KR20190077998A - Tpx-0005를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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KR20190077998A KR1020170179636A KR20170179636A KR20190077998A KR 20190077998 A KR20190077998 A KR 20190077998A KR 1020170179636 A KR1020170179636 A KR 1020170179636A KR 20170179636 A KR20170179636 A KR 20170179636A KR 20190077998 A KR20190077998 A KR 20190077998A
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Abstract

본 발명은 TPX-0005를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 TPX-0005를 유효성분으로 포함하는 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 환자에서 종래 ALK/ROS1/TRK 억제제로 알려진 TPX-0005에 의한 항 종양효과를 확인하였고, 또 다른 ALK/ROS1/TRK 억제제로 알려진 RXDX-101과 비교하여 더욱 적은 농도로 우수한 효과를 나타냄을 확인하였는바, 본 발명에 따른 TPX-0005는 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 및 상기 융합 유전자를 갖는 다른 유형의 암 종에 대한 치료물질로써 유용하게 이용 가능할 것으로 기대된다.

Description

TPX-0005를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer containing TPX-0005}
본 발명은 TPX-0005를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암에 대한 TPX-0005의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
뉴로트로핀 수용체 인산화효소(neurotrophin receptor kinase; NTRK) 유전자에 의해 암호화되는 트로포마이오신 수용체 인산화효소(Tropomyosin receptor kinase; TRK)는 인간 RTK의 58개 종류 중 TRK 하위 패밀리에 속하며, TRK 패밀리는 NTRK1, NTRK2, 및 NTRK3에 의해 각각 암호화되는 TRKA, TRKB 및 TRKC로 분류된다. TRKA 인산화효소의 형질전환 활성은, 대장암(colorectal cancer; CRC)에서 트로포마이오신 유전자에 대한 형질전환 인산화효소 파트너(TPM3-NTRK1)로서 처음 발견되었다. 이후 다양한 유형의 발암성 NTRK 융합체를 지니는 고형암, 예컨대 대장암 및 연조직 육종에서의 LMNA-NTRK1, 비소세포폐암(NSCLC)에서의 SQSTM-NTRK1, 및 유방 관련 분비 암종에서의 ETV6-NTRK3 등이 보고되어 있다. NTRK 유전자와 관련된 융합 유전자에 대한 보고가 증가함에 따라 이를 표적하는 의약품 개발이 증가하는 추세이며, 보다 구체적으로 엔트렉티닙(Entrectinib), LOXO101, 알티라티닙(altiratinib) 및 시트라바티닙(sitravatinib)이 TRAKA, TRAKB 및/또는 TRAKC에 대한 대표적인 억제제로 보고되어 있다(J Natl Cancer Inst 2016; 108).
최근 엔트렉티닙(RXDX-101)과 조합하여 진행된 두 가지 임상 1상(ALKA-372-001 및 STARTRK-1) 결과가 발표되었는데, 제 1상 임상 시험에서 NTRK1/2/3 재배열을 가지는 3명의 진행성 고형 종양 환자, 예컨대 NSCLC(SQSTM1-NTRK1), MASC(ETV6-NTRK3) 및 CRC(LMNA-NTRK1) 환자가 엔트렉티닙에 대한 종양 반응을 나타내었다는 결과가 보고되었다. NTRK1, NTRK2 및 NTRK3 유전자를 포함하는 재발성 유전자 융합은 종양 성장의 실질적인 요인이며, 재배열된 상태에서 RAS/RAF/MEK/ERK, PI3K/AKT/TOR 및 PLC/PKC 경로를 통해 활성화된 융합 인산화효소 신호가 일어나 종양의 발생 및 진행을 유도한다. 그러나 이러한 현상은 다양한 유형의 종양에서 발견되지만, 일반적으로 발생률은 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 본 발명자들은 이전 연구에서 74명의 전이성 대장암 환자 중 2명의 환자에서 NTRK1:TPM3 유전자 재배열을 갖는 것을 확인하였다.
한편, TPX-0005는 3차원의 거대 고리 구조를 갖는 ALK, ROS1 및 TRK 패밀리의 새로운 저분자 억제제이며, 종래의 억제제들 보다 훨씬 작은 크기를 갖는다. TPX-0005는 청색 용매에 대한 노출 모티프 없이 아데닌 결합 경계 내부에 완전히 위치하여 활성화된 인산화효소와 효율적으로 결합하고 임상적 저항성 변이, 특히 게이트키퍼(gatekeeper) 및 ALK, ROS1 및 TRK 계열 인산화효소의 용매 전방 돌연변이로부터 입체적 간섭을 피할 수 있게 한다. 이에, 본 발명자들은 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암에 대한 TPX-0005의 항암 효과를 알아보고자 하였다.
본 발명자들은 TPX-0005가 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암에 미치는 영향을 분석한 결과, 뛰어난 항 종양 효과를 나타냄을 발견함으로써 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 TPX-0005를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TPX-0005를 유효성분으로 포함하는, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 대장암은 TPM3-NTRK1(Tropomyosin 3-neurotrophin receptor kinase 1) 융합 유전자를 갖는 대장암일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 TPX-0005는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 세포의 생존능을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 세포에서 Trk1, PLC, 및 AKT 매개 신호전달 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 약리학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 보조제(additive)를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 TPX-0005를 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대장암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 대장암 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명자들은 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 환자 유래 세포에서 종래 ALK/ROS1/TRK 억제제로 알려진 TPX-0005에 의한 항 종양효과를 확인하였고, 또 다른 ALK/ROS1/TRK 억제제로 알려진 RXDX-101과 비교하여 더욱 적은 농도로 우수한 항 종양효과를 나타냄을 확인하였는바, 본 발명에 따른 TPX-0005는 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 및 TRK 융합 유전자를 갖는 다른 유형의 암종에 대한 치료물질로써 유용하게 이용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 TPM3-NTRK1 융합 유전자 구조를 도시한 것이다.
도 2는 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 환자 유래 세포(CRC PDC) 및 양성대조군인 KM12 세포주에서 qRT-PCR을 통해 상기 융합체 mRNA의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 3은 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 발현하는 대장암 환자 유래 세포(CRC PDC) 및 양성대조군인 KM12 세포주에 TPX-0005 또는 RXDX-101을 다양한 농도(10-2-104 nM)로 처리한 후 세포 생존능 측정 및 IC50을 도출하여 비교한 결과이다.
도 4는 TPX-0005 처리에 의한 세포증식 신호전달의 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 것으로서, 도 4a는 TPM3-NTRK1 융합체를 갖는 대장암 환자 유래 세포(CRC PDC) 및 KM12 세포주에 TPX-0005를 처리한 후 Trk1, PLCγ, 및 AKT의 단백질 발현수준을 각각 확인한 결과이고, 도 4b는 상기 대장암 환자 유래 세포에 TPX-0005를 농도별로 처리(0, 1, 5, 50, 100 nM)한 후 EGFR, Met, 및 Src의 단백질 발현수준을 확인한 결과이다.
본 발명자들은 TPX-0005가 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암에 미치는 영향을 분석한 결과, 뛰어난 항 종양효과를 나타냄을 발견함으로써 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 TPX-0005를 유효성분으로 포함하는, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 예방 또는 치료를 목적으로 하는 질환인 “대장암(colorectal cancer)”은 대장에 생긴 암세포로 이루어진 악성종양을 말한다. 대부분의 대장암은 대장의 점막에서 발생하는 선암이며, 이 외에도 림프종, 육종, 편평상피암, 및 다른 암의 전이성 병변 등이 있다. 본 발명에 있어서, 대장암은 바람직하게 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 발현하는 대장암을 의미하며, 상기 융합 유전자의 구조는 도 1에 도시된 바와 같다.
상기 TPX-0005는 (13E,14E,3R,6S)-45-fluoro-3,6-dimethyl-5-oxa-2,8-diaza-1(5,3)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidina-4(1,2)-benzenacyclononaphan-9-one의 화학명을 가지며, 다음과 같은 화학식 1의 구조로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00002
상기 TPX-0005는 ALK/ROS1/TRK 억제제로서, ALK G1202R, ROS1 G2032R 및 TRKA G595R 변이를 포함하는 다양한 돌연변이를 효과적으로 억제하며, 또한 ALK WT 및 ALK G1202R 이종이식 동물모델에서 항 종양 효과를 나타냄이 보고된 바 있다.
본 발명자들은 실시예를 통해 상기 TPX-0005가 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 발현하는 대장암 환자 유래 세포에서 우수한 항 종양 효과를 나타냄을 구체적으로 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, qRT-PCR을 통해 TPM3-NTRK1 융합체 mRNA를 발현하는 것으로 확인된 대장암환자 유래 세포(CRC PDC)와 양성대조군인 KM12 세포에 대하여 TPX-0005 또는 RXDX-101을 다양한 농도범위로 처리하여 배양한 다음 세포 생존능을 측정하였다. 그 결과 또 다른 ALK/ROS1/TRK 억제제인 RXDX-101를 처리한 경우에 비해 TPX-0005를 처리한 경우 상기 두 가지 세포의 생존능이 모두 현저하게 감소하였으며, IC50 역시 더 낮은 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
이에 더하여, TPX-0005 처리에 의한 세포 증식 신호전달의 변화를 조사한 결과 p-TRK1, p-PLC 및 p-AKT 단백질의 발현수준이 감소한 것을 통해 TRK1, PLC, 및 AKT 관련 신호전달이 저해되는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
상기 실시예 결과들은 TPX-0005가 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암에 대한 우수한 항 종양 효과를 가짐을 입증하는 것이다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상기 TPX-0005를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대장암 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 대장암 예방 또는 치료용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 실험 약물
TP therapeutics(San Diego, CA, USA)에서 개발한 신규 ALK/ROS1/TRK 억제제인 TPX-0005 및 Ignyta Inc.(San Diego, CA, USA)에서 개발한 RXDX-101(entrectinib) 약물 모두 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 20 mM 농도로 용해시키고 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.
1-2. 환자유래 종양세포 및 세포주 배양
1차 생검 샘플을 DPBS로 세척하고 작은 조각으로 자른 다음 120 g/ml의 콜라게나아제(collagenases), 500 g/ml 디스파제(dispase) 및 2 mg/ml DNA 분해효소(DNase)가 포함된 RPMI1640 배지로 옮겼다. 작은 조직 조각을 분산될 때까지 0.5 내지 1 시간 동안 배양한 다음, 단일 세포를 수집하기 위해, 샘플을 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 다음으로 수집된 세포를 배양 플레이트 상에 분주하고 10% FBS, 1% 항생제-항진균 용액(antibiotic-anti-mycotic solution), 0.5 ㎍/ml 하이드로코르티손(hydrocortisone)(Sigma Aldrich St. Louis, MO, USA), 5 g/ml 인슐린(PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 5 ng의 EGF(PeproTech Rocky Hill, NJ, USA)가 첨가된 RPMI1640으로 배양하였다. 이후 확립된 환자 유래 세포주는 첨가제가 포함된 1차 배양 세포 배지에서 증식시켰다. 한편, KM12 세포주는 10% FBS와 1% 항생제-항진균 용액(Gibco BRL, Paisley, UK)이 포함된 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였으며, 배지는 3일마다 교체해주었다.
1-3. 표적서열
40% 이상의 종양 세포질을 함유하는 포르말린으로 고정된 파라핀 포매(Formalin-fixed paraffin embedded; FFPE) 샘플을 현미경 하에서 4 μm 두께로 절단(10-20 슬라이드) 한 염색되지 않은 부분의 조직절편 또는 신선한 냉동 조직을 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin) 염색 슬라이드와 비교하였다. 한편, 상기 파라핀 포매 조직에서 RNA를 추출하고 cDNA 라이브러리를 합성한 다음, FusionPlex CTL 키트(Archer, Boulder, CO, USA)를 사용하여 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing; NGS)을 위한 라이브러리를 만드는데 사용할 수 있는 표적을 농축하였다. 이후 Archer Analyzer Platform을 사용하여 서열 분석 데이터로부터 융합 및 돌연변이를 검출하였다.
1-4. 세포 생존능 분석
TPX-0005의 효과를 검증하기 위해, 96-웰 플레이트에 3,000개의 세포를 접종하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양한 다음, 세포에 TPX-0005의 농도를 증가시키면서 3일 동안 노출시켰다. 이후 Cell Titer Glo(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 세포 증식을 측정하였으며, 검출된 발광 신호를 대조군(Control)에 대한 백분율로 계산하였고, IC50 값은 TPX-0005를 처리하지 않은 대조군 세포의 성장과 비교하여 세포 성장의 50%를 저해하는 약물의 농도로 정의하였다.
1-5. 웨스턴 블롯 분석
각 세포로부터 단백질을 추출하고, 추출된 동량의 단백질을 8%에서 12% SDS-PAGE로 분리하였다. 이수 크기에 따라 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 옮기고, 관찰하고자 하는 단백질에 특이적인 각 1차 항체를 Tween 20이 포함된 TBS 버퍼(TBS-T)에 1:500 비율로 희석한 다음 상기 멤브레인에 처리하여 4℃에서 밤새 배양하였으며, 상기에서 사용한 1차 항체는 다음과 같다: p-TRK1 (#2508), TRK1 (#4619), p-PLC (#5690), PLC (#2821), p-ERK (#4370), ERK (#9102), p-AKT (#4060) 및 AKT (#9272)는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였고 β-actin (SC-47778)은 Santa Cruz(Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. 다음으로, 상기 각 1차 항체에 결합하는 적절한 2차 항체, 즉 CST에서 구입한 HRP가 접합된 anti-rabbit IgG (#7074) 또는 anti-mouse IgG (#7076) 2차 항체를 TBS-T를 이용해 1:2000으로 희석하여 처리하였다. 표적 단백질에 대한 항체의 결합은 향상된 화학 발광 시스템(enhanced chemi-luminescence system)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 검출하였다.
1-6. RT-PCR 및 real-time PCR
본 실험을 위해 세포에서 AllPrep DNA/RNA 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 총 RNA를 분리한 다음, Superscript III First strand 합성 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 역전사 PCR(RT-PCR)을 실시하여 cDNA를 합성하였고 하기에 기재한 유전자에 특이적인 각 프라이머와 SYBR Green PCR Master Mix(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용해 7500 Real Time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 real-time PCR을 실시하였다. 모든 샘플에 대한 데이터는 GAPDH 데이터를 기준으로 상대적으로 보정하였다. 본 real-time PCR에서 이용한 유전자 특이적 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
유전자 방향 서열 서열번호
TPM3-NTRK1
 Forward_TPM3 5’- TGTGCAGGGCCTCTCCTTAC -3’ 1
Reverse_NTRK1 5’- TGAAGTACAAGGCCATTAGCGA -3’ 2
GAPDH
 Forward 5’- ACAACTTTGGTATCGTGGG-3’ 3
Reverse 5’- GCCATCACGCCACAGTTTC -3’ 4
1-7. 통계분석
통계분석은 PRISM 5.0을 이용하여 수행하였고, 필요 시 대응표본 t 검증(paired t-test)을 이용하여 분석하였으며, 결과는 평균± 표준편차(mean ± SD)로 표현하였다. P-values가 0.05 미만(P < 0.05)인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2. 대장암 환자유래 세포주에서 TPM3-NTRK1 융합 확인
본 발명자들은 이전 연구를 통해 TPM3-NTRK1 융합을 지닌 대장암 환자를 확인하였는바, 본 실시예에서는 이러한 환자의 림프절에서 환자 유래 세포(patient derived cells; PDC)를 확립하였으며, 종양 조직을 이용한 Archer FusionPlex에 근거하여 TPM3-NTRK1 융합 구조를 도 1에 도시하였다.
본 발명자들은 TPM3-NTRK1 융합체를 갖는 대장암 환자로부터 유래된 환자 유래 세포(PDC)가 TPM3-NTRK1 융합체를 갖는지 여부를 확인하기 위해 상기 실시예 1-6의 방법에 따라 qRT-PCR을 실시하였다. 이때, 양성대조군으로는 TPM3-NTRK1 융합체를 발현하는 것으로 잘 알려진 KM12 세포주를 이용하였다.
실험 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 양성대조군인 KM12 세포주의 경우 상기 융합체의 mRNA가 높은 수준으로 발현된 것으로 나타났으며, 상기 대장암환자 유래 세포(CRC PDC) 역시 상기 융합체의 mRNA를 발현하는 것을 확인하였다.
실시예 3. TPX-0005에 의한 항암효과 및 세포 증식 신호전달 저해 확인
상기 결과에 더하여 본 발명자들은 TPX-0005의 항 종양 효과를 조사하기 위해, TPM3-NTRK1 융합체를 발현하는 대장암환자 유래 세포(CRC PDC) 및 양성대조군인 KM12 세포주에 대하여 세포 생존능 분석을 실시하였다.
이를 위해, 상기 각 세포에 TPX-0005 및 RXDX-101를 각각 다양한 농도범위(0.01 nM-10 μM)로 처리하여 3일 동안 배양한 다음, 상기 실시예 1-4의 방법에 따라 세포 생존능 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 TPX-0005의 IC50이 RXDX-101의 IC50보다 유의하게 낮게 측정된 것을 확인하였다(TPX-0005 vs. RXDX-101의 IC50: CC PDC에서 0.15 nM vs. 0.39 nM, KM12에서 0.22 nM vs 12 nM, p <0.0001).
다음으로, TPX-0005 처리에 의한 세포 증식 신호전달의 변화를 알아보고자 하였다. 이를 위해, 대장암환자 유래 세포(CRC PDC) 및 KM12 세포주에 TPM-0005를 처리하고 상기 실시예 1-5의 방법에 따라 웨스턴 블롯을 통해 p-TRK1, p-PLC 및 p-AKT 단백질의 발현수준을 측정하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 상기 단백질들의 발현수준이 모두 현저히 감소된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 TPX-0005에 의한 세포 증식 억제 효과가 TPM3-Trk1 융합체를 발현하는 대장암환자 유래 세포에서 세포 증식과 관련된 신호전달을 저해함으로써 야기된다는 것을 보여주는 것이다.
나아가 상기 두 세포들에 TPX-0005를 다양한 농도(1, 5, 50, 100 nM)로 처리한 후 다른 표적 단백질(EGFR, MET, 및 SRC)의 발현수준을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과 도 4b에 나타낸 바와 같이 상기 단백질들의 발현수준에는 변화가 없는 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer containing TPX-0005 <130> PD17-091 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPM3-NTRK1_Forward_TPM3 <400> 1 tgtgcagggc ctctccttac 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPM3-NTRK1_Reverse_NTRK1 <400> 2 tgaagtacaa ggccattagc ga 22 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_Forward <400> 3 acaactttgg tatcgtggg 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_Reverse <400> 4 gccatcacgc cacagtttc 19

Claims (6)

  1. TPX-0005를 유효성분으로 포함하는, 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 대장암은 TPM3-NTRK1(Tropomyosin 3-neurotrophin receptor kinase 1) 융합 유전자를 갖는 대장암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TPX-0005는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00003

  4. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 세포의 생존능을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 TPM3-NTRK1 융합 유전자를 갖는 대장암 세포에서 Trk1, PLC, 및 AKT 매개 신호전달 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약리학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 보조제(additive)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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