KR20190114375A - 산소를 함유하는 나노 버블의 제조 방법, 나노 버블 및 이를 포함하는 약물 전달체 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 산소를 함유하는 나노 버블의 제조 방법, 나노 버블 및 이를 포함하는 약물 전달체에서, 본 발명의 나노 버블의 제조 방법은 80:20 초과 90:10 미만의 몰비(molar ratio)로 혼합된 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 포함하되 상기 단층 인지질막 형성 유도제가 서로 다른 2종의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 용액을 초음파 처리하여, 단층 인지질로 형성된 단층 인지질막 마이크로 구조체를 형성하는 단계; 및 단층 인지질막 마이크로 구조체를 포함하는 용액에 산소 가스를 주입하면서 상기 용액을 초음파 처리하여, 나노 크기이고 단층 인지질이 형성하는 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하는 나노 버블을 형성하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 산소를 함유하는 나노 크기의 버블 구조체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포에 산소를 전달 가능한 산소를 함유하는 나노 크기의 버블과 이를 제조하는 방법, 그리고 상기 나노 버블을 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.
혈액은 매일 폐로부터 조직으로 약 600 L의 산소를 운반한다. 세포 및 조직으로의 산소 전달은 혈액 내 혈색소(헤모글로빈, hemoglobin)와 산소의 결합능에 의해 좌우된다. 일반적으로, 산소와 혈색소 간의 결합력은 수소 이온이 적을수록, 즉, pH가 높을수록 그리고 체온이 낮을수록 강해지는데, 이와 달리, 말단 조직에서는 반대로 CO2와 혈색소 간의 결합이 강하게 일어단다. 때문에, 말단 조직에서는 산소가 방출되며 CO2는 다시 폐로 운반되어 방출된다.
산소 운반량의 감소와 산소 소모량의 증가는 조직이나 세포의 저산소증(hypoxia)을 초래하며, 조직의 세포를 파괴할 뿐 아니라 인체의 활동을 정지시킬 수도 있다. 저산소증(hypoxia)은 조직세포의 산소분압이 비정상적으로 낮은 경우를 일컫는 용어로, 일반적인 말단세포에서의 저산소 상태는 4~8% 정도의 산소포화 농도를 나타내고, 암조직 등의 저산소 컨디션에서는 1~5% 정도의 산소 포화도를 나타낸다. 저산소증 조건의 말단조직 또는 암조직에서 산소는 세포의 수와 성장에 따라 양적으로 변하며, 특히, 암조직에서는 암세포가 비정상적으로 증가함에 따라 산소의 소비가 촉진되어 국지적 저산소 상태가 된다. 이러한 국지적 저산소 상태는 저산소 유발 단백질의 과다 발현을 유도하고 이를 통해 암세포의 저산소 상태를 치료하여 암세포 성장에 기여한다.
이에, 세포에 독성이 없고 안정적이면서도 세포나 조직에 우수한 효율로 산소를 전달하여 저산소증을 극복 가능하고 암세포의 성장을 저해할 수 있는 물질에 대한 연구 및 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
본 발명의 일 목적은 고농도의 산소를 함유하면서 세포 독성이 없고 세포 친화적인 나노 크기의 버블을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고농도의 산소를 함유하면서 세포 독성이 없고 세포 친화적인 나노 크기의 버블을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 버블을 포함하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 나노 버블의 제조 방법은 80:20 초과 90:10 미만의 몰비(molar ratio)로 혼합된 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 포함하되 상기 단층 인지질막 형성 유도제가 서로 다른 2종의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 용액을 초음파 처리하여, 단층 인지질로 형성된 단층 인지질막 마이크로 구조체를 형성하는 단계 및 단층 인지질막 마이크로 구조체를 포함하는 용액에 산소 가스를 주입하면서 상기 용액을 초음파 처리하여, 나노 크기이고 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하는 나노 버블을 형성하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디라우로일포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디펜타데카노일포스파티딜콜린(DPDPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린(MPPC), 콜레스테롤, 지방산, 지방 알코올(fatty alcohols) 및 지방 에스테르(fatty esters) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단층 인지질막 형성 유도제는 DSPE-PEG-2000 아민, DSPE-PEG-비오틴, DSPE-MPEG-1000, DSPE-MPEG-2000 및 DSPE-MPEG-5000 중 2종을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제의 몰비는 85:15이고, 상기 단층 인지질막 형성 유도제는 서로 다른 2종의 계면활성제를 8:7의 몰비로 포함할 수 있다.
이때, 상기 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 상기 단층 인지질막 형성 유도제는 DSPE-PEG-2000 아민 및 DSPE-PEG-비오틴을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노 버블을 형성하는 단계에서, 250 nm 내지 350 nm의 직경을 갖는 나노 버블이 형성될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노 버블을 형성하는 단계에서, 3 mV 이하의 막 전위를 갖는 나노 버블이 형성될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노 버블을 형성하는 단계는 0℃ 이상 50℃ 미만의 온도에서 수행할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노 버블을 형성하는 단계에서, 인지질 대비 단층 인지질막 형성 유도제의 몰비가 증가할수록 상기 나노 버블의 크기가 감소할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 포함하는 용액은 물, 인산완충액 및 무혈청 배지 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노 버블을 형성하는 단계에서, 상기 단층 인지질막 나노 구조체에 산소 가스가 포집되어 상기 중공에 수용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 위한 나노 버블은 나노 크기이고 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하고, 250 nm 내지 350 nm의 직경 크기를 갖는다.
일 실시예에서, 상기 나노 버블은 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 외부 환경 대비 고농도의 산소 가스를 포함할 수 있다.
이때, 상기 산소 가스 농도는 100 내지 160 mg/L일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 나노 버블은 세포 산소 가스를 전달 가능한 산소 전달체일 수 있다.
이때, 상기 나노 버블은 세포에서 저산소 유발 단백질(HIF-1-alpha)을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 위한 약물 전달체는 나노 크기이고 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하고, 250 nm 내지 350 nm의 직경 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 나노 버블 및 상기 나노 버블의 단층 인지질막 나노 구조체에 결합된 약물을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 약물은 항암제일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단층 인지질막 나노 구조체는 중공을 향하는 내측에 인지질의 소수성부가 위치하고, 외부를 향하는 외측에 인지질의 친수성부가 위치하는 단층 인지질로 형성된 마이셀 구조를 갖고, 상기 약물은 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 소수성부에 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 단층 인지질막 나노 구조체는 표면에 카르복시기(-COOH), 아민기(-NH2) 및 비오틴 중 적어도 어느 하나를 포함하고, 상기 약물은 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 카르복시기(-COOH), 아민기(-NH2) 및 비오틴 중 적어도 어느 하나와 결합될 수 있다.
본 발명의 산소를 함유하는 나노 버블의 제조 방법, 나노 버블 및 이를 포함하는 약물 전달체에 따르면, 본 발명에 따른 나노 버블은 나노 크기이고 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 중공에 수용된 산소 가스를 포함한다. 본 발명에 따르면, 인지질 및 계면활성제의 최적비에 따라 본 발명의 나노 버블을 합성함으로써, 본 발명의 나노 버블은 세포막 투과 효과 및 침착율(EPR)에 극대화된 효과를 갖는 약 300 nm의 직경을 갖고, 막전위(zeta potential)가 0이거나 0에 근접하여 전위 차에 의한 세포 독성 또는 반응성이 없다. 때문에, 본 발명의 나노 버블은 세포 친화적이고 독성이 없으면서, 우수한 효율로 산소를 전달할 수 있고, 이에, 본 발명의 나노 버블은 산소 전달체로서 이용할 수 있다. 본 발명의 나노 버블은 세포에 산소를 전달하여 세포가 저산소 상태인 경우 세포의 저산소 상태를 극복시켜 세포 생존력을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 나노 버블은 저산소 유발 단백질의 발현 및 활성을 억제할 수 있어, 암세포에 적용되는 경우 암세포의 사멸을 유도할 수 있다. 뿐만 아니라, 특히 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)을 증가시켜 암세포의 성장을 방해함으로써 항암 효과를 증대시킬 수 있다. 게다가, 본 발명의 나노 버블은 약물과 결합하여 약물 전달체로서도 이용 가능하다. 뿐만 아니라, 본 발명의 나노 버블은 초음파 영상용 조영제로서 이용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조 방법 및 이에 의해 형성된 나노 버블을 설명하기 위한 도면이다.
도 1b는 본 발명의 나노 버블의 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 크기를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 크기 및 수를 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 크기 및 수를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포막 투과도 및 침착율을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포 독성을 설명하기 위한 도면이다.
도 7은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 저산소 조건에서의 특성을 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포 생존율 증가 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 저산소 유발 단백질 억제를 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 발명의 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신의 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 11은 본 발명의 산소 함유 나노 버블과 독소루비신의 작용메커니즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 12는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 팬텀 테스트 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 1b는 본 발명의 나노 버블의 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 크기를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 크기 및 수를 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 크기 및 수를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포막 투과도 및 침착율을 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포 독성을 설명하기 위한 도면이다.
도 7은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 저산소 조건에서의 특성을 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포 생존율 증가 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 저산소 유발 단백질 억제를 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 발명의 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신의 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 11은 본 발명의 산소 함유 나노 버블과 독소루비신의 작용메커니즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 12는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 팬텀 테스트 결과를 설명하기 위한 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명의 산소 함유 나노 버블의 제조 방법은 먼저, 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 포함하는 용액을 초음파 처리하여, 단층의 인지질로 형성된 단층 인지질막 마이크로 구조체를 형성하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 포함하는 용액은 물, 인산완충액(예를 들어, Dulbecco's phosphate-buffered saline, DPBS) 및 무혈청 배지 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.
인지질은 소수성 및 친수성의 특성을 갖는 양쪽성 물질로서, 본 발명의 인지질은 세포 친화적이고 세포 독성을 나타내지 않으며 용액 중에서 버블 형태를 유지 가능한 단일 막을 갖는 구조체를 형성 가능한 인지질일 수 있다. 인지질 단층막은 하나의 인지질 층으로 형성된 막을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 인지질은 DSPC(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)), DLPC(2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine) 또는 디라우로일포스파티딜콜린(dilauroylphosphatidylcholine)), DMPC(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine) 또는 디미리스토일포스파티딜콜린(dimyristoylphosphatidylcholine)), DPDPC(1,2-디펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipentadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine) 또는 디펜타데카노일포스파티딜콜린(dipentadecanoylphosphatidylcholine)), DPPC(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine) 또는 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine)), MPPC(1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-Myristoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine) 또는 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린(1-myristoyl-2-palmitoylphosphatidylcholine)), 콜레스테롤(cholesterol), 지방산(fatty acids), 지방 알코올(fatty alcohols) 및 지방 에스테르(fatty esters) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 이때, 일례로, 본 발명의 인지질은 DSPC을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 상기에서는 바람직한 본 발명의 인지질을 언급하였으나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 인지질은 세포 친화적이고 세포 독성을 나타내지 않으며 용액 중에서 버블 형태를 유지 가능한 단일 막 구조를 형성 가능한 인지질이면 가능할 수 있다.
본 발명에서 단층 인지질막 형성 유도제는 인지질이 용액 내에 잘 혼합되도록 하고, 상기 인지질이 용액 내에서 자기조립되어 단층의 인지질로 형성된 인지질 단층막을 형성하도록 하는 역할을 하는 물질이다. 또한, 본 발명의 단층 인지질막 형성 유도제는 본 발명에 따라 제조된 나노 버블의 생체적합성 및 안정성에 기여할 수 있고, 아울러, 세포 내 흡수(uptake)가 용이하도록 할 수 있다. 이에 대한 보다 상세한 설명은 하기에서 후술하도록 한다. 본 발명의 단층 인지질막 형성 유도제는 서로 다른 2종의 계면활성제를 포함한다. 예를 들어, 계면활성제는 DSPE-PEG-2000 아민(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino(polyethylene glycol)-2000])), DSPE-PEG-비오틴(1,2- 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌글리콜)-2000](1,2- distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000]), DSPE-MPEG-1000(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜-1000](1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-1000])), DSPE-MPEG-2000((1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜-2000](1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-2000])), DSPE-MPEG-5000(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜-5000](1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-5000])) 등일 수 있다. 일례로, 상기 단층 인지질막 형성 유도제는 DSPE-PEG-2000 아민 및 DSPE-PEG-비오틴을 포함할 수 있다. 상기에서는 본 발명의 단층 인지질막 형성 유도제를 구성할 수 있는 바람직한 계면활성제를 예시적으로 언급하였으나, 본 발명이 반드시 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서는 인지질이 용액 내 용매와 잘 혼합되고 인지질 단층막을 형성 가능한 계면활성제이면 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 포함하는 용액은 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 80:20 초과 90:10 미만의 몰비(molar ratio)로 포함한다. 인지질 대비 단층 인지질막 형성 유도제를 20 이상의 몰비로 포함하는 경우, 형성된 버블의 막 전위가 높아 세포에 독성을 나타낼 수 있고, 버블의 크기 또한 너무 작은 크기를 가져 실질적으로 수용하는 산소의 양이 매우 적을 수 있다. 한편, 인지질 대비 단층 인지질막 형성 유도제를 10 미만의 몰비로 포함하는 경우, 매우 큰 크기의 버블이 형성될 수 있어, 인지질 대비 단층 인지질막 형성 유도제를 10 초과 20 미만의 몰비로 포함하는 것이 바람직할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 85:15의 몰비로 포함할 수 있다. 이때, 상기 단층 인지질막 형성 유도제는 서로 다른 2종의 계면활성제를 서로 상이한 몰비로 포함하거나 동일한 몰비로 포함할 수 있고, 일례로, 상기 단층 인지질막 형성 유도제는 서로 다른 2종의 계면활성제를 8:7의 몰비로 포함할 수 있다. 즉, 상기 용액은 바람직하게 인지질:제1 계면활성제:제2 계면활성제를 85:8:7의 몰비로 포함할 수 있다. 일례로, 제1 계면활성제는 DSPE-PEG-2000 아민일 수 있고, 제2 계면활성제는 DSPE-PEG-비오틴일 수 있다. 본 발명에 따르면, 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 상기와 같은 비율로 포함하는 용액을 이용하여 나노 버블을 형성함으로써, 250 nm 내지 350 nm의 버블 크기를 갖는 본 발명의 나노 버블을 형성할 수 있다. 또한, 상기와 같은 비율로 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 포함함으로써, 본 발명의 나노 버블은 3 mV 이하의 막 전위를 가질 수 있고, 이는 서로 다른 2종의 계면활성제의 몰비에 따라 제어될 수 있으며, 0 또는 이에 가까운 막 전위 값을 나타낼 수도 있다. 일례로, 상기 나노 버블의 막 전위는 계면활성제, 특히, 제1 계면활성제의 비율이 증가할수록 +를 나타낼 수 있다. 이에 대한 보다 구체적인 설명은 하기에서 후술하기로 한다.
단층 인지질막 형성 유도제 및 인지질을 포함하는 용액의 초음파 처리는 소니케이터(sonicator)를 이용하여 수행한다. 일례로, 초음파 처리는 40 KHz 베스 소니케이터(bath sonicator)로 10분 동안 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명에 따라 단층 인지질막 형성 유도제 및 인지질을 포함하는 용액을 초음파 처리하면, 상기 용액 내에서 물 분자와 계면활성제가 반응하여, 상기 인지질이 상기 계면활성제에 의해 상기 용액 내에서 단층의 인지질로 형성된 매우 큰 막 구조체를 형성한다(단층 인지질막 마이크로 구조체). 이때, 상기 인지질막 구조체는 단층의 인지질로 형성된 막을 갖는 2차원의 구조체일 수 있고, 이와 달리, 3차원 구조체일 수도 있다. 일례로, 상기 단층 인지질막 마이크로 구조체는 마이크로 크기를 갖는 단층 인지질막으로 형성된 마이셀 구조를 갖는 구조체일 수 있다.
이어서, 단층 인지질막 마이크로 구조체를 포함하는 용액에 산소를 주입하면서 상기 용액을 초음파 처리하여, 나노 크기이고 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하는 나노 버블을 형성하는 단계를 포함한다.
상기 단층 인지질막 마이크로 구조체를 포함하는 용액에 고순도의 산소 가스를 주입하면서 상기 용액을 초음파 처리하면, 상기 용액 내의 마이크로 구조체가 초음파에 의해 작게 파괴(분해)되고, 파괴(분해)된 마이크로 구조체는 나노 크기로 중공을 갖는 구 형태를 이루는데(단층 인지질막 나노 구조체), 이때, 고순도의 산소 가스가 포집됨으로써, 중공에 산소가 포집된 나노 크기의 버블이 형성된다. 즉, 초음파 분해에 의해 단층 인지질막 마이크로 구조체가 분해되고, 분해된 단층 인지질막이 나노 크기로 자기조립되면서 산소를 포집하여, 중공에 수용된 산소를 포함하는 나노 버블이 형성된다. 상기 단층 인지질막 나노 구조체는 중공을 향하는 내측에 인지질의 소수성부가 위치하고, 외부를 향하는 외측에 인지질의 친수성부가 위치하는 단층 인지질로 형성된 마이셀 구조를 가질 수 있다.
일례로, 상기 용액에서 인지질 대비 단층 인지질막 형성 유도제의 비중이 증가할수록 생성되는 나노 버블의 크기가 감소할 수 있고, 이와 달리, 생성되는 산소 함유 나노 버블의 수는 증가할 수 있는데, 이때, 예를 들어, 상기 인지질이 DSPC, 단층 인지질막 형성 유도제에서 제1 계면활성제가 DSPE-PEG-2000 아민, 제2 계면활성제가 DSPE-PEG-비오틴이고 이들을 85:8:7의 몰비로 혼합하는 경우, 250 nm 내지 350 nm의 크기를 갖고 막 전위가 3 mV 이하를 갖는 산소 함유 나노 버블이 형성될 수 있다.
상기 단층 인지질막 마이크로 구조체를 포함하는 용액의 초음파 분해는 일례로, 팁 소니케이터(Tip sonicator)를 이용할 수 있고, 이와 달리, 베스 소니케이터를 이용하여 수행할 수도 있으며, 둘 모두를 이용하여 수행할 수도 있다. 또는, 상기 초음파 분해를 소니케이터와 함께 볼텍싱(voltexing)하여 수행할 수도 있다. 또한, 상기 초음파 분해는 50 ℃ 미만의 상온 또는 저온의 온도에서 수행할 수 있고, 이때, 수행 시간은 약 5분 이상일 수 있다. 초음파 분해를 더 짧은 시간을 수행하거나 온도가 50 ℃ 이상인 경우 나노 크기의 버블이 형성되지 않을 수도 있다. 일례로, 초음파 분해는 4℃에서 190 W의 펄스모드(에너지)로 5분간 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 고순도의 산소는 99.9% 산소일 수 있다.
또한, 형성된 나노 버블은 용액으로부터 원심분리(300 rcf) 또는 시린지 필터에 의해 분리될 수 있고, 일례로, 시린지 필터는 800 μm 이하의 포어 사이즈를 갖는 필터일 수 있다.
본 발명의 나노 버블은 나노 크기이고 단층의 인지질이 형성하는 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하고, 250 nm 내지 350 nm의 직경 크기를 갖는다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조 방법 및 이에 의해 형성된 나노 버블을 설명하기 위한 도면이다.
도 1a를 참조하면, 본 발명의 나노 버블은 단층의 인지질 막이 고순도의 산소 가스가 수용된 중공을 감싸는 구조를 갖는다. 즉, 본 발명의 나노 버블은 고순도의 산소 가스를 단층 인지질막이 둘러싸고 있는 구조를 가져, 단층 인지질을 통해 단층 인지질막 나노 구조체 내부 중공에 수용된 산소 가스의 외부로부터의 누출을 방지하면서 산소 가스를 안정하게 구속하고 있을 수 있다. 일례로, 본 발명의 나노 버블은 30일 기준으로 30%의 산소 감소율을 나타낼 수 있으며, 이 경우에도, 상기 나노 버블에 산소 가스를 주입하는 경우 즉시 산소 농도를 회복할 수 있다. 본 발명의 나노 버블은 외부 환경 대비 고농도의 산소 가스를 함유하고 있을 수 있으며, 예를 들어, 산소 함유 나노 버블의 산소 농도는 약 160 mg/L일 수 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며, 100 내지 160 mg/L의 범위 이내 또는 그 이상이거나 이하일 수도 있다.
또한, 본 발명의 나노 버블은 막 전위가 3 mV 이하이고, 특히, 0 이거나 0에 근접한 수치를 가질 수 있어, 이에, 본 발명의 나노 버블 입자는 높은 세포막 친화성을 갖고 세포 독성을 나타내지 않을 수 있다. 때문에, 본 발명의 나노 버블은 상기에서 설명한 바와 같이 세포 독성이 없고 세포 친화적인 인지질로 구성된 단층 인지질막 나노 구조체를 포함하고 있는 동시에, 0 내지 3 mV의 매우 낮은 막 전위를 가져 보다 우수한 세포 비독성 및 높은 세포막 친화성을 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 나노 버블은 250 nm 내지 350 nm의 크기를 가가져 우수한 세포막 투과도 및 침착율(enhanced permeability and retention: EPR)을 나타낼 수 있다. 때문에, 본 발명의 나노 버블을 체내에 적용하는 경우, 체내 조직이나 세포에 산소를 안정하고 빠르게 전달할 수 있고, 산소를 조직이나 세포에 전달함으로써 세포의 생존율을 향상시킬 수 있다. 이에, 본 발명의 산소 함유 나노 버블은 조직 및/또는 세포에 산소를 직접 전달하는 효과적인 산소 전달체로서 이용할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 나노 버블은 표면에 기능기(functional group)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표면 기능기는 카르복시기(-COOH) 및 아민기(-NH2) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 또는 상기 나노 버블은 표면에 비오틴을 포함할 수도 있다.
본 발명의 나노 버블은 저산소증 상태의 조직이나 세포에 산소를 전달함으로써 저산소증을 극복하는데 기여할 수 있다. 저산소증은 일반적으로 5% 이하의 산소 농도를 갖는 상태를 의미하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니면 보통 대기 중 산소 농도인 20 내지 21% 보다 낮은 상태를 의미할 수도 있다. 본 발명의 나노 버블은 저산소증 조건의 조직이나 세포에 산소를 전달하여 상기 조직이나 세포의 저산소증 조건을 일반적인 상태로 극복하도록 할 수 있다.
또한, 특히, 본 발명의 산소 함유 나노 버블은 저산소증 유발 단백질(Hypoxia-inducible factor 1-alpha; HIF1-alpha)의 발현 및/또는 활성을 억제할 수도 있다. 이에 대하여는 하기 도 1b를 참조하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
도 1b는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 1b를 참조하면, 일반적인 세포에서는 저산소 유발 단백질이 발현되면 저산소(Hypoxia) 상태가 되어 세포가 사멸하나, 본 발명의 나노 버블은 이러한 저산소증 유발 단백질의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있어, 본 발명의 나노 버블을 저산소 조건의 세포에 처리하는 경우, 저산소 유발 단백질을 억제하여 세포의 사멸을 방지하고 이에 따라 세포의 생존율을 향상시킬 수 있다. 한편, 암세포에서는 저산소 유발 단백질이 과발현되어 저산소 상태가 유도되지만 암세포는 생존한다. 그러나, 이때, 본 발명의 산소 함유 나노 버블이 암세포에 적용되는 경우, 암세포에 산소를 전달하여 프로테아즈 활성을 증가시켜 저산소증 유발 단백질을 분해하고 저산소 유발 단백질을 억제함으로써, 암세포의 생장을 억제할 수 있고 이에 따라 암세포의 사멸에 기여할 수 있다(역 저산소 형성).
즉, 본 발명의 나노 버블은 세포에 산소를 전달하고, 나아가, 세포에서 저산소증 유발 단백질의 발현 및 활성을 억제하여 저산소증을 극복하는데 기여할 수 있으며, 특히, 이를 통해 정상 세포에서는 세포 생존력을 증가시키고 암세포에서는 세포 생장을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 나노 버블은 약물을 담지하거나 약물과 결합되어 약물 전달체로서 이용될 수도 있다. 예를 들어, 약물은 본 발명의 나노 버블의 단층 인지질막 나노 구조체에서 중공을 향하는 내측에 위치하는 소수성부와 결합할 수 있다. 이때, 본 발명의 나노 버블에 약물은 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO), 에탄올 등에 용해한 소수성 약물을 산소 함유 나노 버블을 포함하는 용액에 첨가함으로써 상기 산소 함유 나노 버블의 코어(중공)에 탑재될 수 있다. 이 경우, 약물은 소수성 약물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약물은 독소루비신일 수도 있다. 독소루비신은 항암제로서 본 발명의 산소 함유 나노 버블이 독소루비신을 포함하는 경우 항암제로서 이용될 수 있다. 이때, 상기 산소 함유 나노 버블은 그 자체의 항암 효과와 더불어 독소루비신의 항암 효과를 더욱 증대시킬 수 있고, 일례로, 합성된 독소루비신을 포함하는 산소 함유 나노 버블의 농도는 130 μg/mL(독소루비신/산소 함유 나노 버블)인 것이 바람직할 수 있다. 또한, 이와 달리, 약물은 본 발명의 나노 버블의 단층 인지질막 나노 구조체의 표면에 결합할 수도 있다. 구체적으로, 본 발명의 나노 버블은 표면에 카르복시기나 아민기와 같은 기능기 또는 비오틴을 포함하는 경우, 스트렙타비딘(streptavidin)/ 아비딘(avidin)을 이용하여 약물 전달체로 사용될 수 있다. 이때, 비오틴은 스트렙타비딘/ 아비딘 분자를 결합시키는 가교 역할을 할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 산소 함유 나노 버블은 초음파 영상의 조영제로서 이용할 수 있다. 본 발명의 산소 함유 나노 버블은 내부 코어에 산소를 함유하고 잇어 초음파에 의해 강한 반사 작용을 일으킬 수 있고, 이를 이용하여 본 발명의 산소 함유 나노 버블을 조영제로서 이용할 수 있다.
본 발명에 대한 보다 상세한 설명은 하기에서 구체적인 실시예를 들어 후술하기로 한다.
나노 버블의 제조
먼저, 클로로포름(chloroform)에 인지질인 DSPC과 계면활성제인 DSPE-PEG-2000 아민 및 DSPE-PEG-2000 비오틴을 85:8:7의 몰비로 혼합하였다. 이때, DSPC는 25.2 mg, DSPE-PEG-2000 아민은 8.4 mg, DSPE-PEG-비오틴은 7.95 mg 첨가하였고, 혼합 용액의 최종 농도는 4.16 mg/mL이었다. 이어서, 용매(클로로포름)를 증발시킨 후, 최종 볼륨(volume)이 10 mL가 되도록 인산완충액(DPBS)를 첨가하고 초음파 분산기인 베스 소니케이터(bath sonicator, 40KHz)를 사용하여 60℃에서 10분 동안 초음파 처리하여, 단층 인지질로 형성된 단층 인지질막 마이크로 구조체를 포함하는 용액(이하, 단층 인지질막 용액)을 제조하였다. 그 다음, 단층 인지질막 용액을 3 목 플라스크로 옮긴 후 순도 99.9% 산소를 주입하면서 동시에 팁형 초음파 분산기인 팁 소니케이터(tip sonicator)를 사용하여 4℃ 190 W의 펄스 모드로 5분간 초음파 분해하고, 본 발명의 실시예 1에 따른 나노 버블(이하, 산소 함유 나노 버블)을 제조하였다. 제조된 산소 함유 나노 버블은 800 μm 실린지 필터를 이용하여 분리하였다.
또한, DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴을 50:50:0, 80:20:0 및 90:5:5의 비율로 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1에 따라 산소 함유 나노 버블을 제조한 것과 실질적으로 동일한 방법을 수행하여, 비교예 1 내지 3에 따른 비교 버블을 제조하였다.
(1) 산소 함유 나노 버블의 크기 및 개수
본 발명의 실시예 1에 따라 제조한 산소 함유 나노 버블 및 단층 인지질막 마이크로 구조체의 현미경 이미지를 확인하였다. 주사 전자 현미경 이미지를 위해, 상기 합성한 산소 함유 나노 버블 및 단층 인지질막 마이크로 구조체 100 μL를 5% 아가로스(agarose) 겔에 넣어 굳혀 주사 전자 현미경용 샘플을 제작하였다. 그 다음, 제작된 샘플을 두께 2 μm로 자르고 백금(Pt) 코팅하였다. 또한, 산소 함유 나노 버블 및 단층 인지질막 마이크로 구조체의 형광 이미지를 위해 산소 함유 나노 버블 및 단층 인지질막 마이크로 구조체 10 mL에 아비딘-FITC 100 μL를 첨가한 후 300 rcf로 원심 분리하여 녹색 염색하였고 이를 형광 현미경 480/520 nm에서 확인하였다. 산소 함유 나노 버블 및 단층 인지질막 마이크로 구조체의 현미경 이미지를 도 2에 나타낸다.
도 2는 본 발명의 산소 함유 나노 버블 및 단층 인지질막 마이크로 구조체의 현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 2의 (A)는 고농축된 단층 인지질막 마이크로 구조체를 나타내고, (B)는 단층 인지질막 마이크로 구조체의 공초점 현미경 이미지를 나타내며, (C)는 아비딘-FITC를 이용하여 녹색 염색한 단층 인지질막 마이크로 구조체의 형광 현미경 이미지를 나타내고, (D) 및 (E)는 각각 나노 크기를 갖는 본 발명의 실시예 1에 따른 산소 함유 나노 버블의 주사 현미경 이미지를 나타내며, (F)는 산소 함유 나노 버블의 투과 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조한 산소 함유 나노 버블을 5 Kv로 200,000배로 관찰하였을 때 산소 함유 나노 버블이 약 300 nm 사이즈를 갖는 것을 확인할 수 있다. 또한, 5 Kv로 40,000배로 관찰하였을 때 산소 함유 나노 버블에 4.3 μm 사이즈의 마이크로 버블 또한 관찰되는 것을 확인할 수 있다.
보다 구체적인 본 발명에 따른 산소 함유 나노 버블의 크기 및 수를 확인하기 위해, DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴의 50:50:0, 80:20:0, 87:8:7 및 90:5:5의 비율로 형성된 버블들 각각을 1:1000 비율로 DPBS에 희석하여 NanoSight LM10 (NTA)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타낸다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 크기 및 수를 설명하기 위한 도면이다.
먼저, 도 3은 산소 함유 나노 버블의 형태학적 그래프로서, 도 3의 (A)는 산소 함유 나노 버블을 1:1000 배율로 희석하여 NTA(nanosight LM10)를 이용하여 평균값을 산정한 그래프를 나타내고, (D)는 1:1000 배율로 희석된 산소 함유 나노 버블의 DLS(Dynamic light scattering)를 이용한 사이즈 분포표를 나타낸다.
도 4는 산소 함유 나노 버블의 크기 및 수를 나타내는 분석표로서, 도 4의 (A)는 NTA를 이용하여 정량한 산소 함유 나노 버블의 크기 분석표이고, (B)는 DLS를 이용하여 정량한 산소 함유 나노 버블의 크기 분석표이며, (C)는 첨가한 인산완충액(DPBS) 첨가량에 따른 합성된 산소 함유 나노 버블의 수 분석표이고, (D)는 NTA를 이용하여 정량한 각각 다른 조합으로 생성된 산소 함유 나노 버블 및 비교 버블들의 수를 나타낸다.
도 3 및 도 4를 도 2와 함께 참조하면, 버블은 DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴의 비가 50:50:0일 때 버블의 크기는 평균 210 nm ± 50 nm이고, 80:20:0일 때 평균 240 nm ± 60 nm이며, 85:8:7일 때 평균 300 nm ± 50 nm, 90:5:5일 때 370 nm ± 70 nm의 크기를 갖는 것을 확인할 수 있다. 즉, DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴의 비율이 85:8:7일 때 세포막 투과 효과가 가장 최적화된 300 nm ± 50 nm의 크기를 갖는 산소 함유 나노 버블을 형성할 수 있음을 확인할 수 있다.
또한, 산소 함유 나노 버블은 희석 배수에 따라 입자의 수가 4 X 1011 /mL에서 3.5 X 108 /mL로 (1:10000) 감소하는 직선성을 나타내며, 이때 희석을 많이 할수록 평균 사이즈가 감소하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 이는 입자 수 대비 용액의 비율이 증가하여 산소가 물에 용해되어 나오는 것에 기인한다.
뿐만 아니라, 시간에 따른 산소 함유 나노 버블의 안정성을 확인하기 위해, 실온에 30일 동안 보관한 후 산소 함유 나노 버블을 다시 NTA로 확인한 결과, 30% 정도가 감소된 것을 확인할 수 있고, 그 사이즈도 마찬가지로 20% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이것은 산소 함유 나노 버블로부터 공기 중으로 산소가 확산된 것에 기인하는 결과로, 이때, 산소를 주입하는 경우, 산소 함유 나노 버블의 크기가 다시 증가한다.
즉, 본 발명의 산소 함유 나노 버블은 장기간 안정하며, 산소 가스를 다시 공급하는 정도로 지속적으로 고순도의 산소 가스를 함유할 수 있음을 확인할 수 있다.
(2) 산소 함유 나노 버블의 막전위
또한, 본 발명의 실시예 1에 따른 산소 함유 나노 버블과 비교예에 따른 비교 버블들의 나노 버블 막전위(zeta potential)를 측정하였다. 그 결과, DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴의 비율이 50:50:0일 때 11.5 ± 1 mV를 나타내었고, 80:20:0에서 5 ± 2 mV, 85:8:7에서 1.8 ± 0.8 mV, 90:5:5 에서 3.9 ± 0.2 mV로 나타남을 확인할 수 있다. 즉, 85:8:7의 비율로 인지질 및 2종의 계면활성제를 포함하는 용액을 이용함으로써 0에 가까운 최적화된 막 전위 1.8 ± 0.8 mV를 나타내는 산소 함유 나노 버블을 형성할 수 있음을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명의 실시예 1에 따른 산소 함유 나노 버블이 세포 독성 및 세포 친화성에 영향을 미치는 막 전위가 0에 가까운 수치를 나타내므로, 세포 독성이 없고 세포에 친화적임을 확인할 수 있다.
(3) 산소 함유 나노 버블의 세포막 투과도 및 침착율
이어서, 본 발명에 따른 산소 함유 나노 버블의 세포막 투과도 및 침착율(EPR)를 확인하였다. 구체적으로, 인지질 및 2종의 계면활성제가 각각 다른 비율로 제조된 비교예에 따른 버블들과 본 발명의 실시예 1에 따른 산소 함유 나노 버블 (DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴; 50:50:0, 80:20:0, 85:8:7, 90:5:5) 10 μL와 독소루비신 5 μL를 혼합한 후 DPBS 10 mL를 넣고 산소를 주입시켜 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체를 제조하였다. 그 다음, 유방암세포 (MDA-MB-231 ,5 x 104/mL, 96 well)에 이를 각각 투입 한 뒤 2시간 배양하였다. 이어서, DPBS로 세포를 세척한 다음, 500/560 nm 파장으로 세포내 침착된 독소루비신을 형광세기로 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포막 투과도 및 침착율을 설명하기 위한 도면이다.
도 5의 (A)는 아비딘-FITC(형광 염료(dye))를 산소 함유 나노 버블에 결합 시켜 세포에 처리한 후 세포막에 침착된 형광 염료가 결합된 산소 함유 나노 버블의 정량 그래프를 나타내고, (B)는 산소 함유 나노 버블 단독(ONBs) 또는 독소루비신을 산소 함유 나노 버블과 함께(ONBs+DOX), 그리고 독소루비신을 산소 함유 나노 버블에 결합시킨 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체(ONBs/DOX)를 각각 세포에 처리한 후 세포막에 침착된 독소루비신이 결합된 산소 함유 나노 버블의 정량 그래프를 나타낸다. (C)는 독소루비신, DSPE-PEG-2000 아민 및 DSPE-PEG 2000 비오틴을 각각 50:50:0, 80:20:0, 85:8:7, 90:5:5의 비율로 혼합하여 제조한 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체를 세포에 2시간 처리한 후, 세포막에 남아 있는 독소루비신을 형광 이미지를 분석한 그래프이고, (D)는 동일 조건으로 24시간 처리한 후 분석한 그래프를 나타낸다.
도 5에서 'ONBs'는 산소 함유 나노 버블을 나타내고, 'DOX'는 독소루비신을 나타내며, 'ONBs+DOX'는 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신을 동시 투여한 경우, 'ONBs/DOX'는 독소루비신이 산소 함유 나노 버블에 결합된 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체를 나타낸다.
도 5를 참조하면, 형광세기 기준으로 DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴의 비율이 50:50:0일 때 300 ± 100, 80:20:0일 때 320 ± 50, 85:8:7일 때 590 ± 50, 90:5:5일 때 700 ± 100을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
즉, DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴의 비율이 90:5:5 일 때가 EPR 효과가 가장 우수하였으나, 85:8:7일 때에도 590 ± 50 매우 우수한 EPR 효과를 나타내며, 이에, 본 발명의 산소 함유 나노 버블이 우수한 EPR 특성을 나타냄을 확인할 수 있다.
(4) 산소 함유 나노 버블의 세포 독성 및 확산
산소 함유 나노 버블의 세포 독성을 판단하기 위해, MDA-MB-231 유방암세포를 1 X 106/well로 배양 후, 산소 함유 나노 버블을 10 μL를 기준으로 1:10, 1:100, 1:500,1: 1000, 1:2000로 첨가하여 그 독성을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 1에서 제조한 단층 인지질막 용액에 대하여도, 단층 인지질막 용액을 1, 5, 10 100 μL/mL가 되도록 희석한 후 유방암세포(MDA-MB-231 ,5 X 105/mL, 24 well)에 투여하여 세포 독성 검사를 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포 독성을 설명하기 위한 도면이다.
도 6에서 (A)는 산소 함유 나노 버블의 희석 배수에 따른 사이즈 감소를 나타내는 그래프이고, (B)는 산소 함유 나노 버블의 시간에 따른 안정성 검사 결과를 나타내는 그래프이며, (C)는 실제 산소 함유 나노 버블의 산소 확산을 나타내는 그래프이고, (D)는 산소 함유 나노 버블을 농도별로 세포에 처리 하였을 때 세포 독성 및 세포 증식효과를 나타내는 그래프이며, (E)는 산소를 포함하지 않는 순수한 단층 인지질막 용액을 이용하여 세포에 처리한 세포 독성 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6을 참조하면, 1:10과 1:1000에서는 유의성이 없는 결과가 나온 반면, 1:200, 1:1000, 1:2000에서는 대조군(Control)과 비교하여 세포 독성이 없고 세포가 10% 이상 더 잘 생장하는 것을 확인할 수 있다. 이것은 산소 함유 나노 버블에 의해 세포로 직접 산소가 전달되어 세포가 더 잘 생장하는 것을 의미한다.
또한, 특히 도 6의 (C)를 참조하면, 50 mL의 물을 담은 튜브에 아르곤 가스를 5분간 주입시켜 산소 농도가 2 mg/L가 되도록 한 후, 10% 산소 함유 나노 버블을 첨가하였을 때, 용존산소계(Dissolved oxygen meter)를 이용하여 산소농도를 측정한 결과, 산소 함유 나노 버블을 첨가한 그룹에서는 동량의 대조군을 첨가한 그룹에서 보다 1분 후 40% 이상 산소 농도가 바로 증가되는 것을 확인할 수 있고, 이는 3 시간 동안 지속됨을 확인할 수 있다. 이것은 산소 나노 버블에 의해 산소가 빠르게 확산됨을 의미한다.
즉, 본 발명에 따른 산소 함유 나노 버블을 이용하여 세포로 독성 없이 빠르게 산소를 전달할 수 있음을 확인할 수 있으며, 특히, 산소 함유 나노 버블의 확산은 1분 이내로 매우 빠르고 지속 시간 또한 3시간 지속됨을 확인할 수 있다.
(5) 저산소 조건에서의 산소 함유 나노 버블의 효과
본 발명의 산소 함유 나노 버블의 저산소 조건에서의 특성을 확인하기 위해, 먼저, 저산소 조건을 형성하였다. 저산소 조건은 가로 X 세로 30 cm X 20 cm 밀폐용기(저산소 챔버) 또는 저산소 전용 인큐베이터를 이용하여 형성할 수 있으나, 본 발명에서는 30 cm X 20 cm 저산소 챔버를 이용하였다. 챔버에 두개의 관을 연결한 후 한쪽에는 아르곤 가스를 주입하며 다른 쪽으로 산소를 제거하였다. 이때, 산소 농도가 대기 중 산소 농도 20~21% 보다 현저히 낮은 5% 이하(1 내지 5%)가 될 때까지 20분 동안 아르곤 가스를 주입하였다. 이후, MDA-MD-231 유방암 세포가 배양된 6 well (MDA-MB-231; 5 X 105/mL)을 챔버 중앙에 위치시켜 세포에 저산소증을 유발하였다. 그 다음, 산소 함유 나노 버블을 10%, 20%씩 각각 넣고 image-IT hypoxia reagent (490/610 nm, 10μM; 10 μL/mL)를 첨가한 후 8시간 동안 배양하였다. 그 다음, 형광 현미경을 통하여 저산소증 유발 세포(붉은색 형광)의 세기를 산소나노 버블을 각각 0%, 10%,20% 첨가된 실험군과 비교하여 결과를 도출하였다. 또한, 본 발명의 산소 함유 나노 버블을 각 0 μL, 10 μL, 20 μL씩 MDA-MB-231 세포에 처리 후 24시간 동안 변화를 확인하였다. 이후, 트리판 블루 색소 배제(Trypan blue dye exclusion) 분석을 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정하였고, 이를 통해 산소 함유 나노 버블의 산소 전달 및 세포 생존율과의 관계를 확인하였다(역 저산소증 테스트). 그 결과를 도 7에 나타낸다.
도 7은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 저산소 조건에서의 특성을 설명하기 위한 도면으로, 유방암세포(MDA-MB-231)에 저산소증을 유발한 후 산소 함유 나노 버블의 효과를 나타낸다.
도 7의 (A)는 Image-IT hypoxia Reagent를 이용하여 저산소가 유발된 세포를 형광 염색한 이미지를 나타내고, (B)는 산소 함유 나노 버블을 10%가 되도록 세포에 처리한 후 형광 염색한 이미지를 나타내며, (C)는 산소 함유 나노 버블을 20% 되도록 세포에 처리한 후 형광 염색한 이미지를 나타내고, (D)는 8 시간 동안 저산소증이 유발된 암세포의 현미경 이미지를 나타낸다. (E)는 산소 함유 나노 버블을 10% 되도록 세포에 처리한 후 위상차 현미경 이미지를 나타내고, (F)는 산소 함유 나노 버블을 각각 10%, 20% 되도록 세포에 처리한 후 형광 염색한 이미지를 정량화 한 그래프를 나타내고, (G)는 산소 함유 나노 버블을 각각 10%, 20% 되도록 세포에 처리한 후 세포 독성을 트리판 블루 색소 배제 분석을 통해 정량화한 그래프를 나타낸다.
도 7을 참조하면, 저산소 조건 대비 10% 산소 함유 나노 버블을 주입하였을 때 형광 값은 1/10로 감소하고, 20% 산소 함유 나노 버블을 주입하였을 때는 1/20 이상으로 형광이 감소하는 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 저산소 조건의 세포가 산소 함유 나노 버블에 의해 역 저산소 상태로 변화되었음을 확인할 수 있다. 즉, 저산소 조건의 세포로 산소가 전달되었음을 확인할 수 있다.
또한, 위상차 현미경에서 실제 세포를 확인 한 결과, 산소 함유 나노 버블을 주입한 경우 넣지 않은 경우와 비교하여 생존한 세포의 수가 20% 이상 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 본 발명의 산소 함유 나노 버블이 산소 농도 5% 이하의 저산소증 세포에 산소를 공급하여 저산소증을 극복하고 세포 생존율을 증가시킴을 확인할 수 있다.
(6) 세포 생존력
보다 구체적으로, 본 발명의 산소 함유 나노 버블과 세포 생존력과의 관계를 설명하기 위해, 각기 다른 세포주에 산소나노버블을 처리한 후 세포 생존율 증가를 확인하였다. 간세포; Chang cell, 내피세포; HUVEC, 신장세포; HEK-293T, 쥐의 섬유아세포; NIH-3T3, 햄스터 난소세포. CHO, 유방암세포, MDA-MB-231 및 지방줄기세포; hADSC의 각기 다른 세포주 1 X 106/dish로 배양한 후 본 발명의 산소 함유 나노 버블을 각각 다른 농도로 처리 후 24시간 또는 48시간 동안 세포의 생존율을 CCK-8 실험을 통하여 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8은 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 세포 생존율 증가 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 각각 (A) 인간 간세포; Chang cell (B) 인간 내피세포; HUVEC, (C) 인간 신장세포; HEK-293T, (D) 쥐의 섬유아세포; NIH-3T3, (E) 햄스터 난소세포; CHO, (F) 유방암세포; MDA-MB-231, (G) 인간 지방줄기세포; hADSC에서 산소 함유 나노 버블 처리 후의 세포 생존율을 나타낸다.
도 8을 참조하면, 각각의 세포주, 간세포; Chang cell, 내피세포; HUVEC, 신장세포; HEK-293T, 쥐의 섬유아세포; NIH-3T3, 햄스터 난소세포. CHO, 유방암세포, MDA-MB-231 및 지방줄기세포; hADSC 모두에서 p<0.05 이상의 유의성이 나타내는 것을 확인할 수 있고, 이는 본 발명의 산소 함유 나노 버블에 의해 각각의 세포주에서 모두 세포 생존율이 증가하였음을 나타낸다.
즉, 본 발명의 산소 함유 나노 버블이 다양한 세포에서 세포 생존력을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
(7) 저산소증 유발 단백질
또한, 유방암세포를 이용하여 저산소 유발 단백질 검사를 수행하였다. 구체적으로, 저산소 조건에서 6시간 배양된 세포(MDA-MB-231 ,5 X 105/mL, 8 well slide dish)와 일반 조건에서 배양된 세포에 각각 산소 함유 나노 버블 10 μL을 첨가한 후 4시간 동안 배양기에서 배양하였다. 이어서, (1) 세포를 고정 및 포매한 후, 면역 형광 염색을 실시하여 저산소 유발 단백질(HIF1-alpha)의 항-HIF1-alpha-항체-FITC(anti-HIF1-alpha-antibody-FITC)에 의한 형광 이미지를 확보하였다. 또한, (2) 산소 함유 나노 버블을 첨가하여 배양된 세포를 RIPA 버퍼를 이용하여 단백질 회수 BCA법으로 총 단백질을 정량 한 후 저산소 유발 단백질(HIF1-alpha, Hypoxia ineducable Factor-1 alpha)의 분비량을 면역효소 측정법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)으로 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.
도 9는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 저산소 유발 단백질 억제를 설명하기 위한 도면이다.
도 9의 (A)는 유방암세포를 저산소증과 일반 조건에서 각각 배양하여 유발된 저산소 유발 단백질(HIF1-alpha)를 항-HIF1-alpha-항체-FITC 형광 항체를 이용하여 형광 염색한 이미지이고, (B)는 같은 조건에서 유발된 HI1-alpha 단백질을 ELISA를 이용하여 분석한 그래프이다(DAPI: 핵 염색, 녹색: anti-HIF1-alpha antibody-FITC).
도 9를 참조하면, 산소 함유 나노 버블을 첨가(10 μL/mL)한 후 항-HIF1-alpha-항체-FITC를 이용하여 세포내 HIF1-alpha의 분비량을 확인 한 결과, 30% 이상 HIF1-alpha의 분비량이 감소하였음을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명의 산소 함유 나노 버블이 유방암 세포(MDA-MB-231) 세포에 산소를 공급하여 저산소증 유발 단백질 HIF-1 alpha의 발현을 억제시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
(8) 항암 효과
아울러, 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신에 의한 항암 효과를 확인하였다. 구체적으로, 산소 함유 나노 버블을 독소루비신과 함께 그리고 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체를 유방암세포(MDA-MB-231, 5 X 105/mL, 24 well)에 투여하고, 대조군으로서 무처리와 독소루비신만 10 μg를 세포에 첨가하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다.
도 10은 본 발명의 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신의 효과를 설명하기 위한 도면이다.
도 10의 (A)는 독소루비신 농도에 대한 유방암세포의 사멸 또는 성장 억제 그래프이고, (B)는 산소를 포함하지 않는 단층 인지질막 용액을 이용한 경우의 암세포에 대한 세포 독성 그래프이며, (C)는 독소루비신과 산소 함유 나노 버블(10 μg + 10 μL/mL) 동시 첨가하였을 때 독소루비신에 의한 유방암세포의 사멸 또는 성장억제를 나타내는 그래프이고, (D)는 독소루비신과 산소 함유 나노 버블(10 μg + 5 μL/mL)을 동시 첨가하였을 때 독소루비신에 의한 유방암세포의 사멸 또는 성장 억제 그래프이며, (E)는 독소루비신과 산소 함유 나노 버블(1.3 μg + 5 μL/mL)을 동시 첨가하였을 때와 독소루비신이 산소 함유 나노 버블 코어에 결합된 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체(1.3 μg:10μL/mL) 것을 첨가하였을 때 독소루비신에 의한 유방암세포의 사멸 또는 성장 억제를 나타낸다.
도 10에서 'ONBs'는 산소 함유 나노 버블을 나타내고, 'DOX'는 독소루비신을 나타내며, 'ONBs+DOX'는 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신을 동시 투여한 경우, 'ONBs/DOX'는 독소루비신이 산소 함유 나노 버블에 결합된 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체를 나타낸다.
도 10을 참조하면, 산소 함유 나노 버블과 독소루비신 10 μg/mL을 동시 두여 하였을 때 독소루비신 10 μg/mL만 투여하였을 때 보다 40% 이상의 암세포가 사멸하는 것을 확인할 수 있다. 이것은 산소 나노버블에 의한 암세포의 HIF1-alpha의 분비 억제와 독소루비신의 효과로 암세포가 더 생장을 못하여 사멸함을 나타낸다.
(9) 활성 산소(ROS)
또한, 보다 구체적으로, 독소루비신과 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 작용 기전을 설명하기 위해, 활성 산소(ROS) 발생 실험을 수행하였다.
DCFH-DA 시약을 1:500로 희석하여 각 유방암세포(MDA-MB-231 ,5 X 104/mL, 96 well)에 투여한 후 2시간 동안 반응시킨 다음, 각각 무처리, 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신 혼합물(10 μL + 1.3 μg/mL), 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신이 소수성 결합된 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체(10 μL + 1.3 μg/mL), 독소루비신 1.3 μg/mL 및 산소 함유 나노 버블 10 μL와 대조군으로서 과산화수소(H2O2, 800 μM)를 처리한 후, 다시 2시간 경과 후 480/ 520 nm에서 형광 값을 측정하였다. 그 결과를 도 11에 나타낸다.
도 11은 본 발명의 산소 함유 나노 버블과 독소루비신의 작용메커니즘을 설명하기 위한 도면이다.
도 11의 (A)는 각각 산소 함유 나노 버블 단독, 독소루비신 단독, 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신 혼합물, 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체를 첨가한 유방암세포에서 활성산소 증가량(ROS) 분석 그래프를 나타내고, (B)는 동일 조건에서 24 시간 후 ROS 분석 그래프를 나타낸다.
도 11에서 'B'는 산소 함유 나노 버블을 나타내고, 'DOX'는 독소루비신을 나타내며, 'B+DOX'는 산소 함유 나노 버블 및 독소루비신의 혼합물, 'B/DOX'는 독소루비신이 산소 함유 나노 버블에 결합된 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체를 나타낸다.
도 11을 참조하면, 산소 함유 나노 버블 10 μL 처리 군, 독소루비신 1.3 μg/mL 처리 군, 독소루비신 및 산소 함유 나노 버블의 혼합물(1.3 μg 및 10 μL) 처리 군, 산소 함유 나노 버블 코어에 독소루비신이 소수성 결합된 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체 군(1.3 μg:10 μL)을 각각 동일 조건으로 암세포에 처리 하였을 때, 독소루비신이 산소 함유 나노 버블 코어에 소수성 결합된 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체 군에서 독소루비신 및 산소 함유 나노 버블의 혼합물 군보다 25% 이상 ROS 발생율이 증가함을 확인할 수 있고, 또한, 독소루비신 10 μg 처리 군과 독소루비신이 산소 나노버블 코어에 소수성 결합된 독소루비신-산소 함유 나노 버블 복합체 군(독소루비신의 양: 1.3 μg)의 ROS 발생율이 유사한 정도를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
즉, 본 발명의 산소 함유 나노 버블이 독소루비신과 함께 사용될 때 독소루비신의 효과를 향상시키는 것을 확인할 수 있고, 이때, 독소루비신이 산소 나노 버블 코어에 소수성 결합되는 것이 바람직하며, 이 경우, 독소루비신 및 산소 나노 버블 복합체는 독소루비신 단독 사용 시 보다 7배 이상의 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
(10) 초음파 형광 이미징
본 발명의 산소 함유 나노 버블을 이용하여 펜텀(phantom) 테스트를 실시하였다. 테스트용 라텍스 풍선(가로, 세로, 두께 3cm x 10cm x 1mm)에 대조군으로 물을 넣고 실험군으로 1:10으로 희석된 산소 함유 나노 버블을 첨가한 다음, 5 MHz, 9 MHz 및 12 MHz 의 강도로 초음파 영상을 이미지화하였다. 그 결과를 도 12에 나타낸다.
도 12는 본 발명의 산소 함유 나노 버블의 팬텀 테스트 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 12의 (A)는 공기에 5 MHz의 초음파를 가한 경우, (B)는 순수한 물에 3-5 MHz 초음파를 가한 경우, (C)는 희석된 산소 함유 나노 버블에 3-5 MHz의 초음파를 가한 경우, (D)는 공기에 9 MHz의 초음파를 가한 경우, (E)는 순수한 물에 9 MHz 초음파를 가한 경우, (F)는 희석된 산소 나노 버블에 9 MHz의 초음파를 가한 경우 (G)는 물과 산소 함유 나노 버블에 동시에 9 MHz의 초음파를 가한 경우, (H)는 공기에 12 MHz의 초음파를 가한 경우, (I)는 순수한 물에 12 MHz 초음파를 가한 경우, (J)는 희석된 산소 함유 나노 버블에 12 MHz의 초음파를 가한 경우, (K)는 물과 산소 함유 나노 버블에 동시에 12 MHz의 초음파를 가한 경우의 초음파 영상 이미지를 나타낸다.
도 12를 참조하면, 초음파의 크기가 커질수록 산소 함유 나노 버블 입자의 운동성과 조영의 크기가 증가하는 것을 확인할 수 있고, 이는 본 발명의 산소 함유 나노 버블을 조영제로서 이용 가능함을 의미한다.
따라서, 상기 확인한 바를 소결하면, 본 발명에 따라, 인지질 및 서로 다른 2종의 계면활성제를 포함하는 단층 인지질막 형성 유도제를 이용하여 내부 코어에 산소가 포집된 단층 인지질막으로 형성된 산소 함유 나노 버블을 형성할 수 있고, 이때, 바람직하게는 DSPC:DSPE PEG-2000 아민:DSPE PEG-2000 비오틴을 몰비 85:8:7로 혼합 사용하여 우수한 세포막 침투 및 침착율을 나타내고 평균 크기가 300 ± 50 nm 인 산소 나노 버블을 형성할 수 있다.
본 발명의 산소 함유 나노 버블은 높은 세포 친화성, 적은 세포 독성을 나타내며 저산소 국소 부위에 산소를 전달할 수 있다. 또한, 본 발명의 산소 함유 나노 버블은 세포에 산소를 직접 공급하여 세포의 생존율을 증가 시킬 수 있으며, 또한, 암세포가 생존하기 위하여 발현하는 저산소 유발 단백질(HIF1-alpha)의 분비를 산소 나노버블의 첨가로 저해 시킬 수 있어, 암세포의 생장을 억제할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 산소 함유 나노 버블은 독소루비신과 같은 항암제와의 공동 작용으로 항암효과를 극대화시킬 수 있으며, 특히, 독소루비신이 산소 함유 나노 버블 코어에 결합된 경우 이에 의한 항암 효과가 독소루비신 또는 산소 함유 나노 버블과 독소루비신을 혼합한 경우 보다 25% 이상의 항암 효과를 나타내며 독소루비신의 양을 1/7로 줄여도 같은 항암효과를 나타낼 수 있어 가장 바람직함을 확인할 수 있다. 즉, 적은 양으로도 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
이에, 본 발명의 산소 함유 나노 버블은 목적 국소부위를 직접 타겟팅 하거나 정맥주사요법(IV) 등을 이용하여 간접적으로 타겟팅하여 목적 부위에 국소적인 저산소증 치료 및 산소 전달이 가능한 세포 생장의 보조재로서 사용될 수 있고, 나아가, 산소 함유 나노 버블의 표면 개질에 따라 약물 또는 DNA, RNA, 단백질 등을 결합시켜 약물 전달체로 사용할 수도 있다.
아울러, 고주파 초음파로 본 발명의 산소 함유 나노 버블을 이미지화할 수 있음을 확인할 수 있어 초음파용 조영제로서 이용 가능함을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (11)
- 80:20 초과 90:10 미만의 몰비(molar ratio)로 혼합된 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제를 포함하되 상기 단층 인지질막 형성 유도제가 서로 다른 2종의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 용액을 초음파 처리하여, 단층의 인지질로 형성된 단층 인지질막 마이크로 구조체를 형성하는 단계; 및
단층 인지질막 마이크로 구조체를 포함하는 용액에 산소 가스를 주입하면서 상기 용액을 초음파 분해하여, 나노 크기이고 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하는 나노 버블을 형성하는 단계를 포함하는,
나노 버블의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디라우로일포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디펜타데카노일포스파티딜콜린(DPDPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린(MPPC), 콜레스테롤, 지방산, 지방 알코올(fatty alcohols) 및 지방 에스테르(fatty esters) 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는,
나노 버블의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단층 인지질막 형성 유도제는 DSPE-PEG-2000 아민, DSPE-PEG-비오틴, DSPE-MPEG-1000, DSPE-MPEG-2000 및 DSPE-MPEG-5000 중 2종을 포함하는 것을 특징으로 하는,
나노 버블의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 인지질 및 단층 인지질막 형성 유도제의 몰비는 85:15이고,
상기 단층 인지질막 형성 유도제는 서로 다른 2종의 계면활성제를 8:7의 몰비로 포함하는 것을 특징으로 하는,
나노 버블의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 나노 버블을 형성하는 단계에서,
250 nm 내지 350 nm의 직경을 갖는 나노 버블이 형성되는 것을 특징으로 하는,
나노 버블의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 나노 버블을 형성하는 단계에서,
3 mV 이하의 막 전위를 갖는 나노 버블이 형성되는 것을 특징으로 하는,
나노 버블의 제조 방법.
- 나노 크기이고 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체; 및
상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하고,
250 nm 내지 350 nm의 직경 크기를 갖는 것을 특징으로 하는,
나노 버블.
- 제7항에 있어서,
상기 나노 버블은 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 외부 환경 대비 고농도의 산소 가스를 포함하는 것을 특징으로 하는,
나노 버블.
- 제7항에 있어서,
상기 나노 버블은 세포에 산소 가스를 전달 가능한 산소 전달체인 것을 특징으로 하는,
나노 버블.
- 제7항에 있어서,
상기 나노 버블은 세포에서 저산소 유발 단백질(HIF-1-alpha)을 억제하는 것을 특징으로 하는,
나노 버블.
- 나노 크기이고 중공을 갖는 구형의 단층 인지질막 나노 구조체 및 상기 단층 인지질막 나노 구조체의 중공에 수용된 산소 가스를 포함하고, 250 nm 내지 350 nm의 직경 크기를 갖는 것을 특징으로 하는, 나노 버블; 및
상기 나노 버블의 단층 인지질막 나노 구조체에 결합된 약물을 포함하는,
약물 전달체.
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