KR20190096333A - 체중 및 대사 증후군을 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

체중 및 대사 증후군을 조절하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

아실-조효소 A:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 (acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase, ACAT)를 억제하는 활성제를 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 조성물을 사용함으로써, 음식 섭취가 억제될 수 있고/있거나, 체중이 감소될 수 있고/있거나, 대사 장애가 예방 및/또는 치료될 수 있다.

Description

체중 및 대사 증후군을 조절하기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 음식 섭취의 억제, 체중의 감소, 및 대사성 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
교차 참조
본 출원은 2016년 11월 16일에 출원된 미국 가출원 제62/422,722호를 우선권으로 주장하며 그 개시 내용은 본 명세서에 전체적으로 명백하게 포함된다.
비만은 갈수록 더 널리 퍼지고 있고, 생명을 위협하는 다양한 질병에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 질병에는 심혈관 질환 및 대사성 질환이 포함된다. 비만 관련 질환을 치료하기 위해 효소, 전사 인자 또는 중성 지질(트리글리세라이드) 합성에 관여하는 신호 단백질의 약물 또는 억제제를 개발하는데 많은 노력을 하고 있다. 그러나, 특히 미국에서 비만이 계속 증가하고 있기 때문에, 새롭고 안전하고 효과적인 항 비만 약물의 개발을 위한 추가적인 약물 표적을 규명하는 것이 절실히 필요해졌다.
지방세포의 과형성과 비대는 비만이 발생하는 동안의 지방량 증가의 주요한 두 가지 원인이다. 지질구(LD) 형성과 확대는 각각 과형성과 비대의 특징이다. 그러나 지방 세포에서 LD 발달을 조절하는 분자 기작은 완전히 밝혀지지 않았다 (Farese and Walther 2009).
지방 조직은 또한 콜레스테롤 저장 기관이고, 지방 세포 내 콜레스테롤의 대부분이 유리 콜레스테롤(FC)과 콜레스테롤 에스테르(CE)로 LD에서 발견된다. (Farkas, et al., 1973). 몇몇 연구들은 또한 세포 내 콜레스테롤 수치와 TG 함량 간의 상관 관계를 보고했다 (Farkas, et al., 1973, LeLay, et al., 2001, Kovanen, 1975, Schreibman, 1975). 비만인 사람은 지방 조직에 33-50 %의 체내 콜레스테롤을 저장하는 것으로 보고되고, 정상적인 사람은 약 25 %를 저장한다고 보고된 바와 같이 지방 세포의 지방 콜레스테롤 함량은 인간 비만과 관련이 있는 것으로 보인다 (Schreibman, et al., 1975). 지방 세포에서 발견되는 LD는 중성 지질 코어와 인지질 단층으로 구성된다 (Thiam, et al., 2013). 중성 지질 코어는 일부 CE 및 다른 지질 용해성 화합물과 함께 주로 TG 및 DG를 함유한다. 인지질 단층은 주로 인지질, 콜레스테롤 및 LD 기능과 관련된 단백질을 포함한다. 지질 합성과 관련된 단백질을 포함하여 2000 개 이상의 단백질이 지방 생성 과정에서 2 배 이상 증가하거나 감소한다는 것이 알려져 있다(Welsh, et al., 2004). LD가 증가함에 따라 콜레스테롤 함량이 증가하고, 콜레스테롤 함량을 제한하면 LD의 발달을 막을 수 있다는 것도 알려져 있다(Dagher, et al., 2003).
아실-조효소 A:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제(acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase, ACAT)는 ATP 및 코엔자임 A의 존재 하에 장쇄 지방산 및 콜레스테롤로부터의 CE 형성에 관여한다(Mukherjee, et al., 1958, Chang, et al., 1988, Zhang, et. al., 2003). ACAT1은 콜레스테롤 항상성을 유지하기 위해 여러 조직에서 발현되는 반면, ACAT2는 CE 공급을 위해 간과 내장에서 주로 발현되는 것으로 알려져 있다 (Tomoda, et al., 2007). ACAT1과 ACAT2는 죽상경화증 (Yagyu, et al., 2000, Fazio, et al. 2001)뿐만 아니라 암 (Yue, et al., 2014) 및 알츠하이머 병 (Shibuya, et al., 2015, Bhattacharyya, et al., 2010)의 치료를 위한 약물 표적으로 간주된다. 본 발명은 ACAT가 LD 형성과 시험관 내 지방 생성 동안의 세포 내 콜레스테롤 함량 증가에 필요한 것임을 입증한다. 결국 ACAT는 LD형성에 중요한 역할을 수행할 수 있다. 콜레스테롤 항상성은 지방 세포 기능에 영향을 미치기 때문에(Yu, et al. 2010), ACAT활성 억제는 지방 생성 외에도 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있다.
당뇨병은 성인 인구의 10 % 이상, 미국 인구의 26 %에 영향을 미치는 사망 원인 중 7 위를 차지하는 질병으로 고혈압, 심장 마비, 뇌졸중, 신장 질환 및 안과 질환과 같은 합병증을 유발한다. 미국에서 진단된 당뇨병의 총 비용은 약 2,450 억 달러이며 직접 의료 비용으로 약 1,760 억 달러가 지출된다. 제 2형 당뇨병 (T2D)은 인슐린이 존재할 때 몸이 혈당을 제대로 처리하지 못하기 때문에 "인슐린 저항성"을 특징으로 한다. 북미의 모든 당뇨병의 약 90-95 %가 T2D이다. T2D 환자의 85 % 이상이 비만이기 때문에 T2D와 비만은 밀접하게 상호 연결되어 있다. 사실, 비만은 T2D 및 관련 합병증과 같은 생명을 위협하는 다양한 질병에 원인이 되는 것으로 나타났다.
현재, 약 10 개의 베스트셀러 당뇨병 약이 세계적으로 약 286 억 달러의 시장을 차지하고 있다. 사용가능한 항-당뇨병 약(예 : 로시글리타존, 피오글리타존, 시타글립틴, 삭사글립틴, 리라글립틴, 엑세나티드, 리라글루티드 및 알비글루티드)의 대부분은 원하지 않는 지방량 및 체중 증가를 유발하거나 또는 이에 거의 영향을 미치지 않아 이는 당뇨병 치료법의 전반적인 효능 및 환자의 삶의 질을 저해시킨다. 대부분의 T2D 환자가 이미 과체중 및 비만이라는 사실을 감안할 때, 의사는 T2D 약물 선택 시 추가적으로 체중 감소에 유리한 효과가 있는 약물을 함께 처방하는 것이 권고되고 있다.
T2D를 갖는 환자에서 고혈당, 지질 장애 및 비만 치료에 대한 PPARα/γ 이중 길항제 및 ACAT 억제제의 복합 효과가 보고되었다(예를 들어, WO 2003/088962). 그러나 ACAT 억제제 단독의 체중, 음식 섭취 및 인슐린 저항성에 대한 직접적인 영향에 대한 내용은 개시되지 않았다.
예를 들어, WO 2009/081957, KR 1020030011474, US 출원 공개번호 제 2011/0184173 호, EP 2228376 및 WO 2015065595에 개시된 바와 같이, ACAT2 억제제 및 ACAT1- 선택 억제제를 경구 또는 비경구로 투여함으로써 지질 장애 또는 고지혈증을 치료하고 비만을 억제하는 다양한 방법이 제안되어 있다. 그러나 ACAT 억제제의 투여와 음식 섭취 억제 및 체중 감량 및 인슐린 감수성의 관련성은 어디에도 개시되어 있지 않다.
이 배경 기술 섹션은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것이므로 참고사항일 뿐이며, 선행 기술이 아닌지에 대한 판단으로 이해되어서는 안 된다. 본원에 인용된 참고문헌은 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.
발명의 요약
하나의 측면에서, 본 발명은 음식 섭취의 억제, 체중의 감소 및/또는 대사성 장애의 예방/치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 아실-조효소 A:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 (ACAT)를 억제할 수 있는 유효량의 활성제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 활성제는 ACAT1, ACAT2 또는 모두를 억제할 수 있다. 한 예로서, 상기 활성제가 ACAT1을 억제하는 정도는 상기 활성제가 ACAT2를 억제하는 정도와 유사하거나 이보다 낮을 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 활성제로 아바시미브 (avasimibe)를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 활성제로 CI-976을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 활성제로 아바시미브 및 CI-976을 모두 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체의 음식 섭취를 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 유효량은 약 0.01 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 비경구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 피하, 정맥 내 또는 복강 내로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 체중을 감소시킬 수 있다. 상기 방법은 대사성 장애를 예방하거나 치료할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 활성제를 투여하고 고지방 식이를 섭취한 대상체는 상기 활성제 투여 없이 고지방 식이를 섭취한 대상체와 비교하여 유리 콜레스테롤, CE 및 TG의 수준이 감소되었다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 5를 포함하는, ACAT1을 넉다운하기 위한 shRNA 염기서열을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 6을 포함하는, ACAT2를 넉다운하기 위한 shRNA 염기서열을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 지방 세포에서 지방산 및 TG의 합성을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 렌티바이러스 벡터에 작동가능하게 통합된 shRNA 서열을 상기 지방 세포에 도입하는 단계를 포함하며, 상기 shRNA 염기서열은 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 개시된 각각의 실시예는 다른 개시된 실시예 각각에 적용 가능한 것으로 고려된다. 따라서, 여기에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범위 내에 있다. 다른 측면은 이하에 설명된다.
도 1은 지방 전구세포 (D0), 미성숙 지방 세포 (D2) 및 성숙 지방 세포 (D6)에서의 ACAT1 및 ACAT2의 상대적인 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2는 백색 지방 조직 (WAT), 갈색 지방 조직 (BAT) 및 마른 쥐의 간 및 고지방 식이로 유발된 비만 쥐의 간에서의 RPL27에 대한 ACAT1, ACAT2, 렙틴, UCP-1 및 FAS의 전사 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3a는 오일 레드 오 염색에 의해 가시화된 다양한 농도의 아바시미브의 존재 하에서 지방 전구 세포 및 성숙 지방 세포에서의 지질 축적을 나타내는 이미지이다. 도 3b는 도 3a에 도시된 정량화되고 오일 레드 오로 염색된 지질 축적을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는 성숙한 지방 세포에서 아바시미브에 의해 억제된 지질 축적을 보여주는 CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) 현미경 이미지이다.
도 5a는 오일 레드 오 염색에 의해 가시화된 다양한 농도의 CI-976의 존재 하에 지방 전구 세포 및 성숙 지방 세포에서의 지질 축적을 나타내는 이미지이다. 도 5b는 도 5a에 도시된 정량화되고 오일 레드 오로 염색된 지질 축적을 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은 아바시미브가 지방 세포에서 지질 합성에 관여하는 유전자의 mRNA 수준을 억제하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 아바시미브가 지방 세포에서 125 kDa 불활성 전구체 형태의 SREBP1의 수준을 증가시키는 것을 나타내는 웨스턴 블롯팅 이미지이다.
도 8은 지방 세포에서 지방 신생 합성에서 아바시미브의 억제 역할을 나타내는 SRS (stimulated Raman scattering) 현미경 이미지이다.
도 9는 아바시미브가 지방 생성 동안 지방 세포에서 콜레스테롤 에스테르 (CE)의 축적을 완전히 억제하고 콜레스테롤 수준을 억제하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 10은 아바시미브가 지방 세포에서 SR-BI 및 CD-36의 상대적인 mRNA 수준을 억제하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 11은 아바시미브가 ACAT 활성을 억제함으로써 지방 세포에서 형광 표지된 CE의 축적을 억제하는 것을 나타내는 25-[N-[(7-니트로-2-1,3-벤조옥사다이아졸-4-일)메틸]아미노]-27-노르콜레스테롤 (25-NBD 콜레스테롤)-기반 ACAT 분석의 이미지이다.
도 12는 지방 세포에서 ACAT2 발현 수준을 변화시키지 않고 ACAT1 발현을 넉다운시키는 ACAT1 shRNA의 효율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13a는 오일 레드 오 염색에 의해 시각화된 지방 세포에서의 지질 축적에 대한 ACAT1 넉다운 효과를 나타내는 이미지이다. 도 13b는 도 13a에 도시된 정량화되고 오일 레드 오로 염색된 지질 축적을 나타내는 막대 그래프이다.
도 14는 ACAT1 넉다운이 지방 세포에서 지질 합성에 관여하는 유전자의 mRNA 수준을 감소시키는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 15a는 오일 레드 오 염색에 의해 시각화된 지방 세포에서의 지질 축적에 대한 ACAT2 넉다운 효과를 보여주는 이미지이다. 도 15b는 도 15a에 도시된 정량화되고 오일 레드 오로 염색된 지질 축적을 나타내는 막대 그래프이다.
도 16은 ACAT2 넉다운이 지방 세포에서 지질 합성에 관여하는 유전자의 mRNA 수준을 감소시키는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 17a는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서의 아바시미브에 의한 체중 감소가 나타나는 그래프이다. 도 17b는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서의 아바시미브에 의한 체중 감소 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 18a는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서의 아바시미브에 의한 전신의 체지방량 감소를 나타내는 막대 그래프이다. 도 18b는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 비지방 조직에 비해 아바시미브에 의한 백색 지방 조직량(Ing : inguinal, Epi : epididymal)의 감소를 나타내는 막대 그래프이다.
도 19는 아바시미브가 뚜렷한 간 독성을 보이지 않음을 나타내는 혈청 알라닌 트랜스아미나제 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20a는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서의 아바시미브에 의한 억제된 음식 섭취를 나타내는 막대 그래프이다. 도 20b와 도 20c는 밤과 낮기간 동안 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 아바시미브에 의해 억제된 에너지 소비와 억제된 호흡 교환 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 21a 및 도 21b는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 아바시미브에 의해 억제된 혈당 수준과 억제된 인슐린 수준을 나타내는 그래프이다. 도 21c는 고지방 식이로 유발된 비만 마우스 모델에서 아바시미브에 의해 개선된 글루코스 내성을 나타내는 그래프이다. 도 21d는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 아바시미브에 의한 인슐린 저항성(HOMA-IR) 값의 개선된 항상성 모델 평가를 나타내는 막대 그래프이다.
도 22a, 22b, 와 도 22c는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 억제된 혈청 유리 콜레스테롤 수준, 억제된 혈청 콜레스테롤 에스테르 수준과 억제된 혈청 트리글리세라이드(TG) 수준을 나타내는 그래프이다. 도 22d는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 아바시미브에 의해 억제된 혈청 렙틴 수준을 나타내는 그래프이다.
도 23a는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 아바시미브 및 pair-feeding에 의한 체중의 점진적인 감소를 나타내는 그래프이다. 도 23b, 23c와 도 23d는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 아바시미브 및 pair-feeding에 의해 억제된 음식 섭취, 억제된 배설물 배출 및 억제된 배설물 에너지 배출량을 나타내는 막대 그래프이다. 도 23e는 고지방 식이로 유발된 비만 쥐 모델에서 pair-feeding이 혈당 수준을 억제하지만, 아바시미브만큼 효과적이지는 않다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 24는 LC MS/MS으로 확인된 지방 세포에서 아바시미브에 의해 영향을 받는 단백질의 수를 나타내는 파이 차트이다.
도 25는 지방 세포에서 아바시미브에 의해 발현이 증가되는 단백질과 이들이 관여하는 생물학적 과정의 목록이다.
도 26 과 도 27은 지방 세포에서 아바시미브에 의해 발현이 감소되는 단백질과 이들이 관여하는 생물학적 과정의 목록이다.
본 개시의 원리에 대한 이해를 돕기 위해, 도면에 도시된 실시예가 참조될 것이고, 특정 언어가 이를 설명하기 위해 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 개시의 범위를 제한하는 것은 아니다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 용어 및 과학 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 용어와 같은 용어는 관련 기술의 맥락에서의 의미와 동일한 것으로 해석되어야 하고, 본 명세서에 명시적으로 정의되지 않는 한, 이상적이거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되지 않아야 한다.
본 명세서에 사용된 약어는 화학적 및 생물학적 분야에서 통상적인 의미를 갖는다. 본원에 기재된 화학 구조 및 화학식은 화학 분야에서 공지된 화학 원자가의 표준 규칙에 따라 구성된다.
본 명세서에 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩타이드"에 대한 언급은 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하고, "약학적 담체/전달체"에 대한 언급은 둘 이상의 그러한 담체/전달체의 혼합물을 포함한다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정된 특정값에 대한 수용 가능한 오차 범위를 의미하며, 이는 부분적으로, 측정 시스템의 한계와 같이 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 이내 또는 1 이상의 표준 편차 의미할 수 있다. 또는, "약"은 주어진 값 또는 범위의 최대 20 %, 최대 10 %, 최대 5 % 또는 최대 1 %의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 이 용어는 값의 5 배 이내 및 2 배 이내를 의미할 수 있다. 특정값이 출원 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정값에 대한 허용 오차 범위 내에서의 "약" 의미를 가정해야 한다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, 단백질 활성제(예 : 작동제) 상호 작용에 대한 "활성화", "활성화하다", "활성화하는" 등과 같은 용어는 활성제(예를 들어, 본원에 기재된 화합물)의 부재 하 단백질의 활성 또는 기능에 비해 단백질의 활성 또는 기능에 긍정적인 영향(예 : 증가) 을 미치는 것을 의미한다. 따라서, 활성화는 적어도 부분적으로는, 자극을 부분적으로 또는 완전히 증가시키는 것, 활성화를 증가 또는 가능하게 하는 것, 신호 전달 또는 효소 활성을 활성화, 민감하게, 또는 상향 조절하는 것, 또는 감소된 유해한 매개체/물질의 양을 포함할 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, 용어 "투여"는 경구, 좌약, 국소 접촉, 정맥 내, 비경구, 복강 내, 근육 내, 병변 내, 척수강 내, 두개 내, 비강 내, 안구 내, 심장 내, 유리체 내, 대뇌 내, 골 내, 동맥 내, 관절 내, 피내, 경피, 점막, 혀 밑, 내장, 입술 밑, 흡입, 또는 피하 투여, 또는 미니 삼투압 펌프와 같은 지연 방출 장치를 통한 주입을 의미한다. 투여는 비경구 및 점막(예를 들어, 협측, 설하, 구개, 치은, 비강, 질, 직장 또는 경피)을 포함하는 임의의 경로에 의한다. 비경구 투여는 예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 피내, 피하, 복강 내, 심실 내 및 두개 내를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포솜 제제, 정맥 내 주입, 경피 패치 등의 사용을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. "병용 투여"란 본원에 기술된 조성물이 하나 이상의 추가 요법(예 : 항-비만제)의 투여와 동시에, 직전, 또는 직후에 투여되는 것을 의미한다. 상기 화합물은 환자에게 단독으로 투여될 수 있거나 병용 투여될 수 있다. 동시 투여는 화합물을 개별적으로 또는 조합하여(하나 이상의 화합물 또는 물질) 동시 또는 순차 투여를 포함하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 활성제로서 제 1 ACAT 억제제(예 : 아바시미브)를 포함하는 첫 번째 조성물 및 활성제로서 제 2 ACAT 억제제(예 : CI-976)를 포함하는 제 2 조성물을 함께 투여할 수 있다.
제제는 또한 필요한 경우, 다른 활성제(예 : 대사 저하를 줄이기 위해, 프로드럭의 분해 및 약물의 방출을 증가시키기 위해, 검출 가능한 약제)와 조합될 수 있다. 상기 조성물은 국소 경로에 의해 경피 투여될 수 있고, 도포용 스틱, 용액, 현탁액, 에멀전, 겔, 크림, 연고, 페이스트, 젤리, 페인트, 분말 및 에어로졸로서 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 환자의 섭취에 적합한 정제, 알약, 분말, 당의정, 캡슐, 액체, 로젠지(lozenges), 카세제(cachets), 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등을 포함한다. 고체 형태 제제는 분말, 정제, 알제, 캡슐, 카세제(cachets), 좌약 및 분산성 과립을 포함한다. 액체 형태 제제는 용액, 현탁액 및 에멀전, 예를 들어 물 또는 물/프로필렌글리콜 용액을 포함한다. 상기 조성물은 지속 방출 및/또는 편안함을 제공하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 고분자량, 음이온성 태성(mucomimetic) 폴리머, 겔화 폴리사카라이드 및 미세하게 분할된 약물 캐리어 기질을 포함한다. 상기 성분은 미국 특허 제4,911,920호; 제5,403,841호; 제5,212,162호; 및 제4,861,760호에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 상기 특허의 모든 성분은 모든 목적을 위해 본 명세서의 참고로서 포함된다. 상기 조성물은 또한 체내에서 서서히 방출하기 위한 미소구체로서 전달될 수 있다. 예를 들어, 미소구체는 피하로 천천히 방출되는 약물 함유 미소구체의 피내 주사(Rao, J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645, 1995), 생분해성 및 주사 가능한 겔 제형(Gao Pharm. Res. 12:857-863, 1995), 또는 경구 투여의 미소구체 (Eyles, J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674, 1997)로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조성물의 제형은 세포막과 융합되는 리포솜의 활용을 통해 전달되거나 내포작용으로 세포 내로 흡수될 수 있는 바, 예를 들어, 세포 표면의 막 단백질 수용체에 결합하는 리포솜에 부착된 수용체 리간드를 사용함으로써 내포작용(endocytosis)을 유발할 수 있다. 특히, 리포솜 표면이 표적 세포에 특이적인 수용체 리간드를 가지고 있거나 다른 방식으로 우선적으로 특정 기관을 표적하는 리포솜을 활용함으로써, 생체 내에서 표적 세포로 조성물의 전달을 집중시킬 수 있다(예 : Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13:293-306, 1996; Chonn, Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708, 1995; Ostro, Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576-1587, 1989). 상기 조성물은 또한 나노 입자로서 전달될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약물(agent)"는 질환 또는 기타 의학적 상태를 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 임의의 분자, 화학 물질, 조성물, 약, 치료제, 화학요법제 또는 생물학제를 포함하는 것을 의미한다. 용어는 소분자 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA 시약, 항체, 에피토프 인식 부위를 갖는 항체 단편, 펩토이드, 앱타머, 효소, 펩타이드 유기 또는 무기 분자, 천연 또는 합성 화합물 등을 포함한다. 약물은 임상 시험 중, 전임상 시험 중(pre-trial testing) 또는 FDA 승인 후 임의의 단계에서 본 발명의 방법에 따라 분석될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, "변경하다", "변경하는 것", "변경" 등의 용어는 본원에 기술된 표준 기술에 의해 검출된 유전자 또는 폴리펩타이드의 발현 수준 또는 활성의 변화(증가 또는 감소)를 의미한다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "개선"은 질병의 발달 또는 진행을 감소, 억제, 약화, 정지 또는 안정화시키는 것을 의미한다.
본원에 정의된 바와 같이, 질병(예를 들어, 비만)과 관련된 물질 또는 물질 활성 또는 기능과 관련하여 용어 "관련된"은 질병이(전체적으로 또는 부분적으로), 또는 질병의 증상이 물질 또는 물질 활동이나 기능에 의해 (전체적으로 또는 부분적으로) 야기된 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 질병과 관련된 것으로 기술되는 것이 병원체인 경우, 질병의 치료의 표적이 될 수 있다. 예를 들어, 비만과 같은 체중 증가와 관련된 질병은 체중 증가를 감소시키는데 효과적인 약물(예를 들어, 본원에 기재된 화합물)로 치료할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 항목, 구성, 장치, 방법, 프로세스, 시스템 등의 정의되거나 기술된 구성요소에 대한 용어 "포함하는", "포함한다" 또는 "포함된" 및 이의 변형된 용어는 포괄적이거나 개방된 것으로, 추가의 구성요소를 허용함으로써, 정의되거나 기술된 항목, 구성, 장치, 방법, 프로세스, 시스템 등이 이들 특정된 구성요소 또는 적절하게는 이의 균등물을 포함하고, 다른 구성요소가 포함되어도 여전히 정의된 항목, 구성, 장치, 방법, 프로세스, 시스템 등의 범위/정의 내에 포함되는 것임을 의미한다. "필수적으로 이루어진 "또는 "필수적으로 구성된다" 라는 용어는 미국 특허법에서의 의미를 지니고, 상기 용어는 인용된 것의 기본적이거나 새로운 특성이 인용된 것 이상의 것에 의해 변경되지 않는 한 인용된 것 이상을 허용하는 개방적인 의미를 지니지만, 선행 기술은 포함되지 않는다. 또한, 용어 "포함하는", "포함한다", "가지는", "가지다", "함께" 또는 이의 변형된 용어가 상세한 설명 및 또는 청구범위에서 사용되는 한, 그러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포함하는 것을 의미한다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "대조군" 또는 "표준 대조군"은 그의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 시험 샘플과의 비교를 위해, 보통 공지된 것인, 참조의 역할을 하는 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 특정 질병(예를 들어, 비만 또는 당뇨병)을 가진 것으로 의심되는 환자로부터 시험 샘플을 취하여 실제 비만 또는 당뇨병 환자 또는 정상(예를 들어, 비-질병)인 개체로부터 취한 샘플과 비교할 수 있다. 대조군은 비만이나 당뇨병 환자 또는 비슷한 의학적 배경, 나이, 체중 등을 가진 건강한 개인과 같은 유사한 개인들로 이루어진 집단의 평균값을 나타낼 수 있다. 초기, 질병 이전, 또는 치료 전에 취한 샘플 등과 같이 동일한 개인으로부터 대조군을 얻을 수도 있다. 통상의 기술자는 대조군이 여러 매개 변수의 평가를 위해 설계될 수 있음을 인식하고, 특정 상황에서 어떤 대조군이 중요한지 이해하며 대조군의 값과의 비교를 기반으로 데이터를 분석할 수 있을 것이다. 또한, 대조군은 데이터의 의의를 결정함에 있어서도 중요하다. 예를 들어, 주어진 매개 변수에 대한 값이 대조군에서 광범위하게 변하는 경우, 시험 샘플의 변형은 중요하지 않은 것으로 간주된다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "질병" 또는 "상태"는 본원에서 제공하는 화합물, 약학 조성물 또는 방법으로 치료될 수 있는 환자 또는 대상체의 상태 또는 건강 상태를 의미한다. 일부 실시양태에서, 질병은 체중이 증가된 질병이다. 일부 실시양태에서, 질병은 비만이다. 비만은 질병 및/또는 치료될 질병의 주요 원인일 수 있으며, 또한 주요 질병 및/또는 장애의 결과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 질병은 당뇨병과 같은 대사성 질환이다.
용어 "대사성 질환", "대사성 장애" 및 "대사성 증후군"은 일반적으로 유전적 결함으로 인해 대사의 결함이 있는 임의의 상태를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 영향을 미칠 수 있는 대사 과정의 비제한적인 예로는 에너지를 방출하는 음식에서의 탄수화물, 단백질 및/또는 지방 대사 경로, 과잉 질소의 소변으로 배출되는 노폐물로의 전환 및 화학 물질의 다른 물질로의 분해 또는 전환 및 이의 세포 안으로의 운반 등이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 화합물이 존재하지 않는 상태와 비교했을 때 화합물이 목적을 달성하기에 충분한 양을 지칭한다(예를 들어, 투여 효과를 달성하거나, 질병을 치료하거나, 효소 활성을 감소시키거나, 효소 활성을 증가시키거나, 신호 전달 경로를 감소시키거나, 또는 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상을 감소시킴). "유효량"의 예는 질병의 증상 또는 증상의 치료, 예방 또는 감소에 기여할 정도로 충분한 양이며, 이는 또한 "치료 유효량"으로 지칭될 수 있다.
본원에서 정의된 바와 같이, 대상체에게 치료법을 투여하는 것과 관련하여 용어 "조합하여"는 하나 이상의 치료법(예를 들어, 예방 및/또는 치료)의 사용을 의미한다. 용어 "조합하여"의 사용은 비만 또는 당뇨병이었거나, 비만 또는 당뇨병이거나, 또는 감수성이 있는 대상체에게 치료법을 두 번째 치료법의 투여와 병용하거나 또는 상기 투여 후에 이루어지는 것과 같은 치료의 순서를 제한하지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료제들 함께 작용할 수 있도록 연속으로 및 시간 간격을 두고 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료법은 다른 방식으로 투여된 경우보다 개선된 효과를 제공하기 위하여 연속으로 및 시간 간격을 두고 대상체에게 투여된다. 추가 치료법은 다른 추가 치료법과 임의의 순서로 투여될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, 단백질-억제제(예, 길항제) 상호 작용과 관련하여 용어 "억제", "억제하다", "억제하는" 등은 억제제가 없는 경우 단백질의 활성 또는 기능 수준에 비해 단백질의 활성 또는 기능의 수준에 부정적으로 영향(예를 들어, 감소)을 주는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 억제는 질병 또는 질병의 증상의 감소를 지칭한다. 따라서, 억제는 적어도 부분적으로 자극의 부분적 또는 전체적 차단, 활성의 감소, 예방 또는 지연, 또는 신호 전달, 효소 활성 또는 단백질의 양의 비활성화, 둔감화 또는 하향 조절을 포함할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "조절하다", "조절하는" 등은 표적 분자의 수준 또는 표적 분자의 기능을 증가 또는 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 일반적으로 본원에서 달리 명시하지 않는 한 "및/또는" 을 포함하는 의미로 사용된다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 부형제" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성제의 투여 및 대상체에의 흡수를 돕는 물질을 지칭하며, 환자에게 심각한 독물학적 부작용을 야기시키지 않으면서 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제의 비제한적인 예로는 물, NaCl, 정상 식염수 용액, 젖산 링거액(lactated Ringer's), 정상 수크로스, 정상 포도당, 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅제, 감미제, 향미제, 염 용액(예 : 링거액), 알코올, 오일, 젤라틴, 락토스, 아밀로스 또는 전분과 같은 탄수화물, 지방산 에스테르, 히드록시 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리딘 및 색소 등을 포함한다. 이러한 제제는 멸균될 수 있고, 원한다면 본 발명의 화합물과 유해한 반응을 일으키지 않는 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제 및/또는 방향제 등을 혼합할 수 있다. 본 발명의 화합물과 병용 할 수 있다. 당업자는 다른 약제학적 부형제가 본 발명에서 유용하다는 것을 인식할 것이다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은 질병은 없지만 질병 또는 증상이 발생할 위험이 있거나 감수성이 있는 사람에게서 질병 또는 증상이 발생할 확률을 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 약물의 "예방유효량"은 대상체에게 투여될 때 의도된 예방 효과, 예를 들어, 부상, 질병, 병적 이상 또는 상태의 발병(또는 재발)을 예방하거나 지연시키는 또는 부상, 질병, 병적 이상, 또는 상태, 또는 그 증상의 발병(또는 재발) 가능성을 감소시키는 예방 효과를 가져오는 약물의 양이다. 1회 용량의 투여로 전체적인 예방 효과가 반드시 발생하는 것은 아니며 일련의 용량을 투여한 후에만 발생할 수 있다. 따라서, 예방 유효량은 하나 이상의 투여가 될 수 있다. 본원에 사용된 "활성 감소량"은 길항제가 존재하지 않는 경우에 비해 효소의 활성을 감소시키는 데 필요한 길항제의 양을 나타낸다. 정확한 양은 치료 목적에 따라 달라질 것이며, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다(Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999), Pickar, Dosage Calculations (1999), Remington : The Science and Practice of Pharmacy , 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
본원에 정의된 바와 같이, "대상체", "환자", "개체" 등과 같은 용어는 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물의 투여에 의해 치료될 수 있는 질병 또는 상태를 앓고 있거나 감염될 수 있는 살아있는 유기체를 지칭한다. 비제한적 예로는 인간, 척추 동물, 다른 포유 동물, 소, 새, 쥐, 생쥐, 개, 고양이, 말, 영장류, 닭, 돼지, 유인원, 원숭이, 염소, 낙타, 양, 젖소, 사슴 및 기타 비포유 동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 개 또는 고양이와 같은 동반 동물이다. 일부 실시 양태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 전-비만(pre-obese), 비만 또는 병적 비만(morbidly obese)이다. 일부 실시양태에서, 환자는 전-비만, 비만 또는 병적 비만은 아니지만 과거에 전-비만, 비만 또는 병적 비만이었다. 일부 실시양태에서, 환자는 체중을 줄이거나 식욕을 감소시키고자 한다. 대안으로 또는 부가적으로, 환자는 비만 관련 질환 또는 장애가 있다. 이러한 예는 제한적이지 않다. 본 명세서에서 사용되는 "대상체", "환자", "개인" 등의 용어는 제한하려는 의도가 아니며 대체로 상호 교환될 수 있다. 즉, "환자"로 묘사된 개체는 반드시 특정 질병이 있거나 의료 전문가의 보살핌을 받을 필요는 없지만 의학적 조언이 없는 경우 치료를 추구하거나 바랄 수 있다(예 :자가 치료). 본원에 기재된 방법에 따르면, "필요가 있는 대상체"는 과체중, 비만, 관련 질환, 또는 T2D를 갖는 대상체이거나 과체중, 비만, T2D, 또는 관련 질환을 발병할 위험성이 증가한 대상체이다.
본원에 정의된 바와 같이, 증상 또는 증상들(및 문법상의 등가물)의 "억제", "억제하다", "억제하는" 등의 용어, 또는 "감소", "감소시키다" 또는 "감소시키는" 등의 용어는 증상(들)의 심각성이나 빈도의 감소 또는 증상(들)의 제거를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료법들" 및 "치료법"은 본원에서 사용될 수 있는 임의의 프로토콜(들), 방법(들), 조성물(들), 제형(들), 및/또는 약물(들) 또는 이와 관련된 질병 또는 증상의 치료를 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, 용어 "치료법들" 및 "치료법"은 생물학적 치료, 보조 요법 및/또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 질환 또는 증상과 관련된 치료 또는 예방에 유용한 다른 치료법을 지칭한다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 부상, 질병, 병적 이상 또는 상태의 치료 또는 개선의 성공의 임의의 징후를 나타내는 것으로서, 이는 완화, 차도, 증상의 감소, 환자가 부상, 병적 증상, 또는 상태를 더 감내할 수 있도록 만드는 것, 악화 또는 쇠퇴의 속도를 낮추는 것, 최종적인 악화 상태를 약화시키는 것, 환자의 육체적 또는 정신적 안녕을 개선시키는 것과 같은 객관적 또는 주관적 변수를 포함한다. 증상의 치료 또는 개선은 객관적 또는 주관적인 변수를 기반으로 할 수 있고, 이는 신체검사의 결과, 신경정신병 시험, 및/또는 정신감정을 포함한다. 예를 들어, 본원의 특정 방법은 비만과 같은 체중 증가와 관련된 질병을 치료한다.
본원에 제공된 범위는 상기 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50로 이루어진 군으로부터 임의의 수, 수들의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 범위 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학, 면역학, 세포 생물학, 세포 배양 및 트랜스제닉(transgenic) 생물학의 통상적인 기술을 사용한다. 예를 들어, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodic updates); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hyvridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.1984); Transcription And Traslation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); 논문, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, Vols. 154 및 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Mayer 및 Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir 및 C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book, A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio), (4th ed., Univ of Oregon Press, Eugene, 2000).
비만
비만은 백색 지방 조직(WAT)의 과도한 축적을 특징으로 하는데, 이는 증가된 지방 세포 수(과형성) 및 지질 저장(비대)에 기인한다. 지방 세포 과형성과 비대는 각각 지방 생성과 LD 축적의 증가에 의해 좌우된다. 따라서 지방 생성을 조절하는 것은 죽상경화증 및 기타 심혈관 질환(CVD)과 같은 비만 및 관련 질병을 조절하는 효과적인 전략이다.
본원에 사용된 용어 "비만"은 체질량 지수가 30kg/m2 를 초과하는 환자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "과체중" 및 "전-비만(pre-obese)"은 체질량 지수가 25 kg/m2 를 초과하는 환자를 지칭한다. 본원에서 사용된 "병적 비만"은 BMI 가 40 mg/m2를 초과하거나, 하나 이상의 질환(comorbidities)을 함께 지니며 BMI가 35 kg/m2를 초과하거나, 통제할 수 없는 당뇨병을 함께 지니며 BMI가 30 kg/m2을 초과하거나, 또는 이들의 조합의 특징을 나타내는 환자를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "비만 관련 질환"은 비만, 전-비만(pre-obesity), 병적 비만, 프래더윌리(Prader-Willi) 증후군, 프로-오피오 멜라노코르틴(POMC) 결핍 비만, LepR 결핍 비만, POMC 이형접합(heterozygous) 결핍 비만, POMC 후성적 장애(epigenetic disorders), 알스트롬(Alstrom syndrome) 증후군, 시상하부 손상 관련 비만(Hypothalamic Injury Associated Obesity), 비알콜성 지방 간염, 고지혈증, 고혈압, 당뇨병, 지방 이상증(lipodystrophy), 지방간, 바르데-비들(Bardet-Biedl)증후군, 코헨(Cohen) 증후군, 심혈관 질환, 관절염, 뇌졸중, 대사성 증후군 및 MOMO(Macrosomia Obesity Macrocephaly Ocular abnormalities) 증후군 등을 지칭한다.
용어 "항-비만제"는 체중 증가를 감소시키고 체중 감소를 촉진시키는 물질 또는 치료의 특성을 나타낸다. 항-비만제의 예는 시부트라민(Sibutramine), 펜터민(Phentermine), 마진돌(Mazindol), 디에틸프로피온(Diethylpropion), 렙틴(Leptin), 올리스타트(Orlistat), 베타-3 작용제 및 리모나반트(Rimonabant)일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 ACAT를 억제하는 약물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 음식 섭취를 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 약제는 ACAT1 및/또는 ACAT2를 억제한다. 일부 실시양태에서, 활성제가 ACAT1을 억제하는 정도는 활성제가 ACAT2를 억제하는 정도와 유사하거나 낮다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 항체 또는 이의 단편, 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 소분자 및 핵산으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 아바시미브 또는 CI-976과 같은 ACAT 비선택적 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 아바시미브, CI-976 또는 이들 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 약물의 유효량은 약 0.01 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일의 범위이다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 비경구로 투여된다. 예를 들어, 상기 약물은 피하, 정맥 내 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약물은 정맥 내 주사에 의해 투여된다. 한 측면에서, 본 발명은 ACAT를 억제하여 대상체의 음식 섭취를 억제하는 약물 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원에 기술된 방법에 따라 대상체의 음식 섭취를 억제하는 것은 바람직하게는 치료 전 대상체의 음식 섭취의 양, 부피, 중량 및/또는 칼로리에 비해 대상체의 음식 섭취를 적어도 약 10 % 이상 감소시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 음식 섭취를 적어도 약 20 % 이상 감소시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 음식 섭취를 적어도 약 30 % 이상 감소시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 음식 섭취를 적어도 약 40 % 이상 감소시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 음식 섭취를 적어도 약 50 % 이상 감소시키는 것; 보다 더 바람직하게는, 대상체의 음식 섭취를 적어도 약 60 % 이상 감소시키는 것; 가장 바람직하게는, 대상체의 음식 섭취를 적어도 약 70 % 이상 감소시키는 것이다. 음식 섭취는 재현 가능한 측정 방법으로 평가할 수 있다. 음식 섭취는 양, 부피, 체중 및/또는 칼로리로 측정될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 ACAT를 억제하는 약물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 체중 감소 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 ACAT1 및/또는 ACAT2를 억제한다. 일부 실시양태에서, 활성제가 ACAT1을 억제하는 정도는 활성제가 ACAT2를 억제하는 정도와 유사하거나 낮다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 항체 또는 이의 단편, 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 소분자 및 핵산으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 아바시미브 또는 CI-976과 같은 ACAT 비선택적 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 아바시미브 또는 CI-976을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 약물의 유효량은 약 0.01 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일의 범위이다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 비경구로 투여된다. 예를 들어, 상기 약물은 피하, 정맥 내 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 정맥 내 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 약물은 대상체의 신체에서 지질 축적을 억제한다. 한 측면에서, 본 발명은 ACAT를 억제하여 대상체의 체중을 감소시키는 약물 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 대상체의 체중을 감소시키는 것은 대상체의 체중 증가를 억제하는 것을 의미한다. 대상체의 체중 증가를 억제하는 것은 바람직하게는 치료 전 대상체의 체중에 비해 대상체의 체중을 최대 약 110 % 이하로 유지시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 109 % 이하로 유지시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 108 % 이하로 유지시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 107 % 이하로 유지시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 106 % 이하로 유지시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 105 % 이하로 유지시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 104 % 이하로 유지시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 103 % 이하로 유지시키는 것; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 102 % 이하로 유지시키는 것; 보다 더 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 101 % 이하로 유지시키는 것; 가장 바람직하게는, 대상체의 체중을 최대 약 100 % 이하로 유지시키는 것이다. 체중은 재현 가능한 측정 방법으로 평가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 대상체의 체중을 감소시키는 것은 대상체의 체중 감소를 의미한다. 대상체의 체중 감소는 바람직하게는 치료 전 대상체의 체중에 비해 대상체의 체중의 적어도 약 5 % 이상의 감소; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중의 적어도 약 10 % 이상의 감소; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중의 적어도 약 15 % 이상의 감소; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중의 적어도 약 20 % 이상의 감소; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중의 적어도 약 25 % 이상의 감소; 보다 바람직하게는, 대상체의 체중의 적어도 약 30 % 이상의 감소; 보다 더 바람직하게는, 대상체의 체중의 적어도 약 35 % 이상의 감소; 가장 바람직하게는, 대상체의 체중의 적어도 약 40 % 이상의 감소이다. 체중은 재현 가능한 측정 방법으로 평가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 대상체의 체중 증가의 억제는 총 백색 지방 조직(WAT)의 중량 감소에 기인한다. 대상체의 총 백색 지방 조직(WAT)의 중량은 바람직하게는 치료 전 대상체의 총 백색 지방 조직(WAT)의 중량에 비해 적어도 약 5 % 이상 감소; 보다 바람직하게는, 적어도 약 10 % 이상 감소; 보다 바람직하게는, 적어도 약 15 % 이상 감소; 보다 바람직하게는, 적어도 약 20 % 이상 감소; 보다 바람직하게는, 적어도 약 25 % 이상 감소; 보다 바람직하게는, 적어도 약 30 % 이상 감소; 보다 더 바람직하게는, 적어도 약 35 % 이상 감소; 가장 바람직하게는, 적어도 약 40 % 이상 감소한다. 총 백색 지방 중량(WAT)은 재현 가능한 측정 방법으로 평가할 수 있다.
지방 생성
지방 생성은 지방 전구 세포가 성숙 지방 세포가 되는 세포 분화의 과정이다. 지방 전구 세포에서 성숙 지방 세포로의 변화에는 뚜렷한 4 가지 단계가 필요하다. 1) 성장 정지; 2) 유사 분열 클론 증식(2-3 회의 추가적인 세포 주기); 3) 조기 분화; 4) 중간 및 최종 분화. 지방 생성의 유도 시, 성장 정지된 3T3-L1 지방 전구 세포는 cdk2 및 cyclinA와 같은 세포 주기 단백질의 활성화/발현과 함께 유사 분열 클론 증식된다. 유사 분열 클론 증식은 또한 인슐린 의존성 포스파티딜이노시톨(PI) 3-키나아제 및 세포 외 신호 조절 키나아제(ERK) 경로와 같은 세포 신호 전달 경로의 활성화를 수반하며, 일련의 지방 생성 전사 인자의 발현을 개시한다. 지방 생성을 조절하는 주요 지방 생성 전사 인자는 CCAAT/인핸서 결합 단백질(enhancer binding protein) (C/EBP), C/EBP 및 퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptor γ)(PPARγ)이다. C/EBPβ는 클론 증식 후 분화 초기에 발현되며, 이어지는 C/EBPα와 PPARγ의 발현에 필요하다. 지방 생성의 종결 단계에서 분화하는 세포는 ATP 구연산 리아제, 아세틸-CoA 카복실라아제(ACC), 스테아로일-CoA 불포화효소 1(SCD1), 글리세롤-3-인산염 아실 트랜스퍼라제(GPAT), 글리세롤-3-인산염 탈수소효소, 지방산 생성효소(fatty acid synthase)(FAS), 글리세르 알데하이드-3-인산염 탈수소효소(GAPDH), 모노글리세라이드 아실 트렌스퍼라제(MGAT), 디글리세라이드 아실 트랜스퍼라제(DGAT) 등을 포함한 지방 신생 합성(de novo lipogenesis) 및 TG 합성에 관여하는 유전자의 발현을 현저하게 증가시켜 새로운 LD 생산과 지방 세포의 수 및 크기의 확장을 야기한다. 지방 세포 수는 마른 체형과 비만 체형 모두에서 소아기 및 청소년기의 지방량 증가의 주된 결정 요인이기 때문에 지방 생성 억제는 새로운 지방 세포의 생성과 형성을 낮춤으로써 총 지방량을 감소시키거나 억제하는 효과적인 방법으로 제안되었다.
지방 생성은 in vitro에서 TG, CE 및 콜레스테롤의 급격한 증가와 관련되는 것으로 보고되었다. 또한, 3T3-L1 세포에서 지방 생성 동안 콜레스테롤 에스테라제의 활성이 약 280 배 증가한다. 지방 생성 과정에서 지방 세포 내 대부분의 세포 콜레스테롤과 CE는 원형질막과 LD에 존재한다. 이는 지방 세포의 기능적 항상성(functional homeostasis) 조절에 있어 콜레스테롤 축적 형태인 CE의 잠재적인 역할을 나타낸다.
지질체
지질체, 오일 바디(oil body) 또는 아디포좀(Adiposome)으로도 지칭되는 LD는 중성 지질의 저장 및 가수 분해를 조절하고 주로 지방 조직에서 발견되는 지질이 풍부한 세포 소기관이다. 상기 LD는 또한 막 형성 및 유지를 위해 콜레스테롤과 아실 글리세롤을 저장하는 역할을 한다. 상기 LD는 모든 진핵 생물에서 발견되며 포유 동물의 지방 세포에 많은 지질을 저장한다. 지방 조직은 주로 에너지를 LD 형태로 저장하는 에너지 저장소로 여겨진다.
TG는 LD에서 발견되는 주요 지질이며, 콜레스테롤 및 CE는 지방 세포 및 대식 세포에서 발견되는 LD의 중성 코어를 형성하고, 인지질 및 다른 극성 지질의 단일층으로 싸여있다. 한편, 레티놀 에스테르는 간 성상 세포의LD에서 발견되는 두드러진 중성 지질이다. LD의 구조는 파타틴(patatin)-유사 포스포리파아제 도메인-함유 단백질(예컨대, 페리리핀 1, 페리리핀 2/아디포피린(adipophilin)(ADRP), 페리리핀 3/Tip47 및 페리리핀 4/S3-12)과 같은 다양한 LD-결합 단백질, 세포 사멸 유도 DNA 절편화 효소(cell death inducing DNA fragmentation factor proteins)(CIDEs), 27 kDa의 지방 특이적 단백질(FSP27) 및 일부 리파아제에 의해 유지되고 안정화된다.
상기 많은 LD-결합 단백질의 기능 이상은 지방 세포에서 손상된 지방 생성 및 LD 생성과 관련되는 것으로 보고되었다. LD 성장은 TG 합성을 위한 DGAT 및 콜레스테롤 에스테르 합성을 위한 ACAT와 같은 활성화된 소포체 상주 효소(ER resident enzymes)에 의해 촉진된다. 이는 또한, 지방 세포에서 지방 신생 합성과 지방산/콜레스테롤 흡수의 활성화를 동반한다. LD는 매우 역동적인 세포 구획으로, 상기 LD의 과다한 식이에 따른 지방산 생성과 부족한 영양 공급에 따른 지방산 분해는 생체 에너지 및 염증 항상성을 유지하기 위해 긴밀하게 조절되고 있다.
따라서, 세포 내 LD 축적의 변화는 지방 이상증과 관련된 인슐린 저항성, 지방간 및 고혈압과 같은 광범위한 대사성 및 염증성 인간 질병과 관련이 있다. 마찬가지로 지방 조직 및 심장, 간 및 근육과 같은 비지방 주변 조직에서의 TG 및 CE가 함유된 LD의 과다 축적은 또한 중성 지질 저장 질환, 심근병, 비만, T2D, 지방간, 및 관상동맥성 심장병 등과 관련이 있다.
TG가 대부분의 조직에 축적된 LD의 주된 지질이기 때문에, 전술한 만성 질환을 치료하기 위한 현재의 치료법은 지방산 및 TG 합성에 관여하는 효소 및 유전자를 억제하는 방법을 개발하는데 집중되어 왔다. 지방 세포 내 LD 에서의 TG의 역할에 더하여, 지방 조직은 콜레스테롤의 가장 큰 저장고 중 하나이며, 지방 세포에서 콜레스테롤 풀의 크기는 TG 함량 및 LD 크기에 비례한다. 지방 세포 내 콜레스테롤 함량이 콜레스테롤 합성, 대사, 유출 및/또는 유입에 의해 조절된다는 사실은 알려졌음에도 불구하고 지방 조직 내 LD 성장과 크기 및 비만 유발에서 콜레스테롤 대사의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.
ACAT/SOAT
스테롤 O-아실트랜스퍼라제(SOAT)로도 알려진 아실-조효소 A : 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제(ACAT)는 세포 콜레스테롤 에스테르화에 따른 장내 콜레스테롤의 더딘 흡수 및 간의 지단백질 분비(hepatic lipoprotein secretion)에서 중요한 역할을 한다. ACAT는 ATP와 조효소 A의 존재 하에 장쇄 지방산과 콜레스테롤로부터 CE 형성의 촉매 작용을 한다. 상기 효소의 상기 두 기질은 아실-CoA와 콜레스테롤이지만, 두 결과물은 CoA와 CE이다. 상기 효소는 트랜스퍼라제 계열, 특히 아미노 아실기 이외의 다른 기(group)를 전달하는 아실 트랜스퍼라제 계열, 막-결합(membrane-bound) O-아실 트랜스퍼라제에 속하며, 또한, 담즙산 생합성에도 관여한다.
ACAT1 및 ACAT2는 모두 소포체(endoplasmic reticulum, ER) 막에 위치하고, 상기 효소들은 모두 콜레스테롤에 의해 알로스테릭 활성화가 유발된다. ACAT1은 다양한 조직에서 골고루 발현되는 반면, ACAT2는 초저밀도 지단백질(VLDL)과 킬로마이크론(chylomicrons)의 지질 코어로서 CE를 공급하기 위해 주로 각각 간과 장에서 발현된다.
CE는 대식세포에서 대부분의 LD를 구성하고 지질 함유 세포의 형성과 양의 상관 관계를 가지기 때문에, ACAT는 죽상경화증 및 고콜레스테롤증의 치료 표적으로 제안되어 왔다. 넉아웃 생쥐 모델에서 ACAT2는 장과 간에서 콜레스테롤 에스테르화 활성을 상실시킴으로써 식이로 유도된 고콜레스테롤증 예방 효과를 보였지만, 재조합 ACAT1 대식세포를 가진 고지혈증 생쥐 모델에서는 연구 설계에 따라 죽상경화증에 유해한 또는 예방적 기능을 나타냈기 때문에 죽상경화증에서의 ACAT1의 역할에 대해서는 논란의 여지가 있다.
고콜레스테롤증에서의 ACAT의 기능 이외에도, CE 합성은 TG 합성 및 LD 생물학(biology)에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보인다. 예를 들어, TG와 스테롤 에스테르가 결핍된 효모는 이중막 사이에 중성 지질이 과도하게 축적되는 비정상적인 LD 생체 내 합성(biogenesis)을 보였다. 그러나 지방 세포에서의 지방 발달 및 LD 생체 내 합성에 있어서 CE 및 ACAT의 역할은 아직 연구된 바 없다.
전술한 바와 같이, 비만은 지방 조직에 지질이 과도하게 축적되어 LD가 증가하는 것을 특징으로 한다. LD는 트리글리세라이드와 같은 중성 지질, 콜레스테롤 에스테르, 인지질 및 LD 결합 단백질로 구성되어 있다. 본원에서는 ACAT1 및 ACAT2가 유리 콜레스테롤의 CE 로의 전환을 촉매하는 주요 효소이고, 따라서 지방산 합성, LD 축적 및 비만 발생을 감소시키는 예방 및 치료 표적임을 개시한다. 일부 실시양태에서, 죽상경화증을 조절하기 위해 개발된 시판되는 약인 아바시미브는 ACAT1 및 ACAT2의 억제제로서 사용되어 비만을 조절, 치료 및/또는 예방한다.
제2형 당뇨
개선된 혈당 항상성 및 체중 감소로 T2D를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 개발되었다. 과도한 백색 지방 조직의 양은 증가된 지방 세포 수(과형성) 및 지질 저장(비대)으로 인한 비만 및 인슐린 저항성의 발달에 기여한다. 전술한 바와 같이, 지방 세포의 과형성과 비대는 지방 생성과 LD 축적의 증가에 의해 좌우된다. 따라서 지방 생성 및/또는 LD 생성을 조절하는 것이 인슐린 저항성과 비만을 조절하는 효과적인 전략 중 하나이다. 전술한 바와 같이, LD는 주로 트리글리세라이드와 같은 중성 지방, 콜레스테롤 에스테르, 인지질 및 LD 결합 단백질로 구성되어 있다. 본원에서는 유리 콜레스테롤의 콜레스테롤 에스테르로의 전환을 촉매하는 주요 효소인 ACAT1 및 ACAT2가 혈당 및 인슐린 감수성을 조절하고 체지방 및 음식 섭취를 낮추기 위한 예방 및 치료 표적임을 개시한다.
ACAT 억제제
본원에 사용된 "ACAT 억제제"는 ACAT 효소 활성 및/또는 발현을 억제하는 약물이다. 보다 구체적으로, 상기 ACAT 억제제는 항체 또는 이의 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 소분자 및 억제성 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 용어 "ACAT1" 및 "ACAT2" 는 사람 ACAT1 및 ACAT2의 변이형, 동형체(isoforms), 동종(species homologs)을 포함한다. 완전한 ACAT1 아미노산 서열은 GENBANK® Accession No. AAH10942.1 (GI : 15012080)에 나타나있으며, 하기 (서열번호 1)와 같다.
Figure pct00001
완전한 ACAT1 핵산 서열은 GENBANK® Accession No. BC010942 (GI : 15012079)에 나타나있으며, 하기 (서열번호 2)와 같다.
Figure pct00002
완전한 ACAT2 아미노산 서열은 GENBANK® Accession No. AAH00408.1 (GI : 12653279)에 나타나있으며, 하기 (서열번호 3)와 같다.
Figure pct00003
완전한 ACAT2 핵산 서열은 GENBANK® Accession No. BC000408.2 (GI : 38197144)에 나타나있으며, 하기 (서열번호 4)와 같다.
Figure pct00004
생쥐 ACAT1 shRNA 서열은 하기와 같다(서열번호 5).
Figure pct00005
생쥐ACAT2 shRNA 서열은 하기와 같다(서열번호 6).
Figure pct00006
일부 실시양태에서, ACAT 억제제는 작은 분자이다. 예시적인 ACAT 소분자 억제제는 아바시미브(CI-1011)(Pfizer); CI-976; CP113,818(Pfizer); pactimibe; NTE-122(Nissin Food Products, Ltd); F-1394(Fujirebio Inc.); PD140296 (Parke-Davis); PD128042 (Parke-Davis); PD132301-2 (Parke-Davis); octimibate; DuP128; 58-035; HL-004; SMP-500 (Sumitomo Pharmaceuticals Co.); CL-277,082; SKF-99085 (Glaxo Smith-Kline); CS-505 (Sankyo Pharma); eflucimibe, F12511; E5324; FR145237 (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.); CL277,082; YM-17E, FR129169 (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.); 및 타목시펜을 포함한다.
ACAT1 및 ACAT2 모두를 억제하는 소분자 억제제 또한 고려된다. ACAT1 및 ACAT2 모두를 억제하는 ACAT 비선택적 소분자 억제제는 예를 들어, 아바시미브(CI-1011), CI-976 및 pactimibe를 포함 할 수 있다. 아바시미브는 10 μM 의 ACAT1에 대한 IC50을 나타내고, 2.5 μM 의 ACAT2에 대한 IC50을 나타내는 경구용 ACAT 비선택적 억제제이다. 아바시미브는 일반적으로 쥐, 개 및 인간에게 투여 할 때 안전하다고 여겨진다. 아바시미브가 고콜레스테롤증을 효과적으로 감소시켰음에도 불구하고, 경구 투여된 아바시미브는 체중, 음식 섭취 및 인슐린 저항에 영향을 주지 않았다.
일부 실시양태에서, 소분자는 아바시미브, ([[2,4,6-트리스(1-메틸에틸)페닐]아세틸]-, 2,6- 비스(1-메틸에틸)페닐에스테르]설 파믹산), 본래 죽상경화증을 통제하기 위해 개발된 작은 분자이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 CI-976, (2,2-디메틸-N-(2,4,6-트리메톡시페닐)도데칸아미드)이다. CI-976은 5 μM의 ACAT1에 대한 IC50을 나타내고, 1 μM 미만의 ACAT2에 대한 IC50을 나타내는 ACAT 비선택적 억제제이다.
Figure pct00007
본 발명에서, ACAT 소분자 억제제는 시험관 내에서 1 nM 내지 100 μM 범위의 IC50 값을 갖는다. 본원에 기재된 본 발명의 방법에 사용되는 경우, 하나 이상의 ACAT 억제제가 대상체(예를 들어, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 소 및 인간과 같은 포유류)에 투여되며, 이 때, ACAT 억제제로 치료를받지 않은 대상체와 비교하여, 상기 대상체는, 지방 조직 및/또는 간에서의 지방산, 트리글리세리드 및/또는 LD의 축적; 지방 조직 및/또는 간 중량; 혈당, 인슐린, 유리 지방산, 콜레스테롤, LDL, 렙틴 및/또는 사이토킨; 전신 중량을 포함하나 이에 한정되지 않는 비만 및/또는 T2D의 하나 이상의 징후 또는 증상의 감소, 억제, 경감 또는 개선의 치료적 이점을 나타낸다.
일부 실시 양태에서, ACAT 억제제는 항체이다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 용어 항체는 면역글로불린의 다양한 클래스 또는 서브클래스(예를 들어, 임의의 동물, 예를 들어, 양, 토끼, 염소 또는 마우스와 같은 통상적으로 사용되는 임의의 동물 유래의 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE)의, 또는 마우스) 중 임의의 건을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 모노클로날 항체, 예를 들어 ACAT1 모노클로날 항체 및/또는 ACAT2 모노클로날 항체를 포함한다.
본원에 사용된 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로없는 항체(예 : ACAT1에 특이적으로 결합하거나 또는 ACAT2에 특이적으로 결합하고, ACAT1 또는 ACAT2이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는 분리된 항체)를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러나 ACAT1에 특이적으로 결합하거나 또는 ACAT2에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종의 ACAT1 또는 ACAT2 분자와 같은 다른 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포물질 및/또는 화학 물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제조물(preparation)를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.
"항체 단편"은 손상되지 않은 항체의 일부, 바람직하게는 손상되지 않은 항체의 항원 결합 및/또는 가변영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab*, F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 항체 단편으로부터 형성된 단일 사슬 항체 분자 및 다중 특이성 항체를 포함한다. 파파인으로 분해되는 항체는 "Fab" 단편이라고 불리는 두 개의 동일한 항원 결합 단편과 쉽게 결정화 하는 능력을 반영하는 잔여 "Fc 단편"을 생산한다. Fab 단편은 H 쇄 (VH)의 가변 영역 도메인 및 하나의 중쇄(CH1)의 첫번째 불변 도메인과 함께 전체 L 쇄로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가이며, 즉, 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체에 펩신(pepsin) 처리시, 항원 결합 활성이 다른 2 개의 디설파이드가 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응하고 여전히 항원에 가교 결합할 수있는 하나의 큰 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 경첩 부위의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 추가 잔기를 가진다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 갖는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 경첩 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍(pair)으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어있다.
일부 실시양태에서, 예시적인 ACAT1 항체는 예를 들어 Abcam, BD Biosciences, BioRad, Cell Signaling, EMD Milipore, Novus Biologicals, R & D Systems 등을 포함하는 임의의 적합한 구입처로부터 구입한 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, Abcam의 예시적인 ACAT1 항체는 Aviva Systems Biology, Novus Biologicals, LifeSpan BioSciences, GeneTex, Abnova Corporation, Atlas Antibodies, GenWay Biotech, Invigrogen Antibodies, Sigma-Aldrich 및 Biovision을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 예시적인 ACAT2 항체는 예를 들어 Abcam, BD Biosciences, BioRad, Cell Signaling, EMD Milipore, Novus Biologicals, R & D Systems 등을 포함하는 임의의 적합한 구입처로부터 구입한 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, Abcam의 예시적인 ACAT2 항체는 Aviva Systems Biology, Novus Biologicals, LifeSpan BioSciences, GeneTex, Abnova Corporation, Atlas Antibodies, GenWay Biotech, Invigrogen Antibodies, Sigma-Aldrich 및 Biovision을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, ACAT 억제제는 억제성 핵산이다. 본원에 사용된 바와 같은, "억제성 핵산"은 포유동물 세포에 투여 될 때 표적 유전자(예 : ACAT1 및 ACAT2)의 발현을(예를 들어, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % 또는 심지어 90-100 %만큼) 감소시키는 이중 가닥 RNA, siRNA, shRNA 또는 안티센스 RNA, 또는 이의 일부 또는 모방체를 의미한다. 전형적으로, 핵산 억제제는 표적 핵산 분자의 적어도 일부 또는 그 오르토로그(ortholog)를 포함하거나 또는 표적 핵산 분자의 상보적인 가닥의 적어도 일부를 포함한다. 예를 들어, 억제성 핵산 분자는 본 명세서에 기술된 임의의 또는 모든 핵산의 적어도 일부를 포함한다.
억제성 핵산인 siRNA는 이중 가닥 RNA를 지칭할 수 있다. 최적으로, siRNA는 길이가 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드이고 3' 말단에 2개의 염기 돌출부(overhang)을 갖는다. 이러한 dsRNA는 개별 세포 또는 전체 동물에게 도입될 수 있다. 예를 들어 혈류를 통해 전신 도입될 수 있다. 이러한 siRNA는 mRNA 수준 또는 프로모터 활성을 하향 조절하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, ACAT 억제제는 억제성 핵산이며, 억제성 핵산은 shRNA이다.
방법
본 발명의 방법은 음식 섭취 억제, 체중 감소; 및 대사성 질환의 치료 또는 예방을 위해 ACAT 억제제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 소분자 및 억제성 핵산)를 투여하는 것을 포함한다.
(예방적 처치를 포함하는) 본 발명의 치료 방법은 일반적으로 본원의 화합물, 예컨대 본원의 화학식의 화합물의 치료적 유효량을, 이를 필요로하는 대상체(포유 동물, 특히, 인간을 포함)에게 투여하는 것을 포함한다. 그러한 치료는 대사성 질환 또는 그의 증상을 앓고 있거나, 갖고 있거나, 대사성 질환 또는 증상에 걸리기 쉽거나, 또는 대사성 질환 또는 증상에 걸릴 위험이 있는 대상체, 특히, 인간에게 적절하게 투여될 것이다. "(질환 또는 증상에 걸릴) 위험이 있는" 대상체의 결정은 대상체 또는 건강 관리 제공자(health care provider)의 진단 검사 또는 의견에 의한 객관적 또는 주관적 결정에 의해 이루어질 수 있다(예 : 유전자 검사, 효소 또는 단백질 표지자, 가족력 등).
용어 "치료적 유효량"은 음식 섭취를 억제하고 체중을 억제하고, ACAT의 작용에 의해 유리 지방산, TG 및 CE의 축적과 관련된 대사성 질환(예컨대, T2D 및 비만)의 증상을 치료, 완화하거나, 중증도를 경감시키거나, 그 지속기간을 감소시키기에 충분한 ACAT 억제제의 투여량을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 치료적 유효량은 다음 중 하나 이상을 달성하는데 효과적인 양이다: 지방 조직에서 지질구(lipid droplet) 크기 축적의 억제 및 유리 콜레스테롤의 콜레스테롤 에스테르로의 전환을 촉매하는 효소의 억제(예 : 아실-조효소 A : 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 1(ACAT1) 및 아실-조효소 A : 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 2(ACAT2)). 또한, 치료적 유효량은 지방 축적을 감소 또는 억제하고(예 : 지방 조직에서), 전반적인 음식 섭취를 감소 또는 억제하고, 혈당을 감소 또는 억제하고, 혈액 인슐린을 감소 또는 억제하고, 인슐린 민감도를 향상시키고, 렙틴을 감소 또는 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 치료적 유효량은, ACAT 억제제로 치료받지 않은 대상체와 비교하여, 상기 대상체에서 지방 조직 및/또는 간에서의 지방산, 트리글리세라이드 및/또는 LD의 축적; 지방조직 및/또는 간의 무게; 혈당, 인슐린, 유리 지방산, 콜레스테롤, 렙틴 및 / 또는 사이토킨; 또는 전체 체중을 비제한적으로 포함하는 비만의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소, 억제, 감소 또는 개선시키는데 효과적인 양이다.
ACAT 억제제의 투여량은 환자의 요건에 따라 달라질 수 있다. 본원에서 제공된 개시내용을 이용하여, 실질적인 독성을 일으키지 않지만 특정 환자에 의해 입증된 임상 증상을 치료하는데 효과적인 예방 또는 치료요법을 계획할 수 있다. 환자에게 투여되는 용량은 시간이 지남에 따라 환자에서 유익한 치료 반응에 영향을 미치기에 충분하여야 한다. 용량의 규모는 또한 부작용의 존재, 본질 및 범위에 의해 결정될 것이다. 특정 상황에 대한 적절한 투여량의 결정은 통상의 기술자의 기술 범위 내에있다. 이 계획은 화합물 역가, 상대적 생체이용률, 환자 체중, 부작용의 존재 및 중증도와 같은 요소를 고려하여 ACAT 억제제를 주의깊게 선택하는 것을 포함하여야 한다. 일반적으로, 치료는 ACAT 억제제의 최적 용량보다 적은 더 적은 투여량으로 개시된다. 그 후, 상황에 따라 최적의 효과에 도달할 때까지 투여량을 조금씩 증가시킨다. 투여량 및 간격은 치료되는 특정 임상 징후에 효과적인 ACAT 억제제의 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 이것은 개인의 질병 상태의 중증도에 맞게 치료 요법을 제공할 것이다.
대상체에게 투여되는 ACAT 억제제의 투여량 및 빈도(단일 또는 다회 용량)는 다양한 인자, 예를 들어 포유 동물이 다른 질병을 앓고 있는지, 그리고 이의 투여 경로는 무엇인지 여부; 수용자의 크기, 나이, 성별, 건강, 체중, 체질량 지수 및 식단; 치료되는 질병의 증상의 성질 및 정도(예 : 증상 및 그 증상의 중증도), 동시 치료의 종류, 치료되는 질병의 합병증 또는 기타 건강 관련 문제에 따라 다양할 수 있다. 투여량은 mg/kg/day 단위로 제공될 수 있다(이의 용량은 환자의 체중(kg), 신체 표면적(m2), 연령(세)로 조정할 수 있음). 다른 치료 요법 또는 제제를 본원에 기재된 방법 및 ACAT 억제제와 함께 사용할 수 있다. 확립된 투여량(예를 들어, 빈도 및 기간)의 조절 및 조작은 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 조성물 및 ACAT 억제제에 대해, 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 결정될 수 있다. 목표 농도는 본원에 기술된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정된 바와 같이, 본원에 기재된 방법을 달성할 수있는 ACAT 억제제의 농도일 것이다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 인간에서 사용하기위한 ACAT 억제제의 유효량은 또한 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간에 대한 용량은 동물에 효과적인 것으로 밝혀진 농도를 달성하도록 결정될 수 있다. 인체에서의 투여량은 위에서 설명한 바와 같이 유효성을 모니터링하고 투여량을 상향 또는 하향 조정함으로써 조정될 수 있다. 상기 기술된 방법 및 다른 방법에 기초하여 인간에서 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조절하는 것은 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 유효량은 약 0.001 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg로 보다 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위에 있을 수 있거나; 또는 범위의 하한이 0.001 mg/kg 내지 900 mg/kg 사이의 임의의 양이고, 범위의 상한이 0.1 mg/kg 내지 1000 mg/kg 사이의 임의의 양(예를 들어, 0.005 mg/kg 및 200 mg/kg, 0.5 mg/kg 및 20 mg/kg)인 임의의 범위일 수 있다. 유효량은 또한 치료된 질병, 투여 경로, 부형제 사용 및 다른 약제의 사용과 같은 다른 치료법과 병용 가능성에 따라 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 다양 할 것이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 전형적으로 0.01 mg/kg/day 내지 약 750 mg/kg/day에서 다양하다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 약 0.01 mg/kg/day 내지 약 200 mg/kg/day이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 특정 투여 스케쥴 또는 치료 요법에 따라 ACAT 억제제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, ACAT 억제제는 1 일 1 회 또는 1일 2 내지 5 회 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, ACAT 억제제는 1 일 3 회, 1 일 2 회, 1 일 1 회, 3주 주기의 경우 14 일 투여(1 일 4 회, 1 일 3 회 또는 1 일 2 회, 또는 1 일 1 회) 및 7 일 비투여, 3주 주기의 경우 최대 5 또는 7일 투여 (1 일 4 회, 1 일 3 회 또는 1 일 2 회, 또는 1 일 1 회) 및 14-16일 비투여, 또는 2 일에 1 회, 또는 1주 1 회, 또는 2주 1회, 또는 3주에 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, ACAT 억제제는 적어도 25 일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, ACAT 억제제는 적어도 14 일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, ACAT 억제제는 적어도 8 일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, ACAT 억제제는 적어도 6 일 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 경구 투여, 피하 주사, 복강 내 주사, 정맥 내 주사, 직장 투여, 국소 적용 또는 흡입에 의해 ACAT 억제제를 전신 또는 국소 투여하는 것을 포함할 수 있다.
조성물
본 발명은 유효량의 ACAT 억제제(예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 소분자 및 억제성 핵산) 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 이 때 유효량은 본 발명의 방법과 관련하여 전술한 바와 같다. 본원에 기술된 임의의 양태에 따라, 상기 약학 조성물은 경구, 협측 또는 비경구, 피하, 복강 내, 정맥 내, 직장 또는 국소 투여 또는 흡입에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 경구 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 정맥 내 주사에 적합하다. 일부 실시양태에서, 조성물은 활성제로서 2 종 이상의 ACAT 억제제(예 : 아바시미브 및 CI-976)를 포함할 수 있다.
"약학 조성물"은 환자에게 투여하기에 적합한 약학적으로 허용되는 형태로 본원에 기재된 화합물을 함유하는 제제이다. 용어 "약학적으로 허용되는"은 온전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 위험/이익 비율에 상응하는, 화합물, 물질, 조성물, 담체 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 또한, "약학적으로 허용되는"이란 미연방 정부 또는 주정부의 규제 기관이나, 미국 이외의 국가의 해당 기관에 의해 승인되거나 승인가능한 것을 의미하거나, 또는 동물, 보다 특히, 인간에 사용하기 위해 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재되어 있는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "약학적으로 허용되는 부형제"는 일반적으로 안전하고, 비 독성이며, 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 것이 아닌 약학 조성물을 제조하는데 유용한 부형제를 의미하며, 인간 약제용으로뿐 아니라, 동물용으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제의 예는 무균 액체, 물, 완충 식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 오일, detergent, 현탁화제, 탄수화물(예 : 글루코스, 락토스, 수크로스 또는 덱스트란), 항산화제(예 : 아스코르브산 또는 글루타치온), 킬레이트제, 저분자량 단백질 또는 이들의 적합한 혼합물을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체의 유형은 의도된 투여 경로에 기초하여 선택될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 무균의 국소 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성제를 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져있다. 본원에서 사용된 "제약 담체"또는 "담체"는 사용된 투여량 및 농도에서 세포 또는 포유 동물에 노출시 비독성인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 종종 생리학적으로 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 TweenTM, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PluronicsTM과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
약학 조성물은 임의의 바람직한 투여 경로(예컨대, 폐, 흡입, 비강 내, 경구, 협측, 설하, 비경구, 피하, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 흉막 내, 경막 내, 경피, 경점막, 직장 등)에 적합한 임의의 형태(예를 들어, 액체, 에어로졸, 용액, 흡입제, 미스트, 스프레이 또는 고체, 분말, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 패치 등)를 취할 수 있다. 활성 치료제(들)은 또한 제어된 방출을 위해 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 나노 입자, 리포솜 등으로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 흡입에 의한 에어로졸 투여용의 수용액 또는 분말의 형태; 경구 투여용 정제 또는 캡슐 형태; 직접 주사에 의한 투여 또는 정맥 내 주입용 무균 주입 유체에의 첨가에 의한 투여에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태; 또는 경피 투여 또는 경점막 투여용 로션, 크림, 발포제, 패치, 현탁액, 용액 또는 좌제의 형태로 투여 될 수 있다.
경구 제제는 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제제 또는 분말의 형태를 취한다. 일부 실시양태에서, 경구 약학 조성물은 불활성 희석제 또는 혼화가능한(assimilable) 식용 담체를 포함할 것이거나, 또는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 되거나, 또는 정제로 압축될 수 있거나, 또는 식이 요법의 식품과 직접 혼합될 수 있다. 치료학적 경구 투여의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합될 수 있고 섭취 가능한 정제, 박칼정, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 활성 화합물을 0.1 % 이상 함유해야 한다. 조성물 및 제제의 비율은 물론 다양할 수 있으며, 편리하게는 단위 중량의 약 2 내지 약 75 %, 또는 바람직하게는 25 내지 60 %일 수 있다. 상기 조성물에서 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 얻어질 수 있는 양이다.
약학 조성물은 비경구 투여에 의한 투여 또는 정맥내 주입을위한 멸균 주입 유체에의 첨가에 의한 투여를 위해 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태일 수 있고, 물, 에탄올, 폴리올(예 : 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적합한 혼합물, 또는 하나 이상의 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매를 포함한다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 본 발명의 화합물의 용액 또는 현탁액은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 적합한 계면활성제의 예를 하기에 제시한다.
약학 조성물은 또는 통상의 비독성 약학적으로 허용되는 담체 또는 아주번트를 함유하는 투여 형태, 제제, 적합한 전달 장치 또는 임플란트를 통해, 주사, 주입 또는 이식(피하, 정맥 내, 근육 내, 복강 내 등)에 의해 비경구로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 동맥 내, 활액 내, 흉골 내, 척수강 내, 병소 내 및 두개 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 예를 들어, 수용액에서의 비경구 투여를 위해, 용액은 적절하게 완충되어야하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 멸균 주사용액은 활성 화합물을 적절한 용매에 필요한 양으로 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 기본 분산매를 함유하는 무균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 활성 성분 및 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술을 사용하여, 멸균 주사 용액의 재구성을위한 멸균 분말을 제조할 수 있다. 수용액, 특히 멸균 수성 매질은 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이러한 용액은 멸균 처리되어있어 일반적으로 바람직하지 않은 물질을 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 통상의 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 예를 들어, 1 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ml의 피하주입 유체에 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주입할 수 있다.
상기 조성물은 생리적 조건에 거의 근사한 것이 요구됨에 따른 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 안정화제, 장성 조절제(toncity adjusting), pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소듐 락테이트 염산, 수산화 나트륨, 1,3- 부탄디올, 링거액, 등장성 염화 나트륨 용액, 덱스트로스 용액 등을 함유할 수 있다. 이들 제제 중 활성제의 농도는 다양할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 대상체의 필요에 따라 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 주로 선택될 것이다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 히드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제(예 : 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트)를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 약학적 제제 분야의 당업자에게 잘 알려져있다. 제제는 상기 언급한 문헌 Remington : The Science and Practice of Pharmacy에서 확인할 수 있다. 화합물 중 하나가 물에 거의 용해되지 않거나 또는 약간 용해되는 경우(sparingly or slightly soluble), 용해 촉진제 또는 가용화제가 첨가될 수 있거나 또는 용매가 10 내지 60 % w/w의 프로필렌 글리콜 등을 포함 할 수 있다. 직접 주입을 위해 더 많거나 또는 매우 농축된 용액의 제조도 고려된다. DMSO는 매우 빠른 침투를 위한 용매로 사용되어, 고농도의 활성제를 작은 부위에 전달할 수 있다.
약학 조성물은 비강 내 또는 흡입가능한 용액 또는 스프레이, 에어로졸 또는 흡입제를 통해 전달될 수 있다. 비강 용액은 점적(drop) 또는 스프레이로 비강에 투여되도록 고안된 수용액일 수 있다. 비강 용액은 많은면에서 비강 분비물과 유사하도록 제조될 수 있다. 따라서, 비강 수용액은 일반적으로 등장성이고 약간 완충되어 pH 5.5 내지 6.5를 유지한다. 또한, 필요하다면 안약 제제 및 적절한 약물 안정화제에 사용되는 것과 유사한 항균 방부제가 제제에 포함될 수 있다. 다양한 시판 비강 제제가 공지되어 있으며, 예를 들어, 항생제 및 항히스타민제를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 약학 조성물은 제제 내에 존재하는 임의의 담체 또는 희석제(예컨대 락토스 또는 만니톨) 이외에 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 첨가제는 하나 이상의 계면활성제를 포함하거나 하나 이상의 계면활성제로 이루어질 수 있다. 계면활성제는 전형적으로, 약물 침투 및 흡수를 향상시키기 위해, 세포의 지질 구조에 직접 삽입될 수 있는 지방산과 같은 하나 이상의 긴 지방족 사슬을 갖는다. 계면활성제의 상대적 친수성 및 소수성을 특성화하기 위해 일반적으로 사용되는 실험적 파라미터는 친수성-친유성 밸런스("HLB" 값)이다. 보다 낮은 HLB 값을 갖는 계면활성제는 보다 소수성이며, 오일 내에서 보다 큰 용해도를 갖는 반면, 보다 높은 HLB 값을 갖는 계면활성제는 보다 친수성이고, 수용액에서 보다 큰 용해도를 갖는다. 따라서, 친수성 계면활성제는 일반적으로 약 10 이상의 HLB 값을 갖는 화합물로 간주되며, 소수성 계면활성제는 일반적으로 약 10 미만의 HLB 값을 갖는 것들이다. 그러나, HLB 값은 HLB 값을 결정하는데 선택되는 실험적 방법에 따라 약 8 HLB 단위만큼 다를 수 있으므로, 이러한 HLB 값은 단지 많은 계면활성제에 대한 지침일 뿐이다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 계면활성제 중에는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지방산 및 PEG-지방산 모노 및 디에스테르, PEG 글리세롤 에스테르, 알코올-오일 에스테르교환반응 생성물(alcohol-oil transesterification products), 폴리글리세릴 지방산, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 스테롤 및 스테롤 유도체, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 당 및 이의 유도체, 폴리에틸렌 글리콜 알킬페놀, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌(POE-POP) 블록 공중 합체, 소르비탄 지방산 에스테르, 이온성 계면활성제, 지용성 비타민 및 이들의 염, 수용성 비타민 및 이들의 양친매성 유도체, 아미노산 및 이들의 염, 및 유기산 및 이들의 에스테르 및 무수물이 있다.
화합물의 제형은 앰플 및 바이알과 같이 적절한 방부제가 첨가될 수 있는 벌크 또는 단위-용량(예: 단일-용량 앰플) 또는 다회-용량 밀폐 용기로 제공될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 약학 조성물을 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 따라서, 조성물은 단위 투여 형태일 수있다. 이러한 형태에서, 제제는 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 세분된다. 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투여형으로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "투여 단위 형태"는 치료 대상체에게 단일 투여로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 발생시키도록 계산된 정량의 활성 화합물을 함유한다. 개시된 투여 단위 형태에 대한 명세는 활성 화합물의 특이적 성질 및 달성될 특정 치료 효과에 의해 기재되고 직접적으로 의존한다. 투여 단위 형태는 앰플, 바이알, 좌제, 분말, 정제, 환제, 캡슐, 로젠지, IV 백, 또는 에어로졸 흡입기상의 단일 펌프를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
병용 요법
본 발명은 또한 병용 요법을 포함하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 "병용 요법(combination therapy)"또는 "공동 요법(co-theraphy)"이란 용어는 요법에서 활성제들의 공동작용으로부터 유익한 효과를 제공하도록 의도된 특정 치료 요법의 일부로서 치료적 유효량의 ACAT 억제제를 적어도 하나의 추가 활성제와 함께 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 대사 질환(예를 들어, 과체중, 비만, 당뇨병, T2D 또는 관련 질병)의 치료를 위한 요법에서 ACAT 억제제 및 적어도 하나의 추가 활성제를 포함하는 병용 요법을 사용하여 비만 또는 T2D 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
적어도 하나 이상의 추가 활성제는 치료제, 예를 들어 항염증제, 또는 비 치료제, 및 이들의 조합일 수있다. 치료제와 관련하여, 병용의 유익한 효과는 치료 활성 화합물의 병용으로 인한 약동학 또는 약력학적 공동작용을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
항염증제의 비제한적인 예는 21-아세톡시프레그네놀론, 알로메타손, 알지스톤, 암시노나이드, 베타메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 클로로프레드니손, 클로베타솔, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티바졸, 데프라자코트, 데소니드, 덱사메타손 알콜, 덱사메타손 소디움 포스페이트, 디폴로라손, 두타스테라이드, 플루메타손 피바레이트, 플루오시노니드, 플루오로메토론 아세테이트, 플루오로메토론 알콜, 프루티카손 프로피오네이트, 할시노니드, 할로베타솔 프로피오네이트, 할로메타손, 할로프레돈 아세테이트, 히드로코르타민, 히드로코르티손, 히드로플루메티아지드 로토프렌돌 에타보네이트, 메드리손, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 소디움 포스페이트, 리멕솔론, 하이드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 로독사미드 트로메타민, 디플루프레드네이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일 측면에서, 스테로이드성 항염증제는 프레드니솔론 아세테이트와 같은 코르티코스테로이드 약물일 수 있다.
항염증제는 임의의 적합한 양으로 사용될 수있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 그러한 항염증제는 약 0.01 중량 % 내지 10.0 중량 %의 농도일 수 있다. 항염증제는 약 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 및 10 중량 % 또는 이들 양 사이의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항염증제는 약 0.05 % (w/v) 내지 약 1.0 % (w/v)의 농도로 존재할 수 있다.
본원에서 사용된 "조합된 상승적 양"은 상승적 효과(즉, 상가적 효과보다 큰 효과)를 발생시키는 제 1 양 (예를 들어, ACAT 억제제의 양) 및 제 2 양 (예를 들어, 항염증제의 양)의 합을 의미한다. 따라서, 상호 호환적으로 본원에서 사용되는 용어 "시너지", "상승작용", "상승적", "조합된 상승적 양"및 "상승적 치료 효과"는 측정된 효과가 단일 약제로서 단독으로 투여된 각 화합물의 개별 효과의 합보다 큰 경우, 병용 투여시 화합물의 측정된 효과를 의미한다.
본원에서 사용된 "조합된 상가적 양"은 상가적 효과(즉, 효과들의 합과 같은 효과)를 발생시키는 제 1 양 (예를 들어, ACAT 억제제의 양) 및 제 2 양 (예를 들어, 항염증제의 양)의 합을 의미한다. 따라서, 본원에서 상호 호환적으로 사용되는 용어 "상가", "조합된 상가적 양"및 "상가적 치료 효과"는 측정된 효과가 단일 약제로서 단독으로 투여된 각 화합물의 개별 효과의 합과 동일한 경우, 병용 투여시 화합물의 측정된 효과를 의미한다.
약제 또는 조성물의 조합은 함께 (예를 들어, 혼합물로서), 개별적이나 동시에 (예를 들어, 별도의 정맥 주사 라인을 통해) 또는 순차적으로 (예를 들어, 첫 번째 약제의 투여에 이어서 두 번째 약제가 투여됨) 투여될 수 있다. 따라서, 조합이라는 용어는 둘 이상의 약제 또는 조성물의 함께, 동시적 또는 순차적 투여를 지칭하기 위해 사용된다. 치료 과정은 대상체의 특정한 성질 및 선택된 치료 유형에 따라 개별적으로 결정하는 것이 가장 좋다. 본원에 개시된 것과 같은 치료는 매일, 격일로, 격주로, 매월 또는 치료적으로 유효한 임의의 적용 기준에 따라 대상체에 투여될 수 있다. 치료는 단독으로 또는 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 임의의 다른 치료와 병용으로 투여될 수 있다. 추가적인 치료는 제 1 치료와 동시에, 상이한 시간에, 또는 완전히 다른 치료 스케줄 (예를 들어, 제 1 치료는 매일, 추가 치료는 매주)로 투여될 수 있다.
조합된 투여는 별개의 제형 또는 단일 약학 제형을 사용하는 병용 투여 및 어느 순서로든 연속적 투여를 고려하며, 바람직하게는 둘 다의 (또는 모든) 활성제가 동시에 그의 생물학적 활성을 발휘하는 기간이 존재한다.
실시예
본원의 실시양태는 하기 실시예 및 상세한 프로토콜에 의해 추가로 예시된다. 그러나, 실시예는 단지 실시양태를 설명하기 위한 것이며 본원의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌과 공개된 특허 및 특허 출원의 내용은 본원에 참고로서 포함된다.
실시예 1: ACAT1 발현과 지방 생성 및 비만의 긍정적 상관관계
비만에서 ACAT의 기능을 시험하기 위해, 생체 외에서 쥐과 유래 3T3-L1 지방 전구 세포의 지방 생성 동안 ACAT1와 ACAT2 유전자, 및 그들의 유전자 산물의 발현 패턴을 in vitro에서 검사하였다. 실시간 PCR 분석 (도 1)으로부터 판단되는바와 같이, 지방 세포에서 ACAT1 mRNA 수준은 지방 생성 개시 2일 후 (즉, D2) 부터 현저하게 증가하였다. 그러나, ACAT2 mRNA 수준은 지방 전구 세포 (D0)와 성숙 지방 세포 (D6) 사이에서 유사하였으며, ACAT2 수준의 일시적인 감소가 D2에서 관찰되었다 (도 1). 또한, 실시간 PCR 분석에 의해 판단된바와 같이 고지방 식이-유도 비만 마우스로부터 분리된 백색 지방 조직 (WAT)은 마른 마우스의 경우와 비교하여 ACAT1의 mRNA 수준 증가와 ACAT2의 mRNA 수준 감소가 나타났다. 비만의 진행을 확인하기 위해 렙틴(leptin)의 수준을 마른 마우스와 비만 마우스의 WAT에서 측정하었다 (도 2). 또한, 비만 마우스의 갈색 지방 조직 (BAT)에서는 ACAT1과 ACAT2의 수준이 모두 증가했다. BAT-특이적 마커로 Uncoupling protein-1 (UCP-1)의 수준을 마른 마우스와 비만 마우스의 BAT에서 측정하였다. 반면 마른 마우스와 비만 마우스의 간에서는 ACAT1과 ACAT2가 비슷한 수준으로 발현되었다 (도 2).
실시예 2: ACAT 억제제 (아바시미브 및 CI-976)에 의한 지방 세포에서의 지질 축적 억제
지방 세포에서의 지질 축적에 대한 ACAT 억제제의 효과를 결정하기 위해 쥐과 유래 3T3-L1 지방 전구 세포를 아바시미브 (0 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM 및 20 μM)를 처리 또는 처리하지 않은 상태로 6일 동안 성숙 지방 세포로 분화시켰다. 아바시미브 용액은 디메틸설폭시드 (DMSO)에 용해시켜 제조하였다. 분화 6일째, 분화된 지방 전구 세포와 아바시미브가 처리된 분화된 지방 세포에 축적된 세포내 지질을 가시화하기 위해 Oil Red O염색을 하였다. 다음으로 지질의 분광 정량분석을 위해 Oil Red O 염색된 지질을 추출하였다. 세포 내 지질은 용량-의존적으로 60 %까지 감소하였다 (도 3A 및 도 3B). 아바시미브에의한 지질 축적 억제는 생물학적 시스템에서 지질 함유 분자의 시각화를 위한 무 염료, 비 침습적 이미징 기술인 Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) 현미경법에 의해 확인되었다 (도 4). 아바시미브와 유사하게, 비 선택적 ACAT 억제제인 CI-976을 0 μM, 5 μM, 15 μM 및 20 μM의 농도 범위에서 6일 동안 분화하는 지방 세포에 처리한 결과, 지질 축적의 감소를 Oil Red O 염색으로 확인하였다 (도 5a 및 도 5b). 따라서, 이들 데이터는 아바시미브 및 CI-976이 분화하는 in vitro 지방 세포에서 지질구의 축적을 현저하게 감소시키거나 억제하는데 효과적이었음을 나타낸다.
지질 대사 및 지방 세포 기능에 관여하는 유전자의 mRNA 수준에 대한 아바시미브 처리의 효과를 특징짓기 위해, 6일 동안 아비시미브 (20 μM)의 존재 또는 부재하에 분화된 3T3-L1 지방 전구 세포에 대하여 지방산 및 TG 합성에 관여하는 유전자, 예를 들어 PPARg, sterol regulatory element binding protein 1c (SREBP1c), MGAT1, DGAT2, FAS 및 SCD-1의 발현을 분석하기 위해 실시간 PCR분석을 수행하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 아바시미브의 처리는 지방 세포에서 지질 합성에 관여하는 유전자의 mRNA 수준의 현저한 감소를 가져왔다.
실시예 3: 아바시미브는 SREBP1 발현과 지질 합성 기능의 조절을 통해 지방 세포에서 지질 축적을 감소시킴.
SREBP1이 신생 지방산 및 지질 합성에서 중요한 역할을 하고, 도 6은 지방산 및 TG 합성에 관여하는 SREBP1-downstream 유전자의 억제에 있어 아바시미브의 잠재적 억제성 역할을 나타내기 때문에, 아바시미브 처리가 지방 세포에서 SREBP1 단백질 발현 및 신규 지방산 합성을 변화시키는 능력을 시험하였다. SREBP1 특이적 항체 및 베타-엑틴 (단백질 로딩 대조군)을 사용한 웨스턴 블롯 분석결과, 아바시미브 처리는 지방세포에서 125 kDa 불활성 전구체 형태의 SREBP1를 증가시켰다 (도 7).
중수소 표지된 글루코스-d7을 사용하여, 아바시미브로 처리되거나 처리되지 않은 지방 세포에서 신생 지방산 합성에 대한 아바시미브의 영향을 시험하였다. 글루코스-d7 함유 지방산은 stimulated Raman scattering (SRS) 현미경으로 가시화되었다. SRS 이미징은 아바시미브 처리된 지방 세포에서 지방산의 모든 수소원자가 글루코스-유래 중수소 원자로 치환된 결과로서, 감소된 지질구(LD) 축적 수준 (즉, C-H결합이 많은 지질 분자의 진동 이미지)과 지질구내 축적된 글루코스-d7의 신호 강도 (즉, C-D결합이 많은 지질 분자의 진동 이미지)를 나타내였다 (도 8). 이러한 결과는 잠재적으로 SREBP1 기능의 억제를 통해 신생 지방산 합성에서 아바시미브의 억제성 또는 저해성 역할을 나타낸다.
실시예 4: 지방 세포에서 아바시미브가 콜레스테롤 대사에 미치는 영향
이전의 연구들은 지방 세포에서 콜레스테롤 축적의 지방 생성-의존적 증가를 보고했다. 유사하게, 지방 생성은 CE수준의 변화가 거의 없는 유리 콜레스테롤의 증가와 관련이 있었다. 더욱이 아바시미브 처리는 지방 세포의 지방 생성 중 콜레스테롤의 양을 현저히 낮추고 CE의 축적도 완전하게 감소시켰다 (도 9). 이것은 대조군의 지방 세포와 비교하여 아바시미브로 처리한 지방 세포에서, scavenger receptor class B member 1 (SR-BI) 및 CD-36과 같이 콜레스테롤 흡수에 관여하는 유전자의 mRNA 수준의 현저한 감소를 동반했다 (도 10). 25-[N-[(7-니트로-2-1,3-벤조옥사다이아졸-4-일)메틸]아미노]-27-노르콜레스테롤 (25-NBD 콜레스테롤)-기반 ACAT 분석에서, 아바시미브는 실제로 ACAT의 활성을 억제함으로써 지방 세포에서 형광 표지된 CE의 축적을 저하시켰다 (도 11). 결국 이 결과들은 아바시미브가 지방산과 TG의 합성을 억제할 뿐만 아니라, 매질로부터 콜레스테롤 흡수에 관여하는 유전자의 발현을 억제함으로써 지방 세포에서 콜레스테롤 흡수와 유리 콜레스테롤 및 CE의 축적 또한 억제한다는 것을 시사한다.
실시예 5: ACAT1의 shRNA 억제가 지방 세포내 지질구의 축적에 미치는 영향
지방 세포에서 지방산 및 TG 합성에 대한 ACAT1의 직접적 역할을 특정 shRNA를 사용한 렌티바이러스-매개 ACAT1 넉다운으로 시험하였다. 도 12는 지방 세포에서의 ACAT2 발현 수준에 영향 없이 ACAT1에 대한 shRNA의 유전자 넉다운 효율을 나타낸다. 지방 세포에 대한 아바시미브의 효과와 유사하게, ACAT1 넉다운은 대조군 shRNA지방 세포보다 지방 세포에서 지질 축적을 40 %까지 억제시킨 것을 Oil Red O 염색법에 의해 확인하였고 (도 13a 및 도 13b), 실시간 PCR 분석에 의하면 지질 합성에 관여하는 유전자의mRNA수준도 현저하게 감소시켰다 (도 14). 유사하게, ACAT2 넉다운은 대조군 shRNA 지방 세포보다 지방 세포에서 지질 축적을 55%까지 억제시킨 것을 Oil Red O 염색법에 의해 확인하였다 (도 15a 및 도 15b). ACAT2 넉다운은 TG합성에 관여하는 유전자의 mRNA수준을 현저하게 감소시켰다 (도 16). 여기에서 ACAT 억제제인 아바시미브 및 CI-976는 비만 마우스 모델에서 항-비만 치료에 매우 효과적인 것으로 확인되었다. 세포기반의 연구에 따르면 ACAT억제 및 ACAT1 넉다운은 유리 콜레스테롤 및 CE 축적 수준이 낮은 지방 세포에서 지방산, TG 및 지질구의 합성을 감소시키거나 억제했다. 또한 세포기반의 연구는 지방 세포에서 지질 합성에 대한, ACAT억제 및 ACAT1넉다운의 저해성 또는 억제성 역할이 SREBP1의 발현과 기능, 및 지방산과 TG의 합성에 관여하는 그의 downstream 유전자의 발현의 억제로부터 크게 기인한다고 제안한다.
실시예 6: 고-지방 식이-유도된 비만과 인슐린 저항성을 갖는 마우스에서 아바시미브의 항-당뇨병 효과
ACAT의 조직- 및 isoform- 특이적 조절은 죽상 경화증과 같은 콜레스테롤 조절 이상 질환에 대한 치료 전략으로 제안되어 왔다. 그러나 비만에서 ACAT의 치료적 역할은 전혀 연구된 적이 없다. 고지방 식이를 섭취한 C57BL/6J 비만 및 당뇨병 마우스에 약 2 주간 매일 아바시미브 (20 mg /kg 체중)를 복강 주사한 결과 총 체중 증가의 약 25 % 감소 또는 억제 (도 17a 및 도 17b)와 함께 총 체지방량 (도 18a)과 백색 지방 조직 (Ing : 서혜부 지방 조직, Epi : 부고환 지방 조직, Retro : 후 복막 지방 조직) 무게의 유의한 감소를 보였으며 (도 18b), 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 분석 결과 뚜렷한 간독성은 나타나지 않았다 (도 19). 아비시미브의 투여는 음식 섭취를 약 50 % 감소시켰다 (도 20a). 이는 결국 아바시미브가 투여된 마우스에서 호흡 교환 비와 혈당 수준이 대조군 마우스와 비교하여 감소된 것으로부터 알 수 있듯이 (도 20 c), 시험군 마우스의 에너지 이용 패턴을 식이 탄수화물에서 지방 조직에 저장된 지질로 이동시키며 에너지 소비 (energy expenditure)를 감소시켰다 (도 20b). 더욱이 비만 및 당뇨병 마우스에 대한 2주간의 아바시미브 투여는 혈당 (도 21a) 및 인슐린 수준 (도 21b)의 현저한 감소와, 개선된 글루코스 내성 (도 21c) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가 (HOMA-IR) 값 (도 21d)을 보였다.
아바시미브가 투여된 쥐의 경우 유리 콜레스테롤 (도 22a), CE (도 22b) 및 TG (도 22c)의 감소와 같이 유의하게 개선된 혈중 지질 프로파일을 나타냈다. 도 18a와 도 18b에 도시된 지방 조직 질량의 감소 또는 억제와 일관되게, 음식 섭취 거동을 억제하여 전신 에너지 균형을 조절하는 지방 조직-분비 포만 호르몬인 렙틴의 수준은 아바시미브의 처리에 의해 현저하게 억제되었다 (도 22d).
ACAT1 억제제는 음식 섭취를 현저하게 감소시켰기 때문에, 아바시미브가 음식 섭취를 감소시키거나 억제하는 작용이 비만 표현형 및 인슐린 저항성을 낮추는 효과에 대하여 시험하였다. 이를 위해 아바시미브가 투여된 마우스가 소비한 것과 동량의 음식을 마우스에게 8일 동안 섭취시켰다 (pair-fed). 아바시미브가 투여된 마우스 및 pair-fed 마우스 모두 비슷한 수준의 체중 감소 (도 23a)와 음식 섭취 (도 23b)를 보였고, 분에너지(fecal energy) 함량의 변화는 거의 없었다 (도 23c 및 도23d).
흥미롭게도, pair-fed 그룹의 마우스들은 대조군과 비교하여 낮은 혈당 수준을 보였으나, 아마시미브 처리된 마우스에서 발견된 수준에는 미치지 못하였다 (도 23e). 따라서 이러한 결과는 식이-유도된 비만 및 당뇨병 마우스에서 ACAT1활성의 저해가 체중 감소의 이점을 가지며 T2D를 치료하기 위한 유용한 전략이라는 증거를 제공하였다.
여기에서 ACAT 억제제인 아바시미브 및 CI-976이 매우 효과적인 항당뇨병 치료제로 확인되었다. 본 발명의 방법은 T2D 및 비만 증상 치료에 효능이 있는 것으로 알려진 임의의 바람직한 경로에 의해 단독으로 또는 다른 약물과 병용하여 ACAT1 억제제를 투여하는 것과 관련성이 있다고 기대된다.
당업자는 전술한 특정 구현예에 대해 많은 수정이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 구현은 설명된 특정 제한에 한정되어서는 안된다. 다른 구현이 가능할 수 있다.
실시예 7: LC MS/MS를 이용한 지방 세포에서 아바시미브의 영향을 받는 단백질의 단백체 분석
지방 생성 동안 지질구 발달에서 ACAT의 역할에 대한 포괄적인 시각을 얻고 ACAT 억제에 의해 영향을 받는 새로운 분자 타겟을 분석하기 위해, 우리는 광범위한 단백체 접근법을 적용하여 3T3-L1 지방 전구세포 모델에서 ACAT억제가 지방 세포 단백체에 미치는 영향을 조사하였다.
재료 및 방법
1. 세포 준비 및 분해
3T3-L1 지방 전구세포는 다른 곳에서 기술된 것과 동일한 배양 조건에서 성숙 지방 세포로 분화하도록 유도되었다. 세포를 아바시미브 (10 μM) 또는 DMSO로 분화 과정 2일째에서 6일째까지 처리하였는데, 이는 지질구가 형성되는 기간이다. 아바시미브 또는 DMSO는 매 48 시간마다 새롭게 교체되었다. 각 조건은 3번 반복실험 하였다. 6일째에 지방 세포를 1 x PBS에 세척하고 배양접시에서 분리하였다. 지방 세포 pellet들을 원심분리 후 수집하고 단백질에 대한 트립신의 비율이 1:50 (㎍/㎍)인 트립신 (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)으로 분해시켰다.
2. LC MS/MS및 단백체 분석
트립신 분해 후 트립신 펩타이드는 이전에 기술된 바와 같이 (D'Aquila, et al. 2015) 나노 LC시스템 (1100 시리즈 LC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에서 분리되었다. 간략하게, 펩타이드를 Agilent 300SB-C18 농축 컬럼으로 농축하고 C18 역상 ZORBAX 300SB-C18 컬럼으로 분리하였다. 고 해상도 하이브리드 이온 트랩 질량 분석기 LTQ-Orbitrap LX (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA, USA)를 사용하여 데이터 의존 양성 포착 모드에서 펩타이드를 확인하였다. 이 실험은 Bindley Bioscience Center에서 수행되었다. 우리는 LC MS/MS 분석 결과를 분석하기 위해 MaxQuant 전산 단백체 플랫폼 버전 1.5.3.17 (Cox and Mann, 2008)을 사용하였다. 2015 년 9 월 1 일에 검색된 UNIPROT의 Mus musculus (24754 항목) 서열과 일반적인 오염 물질 데이터베이스가 참조 데이터베이스로 사용되었다. MaxQuant는 다음과 같은 매개 변수로 설정되었다: 최소 펩타이드 길이는 7 개의 아미노산으로 설정되었고, "Match between runs"간격은 1분으로 설정되었으며; FASTA 데이터베이스는 무작위로 추출되어 1 %의 단백질 오류 발견율이 허용되었고; 트립신 분해에서는, 두 개의 missed cleavaeg가 허용되었고, “Iodoethanol”과 같은 고정된 변형과 “Oxidation (M)”및 “(Protein N-term)”과 같은 다양한 변형을 포함하여 펩타이드 당 3개의 변형이 허용되었고; 초기 전구체는 0.07로 설정되었고 매스 프래그먼트 허용 오차는 0.02 Da로 설정되었으며; 데이터는 “Label-free quantification”(LFQ)으로 분석하였다.
MaxQuant 결과는 모든 일반적 오염 단백질을 제거하고 생물학적 복제 및 로그 변환[log2 (x)]에 대한 평균 LFQ 강도 값을 계산하기 위한 인하우스 스크립트에서 사용되었다. 누락된 값은 표시된 경우를 제외하고는 공백으로 남겼다. Two tailed student t-test는 LFQ 강도에서 수행되었다.
결과 및 고찰
1. LC MS/MS에 의한 단백질 동정
지질구 형성 단계 (즉, 2일째 - 6일째) 동안 아바시미브 (10 μM) (n = 3)의 존재 또는 부재하에 배양된 3T3-L1 지방 세포 (D6)의 단백체를 분석하였다. 669개의 단백질이 검출 및 동정되었다. 이 분석은 세 번의 생물학적 반복 (217 + 10 + 9 = 236 단백질) 모두에서 확인된 단백질에 국한되었다. 추가 분석 (도 24)은 ACAT 억제가 76개의 동정된 단백질의 수준을 감소 또는 억제시켰고, 동정된 102개의 단백질의 수준을 증가시켰으며 58개의 단백질의 수준을 유의적으로 변화시키지 않았음을 나타낸다.
빈도가 ≥ 2배 증가 또는 감소하는 기준으로 데이터를 필터링 하였을때 (log2 T - log2 C > 1 또는 <-1이고 empty value는 최저 강도 값의 절반, 즉 6.3462-1 = 5.3462로 채워질 때) 아바시미브 처리가 22개의 단백질 수준을 증가시키고 53개의 단백질 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 이 75개의 단백질은 Annotation, Visualization 및 Integrated Discovery 단백질 분석 Database(DAVID)에 의해 더 분석되었고, 도 25 내지 도 27에 나열된 결과는 아래에 설명된다.
2. 단백체 결과는 종전 in vitro 발견과 일치함.
이 단백체 분석으로 지방산 대사 과정과 관련된 7 개의 동정된 단백질이 아바시미브 처리로 downregulated 되었음을 확인했다. 이 7개 단백질들은 2개의 그룹으로 분류되었다: 1) 지방 생성 관련 단백질: Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 (86% 감소), FAS (대조군에서만 발견됨); 2) 미토콘드리아 지방산 b-산화에 관련된 단백질: Acyl-CoA dehydrogenase (56% 감소), enoyl CoA hydratase short chain 1 (64% 감소), hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (64% 감소), acetyl-CoA acyltransferase 1 (61% 감소), carnitine O-acetyltransferase (대조군에서만 발견됨) 및 hydroxysteroid (17-b) dehydrogenase 4 (38% 감소).
추가로, ACAT 억제는 또한 아디포넥틴 (84 % 감소) 및 지방산 결합 단백질 4 (64 % 감소)를 포함하는 지방 세포 마커의 단백질 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 콜레스테롤 대사와 관련된 3 가지 단백질이 동정되었다. 그 중 cytochrome B5 Reductase 3 (콜레스테롤 생합성에 관여) 및 superoxide dismutase 1 (콜레스테롤 생합성 음성 조절과 관련 있음)은 ACAT 억제에 의해 크게 변화되지 않았지만, sterol carrier protein 2 (담즙산 생합성 기능)는 36% 감소되었다. 콜레스테롤 신생 합성이 지방 세포에서 제한적으로 일어난다는 것을 고려할 때, 이후 효소활성법으로 검증이 필요하겠지만 ACAT 억제가 지방 세포에서 콜레스테롤 생합성을 크게 변화시키지는 않을 것으로 추측된다.
특히, 아바시미브는 중요한 약물 대사 효소인 cytochrome P450 (CYP450)을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Sahi, et al. 2004). 유사하게, 본 단백체 결과는 ACAT 억제가 CYP450 경로에 관여하는 cytochrome B5 Type A (67 % 감소)의 단백질 수준을 감소시키거나 억제함을 시사했다. 종합하면, 단백체 분석은 ACAT 억제가 in vitro에서 지방 생성에 관여하는 단백질을 억제하고 지방 생성을 지연시키는 것을 뒷받침한다.
3. 세포골격은 ACAT억제에 의한 지질구 발달 억제에 관여할 수 있음.
지방 생성 동안, 세포 형태는 평면에서 구형으로 변화하며 이러한 형태학적 변화는 미세소관 (microtubules)의 단편화 및 지방 생성 동안의 액틴 마이크로필라멘트의 해중합 (depolymerization)을 포함한 세포골격 리모델링에 의해 설명된다 (Smas and Sul 1995; Welsh, et al. 2004). 더구나 거의 모든 검출된 세포골격 단백질 수준이 지방 생성 동안 감소한다는 것이 잘 알려져 있다 (Soukas, et al. 2001; Welsh, et al. 2004). 앞서 단백체 연구에서 언급된 Annotation, Visualization 및 Integrated Discovery 분석 Database(DAVID)은 아바시미브에 의해 upregulated된 단백질이 주로 세포골격과 관련이 있음을 보여주었다. 이것은 ACAT억제가 어떻게 지방 생성 과정을 지연시키는지를 설명할 수 있다. 세포골격 단백질은 인간 지방 세포에서 새로 생성된 지질구를 안정화 시키는데 필요하다고 알려져 있다 (Heid, et al. 2014). 그러나 아비시미브가 세포골격 리모델링을 통해 지질구의 발달을 억제하는지 여부는 불분명하다. 이러한 결과는 ACATs가 세포골격 리모델링을 통해 지질구 발달에 영향을 미치는지에 대한 가설을 제시한다.
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Cys Cys His Val 145 150 155 160 Arg Arg <210> 2 <211> 1370 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggggagtcta cgcctgtgga gccgatactc agcccactgc gaccatggct gtgctgccgg 60 cacttctgcg cagcggcgcc cgcagccgca gccccctgct ccggaggctg gtgcaggaaa 120 taagatatgt ggaacggagt tatgtatcaa aacccacttt gaaggaagtg gtcatagtaa 180 gtgctacaag aacacccatt ggatcttttt taggcagcct ttccttgctg ccagccacta 240 agcttggttc cattgcaatt cagggagcca ttgaaaaggc agggattcca aaagaagaag 300 tgaaagaagc atacatgggt aatgttctac aaggaggtga aggacaagct cctacaaggc 360 aggcagtatt gggtgcaggc ttacctattt ctactccatg taccaccata aacaaagttt 420 gtgcttcagg aatgaaagcc atcatgatgg cctctcaaag tcttatgtgt ggacatcaga 480 tcaagcaaga gacaggctcc ttagcaaaaa tatgctgtca tgtcaggagg tgagacctgg 540 acacacagaa gaatcaagat tctctcagat ctgagccctt catttttcag atgaagattt 600 tttttcagtg tgtctgagac agccacagag ttacagggct gagcatctgc catgtgacag 660 tcattggaaa tagagtggtg aacaaaacat ttaaaaaaat ctgtacatgt gcaggtctct 720 gttggaaaaa tgcctaaaag aaatgctgag tcaggatttg aacattttgg tatttgcaaa 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Val Ile Phe Gly His Val Leu Ala Ala Gly 50 55 60 Cys Gly Gln Asn Pro Val Arg Gln Ala Ser Val Gly Ala Gly Ile Pro 65 70 75 80 Tyr Ser Val Pro Ala Trp Ser Cys Gln Met Ile Cys Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Lys Ala Val Cys Leu Ala Val Gln Ser Ile Gly Ile Gly Asp Ser Ser 100 105 110 Ile Val Val Ala Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Lys Ala Pro His Leu 115 120 125 Ala Tyr Leu Arg Thr Gly Val Lys Ile Gly Glu Met Pro Leu Thr Asp 130 135 140 Ser Ile Leu Cys Asp Gly Leu Thr Asp Ala Phe His Asn Cys His Met 145 150 155 160 Gly Ile Thr Ala Glu Asn Val Ala Lys Lys Trp Gln Val Ser Arg Glu 165 170 175 Asp Gln Asp Lys Val Ala Val Leu Ser Gln Asn Arg Thr Glu Asn Ala 180 185 190 Gln Lys Ala Gly His Phe Asp Lys Glu Ile Val Pro Val Leu Val Ser 195 200 205 Thr Arg Arg Gly Leu Ile Glu Val Lys Thr Asp Glu Phe Pro Arg His 210 215 220 Gly Ser Asn Ile Glu Ala Met Ser Lys Leu Lys Pro Tyr Phe Leu Thr 225 230 235 240 Asp Gly Thr Gly Thr Val Thr Pro Ala Asn Ala Ser Gly Ile Asn Asp 245 250 255 Gly Ala Ala Ala Val Val Leu Met Lys Lys Ser Glu Ala Asp Lys Arg 260 265 270 Gly Leu Thr Pro Leu Ala Arg Ile Val Ser Trp Ser Gln Val Gly Val 275 280 285 Glu Pro Ser Ile Met Gly Ile Gly Pro Ile Pro Ala Ile Lys Gln Ala 290 295 300 Val Thr Lys Ala Gly Trp Ser Leu Glu Asp Val Asp Ile Phe Glu Ile 305 310 315 320 Asn Glu Ala Phe Ala Ala Val Ser Ala Ala Ile Val Lys Glu Leu Gly 325 330 335 Leu Asn Pro Glu Lys Val Asn Ile Glu Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly 340 345 350 His Pro Leu Gly Ala Ser Gly Cys Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu His 355 360 365 Thr Leu Glu Arg Met Gly Arg Ser Arg Gly Val Ala Ala Leu Cys Ile 370 375 380 Gly Gly Gly Met Gly Ile Ala Met Cys Val Gln Arg Glu 385 390 395 <210> 4 <211> 1443 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggagaagcaa gatgaatgca ggctcagatc ctgtggtcat cgtctcggcg gcgcggacca 60 tcataggttc cttcaatggt gccttagctg ctgttcctgt ccaggacctg ggctccactg 120 tcatcaaaga agtcttgaag agggccactg tggctccgga agatgtgtct gaggtcatct 180 ttggacatgt cttggcagca ggctgtgggc agaatcctgt tagacaagcc agtgtgggtg 240 caggaattcc ctactctgtt ccagcatgga gctgccagat gatctgtggg tcaggcctaa 300 aagctgtgtg ccttgcagtc cagtcaatag ggataggaga ctccagcatt gtggttgcag 360 gaggcatgga aaatatgagc aaggctcctc acttggctta cttgagaaca ggagtaaaga 420 taggtgagat gccactgact gacagtatac tctgtgatgg tcttacagat gcatttcaca 480 actgtcatat gggtattaca gctgaaaatg tagccaaaaa atggcaagtg agtagagaag 540 atcaggacaa ggttgcagtt ctgtcccaga acaggacaga gaatgcacag aaagctggcc 600 attttgacaa agagattgta ccagttttgg tgtcaactag aagaggtctt attgaagtta 660 aaacagatga gtttcctcgc catgggagca acatagaagc catgtccaag ctaaagcctt 720 actttcttac tgatggaacg ggaacagtca ccccagccaa tgcttcagga ataaatgatg 780 gtgctgcagc tgtcgttctt atgaagaagt cagaagctga taaacgtgga cttacacctt 840 tagcacggat agtttcctgg tcccaagtgg gtgtggagcc ttccattatg ggaataggac 900 caattccagc cataaagcaa gctgttacaa aagcaggttg gtcactggaa gatgttgaca 960 tatttgaaat caatgaagcc tttgcagctg tctctgctgc aatagttaaa gaacttggat 1020 taaacccaga gaaggtcaat attgaaggag gggctatagc cttgggccac cctcttggag 1080 catctggctg tcgaattctt gtgaccctgt tacacacact ggagagaatg ggcagaagtc 1140 gtggtgttgc agccctgtgc attgggggtg ggatgggaat agcaatgtgt gttcagagag 1200 aatgaattgc ttaaactttg aacaacctca atttcttttt aaactaataa agtactaggt 1260 tgcaatatgt gaaatcagag gaccaaagta cagatggaaa ccatttccta catcacaaaa 1320 acccaagttt acagcttgta ctttacttta atgtgtaata ctcaactcaa ggtacaagac 1380 aattgcattt aacattgtta taaataaaag gaacatcaga tcaatcaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaa 1443 <210> 5 <211> 59 <212> RNA <213> mouse <400> 5 ccggccaacc agagacuaaa cauaucucga gauauguuua gucucugguu gguuuuuug 59 <210> 6 <211> 59 <212> RNA <213> mouse <400> 6 ccggugcggu gguucaugag uauaucucga gauauacuca ugaaccaccg cauuuuuug 59

Claims (12)

  1. 아실-조효소 A:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 1(ACAT1) 및 아실-조효소 A:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 2(ACAT2)를 억제하는 유효량의 활성제를 포함하는, 대상체의 음식 섭취를 억제하거나 또는 체중을 감소시키기 위한 조성물이며, 이 때 상기 활성제가 ACAT1을 억제하는 정도는 상기 활성제가 ACAT2를 억제하는 정도와 유사하거나 그보다 낮은 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 활성제는 아바시미브, CI-976 또는 양쪽 모두인 조성물.
  3. 아실-조효소 A:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제(ACAT)를 억제하는 유효량의 활성제를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 음식 섭취를 억제하거나 또는 체중을 감소시키는 방법이며, 이 때 상기 활성제가 ACAT1을 억제하는 정도는 상기 활성제가 ACAT2를 억제하는 정도와 유사하거나 그보다 낮은 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 활성제가 아바시미브, CI-976, 또는 양쪽 모두인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유효량이 약 0.01 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일의 범위인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 조성물이 비경구로 투여되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물이 피하, 정맥 내 또는 복강 내로 투여되는 것인 방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 활성제가 대상체의 당뇨병 상태를 개선시키는 것인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 활성제를 투여 받은 상기 대상체는, 활성제 투여 없이 고지방 식이를 섭취한 대상체와 비교하여, 유리 콜레스테롤, CE, TG 또는 이들의 임의의 조합물의 감소된 수준을 갖는 것인 방법.
  10. 서열번호 5를 포함하는, ACAT1을 넉다운하기 위한 shRNA 염기서열.
  11. 서열번호 6을 포함하는, ACAT2를 넉다운하기 위한 shRNA 염기서열.
  12. 렌티바이러스 벡터에 작동 가능하게 통합되며 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 shRNA 서열을 지방 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 상기 지방 세포에서 지방산 및 TG의 합성을 억제하는 방법.
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