조직(320)은 부착부재(311)와 인접되거나 중첩되어 층을 형성하게 되어서 부착부재(311)와 접촉 가능성이 대폭 증가하게 되고 부착부재(311)에 부착될 가능성이 대폭 증가하게 된다. 결과적으로, 부착부재(311)에 부착된 생체조직(320)에서 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직(320)의 외부로 이동할 가능성이 대폭 증가하게 된다. For example, as shown in FIG. 6, the blocking membrane 360 is immersed in the culture medium 340, such as near the water surface below the surface of the culture medium 340 in the accommodation space 351 in a state where the container 350 is stopped. Are arranged in position. A plurality of through holes are formed in the blocking membrane 360. The through holes have a size adjusted such that the culture solution 340 is transmitted but the biological tissue 320 and the attachment members 310 and 311 are not transmitted. The biological tissue 320 injected into the culture medium 340 under the blocking film 360 is blocked by the blocking film 360 when the average specific gravity is smaller than that of the culture medium 340, and thus does not float on the water surface of the culture solution 340. ) Will gather near the bottom. Of the attachment members 310 and 311 injected into the culture medium 340 below the blocking membrane 360, the attachment member 311 having a smaller average specific gravity than the culture solution 340 is blocked by the blocking membrane 360 to allow the culture solution 340 to be removed. Rather than floating on the surface of the water, it is gathered near the bottom of the blocking film 360. If the biological tissue 320 has a smaller average specific gravity than the attachment member 311, the attachment member 311 is collected under the layer where the biological tissue 320 is collected. Therefore, the biological tissue 320 is adjacent to or overlapped with the attachment member 311 to form a layer, thereby greatly increasing the possibility of contact with the attachment member 311 and greatly increasing the possibility of attachment to the attachment member 311. As a result, the possibility that the stromal cells move to the outside of the living tissue 320 by spontaneous migration in the living tissue 320 attached to the attachment member 311 is greatly increased.

또한, 차단막은 배양액의 난류에 의해 부착부재가 난류 운동을 할 때에 부착부재가 배양액 상부로 이탈하는 것을 차단함으로써 부착부재 상에서 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배양액 외부로 이탈하는 것을 차단하는 역할도 한다.In addition, the blocking membrane blocks the detachment of the adherent member from the upper part of the culture medium when the attachment member is turbulent by the turbulent flow of the culture medium, thereby preventing the detachment of the stromal cells transferred to the outside of the biological tissue from the attachment member. Also

용기는 원심력이 최대인 위치에 형성되어 생체조직에서 분리된 기질세포를 원심력에 의해 수렴시키는 수렴부를 가질 수 있다. 이에 의하여 생체조직에서 분리된 기질세포를 수렴하여 외부로 쉽게 배출할 수 있게 된다.The container may have a converging portion formed at a position where the centrifugal force is maximum to converge the stromal cells separated from the biological tissue by the centrifugal force. As a result, the stromal cells separated from the biological tissues can be converged and easily discharged to the outside.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 수렴부(354a)(354b)는 수용공간(351)의 상부 가장자리 중에서 원심력이 최대인 위치에 배열된 제1 수렴부(354a)와, 수용공간(351)의 상부 가장자리 중에서 제1 수렴부(354a)와 대칭이 되면서 원심력이 최대인 위치에 배열된 제2 수렴부(354b)를 구비한다. 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b)는 각각 배양액(340)과 함께 수렴된 기질세포를 수용할 수 있는 공간을 갖는다. 이러한 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)는 원심력이 최대인 위치에 배열되어 있기 때문에 용기(350)의 회전에 의한 원심 분리가 이루어질 때에 생체조직(320)에서 분리되어 배양액(340)에 분포되어 있는 기질세포가 배양액(340)과 함께 수렴되도록 유도하게 된다. 수렴부는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 것에 한정되지 않고 한 개 또는 세 개 이상의 수렴부로 이루어질 수 있다.For example, as shown in FIG. 6, the convergence parts 354a and 354b may include the first converging part 354a arranged at a position where the centrifugal force is maximum among the upper edges of the accommodation space 351 and the accommodation space 351. And a second converging portion 354b arranged at a position where the centrifugal force is maximal while being symmetrical with the first converging portion 354a among the upper edges of the upper edge. Each of the first converging portion 354a and the second converging portion 354b has a space for accommodating the stromal cells that have converged with the culture solution 340. Since the first and second converging portions 354a and 354b are arranged at positions where the centrifugal force is maximum, the first and second converging portions 354a and 354b are separated from the biological tissue 320 when the centrifugal separation by the rotation of the container 350 is performed, and thus the culture solution 340. Stromal cells distributed in the culture medium 340 is induced to converge with. The convergence unit is not limited to that shown in FIG. 6 by way of example, but may consist of one or three or more convergence units.

용기는 수용공간에서 수렴부까지의 경로 상에 위치하여 원심력에 의한 기질세포의 이동을 허용하고 생체조직 및 부착부재의 이동을 차단하는 필터를 더 구비할 수 있다. 이에 의하여 수렴부에는 기질세포가 분포된 배양액은 수렴되고 생체조직과 부착부재는 수렴되지 않도록 조절할 수 있게 된다.The container may further include a filter positioned on a path from the accommodation space to the convergent part to allow movement of the stromal cells by centrifugal force and block movement of the living tissue and the attachment member. As a result, the culture medium in which the stromal cells are distributed in the convergent part is converged, and the biological tissue and the attachment member can be adjusted so as not to converge.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 필터(370a)(370b)는 수용공간(351)에서 제1 수렴부(354a)까지의 경로 상에 위치하는 제1 필터(370a)와, 수용공간(351)에서 제2 수렴부(354b)까지의 경로 상에 위치하는 제1 필터(370b)를 구비한다. 제1 필터(370a)는 제1 수렴부(354a)의 입구에 위치하고, 제2 필터(370b)는 제2 수렴부(354b)의 입구에 위치한다. 제1 및 제2 필터(370a)(370b)에는 복수의 관통공이 형성되어 있는데, 이러한 관통공은 기질세포가 분포된 배양액(340)은 관통되도록 하고 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)는 관통되지 않게 조절되어 있는 크기를 갖는다. 이에 의하여 제1 및 제2 필터(370a)(370b)는 기질세포가 분포된 배양액(340)의 이동을 허용하고 생체조직(320)과 부착부재(310)(320)의 이동을 차단함으로써 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)를 제외하고 기질세포가 분포된 배양액(340)이 수렴되도록 한다. 필터는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 것에 한정되지 않고 수용공간에서 수렴부까지의 경로 상의 다양한 위치에 배열될 수 있다.For example, as illustrated in FIG. 6, the filters 370a and 370b may include a first filter 370a positioned on a path from the accommodation space 351 to the first converging portion 354a, and the accommodation space 351. ) And a first filter 370b positioned on a path from the second convergence part 354b. The first filter 370a is located at the inlet of the first converging unit 354a and the second filter 370b is located at the inlet of the second converging unit 354b. A plurality of through holes are formed in the first and second filters 370a and 370b. The through holes allow the culture medium 340 in which the stromal cells are distributed to penetrate the living tissue 320 and the attachment member 310 ( 311 is sized so as not to penetrate. Accordingly, the first and second filters 370a and 370b allow the movement of the culture medium 340 in which the stromal cells are distributed and block the movement of the biological tissue 320 and the attachment members 310 and 320. And a culture medium 340 in which stromal cells are distributed except for the biological tissue 320 and the attachment members 310 and 311 to the second convergent portions 354a and 354b. The filter is illustratively not limited to that shown in FIG. 6 but may be arranged at various locations on the path from the accommodation space to the convergence portion.

용기는 수렴부에 형성되어 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 기질세포 배출부를 더 구비할 수 있다. 이에 의하여 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 쉽게 배출시킬 수 있게 된다.The container may further include a stromal cell outlet configured to discharge the stromal cells converged on the convergent part to the outside. This makes it possible to easily discharge the stromal cells converged to the convergent portion to the outside.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 기질세포 배출부(355a)(355b)는 제1 수렴부(354a)에 형성되어 제1 수렴부(354a)에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 제1 기질세포 배출부(355a)와, 제2 수렴부(354b)에 형성되어 제2 수렴부(354b)에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 제2 기질세포 배출부(355b)를 구비한다. 제1 기질세포 배출부(355a)는 제1 수렴부(354a)에 수렴된 기질세포가 분포된 배양액(340)을 외부로 배출시키고, 제2 기질세포 배출부(355b)는 제2 수렴부(354b)에 수렴된 기질세포가 분포된 배양액(340)을 외부로 배출시킨다. 제1 및 제2 기질세포 배출부(355a)(355b)는 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에 형성된 배출구에 연결된 튜브로 이루어질 수 있다. 기질세포 배출부는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 것에 한정되지 않고 수렴부에 형성되어 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시킬 수 있는 다양한 구성으로 이루어질 수 있다.For example, as shown in FIG. 6, the stromal cell outlets 355a and 355b are formed in the first converging part 354a to discharge the stromal cells converged in the first converging part 354a to the outside. A stromal cell outlet 355a and a second stromal cell outlet 355b formed in the second converging unit 354b for discharging the stromal cells converged in the second converging unit 354b to the outside. The first stromal cell outlet 355a discharges the culture medium 340 in which the stromal cells converged to the first converging unit 354a to the outside, and the second stromal cell outlet 355b is the second converging part ( The culture medium 340 in which the stromal cells converged in 354b) is discharged to the outside. The first and second stromal cell outlets 355a and 355b may be formed of tubes connected to outlets formed in the first and second converging parts 354a and 354b. Exemplary stromal cells are not limited to those shown in Figure 6 is formed in the converging portion may be made of a variety of configurations that can discharge the stromal cells converged on the converging portion to the outside.

용기는 외부에서 수용공간으로 연장되어 배양액을 주입하거나 배출시키는 배양액 관통관을 더 구비할 수 있다. 이에 의하여 수용공간으로 배양액을 주입하거나 배출시키는 것을 용이하게 실행할 수 있게 된다.The container may further include a culture solution through-tube extending from the outside to the receiving space to inject or discharge the culture solution. This makes it easy to inject or discharge the culture solution into the receiving space.

예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 배양액 관통관(380)은 외부에서 덮개(353)를 관통하여 수용공간(351) 내부로 연장된 튜브를 구비한다. 배양액 관통관(380)은 덮개(353) 및 차단막(360)의 중앙 부분을 차례로 관통하여 수용공간(351)의 중앙 저면 근처까지 연장될 수 있다. 배양액 관통관(380)이 관통하는 덮개(353)의 중앙 부분에는 고무 재질의 실링부재(390)가 배열됨으로써 배양액 관통관(380)이 관통하는 수용공간(351)의 중앙 부분을 견고하게 밀폐시킬 수 있다. 배양액 관통관(380)에 의하여 덮개(353)를 개봉하지 않고도 외부에서 수용공간(351)으로 배양액을 용이하게 주입하거나 배출함으로써 필요할 때마다 쉽게 배양액을 주입 또는 교체할 수 있게 된다. 배양액 관통관은 예시적으로 도 6에 나타나 있는 것에 한정되지 않고 외부에서 수용공간으로 연장되어 배양액을 주입하거나 배출시킬 수 있는 다양한 구성으로 이루어질 수 있다.For example, as shown in FIG. 6, the culture through-tube 380 includes a tube extending from the outside through the cover 353 and into the receiving space 351. The culture solution through tube 380 may extend through the central portion of the cover 353 and the blocking membrane 360 to the vicinity of the central bottom of the accommodation space 351. A rubber sealing member 390 is arranged in the central portion of the cover 353 through which the culture solution through tube 380 penetrates to tightly seal the central portion of the accommodation space 351 through which the culture solution through tube 380 penetrates. Can be. By easily injecting or discharging the culture solution from the outside to the receiving space 351 by opening the culture medium through-tube 380, it is possible to easily inject or replace the culture solution whenever necessary. The culture medium through tube is not limited to that illustrated in FIG. 6, but may be formed in various configurations that extend from the outside to the receiving space to inject or discharge the culture solution.

용기는 내부 소독을 위한 가스를 주입시키는 가스 주입부를 더 구비할 수 있다. 이에 의하여 용기 내부 소독을 용이하게 실행할 수 있다.The container may further include a gas injection unit for injecting a gas for internal disinfection. Thereby, disinfection inside a container can be performed easily.

3. 실시례3. Example

본 발명의 일 실시례는, 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서, (1) 생체조직을 미세하게 절단하는 단계; (2) 미세하게 절단된 생체조직을 배양액 내에서 그 생체조직이 부착될 수 있는 소재의 부착부재 상에 부착시키는 단계; (3) 부착부재 상에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 단계; (4) 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리하는 단계; 및 (5) 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 단계를 포함한다.One embodiment of the present invention, a method for separating stromal cells from biological tissue without using an enzyme, comprising the steps of: (1) finely cutting the biological tissue; (2) attaching the finely cut biological tissue onto the attachment member of the material to which the biological tissue can be attached in the culture medium; (3) inducing spontaneous migration of stromal cells on the attachment member to move the stromal cells out of the living tissue; (4) separating the stromal cells migrated out of the living tissue from the living tissue; And (5) collecting stromal cells isolated from biological tissue.

(1) 생체조직을 미세하게 절단하는 단계는 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단하는 것을 말한다. 이러한 생체조직의 절단은 레이져 등을 이용하여 이루어질 수 있다. 이와 같이 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 생체조직을 미세하게 절단함으로써 생체조직에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 효과적으로 유도할 수 있게 된다.(1) finely cutting the biological tissue refers to finely cutting so that at least a portion of the stromal cells is exposed to the outside between collagen surrounding the stromal cells in the biological tissue. The cutting of such biological tissues can be made using a laser or the like. In this way, by finely cutting the biological tissue so that at least some of the stromal cells are exposed to the outside between collagen surrounding the stromal cells, it is possible to effectively induce spontaneous migration of the stromal cells in the biological tissues.

(2) 미세하게 절단된 생체조직을 배양액 내에서 그 생체조직이 부착될 수 있는 소재의 부착부재 상에 부착시키는 단계는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 생체조직과 배양액 및 부착부재를 넣은 용기 내에서 이루어진다. (2) attaching the finely cut biological tissue to the attachment member of the material to which the biological tissue can be attached in the culture medium, as shown in FIG. It takes place in a container.

먼저, 생체조직(320)과 배양액(340) 및 부착부재(310)(311)를 수용하는 수용공간(351)을 갖는 용기(350)를 준비한다. 용기(350)의 덮개(353) 및 차단막(360)을 용기(350)로부터 분리한 다음 미리 준비한 미세하게 절단된 생체조직(320) 및 생체조직(320)이 부착될 수 있는 소재의 부착부재(310)(311)를 수용공간(351)에 위치시킨다. 이후 덮개(353) 및 차단막(360)을 용기(350)와 결합한 다음, 덮개(353) 및 차단막(360)의 중앙부를 차례로 관통하여 수용공간(351)까지 연장된 배양액 관통관(380)을 통해 기질세포가 생존할 수 있는 배양액(340)을 주입한다. 이때 배양액(340)의 수면이 차단막(360)보다 높은 위치에 있도록 배양액(340)을 주입한다.First, a container 350 having a living space 320 and a receiving space 351 for accommodating the culture medium 340 and the attachment members 310 and 311 is prepared. The cover 353 and the blocking film 360 of the container 350 are separated from the container 350 and then the attachment member of the material to which the previously cut fine tissue 320 and the biological tissue 320 may be attached. 310 and 311 are positioned in the accommodation space 351. Thereafter, the cover 353 and the blocking membrane 360 are combined with the container 350, and then the cover 353 and the blocking membrane 360 are sequentially penetrated through the culture medium through tube 380 extending to the receiving space 351. Inject the culture solution 340 in which the stromal cells can survive. At this time, the culture solution 340 is injected such that the surface of the culture solution 340 is higher than the blocking membrane 360.

위와 같이 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)를 용기(350)의 수용공간(351)에 위치시킨 상태에서 배양액(340)을 주입하게 되면, 배양액(340)보다 평균비중이 작은 생체조직(320)과 부착부재(311)는 배양액(340)의 수면 쪽으로 상승하여 차단막(360) 하측면 및 그 근방에 층을 이루어 배열된다. 이때 부착부재(311)보다 평균비중이 작은 생체조직(320)이 부착부재(311)의 상층에 위치하게 되고 부착부재(311)는 생체조직(320)의 하층에 위치하게 된다. 이 경우 생체조직(320)이 배열된 층은 부착부재(311)이 배열된 층과 일부 중첩되거나 인접하게 되어 생체조직(320)은 부착부재(311)와 접촉하는 영역이 대폭 확대된다. 배양액(340)보다 평균비중이 큰 부착부재(310)는 배양액(340)의 아래쪽에 있는 수용공간(351)의 저면 및 그 근방에 배열된다. 배양액(340)보다 평균비중이 큰 부착부재(310)의 일부는 차단막(360)의 상측면에 배열될 수 있다. 이와 같이 배양액(340)과 생체조직(320) 및 부착부재(311)이 배열된 상태에서 시간이 지나면, 생체조직(320)은 부착부재(311)에 부착하게 된다.When the culture medium 340 is injected while the living tissue 320 and the attachment member 310 and 311 are positioned in the accommodation space 351 of the container 350 as described above, the average specific gravity is smaller than that of the culture medium 340. The biological tissue 320 and the attachment member 311 are raised to the water surface of the culture medium 340 and arranged in a layer on the lower surface of the blocking membrane 360 and the vicinity thereof. At this time, the biological tissue 320 having a smaller average specific gravity than the attachment member 311 is located in the upper layer of the attachment member 311 and the attachment member 311 is located in the lower layer of the biological tissue 320. In this case, the layer on which the biological tissue 320 is arranged is partially overlapped or adjacent to the layer on which the attaching member 311 is arranged, so that the area in contact with the attaching member 311 is greatly enlarged in the biological tissue 320. The attachment member 310 having a larger average specific gravity than the culture medium 340 is arranged at the bottom of the receiving space 351 below the culture medium 340 and in the vicinity thereof. A portion of the attachment member 310 having a larger average specific gravity than the culture solution 340 may be arranged on the upper side of the blocking membrane 360. As time passes in the state in which the culture medium 340, the biological tissue 320, and the attachment member 311 are arranged, the biological tissue 320 is attached to the attachment member 311.

(3) 부착부재 상에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 단계는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 생체조직(320)이 부착된 부착부재(311) 상에서 생체조직(320) 내의 기질세포가 자발적 마이그레이션에 의하여 생체조직(320)의 외부로 이동되도록 하는 것을 의미한다.(3) inducing spontaneous migration of stromal cells on the attachment member to move the stromal cells out of the biological tissue is illustrated on the attachment member 311 to which the biological tissue 320 is attached, as shown in FIG. 6. This means that the stromal cells in the living tissue 320 are moved out of the living tissue 320 by spontaneous migration.

생체조직(320) 내의 기질세포는 자발적 마이그레이션에 의하여 생체조직(320)의 외측면이나 부착부재(311)의 표면 또는 배양액(340) 내부로 이동하게 된다. 이러한 기질세포의 이동은 부착부재(311) 상에 부착된 생체조직(320)의 콜라겐 사이를 통해 외부로 노출된 기질세포에 의해 활발히 일어나게 된다.The stromal cells in the biological tissue 320 are moved to the outer surface of the biological tissue 320 or the surface of the attachment member 311 or the culture medium 340 by spontaneous migration. The movement of the stromal cells is actively caused by the stromal cells exposed to the outside through the collagen of the biological tissue 320 attached on the attachment member 311.

(4) 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리하는 단계는 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 생체조직(320)이 부착된 부착부재(311) 상에서 생체조직(320) 내의 기질세포의 자발적 마이그레이션에 의하여 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직(320)에서 분리하여 배양액(340) 내로 이동시키는 것을 의미한다.(4) separating the stromal cells moved out of the biological tissue from the biological tissue may be performed in the biological tissue 320 on the attachment member 311 to which the biological tissue 320 is attached, as shown in FIG. 6. By spontaneous migration of the stromal cells means that the stromal cells moved out of the biological tissue 320 to be separated from the biological tissue 320 and moved into the culture medium 340.

생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직(320)에서 분리하여 배양액(340) 내로 이동시키는 것은 예시적으로 도 6에 나타나 있는 바와 같이 용기(350)의 정회전과 역회전을 번갈아 반복하여 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포에 생체조직(320)에서 분리시키는 물리적 힘을 가함으로써 이루어진다. 용기(350)의 정회전과 역회전을 번갈아 반복하게 되면, 배양액(340)에 난류가 발생하게 되어 배양액(340)에 잠긴 부착부재(311)가 난류 운동을 하게 되므로, 부착부재(311) 상에서 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포가 생체조직(320)에서 분리되도록 하는 물리적 힘을 받게 된다. Separating the stromal cells moved out of the biological tissue 320 from the biological tissue 320 and moving them into the culture medium 340, as shown in FIG. 6, causes forward and reverse rotation of the container 350. The alternating repetition is made by applying a physical force to separate the living tissue 320 to the stromal cells moved to the outside of the living tissue 320. When the rotation of the container 350 is alternately repeated, the turbulence is generated in the culture solution 340, and the attachment member 311 submerged in the culture solution 340 undergoes turbulent motion. The stromal cells moved out of the biological tissue 320 are subjected to a physical force to be separated from the biological tissue 320.

또한, 다수의 부착부재(311)들의 난류 운동에 의해 부착부재(311)들이 서로 충돌하게 되면서 부착부재(311)에 형성된 스크레이핑부(도 5 참조)에 의해 다른 부착부재(311) 상에서 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포를 스크레이핑(scraping)하게 됨으로써 기질세포가 생체조직(320)에서 배양액(340) 내부로 분리되는 것을 더욱 촉진하게 된다. In addition, as the attachment members 311 collide with each other due to the turbulent motion of the plurality of attachment members 311, the scraping part (see FIG. 5) formed on the attachment member 311 may be formed on the other tissue 311. By scraping the stromal cells moved to the outside of the 320, the stromal cells are further promoted to be separated from the biological tissue 320 into the culture medium 340.

나아가, 다수의 부착부재(311)들의 난류 운동에 의해 부착부재(311)들이 용기(350)의 경사부(352)의 내측면, 평균비중이 배양액(340)보다 더 크면서 난류 운동을 하는 부착부재(310), 배양액 관통관(380)의 외측면 또는 차단막(360)의 하측면에 접촉 내지 충돌하게 되면서 부착부재(311) 상에서 생체조직(320)의 외부로 이동된 기질세포가 생체조직(320)에서 배양액(340) 내부로 분리되는 것을 촉진하게 된다.Further, by the turbulent movement of the plurality of attachment members 311 is attached to the inner surface of the inclined portion 352 of the container 350, the average specific gravity is larger than the culture medium 340 and the turbulent movement The stromal cells moved to the outside of the biological tissue 320 on the attachment member 311 while contacting or colliding with the member 310, the outer surface of the culture medium through-tube 380, or the lower surface of the blocking membrane 360 are formed in the biological tissue ( In 320, it is promoted to be separated into the culture medium 340.

(5) 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 단계는 생체조직에서 배양액 내부로 분리된 기질세포를 생체조직 및 부착부재와 분리하여 수집하는 것으로서, 예시적으로 도 7 및 도 8에 나타나 있는 바와 같이, (a) 생체조직(320)에서 배양액(340) 내부로 분리된 기질세포(330)를 원심분리에 의해 수렴부(354a)(354b)에 수렴하는 단계와, (b) 수렴부(354a)(354b)에 수렴된 기질세포(330)를 외부로 배출하는 단계로 이루어진다.(5) collecting the stromal cells separated from the biological tissue is to collect the stromal cells separated into the culture medium from the biological tissue and separated from the biological tissue and the attachment member, as shown in Figures 7 and 8 by way of example As described above, (a) converging the stromal cells 330 separated from the biological tissue 320 into the culture medium 340 to the convergent parts 354a and 354b by centrifugation, and (b) the convergent parts 354a. At step 354b, the stromal cells 330 converged are discharged to the outside.

(a) 생체조직(320)에서 배양액(340) 내부로 분리된 기질세포(330)를 원심분리에 의해 수렴부(354a)(354b)에 수렴하는 단계는, 예시적으로 도 7에 나타나 있는 바와 같이, 생체조직(320)에서 배양액(340) 분리된 기질세포(330)를 포함하는 용기(350)를 정회전 또는 역회전의 일 방향으로 회전시켜 기질세포(330)에 원심력을 가함으로써, 기질세포(330)를 서로 대칭이 되는 위치에 배열되어 원심력이 최대로 작용하는 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b)에 각각 수렴시키는 것이다.(A) the step of converging the stromal cells 330 separated from the living tissue 320 into the culture medium 340 to the converging portions 354a and 354b by centrifugation, as shown in FIG. 7. Likewise, by rotating the container 350 including the stromal cells 330 separated from the culture medium 340 in the biological tissue 320 in one direction of forward rotation or reverse rotation, applying a centrifugal force to the stromal cells 330, The cells 330 are arranged in symmetrical positions with each other to converge to the first converging portion 354a and the second converging portion 354b where the centrifugal force acts at the maximum.

용기(350)가 일 방향으로 회전함에 따라, 배양액(340)은 물론 생체조직(320) 및 부착부재(310)(311)도 원심력에 의해 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b)로 이동하게 된다. 이때 배양액(340)은 기질세포(320)와 함께 제1 수렴부(354a)의 입구에 배열된 제1 필터(370a) 및 제2 수렴부(354b)의 입구에 배열된 제2 필터(370b)를 각각 투과하여 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b)에 각각 수렴된다. 그러나 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)는 모두 제1 수렴부(354a)의 입구에 배열된 제1 필터(370a) 및 제2 수렴부(354b)의 입구에 배열된 제2 필터(370b)를 모두 투과하지 못하여 제1 수렴부(354a) 및 제2 수렴부(354b) 중 어느 곳에도 수렴되지 못한다. 왜냐하면, 제1 및 제2 필터(370a)(370b)는 모두 배양액(340)과 기질세포(320)는 투과하지만 생체조직(320)과 부착부재(310)(311)는 투과하지 못하도록 관통공의 크기가 조절되어 있기 때문이다.As the container 350 rotates in one direction, not only the culture medium 340 but also the biological tissue 320 and the attachment member 310 and 311 may be centrifugal force so that the first converging portion 354a and the second converging portion 354b. Will be moved to). At this time, the culture medium 340 is the first filter 370a and the second filter 370b arranged at the inlet of the first converging unit 354a together with the stromal cells 320. Are transmitted through, respectively, and converge at the first converging portion 354a and the second converging portion 354b. However, the biological tissue 320 and the attachment members 310 and 311 are both arranged at the inlet of the first converging portion 354a and the second filter 370a and the second converging portion 354b. Since all of the filters 370b do not penetrate, neither the first converging portion 354a nor the second converging portion 354b converges. This is because the first and second filters 370a and 370b both penetrate the culture medium 340 and the stromal cells 320, but do not penetrate the biological tissue 320 and the attachment members 310 and 311. Because it is scaled.

위와 같이 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에는 각각 배양액(340)과 함께 기질세포(320)만이 수렴된다.As described above, only the stromal cells 320 converge with the culture solution 340 in the first and second convergent portions 354a and 354b, respectively.

(b) 수렴부(354a)(354b)에 수렴된 기질세포(330)를 외부로 배출하는 단계는 예시적으로 도 8에 나타나 있는 바와 같이 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에 각각 수렴된 배양액(340)과 기질세포(320)를 외부로 배출하는 것을 의미한다.(b) discharging the stromal cells 330 converged to the converging portions 354a and 354b to the outside, as illustrated in FIG. 8, to the first and second converging portions 354a and 354b. Mean to discharge the converged culture solution 340 and stromal cells 320 to the outside, respectively.

용기(350)의 일 방향 회전에 의하여 제1 및 제2 수렴부(354a)(354b)에 각각 배양액(340)과 기질세포(320)만이 수렴되면, 용기(350)의 회전을 정지시킨다. 그 다음, 제1 수렴부(354a)에 형성된 제1 기질세포 배출부(355a)를 통해 제1 수렴부(354a)에 수렴된 배양액(340)과 기질세포(330)를 외부로 배출하고, 제2 수렴부(354b)에 형성된 제2 기질세포 배출부(355b)를 통해 제2 수렴부(354b)에 수렴된 배양액(340)과 기질세포(330)를 외부로 배출하게 된다.When only the culture medium 340 and the stromal cells 320 converge on the first and second convergent parts 354a and 354b by one direction rotation of the container 350, the rotation of the container 350 is stopped. Next, the culture medium 340 and the stromal cells 330 converged to the first converging part 354a are discharged to the outside through the first stromal cell discharging part 355a formed in the first converging part 354a. The culture medium 340 and the stromal cells 330 converged to the second convergent part 354b are discharged to the outside through the second stromal cell discharge part 355b formed at the second convergent part 354b.

위와 같은 과정을 통해 생체조직(320)에서 분리된 기질세포(330)를 최종적으로 수집하게 된다. Through the above process, the stromal cells 330 separated from the biological tissue 320 are finally collected.

위 (1) 내지 (5)의 단계를 연속해서 실행함으로써 생체조직에서 기질세포를 연속적으로 분리할 수 있어서 분리효율을 향상시킬 수 있게 된다.By performing the above steps (1) to (5) continuously, it is possible to continuously separate the stromal cells from the living tissue, thereby improving the separation efficiency.

위 (2) 내지 (5)의 단계는 순서대로 반복해서 실행될 수 있다. 이에 의해 용기(350)의 수용공간(351) 내에 존재하는 동일한 부착부재(310)(311)나 생체조직(320) 또는 배양액(340)에 잔존하는 기질세포(330)을 반복해서 수집할 수 있어서 기질세포의 수율을 향상시킬 수 있다.Steps (2) to (5) above may be repeated in sequence. Thereby, the stromal cells 330 remaining in the same attachment member 310, 311, living tissue 320, or culture medium 340 present in the receiving space 351 of the container 350 can be repeatedly collected. The yield of stromal cells can be improved.

위 (2) 내지 (4)의 단계에서 생체조직(320), 배양액(340) 및 부착부재(310)(311) 중 적어도 어느 하나를 교체한 후에 위 (2) 내지 (5)의 단계를 순서대로 반복해서 실행할 수도 있다. 이에 의해 용기(350)의 수용공간(351) 내에 존재하는 생체조직(320), 배양액(340) 및 부착부재(310)(311) 중 적어도 어느 하나를 교체하면서 기질세포(330)을 반복해서 수집할 수 있어서 수율을 대폭 향상시킬 수 있다.Steps (2) to (5) above after replacing at least one of the biological tissue 320, the culture medium 340 and the attachment member 310, 311 in the step (2) to (4) above You can run it again as you like. Thereby, the stromal cells 330 are repeatedly collected while replacing at least one of the biological tissue 320, the culture medium 340, and the attachment member 310, 311 existing in the accommodation space 351 of the container 350. The yield can be greatly improved.

본 발명은 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법 및 장치에 이용할 수 있다.The present invention can be used in a method and apparatus for separating stromal cells from living tissue without using an enzyme.

110, 210, 210', 310, 311: 부착부재
120, 220, 320: 생체조직
130, 230, 330: 기질세포
340: 배양액
350: 용기
353: 덮개
354a: 제1 수렴부
354b: 제2 수렴부
360: 차단막
370a: 제1 필터
370b: 제2 필터
380: 배양액 관통관
390: 실링부재110, 210, 210 ', 310, 311: Attachment member
120, 220, 320: living tissue
130, 230, 330: stromal cells
340: culture medium
350: container
353: cover
354a: first convergent portion
354b: second converging portion
360: barrier
370a: first filter
370b: second filter
380: culture through tube
390: sealing member

Claims (29)

효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서,
생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션(spontaneous migration)을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것을 이용하고,
기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 생체조직을 부착시킬 수 있는 소재의 부착부재 상에 생체조직이 부착된 상태에서 이루어지며,
기질세포의 자발적 마이그레이션의 유도는 기질세포가 생존할 수 있는 배양액 내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.As a method of separating stromal cells from living tissue without using an enzyme,
Induces spontaneous migration of stromal cells of living tissues to move stromal cells out of living tissues,
Induction of spontaneous migration of stromal cells is made in a state where the biological tissue is attached on the attachment member of the material that can attach the biological tissue,
Induction of spontaneous migration of stromal cells is characterized in that the stromal cells can survive. 청구항 1에 있어서,
생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 생체조직을 미세하게 절단하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 1,
And cutting the biological tissue finely such that at least a portion of the stromal cells are exposed to the outside between collagen surrounding the stromal cells in the biological tissue. 청구항 1에 있어서,
부착부재의 외부로 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리하는 것을 더 포함하고,
기질세포의 분리는 부착부재에 부착된 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 1,
Separating the stromal cells moved to the outside of the attachment member in the living tissue,
Separation of stromal cells is characterized in that by applying a physical force to the stromal cells attached to the attachment member. 청구항 3에 있어서,
생체조직의 외부로 이동된 기질세포에 가하는 물리적 힘은 배양액 내에서 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 배양액과 함께 난류 운동시킴으로써 발생하는 힘인 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 3,
The physical force applied to the stromal cells moved out of the biological tissue is a force generated by turbulent movement of the stromal cells moved out of the biological tissue with the culture medium in the culture medium. 청구항 1에 있어서,
생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. The method according to claim 1,
Collecting stromal cells isolated from biological tissue. 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 방법으로서,
(1) 생체조직을 미세하게 절단하는 것;
(2) 미세하게 절단된 생체조직을 배양액 내에서 그 생체조직이 부착될 수 있는 소재의 부착부재 상에 부착시키는 것;
(3) 부착부재 상에서 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 것; 및
(4) 생체조직의 외부로 이동된 기질세포를 부착부재에서 분리하는 것을
포함하는 것을 특징으로 하는 방법.As a method of separating stromal cells from living tissue without using an enzyme,
(1) finely cutting living tissue;
(2) attaching the finely cut living tissue to the attachment member of the material to which the living tissue can be attached in the culture medium;
(3) inducing spontaneous migration of stromal cells on the attachment member to move the stromal cells out of the living tissue; And
(4) separating the stromal cells that have migrated out of the living tissue from the attachment member.
Method comprising a. 청구항 6에 있어서,
(1)의 생체조직은 그 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단되는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
The biological tissue of (1) is finely cut so that at least a part of the stromal cells are exposed to the outside between collagen surrounding the stromal cells in the biological tissue. 청구항 6에 있어서,
(4)의 기질세포의 분리는 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배열된 복수의 부착부재들을 배양액의 난류 운동에 의해 서로 충돌시켜 기질세포에 물리적 힘을 가함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
Separation of the stromal cells of (4) is characterized in that the plural attachment members arranged in the stromal cells moved to the outside of the living tissues collide with each other by turbulent movement of the culture medium to apply a physical force to the stromal cells. 청구항 6에 있어서,
(5) 생체조직에서 분리된 기질세포를 수집하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
(5) further comprising collecting stromal cells isolated from biological tissue. 청구항 6에 있어서,
(2) 내지 (4)를 순서대로 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
The method characterized by repeating (2)-(4) in order. 청구항 6에 있어서,
생체조직, 배양액 및 부착부재로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나를 교체한 후에 (2) 내지 (4)를 순서대로 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 6,
(2) to (4) in sequence after replacing at least one selected from the group consisting of a biological tissue, a culture medium and an attachment member. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
생체조직은 피부, 지방, 연골, 점막, 혈관, 인대, 심장, 뇌, 태반, 제대, 양막, 근육 및 말초신경으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to any one of claims 1 to 11,
The biological tissue comprises at least one selected from the group consisting of skin, fat, cartilage, mucosa, blood vessels, ligaments, heart, brain, placenta, umbilical cord, amniotic membrane, muscle and peripheral nerves. 청구항 6 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 및 소태아혈청(fetal bovine serum)으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to any one of claims 6 to 11,
The culture medium is at least one selected from the group consisting of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) and fetal bovine serum (fetal bovine serum). 효소를 사용하지 않고 생체조직에서 기질세포를 분리하는 장치로서,
배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시키는 부착부재를 구비하고,
부착부재는 배양액보다 더 작은 평균비중을 가지거나 또는 배양액보다 더 큰 평균비중을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.As an apparatus for separating stromal cells from living tissue without using an enzyme,
Attaching biological tissues in the culture medium to induce spontaneous migration of stromal cells of the biological tissues, and having an attachment member for moving the stromal cells out of the biological tissues,
The attachment member is characterized in that it has a smaller average specific gravity than the culture medium or has a larger average specific gravity than the culture medium. 청구항 14에 있어서,
부착부재가 배양액보다 더 작은 평균비중을 경우에, 그 부착부재는, 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 14,
When the attachment member has a smaller average specific gravity than the culture medium, the attachment member is made of polypropylene, polyethylene, polyurethane, extracellular matrix, collagen, polydioxanone. (polydioxanone), polycaprolactone, poly (L-lactide), PLGA (poly (lactic-co-glycolic acid)), PLA (poly (lactic acid)), PGA (pterolyglutamic acid), Device comprising at least one selected from the group consisting of hyaluronic acid and silicon. 청구항 14에 있어서,
부착부재가 배양액보다 더 큰 평균비중을 경우에, 그 부착부재는, 테프론(teflon), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리에틸렌(polyethylene), 프탈레이트(phthalate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리우레탄(polyurethane), ECM(Extracellular Matrix), 콜라겐(collagen), 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), PLLA(poly(L-lactide)), PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PLA(poly(lactic acid)), PGA(pterolyglutamic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 14,
In the case where the attachment member has a greater average specific gravity than the culture medium, the attachment member is made of teflon, polycarbonate, polyethylene, phthalate, polystyrene, polyurethane, ECM (Extracellular Matrix), collagen, polydioxanone, polycaprolactone, poly (L-lactide), PLGA (poly (lactic-co-glycolic acid), Apparatus comprising at least one selected from the group consisting of PLA (poly (lactic acid), PGA (pterolyglutamic acid), hyaluronic acid (hyaluronic acid) and silicon. 청구항 14에 있어서,
부착부재는 생체조직에서 기질세포를 둘러싸는 콜라겐 사이로 기질세포의 적어도 일부가 외부로 노출되도록 미세하게 절단된 생체조직을 부착시키는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 14,
The attachment member is a device, characterized in that for attaching the finely cut biological tissue so that at least a portion of the stromal cells exposed to the outside between the collagen surrounding the stromal cells in the biological tissue. 청구항 14에 있어서,
부착부재는, 배양액 내에서 생체조직을 부착시켜 생체조직의 기질세포의 자발적 마이그레이션을 유도하여 기질세포를 생체조직의 외부로 이동시킬 뿐만 아니라, 이와 같이 이동된 기질세포를 생체조직에서 분리시키는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 14,
The attachment member is characterized by attaching the living tissue in the culture medium to induce spontaneous migration of the stromal cells of the living tissue to move the stromal cells out of the living tissue, as well as separating the transferred stromal cells from the living tissue. Device. 청구항 18에 있어서,
부착부재는, 자발적 마이그레이션에 의해 생체조직의 외부로 이동된 기질세포가 배열되는 영역을 이루는 본체와, 본체에서 외측으로 연장되어 본체의 두께보다 더 얇은 두께로서 타 부착부재에 배열된 기질세포를 스크레이핑(scraping)할 수 있는 형상을 갖는 스크레이핑부를 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 18,
The attachment member comprises a main body that forms an area in which the stromal cells moved out of the biological tissue by spontaneous migration and a stromal cell which extends outward from the main body and is thinner than the thickness of the main body and arranged in the other attachment member. Apparatus comprising a scraping portion having a shape capable of scraping. 청구항 19에 있어서,
스크레이핑부는 그 횡단면의 코너부가 형성하는 각도가 예각을 이루는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 19,
The scraping unit is characterized in that the angle formed by the corner portion of the cross section is acute angle. 청구항 14에 있어서,
배양액과 생체조직 및 부착부재를 내부에 수용하는 용기를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 14,
The apparatus further comprises a container for accommodating the culture solution and biological tissue and the attachment member therein. 청구항 21에 있어서,
용기는 배양액과 생체조직 및 부착부재가 수용되는 공간을 형성하며 회전에 의한 원심분리가 가능하도록 형성된 경사부를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 21,
The container is characterized in that the inclined portion formed to enable the centrifugation by rotation to form a space in which the culture medium and the biological tissue and the attachment member is accommodated. 청구항 21에 있어서,
용기는 정회전과 역회전에 의한 배양액의 난류를 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 21,
The vessel is characterized in that the induction of turbulent flow of the culture medium by the forward and reverse rotation. 청구항 21에 있어서,
용기는 생체조직은 투과되지 않고 배양액은 투과되며 용기가 정지된 상태에서 배양액에 잠기는 위치에 배열되어 배양액에 뜨는 생체조직이 배양액에 뜨는 것을 차단하는 차단막을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 21,
The container further comprises a barrier membrane which prevents biological tissue from penetrating into the culture medium while the culture medium is permeated and the culture medium is permeated and arranged in a position where the container is immersed in the culture medium. 청구항 21에 있어서,
용기는 원심력이 최대인 위치에 형성되어 생체조직에서 분리된 기질세포를 원심력에 의해 수렴시키는 수렴부를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 21,
The container is formed in a position where the centrifugal force is maximum, characterized in that it has a converging portion for converging the stromal cells separated from the biological tissue by the centrifugal force. 청구항 25에 있어서,
용기는 수용 공간에서 수렴부까지의 경로 상에 위치하여 원심력에 의한 기질세포의 이동을 허용하고 생체조직 및 부착부재의 이동을 차단하는 필터를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 25,
The container further comprises a filter positioned on the path from the accommodation space to the convergent portion to allow movement of the stromal cells by centrifugal force and block movement of the living tissue and attachment member. 청구항 25에 있어서,
용기는 수렴부에 형성되어 수렴부에 수렴된 기질세포를 외부로 배출시키는 기질세포 배출부를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 25,
The container further comprises a stromal cell discharge portion formed in the converging portion to discharge the stromal cells converged on the converging portion to the outside. 청구항 21에 있어서,
용기는 외부에서 수용 공간으로 연장되어 배양액을 주입하거나 배출시키는 배양액 관통관을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 21,
The vessel further comprises a culture medium through-tube extending from the outside to the receiving space to inject or discharge the culture. 청구항 21에 있어서,
용기는 내부 소독을 위한 가스를 주입시키는 가스 주입부를 더 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.The method according to claim 21,
The container further comprises a gas inlet for injecting gas for internal disinfection.
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