KR20190110258A - 박막간섭효과 기반 광학탐침자 - Google Patents
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Abstract
구형 유전체 상에 광대역 광원을 조사하는 단계; 상기 구형 유전체로부터의 반사광의 간섭 스펙트럼을 측정하는 단계; 및 상기 반사광을 박막 간섭이론(thin-film interference theory)을 통해 해석하는 단계; 를 포함하는, 광학 표지자의 분석 방법에 관한 것이다.
Description
본원은 구형 유전체에서 나타나는 박막간섭효과에 기반한 광학탐침자에 관한 것이다.
복잡한 조직 내에서 서로 다른 개체들을 표지해 줄 수 있는 광학 표지자는 생물학 연구에서의 활용도가 높다. 특히, 같은 종류의 세포일지라도 서로 다른 유전자를 발현하기 때문에 서로 다른 세포들을 각각 관찰하는 것이 암의 전이 과정이나 생물의 발생 과정 관찰에 유용하다. 가장 많이 활용되는 광학 표지자인 형광 표지자는 사용하기 쉽다는 장점이 있다. 하지만 광 표백(photobleaching) 현상이 일어나 시간이 지날수록 신호가 약해지기 때문에 긴 시간 동안 형광 표지가 된 개체를 추적할 수 없는 문제점이 있다. 또한, 형광 표지자는 상대적으로 넓은 발광 스펙트럼 영역을 가지기 때문에 동시에 표지 가능한 색이 3개 내지 5개로 제한되어 수 백, 수 천의 세포를 개체 별로 동시에 표지할 수 없는 단점이 있다.
본원의 배경이 되는 기술인 한국공개특허공보 제 2017-0075221호는 바이오 센서용 광학 표지자, 이를 포함하는 광학 바이오센서 및 상기 바이오 센서용 광학 표지자의 제조방법에 관한 것이다. 그러나, 상기 공개 특허는 목적 생체물질과 선택적으로 결합하는 생체인지물질을 포함하는 바이오 센서용 광학 표지자에 관한 것으로서, 수 백개 이상의 마이크로 물질의 크기를 동시에 분석할 수 있는 기술에 대해서는 언급하고 있지 않다.
본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 광학 표지자의 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들에 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1측면은, 구형 유전체 상에 광대역 광원을 조사하는 단계; 상기 구형 유전체로부터의 반사광의 간섭 스펙트럼을 측정하는 단계; 및 상기 반사광을 박막 간섭이론(thin-film interference theory)을 통해 해석하는 단계; 를 포함하는, 광학 표지자의 분석 방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반사광을 상기 박막 간섭이론을 통해 해석하기 전 상기 광대역 광원 및 상기 반사광을 정규화 시키는 단계를 추가 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면 상기 박막 간섭이론을 통해 상기 반사광을 해석하는 것은 하기 수학식 1 내지 수학식 4를 통해 해석한 반사광의 세기(R)의 함수와 실제 측정한 반사광의 세기(R)를 비교하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[수학식 1]
상기 수학식 1에서, 상기 구형 유전체가 m개의 층으로 이루어졌을 때, 상기 J는 하기 수학식 2로서 나타내며,
[수학식 2]
상기 H는 하기 수학식 3으로서 나타내며,
[수학식 3]
상기 수학식 1, 2 및 3에서, 상기 di는 상기 구형 유전체의 i 번째 박막의 두께이고, 상기 θi는 상기 광대역 광원이 입사하는 각의 크기이고, 상기 ni는 상기 구형 유전체의 i 번째 박막의 굴절률이고, 횡방향 전계 모드일 때, 상기 si는 1이고, 상기 ti는 nicosθi이고, 상기 k는 
로서 나타내고, 횡방향 자계 모드일 때, 상기 si는 cosθi이고, ti는 ni인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[수학식 4]
상기 수학식 4에서 R은 반사광의 세기이다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체의 직경은 0.1 μm 내지 500 μm인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체는 고형의 고분자, 하이드로젤, 리포좀 및 이들의 조합들을 포함하는 연성 물질, 또는 에어로젤을 포함하는 기체 기반 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체는 하나 또는 두 개 이상의 물질 층을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 상기 구형 유전체 표면은 결합 특이성을 가지는 물질이 도포된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체는 반응 민감성을 가져 화학적 또는 물리적 조건에 따라 크기 또는 내부 굴절률이 변동되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체는 두께 또는 내부 굴절률 이 상이한 복수 층의 구형 유전체를 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 광대역 광원은 파장의 대역폭이 20 nm 내지 2,000 nm인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반사광의 간섭 스펙트럼을 측정하는 단계는 분광기 혹은 음향광변조필터에 의해 수행되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 공초점 광학계를 통해 상기 구형 유전체의 중심에서 반사되는 반사광의 광초점 신호만을 선택적으로 수집하여 간섭 스펙트럼을 측정하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 광학 표지자의 분석 방법은 구형 유전체의 크기를 분석하기 위해 반복하여 측정하였을 때, 상기 측정의 표준 편차는 2 nm 이내로, 정밀도가 높다. 때문에 최대 1 μm 정도의 크기 차이가 나는 표지자들이 존재할 때20 개 이상의 상기 구형 유전체의 크기를 동시에 분석할 수 있다. 나아가, 크기의 편차가 1 μm 보다 더 큰 상기 구형 유전체의 크기를 분석할 때, 수 천 개 이상을 동시에 분석할 수 있다. 이는 종래 기술인 형광 표지자가 동시에 표지할 수 있는 것이 3개 내지 5개로 제한되어 있는 기존의 단점을 극복한 것이다. 여러 대상을 동시에 분석할 수 있기 때문에, 세포 군집체 내의 개별 세포들을 추적 관찰할 수 있으며, 특히 암 전이를 추적 및 암 치료 연구에 활용할 수 있다. 또한, 다종의 유전자를 표지할 수 있어 대용량 유전자 분석에 활용이 가능하고 조직 내 세포의 다양성을 조사할 수 있다.
또한, 본원의 일 구현예에 따른 광학 표지자의 분석 방법을 이용했을 때, 반사된 광원의 세기가 종래 기술인 형광 표지자의 세기보다 10배 이상 높아 쉽게 검출할 수 있으며, 상기 반사된 광원의 세기가 일정하게 오랜 시간 동안 유지될 수 있는 안정성이 높다.
더욱이, 구형 유전체 상에 분석 물질과 선택적으로 결합하는 인지 물질을 추가적으로 결합시키는 경우 선택적으로 세포 및 다른 시료들을 표지할 수 있다. 상기 인지 물질이 결합되면 분석하고자 하는 물질에 대한 선택성이 높아져 원하는 물질을 표지하는 데 더욱 용이해진다.
나아가, 특정한 단백질 또는 특정 분자를 검출할 수 있는 검출기에 활용할 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 광학 표지자의 분석 방법의 순서도이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 구형 유전체의 3D 스캐닝 방법의 모식도이다.
도 3의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 1 μm 내지 5 μm 크기의 마이크로 비드에서 나오는 반사 스펙트럼을 2D로 나타낸 그래프이고, 도 3의 (b)는 상기 도 3의 (a)에 나타난 그래프에서 3 개의 마이크로 비드의 반사 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4의 (a)는 비교예로서 형광 표지자가 염색된 마이크로 비드의 형광 영상이고, 도 4의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자의 스펙트럼이고, 도 4의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자의 크기를 반복적으로 측정하였을 때 나타나는 측정횟수에 따른 상기 반사광 표지자의 크기를 나타낸 것이고, 도 4의 (d)는 상기 도 4의 (c)에 나타난 상기 반사광 표지자의 크기의 표준편차를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 영상이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 세기를 나타낸 그래프이다.
도 7은 지속적으로 빛을 주었을 때 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 신호 크기를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체를 나타낸 사진이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체의 스펙트럼을 파수에 따른 강도로 나타낸 그래프이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체의 크기를 시간에 따라 측정했을 때 나타나는 그래프이다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자 상에 검출하고자 하는 분자가 흡착되었을 때 나타나는 변화 사진 및 스펙트럼이다.
도 12는 본원의 일 구현예에 따른 복수 층의 구형 유전체의 그림이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 구형 유전체의 3D 스캐닝 방법의 모식도이다.
도 3의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 1 μm 내지 5 μm 크기의 마이크로 비드에서 나오는 반사 스펙트럼을 2D로 나타낸 그래프이고, 도 3의 (b)는 상기 도 3의 (a)에 나타난 그래프에서 3 개의 마이크로 비드의 반사 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4의 (a)는 비교예로서 형광 표지자가 염색된 마이크로 비드의 형광 영상이고, 도 4의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자의 스펙트럼이고, 도 4의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자의 크기를 반복적으로 측정하였을 때 나타나는 측정횟수에 따른 상기 반사광 표지자의 크기를 나타낸 것이고, 도 4의 (d)는 상기 도 4의 (c)에 나타난 상기 반사광 표지자의 크기의 표준편차를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 영상이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 세기를 나타낸 그래프이다.
도 7은 지속적으로 빛을 주었을 때 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 신호 크기를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체를 나타낸 사진이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체의 스펙트럼을 파수에 따른 강도로 나타낸 그래프이다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체의 크기를 시간에 따라 측정했을 때 나타나는 그래프이다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자 상에 검출하고자 하는 분자가 흡착되었을 때 나타나는 변화 사진 및 스펙트럼이다.
도 12는 본원의 일 구현예에 따른 복수 층의 구형 유전체의 그림이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, 표지자, 구형 유전체 및 탐침자는 같은 의미로 사용되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하에서는 본원의 광학 표지자의 분석 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1측면은 구형 유전체 상에 광대역 광원을 조사하는 단계; 상기 구형 유전체로부터의 반사광의 간섭 스펙트럼을 측정하는 단계; 및 상기 반사광을 박막 간섭이론(thin-film interference theory)을 통해 해석하는 단계; 를 포함하는, 광학 표지자의 분석 방법에 관한 것이다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 광학 표지자의 분석 방법의 순서도이다.
먼저, 구형 유전체 상에 광대역 광원을 조사한다(S100).
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체의 직경은 0.1 μm 내지 500 μm인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형은 원형의 입체 모양인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형은 한 정점에서 일정한 거리에 있는 점의 자취를 구면이라고 했을 때, 상기 구면을 경계로 하는 입체 모양인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체는 예외적으로 섬유 형태인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 섬유 형태는 종횡비가 10 이상인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체는 고형의 고분자, 하이드로젤, 리포좀 및 이들의 조합들을 포함하는 연성 물질, 또는 에어로젤을 포함하는 기체 기반 물질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체는 마이크로 비드를 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 마이크로 비드는 유전 물질로 이루어진 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 광학 표지자의 분석 방법으로 표지 또는 검출할 수 있는 대상은 세포, 단백질, 분자, 항체, 효소, 양자점, 바이러스, 박테리아 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 물질인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질은 tert-뷰틸옥시카보닐-디페닐알라닌(Boc-Diphenylalanine), 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신, 루신, 발린, 이소루신, 히스티딘 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 단백질을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체는 하나 또는 두 개 이상의 물질 층을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체가 하나 또는 두 개 이상의 물질 층을 포함하여도 상기 박막 간섭 이론을 통한 하기 수학식 1 내지 수학식 4를 통해 상기 구형 유전체의 각 물질층의 두께를 알 수 있다.
본원의 일 구현예에 상기 구형 유전체 표면은 결합 특이성을 가지는 물질이 도포된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체 표면은 항원 또는 항체가 형성되어 있어 상기 항원 또는 상기 항체에 대해 특이적 반응을 나타내는 항체 또는 항원의 검출을 용이하게 할 수 있다. 즉, 상기 구형 유전체의 크기를 정확히 측정함으로써 특정 물질을 표지하거나 검출할 수 있을 뿐만 아니라 상기 결합 특이성을 가지는 물질이 도포되어 있어, 원하는 물질을 선택적으로 표지 및 검출 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체는 반응 민감성을 가져 화학적 또는 물리적 조건에 따라 크기 또는 내부 굴절률이 변동되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 구형 유전체는 두께 또는 내부 굴절률이 상이한 복수 층의 구형 유전체를 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체를 20 개 이상을 동시에 분석할 수 있는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체의 복수 층은 하나 이상의 층으로 형성되어 있는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 12는 본원의 일 구현예에 따른 복수 층의 구형 유전체의 그림이다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 광대역 광원은 파장의 대역폭이 20 nm 내지 2,000 nm 인 것 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 광대역 광원의 파장의 대역 폭이 넓을수록 정확하고 정밀한 분석이 가능하다. 때문에, 상기 광대역 광원의 파장의 대역폭이 2,000 nm 이상일 때에도 광학 표지자의 분석 방법을 수행할 수 있다.
상기 광대역 광원은 LED(light emitting diode), OLED(organic light emitting diode), 레이저(Laser), 텅스텐 램프(tungsten lamp) 및 이들의 조합들로부터 발생된 광원을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이어서, 상기 구형 유전체로부터의 반사광의 간섭 스펙트럼을 측정한다(S200).
상기 반사광은 상기 조사된 광대역 광원에 대해 프레넬 반사(Fresnel reflection)되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반사광의 간섭 스펙트럼을 측정하는 단계는 분광기 혹은 음향광변조필터에 의해 수행되는 것 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 공초점 광학계를 통해 상기 반사광의 광초점 신호만을 선택적으로 수집하여 간섭 스펙트럼을 측정하는 것 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공초점 광학계는 공초점 현미경을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공초점 광학계는 핀홀(phinhole)을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공초점 광학계는 상기 핀홀을 이용하여 초점에서 반사된 빛만 받아들일 수 있어 더 선명한 이미지를 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 공초점 광학계를 이용하여 시편을 관찰 또는 측정할 때, 입사된 광원이 상기 시편에 조사되고, 상기 시편에 반사된 광원이 핀홀을 통해 광 검출기를 통과하게 된다. 이 때, 상기 시편의 중심 (또는 마이크로 비드의 중심) 이외에 의해 반사된 광원은 상기 핀홀을 통해 광 검출기를 통과하지 못하게 된다. 따라서, 상기 핀홀이 상기 시편의 중심 (또는 마이크로 비드의 중심) 이외에 의해 반사된 빛을 걸러줌으로써 더욱 선명한 이미지를 얻을 수 있다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 구형 유전체의 3D 스캐닝 방법의 모식도이다.
구체적으로, 상기 반사광 중 가장 강하게 반사되는 광원을 찾기 위해 상기 구형 유전체를 공초점 현미경을 이용하여 3D로 스캐닝하는 단계를 추가 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 공초점 현미경을 이용한 3D 스캐닝을 통해 가장 강하게 반사되는 광원의 스펙트럼을 나타내는 것 일 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 반사광을 상기 박막 간섭이론을 통해 해석하기 전 상기 광대역 광원 및 상기 반사광을 정규화 시키는 단계를 추가 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 정규화는 상기 조사된 광대역 광원의 스펙트럼의 값을 상기 반사광의 스펙트럼의 값으로 나누는 것 일 수 있다. 또는 상기 정규화는 상기 반사광의 스펙트럼의 값을 상기 조사된 광원의 스펙트럼의 값으로 나누는 것 일 수 있다.
상기 반사광은 상기 구형 유전체의 바깥쪽 면 및/또는 안쪽 면에서 반사되는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체의 서로 다른 두 면에서 반사된 반사광 사이에서 간섭 현상이 발생할 수 있다. 이 때의 광 스펙트럼은 파수(wavenumber)에 대해 사인 함수 또는 코사인 함수처럼 주기적인 모양이 나타날 수 있다.
이어서, 상기 반사광을 박막 간섭이론을 통해 해석한다(S300).
본원의 일 구현예에 따르면 상기 박막 간섭이론을 통해 상기 반사광을 해석하는 것은 하기 수학식 1 내지 수학식 4를 통해 해석한 반사광의 세기(R)의 함수와 실제 측정한 반사광의 세기(R)를 비교하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[수학식 1]
상기 수학식 1에서, 상기 구형 유전체가 m개의 층으로 이루어졌을 때, 상기 J는 하기 수학식 2로서 나타내며,
[수학식 2]
상기 H는 하기 수학식 3으로서 나타내며,
[수학식 3]
상기 수학식 1, 2 및 3에서, 상기 di는 상기 구형 유전체의 i 번째 박막의 두께이고, 상기 θi는 상기 광대역 광원이 입사하는 각의 크기이고, 상기 ni는 상기 구형 유전체의 i 번째 박막의 굴절률이고, 상기 k는 
로서 나타내고, 횡방향 전계 모드일 때, 상기 si는 1이고, 상기 ti는 nicosθi이고, 횡방향 자계 모드일 때, 상기 si는 cosθi이고, ti는 ni인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[수학식 4]
상기 수학식 4에서 R은 반사광의 세기이다.
상기 k는 파수이다.
상기 수학식 1은 입사된 광원의 전자기파가 상기 구형 유전체를 통과하고 난 후의 전자기파를 예측할 때 사용되는 특성행렬(characteristic matrix)이다. 상기 특성행렬은 
과 같은 형태로 나타낼 수 있으며, 상기 E1및 상기 H1은 각각 독립적으로 유전체를 통과하기 전의 전기장 및 자기장이고, 상기 E2및 H2는 각각 독립적으로 유전체를 통과하고 난 후 변화한 전기장 및 자기장이다.
상기 수학식 1 내지 3을 통해 상기 특성행렬의 M을 구한 후, 상기 수학식 4를 통해서 각 파장 별 반사광의 세기 R을 구할 수 있으며, 이를 측정값과 비교하여 구형 유전체의 크기를 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 수학식 1 내지 4를 통해 상기 반사광의 세기 R을 파장 (λ) 또는 파수(k)에 대한 함수로서 나타낼 수 있다. 예를 들어 도 3의 (b)를 참조하면, 파수에 따른 정규화된 반사광의 세기를 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 그래프로서 나타낼 수 있으며, 상기 그래프는 구형 유전체의 직경에 따라 다르게 나타난다. 즉, 상기 수학식 1 내지 4를 통해 상기 구형 유전체의 직경에 따른 이론 값을 수득할 수 있고, 실험을 통해 측정한 값과 상기 이론 값을 비교하여 상기 구형 유전체의 크기(직경)을 분석할 수 있다.
상기 구형 유전체의 직경은 하기 수학식 5 및 6을 통해 분석할 수 있는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[수학식 5]
상기 수학식 5에서, R은 상기 반사광의 세기 이며, 상기 r01 및 r02는 각각 독립적으로, 
, 
이고, 상기 n0 및 n2는 각각 독립적으로, 상기 구형 유전체 주변 매질의 굴절률이고, 상기 n1은 상기 구형 유전체의 굴절률이고,
상기 δ는 하기 수학식 6으로서 나타나며,
[수학식 6]
상기 d는 상기 구형 유전체의 지름이고, 상기 λ는 상기 조사되는 광대역 광원의 파장인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 수학식 5 및 6은 상기 수학식 1 내지 4를 이용하여 도출한 식이다.
상기 구형 유전체가 단일 층으로 이루어졌을 때 상기 수학식 5 및 6을 통해 상기 구형 유전체의 직경을 구할 수 있다.
즉, 상기 수학식 5 및 6은 상기 구형 유전체가 단일 층으로 이루어 졌을 때, 상기 수학식 1 내지 4를 이용하는 것 보다 간단하게 상기 구형 유전체의 직경을 구할 수 있는 것이다.
상기 조사된 광대역 광원 및 상기 반사광을 정규화 시킨 스펙트럼을 상기 수학식 1 내지 수학식 6을 이용한 분석을 통해 상기 구형 유전체를 분석할 수 있다.
상기 수학식 1 내지 수학식 4는 박막간섭의 일반식으로서 하나 이상의 복수의 층으로 이루어진 모든 구형 유전체에서 발생하는 반사광을 분석할 수 있다.
상기 수학식 5 및 6은 단일층으로 이루어진 구형 유전체에서의 반사광을 분석할 수 있다.
상기 박막 간섭이론을 통해 상기 구형 유전체의 크기를 분석하고, 상기 구형 유전체 상에 표지 또는 검출하고자 하는 대상이 흡착되었을 때 나타나는 상기 구형 유전체의 크기 변화를 통해 상기 표지 또는 검출하고자 하는 대상의 존재 유무를 알 수 있다. 상기 표지 또는 검출하고자 하는 대상의 크기를 분석함으로써 상기 표지 또는 검출하고자 하는 대상을 파악할 수 있다.
상기 구형 유전체 상에 상기 표지 또는 검출하고자 하는 대상이 흡착할 수 있으며, 상기 흡착 여부에 따라 측정값이 달라지게 된다. 상기 측정값의 변화에 따라 흡착하는 상기 표지 또는 검출하고자 하는 대상을 분석할 수 있으며, 이를 이용하여 센서 또는 마커에 응용할 수 있다.
상기 박막 간섭이론에 빛의 회절 및 편광을 추가적으로 고려하기 위해 전자기파 이론(theory of electromagnetic wave)을 이용하여 상기 구형 유전체를 분석하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 수학식 1 내지 6은 전자기파 이론에 의해 유도된 식이다. 빛의 편광을 고려하여 상기 수학식 2에서 횡방향 전계 및 자계 모드에 따라 상기 s 및 상기 t 값이 다르게 표현될 수 있다.
회절이론을 이용하여 상기 구형 유전체를 분석하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체를 분석하는 것은 상기 유전체의 크기, 내부 굴절률, 특이성, 물질 등을 분석하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체의 크기를 측정하는 것의 오차는 2 nm 이하인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 구형 유전체의 크기를 분석하기 위해 반복하여 측정하였을 때, 상기 측정의 표준 편차는 2 nm 이내로, 정밀도가 높다. 때문에 최대 1 μm 정도의 크기 차이가 나는 표지자들이 존재할 때20 개 이상의 상기 구형 유전체의 크기를 동시에 분석할 수 있다. 나아가 크기의 편차가 1 μm 보다 더 큰 상기 구형 유전체의 크기를 분석할 때, 수 천 개 이상을 동시에 분석할 수 있다. 이는 종래 기술인 형광 표지자가 동시에 표지할 수 있는 것이 3개 내지 5개로 제한되어 있는 기존의 단점을 극복한 것이다. 여러 대상을 동시에 분석할 수 있기 때문에, 세포 군집체 내의 개별 세포들을 추적 관찰할 수 있으며, 특히 암 전이를 추적 및 암 치료 연구에 활용할 수 있다. 또한, 다종의 유전자를 표지할 수 있어 대용량 유전자 분석에 활용이 가능하고 조직 내 세포의 다양성을 조사할 수 있다.
상기 광학 표지자의 분석 방법을 이용했을 때, 상기 반사광의 세기가 종래 기술인 형광 표지자의 세기보다 10배 이상 높아 쉽게 검출할 수 있다. 또한, 상기 반사광의 세기가 일정하게 오랜 시간 동안 유지될 수 있는 안정성이 높다.
더욱이 상기 구형 유전체 상에 분석 물질과 선택적으로 결합하는 인지 물질을 추가적으로 결합시키는 경우 선택적으로 세포 및 다른 시료들을 표지할 수 있다. 상기 인지 물질이 결합되면 분석하고자 하는 물질에 대한 선택성이 높아져 원하는 물질을 표지하는 데 더욱 용이해진다.
상기 인지 물질은 특이성을 가지는 물질인 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 특정한 단백질 또는 특정 분자를 검출할 수 있는 검출기에 활용할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
먼저, 구형 유전체로서 사용한 마이크로 비드 상에 백색광을 조사했을 때, 가장 강하게 반사되는 빛을 찾기 위해 공초점 현미경으로 상기 마이크로 비드를 3D로 스캐닝하였다. 상기 3D 스캐닝한 결과에서 가장 강한 빛이 반사되는 부분의 입사광의 스펙트럼 및 반사광의 스펙트럼을 수득하였다. 상기 입사광의 스펙트럼으로 상기 반사광의 스펙트럼을 나눠서 정규화하였다. 상기 정규화된 스펙트럼을 하기 수학식 5를 이용하여 상기 마이크로 비드의 크기를 측정하였고, 상기 백색광이 조사된 마이크로 비드를 반사광 표지자라고 칭하였다.
[수학식 5]
상기 수학식 5에서, R은 상기 반사광의 세기 이며, 상기 r01 및 r02는 각각 독립적으로, 
, 
이고, 상기 n0 및 n2는 각각 독립적으로, 상기 마이크로 비드 주변 매질의 굴절률이고, 상기 n1은 상기 마이크로 비드의 굴절률이고,
상기 δ는 하기 수학식 6으로서 나타나며,
[수학식 6]
상기 d는 상기 마이크로 비드의 지름이고, 상기 λ는 상기 조사되는 광대역 광원의 파장을 나타낸다.
[실험예]
상기 실시예에서 제조된 반사광 표지자의 특성을 확인하였고 그 결과를 도 3 및 도 4로서 나타내었다.
도 3의 (a)는 본원의 일 실시예에 따른 0.1 μm 내지 5 μm 크기의 마이크로 비드에서 나오는 반사 스펙트럼을 2D로 나타낸 그래프이고, 도 3의 (b)는 상기 도 3의 (a)에 나타난 그래프에서 3 개의 마이크로 비드의 반사 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
구체적으로 도 3의 (a) 및 (b)의 그래프는 상기 수학식 5 및 6을 이용하여 상기 마이크로 비드의 크기 별 파수에 따른 정규화된 반사광 세기를 나타낸 것이다.
도 4의 (a)는 비교예로서 형광 표지자가 염색된 마이크로 비드의 형광 영상이고, 도 4의 (b)는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자의 스펙트럼이고, 도 4의 (c)는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자의 크기를 반복적으로 측정하였을 때 나타나는 측정횟수에 따른 상기 반사광 표지자의 크기를 나타낸 것이고, 도 4의 (d)는 상기 도 4의 (c)에 나타난 상기 반사광 표지자의 크기의 표준편차를 나타낸 그래프이다.
구체적으로, 도 4의 (a) 및 도 4의 (b)는 종래 기술인 형광 표지자와 본원 기술을 비교한 것이다. 형광 표지자가 염색된 마이크로 비드의 형광 영상으로는 도 4의 (a)에 나타나는 것처럼 상기 마이크로 비드의 크기를 비교하기 힘들다. 하지만, 도 4의 (b)에 나타나는 반사광 표지자의 파수에 따른 반사광의 강도를 나타낸 그래프를 상기 수학식 5 및 6 을 이용하여 나타낸 그래프인 도 3의 (a) 및 (b)에 나타난 결과 값과 비교하여 분석했을 때, 마이크로 비드ⅰ의 크기는 3.693 ㎛이고, 마이크로 비드 ⅱ의 크기는 3.684 ㎛이고, 마이크로 비드 ⅲ의 크기는 3.756 ㎛이고, 마이크로 비드 ⅳ의 크기는 3.742 ㎛으로 확인할 수 있다. 도 4의 (c)는 상기 반사광 표지자를 반복적으로 측정했을 때 나타나는 측정 횟수에 따른 상기 마이크로 비드의 크기를 나타낸 그래프로서, 최대 1.5 nm의 오차가 발생하였다. 도 4의 (d) 에서 나타난 표준편차는 1.3 nm로 정밀도가 매우 높은 것을 확인하였다. 이에, 20개 이상의 마이크로 물질의 크기를 동시에 측정 및 분석할 수 있다.
상기 실시예에서 제조한 반사광 표지자의 신호 세기 및 안정성을 확인하였고, 비교예로서 종래 기술인 형광 표지자를 이용한 방법의 신호 세기 및 안정성을 비교한 것을 도 5 내지 도 7로서 나타내었다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 영상이다.
도 5에서 나타난 결과에 따르면, 도 5의 왼쪽은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로서, 중앙에서 빛의 신호가 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 반면에, 도 5의 오른쪽은 비교예로서 형광 표지자로서, 빛의 신호가 약하기 때문에 45배 밝게 조절했을 때 검출할 수 있었다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 세기를 나타낸 그래프이다.
도 6에서 나타난 결과에 따르면, 상기 반사광 표지자와 상기 형광 표지자의 세기를 비교했을 때, 상기 반사광 표지자의 빛의 세기가 상기 형광 표지자의 빛의 세기보다 10배 이상 더 밝은 것을 확인할 수 있었다.
본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자는 종래 기술인 형광 표지자 보다 빛의 세기가 크기 때문에 검출에 용이하다.
도 7은 지속적으로 빛을 주었을 때 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자와 비교예로서 형광 표지자의 신호 크기를 나타낸 그래프이다.
도 7에서 나타난 결과에 따르면, 지속적으로 빛을 주었을 때, 상기 반사광 표지자는 일정한 세기를 나타내는 반면, 상기 형광 표지자의 세기는 점점 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자의 안정성이 높은 것을 확인 하였다.
상기 실시예에서 제조한 반사광 표지자의 세포 추적에 대한 특성을 확인하였고, 그 결과를 도 8 및 도 9로서 나타내었다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체를 나타낸 사진이다.
구체적으로, 도 8에서 붉은 색으로 표지된 부분은 세포막이고, 보라색으로 표지된 부분은 세포핵이며, 파란 색으로 표지된 부분은 반사광 표지자이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체의 스펙트럼을 파수에 따른 강도로 나타낸 그래프이다.
도 9에 나타난 결과에 따르면, 본원의 실시예에 따른 반사광 표지자의 스펙트럼 신호가 산란이 많이 발생하는 세포조직 내에서도 잘 측정될 수 있는 것을 확인할 수 있다.
도 10은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자로 표지가 된 세포 군집체의 크기를 시간에 따라 측정했을 때 나타나는 그래프이다.
도 10에 나타난 결과에 따르면, 1시간 동안 ±3 nm의 정밀도로 상기 반사광 표지자를 잘 추적할 수 있는 것을 확인하였다.
상기 실시예에서 제조한 반사광 표지자의 분자 검출에 대한 특성을 확인하였고, 그 결과를 도 11로서 나타내었다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 반사광 표지자 상에 검출하고자 하는 분자가 흡착되었을 때 나타나는 변화 사진 및 스펙트럼이다.
도 11에 나타난 결과에 따르면, 상기 반사광 표지자 상에 형광 표지된 스트렙타비딘 분자가 흡착되었을 때, 반사광 스펙트럼의 위상이 변화되는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 상기 반사광 표지자를 분자 검출기로서 응용할 수 있음을 확인하였다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (13)
- 구형 유전체 상에 광대역 광원을 조사하는 단계;
상기 구형 유전체로부터의 반사광의 간섭 스펙트럼을 측정하는 단계; 및
상기 반사광을 박막 간섭이론(thin-film interference theory)을 통해 해석하는 단계;
를 포함하는, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 반사광을 상기 박막 간섭이론을 통해 해석하기 전 상기 광대역 광원 및 상기 반사광을 정규화 시키는 단계를 추가 포함하는 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 박막 간섭이론을 통해 상기 반사광을 해석하는 것은 하기 수학식 1 내지 수학식 4를 통해 해석한 반사광의 세기(R)의 함수와 실제 측정한 반사광의 세기(R)를 비교하는 것인, 광학 표지자의 분석 방법:
[수학식 1]
(상기 수학식 1에서,
상기 구형 유전체가 m개의 층으로 이루어졌을 때,
상기 J는 하기 수학식 2로서 나타내며,
[수학식 2]
상기 H는 하기 수학식 3으로서 나타내며,
[수학식 3]
상기 수학식 1, 2 및 3에서,
상기 di는 상기 구형 유전체의 i 번째 박막의 두께이고,
상기 θi는 상기 광대역 광원이 입사하는 각의 크기이고,
상기 ni는 상기 구형 유전체의 i 번째 박막의 굴절률이고,
상기 k는로서 나타내고,
횡방향 전계 모드일 때, 상기 si는 1이고, 상기 ti는 nicosθi이고,
횡방향 자계 모드일 때, 상기 si는 cosθi이고, ti는 ni인 것이고,
[수학식 4]
상기 수학식 4에서,
상기 R은 반사광의 세기인 것임).
- 제 1 항에 있어서,
상기 광대역 광원의 광초점을 상기 구형 유전체의 중심에 조사하는 것을 포함하는 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 구형 유전체의 직경은 0.1 μm 내지 500 μm인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 구형 유전체는 고형의 고분자, 하이드로젤, 리포좀 및 이들의 조합들을 포함하는 연성 물질, 또는 에어로젤을 포함하는 기체 기반 물질을 포함하는 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 구형 유전체는 하나 또는 두 개 이상의 물질 층을 포함하는 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 구형 유전체 표면은 결합 특이성을 가지는 물질이 도포된 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 구형 유전체는 반응 민감성을 가져 화학적 또는 물리적 조건에 따라 크기 또는 내부 굴절률이 변동되는 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 구형 유전체는 두께 또는 내부 굴절률이 상이한 복수 층의 유전체를 포함하는 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 광대역 광원은 파장의 대역폭이 20 nm 내지 2,000 nm인 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
상기 반사광의 간섭 스펙트럼을 측정하는 단계는 분광기 혹은 음향광변조필터에 의해 수행되는 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
- 제 1 항에 있어서,
공초점 광학계를 통해 상기 구형 유전체의 중심에서 반사되는 반사광의 광초점 신호만을 선택적으로 수집하여 간섭 스펙트럼을 측정하는 것인, 광학 표지자의 분석 방법.
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