KR20190112978A - Use of CRY1 for Treating or Diagnosing NANOG-mediated Diseases - Google Patents

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KR20190112978A
KR20190112978A KR1020180035037A KR20180035037A KR20190112978A KR 20190112978 A KR20190112978 A KR 20190112978A KR 1020180035037 A KR1020180035037 A KR 1020180035037A KR 20180035037 A KR20180035037 A KR 20180035037A KR 20190112978 A KR20190112978 A KR 20190112978A
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김태우
우선랑
송권호
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to the use of CRY1 for treating or diagnosing NANOG-mediated diseases. More specifically, the present invention relates to the use of CRY1 for treating and diagnosing anti-cancer immune resistant cancer with increased NANOG expression. A composition for treating NANOG dependent resistant cancer using a novel NANOG/CRY1 immunoresistant molecular axis as a pathological marker, the resistant cancer diagnosing kit or an information providing method for diagnosis according to the present invention is very useful for more precisely and quickly diagnosing and treating cancer that is resistant to chemotherapy, such as chemotherapy or immunotherapy and cancer that is relapsed or metastasized after chemotherapy.

Description

NANOG 매개 질환의 치료 또는 진단을 위한 CRY1의 용도 {Use of CRY1 for Treating or Diagnosing NANOG-mediated Diseases}Use of CRY1 for Treating or Diagnosing NANOG-mediated Diseases}

본 발명은 NANOG 매개 질환의 치료 또는 진단을 위한 CRY1 (cryptochrome 1)의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NANOG 발현이 증가되어 있는 항암면역 내성암의 치료 및 진단을 위한 CRY1의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of CRY1 (cryptochrome 1) for the treatment or diagnosis of NANOG-mediated disease, and more particularly to the use of CRY1 for the treatment and diagnosis of anti-cancer immune resistant cancer with increased NANOG expression.

암의 치료를 위해서는 외과적 수술, 방사선 치료법, 항암제 치료법 및 면역 치료법 등이 있으나, 이러한 많은 치료법에도 불구하고 임상적 치료효능이 낮은 이유는 재발암의 발생 때문이다. 임상적 난제인 재발암의 주요 원인은 암이 가지고 있는 고유 내성뿐만 아니라 다양한 항암치료 후에 발생하는 획득내성에 기인한 치료내성으로 더욱 악성화된 특성을 가진 암세포들이 성장하기 때문이다. 따라서 효과적인 암 치료를 위해서는 암이 가지고 있는 고유 내성뿐만 아니라 다양한 항암 치료법에 의해 획득되어지는 내성 극복에 대한 연구가 반드시 필요하다. 내성 극복에 대한 연구는 내성 관련 유전자 또는 분자축의 규명 및 규명된 유전자 또는 분자축을 이용하여 진단 및 표적화하는 암치료법이 연구되어야 한다.Surgical surgery, radiation therapy, anticancer therapy, and immunotherapy for the treatment of cancer include, but despite the many treatments, the clinical efficacy is low because of recurrence of cancer. The main cause of recurrence, a clinical challenge, is the growth of cancer cells with more malignant characteristics due to the inherent resistance of the cancer as well as the treatment resistance due to acquisition tolerance that occurs after various chemotherapy. Therefore, for effective cancer treatment, research on overcoming resistance obtained by various chemotherapy as well as inherent resistance of cancer is essential. In the study of overcoming resistance, cancer treatments should be studied to identify resistance-related genes or molecular axes and diagnose and target using identified genes or molecular axes.

CRY1 (cryptochrome 1)은 현재 일주기 생체리듬을 조절하는 주요인자로 알려져 있다. 2000년대 후반, 일주기 생체리듬의 교란이 종양 발생의 위험성과 연결될 수 있음이 다양한 역학연구와 유전학적 연구를 통해 규명되었다. 암 발생률을 검토한 역학연구의 분석에 따르면 국제선 승무원, 교대제 근무자에서 유방암 및 전립선암이 약 40-70%까지 증가한다고 보고되어 있고 (Erren TC et al. Naturwissenschaften . 95(5):367-82, 2008), 이에 2007년 세계보건 기구 (WHO)의 부속조직인 국제 암연구기관 (IARC)에서 교대제 업무 (shift-work)를 발암작용의 가능성이 있다고 분류하여 발표하였고, 뿐만 아니라 장기간의 추적연구를 통해 암 환자들 중에서 낮과 밤의 생활주기가 일정한 환자가 그렇지 않은 환자보다 5년간 생존율이 높다고 보고되어 있다 (Straif K et al., Lancet Oncol . 8(12):1065-6, 2007). CRY1 (cryptochrome 1) is currently known to be a major factor in regulating circadian rhythms. In the late 2000s, various epidemiological and genetic studies have identified that disturbances of circadian biorhythms can be linked to the risk of tumor development. Analysis of epidemiological studies examining cancer incidences has reported an increase in breast cancer and prostate cancer by approximately 40-70% in international flight attendants and shift workers ( Erren TC et al. Naturwissenschaften . 95 (5): 367-82, 2008 ), and in 2007, the International Cancer Research Institute (IARC), a subsidiary of the World Health Organization (WHO), classified shift-work as potentially carcinogenic. In addition, long-term follow-up studies have shown that among cancer patients, patients with a constant day and night life cycle have a 5 year higher survival rate than those without ( Straif K et al., Lancet Oncol . 1065-6, 2007 ).

또한, 생쥐에서 중추생체시계인 SCN (suprachiasmatic nucleus)을 제거하면 행동리듬과 체온의 일정한 주기가 교란될 뿐만 아니라 골육종암과 췌장암 세포의 성장도 빨라진다고 알려져 있다 (Filipski E et al., J Natl Cancer Inst . 94(9):690-7, 2002). 역학연구에 이어 의학 및 분자생물학에서도 많은 연구가 진행되었고, 다양한 암세포주에서 일주기적 생체리듬이 파괴되어있다는 사실은 많은 연구자들에 의해 확인되었다 (Savvidis C et al. Mol Med . 18:1249-60, 2012). 지속적으로 분자 네트워크 상에서 생체시계 핵심 유전자인 BMAL1, CLOCK, period 계열 및 crytochrome 계열의 시계유전자들이 암 발생 및 항암제 민감성 등과 밀접한 관련이 있다는 증거들이 잇따라 보고되고 있는 것은 암세포에서 생체시계의 이상이 있음을 강력히 시사하고 있다. In addition, the removal of the central biological clock, SCN (suprachiasmatic nucleus), has been shown to disrupt the rhythm of behavioral rhythms and body temperature as well as accelerate the growth of osteosarcoma and pancreatic cancer cells ( Filipski E et al., J Natl Cancer). Inst . 94 (9): 690-7, 2002 ). Numerous studies have been conducted in medicine and molecular biology following epidemiological studies, and many researchers have confirmed that circadian biorhythms have been destroyed in various cancer cell lines ( Savvidis C et al. Mol) . Med . 18: 1249-60, 2012 ). There is continuous evidence on the molecular network that BMAL1, CLOCK, period and crytochrome clock genes are closely related to cancer incidence and anticancer sensitivity in the molecular network. Suggests.

특히 CRY1의 경우 대장암에서 CRY1의 과발현은 암 성장과 환자의 나쁜 예후와 관련이 있고, 위암에서도 진행된 암에서 CRY1의 발현이 높은 것으로 보고되었으며 (Hongyan Yu et al. PLoS One. 8(4):e61679 , 2013; Hu ML et al. BMC Gastroenterol . 14:67, 2014), 신경교종에서는 정상세포보다 CRY1의 발현이 증가되어 있다고 보고되어 있다 (Luo Y et al. Asian Pac J Cancer Prev . 13(11):5725-8, 2012). 또한, 대표적인 종양 유발 동물 모델 중의 하나인 p53 유전자 결손 생쥐에서 CRY1/2를 추가로 결손시킬 경우 종양의 생성과 성장을 억제한다고 알려져 있다 (Kross E et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 108(26):10668-72, 2011).In particular, CRY1 CRY1 overexpression in colorectal cancer is associated with growth and poor prognosis of patients with cancer in advanced gastric cancer has been reported to be highly expressed in CRY1 (Hongyan Yu et al. PLoS One. 8 (4): e61679 , 2013; Hu ML et al. BMC Gastroenterol . 14:67, 2014 ), it is reported that glioma has increased expression of CRY1 than normal cells ( Luo Y et al. Asian Pac J Cancer Prev . 13 (11): 5725-8, 2012 ). In addition, further deletion of CRY1 / 2 in p53 gene deficient mice, one of the representative tumor-induced animal models, is known to inhibit tumor formation and growth ( Kross E et al. Proc) . Natl Acad Sci US A. 108 (26): 10668-72, 2011 ).

이전 연구에서 본 발명자들은 NANOG가 면역내성 획득에 필수적인 분자이며, NANOG/TCL1/AKT/MCL-1의 항암면역 내성관련 분자축을 규명하였다 (대한민국 공개특허 10-2012-0083504). In a previous study, we identified the molecular axis related to the anticancer immunity resistance of NANOG / NATG / TCL1 / AKT / MCL-1, in which NANOG is an essential molecule for obtaining immunity (Korea Patent Publication 10-2012-0083504).

이에, 본 발명자들은 항암면역 치료 후 재발된 암, 내성이 생긴 암 또는 전이암의 직접적인 표적이 될 수 있는 분자축을 규명함으로써 NANOG 의존적 내성암을 효과적으로 진단 및 치료하기 위하여, NANOG에 의한 면역내성 기전에서 CRY1의 발현이 비특이적으로 증가되어 있는 사실을 확인하고, NANOG 매개 항암면역 내성 치료에서 CRY1의 표적화 및 이용 가능성을 조사하였다. 그 결과, CRY1의 발현이 줄기세포 인자인 NANOG에 의해 직접적으로 조절되는 것을 규명하여, 항암면역내성을 획득한 종양세포에서 증가된 CRY1이 면역내성획득에 필수적인 분자임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have identified a molecular axis that may be a direct target of recurrent cancer, resistant cancer, or metastatic cancer after anticancer immunity treatment, and thus, in order to effectively diagnose and treat NANOG dependent resistant cancer, It was confirmed that the expression of CRY1 was nonspecifically increased and the targeting and availability of CRY1 in the treatment of NANOG mediated anticancer immunity was investigated. As a result, it was confirmed that the expression of CRY1 is directly regulated by the stem cell factor NANOG, confirming that the increased CRY1 is an essential molecule for obtaining immunity in tumor cells that have acquired anticancer immunity, and completed the present invention. .

본 발명의 목적은 NANOG/CRY1 면역내성 분자축의 CRY1를 표적하여 NANOG 발현이 증가되어 있는 항암면역 내성암을 치료 또는 진단하기 위한 NANOG 의존적 내성암의 예방 또는 치료용 조성물, 진단용 키트 및 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to target CRY1 of the NANOG / CRY1 immunoresistant molecule axis and to prevent or treat NANOG dependent resistant cancer for the treatment or diagnosis of anti-cancer immune resistant cancer having increased NANOG expression, diagnostic kits and diagnostics. To provide a way to provide information.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CRY1의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 함유하는 NANOG 의존적 내성암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for the prevention or treatment of NANOG dependent resistant cancer containing CRY1 expression or activity inhibitor as an active ingredient.

본 발명은 또한, CRY1 유전자와 엄격한 조건에서 혼성할 수 있는 프로브 또는 CRY1 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 NANOG 의존적 내성암의 진단용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for diagnosing NANOG dependent resistant cancer, comprising a probe capable of amplifying a CRY1 gene or a probe capable of hybridizing with a CRY1 gene under stringent conditions.

본 발명은 또한, 분리된 생물학적 시료로부터 CRY1 유전자의 mRNA 수준 또는 CRY1 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 CRY1 유전자의 mRNA 수준 또는 CRY1 단백질 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 NANOG 의존적 내성암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of measuring the mRNA or CRY1 protein level of a CRY1 gene from an isolated biological sample; And it provides a method for providing information for the diagnosis of NANOG dependent resistant cancer comprising comparing the measured mRNA level or CRY1 protein level of the CRY1 gene with a control sample.

본 발명에 따른 병리적 마커로서의 새로운 NANOG/CRY1 면역내성 분자축을 이용한 NANOG 의존적 내성암의 치료용 조성물, 상기 내성암 진단 키트 또는 진단을 위한 정보제공 방법은 항암제 또는 면역 요법 등의 항암치료에 대해 내성이 생긴 암 및 항암 치료 후 재발 또는 전이가 일어난 암을 보다 정확하고 신속하게 진단하고 치료하는데 매우 유용하다.The composition for the treatment of NANOG-dependent resistant cancer using the novel NANOG / CRY1 immunoresistant molecular axis as a pathological marker according to the present invention, the resistant cancer diagnostic kit or a method for providing information for diagnosis is resistant to chemotherapy such as an anticancer agent or immunotherapy. It is very useful for more precisely and quickly diagnosing and treating cancer in which recurrence or metastasis has occurred after this cancer and chemotherapy.

도 1은 다양한 인간 암 세포주에서 CRY1 단백질과 NANOG 단백질의 발현 (A) 및 그 발현의 상관관계 (B)를 확인한 것이다.
도 2는 항암면역 내성 CaSki P3 세포주에서 일주기 생체리듬 인자들 중 비특이적이로 증가된 CRY1의 발현을 확인하고, 항암면역 내성 CaSki P3 세포의 항암면역 내성 및 종양구 형성능에 대한 CRY1의 역할을 확인한 것이다.
도 3은 항암면역 내성 CaSki P3 세포주에서 NANOG의 발현 억제시 CRY1의 발현이 저하되고 원발암 세포주 CaSki에서 NANOG 과발현시 CRY1의 발현이 증가되는 것을 확인하고, NANOG 과발현 자궁경부암 세포에서 CRY1 발현 저하시 항세포사멸인자 MCL-1발현과 세포증식인자 CyclinA의 발현 감소를 유도하여 항암면역 내성 및 시험관내 종양구 형성능을 확인한 것이다.
도 4는 HEK293 세포주에서 NANOG의 전사활성 의존적으로 CRY1 단백질의 발현 증가, CRY1 mRNA 발현 증가, CRY1 프로모터에서 NANOG 결합부위의 확인, NANOG의 전사활성 의존적으로 CRY1 프로모터 활성의 증가, 및 CRY1 프로모터에서 NANOG 단백질의 직접 결합하고 있음을 확인한 것이다.
도 5는 항암면역 내성 자궁경부암 세포인 CaSki P3 세포주와 NANOG 시그널을 활성화시킨 NANOG 과발현 세포주에서 CRY1 억제 합성화합물에 대한 높은 민감성을 비교한 것이다.
도 6은 항암면역 내성 CaSki P3 세포주에서 CRY1 억제 합성화합물과 면역치료를 병용하였을 때 모암세포주인 CaSki P0에 비해서 높은 민감성을 확인한 것이다.
도 7는 NANOG가 과발현된 자궁경부암 CaSki 세포주를 비롯하여 항암면역 내성 유방암 세포인 MDA-MB231 P3 세포주, 자연적으로 NANOG가 과발현되어 있는 자궁경부암 세포인 SiHa 및 자연적으로 NANOG가 과발현되어 있는 대장암 세포인 HCT116 세포주에서 CRY1 억제 합성화합물과 면역치료를 병용하였을 때 합성화합물 농도 의존적으로 민감도가 증가하는 것을 확인한 것이다.
도 8은 항암면역 내성 유방암 세포, MDA-MB231 P3 세포주를 피하 주사법을 통해 NOD/SCID 쥐에 주입하여 종양을 형성시킨 후, CRY1 억제 합성화합물과 CD8+ T 세포를 이용한 면역치료를 병행한 결과 종양 형성이 감소함을 확인한 것이다. Figure 1 shows the expression (A) and the correlation (B) of the CRY1 protein and NANOG protein in various human cancer cell lines.
Figure 2 confirms the non-specifically increased expression of CRY1 among circadian rhythm factors in the anti-cancer immune resistant CaSki P3 cell line, confirming the role of CRY1 on the anti-cancer immunity and tumorigenic capacity of the anti-cancer immune resistant CaSki P3 cells will be.
3 shows that the expression of CRY1 is decreased when NANOG expression is inhibited in the anti-cancer immune resistant CaSki P3 cell line, and that the expression of CRY1 is increased when NANOG is overexpressed in the primary cancer cell line CaSki, and that when CRY1 expression is decreased in NANOG overexpressing cervical cancer cells Induction of apoptosis factor MCL-1 and decreased expression of cell proliferation factor CyclinA were confirmed to be anti-cancer immunity and in vitro tumor cell formation ability.
Figure 4 shows the expression of CRY1 protein in the HEK293 cell line dependent on the transcriptional activity of NANOG, increased CRY1 mRNA expression, identification of NANOG binding site in the CRY1 promoter, increase of CRY1 promoter activity dependent on the transcriptional activity of NANOG, and NANOG protein in the CRY1 promoter It is confirmed that the direct combination of.
Figure 5 compares the high sensitivity of CRY1 inhibitory synthetic compounds in CaSki P3 cell line, which is an anti-cancer immune resistant cervical cancer cell, and NANOG overexpressing cell line that activated NANOG signal.
Figure 6 confirms the high sensitivity of the cancer cell line CaSki P0 when combined with the anti-cancer immunity resistant CaSki P3 cell line when combined with CRY1 inhibitory synthetic compounds and immunotherapy.
FIG. 7 is a diagram showing cervical cancer CaSki cell line overexpressing NANOG, MDA-MB231 P3 cell line, which is an anti-cancer immunity resistant breast cancer cell, cervical cancer cell overexpressing NANOG, and colon cancer cell overexpressing NANOG naturally. When the combination of CRY1 inhibitory compound and immunotherapy is used in the cell line, it was confirmed that the sensitivity increased depending on the compound concentration.
FIG. 8 shows tumor formation by injecting anti-cancer immunity-resistant breast cancer cells, MDA-MB231 P3 cell line into subcutaneous injection into NOD / SCID mice, and immunotherapy using CRY1 inhibitory synthetic compounds and CD8 + T cells. This decrease was confirmed.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.

본 명세서에서 "원발암"은 통상의 암을 뜻하며, "내성암"은 항암제 또는 항암면역에 대한 내성암인 것을 뜻하며, "항암면역 내성암"은 항암면역치료에 대한 내성을 획득한 암을 뜻하며, 항암면역치료란 암 특이 항원 또는 암 관련 항원에 대한 면역반응을 유도하여 암 특이성 독성 면역세포에 의해 암세포를 제거하는 모든 체계의 통합을 지칭한다. 암 항원에 대한 면역유도 방법으로는 유전자, 단백질, 바이러스, 수지상세포 등의 방법을 포함한다. "재발암"은 통상의 암 치료 후 재발생된 암을 뜻하고, "내성암"은 상기 암 치료에 내성을 갖는 암을 일컫는 말이다. 여기서, 통상의 암 치료는 예를 들어, 수술, 화학치료, 방사선치료, 호르몬 치료, 생물학적 치료, 면역치료 등을 포함한다. 상기 암의 종류로는 뇌종양, 척수종양, 망막 세포종, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암, 후두암, 경부암을 포함하는 두경부암, 피부암, 유방암, 갑상선암, 악성부신종양을 포함하는 유방암, 내분비암, 폐암, 흉막종양, 악성부신종양을 포함하는 호흡기암, 식도암, 위암, 소장의 악성종양, 대장암, 항문암, 간암, 담도암 또는 췌장암을 포함하는 소화기암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암 또는 음경암을 포함하는 비뇨기암, 자궁경부암, 자궁체부암, 융모상피암 또는 난소암을 포함하는 부인암, 급성 또는 만성 백혈병, 악성림프종 또는 다발성 골수증을 포함하는 혈액암, 골종양 또는 연부종양을 포함하는 골 또는 연부 종양, 및 소아 백혈병 또는 소아 고형종양을 포함하는 소아암 등일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 "암전이 또는 전이암"은 특정 부위에서 발생한 원발암 또는 재발암이 다른 부위로 전이된 것을 일컫는다.In the present specification, "primary cancer" means a conventional cancer, "resistant cancer" means an anticancer drug or cancer resistant to cancer, and "anticancer immunity cancer" refers to a cancer obtained resistance to chemotherapy. In addition, anticancer immunotherapy refers to the integration of all systems of inducing immune responses against cancer specific antigens or cancer related antigens to remove cancer cells by cancer specific toxic immune cells. Immune induction methods for cancer antigens include genes, proteins, viruses, dendritic cells and the like. "Recurrence cancer" refers to cancer that has reoccurred after conventional cancer treatment, and "resistant cancer" refers to cancer that is resistant to the cancer treatment. Here, conventional cancer treatments include, for example, surgery, chemotherapy, radiation therapy, hormonal therapy, biological therapy, immunotherapy and the like. Examples of the cancer include brain tumors, spinal cord tumors, retinal cell tumors, oral cancers, nasal cancers, sinus cancers, pharyngeal cancers, laryngeal cancers, head and neck cancers including cervical cancers, skin cancers, breast cancers, thyroid cancers, breast cancers including malignant adrenal tumors Gastrointestinal cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, including lung cancer, pleural tumor, respiratory cancer, esophageal cancer, stomach cancer, small intestine malignant tumor, colon cancer, anal cancer, liver cancer, biliary tract cancer or pancreatic cancer Urinary cancer including testicular cancer or penile cancer, cervical cancer, cervical cancer, gynecological cancer including choriocarcinoma or ovarian cancer, hematologic cancer including acute or chronic leukemia, malignant lymphoma or multiple myeloma, bone tumor or soft tumor Bone or soft tumors, and pediatric cancer including pediatric leukemia or pediatric solid tumors. In addition, the term "cancer metastasis or metastatic cancer" refers to the metastasis of a primary or recurring cancer occurring at a specific site to another site.

항암면역 내성 획득에 NANOG가 필수 분자(대한민국 공개특허 10-2012-0083504)임이 알려져 있다. 이러한 NANOG에 의한 면역내성 기전에서 CRY1의 발현이 비특이적으로 증가되어 있는 사실을 본 발명에서 확인하였다. It is known that NANOG is an essential molecule for obtaining anticancer immunity (Korea Patent Publication No. 10-2012-0083504). It was confirmed in the present invention that the expression of CRY1 in non-specifically increased immune resistance mechanism by NANOG.

본 발명의 CRY1 단백질은 항암면역 내성뿐만 아니라 항암제 및 방사선 내성을 나타내고, 전이성이 높은 암세포에서 많이 발현되므로, 상기 단백질의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 저해제를 투여함으로써 NANOG 매개의 NANOG 의존적인 항암면역 내성암의 재발 및 전이뿐만 아니라 재발암, 내성암 또는 암전이 치료적 용도로 사용될 수 있다.Since CRY1 protein of the present invention exhibits not only anticancer immunity but also anticancer agent and radiation resistance, and is highly expressed in highly metastatic cancer cells, NANOG-mediated NANOG-dependent by administering an inhibitor that inhibits the expression or activity of the gene or protein of the protein. Recurrent cancer, resistant cancer or cancer metastasis can be used for therapeutic purposes as well as recurrence and metastasis of anticancer immune resistant cancer.

본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이의 예방 또는 치료는 항암면역내성암의 재발 및 전이의 예방, 억제 또는 경감을 포함한다.The prevention or treatment of the recurrence and metastasis of anticancer immune cancer of the present invention includes the prevention, inhibition or alleviation of the recurrence and metastasis of anticancer immune cancer.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, CRY1의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 함유하는 NANOG 의존적 내성암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.Therefore, in one aspect, the present invention relates to a composition for preventing or treating NANOG-dependent resistant cancer containing CRY1 expression or activity inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 CRY1 유전자 저해제(발현 저해제)로서, CRY1 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA, 안티센스, 또는 shRNAi를 들 수 있다. 상기 CRY1 유전자는 항암면역 내성, 항암제 및 방사선 내성을 나타내고, 암전이와 관련된 유전자이므로, siRNA, 안티센스, 또는 shRNAi에 의해 NANOG 유전자 발현을 억제함으로써, NANOG 의존적 내성암의 재발 및 전이를 예방 또는 치료할 수 있다.Examples of the CRY1 gene inhibitor (expression inhibitor) of the present invention include siRNA, antisense, or shRNAi that specifically bind to mRNA of the CRY1 gene to inhibit expression. Since the CRY1 gene exhibits anticancer immunity resistance, anticancer agent and radiation resistance, and is related to cancer metastasis, the CRY1 gene may prevent or treat relapse and metastasis of NANOG dependent resistant cancer by inhibiting NANOG gene expression by siRNA, antisense, or shRNAi. have.

본 명세서에서 "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.As used herein, "siRNA" refers to a double-chain RNA that induces RNA interference through cleavage of mRNA of a target gene, and an RNA strand of a sense sequence having the same sequence as the mRNA of the target gene and an antisense having a complementary sequence thereto. It consists of the RNA strand of the sequence.

상기 siRNA는 시험관에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.The siRNA may include a form expressed by inserting the siRNA itself or a base sequence encoding the siRNA synthesized in vitro into the expression vector.

상기 siRNA는 바람직하게는 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 가질 수 있다.The siRNA may preferably have one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 5.

보다 구체적으로, 서열번호 1 내지 5에 기재된 siRNA 서열은 하기 표 1에 나타내었다. More specifically, siRNA sequences set forth in SEQ ID NOS: 1 to 5 are shown in Table 1 below.

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또한, 상기 안티센스는 CRY1 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 암전이 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.In addition, the antisense has a sequence complementary to all or part of the mRNA sequence transcribed from the CRY1 gene or fragment thereof, and can bind to the mRNA to inhibit the expression of the cancer metastasis gene or fragment.

상기 CRY1의 저해제는 상기 단백질들의 발현을 억제하는 물질 또는 기능을 저해하는 물질이 될 수 있는데, 구체적으로, CRY1 단백질의 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 2-에특시프로피온산 유도체인 KS15인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.The inhibitor of CRY1 may be a substance that inhibits the expression of the proteins or a substance that inhibits the function. Specifically, the CRY1 may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody of CRY1 protein, and most preferably 2- Although it is KS15 which is an Epoxy propionic acid derivative, it is not limited to this.

또한, 상기 CRY1 유전자의 mRNA 또는 단백질 저해제를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물은 하나 또는 그 이상의 항암제 또는 면역치료제를 더 포함하여 제제화하거나, 병용하여 사용할 수 있다. In addition, the composition for the prevention or treatment of recurrence and metastasis of the anticancer immune cancer of the present invention containing the mRNA or protein inhibitor of the CRY1 gene as an active ingredient further comprises one or more anticancer agents or immunotherapy agents, or Can be used.

본 발명의 조성물과의 병용은 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.Combination with the composition of the present invention may be characterized by simultaneous, separate or sequential administration.

CRY1의 저해제 또는 항체는 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent) 또는 방선선 치료와 함께 사용될 수 있으며, 예를 들어, 시클로포스파미드, 아지리딘, 알킬알콘설포네이트, 나이트로소우레아, 다카르바진, 카르보플라틴, 시스플라틴 등과 같은 알킬화제(alkylating agent), 마이토마이신 C, 안트라사이클린, 독소루비신(아드리아마이신) 등과 같은 항생제, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 시타라빈 등과 같은 항대사제(antimetabolitic agent), 빈카 알칼로이드와 같은 식물유래 약제 및 호르몬 등이 될 수 있다. Inhibitors or antibodies of CRY1 may be used in combination with chemotherapeutic agents or radiation therapy well known to those skilled in the art, for example cyclophosphamide, aziridine, alkylalconsulfonates, nitrosoureas, dakars Alkylating agents such as vagin, carboplatin, cisplatin, etc., antibiotics such as mitomycin C, anthracycline, doxorubicin (adriamycin), and antimetabolitic agents such as methotrexate, 5-fluorouracil, cytarabine, etc. And plant-derived drugs such as vinca alkaloids and hormones.

또한, 상기 CRY1 유전자의 mRNA 또는 단백질 저해제를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 NANOG 의존적 내성암의 예방 또는 치료용 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.In addition, the composition for the prophylaxis or treatment of NANOG dependent resistant cancer of the present invention containing the mRNA or protein inhibitor of the CRY1 gene as an active ingredient, in addition to the active ingredient described above for the administration of one additional pharmaceutically acceptable carrier It can be preferably formulated into a pharmaceutical composition including the above.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated in liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary.

또한, 상기 CRY1 유전자의 mRNA 또는 단백질 저해제를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 NANOG 의존적 내성암의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.In addition, a composition for preventing or treating NANOG dependent resistant cancer of the present invention containing the mRNA or protein inhibitor of the CRY1 gene as an active ingredient may be prepared using a pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient. The auxiliary agent may be a solubilizer such as an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, an expanding agent, a lubricant, a lubricant, or a flavoring agent.

또한, 본 발명의 NANOG 의존적 내성암의 예방 또는 치료용 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.In addition, the composition for the prevention or treatment of NANOG dependent resistant cancer of the present invention may be added in addition to diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants to injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules or It may be formulated into a tablet. Furthermore, the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA can be formulated according to each disease or component according to the appropriate method in the art.

또한, 본 발명의 항암면역내성암의 예방 또는 치료용 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.In addition, the composition for the prevention or treatment of cancer-resistant cancer of the present invention is intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, sternum, transdermal, nasal, inhalation, topical, rectal, oral, Administration can be in conventional manner via the intraocular or intradermal route.

상기 항암면역내성암의 예방 또는 치료용 조성물의 투여량은 항암면역내성암의 재발 및 전이를 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, CRY1 유전자의 저해제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.The dosage of the composition for preventing or treating cancer-resistant cancer is meant an amount required to achieve an effect of suppressing the recurrence and metastasis of the cancer-resistant cancer. Thus, the type of disease, the severity of the disease, the type and content of the active ingredients and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, body weight, general health status, sex and diet of the patient, time of administration, route of administration and composition It can be adjusted according to various factors including the rate of secretion, the duration of treatment, and the drug used concurrently. In adults, when the inhibitor of the CRY1 gene is administered once or several times per day, 0.01 ng / kg to 10 mg / kg for siRNA, 0.1 ng / kg to 10 mg / kg for compound, and monoclonal antibody It is preferable to administer at a dose of 0.1ng / kg-10mg / kg.

본 발명은 다른 관점에서, CRY1 유전자와 엄격한 조건에서 혼성할 수 있는 프로브 또는 CRY1 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 NANOG 의존적 내성암의 진단용 키트에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a kit for diagnosing a NANOG dependent resistant cancer comprising a probe capable of amplifying a CRY1 gene or a probe capable of hybridizing with a CRY1 gene under stringent conditions.

본 명세서에서 "프로브"는 CRY1 유전자 또는 단백질과 특이적으로 결합하여 이들을 인지할 수 있는 항체, PCR 프라이머, 핵산 프로브 등을 포괄적으로 포함하는 개념이다.As used herein, the term "probe" is a concept that encompasses antibodies, PCR primers, nucleic acid probes, and the like that can specifically bind to and recognize CRY1 genes or proteins.

본 발명에 있어서, 상기 CRY1 유전자에 대한 프라이머는 서열번호 6 내지 서열번호 9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the primer for the CRY1 gene is preferably any one or more selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto.

본 발명의 NANOG 의존적 내성암의 진단용 키트는 생리학적 시료에서 항암면역내성암의 재발 및 전이 병리적 마커를 검출하기 위한 것으로, CRY1 유전자가 항암면역내성암의 재발 및 전이성이 있는 암세포의 안팎에서 특이적으로 발현이 증가되는 양상을 보이고, 이의 발현량과 비례하여 세포의 종양형성능이 증가하므로, 암세포 또는 조직에서의 CRY1 유전자, 또는 이로부터 코딩되는 단백질의 발현 정도를 정량분석함으로써 항암면역내성암의 재발 및 전이를 진단할 수 있는 것이다.The diagnostic kit for NANOG dependent resistant cancer of the present invention is for detecting the recurrence and metastatic pathologic markers of anticancer immune cancer in physiological samples, and the CRY1 gene is specific to inside and outside cancer cells having recurrent and metastatic cancer. As the expression level increases, the tumorigenic ability of the cell increases in proportion to its expression level, and thus the recurrence of anti-cancer immunity cancer by quantitative analysis of the expression level of the CRY1 gene or a protein encoded therefrom in cancer cells or tissues. And metastasis.

상기 CRY1는 사람 또는 마우스에서 유래한 것으로, 공지된 서열, 예를 들어, GenBank Accession No. NM_004075 (사람), GenBank Accession No. NM_007771 (마우스) 등을 포함하거나, 염기 또는 아미노산의 결실, 치환, 부가되어도 동일한 기능을 수행할 수 있는 변이체를 포함할 수 있다.The CRY1 is derived from a human or mouse, and known sequences, such as GenBank Accession No. NM_004075 (Person), GenBank Accession No. NM_007771 (mouse) and the like, or may include a variant capable of performing the same function even if deleted, substituted, added to the base or amino acid.

본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 조성물은 상기 프로브로 CRY1 단백질의 에피토프와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다.The composition for diagnosing recurrence and metastasis of an anticancer immune cancer of the present invention may include a monoclonal antibody or a polyclonal antibody that specifically binds to an epitope of CRY1 protein with the probe.

본 발명의 NANOG 의존적 내성암의 진단용 키트를 이용한 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단은, 포유류의 조직 또는 세포시료로부터 발현된 단백질 시료를 수득하는 단계; 및 수득한 시료에서 CRY1 단백질을 확인하고 정량하는 단계를 포함할 수 있다. Diagnosis of recurrence and metastasis of cancer-resistant cancers using the NANOG-dependent resistant cancer diagnostic kit of the present invention comprises the steps of: obtaining a protein sample expressed from a mammalian tissue or cell sample; And identifying and quantifying the CRY1 protein in the obtained sample.

또는, 상기 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단은, 포유류의 조직 또는 세포시료로부터 발현된 단백질 시료를 수득하는 단계; 및 수득한 시료를 CRY1 단백질의 모노클로날 항체와 반응시켜 CRY1 단백질의 발현을 확인하고 정량하는 단계를 포함할 수 있다.Alternatively, the diagnosis of recurrence and metastasis of the anticancer immunity cancer may include obtaining a protein sample expressed from a mammalian tissue or cell sample; And reacting the obtained sample with a monoclonal antibody of CRY1 protein to confirm and quantify the expression of CRY1 protein.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 분리된 생물학적 시료로부터 CRY1 유전자의 mRNA 수준 또는 CRY1 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 CRY1 유전자의 mRNA 수준 또는 CRY1 단백질 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 NANOG 의존적 내성암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.Accordingly, in another aspect, the present invention provides a method for preparing a CRY1 gene, comprising: (a) measuring the mRNA level or CRY1 protein level of a CRY1 gene from an isolated biological sample; And (b) comparing the measured mRNA level or CRY1 protein level of the CRY1 gene with a control sample, thereby providing information for diagnosing NANOG dependent resistant cancer.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 CRY1 유전자의 mRNA 수준 또는 CRY1 단백질 수준이 증가하는 경우, NANOG 의존적 내성암으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, step (b) may be characterized as determining NANOG dependent resistance cancer when the mRNA level or CRY1 protein level of the CRY1 gene increases compared to the control group.

또한, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the sample is preferably selected from the group consisting of tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, sweat, urine, ascites fluid and peritoneal fluid, but is not limited thereto.

상기 측정방법은, CRY1 단백질의 모노클로날 항체를 함유한 NANOG 의존적 내성암의 진단용 키트를 생체로부터 배출된 물질(암세포 또는 조직의 단백질 추출물이나 혈장 등)에 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay) 방법을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하거나, 생체에서 배출된 암조직이나 세포에 CRY1 단백질 특이적 면역염색(histoimmunostaining)을 이용하여 항암면역내성암의 재발 및 전이 여부를 측정할 수 있다. 또는, 생체로부터 배출된 암조직이나 세포에 웨스턴 블롯분석을 이용하여 단백질 수준에서 CRY1 단백질 발현량을 정상대조군과 비교분석함으로서 NANOG 의존적 내성암의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.The measurement method is an ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay) method to a material (eg, protein extracts or plasma of cancer cells or tissues) discharged from a living body of a diagnostic kit for NANOG dependent resistant cancer containing a monoclonal antibody of CRY1 protein. It can be quantitatively analyzed by color reaction, or the recurrence and metastasis of anticancer immunity cancer can be measured using CRY1 protein-specific immunostaining to cancer tissues or cells discharged from the living body. Alternatively, by using Western blot analysis on cancer tissues or cells discharged from the living body, the expression level of CRY1 protein at the protein level can be compared with the normal control group to provide information for diagnosis of NANOG dependent resistant cancer.

또는, 상기 NANOG 의존적 내성암의 진단을 위한 정보를 제공은, CRY1 단백질에 대한 모노클로날 항체를 겔형 지지체에 부착시켜 면역친화컬럼을 제조하는 단계; 상기 단계의 면역친화컬럼을 사용하여 생체로부터 배출된 물질(암세포 또는 조직의 단백질 추출물이나 혈장 등)에서 CRY1 단백질을 HPLC 방법으로 정량하는 단계; 및 상기 정량 결과를 비교분석하여 항암면역내성암의 재발 및 전이 정도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.Alternatively, providing information for diagnosing NANOG dependent resistant cancer may include attaching a monoclonal antibody against CRY1 protein to a gel-like support to prepare an immunoaffinity column; Quantifying CRY1 protein in a substance (protein extract or plasma of cancer cells or tissues) released from the living body using the immunoaffinity column of the above step by HPLC method; And comparing and analyzing the quantitative results to determine a degree of recurrence and metastasis of anticancer immune cancer.

상기 CRY1 단백질의 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다.The monoclonal antibody of the CRY1 protein may be prepared and used through a monoclonal antibody manufacturing method common in the art, or may be commercially available.

상기 CRY1 단백질의 모노클로날 항체에는 일반적으로 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, AP) 또는 홀스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하거나, 직접 CRY1 단백질 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다.The monoclonal antibody of the CRY1 protein is generally colored using a secondary antibody conjugated with an enzyme such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) and a substrate thereof. It can also be quantitatively analyzed by reacting or quantitatively using the conjugate of AP or HRP enzyme or the like directly to the CRY1 protein monoclonal antibody.

또한, 상기 CRY1 단백질 모노클로날 항체 대신에 CRY1 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있으며, 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수 있다.In addition, a polyclonal antibody that recognizes the CRY1 protein may be used instead of the CRY1 protein monoclonal antibody, which may be manufactured and used through a conventional antiserum production method in the art.

또한, 상기 프로브는 CRY1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 PCR 프라이머 또는 핵산 프로브를 포함할 수 있다.In addition, the probe may include a PCR primer or nucleic acid probe that specifically binds to mRNA of CRY1.

본 발명에 있어서, 상기 CRY1 유전자에 대한 프라이머는 서열번호 6 내지 서열번호 9로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the primer for the CRY1 gene is preferably any one or more selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto.

상기 CRY1 유전자에 대한 프라이머를 이용한 RT-PCR 또는 정량적 RT-PCR 등을 수행하여 CRY1 유전자의 발현량을 정상군과 비교함으로써 NANOG 의존적 내성암의 재발 및 전이를 진단할 수 있다.RT-PCR or quantitative RT-PCR using primers for the CRY1 gene may be performed to compare the expression level of the CRY1 gene with a normal group to diagnose relapse and metastasis of NANOG dependent resistant cancer.

또한, 상기 CRY1 유전자에 대한 핵산 프로브를 이용하여 노던 블롯 분석 등을 수행하여 NANOG 유전자의 발현량을 정상군과 비교함으로써 NANOG 의존적 내성암의 재발 및 전이를 진단할 수 있다.In addition, Northern blot analysis using the nucleic acid probe for the CRY1 gene may be performed to compare the expression level of NANOG gene with the normal group to diagnose relapse and metastasis of NANOG dependent resistant cancer.

상기 PCR 프라이머 또는 핵산 프로브는 CRY1 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 뉴클레오티드라면 특별히 제한하지 않는다.The PCR primer or nucleic acid probe is not particularly limited as long as it is a nucleotide capable of specifically binding to mRNA of the CRY1 gene.

상기 CRY1 유전자의 mRNA 검출용 프라이머 또는 핵산 프로브를 포함하는 본 발명에 따른 NANOG 의존적 내성암의 재발 및 전이 진단용 키트를 생체로부터 배출된 물질(암세포 또는 조직에서 추출한 RNA)과 반응(RT-PCR 또는 정량적 RT-PCR 또는 노던블롯팅)시켜 정상군과 비교 분석함으로써 NANOG 의존적 내성암의 재발 및 전이 진단을 수행할 수 있다.Reaction and metastasis of the NANOG dependent resistant cancer according to the present invention comprising a primer or nucleic acid probe for detecting the mRNA of the CRY1 gene and a reaction (RT-PCR or quantitative) with a substance (RNA extracted from cancer cells or tissues) discharged from a living body RT-PCR or Northern blotting) can be compared to the normal group to perform recurrence and metastasis diagnosis of NANOG dependent resistant cancer.

상기 NANOG 의존적 내성암의 재발 및 전이 진단은 포유류의 조직 또는 세포시료로부터 발현된 RNA 시료를 수득하는 단계; 및 수득한 시료를 CRY1 유전자에 특이적으로 결합하는 PCR 프라이머 또는 프로브와 반응시켜 상기 유전자의 발현을 확인하고 정량하는 단계를 포함할 수 있다.Diagnosis of relapse and metastasis of the NANOG dependent resistant cancer may include obtaining an RNA sample expressed from a mammalian tissue or cell sample; And reacting the obtained sample with a PCR primer or probe specifically binding to the CRY1 gene to confirm and quantify the expression of the gene.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.Matters related to genetic engineering in the present invention are described in Sambrook et al. (Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)) and Frederick et al. M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volumes 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).

[[ 실시예Example ]]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.

실시예 1: 인간 암 세포주에서 CRY1 및 NANOG 단백질 발현 확인Example 1: Confirmation of CRY1 and NANOG Protein Expression in Human Cancer Cell Lines

인간 자궁경부암 세포주(CUMC6, SiHa, HeLa, CaSki), 대장암 세포주(SNUC4, SW620, L0V0, HT29, HCT116), 폐암 세포주(H358, H1299, H3122, HCC95), 흑색종 세포주(A375, 526mel, SK-MEL-1, Malme-3M), 췌장암 세포주(cf-pac-1, Panc-1) 및 전립선암 세포주 (Du145, PC3)를 RIPA버퍼(Elpis, Korea)에 넣어 얼음에 30분간 정치시킨 후 냉장 원심분리기에서 13000rpm으로 30분간 원심분리하고, 상층액만 취하여 단백질 정량 후 30㎍의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그 후 PVDF에 로딩된 젤을 트랜스퍼하여 5% BSA로 1시간 동안 블로킹한 후 CRY1 항체(Bethyl Laboratories, USA) 및 NANOG 항체(Bethyl Laboratories, USA)를 1:5000으로 희석하여 12시간 동안 반응시켰다. 세척 후, HRP가 부착된 2차 항체를 1시간 동안 반응시킨 후 ECL용액을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하였다.Human cervical cancer cell lines (CUMC6, SiHa, HeLa, CaSki), colorectal cancer cell lines (SNUC4, SW620, L0V0, HT29, HCT116), lung cancer cell lines (H358, H1299, H3122, HCC95), melanoma cell lines (A375, 526mel, SK) -MEL-1, Malme-3M), pancreatic cancer cell lines (cf-pac-1, Panc-1) and prostate cancer cell lines (Du145, PC3) were placed in RIPA buffer (Elpis, Korea) for 30 minutes on ice and refrigerated After centrifugation at 13000 rpm for 30 minutes in a centrifuge, only the supernatant was taken and the protein was quantified and 30 µg of protein was loaded onto the SDS-PAGE gel. Thereafter, the gel loaded in PVDF was transferred and blocked with 5% BSA for 1 hour, and then, the CRY1 antibody (Bethyl Laboratories, USA) and NANOG antibody (Bethyl Laboratories, USA) were diluted 1: 5000 and reacted for 12 hours. After washing, the secondary antibody to which HRP was attached was reacted for 1 hour, and then the band of the protein was confirmed by using ECL solution.

그 결과, 다양한 인간 암 종에서 CRY1 및 NANOG 단백질의 발현을 확인할 수 있었으며, CRY1와 NANOG 단백질 발현의 상관관계를 분석할 수 있었다 (도 1).As a result, it was possible to confirm the expression of CRY1 and NANOG protein in various human carcinoma, and to analyze the correlation between CRY1 and NANOG protein expression (FIG. 1).

실시예 2: 항암면역 내성암 세포주에서 CRY1의 기능 Example 2: Function of CRY1 in Anticancer Immunity Resistant Cancer Cell Lines

2-1: 항암면역 내성암 세포주에서 CRY1의 유전자 발현 확인2-1: Confirmation of gene expression of CRY1 in anticancer immune resistant cancer cell line

모암 세포주 (CaSki P0) 및 항암면역 내성암 세포주 (CaSki P3)의 전체 RNA는 RNeasy Mico Kit (Qiagen)을 사용하여 분리하였고, iScrip cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)를 사용하여 역전사 효소로 cDNA를 합성하였다. 정량적 real-time PCR은 iQ SYBR Green super mix (Bio-Rad)를 사용하고 CFX96 실시간 PCR 검출 프로토콜을 이용하여 수행되었다. 모든 PCR 실험은 3회 반복 실험하였고, Bio-Rad CCFX96 Manager 3.0 소프트웨어를 사용하여 정량 사이클(Cq) 값을 도출하였다. mRNA 수준의 상대적 정량화는 beta-actin을 대조 유전자로 사용하여 비례정량으로 계산하였다. CRY1 유전자에 대한 센스 프라이머 (서열번호 6: 5‘-TTGGAAAGGAACGAGACGCA-3’)와 안티센스 프라이머 (서열번호 7: 5’-AGTTAGAGGCGGTTGTCCAC-3‘) 혹은 센스 프라이머 (서열번호 8: 5‘-TGGGAATGGAGGCTTCATGG-3’)와 안티센스 프라이머 (서열번호 9: 5’-ACGTTTCCCACCACTGAGAC-3‘)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. Total RNA from blast cancer cell line (CaSki P0) and anti-cancer immune resistant cancer cell line (CaSki P3) was isolated using RNeasy Mico Kit (Qiagen) and synthesized cDNA by reverse transcriptase using iScrip cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) It was. Quantitative real-time PCR was performed using iQ SYBR Green super mix (Bio-Rad) and using the CFX96 real time PCR detection protocol. All PCR experiments were repeated three times and quantitative cycle (Cq) values were derived using Bio-Rad CCFX96 Manager 3.0 software. Relative quantification of mRNA levels was calculated by proportional quantification using beta-actin as a control gene. A sense primer (SEQ ID NO: 6'5'-TTGGAAAGGAACGAGACGCA-3 ') and an antisense primer (SEQ ID NO: 7: 5'-AGTTAGAGGCGGTTGTCCAC-3') or a sense primer (SEQ ID NO: 8: 5'-TGGGAATGGAGGCTTCATGG-3 ') for the CRY1 gene ) And antisense primers (SEQ ID NO: 5'-ACGTTTCCCACCACTGAGAC-3 ') were amplified by PCR.

그 결과, 항암면역 내성 CaSki P3 세포주에서 일주기 생체리듬 인자들 중 비특이적이로 증가된 CRY1의 발현을 확인하였다 (도 2).As a result, it was confirmed that the expression of non-specifically increased CRY1 among the circadian biorhythm factors in the anti-cancer immune resistant CaSki P3 cell line (FIG. 2).

2-2: CRY1 발현 억제에 따른 세포성장 변화 확인2-2: Confirmation of Cell Growth Changes by Inhibiting CRY1 Expression

특이적 siRNA 처리는 리포좀 제제인 리포펙타민 2000 (lipofectamin 2000, Invitrogene, USA)을 질량비 1:2로 섞어 항암면역 내성암 세포주에 처리하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 48-72시간 배양하였다. Specific siRNA treatment was mixed liposometamine 2000 (lipofectamin 2000, Invitrogene, USA) in a mass ratio of 1: 2 and treated in anti-cancer immunity resistant cancer cell line and incubated for 48-72 hours in a 5% CO 2 , 37 ℃ incubator. .

CRY1 특이적 siRNA는 표 1의 서열번호 1 내지 5와 같다.CRY1 specific siRNAs are shown in SEQ ID NOs: 1-5.

이러한 방법으로 얻어진 세포를 세포배양용 96-웰 플레이트에 각각 5000개씩 접종하였다. 12시간 배양 후 항암제 Cisplatin 또는 방사선을 72시간 동안 처리하였다. 각각의 세포 생존률은 MTT 분석법을 이용하여 측정하였다.The cells obtained by this method were inoculated with 5000 cells in 96-well plates for cell culture, respectively. After 12 hours of incubation, the anticancer drug Cisplatin or radiation was treated for 72 hours. Each cell viability was measured using the MTT assay.

그 결과, 모암 세포주 (CaSki P0)에 비하여 항암면역 내성암 세포주 (CaSki P3)는 CRY1 발현 억제에 대해 세포 성장 민감도가 높음을 확인하였고, 이는 CRY1의 발현 증가에 의한 것임을 확인하였다 (도 2). As a result, it was confirmed that the anticancer immunity resistant cancer cell line (CaSki P3) has a high cell growth sensitivity to the inhibition of CRY1 expression compared to the mother cancer cell line (CaSki P0), which was confirmed by the increased expression of CRY1 (Fig. 2).

2-3: 시험관내 종양구 형성2-3: in vitro tumor cell formation

상기 실시예 2-2의 세포 1000개를 20ng/ml의 EGF (Invitrogen, USA), 20ng/ml의 bFGF (Invitrogen, USA) 및 B27 (Gibco, USA)이 포함된 DMEM-F12 배지에 넣고 24 well-super-low adherence plates (Corning, USA)에서 2주간 배양하여 관찰하였다. 이때 3일마다 새로운 배지를 100㎕씩 추가해 주었다. 형성된 종양구는 광학현미경을 이용하여 사진 이미지를 획득한 후 종양구의 직경을 측정함으로서 20-50㎛ 이상의 종양구를 계수하여 정량하였다 (도 2). 1000 cells of Example 2-2 were placed in DMEM-F12 medium containing 20ng / ml of EGF (Invitrogen, USA), 20ng / ml of bFGF (Invitrogen, USA), and B27 (Gibco, USA). -Super-low adherence plates (Corning, USA) was observed by incubation for 2 weeks. At this time, 100 μl of fresh medium was added every 3 days. The formed tumor cells were quantified by counting tumor spheres of 20-50 μm or more by measuring diameters of the tumor spheres after acquiring photographic images using an optical microscope (FIG. 2).

그 결과, 항암면역 내성 CaSki P3 세포에서 CRY1 발현 억제가 종양구 형성능을 감소시키는 것을 확인하였다 (도 2). As a result, it was confirmed that suppression of CRY1 expression in tumor-resistant CaSki P3 cells reduced tumor cell formation ability (FIG. 2).

2-4: CRY1 억제에 따른 면역내성 변화 확인2-4: Confirmation of Changes in Immune Tolerance Following CRY1 Inhibition

상기 실시예 2-2의 방법으로 얻어진 CRY1 발현 억제된 세포를 이용하여 항암면역 내성 변화 실험을 수행하였다. CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)를 이용하여 CaSki P0, CaSki P3 세포주에 표식한 후, 1ug/ml의 E7 peptide(아미노산 번호 49-57, RAHYNIVTF: 서열번호 10)를 1시간 동안 자극을 준 후 E7 특이적인 CTL(cytotoxic T-lymphocyte)을 1:1 비율로 섞어준 후 CFSE 표식이 된 CaSki P0, CaSki P3 세포주에서의 활성 카스파제-3(active caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다. The anti-cancer immunity change experiment was performed using CRY1 expression-inhibited cells obtained by the method of Example 2-2. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) was used to label CaSki P0 and CaSki P3 cell lines, followed by stimulation of 1ug / ml of E7 peptide (amino acids 49-57, RAHYNIVTF: SEQ ID NO: 10) for 1 hour. After mixing CTL (cytotoxic T-lymphocyte) in a 1: 1 ratio, active caspase-3 in CaSki P0 and CaSki P3 cell lines labeled with CFSE was observed through FACS.

그 결과, 항암면역 내성 CaSki P3 세포에서 CRY1 발현 억제가 항암면역 민감성을 증가시키는 것을 확인하였다 (도 2). As a result, it was confirmed that the inhibition of CRY1 expression in the anticancer immune resistant CaSki P3 cells increases the anticancer immune sensitivity (FIG. 2).

실시예 3: NANOG를 발현하는 CaSki 세포주 제조Example 3: Preparation of CaSki Cell Line Expressing NANOG

대한민국 공개특허 10-2012-0083504에서 제작한 pMSCV-NANOG 벡터와 리포좀 제제인 리포펙타민 2000 (lipofectamin 2000, Invitrogen, USA)을 질량비 1:2로 섞어 패키징 (packaging) 세포주인 피닉스 세포 (Clontech)에 처리하였다. 24시간 배양 후 퓨로마이신 (Invitrogen, USA)이 포함된 배양액으로 형질전환된 피닉스 세포를 선별하였다. 선별된 세포들은 3-4일간 배양하여 레트로 바이러스가 포함된 세포배양액을 확보한 후, amicon ultra-15 (millipore, USA)을 이용하여 농축하였다. 최종 배양 농축액 500㎕와 폴리브렌 (Polybrene, Sigma)을 혼합한 혼합액을 인간 자궁경부암 세포주인 CaSki 세포주에 처리하여 형질도입시킴으로서 NANOG를 발현하는 CaSki-NANOG 세포주를 제조하였다.The pMSCV-NANOG vector and liposome preparation (lipofectamin 2000, Invitrogen, USA) prepared in Korean Patent Application Publication No. 10-2012-0083504 were mixed in a mass ratio of 1: 2 to the packaging cell line Phoenix cell (Clontech). Treated. After 24 hours of culture, transformed Phoenix cells were selected with a culture solution containing puromycin (Invitrogen, USA). Selected cells were cultured for 3-4 days to obtain a cell culture medium containing retrovirus, and then concentrated using amicon ultra-15 (millipore, USA). CaSki-NANOG cell line expressing NANOG was prepared by transducing a mixed solution of 500 μl of the final culture concentrate and polybrene (Polybrene, Sigma) to CaSki cell line, a human cervical cancer cell line.

실시예 4: CRY1 프로모터에 결합하는 NANOG의 전사활성 확인Example 4 Confirmation of Transcription Activity of NANOG Binding to CRY1 Promoter

HEK293 세포를 10 % FBS가 함유 된 세포배양 배지로 유지시키고, 분석하기 1일 전에 12-well plate에 105 cells/well을 적응시켰다. 리포터 벡터, pGL3-basic, pGL3-CRY1 Wt, GL3-CRY1 Mut와 함께 NANOG Wt, NANOG Mut를 각각 동시에 과발현시켰다. 또한 이와 동시에 모든 샘플에 transfection 효율을 확인하기 위한 대조 벡터 pCMV-β-Gal도 함께 리포펙타민 2000을 사용하여 HEK293 세포로 공동 형질 감염시켰다. 24 시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 Cell Culture Lysis Reagent (Promega, USA)로 용해시켰다. 루시퍼 라제 활성은 40㎕의 루시퍼라아제 분석 시약 (Promega, USA)을 첨가 한 후 Turner Biosystems TD-20 / 20 루미넌스로 측정 하였다. β- 갈락토시다아제 활성은 1 mM 클로로 페놀 레드 β-D- 갈락토피라노사이드 기질 (Roche)을 함유하는 β- 갈락토시다아제 측정 시약의 첨가 후 570 nm 파장에서 uQuant 마이크로 플레이트 판독기 (BioTek, Winooski, VT)로 측정 하였다. 상대적인 루시퍼라아제 활성은 세포 용해물의 β- 갈락토시다아제 활성으로 표준화시켰다.HEK293 cells were maintained in cell culture medium containing 10% FBS and 10 5 cells / well were adapted to 12-well plates 1 day prior to analysis. NANOG Wt and NANOG Mut were overexpressed simultaneously with the reporter vector, pGL3-basic, pGL3-CRY1 Wt and GL3-CRY1 Mut. At the same time, all samples were co-transfected with HEK293 cells using lipofectamine 2000 with control vector pCMV-β-Gal to confirm transfection efficiency. After 24 hours, cells were washed with PBS and lysed with Cell Culture Lysis Reagent (Promega, USA). Luciferase activity was measured by Turner Biosystems TD-20 / 20 luminance after addition of 40 μL luciferase assay reagent (Promega, USA). β-galactosidase activity was determined by uQuant microplate reader (BioTek) at 570 nm wavelength after addition of the β-galactosidase measurement reagent containing 1 mM chlorophenol red β-D-galactopyranoside substrate (Roche). , Winooski, VT). Relative luciferase activity was normalized to β-galactosidase activity of cell lysates.

그 결과, NANOG의 전사활성 의존적으로 CRY1 단백질의 발현 증가, CRY1 mRNA 발현 증가는 CRY1 프로모터에서 NANOG 결합부위가 존재하며, NANOG의 전사활성 의존적으로 CRY1 프로모터 활성의 증가 및 CRY1 프로모터에서 NANOG 단백질이 직접 결합하고 있음을 확인한 것이다 (도 4).As a result, the expression of CRY1 protein and the expression of CRY1 mRNA increased depending on the transcriptional activity of NANOG, and there was NANOG binding site in the CRY1 promoter, and the increase of CRY1 promoter activity and NANOG protein in CRY1 promoter were directly dependent on the transcriptional activity of NANOG. It is confirmed that the (Fig. 4).

실시예 5: 항암면역 내성암에서 CRY1 저해제, KS15의 항암면역 내성 억제 기능 확인Example 5: Confirmation of the anti-cancer immune resistance inhibitory effect of CRY1 inhibitor, KS15 in anti-cancer immune cancer

모암세포 (CaSki P0)와 항암면역 내성암세포 (CaSki P3)를 비롯하여 실시예 3-1을 통해서 얻어진 세포들을 세포배양용 96-웰 플레이트에 각각 5000개씩 접종하였다. 12시간 배양 후 CRY1 저해제, KS15를 0, 50, 100uM의 농도로 72시간 동안 처리하였다. 각각의 세포 생존률은 MTT 분석법을 이용하여 측정하였다.Cells obtained through Example 3-1, including the mother cancer cells (CaSki P0) and the anticancer immune resistant cancer cells (CaSki P3), were inoculated with 5000 cells in 96-well plates for cell culture. After 12 hours of incubation, the CRY1 inhibitor, KS15, was treated for 72 hours at concentrations of 0, 50, and 100 uM. Each cell viability was measured using the MTT assay.

그 결과, 모암 세포주 (CaSki P0)에 비하여 항암면역 내성암 세포주 (CaSki P3)가 CRY1 저해제에 대해 세포 성장 민감도가 높음을 확인하였고, 동시에 NANOG 과발현된 세포에서도 CRY1 저해제에 대한 민감도가 높음을 확인하였다 (도 5). As a result, it was confirmed that the anticancer immunity-resistant cancer cell line (CaSki P3) had higher cell growth sensitivity to the CRY1 inhibitor than the cancer cell line (CaSki P0), and at the same time, the sensitivity to the CRY1 inhibitor was also high in NANOG overexpressed cells. (FIG. 5).

실시예 6: CRY1 저해제, KS15에 따른 면역내성 변화 확인Example 6: Confirmation of changes in immunoresistant according to CRY1 inhibitor, KS15

모암세포 (CaSki P0)와 항암면역 내성암세포 (CaSki P3)에 CRY1 저해제, KS15의 sublethal dose인 10uM을 처리 한 후 항암면역 내성 변화 실험을 수행하였다. CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)를 이용하여 CaSki P0, CaSki P3 세포주에 표식한 후, 1ug/ml의 E7 peptide(아미노산 번호 49-57, RAHYNIVTF: 서열번호 10)를 1시간 동안 자극을 준 후 E7 특이적인 CTL(cytotoxic T-lymphocyte)을 1:1 비율로 섞어준 후 CFSE 표식이 된 CaSki P0, CaSki P3 세포주에서의 활성 카스파제-3(active caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다. Changes in anticancer immunity were performed after treatment with CRY1 inhibitor and KS15 sublethal dose of 10 μM to blast cancer cells (CaSki P0) and anticancer immune resistant cancer cells (CaSki P3). Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) was used to label CaSki P0 and CaSki P3 cell lines, followed by stimulation of 1ug / ml of E7 peptide (amino acids 49-57, RAHYNIVTF: SEQ ID NO: 10) for 1 hour. After mixing CTL (cytotoxic T-lymphocyte) in a 1: 1 ratio, active caspase-3 in CaSki P0 and CaSki P3 cell lines labeled with CFSE was observed through FACS.

그 결과, 항암면역 내성 CaSki P3 세포주에서 CRY1 저해제, KS15와 면역치료를 병용하였을 때 모암세포주인 CaSki P0에 비해서 높은 민감성을 확인한 것이다 (도 6).As a result, the combination of CRY1 inhibitor, KS15 and immunotherapy in the anti-cancer immune resistant CaSki P3 cell line confirmed higher sensitivity compared to CaSki P0, the cancer cell line (FIG. 6).

실시예 7: NANOG 과발현된 다양한 암종에서 CRY1 저해제, KS15에 따른 면역내성 변화 확인Example 7 Identification of Changes in Immune Tolerance According to CRY1 Inhibitor, KS15 in NANOG Overexpressed Various Carcinomas

NANOG가 과발현된 자궁경부암 CaSki 세포주를 비롯하여 항암면역 내성 유방암 세포인 MDA-MB231 P3 세포주, 자연적으로 NANOG가 과발현되어 있는 자궁경부암 세포인 SiHa 및 자연적으로 NANOG가 과발현되어 있는 대장암 세포인 HCT116 세포주에 CRY1 저해제, KS15의 sublethal dose인 10uM을 처리 한 후 항암면역 내성 변화 실험을 수행하였다. CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)를 이용하여 CaSki P0, CaSki P3 세포주에 표식한 후, 1ug/ml의 E7 peptide(아미노산 번호 49-57, RAHYNIVTF: 서열번호 10)를 1시간 동안 자극을 준 후 E7 특이적인 CTL(cytotoxic T-lymphocyte)을 1:1 비율로 섞어준 후 CFSE 표식이 된 CaSki P0, CaSki P3 세포주에서의 활성 카스파제-3(active caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다. CRY1 in the cervical cancer CaSki cell line overexpressing NANOG, MDA-MB231 P3 cell line, an anti-cancer immune resistant breast cancer cell, SiHa, which is naturally overexpressed NANOG, and HCT116 cell line, which is naturally overexpressed NANOG. Anti-cancer immunity change experiments were performed after treatment with 10 uM sublethal dose of inhibitor, KS15. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) was used to label CaSki P0 and CaSki P3 cell lines, followed by stimulation of 1ug / ml of E7 peptide (amino acids 49-57, RAHYNIVTF: SEQ ID NO: 10) for 1 hour. After mixing CTL (cytotoxic T-lymphocyte) in a 1: 1 ratio, active caspase-3 in CaSki P0 and CaSki P3 cell lines labeled with CFSE was observed through FACS.

그 결과, NANOG가 과발현되어 있는 다양한 암종에서 모두 CRY1 저해제, KS15와 면역치료를 병용하였을 때 합성화합물 농도 의존적으로 민감도가 증가하는 것을 확인한 것이다 (도 7). As a result, it was confirmed that the sensitivity increases depending on the synthetic compound concentration when combined with CRY1 inhibitor, KS15 and immunotherapy in all the various carcinomas overexpressing NANOG (Fig. 7).

실시예 8: CRY1 저해제, KS15에 의한 생체내 항암면역 내성 무력화 확인Example 8: Confirmation of neutralizing in vivo anticancer immunity by CRY1 inhibitor, KS15

MDA-MB231 P3 세포를 NOD-SCID생쥐군 (암컷, 5주령, n=5, 중앙실험동물) 각각의 복부 표피에 2 X 106개씩 주입하고, 주입 7일째에 KS15 (0.01mg/kg) 또는 DMSO를 포함하는 열감응성 키토산 하이드로겔을 종양 내로 주입하였다. 저해제 주입 후 다음 날 2 × 106 MART-1-specific T세포를 IL-2와 함께 정맥주사하여 면역하였다. 7일 간격으로 동일 세트를 진행하였고 3회 반복하였다. 각각의 생쥐에 대하여 종양체적을 캘리버 (caliber; Mitutoyo, Japan)로 측정하여, 종양체적은 (단축x장축2)/2의 식으로 구하였다.MDA-MB231 P3 cells were injected 2 x 10 6 into the ventral epidermis of each NOD-SCID mouse group (female, 5 weeks old, n = 5, central experimental animals) and KS15 (0.01 mg / kg) or 7 days after infusion. Thermosensitive chitosan hydrogels containing DMSO were injected into the tumor. 2 x 10 6 MART-1-specific T cells were immunized intravenously with IL-2 the next day after inhibitor injection. The same set was run at 7 day intervals and repeated 3 times. For each mouse, the tumor volume was measured by caliber (Mitutoyo, Japan), and the tumor volume was calculated by the formula of (short axis x long axis 2) / 2.

그 결과, CRY1 억제 합성화합물과 CD8+ T 세포를 이용한 면역치료를 병행한 결과 종양 형성이 감소함을 확인한 것이다 (도 8). As a result, it was confirmed that tumor formation was reduced as a result of the combination of immunotherapy using CRY1 inhibitory compound and CD8 + T cells (FIG. 8).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.The specific parts of the present invention have been described in detail above, and it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Use of CRY1 for Treating or Diagnosing NANOG-mediated Diseases <130> P17-B216 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 1 <400> 1 caaccgcctc taacttata 19 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 2 <400> 2 agctattaag aaactggcaa ctgaa 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 3 <400> 3 gaagctggag tagaagtcat tgtaa 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 4 <400> 4 gagataccag tagagacaat tactt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 5 <400> 5 caagccctac tggacttagt cctta 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1 primer <400> 6 ttggaaagga acgagacgca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS1 primer <400> 7 agttagaggc ggttgtccac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S2 primer <400> 8 tgggaatgga ggcttcatgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS2 primer <400> 9 acgtttccca ccactgagac 20 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E7 peptide <400> 10 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> Use of CRY1 for Treating or Diagnosing NANOG-mediated Diseases <130> P17-B216 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 1 <400> 1 caaccgcctc taacttata 19 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 2 <400> 2 agctattaag aaactggcaa ctgaa 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 3 <400> 3 gaagctggag tagaagtcat tgtaa 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 4 <400> 4 gagataccag tagagacaat tactt 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA 5 <400> 5 caagccctac tggacttagt cctta 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> S223 primer <400> 6 ttggaaagga acgagacgca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS1 primer <400> 7 agttagaggc ggttgtccac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> S223 primer <400> 8 tgggaatgga ggcttcatgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AS2 primer <400> 9 acgtttccca ccactgagac 20 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E7 peptide <400> 10 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe   1 5

Claims (12)

CRY1 (cryptochrome 1)의 발현 또는 활성 저해제를 유효성분으로 함유하는 NANOG 의존적 내성암의 예방 또는 치료용 조성물.
A composition for preventing or treating NANOG dependent resistant cancer containing CRY1 (cryptochrome 1) expression or activity inhibitor as an active ingredient.
제1항에 있어서, 상기 발현 또는 활성 저해제는 CRY1 유전자에 대한 siRNA 또는 CRY1 단백질과 특이적으로 결합하는 항체, 압타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 1, wherein the expression or activity inhibitor is an antibody, aptamer or compound that specifically binds to siRNA or CRY1 protein for the CRY1 gene.
제2항에 있어서, 상기 화합물은 2-에톡시프로피온산 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 2 wherein the compound is a 2-ethoxypropionic acid derivative.
제1항에 있어서, 면역치료제와 병용하여 사용하는 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 조성물.
The composition according to claim 1, which is used in combination with an immunotherapeutic agent.
제1항에 있어서, 상기 내성암은 항암제 또는 항암면역 내성암인 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 1, wherein the resistant cancer is an anticancer agent or an anticancer immune cancer.
CRY1 유전자와 엄격한 조건에서 혼성할 수 있는 프로브 또는 CRY1 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 NANOG 의존적 내성암의 진단용 키트.
A kit for diagnosing NANOG dependent resistant cancer, comprising a probe capable of hybridizing with CRY1 gene under severe conditions or a primer capable of amplifying CRY1 gene.
제6항에 있어서, 상기 내성암은 항암제 또는 항암면역 내성암인 것을 특징으로 하는 키트.
The kit of claim 6, wherein the resistant cancer is an anticancer agent or an anticancer immune resistant cancer.
다음 단계를 포함하는 NANOG 의존적 내성암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
(a) 분리된 생물학적 시료로부터 CRY1 유전자의 mRNA 수준 또는 CRY1 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 CRY1 유전자의 mRNA 수준 또는 CRY1 단백질 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계.
How to provide information for diagnosis of NANOG dependent resistant cancer, including the following steps:
(a) measuring the mRNA level or CRY1 protein level of the CRY1 gene from the isolated biological sample; And
(b) comparing the measured mRNA level or CRY1 protein level of the CRY1 gene with a control sample.
제8항에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 CRY1 유전자의 mRNA 수준 또는 CRY1 단백질 수준이 증가하는 경우, NANOG 의존적 내성암으로 판단하는 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법.
The method of claim 8, wherein the step (b) is determined as NANOG dependent resistant cancer when the mRNA level or CRY1 protein level of the CRY1 gene is increased compared to the control group.
제8항에 있어서, 상기 내성암은 항암제 또는 항암면역 내성암인 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법.
The method of claim 8, wherein the resistant cancer is an anticancer agent or an anticancer immune resistant cancer.
제8항에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법.
The method of claim 8, wherein the sample is selected from the group consisting of tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid, sweat, urine, ascites fluid and peritoneal fluid.
제8항에 있어서, 상기 측정은 면역블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질칩으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 정보를 제공하는 방법.
According to claim 8, The measurement is immunoblot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunity staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip Method for providing information, characterized in that using any one selected from the group consisting of.
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