KR20190114316A

KR20190114316A - 녹차추출물을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법

Info

Publication number: KR20190114316A
Application number: KR1020180036834A
Authority: KR
Inventors: 류기현; 송은경; 이혜민
Original assignee: 서울여자대학교 산학협력단
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2019-10-10
Also published as: KR102080889B1

Abstract

본 발명은 녹차추출물을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 식물바이러스 불활성화 효과뿐만 아니나, 보호 효과도 있어 식물바이러스를 친환경적으로 방제 또는 예방할 수 있는, 녹차추출물을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법에 관한 것이다.

Description

녹차추출물을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물바이러스 방제 방법{Composition for controlling plant viruses comprising green tee extract, and method for controlling plant viruses using the same}

식물바이러스는 식물 세포를 감염시키는 바이러스를 총칭한다. 식물바이러스는 완전한 생명체 단위의 균류와 달리 비세포로 구성되어 있고, 효소가 없어 스스로 물질대사를 못하는 등의 비생물적 특징을 지닌다. 특히, 식물바이러스는 숙주의 세포(host cell)를 이용하여 복제하기 때문에 다양한 식물 개체에게 피해를 입히며, 숙주 개체와 세포 과정(cellular process)을 공유하기 때문에 식물바이러스의 기능만을 저해하는데 어려움이 따른다(Yanmei Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104:8083-8088, 2007). 그렇기 때문에 식물바이러스는 1890년대에 그 존재가 처음 밝혀졌음에도 불구하고, 현재까지도 발병된 식물을 포장에서 제거하거나 매개충을 방제하는 등의 물리적 또는 간접적 방제 방법이 널리 쓰이고 있을 뿐, 식물바이러스병에 대한 항바이러스제의 개발 수준은 미비한 수준이다.

식물바이러스는 전 세계적으로 1,181종 (2012년 기준)으로 주요 농작물과 원예작물의 생산량 및 품질저하와 품종퇴화 등 농업생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있으며, 식물바이러스병으로 인한 농작물의 수확량 감소는 세계적으로 연간 60억 달러 이상으로 농업생산량에 막대한 피해를 초래하고 있다 (Song et al., 2010).

특히, 고추, 오이, 참외, 수박, 애호박, 마늘, 딸기, 백합, 난 등 농업생산소득이 높은 작목에 피해가 심하지만, 아직까지 실용적인 방제제를 개발하지 못하고 있는 실정이다. 따라서 작물에 큰 피해를 주는 바이러스만을 효과적인 방제할 수 있는 항바이러스물질의 개발이 매우 필요하다.

최근에는 담배모자이크바이러스(tobacco mosaic virus, TMV)에 대한 항바이러스 활성을 지닌 식물유래 대사물질에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 현재까지 소태나무(Picrasma quassioides) 유래 알칼로이드(alkaloid) 계열, 아담자(Brucea javanica) 유래 콰씨노이드(quassinoid) 계열, 금사슬나무(Cassia fistula) 유래 플라보노이드(flavonoid) 계열, 철도목(Cassia siamea) 유래 크로몬(chromone) 계열 등의 활성이 보고되었다 (Jia Chen et al., J. Agric, Food Chem. 57:6590-9595, 2009; Xiao-Hui Yan et al., J. Agric, Food Chem. 58:1572-1577, 2010; Wei Zhao et al., Phytochem. Lett. 179-182, 2013; Qiu-Fen Hu et al., J. Nat. Prod. 75:1909-1914, 2012). 하지만 상기 물질들은 부분 병반(local lesion)만을 보이는 담배모자이크바이러스를 대상으로 항바이러스 활성을 확인한 것에 불과해 그 적용에는 한계가 있다.

본 발명의 배경기술로는 대한민국 특허 제10-1680183호가 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 녹차추출물을 이용하여 바이러스에 감염된 식물에서 저항성 효과를 검정하였고, 녹차추출물이 식물바이러스 불활성화 효과뿐만 아니나, 보호 효과도 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물을 이용한 식물바이러스의 방제 방법을 제공하는 것이다.

발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

일 측면에 따르면, 녹차추출물을 유효성분으로 포함하는, 식물바이러스 방제용 조성물이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 식물바이러스는 담배모자이크바이러스(TMV), 고추모틀바이러스(PepMoV), 오이모자이크바이러스(CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스Y(PVY), 순무모자이크바이러스(TuMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 쥬키니녹반모자이크바이러스(ZGMMV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV), 잠두위축바이러스(BBWV), 토마토윤점바이러스(TomRSV), 담배윤점바이러스(TRSV), 토마토황화괴저바이러스(TSWV), 딸기바이러스(SMoV) 또는 선인장X바이러스(CVX)일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 식물바이러스는 담배모자이크바이러스(TMV) 또는 고추모틀바이러스(PepMoV)일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 녹차추출물은 녹차잎에 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나의 추출용매를 가하여 추출한 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 항바이러스 활성을 갖는 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 식물바이러스 방제용 조성물은 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제 또는 도포제의 형태일 수 있다.

다른 측면에 따르면, 상기 식물바이러스 방제용 조성물을 포함하는, 식물바이러스 방제 활성을 갖는 농약 조성물이 제공된다.

또 다른 측면에 따르면, 상기 식물바이러스 방제용 조성물을 포함하는, 식물바이러스 방제 활성을 갖는 비료 첨가용 조성물이 제공된다.

또 다른 측면에 따르면, 상기 식물바이러스 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계;를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 처리하는 단계는 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지처리, 또는 농기구 처리를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 녹차추출물은 식물바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지고 있어 식물바이러스 방제에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 식물바이러스 방제용 조성물은 식물바이러스 불활성화 효과뿐만 아니나, 보호 효과도 있어 식물바이러스를 효과적으로 예방할 수 있다.

본 발명은 녹차추출물이라는 천연물을 기반으로 한 것으로 유효성분의 대량생산이 용이하며, 식물체에 피해를 주지 않는 안전한 물질을 이용한 환경 친화적인 식물바이러스 방제제의 개발 및 고부가가치의 농작물 생산 등, 농업 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편(leaf disc)에서 GFP 발현양상을 보여주는 사진이다. 1: 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편, 2: 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편, 3: 녹차추출물이 처리되지 않은 PepMoV-Vb1/GFP 감염된 고추의 잎 절편, 4: 건전 고추 잎 절편.
도 2는 녹차추출물을 처리한 바이러스 감염 잎 절편(leaf disc)에서 RT-PCR과 웨스턴 블럿(western blot) 검정결과를 보여주는 사진이다. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편, 2: 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편, 3: 녹차추출물이 처리되지 않은 PepMoV-Vb1/GFP 감염된 고추의 잎 절편, 4: 건전 고추 잎 절편.
도 3은 고추에서 녹차추출물에 의한 불활성화 효과를 검정한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 고추에서 녹차추출물에 의한 불활성화 효과 검정을 위한 RT-PCR과 웨스턴 블럿(western blot) 분석 결과를 보여주는 사진이다. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (5 dpi), 2: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (7dpi), 3: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (9dpi), 4: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (11 dpi), 5: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (13 dpi), 6: PepMoV-Vb1/GFP만 접종된 고추의 상엽 (positive control), 7: S.D.W.(sterile distilled water)만 접종된 고추의 상엽 (negative control).
도 5는 고추에서 녹차추출물에 의한 보호 효과를 검정한 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 고추에서 녹차추출물에 의한 보호 효과 검정을 위한 RT-PCR과 웨스턴 블럿(western blot) 분석 결과를 보여주는 사진이다. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (5 dpi), 2: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (7dpi), 3: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (9dpi), 4: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (11 dpi), 5: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (13 dpi), 6: PepMoV-Vb1/GFP만 접종된 고추의 상엽 (positive control), 7: S.D.W.만 접종된 고추의 상엽 (negative control).

본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 뿐만 아니라, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함할 것이다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학, 그리고 혼성화와 관련되어 사용되는 명명법과 이와 관련된 기술들은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 것이며, 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 사용되고 있는 것이다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 녹차추출물을 포함하는 식물바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 녹차추출물은 식물바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지고 있다. 녹차추출물은 식물바이러스 불활성화 효과뿐만 아니나, 보호 효과도 있어어, 식물바이러스에 의해 발생하는 식물바이러스병의 예방 또는 치료를 위한 방제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 식물바이러스는 담배모자이크바이러스(TMV), 고추모틀바이러스(PepMoV), 오이모자이크바이러스(CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스Y(PVY), 순무모자이크바이러스(TuMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 쥬키니녹반모자이크바이러스(ZGMMV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV), 잠두위축바이러스(BBWV), 토마토윤점바이러스(TomRSV), 담배윤점바이러스(TRSV), 토마토황화괴저바이러스(TSWV), 딸기바이러스(SMoV) 또는 선인장X바이러스(CVX)를 포함하며, 바람직하게는 담배모자이크바이러스(TMV) 또는 고추모틀바이러스(PepMoV)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 녹차추출물은 녹차잎에 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나의 추출용매를 가하여 추출한 것일 수 있고, 에탄올이 적합할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등)이 적합하고, 에탄올이 더 적합할 수 있다. 본 발명의 추출물은 조추출물뿐만 아니라 분획물도 포함한다.

본 발명의 식물바이러스 방제용 조성물은 유효성분인 녹차추출물 이외에 당업계에 공지된 항바이러스 활성을 갖는 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.

본 발명의 식물바이러스 방제용 조성물은 농약분야에 공지된 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제형화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제 또는 도포제의 형태로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식물바이러스 방제용 조성물은 제형화를 위해 다양한 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 액체 담체, 고체 담체, 계면활성제 또는 보조제 등이 포함될 수 있다.

상기 액체 담체로는 물(water), 식물유(vegetable oil), 에탄올(ethanol) 등이 사용될 수 있으며, 상기 식물유에는 대두유, 유채씨기름, 야자유, 팜핵유, 미강유, 옥수수유, 팜유, 올리브유 등이 포함되고, 이에 제한되지 않는다.

상기 고체 담체로는 광물 분말, 젤라틴, 알긴산 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 광물 분말로는 양이온 점토(cation clay), 벤토나이트(bentonite), 카올린(kaolin), 탈크(Talc), 규조토(diatomaceous earth) 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 계면활성제로는 에틸렌옥사이드(Ethyleneoxide)계, 다이에탄올아민(Diethanolamine)계, 솔비톨(Sorbitol)계, 글리세린(Glycerine)계 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 보조제로는 증량제, 부동액, 용제, 증점제, 및 전착제 등이 1종 이상 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

이에 한정되는 것은 아니나, 상기 녹차추출물은 식물바이러스 방제용 조성물 전체 중량에 대하여 10 ~ 90 중량부로 포함될 수 있다. 상기 녹차추출물이 식물바이러스 방제용 조성물 전체 중량에 대하여 10 중량부 미만이면, 녹차추출물에 의한 식물바이러스 방제 효과가 미미할 수 있다. 또한, 상기 녹차추출물이 식물바이러스 방제용 조성물 전체 중량에 대하여 90 중량부 초과이면 투여 녹차추출물의 함량에 비해 항바이러스 활성의 증가 효과가 크지 않을 수 있다.

본 발명의 식물바이러스 방제용 조성물에 포함되는 녹차추출물의 농도는 식물체의 생육정도, 경작지 환경, 식물바이러스병의 발병 정도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 조절할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 식물바이러스 방제 활성을 갖는 농약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 식물바이러스 방제 활성을 갖는 비료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 녹차추출물은 식물바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지고 있어, 식물바이러스에 의해 발생하는 질병의 예방, 치료 또는 개선을 위한 농약, 비료 등에 첨가될 수 있다.

본 발명의 농약 조성물 또는 비료 첨가용 조성물에는 유효성분인 녹차추출물 이외에 당업계에 공지된 일반적인 성분(예를 들어, 용매, 담체, 유화제, 분산제, 보조제 등)이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계;를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법을 제공한다.

상기 처리 방법에는 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지처리 또는 농기구소독에 적용하는 처리 방법 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

녹차추출물의 항바이러스 효과를 확인하기 위해, 먼저 본 발명자들에 의해 국내 특허등록(제10-1372363호)된‘항바이러스제 스크리닝 방법’과 Ryu et al. (2017)에서 사용된 방법을 이용하여 녹차추출물에 대한 항바이러스 효과를 검정하였다. 또한, 바이러스 전신감염 기주에서의 효과를 확인하기 위해 고추작물로 바이러스에 대한 불활성화 효과 (inactivation effect)와 보호효과 (protective effect)를 검정하였다.

녹차추출물

5 g 건조된 녹차잎을 15 ml 70% 에탄올 (Duksan, 대한민국)에 넣고 3일 동안 반응시킨 후, 그 처리된 액체를 동결건조시켰다. 동결건조시킨 물질을 1 ml S.D.W. (sterile distilled water)에 녹인 후, 항바이러스 효과 검증에 사용하였다.

바이러스

본 발명자들에 의해 특허등록 (제10-1103705)된 PepMoV-Vb1/GFP를 사용하였다.

항바이러스제 스크리닝 방법

국내특허등록(제10-1372363호)된 방법에 따라 24-웰 배양 플레이트 (SPL, 대한민국)의 각 웰에 950 ul 1/2 MS 액체배지에 50 ul 녹차추출물을 넣고, 7일까지 PepMoV-Vb1/GFP 감염된 잎 절편에서 GFP 발현 유무를 UV 아래에서 관찰하였다. 또한, 녹차추출물 처리한 7일 후의 PepMoV-Vb1/GFP 감염된 잎 절편에서 총 RNA와 총 단백질을 분리하여 PepMoV-CP 프라이머를 사용한 RT-PCR과 PepMoV-CP 항체를 사용한 웨스턴 블럿(western blot) 분석하여 항바이러스 효과를 검증하였다.

불활성화 효과 (inactivation effect)

1.5 ml tube에 100 ul 녹차추출물과 10 ng PepMoV-Vb1/GFP를 30분 동안 반응시킨 후, 카보런덤(carborundum, Fisher Scientfic, 미국)이 처리된 고춧잎 두 장에 기계식 접종한 후, 25℃가 유지되는 온실에 14일 동안 병징과 UV 아래에서 GFP 발현을 관찰하였다. 또한, 접종한 고추의 상엽에서 총 RNA와 총 단백질을 분리하여 PepMoV-CP 프라이머를 사용한 RT-PCR과 PepMoV-CP 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석하여 항바이러스 효과를 검증하였다.

보호효과 (protective effect)

1.5 ml tube에 100 ul 녹차추출물과 1 ul Tween20 (Sigma-Aldrich, 미국)을 혼합하여 고춧잎 두 장에 처리한 후, 1시간 뒤에 PepMoV-Vb1/GFP 10ng을 접종하였고, 25℃가 유지되는 온실에 14일 동안 병징과 UV 아래에서 GFP 발현을 관찰하였다. 또한, 접종한 고추의 상엽에서 총 RNA와 총 단백질을 분리하여 PepMoV-CP 프라이머를 사용한 RT-PCR과 PepMoV-CP 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석하여 항바이러스 효과를 검증하였다.

RNA 분리

식물의 잎에서 총 RNA를 추출하였다. 잎 절편 (leaf disc) 및 잎 조직을 1.5 ㎖ 튜브의 추출 용액(50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.1% SDS 및 0.1% 2-머캅토에탄올)에 넣어 균질화 하였다. 반응 혼합물을 페놀:클로로포름:이소아밀아코올(PCI, 25:24:1, v/v/v)로 2번 추출하였다. 총 RNA를 3배 부피의 완전 에탄올을 처리하여 침전시키고 -80℃에서 30분 동안 보관하였다. 원심분리 후, 침전된 총 RNA를 70% 에탄올로 세척하고 진공 원심분리기(Tomy, 미국)로 건조하였다. RNA 추출의 결과물을 RNase-프리 증류수에 용해하였다.

단백질 분리

식물의 잎에서 총 단백질을 추출하였다. 잎 절편 (leaf disc) 및 잎 조직을 1.5 ㎖ 튜브의 추출 용액(50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.1% SDS 및 0.1% 2-머캅토에탄올)에 넣어 균질화 하였다. 반응 혼합물을 페놀:클로로포름:이소아밀아코올(PCI, 25:24:1, v/v/v)로 처리하여 중간층의 단백질 부분을 분리하였고, 100% 아세톤 (Duksan, 대한민국) 1ml을 넣고 -20℃에서 30분 동안 보관하였다. 원심분리 후, 침전된 총 진공 원심분리기(Tomy, 미국)로 건조하였다. 단백질 추출의 결과물을 100 ul 2×loading buffer (100mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol, 200mM 2-mercaptoethanol)에 넣고 80℃에서 15분간 반응시켰다.

RT- PCR

식물의 잎에서 분리한 총 RNA를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT 반응은 42℃에서 60분 동안 800ng 총 RNA, 50mM KCl, 4mM MgCl2, 10mM DTT, 2.5mM 각 dNTP 혼합물, 0.5㎕ random hexamer (Qiagen, Germany) 및 20 유닛 RevertAid reverse transcriptase (Thermo scientific, 미국)을 포함하는 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.3)에서 My Cycler^TM Thermal Cycler(Bio-rad, 미국)로 실시하였다.

합성 cDNA, PCR 버퍼(10mM Tris-HCl(pH 8.3), 1.5mM MgCl₂ 및 50mM KCl), 10pMol 프라이머 쌍(정방향 프라이머 및 역방향 프라이머) 및 2.5mM 각 dNTP 혼합물을 포함하는 50㎕에 1 유닛 재조합 Taq DNA 폴리머라아제(Takara, 일본)를 사용하여 cDNA를 증폭하였다. cDNA를 MyCycler^TM Thermal Cycler(Bio-Rad, 미국)을 사용하여 30 사이클 증폭하였다. 변성은 95℃로 30초 동안 실시하였고 프라이머 어닐링은 58℃에서 30초 동안 실시하였으며, DNA 신장은 72℃에서 1분 동안 실시하였다. 30 사이클이 종료되고 10분 동안 72℃에서 연장하였다. RT-PCR 산물을 1.0% 아가로즈 젤 전기영동 및 이티디움 브로마이드(Ethidium bromide; EtBr) 젤 염색을 통해 확인하였다.

PepMoV-Vb1/GFP를 확인하기 위한 프라이머를 [표 1]에 나타내었다.

프라이머	서열	크기 (bp)
PepMoV -CP UP	ATG GCA ATT AAC GTT ATT	822 bp
PepMoV -CP DN	ATA CTG TTC CAT ATG AAG	822 bp

웨스턴 블럿 (Western blot)

식물의 잎에서 분리한 총 단백질을 사용하여 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하였다. 총 단백질을 SDS-polyacrylamide gel (12% (w/v) polyacrylamide separate gel and 5% (w/v) polyacrylamide stacking gel)에 로딩한 후, 110V로 90분간 전기 영동하였다.

총 단백질이 전기 영동된 polyacrylamide gel를 nitrocellulose (NC) membrane (Osmonics, 미국), 6장의 3 MM 종이 (Whatman, 미국)와 함께 Protein Electrophoresis System (Bio-Rad, 미국)을 사용하여 1×buffer (2.9 g glycine, 5. Tris-base, 0.37 g SDS, 200 ml methanol per liter) 안에서 총 단백질이 NC membrane으로 이동되게 하였다.

그 NC membrane을 1×buffer (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 용해된 5% skim milk에 1시간 동안 반응시킨 후, 1×buffer로 5분씩 세 번 세척하였다. PepMoV-CP 항체 (식물바이러스은행, 대한민국)가 1/1000로 희석된 1×buffer에 1시간 동안 반응시킨 후, 1×buffer로 5분씩 세 번 세척하였다. Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secodary antibody (Promega, 미국)가 1/7500로 희석된 1×buffer에 40분 동안 반응시킨 후, 1×buffer로 5분씩 세 번 세척하였다. AP-substrate buffer (0.1 M Tris (pH 9.5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2)로 1분 반응시킨 후, 항체-항원 반응의 발색을 위해 1 ml Western Blue Stabilized Substrate Solution (Promega, 미국) 처리하여 확인하였다.

[결과]

1. 항바이러스제 스크리닝 방법에서의 녹차추출물의 항바이러스 효과

도 1은 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편(leaf disc)에서 GFP 발현양상을 보여주는 사진이다. 1: 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편, 2: 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편, 3: 녹차추출물이 처리되지 않은 PepMoV-Vb1/GFP 감염된 고추의 잎 절편, 4: 건전 고추 잎 절편.

도 1에 나타난 바와 같이, 녹차추출물을 처리한 바이러스 감염 잎 절편은 3일부터 잎 절편의 외각에서 GFP 발현이 붉은색으로 조금씩 변하는 것을 UV 아래에서 관찰할 수 있었고, 7일에는 대부분의 바이러스 감염 잎 절편들의 GFP 발현이 모두 붉은색으로 변한 것을 UV 아래에서 관찰할 수 있었다.

도 2는 녹차추출물을 처리한 바이러스 감염 잎 절편(leaf disc)에서 RT-PCR과 웨스턴 블럿(western blot) 검정결과를 보여주는 사진이다. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편, 2: 녹차추출물 처리한 바이러스 감염 잎 절편, 3: 녹차추출물이 처리되지 않은 PepMoV-Vb1/GFP 감염된 고추의 잎 절편, 4: 건전 고추 잎 절편.

도 2에 나타난 바와 같이, 녹차추출물 처리된 바이러스 감염 잎 절편들로부터 분리된 총 RNA에서 PepMoV의 CP 부위가 RT-PCR로 검정되지 않았다. 그러나 녹차추출물 처리된 바이러스 감염 잎 절편들로부터 분리된 총 단백질에서는 PepMoV CP 항체가 반응한 것을 웨스턴 블럿으로 검정되었다 (도 2).

2. 불활성화 효과 (inactivation effect)

도 3은 고추에서 녹차추출물에 의한 불활성화 효과를 검정한 결과를 보여주는 사진이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP를 함께 30분 동안 반응시킨 후, 고추에 접종하여 13일까지 바이러스 감염을 관찰하였다. 그 결과, UV 아래서 녹차추출물과 함께 반응한 PepMoV-Vb1/GFP는 접종 후, 13일까지 GFP 발현이 관찰되지 않았다. 양성대조군으로 사용된 PepMoV-Vb1/GFP만 접종된 고추에서는 접종 7일 후부터 GFP 발현이 관찰되었고, 음성대조군으로 사용된 S.D.W.만 접종된 고추에서는 GFP 발현이 관찰되지 않았다.

도 4는 고추에서 녹차추출물에 의한 불활성화 효과 검정을 위한 RT-PCR과 웨스턴 블럿(western blot) 분석 결과를 보여주는 사진이다. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (5 dpi), 2: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (7dpi), 3: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (9dpi), 4: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (11 dpi), 5: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (13 dpi), 6: PepMoV-Vb1/GFP만 접종된 고추의 상엽 (positive control), 7: S.D.W.(sterile distilled water)만 접종된 고추의 상엽 (negative control).

도 4에 나타난 바와 같이, 녹차추출물과 함께 반응한 PepMoV-Vb1/GFP 접종 고추의 상엽에서 분리된 총 RNA와 총 단백질들은 각각 RT-PCR과 웨스턴 블럿 분석으로 PepMoV-Vb1/GFP가 모두 검정되지 않았다.

따라서 녹차추출물은 PepMoV-Vb1/GFP에 대하여 불활성화 효과를 나타내는 것으로 분석된다.

3. 보호효과 (protective effect)

도 5는 고추에서 녹차추출물에 의한 보호 효과를 검정한 결과를 보여주는 사진이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 녹차추출물을 고추잎에 처리한 후, PepMoV-Vb1/GFP를 처리된 고추에 접종하여 13일까지 바이러스 감염을 관찰하였다. 그 결과, UV 아래서 녹차추출물을 처리한 고추에서는 13일까지 PepMoV-Vb1/GFP의 GFP 발현이 관찰되지 않았다. 양성대조군으로 사용된 buffer만 처리한 후, PepMoV-Vb1/GFP를 접종한 고추에서는 접종 7일 후부터 상엽에서 GFP 발현이 관찰되었고, 음성대조군으로 사용된 S.D.W.만 처리한 고추에서는 GFP 발현이 관찰되지 않았다.

도 6은 고추에서 녹차추출물에 의한 보호 효과 검정을 위한 RT-PCR과 웨스턴 블럿(western blot) 분석 결과를 보여주는 사진이다. M: Markers (1kb+ DNA ladder and PageRuler Plus Pre-Strained Protein ladder), 1: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (5 dpi), 2: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (7dpi), 3: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (9dpi), 4: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (11 dpi), 5: 녹차추출물과 PepMoV-Vb1/GFP 함께 접종한 고추의 상엽 (13 dpi), 6: PepMoV-Vb1/GFP만 접종된 고추의 상엽 (positive control), 7: S.D.W.만 접종된 고추의 상엽 (negative control).

도 6에 나타난 바와 같이, 녹차추출물을 처리한 후, PepMoV-Vb1/GFP를 접종한 고추의 상엽에서 분리된 총 RNA와 총 단백질들은 각각 RT-PCR과 웨스턴 블럿 분석으로 PepMoV-Vb1/GFP가 모두 검정되지 않았다.

따라서 녹차추출물은 PepMoV-Vb1/GFP에 대하여 보호 효과를 나타내는 것으로 분석된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

녹차추출물을 유효성분으로 포함하는, 식물바이러스 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 식물바이러스는 담배모자이크바이러스(TMV), 고추모틀바이러스(PepMoV), 오이모자이크바이러스(CMV), 고추마일드모틀바이러스(PMMoV), 쥬키니황반모자이크바이러스(ZYMV), 수박모자이크바이러스(WMV), 호박모자이크바이러스(WMV2), 감자바이러스Y(PVY), 순무모자이크바이러스(TuMV), 메론괴저반점바이러스(MNSV), 오이녹반모자이크바이러스(CGMMV), 쥬키니녹반모자이크바이러스(ZGMMV), 감자엽권바이러스(PLRV), 나리모자이크바이러스(LMoV), 나리무병징바이러스(LSV), 오돈토그로솜링스포트바이러스(ORSV), 심비디움모자이크바이러스(CyMV), 잠두위축바이러스(BBWV), 토마토윤점바이러스(TomRSV), 담배윤점바이러스(TRSV), 토마토황화괴저바이러스(TSWV), 딸기바이러스(SMoV) 또는 선인장X바이러스(CVX)인, 식물바이러스 방제용 조성물.
제2항에 있어서, 식물바이러스는 담배모자이크바이러스(TMV) 또는 고추모틀바이러스(PepMoV)인, 식물바이러스 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 녹차추출물은 녹차잎에 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나의 추출용매를 가하여 추출한 것인, 식물바이러스 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 항바이러스 활성을 갖는 물질을 1종 이상 더 포함하는, 식물바이러스 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제 또는 도포제의 형태인, 식물바이러스 방제용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 식물바이러스 방제용 조성물을 포함하는, 식물바이러스 방제 활성을 갖는 농약 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 식물바이러스 방제용 조성물을 포함하는, 식물바이러스 방제 활성을 갖는 비료 첨가용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 식물바이러스 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계;를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법.
제9항에 있어서, 상기 처리하는 단계는 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지처리, 또는 농기구 처리를 포함하는, 식물바이러스의 방제 방법.