KR20190094710A - 암 환자에서 면역 치료 효과를 예측하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 환자에서 면역 치료 효과를 예측하는 방법, 보다 구체적으로 항 PD-1 면역항암제 치료 효과를 예측하는 방법에 관한 것이다. 면역항암제란 인체가 가지고 있는 고유의 면역계를 강화시켜 암에 대항력을 높여 주는 약물을 의미한다. 면역항암제는 기존의 암 치료법의 단점을 보완하였는데, 1세대 화학항암제가 암세포를 직접 공격하고, 2세대 표적 항암제가 암 관련 유전자를 공격하는 기능을 한다면, 3세대 항암제라 불리는 면역항암제는 면역력을 강화해 암을 치료하게 된다. 가장 대표적인 면역항암제인 PD-1 면역항암제로 키트루다와 옵디보가 출시되어 의학 분야에서 암 치료에 이용되고 있으나, PD-1 면역항암제가 효과가 있는 환자군과 효과가 없는 환자군을 사전에 구분할 수 있는 방법이 부재하여, 효과가 없는 환자군의 경우 PD-1 면역항암제 치료에 대한 비용과 시간을 손실하고 있는 실정이다.
따라서 본 발명은 암 환자에서 면역 치료 효과를 예측하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면 PD-1 면역항암제가 효과가 있는 환자군과 효과가 없는 환자군을 사전에 구분 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

암 환자에서 면역 치료 효과를 예측하는 방법{A method for prediction of the immunotherapy effects to cancer patients}
본 발명은 암 환자에서 면역 치료 효과를 예측하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 항 PD-1 면역항암제 치료 효과를 예측하는 방법에 관한 것이다.
종래의 암 치료는 수술, 방사선 요법, 및 화학요법으로 최대한 암세포를 환자에게서 제거해 내는 방법이었다. 그러나 수술 및 방사선 요법은 비교적 초기 암으로 전이가 되지 않은 상황에서 완전히 암세포를 제거하였을 때 치료 효과가 있다. 즉, 수술에 의해 암 조직을 제거하더라도 소수의 암세포가 신체의 다른 부위로 전이된 경우에는 재발 위험이 높다. 또한 화학요법은 광범위하게 암 치료에 사용할 수 있으나, 대부분의 고형암에서 치료율이 좋지 않고, 빠르게 분열하는 정상적인 세포들을 함께 사멸시키므로 여러 가지 부작용이 나타나는 단점이 있었다. 이러한 종래의 문제점을 개선하기 위해서, 최근에는 면역항암제를 이용한 면역 치료가 대두되고 있다.
면역항암제란 인체가 가지고 있는 고유의 면역계를 강화시켜 암에 대항력을 높여 주는 약물을 의미한다. 인체가 가진 본연의 힘으로 암을 저지한다는 점에서 종래의 암치료를 바라보는 개념과 근본적인 차이가 있다. 면역항암제는 기존의 암 치료법의 단점을 보완하였는데, 1세대 화학항암제가 암세포를 직접 공격하고, 2세대 표적 항암제가 암 관련 유전자를 공격하는 기능을 한다면, 3세대 항암제라 불리는 면역항암제는 면역력을 강화해 암을 치료하게 된다.
가장 대표적인 면역항암제인 항 PD-1 항체는 활성화된 T세포(면역세포)의 표면에 있는 단백질인 PD-1과 암세포의 표면에 있는 단백질인 PD-L1, PD-L2의 결합을 막아주는 치료제이다. 암세포의 표면에 있는 PD-L1과 PD-L2가 T세포의 표면에 있는 단백질인 PD-1과 결합하면, T세포의 기능이 저하되고 암세포를 공격하지 못한다. 따라서 항 PD-1 면역항암제는 T세포의 PD-1 수용체에 달라붙어, 암세포의 PD-L1, PD-L2와 T세포의 PD-1이 결합하는 것을 억제함으로서, 암 세포에 대한 T세포의 활성을 유지하도록 하고 암세포의 회피 기능을 억제한다. 항 PD-1 면역항암제로 키트루다와 옵디보가 출시되어 의학 분야에서 암 치료에 이용되고 있으나, 항 PD-1 면역항암제가 효과가 있는 환자군과 효과가 없는 환자군을 사전에 구분할 수 있는 방법이 부재하여, 효과가 없는 환자군의 경우 항 PD-1 면역항암제 치료에 대한 비용과 시간을 손실하고 있는 실정이다.
따라서 본 발명은 암 환자에서 면역 치료 효과를 예측하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면 항 PD-1 면역항암제가 효과가 있는 환자군과 효과가 없는 환자군을 사전에 구분 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 암 환자에서 면역 치료 효과를 예측하는 방법, 보다 구체적으로 항 PD-1 면역항암제 치료 효과를 예측하는 방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 "면역항암제"란, 방사선, 항암제 등 암세포를 직접적으로 공격하는 치료나 약물 대신 환자의 면역력을 키워 암을 치료할 수 있도록 돕는 치료제를 말한다. 주로 면역 체크포인트 단백질(PD-1, PD-L1, CTLA-4)을 찾아 암세포의 면역회피 기능을 마비시켜 T세포(면역세포)가 암세포를 파괴하는 것을 도와주는 방식이다. 몸속의 면역체계가 암세포를 공격하는 성질을 활성화시키는 역할을 하기 때문에 다양한 암에 적용할 수 있으며 소화불량, 구토, 백혈구 감소증, 탈모 등의 부작용도 줄일 수 있다. 현재 면역 체크포인트 단백질을 막는 다양한 항체들이 임상적으로 사용되거나 임상시험중에 있으며 항 PD-1 항체는 opdivo(nivolumab), keytruda(pembrolizumab), MEDI0680, pidizilumab가 있고 항 PD-L1 항체는 tecentriq(atezolizumab), Imfinzi(duvuralumab), Bavencio(Avelumab), MDX-1105 이 있으며, 항 CTLA-4 항체는 Yervoy(ipilimumab)이 있다(Topalian et al., 2015 Cancer Cell 27:450-461; Alsaab et al.,2017 Front Pharmacol 23:561).
본 발명의 일 구체예에서 “PD-1”이란, CD279로도 명명되며, CD28/CTLA4 공동 자극/억제 수용체 패밀리(co-stimulatory/inhibitory receptor family)와 관련된 55 KD의 수용체 단백질이다(Blank et al., 2005 Cancer Immunol Immunother 54:307-314). PD-1을 코딩하는 유전자 및 cDNA를 클로닝하여 마우스 및 인간에서의 특징을 살펴본 바 있다(Ishida et al., 1992 EMBO J 11:3887-3395; Shinohara et al., 1994 Genomics 23:704-706). 전장 PD-1은 288개의 아미노산 잔기 (NCBI accession number: NP_005009)를 포함한다. 세포외 도메인은 1-167 아미노산 잔기로 구성되고, 세포질 C-말단 꼬리는 191-288 잔기를 포함하며, 이는 2개의 가설적 면역-조절 모티프인 면역수용체 티로신 기반 저해 모티프(ITIM; Vivier et al., 1997 Immunol Today 18:286-291) 및 면역수용체 티로신 스위치 모티프(ITSM; Chemnitz et al., 2004 J Immunol 173:945-954)를 포함한다. 지금까지, 2개의 서열 관련 리간드 PD-L1(B7-H1), 및 PD-L2(B7-DC)는 PD-1과 특이적으로 상호작용하여 세포 내 신호전달을 유도하고, CD3 및 CD28 매개 T-세포 활성화를 저해하는 것으로 확인되었으며(Riley, 2009 Immunol Rev 229:114-125), 결국 T-세포 활성을 조절 예를 들어, 기타 성장 인자 및 싸이토카인 분비뿐 아니라, 세포 성장, IL-2 및 IFN-γ 분비를 감소시키는 것이다.
PD-1의 발현은 T-세포, B-세포, 단핵세포 및 자연살해(NK) 세포와 같은 면역세포에서 빈번하게 확인된다. 기타 인간 조직, 예를 들어 근육, 상피, 신경 조직 등에서는 거의 발현되지 않는다. 또한, 고레벨의 PD-1 발현은 종종 면역세포의 활성과 관련이 있다. 예를 들어, 인간 T-세포주인 Jurkat이 PHA(phytohaemagglutinin) 또는 포르볼 에스테르(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate 또는 TPA)에 의해 활성화되면, 웨스턴 블랏에서 보이는 바와 같이 PD-1의 발현이 상향 조절되었다(Vibharka et al., 1997 Exp Cell Res 232:25-28). 항-CD3 항체의 자극에 의해, 자극된 마우스 T- 및 B-림프구와 1차 인간 CD4+　T 세포에서 동일한 현상이 관찰되었다(Agata et al., 1996 Int Immunol 8:765-772; Bennett et al., 2003 J Immunol 170:711-118). PD-1 발현 증가에 의해 효과 T세포를 자극하고, 활성화된 효과 T세포를 고갈 및 감소된 면역활성 방향으로 다시 안내한다. 따라서, PD-1 매개 저해 신호는 면역 관용에 중요한 역할을 한다(Bour-Jordan et al., 2011 Immunol Rev 241:180-205).
다양한 암에서 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocytes: TILs)의 PD-1 발현 및 종양 세포의 PD-1 리간드 발현 증가가 보고되었고, 다른 유형의 조직 및 기관 예를 들어 폐(Konishi et al., 2004 Clin Cancer Res 10:5094-5100), 간(Shi et al., 2008 Int J Cancer 128:887-896; Gao et al., 2009 Clin Cancer Res 15:971-979), 위(Wu et al., 2006 Acta Histochem 108:19-24), 신장(Thompson et al., 2004 Proc Natl Acad Sci 101:17174-17179; Thompson et al., 2007 Clin Cancer Res 13:1757-1761), 유방 (Ghebeh et al., 2006 Neoplasia 8:190-198), 난소(Hamanishi et al. 2007 Proc Natl Acad Sci 104:3360-3365), 췌장(Nomi et al., 2007 Clin Cancer Res 13:2151-2157), 멜라노사이트(Hino et al., 2010 Cancer 116:1757-1766), 및 식도(Ohigashi et al., 2005 Clin Cancer Res 11:2947-2953)가 포함된다. 더욱 빈번하게, 이러한 암에서 PD-1 및 PD-L1의 발현은 환자 생존 결과에 대한 좋지 못한 예후와 연관된다. PD-1 유전자를 낙아웃하여 이종이식(Xenograft) 암 세포 성장을 억제한 형질전환 마우스를 통해, 암 제거 또는 관용을 위한 면역 시스템 조절에서의 PD-1 신호전달에 대한 중요성을 더욱 자세히 설명하였다(Zhang et al., 2009 Blood 114:1545-1552).
PD-1 신호전달의 상향 조절에 의해 면역 관용의 암 증식으로 이어질 뿐 아니라, 인간의 바이러스 감염 및 확장으로도 이어진다. 유행성 간 감염 바이러스 HBV 및 HCV는 간세포에서 PD-1 리간드의 과발현을 유도하고 효과 T세포에서 PD-1 신호전달을 활성화하여, 바이러스 감염에 대한 T-세포 고갈 및 관용을 야기한다(Boni et al., 2007 J Virol 81:4215-4225; Golden-Mason et al., 2008 J Immunol 180:3637-3641). 마찬가지로, HIV 감염은 유사한 기작으로 인간 면역 시스템을 빈번하게 회피한다. 길항 분자에 의해 PD-1 신호전달을 치료적으로 조절하여 관용으로부터 면역세포를 회복할 수 있고, 재활성시켜 암 및 만성 바이러스 감염을 제거할 수 있다(Blank et al., 2005 Cancer Immunol Immunother 54:307-314; Okazaki et al., 2007 Int Immunol 19:813-824).
본 발명의 일 구체예에서, (a) 피검체의 T 세포수를 측정하는 단계; (b) 상기 피검체에게 면역항암제를 투여하는 단계; (c) 상기 피검체의 T 세포수를 1차 재측정하는 단계; (d) (a)단계에서의 측정값보다 (c)단계에서의 측정값이 증가하는 것을 확인하는 단계;를 포함하는 암 환자에 있어서 면역항암제 치료 효과를 예측하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (e) 상기 피검체의 T 세포수를 2차 재측정하는 단계;를 추가로 포함하는 방법을 제공하며, 상기 (c)단계는 (b)단계로부터 1일 내지 14일에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (f) (c)단계에서의 측정값보다 (e)단계에서의 측정값이 감소하는 것을 확인하는 단계;를 추가로 포함하는 방법을 제공하며, 상기 (e)단계는 (b)단계로부터 15일 내지 21일에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 상기의 T 세포수는 T 세포수, T 세포의 활성화 분비물, 및 T 세포 활성화도 중에서 T 세포수를 측정하는 것을 특징으로 하는 암 환자에 있어서 면역항암제 치료 효과를 예측하는 방법을 제공하고, 상기 T 세포수는 Ki-67 발현값으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하며, 상기 발현값은 유전자 발현값, 또는 단백질 발현값인 방법을 제공하며, 상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 이상일 경우에, 상기 피검체의 면역항암제 치료 효과가 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 이상일 경우에, 상기 피검체의 예후가 좋을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 미만일 경우에, 상기 피검체의 면역항암제 치료 효과가 낮을 것으로 예측하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 미만일 경우에, 상기 피검체의 예후가 나쁠 것으로 예측하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한 상기의 암은 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 선암, 및 흉선암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 암 환자에 있어서 면역항암제 치료 효과를 예측하는 방법을 제공하고, 상기 암은 폐암 또는 흉선암인 방법을 제공한다.
또한 상기의 면역항암제는 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체, 또는 항 CTLA-4 항체인, 암 환자에 있어서 면역항암제 치료 효과를 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, (a) 피검체의 T 세포수를 측정하는 단계; (b) 상기 피검체에게 후보물질을 투여하는 단계; (c) 상기 피검체의 T 세포수를 1차 재측정하는 단계; (d) (a)단계에서의 측정값보다 (c)단계에서의 측정값이 증가하는 것을 확인하는 단계;를 포함하는 암 환자에 있어서 면역항암제 후보물질의 암 치료 효과를 스크리닝하는 방법을 제공하고, 상기 (c)단계는 (b)단계로부터 1일 내지 14일에 수행하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하며, 상기 T 세포수는 Ki-67 발현값으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하며, 상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 이상일 경우에, 상기 면역항암제 후보물질을 암 치료용 물질인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 상기 암은 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 선암, 및 흉선암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 방법을 제공하며, 상기 암은 폐암 또는 흉선암인 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명은 암 환자에서 면역 치료 효과를 예측하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면 PD-1 면역항암제가 효과가 있는 환자군과 효과가 없는 환자군을 사전에 구분 가능하므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 흉선상피종양 환자에서 약물투여, 및 혈액 채취의 시간적 도식을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에서 사용한 유세포분석의 게이트 전략(gating strategies)을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 흉선상피종양 환자에서 T 세포의 항원 특이성에 근거한 anti-PD-1 치료의 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 흉선상피종양 환자에서 anti-PD-1 치료 후 PD-1+CD8+ T세포의 Ki-67+과 HLA-DR+CD38+ 빈도 변화를 나타낸 도이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 흉선상피종양 환자에서 anti-PD-1 치료 이후에 135개 파라미터들의 치료반응응 예측력을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 흉선상피종양 환자에서 환자의 치료반응에 따른 PD-1+CD8+ T세포에서 Ki-67 발현의 변화(Ki-67D7 /D0)를 나타낸 도이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 흉선상피종양 환자에서 Ki-67D7/D0 컷오프값이 2.8을 기준으로 구분한 환자들의 질병통제율, 및 질병 무진행 생존율을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 비소세포폐암 환자에서 약물투여 및 혈액 채취의 시간적 도식, 및 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 비소세포폐암 환자에서 anti-PD-1 치료 전, 치료 1주 후, 치료 3주 후 의 PD-1+CD8+ T세포에서 Ki-67+의 빈도 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, anti-PD-1 치료된 비소세포폐암 환자에서 Ki-67D7 /D0 컷오프값이 2.8을 기준으로 구분한 환자들의 질병통제율, 질병 무진행 생존율, 및 전체 생존기간을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
환자 및 샘플 수집
2016년 3월부터 2016년 6월까지 펨브롤리주맙(pembrolizumab)을 투여(200mg/ 3주)하여 효과를 평가하는 2기 임상 시험(NCT02607631)에 등록된 환자 중 적어도 1회 이상의 백금계 항암제를 이용한 항암요법을 받은 4기 흉선상피종양(thymic epithelial tumor; TET) 환자들 중 기관 검사위원회(Institutional Review Boards)에 따라 혈액 수집에 동의한 환자 31명으로부터 첫번째 펨브롤리주맙 투여 전(Day 0)과 투여 7일 후(Day 7) 말초 혈액을 채취하였다. 상기 약물투여 및 혈액 채취의 시간적 도식을 도 1에 나타내었다. 상기와 같은 방법으로, 2016년 4월부터 2017년 4월까지 펨브롤리주맙(pembrolizumab, 200mg/ 3주) 또는 니볼루맙(nivolumab, 2 mg/Kg/ 2주)을 투여받은 4기 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC) 환자 29명에게서도 혈액을 채취하였다. 이들의 자료는 TET 코호트에서 발견된 예측 마커의 검증에 사용하였다. 일부 환자에게서는 0일, 7일, 및 21일째에 혈액 수집을 실시하여 면역 반응의 변화를 모니터링하였다.
수집 혈액으로부터 Ficoll-Paque(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 밀도 구배 원심 분리법으로 말초 혈액 단핵세포(PBMCs)를 분리하였고, 실험에 사용하기 전까지 냉동 보존하였다.
종양 반응은 고체 종양의 반응 평가 기준(RECIST, 버전 1.1.)에 따라 컴퓨터 단층 촬영 또는 자기 공명 영상으로 9주마다 평가하였다. 객관적 반응은 완전 반응 또는 부분 반응으로 구분하였고, 질병통제대조군(Durable disease control)은 6 개월 이상 지속되는 부분적 또는 안정적인 암환자군으로 구분하였다.
유세포 분석
멀티칼라 유세포 분석에 사용된 형광 접합 항체 종류를 하기 표 1에 기재하였다.
항체명 비고
anti-CD8 (SK1 and RPA-T8), BD Biosciences, San Jose, CA
anti-CD3 (UCTH1 or SK7), BD Biosciences, San Jose, CA
anti-CD45RA (HI100), BD Biosciences, San Jose, CA
anti-CD4 (SK3), BD Biosciences, San Jose, CA
anti-ICOS (DX29), BD Biosciences, San Jose, CA
anti-CD25 (M-A251), BD Biosciences, San Jose, CA
anti-CD28 (CD28.2), BD Biosciences, San Jose, CA
anti-Granzyme B (GB11), BD Biosciences, San Jose, CA
anti-PD-1 (EH.12.2H7), Biolegend, San Diego, CA
anti-Ki-67 (Ki-67), Biolegend, San Diego, CA
anti-CD38 (HB7), Biolegend, San Diego, CA
anti-CTLA-4 (L3D10), Biolegend, San Diego, CA
anti-CD127 (A019D5), Biolegend, San Diego, CA
anti-GITR (108-17), Biolegend, San Diego, CA
anti-TIGIT (MBSA43), eBioscience, San Diego, CA
anti-HLA-DR (LN3), eBioscience, San Diego, CA
anti-CCR4 (D8SEE), eBioscience, San Diego, CA
amti-FoxP3 (PCH101), eBioscience, San Diego, CA
anti-CD14 (61D3), eBioscience, San Diego, CA
anti-CD19 (HIB19), eBioscience, San Diego, CA
anti-CD57 (TBO1), eBioscience, San Diego, CA
anti-CCR7 (FAB197F), R&D Systems
anti-human IgG4 Fc (HP6025), Southern Biotech
PD-1 발현 세포에 대한 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙(human IgG4) 약제의 결합이 치료 후 시료에서 PD-1 염색을 방해하기 때문에, anti-PD-1 염색과 함께 anti-human IgG4 Fc 염색을 수행하였다. 생존/사멸(Live/dead) 세포 식별은 적색-형광 반응성 염료(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하였고, Ki-67, granzyme B, FoxP3, 및 CTLA-4에 대한 세포내 염색은 FoxP3 전사 인자 염색 완충액 키트(eBioscience)를 사용하였다. 종양 항원에 특이적인 CD8 T 세포는 PE-conjugated MHC I dextramer NY-ESO-1157-165(SLLMWITQV/HLA-A*0201, Immudex, Copenhagen, Denmark)를 를 사용하여 검출하였고, HCMV에 특이적인 CD8 T 세포는 PE-conjugated MHC I pentamer HCMV pp65 495-504(NLVPMVATV/HLA-A*0201, Proimmune, Oxford, UK)를 사용하여 검출하였다. 모든 유세포분석은 LSR II 유동 세포 계측기(BD Biosciences)로 수행하였고, FlowJo 소프트웨어(Treestar, San Carlos, CA)로 데이터 분석하였다. 본 발명에서 사용한 유세포분석의 게이트 전략(gating strategies)을 도 2에 나타내었다. 구체적으로, (A)는 PD-1+ CD8 T 세포, (B)는 multimer-positive CD8 T 세포의 게이팅 전략을 나타낸다.
통계 처리
마커의 발현량 변화는 7일 시료의 양성 세포 빈도를 0일 시료의 빈도를 기준으로 환산하여 분석하였다. 범주형 변수는 chi-square test, 또는 Fisher's exact test를 사용하여 비교하였다. 정규 분포 연속 변수의 경우에는 Student's t-test와 paired t-test를 사용하여, 정규 분포가 아닌 경우에는 Mann-Whitney U-test와 Wilcoxon signed-rank 검정을 사용하여 쌍을 이루지 않은 값과 쌍을 이루는 값을 각각 비교하였다. 2개 이상의 그룹을 비교할 때에는 One-way analysis of variance(ANOVA) 분석을 사용하였고, 데이터가 비정상적으로 분포되었을 때에는 Kruskal-Wallis test를 이용하였다. 두 매개 변수 사이의 상관 관계는 Pearson 상관 계수를 사용하여 평가하였다. 바이오 마커의 효용성을 평가하기 위해서는 receiver operating characteristic curve (ROC)로부터 area under curve(AUC)를 평가하였고, Youden 지수가 최대화된 지점에서 최적의 cutoff point를 추출하였다. 생존 곡선은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생성하였고, 비교는 log-rank test로 수행 하였으며, 생존율과 관련하여 발견된 바이오 마커의 독립적인 중요성을 평가하기 위해 나이, 성별, 조직학적 데이터, 이전 화학 요법 병력, 및 전이 부위 수를 조정한 다변수 cox 회귀 분석을 수행하였다. 모든 통계 분석에서 0.05 미만의 양면 P 값을 통계적으로 유의하다고 간주하였고, Prism software version 6.0(GraphPad, La Jolla, CA), 및 R statistical software(version 3.2.2, The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)를 이용하여 분석하였다.
환자의 임상적 특징 분석
TET 환자의 임상 병리학적 특징과 NSCLC 환자의 임상 병리학적 특징을 각각 표 2와 표 3에 나타내었다.
Characteristic Discovery cohort (n = 31)
Age, median (range), yrs 58 (26-78)
Sex, n (%)
Male 20 (64.5)
Female 11 (35.5)
Histology, n (%)
Thymoma 6 (19.4)
Thymic carcinoma 25 (80.6)
Prior chemotherapy line, median (range) 2 (1-5)
Tumor burden, median (range), cm 12.4 (1.7-27.0)
Study drug, n (%)
Pembrolizumab 31 (100.0)
Nivolumab 0 (0)
Best overall response, n (%)
Complete response 0 (0)
Partial response 6 (19.4)
Stable disease 18 (58.1)
Progressive disease 7 (22.6)
Characteristic Validation cohort (n = 29)
Age, median (range), yrs 65 (35-82)
Sex, n (%)
Male 21 (72.4)
Female 8 (27.6)
Histology, n (%)
Adenocarcinoma 15 (51.7)
Squamous cell carcinoma 10 (34.5)
Others 4 (13.8)
Prior chemotherapy, median (range) 3 (1-9)
Tumor burden, median (range), cm 7.5 (2.0-15.7)
Study drug, n (%)
Pembrolizumab 13 (44.8)
Nivolumab 16 (55.2)
Best overall response, n (%)
Complete response 1 (3.4)
Partial response 7 (24.2)
Stable disease 8 (27.6)
Progressive disease 13 (44.8)
TET 환자들에게 펨브롤리주맙 중앙값 8 주기(range, 1-22 주기) 치료를 수행하였다. 그 중 6명의 환자들이 객관적인 종양 반응을 나타내었고, 질병통제대조군은 11명의 환자로 구성되었다. NSCLC 환자를 대상으로 한 검증 코호트에서 펨브롤리주맙을 투여받은 환자는 13명이었고, 니볼루맙을 투여받은 환자는 16명이었다. 그 중 8명의 환자들이 객관적인 종양 반응을 나타내었고, 10명의 환자들이 질병통제대조군으로 나타내었다. 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙 투여 주기의 중간값은 4 주기(1-32 주기)였다.
TET 환자에서 anti-PD-1 치료 후 말초 CD8 T세포의 반응 확인
약물 투여 0일, 및 7일째에 채혈된 말초 혈액에서 CD8 T세포의 T세포 활성화(CD38, HLA-DR) 및 증식(Ki-67) 정도를 표현형 마커로 확인하였다. 여섯명의 비소세포폐암 환자로 부터 얻은 선행결과상 7일째 PD-1+CD8+ T세포에서 Ki-67+ 빈도의 증가가 보였으나 21일째에는 유의하게 감소하는 것을 확인하였고, 이를 도 9에 나타내었다. 그래서 치료 전과 치료 7일째의 검체를 분석하였다. 먼저, 항원 특이성에 근거한 anti-PD-1 치료의 효과를 도 3에 나타내었다. NY-ESO-1 mRNA가 상향 조절된 환자와 잠재적인 HCMV 감염이 있는 환자를 평가하였다. 평가 결과, 약물 투여 7 일째 종양 특이적 NY-ESO-1+CD8+ T세포는 Ki-67+과 HLA-DR+CD38+ 빈도의 유의한 증가를 보였으나, 종양 특이성이 없는 HCMV-specific pp65+CD8+ T세포는 최소 증가를 보였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. Ki-67+과 HLA-DR+CD38+ 빈도의 증가는 PD-1+CD8+ T세포에서도 관찰되었고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 결과로부터 anti-PD-1 치료가 PD-1+CD8+ T세포를 활성화시키고, 이러한 현상이 약물 투여 후 시간이 지남에 따라 증가 후 감소한다는 것을 알 수 있었다.
PD-1 + CD8 + T세포의 초기 증식 반응으로 TET 환자에서 anti-PD-1 치료에 대한 종양 반응과 예후를 예측 가능하다.
약물 투여 후 치료 반응을 예측 가능한 바이오 마커를 발굴하기 위해서, PD-1+CD8+ T세포, CD8+ T세포, 및 CD4+ T세포의 빈도 및 표현형 표지자를 포함하여 멀티칼라 유세포 분석으로부터 도출된 135개 파라미터를 통합 분석하였다. 상기 상세 분석값을 표 4에 나타내었다.
Time point Parameter log2ratio AUC P Time point Parameter log2ratio AUC P
Day 0 CD3+ / lymphocyte -0.0821 0.545 0.680 Day 0 Treg (CD25hiCD127loFoxP3+) / CD4+ -0.2853 0.700 0.069
Day 7 CD3+ / lymphocyte -0.1880 0.575 0.496 Day 7 Treg / CD4+ -0.6635 0.764 0.017
Fold change CD3+ / lymphocyte -0.0431 0.591 0.408 Fold change Treg / CD4+ 0.0529 0.559 0.591
Day 0 CD8+ / CD3+ -0.2217 0.698 0.072 Day 0 Fr.I Treg (FoxP3loCD45RA+) / CD4+ -0.4381 0.664 0.137
Day 7 CD8+ / CD3+ -0.2372 0.650 0.173 Day 7 Fr.I Treg / CD4+ -0.8074 0.627 0.247
Fold change CD8+ / CD3+ 0.0560 0.548 0.664 Fold change Fr.I Treg / CD4+ 0.1459 0.514 0.901
Day 0 CD4+ / CD3+ 0.1834 0.668 0.127 Day 0 Fr.II Treg (FoxP3hiCD45RA-) / CD4+ -0.9687 0.705 0.063
Day 7 CD4+ / CD3+ 0.1069 0.691 0.083 Day 7 Fr.II Treg / CD4+ -0.7892 0.743 0.027
Fold change CD4+ / CD3+ -0.0589 0.530 0.788 Fold change Fr.II Treg / CD4+ 0.0703 0.511 0.918
Day 0 CD8+ / CD4+ -0.4021 0.693 0.079 Day 0 Fr.III Treg (FoxP3loCD45RA-) / CD4+ -0.0411 0.611 0.312
Day 7 CD8+ / CD4+ -0.3626 0.666 0.132 Day 7 Fr.III Treg / CD4+ -0.1913 0.695 0.076
Fold change CD8+ / CD4+ 0.0555 0.523 0.836 Fold change Fr.III Treg / CD4+ -0.2361 0.607 0.332
Day 0 Naive (CCR7+CD45RA+) / CD8+ -0.1616 0.523 0.836 Day 0 Ki-67+ / Treg -0.4407 0.650 0.173
Day 7 Naive (CCR7+CD45RA+) / CD8+ 0.0863 0.559 0.591 Day 7 Ki-67+ / Treg 0.0000 0.564 0.563
Fold change Naive (CCR7+CD45RA+) / CD8+ -0.1298 0.518 0.869 Fold change Ki-67+ / Treg 0.4639 0.677 0.107
Day 0 Central memory (CCR7+CD45RA-) / CD8+ -0.0794 0.582 0.457 Day 0 CCR4+ / Treg -0.8524 0.664 0.137
Day 7 Central memory (CCR7+CD45RA-) / CD8+ 0.0589 0.532 0.773 Day 7 CCR4+ / Treg -0.6169 0.691 0.083
Fold change Central memory (CCR7+CD45RA-) / CD8+ 0.2031 0.527 0.804 Fold change CCR4+ / Treg -0.2810 0.618 0.283
Day 0 Effector memory (CCR7-CD45RA-) / CD8+ -0.3510 0.550 0.650 Day 0 CTLA-4+ / Treg 0.0638 0.575 0.496
Day 7 Effector memory (CCR7-CD45RA-) / CD8+ -0.4528 0.559 0.591 Day 7 CTLA-4+ / Treg -0.0235 0.614 0.302
Fold change Effector memory (CCR7-CD45RA-) / CD8+ -0.0426 0.505 0.967 Fold change CTLA-4+ / Treg -0.0388 0.500 1.000
Day 0 Effector memory RA (CCR7-CD45RA+) / CD8+ 0.4683 0.595 0.386 Day 0 ICOS+ / Treg -0.3842 0.664 0.137
Day 7 Effector memory RA (CCR7-CD45RA+) / CD8+ 0.4911 0.595 0.386 Day 7 ICOS+ / Treg -0.5940 0.686 0.091
Fold change Effector memory RA (CCR7-CD45RA+) / CD8+ 0.0589 0.564 0.563 Fold change ICOS+ / Treg 0.0731 0.527 0.804
Day 0 PD-1+ / CD8+ -0.2510 0.593 0.397 Day 0 PD-1+ / Treg 0.1712 0.518 0.869
Day 7 PD-1+ / CD8+ -0.1152 0.564 0.563 Day 7 PD-1+ / Treg 0.5267 0.636 0.215
Fold change PD-1+ / CD8+ 0.2065 0.591 0.409 Fold change PD-1+ / Treg 0.2996 0.607 0.331
Day 0 TIGIT+ / CD8+ 0.2817 0.523 0.836 Day 0 TIGIT+ / Treg -0.3268 0.595 0.386
Day 7 TIGIT+ / CD8+ -0.2226 0.509 0.934 Day 7 TIGIT+ / Treg -0.2409 0.686 0.090
Fold change TIGIT+ / CD8+ -0.1333 0.607 0.331 Fold change TIGIT+ / Treg -0.0759 0.525 0.820
Day 0 PD-1+TIGIT+ / CD8+ -0.8299 0.568 0.536 Day 0 Ki-67+ / Fr. II Treg -0.0636 0.536 0.741
Day 7 PD-1+TIGIT+ / CD8+ -0.6407 0.564 0.563 Day 7 Ki-67+ / Fr. II Treg 0.4462 0.727 0.039
Fold change PD-1+TIGIT+ / CD8+ 0.2630 0.507 0.951 Fold change Ki-67+ / Fr. II Treg 0.6301 0.732 0.035
Day 0 HLA-DR+CD38+ / CD8+ 0.3700 0.677 0.107 Day 0 CCR4+ / Fr. II Treg -0.6595 0.623 0.265
Day 7 HLA-DR+CD38+ / CD8+ 0.5356 0.595 0.386 Day 7 CCR4+ / Fr. II Treg -0.3735 0.677 0.107
Fold change HLA-DR+CD38+ / CD8+ -0.1349 0.659 0.148 Fold change CCR4+ / Fr. II Treg -0.2397 0.630 0.239
Day 0 Granzyme B+ / CD8+ 0.2639 0.677 0.107 Day 0 CTLA-4+ / Fr. II Treg -0.0724 0.614 0.302
Day 7 Granzyme B+ / CD8+ 0.2293 0.648 0.180 Day 7 CTLA-4+ / Fr. II Treg -0.0275 0.502 0.984
Fold change Granzyme B+ / CD8+ -0.0270 0.600 0.363 Fold change CTLA-4+ / Fr. II Treg 0.0976 0.670 0.121
Day 0 Ki-67+ / CD8+ -0.2722 0.518 0.869 Day 0 ICOS+ / Fr. II Treg 0.2493 0.557 0.606
Day 7 Ki-67+ / CD8+ 0.0950 0.514 0.901 Day 7 ICOS+ / Fr. II Treg -0.0883 0.564 0.563
Fold change Ki-67+ / CD8+ -0.2188 0.605 0.342 Fold change ICOS+ / Fr. II Treg 0.2717 0.557 0.606
Day 0 CD28- / CD8+ 0.3715 0.664 0.137 Day 0 PD-1+ / Fr. II Treg 0.0756 0.509 0.934
Day 7 CD28- / CD8+ 0.1860 0.650 0.173 Day 7 PD-1+ / Fr. II Treg 0.2174 0.577 0.483
Fold change CD28- / CD8+ 0.0277 0.584 0.444 Fold change PD-1+ / Fr. II Treg 0.7370 0.634 0.222
Day 0 CD57+ / CD8+ 0.5014 0.757 0.020 Day 0 TIGIT+ / Fr. II Treg -0.0702 0.573 0.509
Day 7 CD57+ / CD8+ 0.5684 0.755 0.021 Day 7 TIGIT+ / Fr. II Treg -0.1026 0.627 0.248
Fold change CD57+ / CD8+ 0.0000 0.520 0.852 Fold change TIGIT+ / Fr. II Treg 0.0135 0.525 0.820
Day 0 CD28-CD57+ / CD8+ 0.4929 0.627 0.248 Day 0 Ki-67+ / Fr. III Treg -0.0081 0.518 0.869
Day 7 CD28-CD57+ / CD8+ 0.5470 0.682 0.099 Day 7 Ki-67+ / Fr. III Treg 0.7903 0.623 0.265
Fold change CD28-CD57+ / CD8+ 0.0566 0.555 0.620 Fold change Ki-67+ / Fr. III Treg 0.6147 0.627 0.248
Day 0 HLA-DR+CD38+ / PD-1+CD8+ -0.4546 0.700 0.069 Day 0 CCR4+ / Fr. III Treg -0.4385 0.614 0.302
Day 7 HLA-DR+CD38+ / PD-1+CD8+ 0.3711 0.514 0.901 Day 7 CCR4+ / Fr. III Treg -0.9978 0.659 0.148
Fold change HLA-DR+CD38+ / PD-1+CD8+ 0.8060 0.727 0.039 Fold change CCR4+ / Fr. III Treg -0.3426 0.652 0.166
Day 0 Granzyme B+ / PD-1+CD8+ -0.1890 0.577 0.483 Day 0 CTLA-4+ / Fr. III Treg 0.1780 0.627 0.248
Day 7 Granzyme B+ / PD-1+CD8+ -0.1106 0.566 0.549 Day 7 CTLA-4+ / Fr. III Treg 0.0604 0.570 0.522
Fold change Granzyme B+ / PD-1+CD8+ 0.0406 0.514 0.901 Fold change CTLA-4+ / Fr. III Treg -0.0132 0.509 0.934
Day 0 Ki-67+ / PD-1+CD8+ -1.0305 0.791 0.008 Day 0 ICOS+ / Fr. III Treg -0.0509 0.527 0.804
Day 7 Ki-67+ / PD-1+CD8+ 0.2975 0.536 0.741 Day 7 ICOS+ / Fr. III Treg -0.6131 0.661 0.143
Fold change Ki-67+ / PD-1+CD8+ 1.0158 0.859 0.001 Fold change ICOS+ / Fr. III Treg -0.3117 0.573 0.509
Day 0 CD28- / PD-1+CD8+ -0.1944 0.536 0.741 Day 0 PD-1+ / Fr. III Treg 0.1841 0.511 0.918
Day 7 CD28- / PD-1+CD8+ -0.2530 0.573 0.509 Day 7 PD-1+ / Fr. III Treg -0.1886 0.532 0.773
Fold change CD28- / PD-1+CD8+ -0.1255 0.516 0.885 Fold change PD-1+ / Fr. III Treg -0.0780 0.527 0.804
Day 0 CD57+ / PD-1+CD8+ -0.1578 0.648 0.180 Day 0 TIGIT+ / Fr. III Treg -0.1227 0.514 0.901
Day 7 CD57+ / PD-1+CD8+ -0.3650 0.664 0.137 Day 7 TIGIT+ / Fr. III Treg -0.1896 0.648 0.180
Fold change CD57+ / PD-1+CD8+ -0.1178 0.666 0.131 Fold change TIGIT+ / Fr. III Treg -0.0399 0.566 0.549
Day 0 CD28-CD57+ / PD-1+CD8+ -0.1275 0.582 0.457
Day 7 CD28-CD57+ / PD-1+CD8+ -0.3139 0.584 0.445
Fold change CD28-CD57+ / PD-1+CD8+ -0.2572 0.573 0.508
0일과 7일째의 측정값뿐만 아니라, anti-PD-1 치료 이후에 디자인된 파라미터들의 변화까지도 평가하였다. 6개월 이상 질병통제된 종양 환자(n=11)와 6개월 미만으로 질병통제된 종양 환자(n=20)를 비교하였고, 화산 도표(Volcano plot)는 반응자와 비반응자 사이의 log2 비율로 나타내었다. x축은 135개 파라미터의 log2 비율, y축은 p값(Mann-Whitney U-test)을 나타낸다. 상기 결과를 도 5와 표 4에 나타내었다.
분석 결과, 소수의 파라미터만이 질병통제 되거나 되지 않은 환자간에 차이를 나타내었는데, PD-1+CD8+ T세포에서 Ki-67 발현의 변화(Ki-67D7 /D0)가 파라미터들 중에서 가장 큰 변화가 있었다(P <0.05). 또한 Ki-67D7 / D0 는 질병통제대조군에서도 가장 높은 예측 정확성을 보였고(AUC = 0.86, 95% CI 0.71-1.00, P = 0.001), 특히 안정된 질병상태(stable disease; SD), 또는 진행성 질병상태(progressive disease; PD)에 비해서 부분 반응(partial response; PR)을 보이는 환자군에서 더 측정값이 높게 나타났다. 상기 결과를 도 6에 나타내었다.
ROC 곡선으로부터 2.8을 최적 컷오프값으로 결정하였고, 상기 컷오프값에 따라 환자를 이분화하였다. 질병통제대조군에서의 감도, 특이도, 음성 예측도(NPV), 및 양성 예측도(PPV)는 각각 90.9%, 75.0%, 93.8%, 및 66.7%로 나타났다. 높은 민감도와 음성 예측도는 Ki-67D7 / D0 가 anti-PD-1 치료로 효과를 얻지 못할 것으로 예상되는 환자를 정확하게 예측할 수 있다는 것을 의미한다. Ki-67D7 /D0 컷오프값이 2.8 미만인 환자들은 질병통제율(durable disease control rates)이 낮은 것으로 나타났다. 또한 이 환자들은 질병 무진행 생존율 (progression-free survival; PFS)이 매우 낮은 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다. 또한 다양한 임상병리학적 요인들을 반영하여 조정한 다변수 분석에서도 Ki-67D7 / D0 가 질병 무진행 생존율의 독립적으로 유의미한 요소인 것을 확인하였다(adjusted hazard ratio; aHR 0.20, 95% confidence interval; CI 0.07-0.56, P=0.002). 이를 하기 표 5에 나타내었다.
Univariate Multivariate
Variable Category HR 95% CI P aHR 95% CI P
Ki - 67 D7 /D0 < 2.8 1.00 0.030 1.00 0.002
≥2.8 0.40 0.17-0.91 0.20 0.07-0.56
Age < 60 yrs 1.00 0.457 1.00 0.028
≥60 yrs 1.34 0.62-2.92 2.95 1.12-7.78
Sex Male 1.00 0.086 1.00 0.011
Female 2.03 0.90-4.56 3.30 1.31-8.28
Histology Thymoma 1.00 0.986 1.00 0.607
Thymic ca. 0.99 0.37-2.65 1.32 0.46-3.73
Prior chemotherapy < 3rd line 1.00 0.098 1.00 0.876
≥3rd line 2.00 0.88-4.54 0.93 0.40-2.20
Tumor burden < 12.5 cm 1.00 0.926 1.00 0.118
≥12.5 cm 1.04 0.48-2.25 2.13 0.83-5.47
anti-PD-1 치료 후 PD-1 + CD8 T세포에서 Ki -67 발현 변화는 비소세포폐암 환자의 종양 반응 및 예후와 관련이 있다.
예측 바이오 마커로서 Ki-67D7 / D0 의 가치를 검증하기 위해, anti-PD-1 치료된 비소세포폐암 환자의 독립적 검증 코호트를 사용하였다. 그 모식도 및 결과를 도 8에 나타내었다. 실험 결과, TET 환자와 유사하게, PD-1-CD8+ T세포와 비교하여 PD-1+CD8+ T세포에서 Ki-67 발현이 더 크게 증가하였고, Ki-67D7 / D0 는 진행성 질병상태(progressive disease; PD) 환자보다 부분 반응(partial response; PR)을 보이는 환자군에서 더 측정값이 높게 나타났다. 이 코호트 조사에서, 컷오프값 2.8을 기준으로 암의 진행이 없는 질병통제대조군의 감도, 특이도, 음성 예측도(NPV), 및 양성 예측도(PPV)는 각각 80.0%, 73.7%, 87.5%, 및 61.5%로 나타났다. 구체적으로, Ki-67D7/D0 ≥2.8인 환자의 경우 질병통제율이 현저히 낮게 나타났고, 질병 무진행 생존율(PFS)과 전체 생존율(OS)이 유의하게 높았다. 상기 결과를 도 10에 나타내었다. 또한 다양한 임상병리학적 요인들을 반영하여 조정한 다변수 분석에서도 Ki-67D7 / D0 가 질병 무진행 생존율(aHR 0.14, 95% CI 0.04-0.46, P = 0.001), 및 전체 생존율(aHR 0.14, 95% CI 0.03-0.63, P = 0.010)의 독립적인 상관 관계를 확인하였다(표 6, 표 7 참조).
Univariate Multivariate
Variable Category HR 95% CI P aHR 95% CI P
Ki - 67 D7 /D0 < 2.8 1.00 0.013 1.00 0.001
≥2.8 0.19 0.05-0.70 0.14 0.04-0.46
Age < 60 yrs 1.00 0.236 1.00 0.853
≥60 yrs 0.45 0.12-1.69 1.12 0.32-5.66
Sex Male 1.00 0.444 1.00 0.642
Female 0.59 0.15-2.30 1.31 0.42-4.03
Histology Adenocarcinoma 1.00 0.388 1.00 0.514
Squamous cell ca. 0.31 0.05-1.72 1.09 0.34-3.52
Other 0.85 0.15-4.76 2.45 0.53-11.38
Prior chemotherapy < 3rd line 1.00 0.070 1.00 0.095
≥3rd line 4.31 0.89-20.94 3.01 0.83-10.95
Tumor burden < 7.5 cm 1.00 0.579 1.00 0.891
≥7.5 cm 1.28 0.54-3.04 1.08 0.36-3.22
Anti-PD-1 agent Nivolumab 1.00 0.805 1.00 0.722
Pembrolizumab 0.90 0.38-2.13 0.83 0.30-2.30
Univariate Multivariate
Variable Category HR 95% CI P-value aHR 95% CI P-value
Ki - 67 D7 /D0 < 2.8 1.00 0.015 1.00 0.010
≥2.8 0.24 0.08-0.76 0.14 0.03-0.63
Age < 60 yrs 1.00 0.460 1.00 0.794
≥60 yrs 0.67 0.23-1.94 1.20 0.30-4.87
Sex Male 1.00 0.428 1.00 0.654
Female 0.65 0.23-1.88 0.75 0.21-2.69
Histology Adenocarcinoma 1.00 0.750 1.00 0.559
Squamous cell ca. 0.67 0.22-2.03 0.53 0.12-2.37
Other 0.70 0.15-3.28 1.59 0.26-9.83
Prior chemotherapy < 3rd line 1.00 0.123 1.00 0.099
≥3rd line 2.27 0.80-6.41 3.42 0.79-14.72
Tumor burden < 7.5 cm 1.00 0.250 1.00 0.532
≥7.5 cm 1.81 0.66-5.00 1.48 0.43-5.04
Anti-PD-1 agent Nivolumab 1.00 0.618 1.00 0.833
Pembrolizumab 0.77 0.28-2.13 0.88 0.27-2.87
상기 실시예 및 결과로부터, anti-PD-1 치료 후에 PD-1+ CD8+ T세포의 초기 증식 반응으로부터 anti-PD-1에 대한 치료 효과가 없을 것으로 예상되는 음성 예측도(NPV) 고위 환자군을 예측하여 선별할 수 있음을 알 수 있었다. 이는 PD-1 면역항암제가 효과가 있는 환자군이 PD-1 면역항암제 치료를 받는 동안에 감수해야 하는 경제적, 시간적 손실을 사전에 방지할 수 있으므로, 의학 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Claims (21)

  1. (a) 피검체의 T 세포수를 측정하는 단계;
    (b) 상기 피검체에게 면역항암제를 투여하는 단계;
    (c) 상기 피검체의 T 세포수를 1차 재측정하는 단계;
    (d) (a)단계에서의 측정값보다 (c)단계에서의 측정값이 증가하는 것을 확인하는 단계;를 포함하는, 암 환자에 있어서 면역항암제 치료 효과를 예측하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 (e) 상기 피검체의 T 세포수를 2차 재측정하는 단계;를 추가로 포함하는, 방법
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (c)단계는 (b)단계로부터 1일 내지 14일에 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 방법은 (f) (c)단계에서의 측정값보다 (e)단계에서의 측정값이 감소하는 것을 확인하는 단계;를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 (e)단계는 (b)단계로부터 15일 내지 21일에 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 T 세포수는 T 세포수, T 세포의 활성화 분비물, 및 T 세포 활성화도 중에서 T 세포수를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 T 세포수는 Ki-67 발현값으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 발현값은 유전자 발현값, 또는 단백질 발현값인, 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 이상일 경우에, 상기 피검체의 면역항암제 치료 효과가 높을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제 7항에 있어서,
    상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 이상일 경우에, 상기 피검체의 예후가 좋을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제 7항에 있어서,
    상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 미만일 경우에, 상기 피검체의 면역항암제 치료 효과가 낮을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제 7항에 있어서,
    상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 미만일 경우에, 상기 피검체의 예후가 나쁠 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 선암, 및 흉선암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 암은 폐암 또는 흉선암인, 방법.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 면역항암제는 항 PD-1 항체, 항 PD-L1 항체, 또는 항 CTLA-4 항체인, 방법.
  16. (a) 피검체의 T 세포수를 측정하는 단계;
    (b) 상기 피검체에게 면역항암제 후보물질을 투여하는 단계;
    (c) 상기 피검체의 T 세포수를 1차 재측정하는 단계;
    (d) (a)단계에서의 측정값보다 (c)단계에서의 측정값이 증가하는 것을 확인하는 단계;를 포함하는, 암 환자에 있어서 면역항암제 후보물질의 암 치료 효과를 스크리닝하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 (c)단계는 (b)단계로부터 1일 내지 14일에 수행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 T 세포수는 Ki-67 발현값으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 (c)단계의 측정값이 (a)단계의 측정값보다 2.8배 이상일 경우에, 상기 면역항암제 후보물질을 효과적인 면역항암제로 판단하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제 16항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 선암, 및 흉선암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 암은 폐암 또는 흉선암인, 방법.
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