KR101491109B1 - Composition for prevention or treating recurrent or metastatic cancer having immunoresistance - Google Patents

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Abstract

본 발명은 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 저해제를 포함하고, 상기 저해제는 siRNA, 안티센스-올리고뉴클레오티드, shRNAi, miRNA 또는 이들을 하나를 포함하는 벡터, 또는 항체인 것을 특징으로 하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물 및 NANOG를 과발현하는 세포주를 이용한 항암제 스크리닝 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 병리적 마커로서 NANOG 유전자를 항암면역내성암의 재발 및 전이의 진단, 억제, 경감 등에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제의 스크리닝에 사용할 수 있어 암에 대한 효과적인 치료제를 개발할 수 있을 것으로 기대된다. The present invention includes an inhibitor for one or more genes or proteins selected from the group consisting of NANOG, T cell lecukemia / Lymphoma 1, AKT and Myeloid cell leukemia sequence 1 (MCL1), wherein the inhibitor is siRNA, antisense- A shRNAi, a miRNA, a vector containing one of these, or an antibody, and a composition for preventing or treating recurrence and metastasis of anti-cancer immune tolerable cancer, and an anticancer agent screening composition using the cell line overexpressing NANOG. According to the present invention, as a pathological marker, the NANOG gene can be used for diagnosing, inhibiting or alleviating recurrence and metastasis of anti-cancer immunostaining cancer, as well as for screening of recurrence and metastatic therapeutic agent of anti-cancer immunostaining cancer. It is expected to develop an effective therapeutic agent.

Description

면역내성암의 재발 및 암전이 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treating recurrent or metastatic cancer having immunoresistance}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a composition for prevention or treatment of recurrence of metastatic cancer and metastatic cancer having immunoresistance,

본 발명은 면역내성암의 재발 및 암전이 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 면역 요법 등의 항암치료에 대해 내성이 생긴 암, 그리고 면역 요법 등의 항암치료 후 재발 또는 전이가 일어난 암들의 치료를 위한 병리적 마커로서 NANOG/TCL-1/AKT/MCL-1 분자 축을 선별한 것으로 항암면역에 대해 내성을 가지는 암에서 관측되는 암의 재발 및 전이를 진단하고 나아가 NANOG/TCL1/AKT/MCL-1의 항암면역내성획득 관련 분자 축을 표적화함으로서 효과적으로 항암면역내성암을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for preventing or treating recurrence of metastatic cancer and cancer metastasis. More particularly, the present invention relates to a method for the treatment of cancers resistant to chemotherapy, such as immunotherapy, and cancer associated with recurrence or metastasis following chemotherapy, such as immunotherapy, as NANOG / TCL-1 / AKT / MCL-1 Molecular axis is selected to diagnose cancer recurrence and metastasis observed in cancer resistant to anti-cancer immunity and further to target the molecular axis related to acquisition of anti-cancer immunity of NANOG / TCL1 / AKT / MCL-1. To a composition capable of preventing or treating tolerance to cancer.

대한민국 통계청의 분석에 따르면 암은 대한민국의 제1의 사망원인으로 남성이 31.7%, 여성이 22.5%를 차지하며 전체 인구의 31.7%가 암으로 사망한다.According to the statistics of the Korea National Statistical Office, cancer accounts for 31.7% of males and 22.5% of females as the first cause of death in Korea, and 31.7% of the total population die from cancer.

우리의 몸은 아주 작은 세포들로 이루어져 있으며, 스스로 증식 또는 사멸하거나 유전적 이상을 가지고 있는 비정상세포들을 면역감시체계(immune surveillance)를 통해 제거함으로써 몸의 항상성을 유지한다. 하지만 많은 유전자의 이상이 중첩되었을 경우 세포는 증식과 사멸을 유지하는 항상성을 잃고 비정상적인 세포 증식이 유도되어 암으로 발전한다. 따라서 암은 유전자의 이상이 중첩되어 면역세포에 의한 사멸을 회피함으로써 발생하는 면역학적 질환이며, 오랜 시간 동안 이상이 중첩되어 발생되는 만성적인 질환이라고 할 수 있다.Our body is made up of very small cells and maintains body homeostasis by removing abnormal cells that grow or die by themselves or have genetic abnormalities through immune surveillance. However, when many abnormalities of genes are overlapped, cells lose homeostasis that maintains proliferation and death, induces abnormal cell proliferation, and develops into cancer. Therefore, cancer is an immunological disease caused by overlapping of gene abnormalities and avoiding death by immune cells, and it can be said that it is a chronic disease that is caused by superposition over a long period of time.

암은 양성종양(benign tumor)과 악성종양(malignant tumor)으로 구분되어지는데, 양성종양은 비교적 성장속도가 느리고 종양의 원발생 부위에서 다른 조직으로 이동되어지는 전이(metastasis)가 되지 않는 것에 반해 악성종양은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤되어 빠르게 성장하는 특징을 가짐으로써 생명을 위협하며 사망에 이르는 아주 중요한 원인이 된다.Cancer is divided into benign tumors and malignant tumors. Benign tumors are relatively slow to grow and do not become metastases that migrate from the origin of the tumor to other tissues, Tumor is a very important cause of death and life threatening by leaving the origin and infiltrating into other tissues and growing rapidly.

암을 치료하기 위해서는 외과적 수술로서 제거하거나, 방사선 치료법, 항암제 치료법, 면역치료법 등이 있으나 많은 연구에도 불구하고 암환자 전체의 50% 이상이 결국 치유되지 못하고 사망한다고 보고된다. 그에 따른 이유는 외과적으로 절제를 하였다 하여도 미세하게 전이된 암세포를 제거하지 못하여 암이 재발하거나, 다양한 항암제의 개발에도 불구하고 항암제를 이용한 암 치료 시 항암제에 대해 암세포가 사멸이 유도되지 않거나 초기에는 반응을 보여 종양이 줄어드는 듯 보이지만 치료도중이나 치료가 끝난 후 함암제에 대한 내성이 생긴 암세포들이 급격히 증식하기 때문이다. 또한, 방사선 치료도 암세포 방사선에 대한 내성을 나타내게 되어 완치가 어렵다. 항암면역치료는 암 특이 항원 또는 암 관련 항원을 이용한 면역 반응을 유도하여 항원을 갖고 있는 암세포를 면역세포를 이용하여 제거하는 방법으로써 부작용이 거의 없어 획기적인 암 치료방법으로 부각되고 있지만, 임상적인 실효성이 매우 미미한 상태이다. 중요한 점은 이들 항암치료에 대한 내성을 획득한 암들은 공통적으로 재발과 함께 암전이가 현저히 증가하는 경향을 가진다는 점이다. 따라서 보다 나은 암 치료를 위해서는 항암제와 방사선 치료를 포함한 면역치료 요법에 대한 암세포의 내성을 극복하는 연구가 필요하며, 동시에 관련 내성유전자의 규명이 매우 필요하다. 또한 규명된 유전자를 표적화하는 암 치료방법이 연구되어야 하며, 암을 초기에 진단하여 빠른 암 치료에 따른 환자의 삶의 질 향상이 절실히 요구되고 있다. In order to treat cancer, it is removed as a surgical operation, radiation therapy, chemotherapy, immunotherapy, etc. However, in spite of many studies, more than 50% of all cancer patients are reported to die without healing. The reason for this is that despite the surgical resection, even if cancer is recurred due to the failure to remove the metastasized cancer cells, or when various cancer drugs have been developed, the cancer cells are not killed or the cancer cells are killed , The tumor seems to be shrinking, but cancer cells that develop resistance to the cancer drug after treatment or treatment are rapidly multiplying. In addition, radiation therapy is also resistant to cancer cell radiation, making it difficult to cure. Anti-cancer immunotherapy is a method of removing cancer cells that have an antigen by using immune cells by inducing an immune response using a cancer-specific antigen or a cancer-associated antigen, and it has been regarded as an epoch-making cancer treatment method since there is no side effect. It is a very small state. It is important to note that cancer that has acquired resistance to these chemotherapeutic therapies has a tendency to significantly increase cancer metastasis with recurrence in common. Therefore, for better cancer treatment, studies to overcome resistance of cancer cells to immunotherapy including chemotherapy and radiotherapy are needed, and at the same time, identification of related resistance genes is highly needed. In addition, cancer treatment methods to target the identified genes should be studied, and improvement of the quality of life of patients due to early cancer treatment is urgently required.

한편, NANOG는 다능성 세포의 유지에 필요한 인자 중에 하나로써 배아줄기세포에서 발현되었다. NANOG단백질의 작용기전에 대한 연구는 현재 완전히 밝혀지진 않았으나 OCT4, SOX2와 같은 전사인자들과 함께 작용하며, NF-kB의 전자활성을 억제하고 STAT3와 협동하여 줄기세포의 특성유지를 한다는 보고들이 되어 있다. 뿐만 아니라 최근 몇몇 논문에서 NANOG의 발현이 배아줄기세포뿐만 아니라 여러 암종에서도 그 발현이 증가 된다는 내용이 보고되고 있으나(Jeter CR et al. Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development. Stem Cells. 2009;27(5):993-1005) 항암면역내성과 관련된 보고는 없고 특히 이러한 NANOG의 증가가 항암면역내성암의 재발 및 전이와 관련되었다는 보고는 전무하다. On the other hand, NANOG was expressed in embryonic stem cells as one of the factors required for maintenance of pluripotent cells. Studies on the function of NANOG proteins have not yet been completely elucidated, but they have been reported to work with transcription factors such as OCT4 and SOX2, inhibit the NF-kB electrophoretic activity, and maintain the characteristics of stem cells in cooperation with STAT3 . In addition, in recent studies, it has been reported that NANOG expression is increased not only in embryonic stem cells but also in various carcinomas (Jeter CR et al.) Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development Stem Cells There is no report that the increase of NANOG is associated with the recurrence and metastasis of the cancer.

본 발명의 배경이 되는 기술로는, 대한민국 공개 특허 10-2010-0115254에 아피시딘을 포함하는 미분화함 치료용 조성물 및 줄기세포성을 나타내는 유전자인 Nanog, Oct4, 또는 Sox2의 발현을 확인함으로써 아피시딘 병용투여제 스크리닝 하는 방법이 공개되어 있다.
As a background of the present invention, Korean Patent Laid-Open No. 10-2010-0115254 discloses a composition for treating undifferentiated cells comprising apicidin and an expression of Nanog, Oct4, or Sox2, which is a gene showing stem cell characteristics, A method for screening a coadministered administra- tion agent is disclosed.

그러나, 항암면역내성을 획득한 종양세포에서 증가된 NANOG가 면역내성획득에 필수적인 분자이며, 이때 NANOG가 AKT 활성화 인자인 TCL1을 직접적으로 전사조절하여 유전자 발현을 증가시키고, 증가된 TCL-1에 의한 AKT 활성화는 항세포자멸 인자인 MCL-1의 발현을 증가시킴으로서 항암면역 내성을 획득하는 NANOG/TCL1/AKT/MCL-1의 항암면역내성획득 관련 분자 축이 실재함이 확인된 적이 없으며, 이를 이용하여 면역 요법 등의 항암치료 후 재발된 암, 내성이 생긴 암, 또는 암전이 치료를 위한 병리적 마커로서 진단에 활용하고 나아가 NANOG/TCL1/AKT/MCL-1의 항암면역내성 관련 분자 축을 표적화함으로서 효과적으로 항암면역내성암을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관해서 알려진 바도 없다.
However, NANOG, which is increased in tumor cells that acquired anti-cancer immunity, is an essential molecule for acquiring immune tolerance. In this case, NANOG directly regulates transcriptional regulation of AKT activator, TCL1, Activation of AKT has not been confirmed to have the molecular axis related to the acquisition of the anti-cancer immunity of NANOG / TCL1 / AKT / MCL-1, which obtains the anti-cancer immunity resistance by increasing the expression of MCL-1, an anti-apoptotic factor. The aim of this study was to investigate the role of NANOG / TCL1 / AKT / MCL-1 in the diagnosis of cancer, recurrence of cancer after immunotherapy, There are no known compositions capable of effectively preventing or treating cancer of the anticancer immune system.

대한민국 공개 특허 10-2010-0115254(2010.10.27)Korean Patent Publication No. 10-2010-0115254 (Oct. 27, 2010)

노경희, 항암면역에 내성을 갖는 종양에서의 AKT의 역할, 2007.Roh, Kyung - Hee, Role of AKT in tumor resistant to anti - cancer immunity, 2007. Jeter CR et al. Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development. Stem Cells. 2009;27(5):993-1005Jeter CR et al. Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development. Stem Cells. 2009; 27 (5): 993-1005

본 발명의 목적은 면역 요법 등의 항암치료에 대해 내성이 생긴 암, 그리고 면역 요법 등의 항암치료 후 재발 또는 전이가 일어난 암에 대한 병리적 마커로 사람의 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 또는 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)으로 이루어진 항암면역내성 획득관련 유전자를 사용하여 항암면역내성암의 재발 및 전이를 치료할 수 있는 약제학적 용도를 제공하고자 한다.It is an object of the present invention to provide a pathological marker for a cancer resistant to chemotherapy such as immunotherapy and cancer which has recurred or metastasized after chemotherapy such as immunotherapy, and is useful as a marker for NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1 ), AKT, or MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1), and to provide a pharmaceutical use for treating the recurrence and metastasis of cancer cells with anti-cancer immunity.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 저해제를 포함하고, According to one aspect of the present invention, the present invention provides an inhibitor for one or more genes or proteins selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1)

바람직하게, 상기 저해제는 siRNA, 안티센스-올리고뉴클레오티드, shRNAi, miRNA 또는 이들을 하나를 포함하는 벡터, 또는 항체인 것을 특징으로 하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
Preferably, the inhibitor is siRNA, antisense-oligonucleotide, shRNAi, miRNA or a vector comprising one of these, or an antibody, or a composition for preventing or treating recurrence and metastasis of the anti-cancer immune tolerable cancer.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting an expression of at least one selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) And a composition for diagnosing recurrence and metastasis of cancerous cancer.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for the treatment of anti-cancer immunosuppressive agents comprising one or more genes selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) A composition for screening recurring and metastatic therapeutic agents.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 발현하는 세포주를 포함하는 조성물에 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 According to another aspect of the present invention, there is provided a composition comprising a cell line expressing at least one selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) Treating the recurrence and metastatic candidate agent of cancer-resistant immune system; And

상기 후보물질이 처리된 세포주(실험군) 내의 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 또는 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)의 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
Measuring the expression level of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT or MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) in the cell line treated with the candidate substance (experimental group) And a method of screening for a metastatic therapeutic agent.

상술한 바와 같은 본 발명에 의하면 면역 요법 등의 항암치료에 대해 내성이 생긴 암, 그리고 면역 요법 등의 항암치료 후 재발 또는 전이가 일어난 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 즉, 병리적 마커로서 새로운 Nanog/Tcl1/pAkt/Mcl1 면역내성 분자 축을 이용함으로서 면역내성암, 재발암 및 전이성 암의 진단, 억제, 경감 등에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제의 스크리닝에 사용할 수 있어 암에 대한 효과적인 치료제를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
As described above, according to the present invention, cancers that have resistance to chemotherapy such as immunotherapy and cancers that have recurred or metastasized after chemotherapy such as immunotherapy can be effectively prevented or treated. By using the new Nanog / Tcl1 / pAkt / Mcl1 immunoregulatory molecular axis as a pathological marker, it can be used for diagnosis, inhibition, and alleviation of immunosuppressive cancer, recurrent cancer and metastatic cancer. In addition, And can be used for the screening of cancer.

도 1은 다양한 인간 암종의 세포주들에서 본 발명의 인간 NANOG 단백질의 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 인간 자궁경부암의 진행 단계에 따른 본 발명의 인간 Nanog/Tcl1/pAkt 단백질의 암의 진행에 따른 발현 지수(A와 B)와 생존율(C)을 나타낸 결과이다.
도 3은 항암면역내성 TC-1 P3 세포주에서 NANOG 단백질의 발현을 확인한 결과이다. (A) 웨스턴 블랏, (B) 면역현광염색 왼쪽: 현광이미지 오른쪽: Nanog 발현 (Nanog +) 세포 백분율.
도 4는 항암면역내성 TC-1 P3 세포주와 면역내성이 없는 모세포 TC-1 P0 세포주에서 세포의 증식(A)과 세포주기(B) 및 세포주기 관련 단백질의 발현(C)을 확인한 결과이다.
도 5는 항암면역내성 TC-1 P3 세포주와 면역내성이 없는 모세포 TC-1 P0 세포주의 시험관내(A: 시험관 내 종양구 형성능 확인) 그리고 생체내 종양형성능(B와 C: 주입된 세포수에 따른 종양형성)을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 NANOG 의존적 세포증식 및 세포구 형성능을 나타낸 것이다. 항암면역내성 TC-1 P3 세포주에서 NANOG의 발현 저하 시 세포증식 감소(A), 세포주기의 변화, 세포주기 관련 인자 CyclinA의 발현 감소(B) 및 시험관 내 종양구 형성 감소를 확인하였다. 반대로 면역내성이 없는 모세포 TC-1 P0 세포주에 Nanog의 발현을 유도하였을 때 세포증식 증가(D), 세포주기의 변화, 세포주기 관련 인자 CyclinA의 발현 증가(E) 및 시험관 내 종양구 형성 증가를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 NANOG를 과발현하는 암세포주(TC-1/NANOG)를 이용하여 NANOG의 항암면역에 대한 내성 유도를 확인한 결과이다. NANOG 발현에 의한 세포독성인자인 Granzyme B 유도 세포자멸사에 대한 내성 증가(A) 및 E7 항원특이적인 세포독성세포(E7 CTL) 매개 세포자멸사에 대한 내성 증가(B) 그리고 E7 항원특이적인 세포독세포의 정맥주사 후 NANOG 과발현 종양의 생체 내 항암면역내성 증가 확인(C)한 결과이다.
도 8은 본 발명의 NANOG의 발현 증가가 항암면역을 통해 나타난 것임을 확인하는 결과이다. 항원특이적인 항암면역을 유도 시에만 NANOG의 발현이 높은 암세포주들(TC-1 P1, P2, P3)이 선택됨을 확인한 결과(A-C)이다.
도 9는 본 발명의 NANOG의 발현증가가 항암면역을 통해 나타나는 것을 인간암세포에서 확인한 결과이다. 본 발명에 사용된 CaSki Db의 면역선택 과정 묘사 (A), 면역선별 과정이 증가함에 따라서 면역내성이 증가함을 확인한 결과(B), 이때 면역선별 횟수가 증가함에 따라서 Nanog 발현 세포의 백분율이 증가함을 확인한 결과(C)이다.
도 10은 항암면역내성을 획득한 인간 자궁경부암 세포주(CaSki Db P3)에서 시험관내(A-C) 뿐만 아니라 생체내(D와 E)에서 종양형성능이 증가됨을 확인한 결과이다.
도 11은 항암면역내성을 획득한 인간 자궁경부암 세포주(CaSki Db P3)에서NANOG 표적화 siRNA를 이용한 NANOG 발현 저하 유도 시 종양형성능(A-D)과 항암면역내성 무력화(E)를 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 NANOG와 전사활성이 약화된 NANOG의 돌연변이체를 이용하여 Nanog의 전사활성 의존적인 AKT의 활성화(B), 세포주기 조절(C와 D), 종양형성능(E), 항암면역내성 (F), 그리고 항세포자멸관련 단백질 MCL-1의 발현 유도(G)와의 상관관계를 규명한 결과이다.
도 13은 본 발명의 NANOG를 과발현하는 인간 자궁경부암에서 AKT의 활성화 기전을 무력화(AKT 화학저해제 (A-C), AKT 표적화 siRNA (D-F))시켰을 때 종양형성능(B와 E)과 항암면역내성(C와 F)을 조사한 결과이다.
도 14는 본 발명의 NANOG를 과발현하는 인간 자궁경부암에서 Nanog 의존적인 Tcl1a의 발현(A) 및 TCL1A에 의한 pAkt와 CyclinA 및 Mcl-1의 발현 조절(B) 및 Nanog 매개 종양형성능(C: 세포증식, D:시험관 내 종양구 형성)과 항암면역내성 조절(E)을 조사한 결과이다.
도 15는 본 발명의 NANOG가 TCL1A의 promoter-938~-721부분에 물리적으로 결합하여 전사를 조절할 수 있는 것을 조사한 결과이다.
도 16은 본 발명의 NANOG를 키토산 나노파티클을 이용하여 siRNA NANOG를 생체 내 전달 시 Nanog의 발현이 높은 인간 대장암세포주인 HCT116 SCTE7의 종양의 면역내성 감소로 인한 종양체적의 감소를 확인한 결과이다. 이러한 결과는 NANOG는 인간암의 면역치료 시 좋은 표적 분자로서 활용될 수 있음을 실증하는 것이다.
도 17은 본 발명의 NANOG를 생쥐 항암면역내성 세포주인 TC-1 P3 에서 siRNA를 이용하여 발현을 저하시킨 후 세포의 이동능(A)과 침윤능(B)을 시험관내 실험을 통해 확인한 결과이다.
도 18은 본 발명의 NANOG를 인간 항암면역내성 세포주인 CaSki/Db P3 에서 siRNA를 이용하여 발현을 저하시킨 후 세포의 이동능(B)과 침윤능(C)을 시험관내 실험을 통해 확인한 결과이다. 도 17과 18의 결과들은 NANOG가 항암면역내성암세포의 암전이에 중요한 인자로서 진단 및 표적으로 활용될 수 있음을 실증하는 것이다.
FIG. 1 shows the results of confirming the expression of the human NANOG protein of the present invention in cell lines of various human carcinomas.
FIG. 2 shows the expression ratios (A and B) and the survival rate (C) of the human Nanog / Tcl1 / pAkt protein according to the progression of human cervical cancer according to progression of cancer.
FIG. 3 shows the results of confirming the expression of NANOG protein in TC-1 P3 cell line. (A) Western blotting, (B) Immunoglobin staining Left: Glare image Right: Nanog expression (Nanog +) Cell percentage.
FIG. 4 shows cell proliferation (A), cell cycle (B), and expression of cell cycle-related protein (C) in the TC-1 P3 cell line and the immunocompetent cell line TC-1 P0.
FIG. 5 is a graph showing the results of in vitro (TC: 1 P3 cell line and TC-1 P0 cell line lacking immuno-tolerance) in vitro and in vivo (B and C: number of injected cells Tumor formation).
FIG. 6 shows the NANOG-dependent cell proliferation and cell-forming ability of the present invention. In the anti-cancer immunostimulatory TC-1 P3 cell line, the decrease in cell proliferation (A), the cell cycle, the decrease in the expression of cyclin A (B) and the decrease in in vitro tumor formation were observed upon the decrease of NANOG expression. Conversely, when Nanog expression was induced in the cell line TC-1 P0, which is not immune-resistant, cell proliferation (D), cell cycle, cell cycle factor Cyclin A (E) The result is confirmed.
FIG. 7 shows the results of confirming the resistance induction of NANOG to the anti-cancer immunity using the cancer cell line (TC-1 / NANOG) overexpressing the NANOG of the present invention. (A) increased resistance to granzyme B induced apoptosis by NANOG expression, and increased resistance to E7 CTL-mediated apoptosis (B) and E7 antigen-specific cytotoxic cells (C) after in vivo intravenous injection of NANOG overexpressing tumor.
FIG. 8 is a result of confirming that the increase of expression of NANOG of the present invention is shown through anti-cancer immunity. (TC-1 P1, P2, P3), which is highly expressed in NANOG, only when inducing antigen-specific anti-cancer immunity (AC).
FIG. 9 is a result of confirming that an increase in expression of NANOG of the present invention occurs through anticancer immunity in human cancer cells. (A) of the CaSki Db used in the present invention, (B) an increase in the immune tolerance as the immune screening process was increased, and (b) the percentage of Nanog-expressing cells was increased (C), respectively.
FIG. 10 shows the results of confirming the increase in tumor forming ability in vitro (D and E) as well as in vitro (AC) in the human cervical cancer cell line (CaSki Db P3) obtained the anti-cancer immunity.
FIG. 11 shows the results of confirming tumorigenicity (AD) and antitumor immunostaining (E) when NANOG-induced siRNA-induced degradation of NANOG expression was induced in human cervical cancer cell line (CaSki Db P3)
FIG. 12 is a graph showing changes in activation (B), cell cycle control (C and D), tumorigenicity (E), antitumor immunity (E) of the Nanog transcriptional activity-dependent AKT using the NANOG of the present invention and NANOG mutants with weak transcription activity (F), and induction of expression of anti-apoptotic protein MCL-1 (G).
FIG. 13 is a graph showing the tumorigenicity (B and E) and the anti-cancer immunity (C (D)) when the activating mechanism of AKT was neutralized (AKT chemoattractant (AC), AKT- targeted siRNA (DF)) in human cervical cancer overexpressing NANOG of the present invention And F).
14 shows the expression of Nanog-dependent Tcl1a (A) and the expression of pAkt, Cyclin A and Mcl-1 by Bcl-2 and Nanog-mediated tumorigenicity (C: cell proliferation) by TCL1A in human cervical cancer overexpressing NANOG of the present invention , D: in vitro tumor formation) and anti-cancer immunity (E).
FIG. 15 is a result of investigation that NANOG of the present invention can physically bind to the promoter-938 to -721 part of TCLlA to control transcription.
FIG. 16 shows the results of confirming the decrease in tumor volume due to the decrease of immunological resistance of the tumor of HCT116 SCTE7, a human colon cancer cell host having high expression of Nanog, when the NANOG of the present invention was delivered in vivo using siRNA NANOG using chitosan nanoparticles. These results demonstrate that NANOG can be used as a good target molecule for immunotherapy of human cancer.
FIG. 17 shows the results of in vitro experiments in which NANOG of the present invention was reduced in expression using siRNA in TC-1 P3, a mouse anti-cancer immunostimulatory cell line, and the cell migration (A) and invasiveness (B) .
FIG. 18 shows the results of in vitro experiments in which NANOG of the present invention was reduced in expression of human anti-cancer immunostimulatory cell line CaSki / Db P3 using siRNA, and then the cell migration ability (B) and invasiveness ability (C) . The results of FIGS. 17 and 18 demonstrate that NANOG can be used as a diagnostic and target agent for cancer metastasis of cancer cells.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail.

본 발명은 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 저해제를 포함하고, The present invention includes an inhibitor for one or more genes or proteins selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1)

상기 저해제는 siRNA, 안티센스-올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA 또는 이들을 하나를 포함하는 벡터, 또는 항체인 것을 특징으로 하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
Wherein the inhibitor is an siRNA, an antisense-oligonucleotide, an shRNA, an miRNA, or a vector comprising one of the foregoing, or an antibody, or a composition for preventing or treating recurrence and metastasis of an anti-cancer immunostaining cancer.

본 명세서에서 "원발암"은 통상의 암을 뜻하며, "면역내성암"은 항암면역치료에 대한 내성을 획득한 암을 뜻하며, 항암면역치료란 암 특이 항원 또는 암 관련 항원에 대한 면역반응을 유도하여 암 특이성 독성 면역세포에 의해 암세포를 제거하는 모든 체계의 통합을 지칭한다. 암 항원에 대한 면역유도 방법으로는 유전자, 단백질, 바이러스, 수지상세포 등의 방법을 포함한다. "재발암"은 통상의 암 치료 후 재발생된 암을 뜻하고, "내성암"은 상기 암 치료에 내성을 갖는 암을 일컫는 말이다. 여기서, 통상의 암 치료는 예를 들어, 수술, 화학치료, 방사선치료, 호르몬 치료, 생물학적 치료, 면역치료 등을 포함한다. 상기 암의 종류로는 뇌종양, 척수종양, 망막 세포종, 구강암, 비강암, 부비동암, 인두암, 후두암, 경부암을 포함하는 두경부암, 피부암, 유방암, 갑상선암, 악성부신종양을 포함하는 유방암, 내분비암, 폐암, 흉막종양, 악성부신종양을 포함하는 호흡기암, 식도암, 위암, 소장의 악성종양, 대장암, 항문암, 간암, 담도암 또는 췌장암을 포함하는 소화기암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암 또는 음경암을 포함하는 비뇨기암, 자궁경부암, 자궁체부암, 융모상피암 또는 난소암을 포함하는 부인암, 급성 또는 만성 백혈병, 악성림프종 또는 다발성 골수증을 포함하는 혈액암, 골종양 또는 연부종양을 포함하는 골 또는 연부 종양, 및 소아 백혈병 또는 소아 고형종양을 포함하는 소아암 등일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 "암전이 또는 전이성암"은 특정 부위에서 발생한 원발암 또는 재발암이 다른 부위로 전이된 것을 일컫는다.In the present specification, "primordial cancer" refers to a common cancer, "immune tolerable cancer" refers to a cancer that has acquired immunity against an anticancer immunotherapy, and anticancer immunotherapy refers to induction of an immune response to a cancer- Refers to the integration of all systems that remove cancer cells by cancer-specific toxic immune cells. Immunogenesis methods for cancer antigen include genes, proteins, viruses, dendritic cells and the like. "Recurrent cancer" refers to cancer that has regenerated after normal cancer treatment, and "resistant cancer" refers to cancer that is resistant to the cancer treatment. Here, typical cancer treatment includes, for example, surgery, chemotherapy, radiation therapy, hormone therapy, biological therapy, immunotherapy and the like. Examples of the cancer include breast cancer including brain tumor, spinal cord tumor, retinoblastoma, oral cancer, nasopharyngeal cancer, sinus cancer, parietal cancer, laryngeal cancer, head and neck cancer including skin cancer, skin cancer, breast cancer, thyroid cancer, malignant adrenal tumor, Lung cancer, lung cancer, pleural tumor, malignant adrenal tumor, esophagus cancer, gastric cancer, malignant tumor of the small intestine, digestive cancer including colon cancer, anal cancer, liver cancer, bile duct cancer or pancreatic cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, Cancer of the cervix, uterine cervical cancer, choriocarcinoma or gynecological cancer including ovarian cancer, acute or chronic leukemia, malignant lymphoma or multiple myeloma, bone cancer, bone tumor or soft tissue tumor including testicular cancer or penile cancer, Bone or soft tissue tumors, and pediatric cancers, including childhood leukemia or pediatric solid tumors. In the present specification, the term " metastatic or metastatic cancer "refers to a metastasis of primary cancer or recurrent cancer developed at a specific site to another site.

본 발명의 NANOG 단백질은 항암면역 내성뿐만 아니라 항암제 및 방사선 내성을 나타내고, 전이성이 높은 암세포에서 많이 발현되므로, 상기 단백질의 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 저해제를 투여함으로써 항암면역내성암의 재발 및 전이뿐만 아니라 재발암, 내성암 또는 암전이 치료적 용도로 사용될 수 있다.Since the NANOG protein of the present invention exhibits not only the anti-cancer immunity but also the anti-cancer agent and radiation resistance and is highly expressed in highly metastatic cancer cells, by administering an inhibitor that inhibits the expression or activity of the protein gene or protein, And metastasis, as well as recurrent cancer, endometritis or metastasis can be used therapeutically.

본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이의 예방 또는 치료는 항암면역내성암의 재발 및 전이의 예방, 억제 또는 경감을 포함한다.The prevention or treatment of recurrence and metastasis of the anti-cancer immunostaining cancer of the present invention includes the prevention, inhibition or alleviation of recurrence and metastasis of the anti-cancer immunostaining cancer.

본 발명의 NANOG 유전자 저해제(발현 억제제)로서, NANOG 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 siRNA, 안티센스, 또는 shRNAi를 들 수 있다. 상기 NANOG 유전자는 항암면역 내성, 항암제 및 방사선 내성을 나타내고, 암전이와 관련된 유전자이므로, siRNA, 안티센스, 또는 shRNAi에 의해 NANOG 유전자 발현을 억제함으로써, 항암면역내성암의 재발 및 전이를 예방 또는 경감할 수 있다.As the NANOG gene inhibitor (expression inhibitor) of the present invention, siRNA, antisense, or shRNAi that specifically binds to and inhibits the expression of mRNA of the NANOG gene can be exemplified. Since the NANOG gene exhibits an anti-cancer immunity, an anticancer agent, and radiation resistance and is a gene associated with cancer metastasis, it inhibits NANOG gene expression by siRNA, antisense, or shRNAi to prevent or reduce the recurrence and metastasis of anti-cancer immunostaining .

본 명세서에서 "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다. As used herein, the term "siRNA" refers to a double-stranded RNA that induces RNA interference through cleavage of the mRNA of a target gene. The term " siRNA " It consists of the RNA strand of the sequence.

상기 siRNA는 시험관에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.The siRNA may include a siRNA synthesized in vitro or a form in which a nucleotide sequence encoding siRNA is inserted into an expression vector and expressed.

상기 siRNA는 바람직하게는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 와 41로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 가질 수 있다. The siRNA is preferably selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, Lt; RTI ID = 0.0 > SEQ ID < / RTI >

보다 구체적으로, 서열번호 1에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 마우스의 NANOG(GenBank Accession No. NM_028016)의 830-852 nt를 갖는다.More specifically, the siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 has a target site of 830-852 nt of mouse NANOG (GenBank Accession No. NM_028016).

서열번호 3에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 마우스의 NANOG의 865-887 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 3 has a target site of 865-887 nt of mouse NANOG.

서열번호 5에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 마우스의 NANOG의 92-114 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 5 has a target region of 92-114 nt of mouse NANOG.

서열번호 7에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 마우스의 NANOG의 327-349 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 7 has a target site of 327-349 nt of mouse NANOG.

서열번호 9에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 마우스의 NANOG의 529-551 nt를 갖는다.
The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 9 has a target site of 529-551 nt of mouse NANOG.

서열번호 11에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 NANOG (GenBank Accession No. NM_024865)의 165-187 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 11 has a target region of 165-187 nt of human NANOG (GenBank Accession No. NM_024865).

서열번호 13에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 NANOG의 857-879 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 13 has a target site of 857-879 nt of human NANOG.

서열번호 15에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 NANOG의 810-832 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 15 has 810-832 nt of human NANOG as a target site.

서열번호 17에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 NANOG의 313-335 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 17 has a target site of 313-335 nt of human NANOG.

서열번호 19에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 NANOG의 811-833 nt를 갖는다.
The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 19 has a target sequence of 811-833 nt of human NANOG.

서열번호 21에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT1 (GenBank Accession No. NM_005163)의 1007-1029 nt과 AKT2 (GenBank Accession No. NM_001626)의 1010-1032 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 21 has a target site of 1007-1029 nt of human AKT1 (GenBank Accession No. NM_005163) and 1010-1032 nt of AKT2 (GenBank Accession No. NM_001626).

서열번호 23에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT1의 96-118 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 23 has 96-118 nt of human AKT1 as a target site.

서열번호 25에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT1의 853-875 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 25 has a target site of 853-875 nt of human AKT1.

서열번호 27에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT1의 72-94 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 27 has 72-94 nt of human AKT1 as a target site.

서열번호 29에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT1의 527-549 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 29 has a target site of 527-549 nt of human AKT1.

서열번호 31에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT2의 429-451 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 31 has 429-451 nt of human AKT2 as a target site.

서열번호 33에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT2의 96-118 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 33 has a target site of 96-118 nt of human AKT2.

서열번호 35에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT2의 1218-1240 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 35 has 1218 to 1240 nt of human AKT2 as a target site.

서열번호 37에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 AKT2의 858-880 nt를 갖는다.
The siRNA sequence set forth in SEQ ID NO: 37 has a target site of 858-880 nt of human AKT2.

서열번호 39에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 TCL1 (GenBank Accession No. NM_021966)의 104-126 nt를 갖는다.The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 39 has a target site of 104-126 nt of human TCL1 (GenBank Accession No. NM_021966).

서열번호 41에 기재된 siRNA 서열은 표적부위로 인간의 TCL1의 275-297 nt를 갖는다.
The siRNA sequence shown in SEQ ID NO: 41 has 275-297 nt of human TCL1 as a target site.

또한, 상기 안티센스는 NANOG, AKT1, AKT2, TCL1 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 암전이 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.
In addition, the antisense has a sequence complementary to all or a part of the mRNA sequence transcribed from the NANOG, AKT1, AKT2, or TCL1 gene or a fragment thereof, and can bind to the mRNA to inhibit the expression of the metastatic gene or fragment.

또한, 상기 shRNAi(short hairpin RNAi)는 인간 또는 마우스상의 shRNAi 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.
In addition, the shRNAi (short hairpin RNAi) can be produced by a conventional method, targeting the shRNAi common base sequence region on human or mouse.

상기 NANOG 단백질의 저해제는 상기 단백질들의 발현을 억제하는 물질 또는 기능을 저해하는 물질이 될 수 있는데, 구체적으로, NANOG 단백질의 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체가 될 수 있다.
The inhibitor of the NANOG protein may be a substance that inhibits the expression of the proteins or a substance that interferes with the function. Specifically, the inhibitor may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody of NANOG protein.

또한, 상기 NANOG 유전자의 mRNA 또는 단백질 저해제를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물은 하나 또는 그 이상의 항암제를 더 포함할 수 있다. In addition, the composition for preventing or treating recurrence and metastasis of the anti-cancer immunostaining cancer of the present invention containing the mRNA or protein inhibitor of the NANOG gene as an active ingredient may further comprise one or more anticancer drugs.

NANOG 단백질의 억제제 또는 항체는 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent)와 함께 사용될 수 있으며, 예를 들어, 시클로포스파미드, 아지리딘, 알킬알콘설포네이트, 나이트로소우레아, 다카르바진, 카르보플라틴, 시스플라틴 등과 같은 알킬화제(alkylating agent), 마이토마이신 C, 안트라사이클린, 독소루비신(아드리아마이신) 등과 같은 항생제, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 시타라빈 등과 같은 항대사제(antimetabolitic agent), 빈카 알칼로이드와 같은 식물유래 약제 및 호르몬 등이 될 수 있다.
Inhibitors or antibodies of the NANOG protein may be used in conjunction with chemotherapeutic agents well known to those skilled in the art and include, for example, cyclophosphamide, aziridine, alkylalkanesulfonate, nitroso urea, Antibiotics such as anthraquinone, doxorubicin (adriamycin) and the like, antimetabolitic agents such as methotrexate, 5-fluorouracil and cytarabine, vinca alkaloids Plant-derived drugs and hormones such as < RTI ID = 0.0 >

또한, 상기 NANOG 유전자의 mRNA 또는 단백질 저해제를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.In addition, the composition for preventing or treating recurrence and metastasis of the anti-cancer immunostaining cancer of the present invention containing the mRNA or protein inhibitor of the NANOG gene as an active ingredient may further contain, in addition to the above- Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.Acceptable pharmaceutical carriers for compositions that are formulated into a liquid solution include sterile solutions suitable for the living body such as saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added.

또한, 상기 NANOG 유전자의 mRNA 또는 단백질 저해제를 유효 성분으로 함유하는 본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.In addition, the composition for preventing or treating the recurrence and metastasis of the anti-cancer immunostaining cancer of the present invention containing the mRNA or protein inhibitor of the NANOG gene as an active ingredient may be prepared by using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant The auxiliary agent may be an excipient such as an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, a swelling agent, a lubricant, a lubricant or a flavoring agent.

또한, 본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물은 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.In addition, the composition for preventing or treating recurrence and metastasis of cancer-resistant immune-tolerant cancer of the present invention may be prepared by additionally adding a diluent, a dispersant, a surfactant, a binder, and a lubricant to prepare injectable formulations such as aqueous solution, suspension, emulsion, , Granules or tablets. Further, it can be suitably formulated according to each disease or ingredient, using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA as an appropriate method in the field.

또한, 본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.In addition, the composition for preventing or treating recurrence and metastasis of the anti-cancer immunostaining cancer of the present invention may be administered orally or intravenously, intraarterially, intraperitoneally, intramuscularly, intraarterally, intraperitoneally, intrasternally, transdermally, , Orally, intraocularly, or intradermally, in a conventional manner.

상기 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물의 투여량은 항암면역내성암의 재발 및 전이를 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, NANOG 유전자의 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
The dose of the composition for preventing or treating the recurrence and metastasis of the anti-cancer immunocompromised intestinal cancer means the amount required for achieving the effect of inhibiting the recurrence and metastasis of the anti-cancer immune tolerable cancer. Accordingly, the present invention is not limited to the particular type of the disease, the severity of the disease, the kind and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the patient's age, body weight, general health status, sex and diet, Rate of administration, duration of treatment, concurrent medication, and the like. In the case of an adult, 0.01 ng / kg to 10 mg / kg for siRNA, 0.1 ng / kg to 10 mg / kg for compound, and monoclonal antibody when the inhibitor of NANOG gene is administered once to several times a day It is preferable to administer at a dose of 0.1 ng / kg to 10 mg / kg.

본 발명은 또한 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 에피토프를 함유하는 면역세포를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for the treatment of recurrence of an anti-cancer immunostaining cancer comprising immune cells containing epitopes of one or more proteins selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) And a composition for preventing or treating metastasis.

본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료용 조성물은 NANOG 단백질의 에피토프를 함유하는 면역세포를 포함하고 있어 생체 내 면역반응을 증강시키는 면역반응 증강용 조성물이거나, 면역반응을 유도함으로써 항암면역내성암의 재발 및 전이를 예방 또는 경감할 수 있는 백신 조성물일 수 있다.The composition for the recurrence and metastasis treatment of cancer-resistant immunocompromised intestinal cancer of the present invention comprises an immune cell containing an epitope of NANOG protein and is a composition for enhancing an immune response which enhances an in vivo immune response, And may be a vaccine composition capable of preventing or alleviating recurrence and metastasis of sexable cancer.

상기 NANOG 단백질의 에피토프를 포함하는 면역세포는 통상의 방법에 따라 에피토프를 감작시킨 것이거나, 형질전환방법을 통해 상기 에피토프를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
The immune cells containing the NANOG protein epitope may be sensitized with an epitope according to a conventional method or may be transformed with a recombinant vector expressing the epitope through a transformation method.

본 발명은 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현을 검출하기 위한 프로브를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for diagnosing recurrence and metastasis of an anti-cancer immunostaining cancer comprising a probe for detecting at least one expression selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) ≪ / RTI >

본 명세서에서 "프로브"는 NANOG 유전자 또는 단백질과 특이적으로 결합하여 이들을 인지할 수 있는 항체, PCR 프라이머, 핵산 프로브 등을 포괄적으로 포함하는 개념이다. As used herein, the term "probe" is a concept inclusive of antibodies, PCR primers, nucleic acid probes and the like capable of specifically recognizing and binding to NANOG gene or protein.

본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 조성물은 생리학적 시료에서 항암면역내성암의 재발 및 전이 병리적 마커를 검출하기 위한 것으로, The composition for the recurrence and metastasis diagnosis of cancer-resistant immune-tolerant cancer of the present invention is for detecting recurrence and metastatic pathologic markers of cancer-resistant immune-tolerant cancer in a physiological sample,

NANOG 유전자가 항암면역내성암의 재발 및 전이성이 있는 암세포의 안팎에서 특이적으로 발현이 증가되는 양상을 보이고, 이의 발현량과 비례하여 세포의 종양형성능이 증가하므로, 암세포 또는 조직에서의 NANOG 유전자, 또는 이로부터 코딩되는 단백질의 발현 정도를 정량분석함으로써 항암면역내성암의 재발 및 전이를 진단할 수 있는 것이다. The NANOG gene is expressed specifically in the inside and outside of cancer cells having recurrence and metastasis of cancer cells with anti-cancer immunity, and the tumor forming ability of cells is increased in proportion to the amount of NANOG gene, so that the NANOG gene in cancer cells or tissues, or And quantitatively analyzing the expression level of the protein encoded thereby to diagnose recurrence and metastasis of cancer cells in the anti-cancer immunity.

상기 NANOG는 사람 또는 마우스에서 유래한 것으로, 공지된 서열, 예를 들어, GenBank Accession No. NM_024865, GenBank Accession No. NM_028016 등을 포함하거나, 염기 또는 아미노산의 결실, 치환, 부가되어도 동일한 기능을 수행할 수 있는 변이체를 포함할 수 있다.The NANOG is derived from a human or a mouse. NM_024865, GenBank Accession No. NM_028016 or the like, or mutants capable of performing the same function even when a base or an amino acid is deleted, substituted or added.

본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 조성물은 상기 프로브로 NANOG 단백질의 에피토프와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다.The composition for recurrence and metastasis diagnosis of cancer-resistant immune-tolerant cancer of the present invention may include a monoclonal antibody or polyclonal antibody that specifically binds to an epitope of the NANOG protein with the probe.

본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 조성물을 이용한 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단은, 포유류의 조직 또는 세포시료로부터 발현된 단백질 시료를 수득하는 단계; 및 수득한 시료에서 NANOG 단백질을 확인하고 정량하는 단계를 포함할 수 있다.The recurrence and metastasis diagnosis of cancer-resistant immune-tolerant cancer using the composition for recurrence and metastasis diagnosis of cancer-resistant immune-tolerant cancer according to the present invention comprises: obtaining a protein sample expressed from a mammalian tissue or a cell sample; And identifying and quantifying the NANOG protein in the obtained sample.

또는, 상기 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단은, 포유류의 조직 또는 세포시료로부터 발현된 단백질 시료를 수득하는 단계; 및 수득한 시료를 NANOG 단백질의 모노클로날 항체와 반응시켜 NANOG 단백질의 발현을 확인하고 정량하는 단계를 포함할 수 있다. Alternatively, the recurrence and metastasis diagnosis of the anticancer immune tolerant cancer can be achieved by obtaining a protein sample expressed from a mammalian tissue or a cell sample; And reacting the obtained sample with a monoclonal antibody of the NANOG protein to confirm and quantify the expression of the NANOG protein.

상기 진단방법은, NANOG 단백질의 모노클로날 항체를 함유한 항암면역내성암의 재발 및 전이의 진단용 조성물을 생체로부터 배출된 물질(암세포 또는 조직의 단백질 추출물이나 혈장 등)에 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay) 방법을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하거나, 생체에서 배출된 암조직이나 세포에 NANOG 단백질 특이적 면역염색(histoimmunostaining)을 이용하여 항암면역내성암의 재발 및 전이 여부를 진단할 수 있다. 또는, 생체로부터 배출된 암조직이나 세포에 웨스턴 블롯분석을 이용하여 단백질 수준에서 NANOG 단백질 발현량을 정상대조군과 비교분석함으로서 항암면역내성암의 재발 및 전이 여부를 진단할 수 있다.The diagnostic method comprises the step of administering an ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) to a substance (cancer cell or tissue protein extract or plasma) excreted from a living body by using a composition for the diagnosis of recurrence and metastasis of an anti-cancer immunostaining cancer containing a monoclonal antibody of NANOG protein ) Method. Alternatively, NANOG protein-specific immunohistochemistry (histoimmunostaining) can be used to quantitatively analyze cancer cells and to determine the recurrence or metastasis of cancer cells. Alternatively, the amount of NANOG protein expressed at the protein level can be compared with the normal control group by Western blot analysis on cancer tissues or cells released from the living body, thereby diagnosing recurrence or metastasis of the cancer cells.

또는, 상기 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단은, NANOG 단백질에 대한 모노클로날 항체를 겔형 지지체에 부착시켜 면역친화컬럼을 제조하는 단계; 상기 단계의 면역친화컬럼을 사용하여 생체로부터 배출된 물질(암세포 또는 조직의 단백질 추출물이나 혈장 등)에서 NANOG 단백질을 HPLC 방법으로 정량하는 단계; 및 상기 정량 결과를 비교분석하여 항암면역내성암의 재발 및 전이 정도를 진단하는 단계를 포함할 수 있다.Alternatively, the recurrence and metastasis diagnosis of the anticancer immune tolerance cancer is performed by attaching a monoclonal antibody against the NANOG protein to a gel-like support to prepare an immunoaffinity column; Quantifying the NANOG protein by an HPLC method in a substance (cancer cell or tissue protein extract or plasma) discharged from the living body using the immunoaffinity column of the above step; And comparing and analyzing the quantitative results to diagnose the recurrence and metastasis degree of the anticancer immune tolerance cancer.

상기 NANOG 단백질의 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다.The monoclonal antibody of the NANOG protein may be prepared by using a monoclonal antibody production method customary in the art, and may be commercially available.

상기 NANOG 단백질의 모노클로날 항체에는 일반적으로 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, AP) 또는 홀스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하거나, 직접 NANOG 단백질 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다.The monoclonal antibody of the NANOG protein is generally prepared by using a secondary antibody conjugated with an enzyme such as alkaline phosphatase (AP) or horseradish peroxidase (HRP) Or by quantitative analysis using a conjugate of AP or HRP enzyme directly to the NANOG protein monoclonal antibody.

또한, 상기 NANOG 단백질 모노클로날 항체 대신에 NANOG 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있으며, 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수 있다.In addition, a polyclonal antibody recognizing the NANOG protein may be used instead of the NANOG protein monoclonal antibody, and it may be prepared and used through an antiserum preparation method customary in the art.

또한, 상기 프로브는 NANOG의 mRNA에 특이적으로 결합하는 PCR 프라이머 또는 핵산 프로브를 포함할 수 있다.In addition, the probe may include a PCR primer or a nucleic acid probe that specifically binds to mRNA of NANOG.

상기 NANOG 유전자에 대한 프라이머를 이용한 RT-PCR 또는 정량적 RT-PCR 등을 수행하여 NANOG 유전자의 발현량을 정상군과 비교함으로써 항암면역내성암의 재발 및 전이를 진단할 수 있다. RT-PCR or quantitative RT-PCR using primers for the NANOG gene and comparing the expression level of the NANOG gene with that of the normal group can be used to diagnose recurrence and metastasis of the cancer cells.

또한, 상기 NANOG 유전자에 대한 핵산 프로브를 이용하여 노던 블롯 분석 등을 수행하여 NANOG 유전자의 발현량을 정상군과 비교함으로써 항암면역내성암의 재발 및 전이를 진단할 수 있다.Also, by performing Northern blot analysis using a nucleic acid probe for the NANOG gene and comparing the expression level of the NANOG gene with that of the normal group, it is possible to diagnose the recurrence and metastasis of the anti-cancer immunostaining cancer.

상기 PCR 프라이머 또는 핵산 프로브는 NANOG 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 뉴클레오티드라면 특별히 제한하지 않는다.The PCR primer or the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it is a nucleotide capable of specifically binding to the mRNA of the NANOG gene.

상기 NANOG 유전자의 mRNA 검출용 프라이머 또는 핵산 프로브를 포함하는 본 발명에 따른 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 조성물을 생체로부터 배출된 물질(암세포 또는 조직에서 추출한 RNA)과 반응(RT-PCR 또는 정량적 RT-PCR 또는 노던블롯팅)시켜 정상군과 비교 분석함으로써 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단을 수행할 수 있다.The composition for recurrence and metastasis diagnosis of cancer-resistant immune-tolerant cancer according to the present invention comprising a primer or a nucleic acid probe for detecting the mRNA of the NANOG gene is reacted with a substance (tumor RNA extracted from cancer cells or tissues) (RT-PCR or quantitative RT-PCR or Northern blotting) and compared with the normal group, it is possible to perform the diagnosis of recurrence and metastasis of cancer cells with anti-cancer immunity.

상기 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단은 포유류의 조직 또는 세포시료로부터 발현된 RNA 시료를 수득하는 단계; 및 수득한 시료를 NANOG 유전자에 특이적으로 결합하는 PCR 프라이머 또는 프로브와 반응시켜 상기 유전자의 발현을 확인하고 정량하는 단계를 포함할 수 있다.The recurrence and metastasis diagnosis of the anti-cancer immunostaining cancer can be accomplished by obtaining an RNA sample expressed from a tissue or a cell sample of a mammal; And reacting the obtained sample with a PCR primer or probe that specifically binds to the NANOG gene to confirm and quantify the expression of the gene.

본 발명은 또한 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for screening recurrence and metastasis of cancer-resistant immunocompromised cancer comprising one or more genes selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) .

본 발명의 조성물이 포함하는 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1) 유전자는 사람 또는 마우스 유래의 전체 염기서열 또는 이의 단편, 또는 다형현상을 포함하는 염기서열 등을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 전체 염기서열의 다형현상을 포함하는 염기서열 중 선택된 하나 이상이 될 수 있으며, 원핵생물 또는 진핵생물 발현벡터 시스템 내에 포함된 형태로 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 스크리닝 조성물에 포함된다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 조성물은 상기 NANOG를 발현하는 플라스미드를 포함하는 TC-1/NANOG 또는 CaskiDb/NANOG 세포주를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 세포주를 이용하면 NANOG/TCL-1/AKT/MCL-1 항암면역내성 분자 축 스크리닝에 대한 양성 대조군으로서 활용될 수 있다.
The NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT, and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) genes contained in the composition of the present invention can be obtained by using a whole base sequence derived from human or mouse or a fragment thereof, Sequence or the like can be used. More specifically, it may be at least one selected from the nucleotide sequence comprising the polymorphism of the entire nucleotide sequence, and is included in the recurrence and metastasis screening composition of the anti-cancer immunostaining cancer in a form contained within a prokaryotic or eukaryotic expression vector system do. Preferably, the composition comprises a TC-1 / NANOG or CaskiDb / NANOG cell line containing the NANOG-expressing plasmid. The above cell line can be used as a positive control for NANOG / TCL-1 / AKT / MCL-1 anti-cancer immunostaining molecular axis screening.

본 발명은 또한 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for screening recurrence and metastatic treatment of cancer-resistant immunocompromised cancer comprising at least one protein selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) .

본 발명의 조성물이 포함하는 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1) 단백질은 사람 또는 마우스 유래의 전체 아미노산 서열 또는 이의 단편, 또는 다형현상을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. NANOG 단백질 등과 동등한 생리적 활성을 나타내는 NANOG 폴리펩타이드 단편 중 선택된 1종 이상일 수 있다.The NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) proteins contained in the composition of the present invention can be derived from human or mouse whole amino acid sequences or fragments thereof, Sequence. And NANOG polypeptide fragments which exhibit physiological activity equivalent to that of NANOG protein or the like.

NANOG는 항암면역내성암의 재발 및 전이를 촉진시키는 효과가 있으므로, 본 발명의 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 스크리닝용 조성물은 NANOG 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 저해하는 물질 또는 NANOG 단백질의 활성을 억제하는 물질을 스크리닝하여 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제로 선택할 수 있다.
Since the NANOG has an effect of promoting the recurrence and metastasis of cancer cells of the anti-cancer immunity, the composition of the present invention for screening recurrence and metastatic treatment of cancer-resistant immunocompromised cancer is a substance which inhibits transcription and translation of mRNA, protein from NANOG gene sequence Or a substance that inhibits the activity of the NANOG protein can be screened and selected as a therapeutic agent for recurrence and metastasis of cancer-resistant immune cells.

또한, 본 발명은 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 및 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 발현하는 세포주를 포함하는 조성물에 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질이 처리된 세포주(실험군) 내의 NANOG, TCL1(T cell lecukemia/Lymphoma 1), AKT 또는 MCL1(Myeloid cell leukemia sequence 1)의 발현량을 측정하는 단계;를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition comprising a cell line expressing at least one selected from the group consisting of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT and MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) Treating the candidate agent for transfer therapy; And measuring the expression level of NANOG, TCL1 (T cell lecukemia / Lymphoma 1), AKT or MCL1 (Myeloid cell leukemia sequence 1) in the cell line treated with the candidate substance (experimental group) Relapse and metastatic therapeutic agent screening methods.

상기 발현량 측정은 전사체의 양을 측정하는 방법, 단백질의 양을 측정하는 방법 또는 인산화된 단백질양을 측정하는 방법으로 수행될 수 있다. AKT의 경우 인산화된 단백질양을 측정함으로서 활성화 정도를 측정할 수 있다. 예를 들어 상기 전사체의 양을 측정하는 방법은 RT(Reverse transcriptase)-PCR을 수행하여, 상기 단백질의 양 및 인산화된 단백질 양을 측정하는 방법은 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. The measurement of the expression level can be performed by a method of measuring the amount of the transcript, a method of measuring the amount of protein, or a method of measuring the amount of phosphorylated protein. In the case of AKT, the degree of activation can be measured by measuring the amount of phosphorylated protein. For example, a method of measuring the amount of the transcript is performed by RT (reverse transcriptase) -PCR, and the amount of the protein and the amount of phosphorylated protein are measured by Western blotting But is not limited thereto, and can be carried out using methods known to those skilled in the art.

보다 구체적으로 살펴보면, 본 발명의 스크리닝 방법에서 NANOG 유전자를 포함하는 조성물과 후보물질 간의 반응 확인은, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) 상기 유전자와 후보물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 후보물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 후보물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다.More specifically, in the screening method of the present invention, confirmation of the reaction between a composition containing a NANOG gene and a candidate substance is carried out by using a conventional method for confirming the reaction between DNA-DNA, DNA-RNA, DNA- Methods can be used. For example, in the living body outside (in a method for measuring the expression rate of the gene through quantitative PCR, quantitative real-time PCR, or the like, or a method for measuring the expression level of the gene by reacting mammalian cells with a candidate substance, A method of introducing a reporter gene into a cell, reacting with a candidate substance, and measuring the expression ratio of a reporter protein can be used.

이러한 경우 본 발명의 조성물은 NANOG 유전자 외에도, 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.In this case, in addition to the NANOG gene, the composition of the present invention may contain distilled water or a buffer to stably maintain the structure of the nucleic acid.

이에 한정되는 것은 아니나, 상기 세포주는 상기 NANOG를 발현하는 플라스미드를 포함하는 TC-1/NANOG 또는 CaskiDb/NANOG 세포주이다.
The cell line is a TC-1 / NANOG or CaskiDb / NANOG cell line containing the plasmid expressing the NANOG.

본 발명의 스크리닝 방법에서 NANOG 단백질을 포함하는 조성물과 후보물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.In the screening method of the present invention, the reaction between a composition containing a NANOG protein and a candidate substance can be confirmed by conventional methods used for confirming whether a protein-protein or a protein-compound is reacted.

예를 들면, NANOG 유전자, 또는 이들의 단백질과 후보물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), NANOG 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩타이드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.For example, a method of measuring activity after reacting NANOG gene or a protein with a candidate substance, a yeast two-hybrid method, a phage-displayed peptide clone that binds to NANOG protein ), High throughput screening (HTS) using natural materials and chemical libraries, drug hit HTS, cell-based screening, or a DNA array. And a screening method using the same can be used.

이러한 경우 본 발명의 조성물은 NANOG 유전자로부터 발현된 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.
In this case, in addition to the protein expressed from the NANOG gene, the composition of the present invention may contain a buffer or a reaction solution which stably maintains the structure or physiological activity of the protein. In addition, the composition of the present invention may be administered in vivo ( in For the vivo experiment, cells expressing the protein, or a cell containing a plasmid expressing the protein under a promoter capable of regulating the transcription rate, and the like may be included.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
In the screening method of the present invention, the candidate substance may be an individual nucleic acid, protein, other extract or a natural substance, a compound, etc., which are presumed to have a possibility of recurrence and metastatic therapeutic agent of cancer- .

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 후보물질 및 반대로 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 후보물질은, 전자의 경우, 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우는 후보물질에 대한 억제제를 개발함으로써 재발암, 내성암 또는 암전이 치료제 후보물질이 될 수 있다.A candidate substance obtained through the screening method of the present invention exhibiting activity of promoting gene expression or enhancing the function of a protein and a candidate substance exhibiting an activity of suppressing gene expression or inhibiting the function of a protein on the contrary, , Recurrence of metastatic carcinoma of the immune system, and candidates for metastatic treatment. In the latter case, recurrent cancer, metastatic cancer or metastasis can be a candidate for treatment by developing an inhibitor against the candidate substance.

이와 같은 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 후보물질은 이후의 재발암, 내성암 또는 암전이 치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 NANOG 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 재발암, 내성암 또는 암전이 치료제를 개발할 수 있다.Such recurring and metastatic treatment candidate agents for cancer-resistant immune-mediated metastases will be used as a leading compound in the development of therapeutic agents for subsequent recurrent cancer, metastatic cancer, or metastasis, and the leading substance may be a NANOG gene or a protein expressed therefrom By modifying and optimizing the structure so as to exhibit the inhibition effect, new remission, tolerance, or metastasis can be developed.

이렇게 하여 얻어진 물질은 NANOG 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질에 대해 부분적 또는 완전한 활성 억제효과를 나타내게 되므로, NANOG 유전자 발현 억제 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 저하에 의하여, 항암면역내성암의 재발 및 전이, 그 이외에 유발되는 질환들을 억제할 수 있다.Since the substance thus obtained exhibits a partial or complete inhibitory effect on the NANOG gene or a protein expressed therefrom, the NANOG gene expression is inhibited or the function of the protein expressed therefrom is lowered, thereby causing the recurrence and metastasis of the cancer cell. It is possible to inhibit diseases caused.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.
(2001)) and Frederick et al . (Frederick et al ., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, M. Ausubel et al ., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & (1994)). ≪ / RTI >

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예만 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited to these embodiments in accordance with the gist of the present invention.

<< 실시예Example 1> 인간  1> Human NANOGNANOG 발현 벡터 제조 Expression vector production

pSin-EF2-Nanog-Puro 벡터 (Addgene plasmid 16578)를 주형으로 하고, XhoI-NANOG 프라이머 (5‘-GCTCGAGATGAGTGTGGATCCAGCTTG -3’), NANOG-EcoRI(5‘- CGAATTCTCACACGTCTTGAGGTTG -3’) 프라이머를 이용하여 변성단계(95℃, 30초), 어닐링단계(56℃, 30초) 및 연장단계(72℃, 40초)를 1 싸이클로 하여 35 싸이클을 실시하여 PCR로 증폭하였다. (5'-GCTCGAGATGAGTGTGGATCCAGCTTG-3 ') and NANOG-EcoRI (5'-CGAATTCTCACACGTCTTGAGGTTG-3') primers using the pSin-EF2-Nanog-Puro vector (Addgene plasmid 16578) (95 ° C, 30 sec), annealing (56 ° C, 30 sec) and extension (72 ° C, 40 sec) cycles.

pMSCV 벡터(clontech, USA)와 상기에서 증폭된 NANOG 유전자 단편에 XhoIEcoRI(NEB, USA)을 처리한 다음, 라이게이즈(바이오니아)로 라이게이션(ligation)하여 NANOG를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 상기 벡터를 pMSCV NANOG로 명명하였다.
After the pMSCV vector (clontech, USA) and the NANOG gene fragment amplified above were treated with XhoI and Eco RI (NEB, USA), they were ligated with ligationase (bioneer) to obtain NANOG-expressing retrovirus vector . This vector was named pMSCV NANOG.

<< 실시예Example 2> 인간  2> human NANOGNANOG 를 발현하는 Expressing CaSkiDbCaSkiDb 세포주 제조 Cell line manufacturing

실시예 1에서 제조한 벡터와 리포좀 제제인 리포펙타민 2000(lipofectamin 2000, Invitrogen, MD, USA)을 부피비 1:2로 섞어 레트로바이러스 패키징(packaging) 세포주인 피닉스(phonenix)세포(clontech)에 3시간 처리 후 혈청이 포함된 배양액을 첨가해 주어 형질전환반응을 정지시켰다. 24시간 배양 후 퓨로마이신(Invitrogen, MD, USA)이 포함된 배양액으로 형질전환된 피닉스세포를 선택배양하였다. 선택된 세포들을 3~4일간 배양하여 배양액에서 얻은 바이러스를 amicon ultra-15(millipore)을 이용하여 12000 rpm에서 30분간 원심 분리하는 방법으로 농축한 500㎕의 농축액과 4㎍의 PEI(Polyethyleneimine; Sigma)를 혼합한 혼합액을 인간 자궁경부암세포주인 CaSki 세포주에 마우스 MHC class I인 Db 유전자가 형질도입되어 있는 CaSki Db(The Journal of experimental medicine 185:453-459, 1997)에 처리하여 형질도입시킴으로써, NANOG를 발현하는 CaSki Db/NANOG 세포주를 제조하였다.
The vector prepared in Example 1 and lipofectamine 2000 (lipofectamin 2000, Invitrogen, MD, USA) were mixed in a volume ratio of 1: 2 to a retrovirus packaging cell line phonenix cell clontech After the treatment, the culture medium containing the serum was added to stop the transformation reaction. After culturing for 24 hours, the transformed phyisan cells were cultured with a culture solution containing puromycin (Invitrogen, MD, USA). The selected cells were cultured for 3 to 4 days, and the virus obtained from the culture was centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes using amicon ultra-15 (millipore), concentrated to 500 μl, and 4 μg of PEI (Polyethyleneimine; Db of MHC class I gene in mice a mixture mixed with human cervical cancer cell line CaSki cell line is transduced to CaSki Db (the Journal of experimental medicine 185: 453-459, 1997) to produce a CaSki Db / NANOG cell line expressing NANOG.

<< 실시예Example 3>  3> NANOGNANOG 를 발현하는 Expressing TCTC -- 1세포주1 cell line 제조 Produce

실시예 1에서 제조한 각각의 벡터와 리포좀 제제인 리포펙타민 2000을 부피비 1:2로 섞어 레트로바이러스 패키징 세포주인 피닉스세포에 3시간 처리 후 혈청이 포함된 배양액을 첨가해 주어 형질전환반응을 정지시켰다. 그 후 24시간 배양 후 퓨로마이신이 포함된 배양액으로 형질전환된 피닉스세포를 선택 배양하였다. 선택된 세포들을 3~4일간 배양하여 배양액에서 얻은 바이러스를 amicon ultra-15 (millipore)을 이용하여 12000 rpm에서 30분간 원심 분리하는 방법으로 농축한 500㎕의 농축액과 4㎍의 PEI를 혼합한 혼합액을 마우스 폐암세포주인 TC-1(ATCC)에 처리하여 형질도입시킴으로써, NANOG를 발현하는 TC-1/NANOG 세포주를 제조하였다.
Each vector prepared in Example 1 and Lipofectamine 2000, a liposome preparation, were mixed at a volume ratio of 1: 2, treated with a retrovirus packaging cell line, Phoenix cells, for 3 hours, and then added with a serum-containing culture medium to stop the transformation . Then, after culturing for 24 hours, phos- phoric cells transformed with the culture medium containing puromycin were selectively cultured. The selected cells were incubated for 3 to 4 days. The virus obtained from the culture was centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes using amicon ultra-15 (millipore). The mixture was concentrated to 500 μl of concentrate and 4 μg of PEI TC-1 / NANOG cell line expressing NANOG was prepared by treatment with mouse lung cancer cell line TC-1 (ATCC).

<< 실시예Example 4>  4> 인간암세포주에서In human cancer cell lines NANOGNANOG 단백질 발현 확인 Confirmation of protein expression

인간신장세포주 HEK293, 자궁경부암세포주 CaSki, CUMC6, 유방암세포주 MCF7, MDA321, MDA435, 폐암세포주 H1299, 간암세포주 HepG2, 난소암세포주 OVCAR3, SKOV3, A2780, 대장암세포주 HT29, SNUC4, SW620, HCT116 세포주를 RIPA버퍼(Elpis, Korea)에 넣어 얼음에 30분간 정치시킨 후 냉장원심분리기에서 13000 rpm 30분간 원심분리하고, 상층액만을 취하여 단백질 정량 후 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩 하였다. 그 후 PVDF에 로딩된 젤을 트랜스퍼한 후 5% BSA 로 1시간 동안 블로킹한 후 NANOG 항체(Millipore, USA)를 1:1000으로 희석한 후 인큐베이션 하였다. HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL용액을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하였다.The human cell line HEK293, cervical cancer cell line CaSki, CUMC6, breast cancer cell line MCF7, MDA321, MDA435, lung cancer cell line H1299, liver cancer cell line HepG2, ovarian cancer cell line OVCAR3, SKOV3, A2780, colon cancer cell line HT29, SNUC4, SW620, (Elpis, Korea) for 30 minutes on ice, centrifuged at 13000 rpm for 30 minutes in a refrigerated centrifuge, and only the supernatant was taken. After protein quantification, 50 μg of the protein was loaded on SDS-PAGE gel. Then, the gel loaded on PVDF was transferred, blocked with 5% BSA for 1 hour, diluted 1: 1000 with NANOG antibody (Millipore, USA) and incubated. After the HRP-conjugated secondary antibody reaction and washing, ECL solution was used to identify the protein band.

도 1에 나타난 바와 같이, 모든 인간 암 종에서 NANOG 단백질이 발현되었다.
As shown in Figure 1, the NANOG protein was expressed in all human cancers.

<< 실시예Example 5> 자궁경부암 조직에서  5> In cervical cancer tissue NANOGNANOG 발현 확인 Confirmation of expression

자궁경부암 조직 슬라이드를 자일렌을 이용하여 탈파린화 과정과 알코올을 이용하여 탈수화 과정을 거친 후 시트레이트 버퍼에 슬라이드를 담궈 전자레인지에서 10분간 돌린 후 실온에서 한 시간 동안 식혀주었다. 증류수로 세척하여 실온에서 5% 염소 혈청으로 한 시간 동안 반응시킨 후 Nanog, Tcl1, 그리고 pAkt 항체를 각각 1:50, 1:20, 그리고 1:50 으로 희석하여 임상시료에 도포하였다. HRP가 부착된 2차 항체를 반응시킨 후 DAB 키트를 이용하여 발색시켰다. The cervical cancer tissue slides were dephosphorylated using xylene and dehydrated using alcohol, slides were immersed in a citrate buffer, and incubated in a microwave oven for 10 minutes, followed by cooling at room temperature for one hour. After washing with distilled water and incubating at room temperature with 5% goat serum for one hour, Nanog, Tcl1, and pAkt antibodies were diluted 1:50, 1:20, and 1:50, respectively, and applied to clinical samples. HRP-conjugated secondary antibody was reacted and developed with DAB kit.

도 2에 나타난 바와 같이, 조직에서 자궁경부암의 진행 단계가 높아질수록 Nanog/Tcl1/pAkt 발현 양상이 증가됨을 확인하였다 (A와 B). 장기간 추적조사를 통한 생존율을 확인한 결과에서도 Nanog/Tcl1/pAkt 발현이 높은 암을 가진 환자의 생존율이 유의하게 낮음을 확인하였다 (C).
As shown in FIG. 2, it was confirmed that the expression pattern of Nanog / Tcl1 / pAkt was increased as the progression of cervical cancer progressed in tissues (A and B). Long-term follow-up confirmed the survival rate of patients with high levels of Nanog / Tcl1 / pAkt expression (C).

<< 실시예Example 6> 항암면역 내성 조사 6> Anti-cancer immunity

본 발명의 NANOG 유전자의 항암면역 내성에 대해 조사하기 위해 상기 실시예 2 및 실시예 3에서 제조한 293Db/NANOG, CaSki/Db NANOG 및 TC-1/NANOG 세포주를 이용하여 항암면역 내성 실험을 수행하였다. To investigate the anti-cancer immunity of the NANOG gene of the present invention, the anti-cancer immunity test was carried out using the 293Db / NANOG, CaSki / Db NANOG and TC-1 / NANOG cell lines prepared in Example 2 and Example 3 .

먼저 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)를 이용하여 TC-1/no isnert, TC-1/NANOG 세포주에 표식한 후, E7 특이적인 CTL(cytotoxic T-lymphocyte)을 1:1 비율로 섞어준 후 CFSE 표식이 된 TC-1/no insert, TC-1/NANOG 세포주에서의 활성 카스파제-3(active caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다. First, CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) was used to label TC-1 / no isnert and TC-1 / NANOG cell lines. E7-specific CTLs (cytotoxic T-lymphocytes) were mixed at a ratio of 1: The active caspase-3 in the TC-1 / no insert, TC-1 / NANOG cell line was observed via FACS.

CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)를 이용하여 CaSki/Db no insert, CaSki/Db NANOG 세포주에 표식한 후, 1ug/ml의 E7 peptide(아미노산 번호 49-57, RAHYNIVTF)를 1시간 동안 자극을 준 후 E7 특이적인 CTL(cytotoxic T-lymphocyte)을 1:1 비율로 섞어준 후 CFSE 표식이 된 CaSki/Db no insert, CaSki/Db NANOG 세포주에서의 활성 카스파제-3(active caspase-3)를 FACS를 통해 관찰하였다. The cells were labeled with CaSki / Db no insert and CaSki / Db NANOG cell line using CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester), stimulated with 1 ug / ml E7 peptide (amino acid number 49-57, RAHYNIVTF) CaSki / Db no insert, CFSE-labeled CaSki / Db NANOG cell line, and active caspase-3 were observed through FACS after 1: 1 ratio of CTL (cytotoxic T-lymphocyte) Respectively.

도 7, 도 12, 도 13에 나타난 바와 같이, NANOG을 과발현하는 세포주는 T세포의 공격에 대해 내성을 가짐을 알 수 있었다.
As shown in FIG. 7, FIG. 12 and FIG. 13, it was found that the cell line overexpressing NANOG was resistant to attack of T cells.

각 siRNA 서열과 표적부위는 표 1, 2, 3, 4 및 5 에 나타내었다. 도 6과 도 11은 생쥐의 항암면역내성 세포인 TC-1 P3와 인간 항암면역내성 세포인 CaSki/Db P3에서 마우스 NANOG 표적부위인 830-852(서열번호 1)과 인간 NANOG 표적부위인 165-187(서열번호 11)을 처리함에 따른 NANOG의 발현 여부를 도시 한 것이다.
Each siRNA sequence and target site is shown in Tables 1, 2, 3, 4 and 5. FIG. 6 and FIG. 11 show the mouse NANOG target site 830-852 (SEQ ID NO: 1) and the human NANOG target site 165-NANOG target site in TC-1 P3, an anti-cancer immunostimulatory cell of mice, and CaSki / Db P3, 187 (SEQ ID NO: 11).

마우스 NANOG 특이적인 siRNAMouse NANOG specific siRNA 표적부위Target site siRNA 서열siRNA sequence 서열번호SEQ ID NO: 830-852830-852 센스sense 5'-CCACAAGCCUUGGAAUUAU UU -3'5'-CCACAAGCCUUGGAAUUAU UU -3 ' 1One 안티센스Antisense 5'-UU GGUGUUCGGAACCUUAAUA-3'5'-UU GGUGUUCGGAACCUUAAUA-3 ' 22 865-887865-887 센스sense 5'-GACUCCACCAGGUGAAAUA UU-3'5'-GACUCCACCAGGUGAAAUA UU-3 ' 33 안티센스Antisense 5'-UU CUGAGGUGGUCCACUUUAU -3'5'-UU CUGAGGUGGUCCACUUUAU -3 ' 44 92-11492-114 센스sense 5'-CCCGAGAACUAUUCUUGCU UU-3'5'-CCCGAGAACUAUUCUUGCU UU-3 ' 55 안티센스Antisense 5'-UU GGGCUCUUGAUAAGAACGA-3'5'-UU GGGCUCUUGAUAAGAACGA-3 ' 66 327-349327-349 센스sense 5'-CACUCAAGGACAGGUUUCA UU-3'5'-CACUCAAGGACAGGUUUCA UU-3 ' 77 안티센스Antisense 5'-UU GUGAGUUCCUGUCCAAAGU-3'5'-UU GUGAGUUCCUGUCCAAAGU-3 ' 88 529-551529-551 센스sense 5'-CAGCAUCCAUUGCAGCUAU UU-3'5'-CAGCAUCCAUUGCAGCUAU UU-3 ' 99 안티센스Antisense 5'-UU GUCGUAGGUAACGUCGAUA-3'5'-UU GUCGUAGGUAACGUCGAUA-3 ' 1010

사람 NANOG 특이적인 siRNAHuman NANOG specific siRNA 표적부위Target site siRNA 서열siRNA sequence 서열번호SEQ ID NO: 165-187165-187 센스sense 5'-CCUCCAUGGAUCUGCUUAU UU-3'5'-CCUCCAUGGAUCUGCUUAU UU-3 ' 1111 안티센스Antisense 5'-UU GGAGGUACCUAGACGAAUA -3'5'-UU GGAGGUACCUAGACGAAUA -3 ' 1212 857-879857-879 센스sense 5'-CCACAAACCAUGGAUUUAU UU -3'5'-CCACAAACCAUGGAUUUAU UU -3 ' 1313 안티센스Antisense 5'-UU GGUGUUUGGUACCUAAAUA-3'5'-UU GGUGUUUGGUACCUAAAUA-3 ' 1414 810-832810-832 센스sense 5'-GGGAAGGCCUUAAUGUAAU UU-3'5'-GGGAAGGCCUUAAUGUAAU UU-3 ' 1515 안티센스Antisense 5'-UU CCCUUCCGGAAUUACAUUA-3'5'-UU CCCUUCCGGAAUUACAUUA-3 ' 1616 313-335313-335 센스sense 5'-CCAGCUGUGUGUACUCAAU UU-3'5'-CCAGCUGUGUGUACUCAAU UU-3 ' 1717 안티센스Antisense 5'-UU GGUCGACACACAUGAGUUA-3'5'-UU GGUCGACACACAUGAGUUA-3 ' 1818 811-833811-833 센스sense 5'-GGAAGGCCUUAAUGUAAUA UU-3'5'-GGAAGGCCUUAAUGUAAUA UU-3 ' 1919 안티센스Antisense 5'-UU CCUUCCGGAAUUACAUUAU-3'5'-UU CCUUCCGGAAUUACAUUAU-3 ' 2020

사람 AKT1 특이적인 siRNAHuman AKT1 specific siRNA 표적부위Target site siRNA 서열siRNA sequence 서열번호SEQ ID NO: 1007-10291007-1029 센스sense 5'-GUGGUCAUGUACGAGAUGA UU-3'5'-GUGGUCAUGUACGAGAUGA UU-3 ' 2121 안티센스Antisense 5'-UU CACCAGUACAUGCUCUACU-3'5'-UU CACCAGUACAUGCUCUACU-3 ' 2222 96-11896-118 센스sense 5'-GCACCUUCAUUGGCUACAA UU-3'5'-GCACCUUCAUUGGCUACAA UU-3 ' 2323 안티센스Antisense 5'-UU CGUGGAAGUAACCGAUGUU-3'5'-UU CGUGGAAGUAACCGAUGUU-3 ' 2424 853-875853-875 센스sense 5'-CGGGCACAUUAAGAUCACA UU-3'5'-CGGGCACAUUAAGAUCACA UU-3 ' 2525 안티센스Antisense 5'-UU GCCCGUGUAAUUCUAGUGU-3'5'-UU GCCCGUGUAAUUCUAGUGU-3 ' 2626 72-9472-94 센스sense 5'-GCUACUUCCUCCUCAAGAA UU-3'5'-GCUACUUCCUCCUCAAGAA UU-3 ' 2727 안티센스Antisense 5'-UU CGAUGAAGGAGGAGUUCUU-3'5'-UU CGAUGAAGGAGGAGUUCUU-3 ' 2828 527-549527-549 센스sense 5'-GCCAUGAAGAUCCUCAAGA UU-3'5'-GCCAUGAAGAUCCUCAAGA UU-3 ' 2929 안티센스Antisense 5'-UU CGGUACUUCUAGGAGUUCU-3'5'-UU CGGUACUUCUAGGAGUUCU-3 ' 3030

사람 AKT2 특이적인 siRNAHuman AKT2 specific siRNA 표적부위Target site siRNA 서열siRNA sequence 서열번호SEQ ID NO: 1010-10321010-1032 센스sense 5'-GUGGUCAUGUACGAGAUGA UU-3'5'-GUGGUCAUGUACGAGAUGA UU-3 ' 2121 안티센스Antisense 5'-UU CACCAGUACAUGCUCUACU-3'5'-UU CACCAGUACAUGCUCUACU-3 ' 2222 429-451429-451 센스sense 5'-GGGCUAAAGUGACCAUGAA UU-3'5'-GGGCUAAAGUGACCAUGAA UU-3 ' 3131 안티센스Antisense 5'-UU CCCGAUUUCACUGGUACUU-3'5'-UU CCCGAUUUCACUGGUACUU-3 ' 3232 96-11896-118 센스sense 5'-GCUCCUUCAUUGGGUACAA UU-3'5'-GCUCCUUCAUUGGGUACAA UU-3 ' 3333 안티센스Antisense 5'-UU CGAGGAAGUAACCCAUGUU-3'5'-UU CGAGGAAGUAACCCAUGUU-3 ' 3434 1218-12401218-1240 센스sense 5'-GGUUCUUCCUCAGCAUCAA UU-3'5'-GGUUCUUCCUCAGCAUCAA UU-3 ' 3535 안티센스Antisense 5'-UU CCAAGAAGGAGUCGUAGUU-3'5'-UU CCAAGAAGGAGUCGUAGUU-3 ' 3636 858-880858-880 센스sense 5'-GCCACAUCAAGAUCACUGA UU-3'5'-GCCACAUCAAGAUCACUGA UU-3 ' 3737 안티센스Antisense 5'-UU CGGUGUAGUUCUAGUGACU-3'5'-UU CGGUGUAGUUCUAGUGACU-3 ' 3838

사람 TCL1 특이적인 siRNAHuman TCL1 specific siRNA 표적부위Target site siRNA 서열siRNA sequence 서열번호SEQ ID NO: 104-126104-126 센스sense 5'-CCCUUAACCAUCGAGAUAA UU-3'5'-CCCUUAACCAUCGAGAUAA UU-3 ' 3939 안티센스Antisense 5'-UU GGGAAUUGGUAGCUCUAUU-3'5'-UU GGGAAUUGGUAGCUCUAUU-3 ' 4040 275-297275-297 센스sense 5'-CGCUUAGUGUACCACAUCA UU-3'5'-CGCUUAGUGUACCACAUCA UU-3 ' 4141 안티센스Antisense 5'-UU GCGAAUCACAUGGUGUAGU-3'5'-UU GCGAAUCACAUGGUGUAGU-3 ' 4242

도 11에 나타난 바와 같이, 인간 항암면역내성세포주인 CaSki/Db P3세포에 siRNA 처리 시 NANOG 단백질의 발현이 억제되었다.As shown in Fig. 11, the expression of NANOG protein was inhibited in the human anti-cancer immunostimulatory cell line CaSki / Db P3 cells upon siRNA treatment.

또한, 도 9에 나타난 바와 같이, NANOG를 발현하는 인간 항암면역내성세포주의 경우, T세포의 공격에 내성을 나타냈다. In addition, as shown in FIG. 9, in the case of the human anti-cancer immunostimulatory cell line expressing NANOG, it was resistant to attack of T cells.

그러나, siRNA를 처리하여 NANOG의 발현을 저하시킨 경우 상기 내성효과에 미치는 영향을 조사한 결과, 대조군인 녹색형광단백질(GFP)의 siRNA를 처리한 인간 항암면역내성 세포주는 T세포의 공격에 거의 영향을 미치지 않았으나, NANOG의 siRNA를 처리한 경우에는 T세포의 공격에 대한 내성이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. However, when the expression of NANOG was decreased by treatment with siRNA, the anti-cancer immunostaining cell line treated with siRNA of green fluorescent protein (GFP) as a control group had almost no effect on T cell attack However, when NANOG siRNA was treated, it was confirmed that the resistance against T cell attack was decreased.

도 13은 CaSki/Db NANOG 세포주에서 인간 AKT1 표적부위인 1007-1029 (서열번호 21)과 인간 AKT2의 표적부위인 1010-1032 (서열번호 21)을 처리함에 따른 T세포의 공격에 대한 내성이 무력화됨을 보여준다 (서열번호 21은 인간 AKT1과 AKT2를 동시에 표적화 한다). Figure 13 shows that the resistance to attack of T cells due to treatment of human AKT1 target site 1007-1029 (SEQ ID NO: 21) and human AKT2 target site 1010-1032 (SEQ ID NO: 21) in CaSki / Db NANOG cell line (SEQ ID NO: 21 targets both human AKT1 and AKT2).

도 14는 CaSki/Db NANOG 세포주에서 인간 TCL1 표적부위인 104-126 (서열번호 39)를 처리함에 따라 pAKT 발현양이 감소됨과 동시에 T세포의 공격에 대한 내성이 무력화됨을 보여준다.
FIG. 14 shows that the treatment of human TCL1 target site 104-126 (SEQ ID NO: 39) in the CaSki / Db NANOG cell line reduced the amount of pAKT expression and at the same time, the tolerance to T cell attack was abolished.

<< 실시예Example 7> 세포의  7> cells 이동능Mobile ability 관찰 observe

본 발명의 NANOG 유전자가 세포이동능에 미치는 영양을 확인하기 위하여 NANOG를 과발현하는 TC-1 P3 와 CaSki/Db P3 세포주를 이용하였다. 대조군으로 siRNA GFP를 이용하였으며, siRNA NANOG를 이용하여 TC-1 P3와 CaSki/Db P3 세포에서 NANOG의 발현을 저하시킨 후, 세포 배양용 6-웰 플레이트에 각각의 세포를 1 x106개 깔아주었다. 일정한 넓이로 상처를 낸 후 12, 24시간의 경과에 따른 상처 회복능을 관찰하였다.TC-1 P3 and CaSki / Db P3 cell lines overexpressing NANOG were used to confirm the nutrition of the NANOG gene of the present invention on cell migration ability. SiRNA GFP was used as a control, NANOG expression was reduced in TC-1 P3 and CaSki / Db P3 cells using siRNA NANOG, and 1 x 10 6 cells were placed on a 6-well plate for cell culture . After wounding with a certain width, the ability to recover the wound was observed after 12 or 24 hours.

도 17 및 도 18에 나타난 바와 같이, NANOG을 과발현하는 세포주 모두 NANOG를 포함하지 않은 대조군에 비해 빠른 시간 내에 이동함을 확인하였다. 그러나, siRNA NANOG를 이용하여 TC-1 P3와 CaSki/Db P3 세포에서 NANOG의 발현을 저하시키면 세포의 이동능력이 감소됨을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 17 and FIG. 18, it was confirmed that the cell line overexpressing NANOG migrated within a shorter time than the control group without NANOG. However, it was confirmed that when NANOG expression was decreased in TC-1 P3 and CaSki / Db P3 cells using siRNA NANOG, the cell migration capacity was decreased.

<< 실시예Example 8> 세포의  8> cells 침윤능Invasiveness 관찰 observe

본 발명의 NANOG 유전자의 침윤능을 확인하기 위하여 NANOG를 과발현하는 TC-1 P3 와 CaSki/Db P3 세포주를 이용하였다. 대조군으로 siRNA GFP를 이용하였으며, siRNA NANOG를 이용하여 TC-1 P3와 CaSki/Db P3 세포에서 NANOG의 발현을 저하시킨 후, 매트리젤을 세포배양배지와 1:3 비율로 섞어준 후 8.0 ㎛의 구멍크기를 가진 세포배양첨가막 (Cell culture insert membrane,Falcon,USA)에 50 ㎕ 넣고 37℃ 배양기에서 30분간 정치하여 굳혔다. 세포 배양용 24-웰 플레이트에 10% FBS 배지를 500 ㎕ 넣고 굳힌 매트리젤이 들어있는 세포배양첨가막을 넣어준 후 그 안에 각각의 1x105개 세포를 0.1% FBS 배지와 섞어 넣었다. 24시간 경과 후 세포막을 뚫고 나온 세포의 수를 관찰하였다. In order to confirm the invasiveness of the NANOG gene of the present invention, TC-1 P3 and CaSki / Db P3 cell lines overexpressing NANOG were used. The expression of NANOG was decreased in TC-1 P3 and CaSki / Db P3 cells using siRNA GFP as a control, and the matrigel was mixed with the cell culture medium at a ratio of 1: 3, 50 μl was added to the cell culture insert membrane (Falcon, USA) with a pore size, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes at 37 ° C in an incubator. To the 24-well plate for cell culture, 500 μl of 10% FBS medium was added, and a cell culture-supplemented membrane containing a hardened matrigel was added. Each 1 × 10 5 cells were mixed with 0.1% FBS medium. After 24 hours, the number of cells that penetrated the cell membrane was observed.

도 17 및 도 18에 나타난 바와 같이, NANOG을 과발현하는 세포주 모두 NANOG를 포함하지 않은 대조군에 비해 침윤능이 현저히 증가함을 확인하였다.
As shown in FIG. 17 and FIG. 18, it was confirmed that the invasion performance of the cell line overexpressing NANOG was significantly increased compared with the control group not containing NANOG.

<< 실시예Example 9>  9> 시험관내In vitro 종양형성능Tumor formation ability 확인( Confirm( 종양구Tumor zone 형성 실험) Formation experiment)

각각의 세포 5 x 103 개를 20 ng/ml EGF(epitdermal growth factor; Invitrogen, USA )와 20 ng/ml의 bFGF(basic fibroblast growth factor; Invitrogen ) 그리고 1X B27 가 포함된 1 ml DMEM-F12 배지에 넣고 24well-super-low adherence plates (Corning, Lowell, MA)에서 2주간 키우면서 관찰하였다. 이때 3일마다 새로운 배지를 100ul씩 넣어주었다. 형성된 종양구는 광학현미경을 이용하여 사진 이미지를 획득한 후 종양구의 직경을 측정함으로서 20~50 um이상의 종양구를 계수하여 정량하였다.
5 x 10 3 of each of the cells was inoculated into 1 ml of DMEM-F12 medium containing 20 ng / ml EGF (epithelium growth factor; Invitrogen, USA), 20 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor; Invitrogen) And were grown in 24-well-super-low adherence plates (Corning, Lowell, Mass.) For 2 weeks. At this time, 100 μl of fresh medium was added every 3 days. The tumor was obtained by photographing using a light microscope and measuring the diameter of the tumor.

<< 실시예Example 10>  10> 생체내In vivo 종양형성능Tumor formation ability 확인 Confirm

각각의 세포를 Opti-MEM I(GIBCO, USA)에 넣어 희석한 후 NOD/SCID 생쥐의 복부 표피에 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105의 세포를 각각 주입한다. 각각의 생쥐에 대하여 종양의 생성 유무를 일주일에 3번씩 관찰하고 기록하였다.
Each cell was diluted in Opti-MEM I (GIBCO, USA) and injected with 1 × 10 2 , 1 × 10 3 , 1 × 10 4 , and 1 × 10 5 cells into the abdominal epidermis of the NOD / do. For each mouse, the presence or absence of tumor formation was observed and recorded three times a week.

<< 실시예Example 11>  11> 생체내In vivo 항암면역내성Anti-cancer immunity 무력화 확인 Confirmation of neutralization

HCT116/SCT E7 세포를 NOD-SCID생쥐군(암컷, 5주령, n=5, 중앙실험동물) 각각의 복부 표피에 1 X 106 개씩 주입하고, 주입 10일째에 siRNA NANOG를 탑재한 키토산 나노파티클을 정맥주사로 주입하였다. 이때 대조군으로는 siRNA GFP를 탑재한 키토산 나노파티클을 주입하여 확인하였다. 키토산 나노파티클은 2일 간격으로 3번 주입하고 2일 경과한 후 E7특이적인 CD8+ T세포를 IL-2와 함께 정맥주사하여 면역하였다. 또다시 2일 경과 후 키토산 나노파티클 3번 주입과 E7 T세포의 주입을 하는 과정을 2번 반복하였다. 각각의 생쥐에 대하여 종양체적을 캘리버 (caliber; Mitutoyo, Japan)로 측정하여, 종양체적은 (단축x장축2)/2의 식으로 구하였다.1 × 10 6 HCT116 / SCT E7 cells were injected into the abdominal epidermis of each of the NOD-SCID mice (female, 5 weeks old, n = 5, central laboratory animal), and the chitosan nanoparticles Were injected intravenously. At this time, siRNA GFP-loaded chitosan nanoparticles were injected as a control. Chitosan nanoparticles were injected three times at 2-day intervals, and after 2 days, E7-specific CD8 + T cells were immunized with IL-2 intravenously. After 2 days, the chitosan nanoparticle injection 3 and E7 T cell injection were repeated twice. Tumor volume was determined by caliber (caliber; Mitutoyo, Japan) for each mouse, and the tumor volume was calculated by the equation (short axis x long axis 2 ) / 2.

도 16에 나타난 바와 같이, siRNA NANOG를 탑재한 키토산 나노파티클과 CD8+ T세포를 함께 주입하여 준 그룹에서 대조군에 비해 유의적으로 종양체적이 감소하였다. 이는 Nanog 표적화에 의해 Nanog 의존적 면역내성 무력화되어 항암면역치료 효능이 증진됨을 실증하는 것이다.
As shown in FIG. 16, when the chitosan nanoparticles loaded with the siRNA NANOG were injected together with the CD8 + T cells, the tumor volume was significantly decreased as compared with the control group. This demonstrates that Nanog-induced immune-tolerance is abolished by Nanog targeting to enhance the anti-cancer immunotherapy efficacy.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is evident that many alternatives, modifications, and variations will be apparent to those skilled in the art. It is therefore intended that the scope of the present invention be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Composition for prevention or treating recurrent or metastatic cancer having immunoresistance <130> P11-120626-01 <160> 42 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 ccacaagccu uggaauuauu u 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 uugguguucg gaaccuuaau a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 gacuccacca ggugaaauau u 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 uucugaggug guccacuuua u 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 cccgagaacu auucuugcuu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 uugggcucuu gauaagaacg a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 cacucaagga cagguuucau u 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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uaacgucgau a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 11 ccuccaugga ucugcuuauu u 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 12 uuggagguac cuagacgaau a 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 13 ccacaaacca uggauuuauu u 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 14 uugguguuug guaccuaaau a 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 15 gggaaggccu uaauguaauu u 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 16 uucccuuccg gaauuacauu a 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 17 ccagcugugu guacucaauu u 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 18 uuggucgaca cacaugaguu a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 19 ggaaggccuu aauguaauau u 21 <210> 20 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Claims (9)

NANOG 유전자에 대한 siRNA; 또는 NANOG 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물.
SiRNA against the NANOG gene; Or an antibody that specifically binds to a NANOG protein. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt;&lt; / RTI &gt;
제1항에 있어서, 상기 NANOG 유전자에 대한 siRNA는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 센스 및 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 안티센스를 포함하는 siRNA인 것을 특징으로 하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 예방 또는 치료용 조성물.
The siRNA for NANOG gene according to claim 1, wherein the siRNA for NANOG gene comprises at least one sense selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 and 19, Wherein the siRNA comprises siRNA comprising at least one antisense selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20.
삭제delete 삭제delete NANOG 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 PCR 조성물.
A PCR composition for the recurrence and metastasis diagnosis of cancer-resistant immunostaining cancer comprising a primer capable of amplifying NANOG gene.
NANOG 유전자와 혼성화 할 수 있는 프로브를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 키트.
A kit for the recurrence and metastasis diagnosis of an anti-cancer immunostaining cancer comprising a probe capable of hybridizing with a NANOG gene.
NANOG 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 진단용 키트.
A kit for the recurrence and metastasis diagnosis of an anti-cancer immunosuppressive cancer comprising an antibody specifically binding to NANOG protein.
NANOG 단백질을 발현하는 세포주에 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질이 처리된 세포주(실험군) 내의 NANOG 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
상기 후보물질 미처리 세포주(대조군)와 비교하여 NANOG 단백질의 발현량이 감소하는 경우의 후보물질을 항암면역내성암의 재발 및 전이의 치료제로 선별하는 단계를 포함하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제의 스크리닝 방법.
Treating the cell line expressing the NANOG protein with a candidate agent for recurrence and metastatic treatment of the cancer-resistant immune system;
Measuring the expression level of the NANOG protein in the cell line treated with the candidate substance (experimental group); And
And a step of selecting a candidate substance when the expression level of the NANOG protein is decreased as compared with the candidate cell untreated cell line (control group), as a therapeutic agent for recurrence and metastasis of the anti-cancer immunostaining cancer. Screening method.
제8항에 있어서, 상기 세포주는 TC-1/NANOG 또는 CaskiDb/NANOG 세포주인 것을 특징으로 하는 항암면역내성암의 재발 및 전이 치료제의 스크리닝 방법.[Claim 9] The method according to claim 8, wherein the cell line is a TC-1 / NANOG or CaskiDb / NANOG cell line.
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