KR20190092383A - 압타머 코팅된 마이크로니들 기반 진단용 피부 패치 제조방법 및 그 패치 - Google Patents

압타머 코팅된 마이크로니들 기반 진단용 피부 패치 제조방법 및 그 패치 Download PDF

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KR20190092383A
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Abstract

본 발명은 압타머 코팅된 마이크로니들 기반 진단용 피부 패치 제조방법 및 그 방법에 의하여 제조된 패치에 관한 것으로, 본 발명의 패치는 항체 물질에 비하여 물질의 사이즈가 훨씬 작고 상대적으로 많은 수의 마이크로니들 팁 표면에 많은 수의 압타머를 결합시킬 수 있다는 장점이 있다. 또한 여러 종류의 바이오 마커에 대한 압타머를 한꺼번에 붙일 수 있으므로 동시에 여러 종류의 물질을 검출할 수 있어서(Multiplexing), 마이크로니들 팁 기반 스킨패치도 압타머를 이용한 단백질 칩으로 사용할 수 있다.

Description

압타머 코팅된 마이크로니들 기반 진단용 피부 패치 제조방법 및 그 패치
본 발명은 압타머 코팅된 마이크로니들 기반 진단용 피부 패치 제조방법 및 그 방법에 의하여 제조된 패치에 관한 것이다.
피부 질환은 오늘날 세계에서 주요 건강 관리 도전을 대표한다. 미국(국립암연구소, www.cancer.gov)에서 해마다 새로이 진단되는 백만 건 이상의 피부암과 더불어, 피부 질환을 예측 및 진단하는 것은 그것의 관리 측면에서 중요하다. 현재의 진단 방법은 시각적인 관찰 및 생검에 주로 의존한다. 그러나, 시각적인 관찰에 의존하는 검출 방법은 피부 상태 또는 질환을 진단하는데 반드시 효과적인 것은 아니며, 임상적인 징후가 나타날 때까지 는 위험(risk) 또는 질환을 검출하지 못한다. 게다가, 생검과 같은 침습성 방법은 시험 대상에 대한 외상뿐만 아니라, 감염의 가능성도 증가시킨다. 또한 상기 방법은 안전하게 실시되기 위해서 의사에 의해 수행되어야 하며, 일반적으로 반응에 관여하는 세포인 피부 표면에 있는 풍부한 세포 샘플을 보통 제공하지 않는다.
따라서 피부 상태 및 질환을 진단 및 모니터링하는 비침습성 방법은 환자의 관리를 위한, 그리고 기존 및 새로운 치료제, 피부 관리 제품 및 피부 관리 섭생의 효능을 평가하기 위한 중요한 수단을 나타낸다. 게다가, 상기방법은 피부 질환의 발생에 대한 시험 대상의 유전적 소인뿐만 아니라, 시험 대상의 피부 상태를 기초로 하는 특이적인 유전적 변화에 관하여 중요한 정보를 제공할 수 있다. 상기 유전적 변화를 동정하는 것은 잠재적인 약물 타겟 및 예방적 조치를 동정하고 특정 치료제, 피부 관리 제품 또는 섭생에 대해 사람이 실제적으로 반응을 하는지를 결정하는데 중요할 수 있다. 뿐만 아니라, 검출 및 진단 방법은 그러한 치료, 제품 및 조치의 안전성을 평가하는데 중요하다.
또한, 국소적인 피부질환은 물론 다양한 질병상태에서 피부의 물질의 조성이 바뀌는 것이 보고되고 있다. 지질, 구조단백질, 염증성물질, 핵산, 대사산물 등 여러물질이 질병상태에 따라 피부에서 다양하게 검출되는 것으로 알려져있다. 현재 아토피성 피부염, 흑색종, 피부의 세균성 염증 외에도 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 유방암, 심혈관계 질환, 당뇨병, 약물 중독등의 다양한 질환에서 피부의 바이오마커 분석이 이루어지고 있다. 그러나, 대부분의 경우 대단히 침습적인 피부생검(Skin Biopsy)이 사용되고 있다. 비침습적 방법으로 Iontophoresis, Microdialysis, Tape stripping, Ultrasound, Microneedle등이 사용되고 있으나, 매우 효율은 낮은 편이다 (Paliwal et al., 2013 Diagnostic opportunities based on skin biomarkers. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences 50:546-556).
대한민국 특허공개번호 제1020120006945호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 다양한 질환의 진단에 이용하기 위한 패치 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다양한 질환의 진단에 이용하기 위한 패치를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 폴리카보네이트(polycarbonate) 마이크로니들을 타이타늄과 골드(gold)로 차례로 코팅하여 코팅된 폴리카보네이트(polycarbonate) 마이크로니들을 제조하고, 티올(thiol) 기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합된 압타머를 제조하여, 상기 타이타늄과 금이 코팅된 폴리카보네이트(polycarbonate) 마이크로니들과 상기 티올(thiol) 기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합된 압타머를 결합시키는 단계를 포함하는 압타머가 코팅된 마이크로니들 기반 피부 진단 패치 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 코팅된 금의 두께는 10 내지 40nm인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 a) 압타머에 아민기를 결합시키는 단계;b) 마이크로니들 팁 표면을 프라즈마 산화(plasma oxidation)로 실라놀(silanol)을 붙인 후, 그 하이드록실(hydroxyl)기에 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (3-GPTMS)으로 실란처리(silanizing)한 후, 상기 3-GPTMS에 포함된 에폭시(epoxy)기에 상기 압타머에 결합된 아민기를 결합시키는 단계를 포함하는 압타머가 코팅된 마이크로니들 기반 피부 진단 패치 제조방법을 제공한다.
또 본 발명은 폴리카보네이트(Polycarbonate) 마이크로니들 표면에 HNO3를 처리한 후 NaBH4로 환원시켜서 최종적으로 아민기를 결합시킨 후 한쪽 끝에 카르복실기를 다른 한쪽 끝에 압타머와 결합하고 있는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 NHS(N-Hydroxysuccinimide), 및 EDC[1-ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimide]를 촉매로 사용하여 결합시키는 단계를 포함하는 압타머가 코팅된 마이크로니들 기반 피부 진단 패치 제조방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 제조된 압타머가 코팅된 마이크로니들 기반 피부 진단 패치를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 피부 진단 패치는 마이크로니들 팁 표면에 압타머가 부착되고 상기 압타머의 말단에는 진단 가능한 성분이 부착될 수 있는 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 아니한다. 상기 진단 가능한 성분은 단백질, 펩타이드, DNA 또는 RNA인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 피부의 각질층 (stratum corneum) 을 침투하여 표피증에 이를 수 있는 길이 약 200 um의 microneedle 표면을 압타머로 코팅하여 피부내 세포간질에 존재하는 다양한 바이오마커를 효과적으로 검출할 수 있게 한 진단용 스킨패치이다.
피부내 세포간질에 포함되어 포집이 가능한 바이오마커의 종류는 각종 감염성 진환에서 감염균 자체나 감염균이 분비하는 물질로, 예를 들면, 말라리아의 경우, 말라리아 균 자체나 균이 배출하는 단백질 등이고, 대표적인 단백질이 PfHRP2이며, 각종 바이러스의 경우 그 바이러스 자체를 검출할 수 있으며, 또한, 각종 퇴행성 뇌질환의 경우, 예를 들어, Tau 단백질은 파킨슨씨 혹은 알츠하이머씨 병에서 증가되어 마커로 사용할 수 있으며, Alpha-synuclein도 파킨슨씨 병의 중요한 진단 마커로 사용될 수 있고, Alymoid beta도 알츠하이머씨 병의 진단 마커로 사용될 수 있고, 또한 각종 암표지자도 포집가능한 바이오마커로 사용될 수 있다.
본 발명의 압타머가 코팅된 마이크로니들 제작과 관련하여서는 Brain-machine interfaces (BMIs)나 피부를 통한 효과적인 약물의 delivery를 위해 그간 여러 종류의 microneedle이 개발되었고 실제 두피를 통한 뇌파의 측정등에 테스트 되었다.
한 예로 2011년에 발표된 Ami, Y et al, J of Micro/Nanolithography, MEMS, and MOEMS. 10 (1), 011503, March 2011 논문을 참고하면Polydimethylsiloxane (PDMS)를 재료로 두께 50 um x 길이 200 um로 끝이 뾰족한 스킨침투용 마이크로니들을 성공적으로 개발한 것을 볼 수 있다.(도 1).
그외 다양한 소재와 길이의 마이크로니들 (microneedle 혹은 microprojection array) 이 제작되고 있다. 마이크로니들의 소재로 쓰이는 화학물질의 종류는 다음과 같다. Polyurethane (PU), Polypropylene (PP), Polyethylene (PE), Polystyrene (PS), Poly(methyl methacrylate) (PMMA), Polydimethylsiloxane (PDMS), Polycarbonate (PS), Liquid crystal polymer (LCP).
압타머란 single strand DNA나 RNA의 삼차원구조를 이용해 특정 물질을 검출하는 방법으로 항원-항체 반응과 비슷하나 물질의 사이즈가 훨씬 작아서 마이크로니들의 끝이나 내부의 홀에 많은 수의 압타머를 결합시킬 수 있다는 장점이 있다.
또한 여러 종류의 바이오 마커에 대한 압타머를 한꺼번에 붙일 수 있으므로 (유전자칩과 비슷한 개념) 동시에 여러 종류의 물질을 검출할 수 있다 (Multiplexing). 유전자 칩의 경우 손톱크기의 칩 위에 10,000종류 이상의 DNA나 RNA를 검출할 수 있는 유전체를 결합시킬 수 있으므로, 이론적으로 스킨패치도 다양한 물질에 대한 압타머로 microneedle을 활성화하여 바이오마커칩으로 사용할 수 있다.
압타머를 이용한 피부 진단 패치의 개발의 경우 표피층의 세포간질에 존재하는 바이오마커를 detection해야 하므로 약 20 um 의 각질층을 통과해야 하는 문제점이 있다. 이 문제를 마이크로니들을 통해 해결한 진단용 스킨 패치 제작을 위해 다음과 같이 압타머를 마이크로니들에 붙일 수 있다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 압타머라는 single strand DNA나 RNA의 삼차원구조를 이용해 특정 물질을 검출하는 방법으로 항원-항체 반응과 비슷하나 물질의 사이즈가 훨씬 작고 상대적으로 많은 수의 마이크로니들 팁 표면에 많은 수의 압타머를 결합시킬 수 있다는 장점이 있다.
또한 여러 종류의 바이오 마커에 대한 압타머를 한꺼번에 붙일 수 있으므로 동시에 여러 종류의 물질을 검출할 수 있어서(Multiplexing), 마이크로니들 팁 기반 스킨패치도 압타머를 이용한 단백질 칩으로 사용할 수 있다.
도 1은 PDMS를 이용한 microneedle의 제작과 피부의 층에 맞추어 본 구조,
도 2는 마이크로니들과 이를 이용한 패치 예,
도 3은 Microneedle tip 표면을 plasma oxidation 으로 silanol을 붙인후, hydroxyl 기에 3-GPTMS로 silanizing후 3-GPTMS에 포함된epoxy기에 압타머와 결합된 PEG의 amine 기를 결합시키는 방법,
도 4는 Amine (NH2-)기가 결합된 PEG에 연결된 압타머,
도 5는 Polycarbonate microneedle표면을 PEG의 한쪽 끝에 결합한 압타머로 코팅하는 방법. (A) PC microneedle 표면에 HNO3를 처리한 후 NaBH4로 환원시켜서 최종적으로 amine group을 결합시킨다. 이후 한쪽 끝에 carboxyl group을, 다른 한쪽 끝에 압타머와 결합하고 있는 PEG을 EDC/NHS와 함께 PC-NH2에 처리하여 완성된 PEG-aptamer functionalized된 PC microneedle을 완성시킨다. (B) ATR-FTIR을 통해 NH2-가 결합된 PC를 확인. (C) Fluorescence tagged anti-sense oligonucleotide를 이용해 PC표면에 부착된 aptamer의 양을 분석함.
도 6은 PEG-aptamer로 표면이 코팅된 PC microneedle.
도 7은 Gold coated polycarbonate microneedle을 사용한 예에 관한 것으로, PC microneedle 를 sputtering을 통해 10nm 두께의 titanium과 40 nm 두께의 gold로 차례로 코팅한 후 Thiol-gold 반응을 통해 PEG-aptamer를 마이크로니들 표면에 결합시킨다.
도 8은 PC microneedle 에 thiol-gold 결합을 통해 코팅된 PEG-aptamer의 분자갯수와 상온 안정성을 약 40일 동안 테스트한 결과를 나타낸 것으로, gold coating 두께에 비례하여 PEG-aptamer 결합 분자갯수가 늘어남을 확인할 수 있었으며, 상온에서 안정적으로 오랜 기간 동안 결합을 유지함이 확인되었다..
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1:Microneedle tip 표면에 압타머를 부착시키는 반응예
마이크로니들에 비특이적으로 결합하는 단백질로 인한 진단의 부정확성을 피하기 위하여, 마이크로니들 표면을 polyethylene glycol(PEG)로 처리한 후 aptamer를 PEG끝에 부착하여 기기를 구성한다.
A. PDMS microneedle의 예:
Microneedle을 구성하는 PDMS의 표면을 Plasma oxidation을 통해 Silanol (SiOH)을 형성한다. 이 Hydroxyl 기를 epoxy기를 가지고 있는 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (3-GPTMS) 로 silanizing 후 이 expoxy기에 압타머와 결합된 PEG의 amine기 (도 4) 를 결합함으로서 Microneedle의 표면에 압타머-PEG을 구성할 수 있다 (도 3).
B.Polycarbonate microneedle표면을 PEG의 한쪽 끝에 결합한 압타머로 코팅하는 방법:
PC 마이크로니들의 표면을 nitric acid 처리로 electrophilic substitution 후 nitro groups을 환원시켜서 primary amine group 을 붙여 PC-NH2를 준비한다. 여기에 carboxyl 기를 갖는 PEG에 결합된 압타머를 N-Hydroxysuccinimide (NHS), 1-ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)를 촉매로 사용하여 결합시킨다 (도. 5A). 즉, PC microneedle 표면에 HNO3를 처리한 후 NaBH4로 환원시켜서 최종적으로 amine group을 결합시킨다. 이후 한쪽 끝에 carboxyl group을, 다른 한쪽 끝에 압타머와 결합하고 있는 PEG을 EDC/NHS와 함께 PC-NH2에 처리하여 완성된 PEG-aptamer functionalized된 PC microneedle을 완성시킨다.
Polycarbonate에 amine기의 결합은ATR- FTIR 방법을 통해 확인하였고 (도 5B), 두번째 반응에 의한PEG에 결합된 압타머의 결합은 fluorescence tagged oligonucleotide를 이용한 방법을 통해 증명하였다 (도 5C).
상기의 두 단계 반응을 통해 도 6에서 보여주는 것과 같은 polycarbonate microneedle의 표면을 PEG에 부착된 압타머로 코팅한 피부의 바이오마커 진단용 스킨패치를 구축하였다.
C. Gold coated polycarbonate microneedle을 사용한 예:
PC 마이크로니들 표면을 sputtering을 통해 titanium과 gold로 차례로 코팅을 한 후에 thiol 기를 갖는 PEG에 결합된 압타머를 TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)와 1시간 상온에서 반응시킨 후, aptamer-PEG-TCEP 를 상기 준비된 gold-coated PC microneedle과 24시간 동안 상온에서 결합시키는 방법을 통해 DNA 압타머로 표면이 기능화된 진단용 마이크로니들을 구현할 수 있다 (도 7). 표면의 코팅상태는 scanning electron microscope (SEM)을 통해 확인하였다.
PC 마이크로니들 표면에 결합된 PEG-aptamer의 갯수와 상온에서의 결합 안정성을 테스트한 결과 약 2 x 1010개의 압타머가 40일 이상 안정적으로 마이크로니들 표면에 결합되어 있는 것으로 확인되었다 (도 8).

Claims (6)

  1. 폴리카보네이트(polycarbonate) 마이크로니들을 타이타늄과 골드(gold)로 차례로 코팅하여 코팅된 폴리카보네이트(polycarbonate) 마이크로니들을 제조하고, 티올(thiol) 기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합된 압타머를 제조하여, 상기 타이타늄과 금이 코팅된 폴리카보네이트(polycarbonate) 마이크로니들과 상기 티올(thiol) 기를 갖는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합된 압타머를 결합시키는 단계를 포함하는 압타머가 코팅된 마이크로니들 기반 피부 진단 패치 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코팅된 금의 두께는 10 내지 40nm인 것을 특징으로 하는 압타머가 코팅된 마이크로니들 기반 피부 진단 패치 제조방법.
  3. 폴리카보네이트(Polycarbonate) 마이크로니들 표면에 HNO3를 처리한 후 NaBH4로 환원시켜서 최종적으로 아민기를 결합시킨 후 한쪽 끝에 카르복실기를 다른 한쪽 끝에 압타머와 결합하고 있는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 NHS(N-Hydroxysuccinimide), 및 EDC[1-ethyl-3-(3′-dimethylaminopropyl)carbodiimide]를 촉매로 사용하여 결합시키는 단계를 포함하는 압타머가 코팅된 마이크로니들 기반 피부 진단 패치 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 압타머가 코팅된 마이크로니들 기반 피부 진단 패치.
  5. 제4항에 있어서, 상기 피부 진단 패치는 마이크로니들 팁 표면에 압타머가 부착되고 상기 압타머의 말단에는 진단 가능한 성분이 부착될 수 있는 것을 특징으로 하는 마이크로니들 기반 피부 진단 패치.
  6. 제4항에 있어서, 상기 진단 가능한 성분은 단백질, 펩타이드, DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 마이크로니들 기반 피부 진단 패치.
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