KR20190073256A - 세포 이중 염색법을 이용한 항생제 내성균의 신속 진단 키트 및 진단 방법 - Google Patents

세포 이중 염색법을 이용한 항생제 내성균의 신속 진단 키트 및 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 이중 염색법을 이용한 항생제 내성균의 신속 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것으로, 본 발명의 프로피디움 요오드화물 및 알라마르 블루를 이용한 이중 염색법은 카바페넴계 항생제에 내성을 나타내는 대표적인 세균 4종, 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumanni), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에 대하여, 단 시간 내 세포 염색으로 얻어진 형광도 값을 세균 증식 속도 및 염색비율 값(항생제 유무에 따른 형광도 값의 비율)으로 보정함으로써 신속하게 내성 여부를 진단하고, 진단의 정확성을 극대화시킬 수 있는 바, 항생제 내성균의 진단 키트, 항생제 내성균의 진단 방법 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

세포 이중 염색법을 이용한 항생제 내성균의 신속 진단 키트 및 진단 방법{Kit and Method for Rapid Diagnosing of Antibiotic Resistant Bacteria Using Cell Double Staining}
본 발명은 세포 이중 염색법을 이용한 항생제 내성균의 신속한 진단 키트 및 방법에 관한 것이다.
최근 들어, 세균성 감염 치료에 사용되고 있는 기존 항생제 중 이미 2/3는 더 이상 치료 효과가 없음이 보고됨에 따라(Pulcini C et al. 2012 Clinical Infectious Diseases; Lestner JM er al. 2015 Antimicrobial Agents and Chemotheraphy), 항생제 내성균의 심각성이 날로 높아지고 있다.
질병관리본부의 검사자료(2016년 5월~2017년 4월)에 의하면, 국내 6개 권역 종합병원의 환자에서 분리된 대장균의 43.9%가 시프로플록사신(Ciprofloxacin)에, 32.1%가 세포탁심(Cefotaxime)에 내성이 있으며, 특히 아시네토박터(Acinetobacter)의 경우 73.4%가 카바페넴(Carbapenem)계 항생제에 내성을 띤 것으로 확인되었다. 카바페넴에 내성을 보이는 아시네토박터 균의 경우 다른 계열의 항생제에도 동시에 내성을 나타내는 다제 내성균이 될 가능성이 있어 특히 주의가 필요하다. 우리나라에서 병원 감염뿐만 아니라 지역사회 감염으로 확인된 아시네토박터 균의 33.3%가 메로페넴(Meropenem) 및 이미페넴(Imipenem) 모두에 내성을 보임에 따라, 아시네토박터에서의 다제내성 발생 차단이 중요한 화두로 떠오르고 있다.
이와 더불어, 최근 전 세계적으로 의료기관을 중심으로 카바페넴-저항성 장내세균(CRE: Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae)이 증가하는 경향을 보이고 있어 적절한 치료제 선택이 어려워지고 있고, 특히 카바페넴 분해효소 유전자(NDM-1, KPC형)가 플라스미드에 위치하는 경우 환자의 이동에 따라 다른 의료기관 또는 지역사회에도 내성균이 전파될 수 있어 공중보건에 큰 위협이 되고 있다. 국내 질병관리본부 하의 검사결과에 따르면 우리나라에서도 CRE 발생률이 최근 들어 급격하게 증가하는 추세를 보였다.
이로 인해 기존의 항생제를 대체할 수 있는 새로운 항생 물질의 개발이 시급할 뿐만 아니라, 이와 동시에 항생제 내성균을 신속하게 진단하여 내성의 전파를 차단하는 기술 개발 또한 절실한 실정이다. 신속한 항생제 내성균의 진단과 그 결과에 따른 적절한 항생제 사용이 내성균의 파급을 차단할 수 있는 가장 경제적이며 효과적인 기술이라 할 수 있다.
기존 진단법의 경우, 균종에 따라 2-3일 이상의 시간이 소요되거나 염기서열이 확보된 균주에서만 이용 가능한 점 또는 진단에 고가의 비용이 소모된다는 점 등의 단점이 존재한다. 하지만, 세포 염색법에 기반한 내성 진단법의 경우, 기존의 진단법보다 훨씬 신속하고 저렴하게 이용이 가능한 바, 이러한 장점을 극대화하면서도, 기존 진단법보다도 정확하고 신속하게 내성균을 판단할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
1. 한국등록특허 제10-0990756호(2010.10.22 등록).
본 발명의 목적은 간단하면서도 효과적이고 신속하게 항생제 내성균을 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간단하면서도 효과적이고 신속하게 항생제 내성균을 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항생제가 포함된 배지, 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI) 및 알라마르 블루(Alamar blue)를 포함하는 항생제 내성균의 신속 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 항생제가 포함된 배지에서 세균을 배양하는 단계; 2) 상기 세균이 포함된 배양액의 흡광도를 측정하는 단계; 3) 상기 세균에 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI)을 처리하고 PI 형광도를 측정하는 단계; 4) 상기 단계 3)에서 형광도 측정이 끝난 세균에 알라마르 블루(Alamar blue; AB)를 처리하고 AB 형광도를 측정하는 단계; 및 5) 상기 단계 3)의 PI 형광도를 단계 2)의 흡광도로 나누어 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도를 계산하는 단계;를 포함하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 프로피디움 요오드화물 및 알라마르 블루를 이용한 이중 염색법은 카바페넴계 항생제에 내성을 나타내는 대표적인 세균 4종, 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumanni), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에 대하여, 단 시간 내 세포 염색으로 얻어진 형광도 값을 세균 증식 속도 및 염색비율 값(항생제 유무에 따른 형광도 값의 비율)으로 보정함으로써 신속하게 내성 여부를 진단하고, 진단의 정확성을 극대화시킬 수 있는 바, 항생제 내성균의 진단 키트, 항생제 내성균의 진단 방법 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1 및 도 2는 이미페넴 저항성이 없는 균주 및 저항성이 있는 균주, 총 18종을 대상으로 일반적인 세포 배양법에 근거하여 이미페넴에 대한 내성 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 프로피디움 요오드화물 및 알라마르 블루를 이용한 세포 이중 염색법의 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 E. coli ATCC 25922의 생균 및 사균을 프로피디움 요오드화물로 염색하여 세균 수에 따른 형광도 값(FI)을 비교한 결과이다.
도 5는 이미페넴 저항성이 없는 균주 및 저항성이 있는 균주, 총 8종을 프로피디움 요오드화물로 염색하여 이미페넴 유무에 따른 형광도 값을 비교한 결과이다.
도 6은 이미페넴 저항성이 없는 균주 및 저항성이 있는 균주, 총 8종을 프로피디움 요오드화물로 염색하여 이미페넴 내성 판별의 기준값을 도출한 결과이다.
도 7은 항생제 감수성 아시네토박터 바우만니 또는 항생제 저항성 아시네토박터 바우만니를 알라마르 블루로 염색하여 이미페넴 유무에 따른 형광도 값을 비교한 결과이다.
도 8은 E. coli ATCC 25922의 생균 및 사균을 알라마르 블루로 염색하여 세균 수에 따른 형광도 값을 비교한 결과이다.
도 9는 이미페넴 저항성이 없는 균주 및 저항성이 있는 균주, 총 8종을 알라마르 블루로 염색하여 이미페넴 내성 판별의 기준값을 도출한 결과이다.
도 10은 프로피디움 요오드화물 및 알라마르 블루를 사용한 이중 염색법을 이용하여 E. coli 임상 균주 12종의 이미페넴 내성 여부를 확인한 결과이다.
도 11은 이미페넴 저항성이 없는 균주를 프로피디움 요오드화물로 염색한 후 얻은 형광도 값을 흡광도 값(세균 증식 속도)으로 보정하여 이미페넴 내성 판별의 기준값을 도출한 결과이다.
도 12는 이미페넴 저항성이 없는 균주를 알라마르 블루로 염색한 후 얻은 형광도 값을 흡광도 값으로 보정하여 이미페넴 내성 판별의 기준값을 도출한 결과이다.
도 13은 이미페넴 저항성이 없는 균주를 프로피디움 요오드화물로 염색한 후 얻은 형광도 값을 염색비율 값(항생제 유무에 따른 형광도 값의 비율)으로 보정하여 이미페넴 민감성 판별의 기준값을 도출한 결과이다.
도 14는 이미페넴 저항성이 있는 균주를 프로피디움 요오드화물로 염색한 후 얻은 형광도 값을 염색비율 값으로 보정하여 이미페넴 내성 판별의 기준값을 도출한 결과이다.
도 15는 이미페넴 저항성이 없는 균주를 알라마르 블루로 염색한 후 얻은 형광도 값을 염색비율 값으로 보정하여 이미페넴 민감성 판별의 기준값을 도출한 결과이다.
도 16은 이미페넴 저항성이 있는 균주를 알라마르 블루로 염색한 후 얻은 형광도 값을 염색비율 값으로 보정하여 이미페넴 내성 판별의 기준값을 도출한 결과이다.
도 17은 프로피디움 요오드화물 및 알라마르 블루를 사용한 이중 염색법을 이용하여 임상 균주의 이미페넴 내성 여부를 확인한 결과이다.
도 18은 염색비율 값으로 보정된 이중 염색법을 이용하여 임상 균주의 내성 여부를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 항생제가 포함된 배지, 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI) 및 알라마르 블루(Alamar blue)를 포함하는 항생제 내성균의 신속 진단 키트를 제공한다.
본 발명에서, 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI)은 세포막 침투성이 떨어지기 때문에 손상된 세포막을 통해 세포 안으로 들어가 DNA와 결합하면서 형광을 띠는 물질이다. 따라서 세포막이 손상된 사균의 염색에 적합한 물질이며, 카바페넴 계열 항생제인 이미페넴 등에 의해 죽은 세균을 염색하는데 사용할 수 있다. 하지만, 항생제 노출로 세포막 손상이 발생하였음에도 불구하고 세균의 종류에 따라 PI의 세포투과성이 달라질 수 있다는 한계가 있다.
한편, 알라마르 블루(Alamar Blue; AB)는 세포막 투과성이 높아 손상되지 않은 세포막을 통해서도 세균 안으로 침투가 가능하고 생균의 세포질 내 환원효소에 의해 환원되면서 형광을 띠는 물질이다. 따라서, 세포막이 손상되지 않은 생균의 염색에 적합하다.
이때, 상기 항생제는 카바페넴계 항생제일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 카바페넴계 항생제는 이미페넴, 메로페넴, 베타미프론, 실라스타틴, 파니페넴, 도리페넴, 바이아페넴 및 테비페넴으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 항생제 내성균은 항생제 저항성을 가진 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 선택되는 어느 하나 이상의 세균일 수 있는 바, 특히 카바페넴계 항생제에 대한 내성이 빈번하게 발생하는 상기 4종의 균주들을 대상으로 항생제 내성 여부를 판단할 수 있으므로 바람직하다.
또한, 본 발명은 1) 항생제가 포함된 배지에서 세균을 배양하는 단계; 2) 상기 세균이 포함된 배양액의 흡광도를 측정하는 단계; 3) 상기 세균에 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI)을 처리하고 PI 형광도를 측정하는 단계; 4) 상기 단계 3)에서 형광도 측정이 끝난 세균에 알라마르 블루(Alamar blue; AB)를 처리하고 AB 형광도를 측정하는 단계; 및 5) 상기 단계 3)의 PI 형광도를 단계 2)의 흡광도로 나누어 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도를 계산하는 단계;를 포함하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법을 제공한다.
상기 단계 1)에서, 상기 항생제는 8 ㎍/ml 내지 70 ㎍/ml로 포함될 수 있고, 보다 상세하게는 상기 항생제는 10 ㎍/ml 내지 70 ㎍/ml로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 단계 1)에서, 상기 세균은 1 X 108 CFU/ml 내지 1 X 1010 CFU/ml로 존재할 수 있는 바, 본 발명의 일 실시예에서 검출 가능한 세균의 최소 농도가 1 X 108 CFU/ml이었으므로, 이러한 농도의 세균들을 대상으로 보다 효과적으로 항생제 내성 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 세균은 일반적인 배양법에 기반을 둔 검출 방법과 유사하게, 세포 배양액, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변, 대변 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 시료에서 순수 분리된 것으로서, 배지에서 증식된 것일 수 있으며, 이 경우 다른 균들과 섞여 있는 경우를 배제할 수 있으므로 보다 정확하게 항생제 내성균을 검출해 낼 수 있다.
상기 단계 2)에서, 흡광도는 세균을 4 내지 8시간 동안 배양한 후 OD600에서 측정될 수 있다.
상기 단계 4)에서, AB 형광도가 6,000 이상 60,000 이하인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단할 수 있고, 상기 단계 5)에서, 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도가 0.001 이상 5,000 이하인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단할 수 있는 바, 이와 같이 이중의 기준을 확립하였으므로 보다 정확하게 항생제 내성 여부를 진단할 수 있다.
더불어, 상기 단계 5) 이후, 단계 4)의 AB 형광도 또는 단계 5)의 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도를 항생제가 포함되지 않은 조건에서의 AB 형광도 또는 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도로 나누어 AB 또는 PI의 염색비율 값을 계산하는 단계;를 더 추가할 수 있다.
상기 PI의 염색비율 값이 2.00 이하인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단하거나, PI의 염색비율 값이 2.00 초과인 경우, 세균에 항생제 민감성이 있는 것으로 판단할 수 있고, 상기 AB의 염색비율 값이 0.95 미만인 경우, 세균에 항생제 민감성이 있는 것으로 판단하거나, AB의 염색비율 값이 0.95 이상인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단할 수 있다.
보다 상세하게는, PI의 염색비율 값이 2.00 이하인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단하거나, PI의 염색비율 값이 2.00 초과 5.47 미만인 경우, 세균에 항생제 민감성과 내성이 중간(intermediate)인 것으로 판단하거나, PI의 염색비율 값이 5.47 이상인 경우, 세균에 항생제 민감성이 있는 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기 AB의 염색비율 값이 0.29 이하인 경우, 세균에 항생제 민감성이 있는 것으로 판단하거나, AB의 염색비율 값이 0.29 초과 0.95 미만인 경우, 세균에 항생제 민감성과 내성이 중간(intermediate)인 것으로 판단하거나, AB의 염색비율 값이 0.95 이상인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단할 수 있다.
즉, 조금이라도 항생제 내성의 가능성이 있는 균주를 검출하기 위해서는 PI의 염색비율 값이 5.47 미만이거나 AB의 염색비율 값이 0.29 초과일 때로 판단하는 것이 바람직하다.
상기 항생제는 카바페넴계 항생제일 수 있고, 보다 바람직하게는, 상기 카바페넴계 항생제는 이미페넴, 메로페넴, 베타미프론, 실라스타틴, 파니페넴, 도리페넴, 바이아페넴 및 테비페넴으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
종래 진단법의 경우 세균의 성장곡선 주기에 따라 1일 내지 3일의 시간이 요구된 반면, 본 발명의 진단 방법은 1시간 내지 12시간 내에 완료될 수 있는 바, 매우 짧은 시간 내에서도 정확하고 효율적으로 항생제 내성 여부를 판단할 수 있다.
보다 상세하게는, 염색약 처리 후 내성 여부 판단을 위한 발색까지 걸리는 시간은 PI의 경우 5분 미만, AB의 경우 1시간 내지 6시간이 소요되므로, 발색을 확인하여 내성 여부를 진단하는 시간은 최소 1시간 내지 최대 7시간일 수 있고, 보다 상세하게는 최소 1시간 10분 내지 최대 6시간 10분일 수 있다. 또한, 발색 과정 이전에 항생제를 처리하는 단계를 포함하여 내성 여부를 판단하는 경우에는 균의 배양 시간이 더 필요하므로, 항생제 처리 후 배양에서부터 염색 반응까지 걸리는 시간은 최소 7시간 내지 최대 12시간 일 수 있다.
이때, 상기 항생제 내성균은 항생제 저항성을 가진 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 선택되는 어느 하나 이상의 세균일 수 있는 바, 특히 카바페넴계 항생제에 대한 내성이 빈번하게 발생하는 상기 4종의 균주들을 대상으로 항생제 내성 여부를 판단할 수 있으므로 바람직하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 균주 및 배양 조건 확인
이미페넴(Imipenem) 항생제에 저항성이 없는 균주로 A. baumannii(ATCC 19606, ATCC 15150, NCCP 16004), P. aeruginosa(ATCC 27853, ATCC 10145, NCCP 15783), E. coli(ATCC 25922, ATCC 11775, ATCC 9637, NCCP 16048), K. pneumoniae(ATCC 700721, ATCC 4352, ATCC 13883, NCCP 16054)은 한국 미생물 보존센터 및 국가 병원체 자원은행에서 분양받아 사용하였다.
이미페넴 항생제에 저항성이 있는 균주로 A. baumannii H08-455(전남대학교), P. aeruginosa K20-B-208(성균관대학교 삼성창원병원), E. coli A-48 DK10(성균관대학교), K. pneumoniae 임정애(동아대학교)로 환자에게서 분리해낸 임상 균주를 사용하였다.
모든 균은 -80℃에 저장되어 있던 보관균을 LB 고체 배지에 도말하고 37℃에서 12시간 동안 배양하여 준비하였다. 세포 이중 염색법 과정에 사용된 18종의 균주들의 이미페넴 항생제에 대한 내성 여부를 일반적인 세포 배양법에 근거하여 확인하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 사용된 균주들을 대상으로 하여 카바페넴 계열 항생제인 이미페넴에 대한 최소저해농도(MIC50) 값을 바탕으로 이미페넴 내성 판별에 사용할 항생제 농도를 10 μg/ml로 결정하였다(하기 표 1). 세포 이중 염색법 과정에 사용된 18종의 균주 중 이미페넴에 내성을 보인 E. coli 및 A. baumannii 균주의 경우, 64 μg/ml 농도의 이미페넴에서도 저항성을 보였다(ND로 표기).
Car susceptible strain MIC ( μg /ml) Car resistant strain MIC ( μg /ml)
A. baumannii ATCC 19606 0.5 A. baumannii H08-277 ND
P. aeruginosa ATCC 27853 4 P. aeruginosa K20-B-208 64
E. coli ATCC 25922 4 E. coli A48 ND
K. pneumoniae ATCC 700721 6 K. pneumoniae 임정애 32
<실시예 2> 세포 이중 염색법에 의한 이미페넴(imipenem) 내성균 판별
도 3에 나타난 바와 같은 방법으로 이미페넴 내성균을 판별하였다. 간략하게, 특정 균주를 LB 액체배지에 OD600 1.0 정도의 수준으로 37℃에서 배양하였다. 96-웰 플레이트에 웰 당 반응액을 200 μl 기준으로 하여 대상균의 세균 수가 5 × 108 CFU/ml(약 OD600 0.5에 해당)이 되도록 첨가하고, 이미페넴(10 μg/ml)을 넣고 LB 배지에서 6시간 동안 배양하였다. 이후, 96-웰 플레이트 상의 세균 배양액을 3,000 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후, 세균을 PBS로 세척하고 다시 동일한 양의 PBS에 세균 혼탁액을 제조한 후, OD600 값을 측정하였다. 이후, 세균 혼탁액에 PI를 2 μM 농도로 첨가하고 5분 동안 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 여기 파장(Excitation) 530 nm, 방출 파장(Emission) 620 nm, 이득값(Gain) 60에서 형광도를 측정하였다. PI 형광도 측정을 끝낸 시료에 연이어 AB를 10% 수준으로 첨가하여 1시간 동안 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 여기 파장(Excitation) 530 nm, 방출 파장(Emission) 590 nm, 이득값(Gain) 35에서 형광도(FI; Fluorescence Intensity)를 측정하였다. PI 염색 시 형광도 값이 2,000 이하이거나, AB 염색 시 형광도(FI = AB 염색 시 형광 값/6시간 배양 후의 OD600 값) 값이 6,000 이상이면 이미페넴에 내성이 있는 것으로 평가하였다.
보다 구체적으로, 상기 진단법을 확립하기 위한 각 단계별 실험 방법 및 실험 결과는 다음과 같다:
1) PI 염색 가능성 확인
먼저, 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide; PI) 염색으로 생균과 사균을 구별하는 데에 필요한 최소 세포 수와 반응시간을 결정하기 위해, E. coli ATCC 25922 균주를 대상으로 조건을 확립하였다. 대수기 단계의 생균과 EtOH 처리로 사멸시킨 사균을 다양한 세포 수로 준비한 후 PI로 염색하고 시간별로 흡광도(Ex 530/Em 620)를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 1 × 108 CFU/ml 이상이면 생균과 차별적으로 사균을 염색할 수 있음을 확인할 수 있었다. 특이한 점으로는 PI 염색 시 반응 시간이 길어질수록 흡광도가 감소하는 경향을 보인 바, PI 염색 시 반응 시간을 10분 이내로 제한하였다.
2) 카바페넴 내성 균주 또는 감수성 균주 8종을 대상으로 세포 염색 기반 내성 진단법 최적화
E. coli를 대상으로, 앞서 확립한 PI 염색 조건을 4종의 병원성 균의 내성 진단에 사용 가능한지 여부를 평가하고자, 이미페넴에 내성 또는 감수성을 가진 대상균, 총 8종을 1 × 108 CFU/ml을 포함한 다양한 세포 농도로 준비한 후 이미페넴과 PI를 동시에 첨가하고 시간별 PI 염색 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, E. coli, K. pneumoniae, 및 P. aeruginosa 3종의 균종에서는 5 × 108 CFU/ml 이상의 세균을 사용하였을 때, 이미페넴 내성 균주의 경우 최대 형광도 값이 2,000 이하를 보인 반면, 감수성 균주의 경우 1시간 이내에 3,000 ~ 4,000 정도의 형광도 값을 보여, PI로 이미페넴에 대한 내성 균주를 판별하는 것이 가능함을 확인하였다.
그러나 A. baumannii의 경우 이미페넴 처리 시 내성 균주와 감수성 균주 간 PI 염색 정도가 비슷하여 PI 단독 염색법으로는 내성 판별이 어려움을 확인하였다. 이러한 PI 염색의 한계를 보완하기 위해 생균 염색법을 동시에 수행하였다.
3) 카바페넴 내성균 별 PI 세포 염색법을 이용한 항생제 내성 평가 기준지표 확립
카바페넴에 내성이 빈번하게 발생하는 4종의 균을 대상으로 이미페넴 처리 시 PI 염색을 통해 생균과 사균을 구별할 수 있는 실험방법을 최적화하였다. 도 6을 참조하여 보면, 균종 및 균주에 상관없이 5 × 108 CFU를 이미페넴 10 μg/ml로 처리하고 최소 1시간 이상 반응시킨 후 PI(2 μM)로 10분간 염색 시, 이미페넴 감수성 균주들의 경우, FI 값이 3,000 이상을 보인 반면, 내성 균주들의 경우 2,000 이하의 FI 값을 보였으므로, 앞서 기술한 조건에서 PI 염색 시 FI 2,000 이하의 값을 보이는 균주의 경우 이미페넴에 내성을 띄는 균주로 선별할 수 있다. 다만 A . baumannii의 내성 판별에는 PI 염색법만으로는 부족하므로 다른 세포염색법과 병행하기로 하였다.
4) 알라마르 블루 ( Alamar Blue, AB, Resazurin ) 세포 염색법을 병행하여 PI에 의한 내성 평가 기준 보강
PI를 이용한 이미페넴 내성균 판별 염색 최적화 과정에서 A. baumannii의 경우 이미페넴 처리 시 생균과 사균이 PI에 유사한 수준으로 염색되어 PI를 이용하여 내성균을 구별하는 데에 어려움이 있었다. 이를 개선하기 위해 생균을 선택적으로 염색하는 AB를 이용하여 A. baumannii에서의 적용 가능성을 검사하였다. AB의 경우 생균의 환원력에 의해 적색의 형광물질(Resorufin)로 전환되는 성질이 있어 생균을 선택적으로 염색하는 것이 가능하다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, A. baumannii 균을 이미페넴에 6시간 노출 후 AB로 염색 시, 이미페넴 감수성 균주(AS)는 FI 2,000 미만의 값을 보였으며, 이미페넴 내성 균주(AR)는 8,000 정도의 FI를 보인 바, AB를 이용하여 이미페넴 내성 여부의 판별이 가능함을 확인하였다. 이미페넴에 노출되지 않은 생균의 경우에서도 FI 값이 7,000 ~ 8,000 정도로, 이미페넴 내성 균주(AR)와 비슷한 수준의 FI 값을 보이는 것을 확인하였다.
이를 토대로 4종의 카바페넴 내성균을 대상으로 AB를 이용한 생균 염색법을 최적화 하였다.
5) AB 염색 가능성 확인
AB 염색으로 생균과 사균을 구별하는 데에 필요한 최소 세포 수와 반응시간을 결정하기 위해, E. coli ATCC 25922 균주를 대상으로 조건을 확립하였다. 대수기 단계의 생균과 열처리로 사멸시킨 사균을 다양한 세포 수로 준비한 후 AB로 염색하고 시간별로 흡광도(Ex 530/Em 590)를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 세포 수가 1 × 109 CFU/ml의 경우 1시간 만에 충분한 FI 값을 보였으며, 1 × 108 CFU/ml 이상이면 6시간 정도 처리 시 생균과 사균과 구별할 수 있을 만큼의 FI 값을 보이는 것을 확인하였다.
6) 카바페넴 내성균 별 AB 세포 염색법을 이용한 항생제 내성 평가 기준지표 확립
상기 실시예 2에서 수행한 실험방법을 적용하여 카바페넴에 내성이 빈번하게 발생하는 4종의 균을 대상으로 이미페넴 처리 시 AB 염색을 통해 생균과 사균을 구별할 수 있는 실험방법을 최적화하였다. 균종 및 균주에 상관없이 1 × 108 CFU를 이미페넴 10 μg/ml로 6시간 처리하고 이후 AB(10%)로 1시간 동안 염색하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 이미페넴 감수성 균주들의 경우, FI 값이 대부분 2,000 이하를 보인 반면, 내성 균주들의 경우 6,000 이상의 FI 값을 보였고, 이를 종합하면 앞서 기술한 조건에서 AB 염색 시 FI 6,000 이상의 값을 보이는 균주의 경우, 이미페넴에 내성을 띄는 균주로 선별할 수 있다. 다만 P . aeruginosa 및 K. pneumoniae에서 생균임에도 불구하고 충분한 양의 FI 값을 보이지 못하는 경우가 발생함에 따라, 이들 두 종의 균에서는 AB 염색방법에 변형을 주어 정확도를 높일 필요가 있다.
즉, PI 염색법과 AB 염색법을 병행할 경우, 이미페넴에 대한 내성 기준의 정확도가 높아지므로 시험 대상으로 사용한 4종의 병원균 모두에 적용 가능한 염색법으로 확립할 수 있다.
7) E. coli 임상균에 PI 및 AB 세포 이중 염색법을 적용하여 항생제 내성 진단법의 정확도 평가
본 발명에서 확보된 세포 이중 염색법의 실효성을 평가하기 위해, E. coli 임상균주 12종을 대상으로 세포 이중 염색법을 적용하여 이미페넴에 대한 내성 판별 결과를 기존 콜로니 카운팅(colony counting) 방법에 의한 결과와 비교하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 분석대상으로 한 총 12종의 균주 중 균주 5종(K20-001, K20-003, K20-004, K20-010, K20-023)의 경우, 콜로니 카운팅 분석 시, 이미페넴에 감수성을 보여 모두 사멸하였음에도 불구하고 PI 염색 시 FI 값이 2,000 이하로 나타나 PI 염색법으로 사균 진단이 완벽하지 않은 것을 확인하였다(내성진단 정확도 58%).
그러나 동일한 균주들을 AB로 염색 시, K20-014 한 균주를 제외하고는 이미페넴에 의해 사멸된 균주들의 경우, 모두 6,000 이하의 FI 값을 보여 사균인 것으로 진단되어(내성진단 정확도 92%), PI 및 AB를 이중으로 사용할 경우 이미페넴 내성을 보다 정확하게 판별할 수 있음을 확인하였다. 즉, 이미페넴 처리 후, PI 염색 시 FI 값 2,000 이하를 가지면서 동시에 AB 염색 시 FI 값 6,000 이상을 가지는 균주는 한 종도 없었으므로 검사한 12종의 E. coli 균주는 모두 이미페넴에 감수성을 가진 것으로 결론지을 수 있었으며, 이러한 결과는 콜로니 카운팅 분석 결과와도 일치하였다.
8) 세포 염색법을 이용한 이미페넴 내성균 판별법 최적화 및 적용
4종의 이미페넴 내성 다발성 병원균에 PI 및 AB 세포 이중 염색법을 적용하여 내성 여부를 평가한 결과, PI 염색으로 P. aeruginosa , E. coli , K. pneumoniae를 포함하는 3종의 균에서 이미페넴에 의한 내성균 판별이 가능하였으며, AB 염색으로 A. baumannii와 E. coli를 포함하는 2종의 균에서 이미페넴 내성균 판별이 가능하였다. 이를 통해, PI 및 AB를 이용한 한 가지 종류 이상의 염색법에서 내성 기준지표를 충족하는 균의 경우, 이미페넴에 대한 내성이 있는 것으로 판단할 수 있다.
<실시예 3> 세균 증식 속도로 보정된 세포 이중 염색법에 의한 이미페넴(imipenem) 내성균 판별
같은 종에 속한 균종이더라도 배양액 내 증식 속도가 상이한 경우가 빈번하게 발생하는 바, 세포 수에 비례하여 염색되는 기존 방법의 경우 세균의 증식 속도를 고려하지 않으면 내성균 판별의 정확성이 떨어지는 한계가 있었다. 따라서 항생제 내성균을 신속하게 진단하기 위해 개발된 본 발명의 세포 이중 염색법의 한계점을 보완하고자 하였다.
이에, 항생제 처리 후 염색된 형광도 값을 세균 수에 비례하여 측정되는 흡광도 값(OD600)으로 보정하여, PI로 염색 시 형광도(FI = PI 염색 시 형광 값/6시간 배양 후의 OD600 값) 값이 0.001 ~ 5,000일 때 내성으로 판별하는 새로운 기준값을 확립하였다.
또한, 균종에 따라 생균 및 사균의 여부와 관계없이 PI 및 AB에 비특이적으로 염색되는 경우가 빈번하게 관찰되어 이를 보완하고자 염색비율 값을 적용하였다. 생균임에도 PI로 염색되거나 AB로 염색이 되지 않을 수 있고, 사균임에도 PI로 염색이 되지 않거나 AB로 염색이 될 수 있는 경우를 고려하지 않은 기존의 방법은 내성진단 정확도가 68.5% 수준이었으나, 비특이적으로 염색될 수 있는 변수를 고려하여 각 균주로부터 얻어진 염색비율 값을 적용하는 경우 75.7%로 내성진단 정확도를 개선할 수 있었다. 특히 개선된 내성 진단법은 내성이 빈번하게 발생하는 A. baumannii의 내성을 평가하는데 특화되었음을 확인하였다(기존 세포 이중 염색법을 이용한 내성진단 정확도: 38.7%, 염색비율 값으로 보정된 세포 이중 염색법을 이용한 내성진단 정확도: 75%).
1) 세균 증식 속도로 보정된 PI 세포 염색법을 이용한 이미페넴 내성균 판별
카바페넴에 내성이 빈번하게 발생하는 4종의 균주 중 이미페넴 항생제에 저항성이 없는 균주를 대상으로 PI 염색 시 생균과 사균을 얼마나 구분할 수 있는지를 확인하였다. 균종 및 균주에 상관없이 1 X 108 CFU에 이미페넴을 10 μg/mL로 처리하고 6시간 반응시킨 후 PI(2 μM)로 염색한 후, FI 값을 계산하였다. 이때 OD600 값으로 보정된 FI 값이 5,000 이상일 경우, 세포가 사멸한 것으로 판별하였다(도 11). 사용된 12종의 균주는 이미페넴에 저항성이 없기 때문에 판별 결과 모두 민감성 균주로 판단되어야 한다. 그러나 ATCC 27853 및 ATCC 10145의 경우, 항생제의 유무에 따라 FI 값에서 큰 차이가 나는 것으로 보이지만 5,000이라는 기준값으로 판단을 하면 IMP-에서 5,000 이상의 값을 보여 사멸한 것으로 판단되기 때문에 민감성 균주로 판단이 불가능하다. 따라서 이와 같은 문제점을 보완하기 위해 항생제 유무에 따른 FI 값의 비율을 이용하여 세포 염색을 이용한 IMP 내성 판별법을 보완하고자 하였다.
2) AB 세포 염색을 이용한 IMP 내성 판별
카바페넴에 내성이 빈번하게 발생하는 4종의 균주 중 이미페넴 항생제에 저항성이 없는 균주를 대상으로 AB 염색 시 생균과 사균을 얼마나 잘 구분할 수 있는지 확인하였다. 균종 및 균주에 상관없이 1 X 108 CFU에 이미페넴을 10 μg/mL로 처리하고 6시간 반응시킨 후 AB(10%)로 염색한 후 1시간 동안 반응시키고 FI 값을 계산하였다. 이때 FI 값이 6,000 이상일 경우, 세포가 살아있는 것으로 판별하였다(도 12). 사용된 8종의 균주는 이미페넴에 저항성이 없기 때문에 판별 결과 모두 민감성 균주로 판별되어야 한다. 그러나 ATCC 11775 및 NCCP 16054의 경우, 항생제 유무에 따른 FI 값에서 큰 차이가 나는 것으로 보이지만 6,000이라는 기준값으로 판단을 하면 ATCC 11775의 경우 IMP+에서 FI가 6,000 이상의 값을 보여 생균으로 판단되고, NCCP 16054의 경우 IMP-에서 6,000 이하의 값을 보여 사균으로 판단되므로 실제 내성 결과와 일치하지 않게 된다. 따라서 이와 같은 문제점을 보완하기 위해 항생제 유무에 따른 FI 값의 비율을 이용하여 세포 염색을 이용한 IMP 내성 판별법을 보완하고자 하였다.
3) 염색비율 값(Fold Change)을 이용한 이미페넴 내성균 판별
PI 와 AB를 이용한 세포 이중 염색법으로 획득한 각각의 FI 값 이용하여 내성균을 판별하였다.
① 특정 균주에서 이미페넴 유무에 따라 PI 염색으로 획득한 FI 값을 PIIMP+/PIIMP-(항생제를 처리하였을 때의 FI 값/항생제를 처리하지 않았을 때의 FI 값, 상기 FI의 값은 OD600으로 보정된 값임)으로 나타내었다.
② 특정 균주에서 이미페넴 유무에 따라 AB 염색으로 획득한 FI 값을 ABIMP+/ABIMP-(항생제를 처리하였을 때의 FI 값/항생제를 처리하지 않았을 때의 FI 값)으로 나타내었다.
③ PI 값의 염색비율 값이 2.00 이하이거나, AB 값의 염색비율 값이 0.95 이상일 때, 이미페넴에 내성이 있는 것으로 평가하였다(도 14 및 16).
④ PI 값의 염색비율 값이 5.47 이상이거나, AB 값의 염색비율 값이 0.29 이하일 때, 이미페넴에 민감성이 있는 것으로 평가하였다(도 13 및 도 15).
보다 상세하게는, 하기 표 2와 같이, PI의 염색비율 값이 2.00 이하인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단하거나, PI의 염색비율 값이 2.00 초과 5.47 미만인 경우, 세균에 항생제 민감성과 내성이 중간(intermediate)인 것으로 판단하거나, PI의 염색비율 값이 5.47 이상인 경우, 세균에 항생제 민감성이 있는 것으로 판단할 수 있다. 또한, 상기 AB의 염색비율 값이 0.29 이하인 경우, 세균에 항생제 민감성이 있는 것으로 판단하거나, AB의 염색비율 값이 0.29 초과 0.95 미만인 경우, 세균에 항생제 민감성과 내성이 중간(intermediate)인 것으로 판단하거나, AB의 염색비율 값이 0.95 이상인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단할 수 있다.
PI AB
내성 2.00 이하 0.95 이상
민감성과 내성의 중간 2.00 초과 5.47 미만 0.29 초과 0.95 미만
민감성 5.47 이상 0.29 이하
4) PI 염색 시 FI 값의 비율을 이용한 이미페넴 내성균 판별
4-1) 고-민감성 기준값(Hyper-sensitivity cut-off value)
같은 민감성 균종이라도 균주 마다 PI로 염색되는 정도가 다르며, 균이 생균임에도 PI로 염색되거나 사균임에도 PI로 염색이 잘 되지 않는 경우가 존재한다. 이러한 문제점으로 인해 이중 염색법에서는 고정된 기준값(cut of value)으로 내성균을 판별하는데 어려움이 있었다. 따라서 생균 및 사균의 여부와 관계없이 비특이적으로 염색이 되는 점을 보완할 수 있는, 항생제 유무에 따른 염색비율 값(fold change)을 이용하여 내성균을 판별하고자 하였다.
먼저 세포 염색을 이용한 IMP 내성 판별법에 염색비율 값을 적용하여 내성균 판별을 보완할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 도 11에서 PI 염색 시 IMP 여부에 따라 얻어진 FI 값들 간 비율(PIIMP+/PIIMP- = 항생제를 처리하였을 때의 FI 값/항생제를 처리하지 않았을 때의 FI 값)을 그래프로 나타내었다(도 13). 그 결과, 모두 민감성 균주로 이미페넴 처리 시 모든 균종이 사멸하는 바, 사균을 염색하는 PI를 처리하였을 때, IMP-에서의 FI 값보다 IMP+에서의 FI 값이 높게 나타났으며 모든 균주의 PIIMP+/PIIMP- 값이 > 1 임을 확인할 수 있었다. 또한 예상했던 대로 균주마다 PI에 의해 염색되는 정도가 다르기 때문에 민감성 균주임에도 다양한 염색비율 값이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 현상을 통해 확실한 민감성 균주지만 PI에 의한 사균과 생균의 염색 차이가 가장 작은, 즉 1보다 큰 염색비율 값을 보이는 민감성 균주들 중 가장 낮은 염색비율 값을 가지는 ATCC 27853(PIIMP+/PIIMP- = 5.47) 균주를 이용하여 염색비율 값 5.47을 고-민감성 기준값으로 설정하였다.
상기 방법을 통하여 PI에 의한 염색 반응성이 다양한 균주들도 확실하게 내성 여부를 판별할 수 있었다. 설정된 고-민감성 기준값을 나머지 11종의 균주에 적용시킨 결과, 모두 고 민감성 균주로 판별되었다. 특히 염색비율 값으로 개선된 이중 염색법을 이용하였을 때, ATCC 27853 및 ATCC 10145가 민감성 균주로 판별된 바(도 13), 기존의 배양법에 근거한 내성 판별검사 결과와 일치하는 것을 확인하였다.
4-2) 내성 기준값
내성 균주의 판별을 위한 기준값을 결정하기 위해 IMP 내성임을 확인한 4종의 균주를 이용하였다. 내성균 4종을 대상으로 PI 염색 시 IMP 여부에 따라 얻어진 FI 값들 간 비율(PIIMP+/PIIMP- = 항생제를 처리하였을 때의 FI 값/항생제를 처리하지 않았을 때의 FI 값)을 그래프로 나타내었다(도 14). 모두 내성을 나타내는 균주임에도 PI로 염색되는 정도가 다르기 때문에 각기 다른 염색비율 값을 나타내게 된다. 이론 상 내성 균주라면 항생제의 유무와 관계없이 균이 동일하게 잘 자라기 때문에 염색비율 값은 1이 나오게 된다. 그러나 모든 내성 균주의 내성 정도가 동일하다고 단정 지을 수 없으며, 이로 인해 고농도의 항생제가 처리되었을 경우 어느 정도 생장 저해 효과 또는 일부 사멸 효과가 나타날 가능성이 있다. 따라서 내성 균주라 하더라도 항생제를 처리를 하지 않았을 때 보다 항생제를 처리하였을 때 PI에 의해 더 높은 염색이 될 수 있다.
이러한 점을 반영하여 PIIMP+/PIIMP- 값이 1 이상으로 확실한 내성균이지만 항생제를 처리하였을 때, PI에 의한 염색 가능성으로 인해 가장 큰 PIIMP+/PIIMP- 값을 나타내는 균주 A48(PIIMP+/PIIMP- = 2.00)을 이용하여 내성 기준값을 2.0으로 설정하였다. 설정된 기준값을 나머지 3종의 균주에 적용시킨 결과, 모두 내성균으로 판별되었다(도 14).
5) AB 염색 시 FI 값의 비율을 이용한 이미페넴 내성균 판별
5-1) 고-민감성 기준값
같은 민감성 균종이라도 균주마다 AB로 염색되는 정도가 다르며, 사균임에도 AB로 염색되거나 생균임에도 AB로 염색이 잘 되지 않는 경우가 존재한다. 이러한 문제점으로 인해 이중 염색법에서는 고정된 기준값(cut-off value)으로 내성균을 판별하는데 어려움이 있었다. 따라서 생균 및 사균의 여부와 관계없이 비특이적으로 염색이 되는 점을 보완할 수 있는, 항생제 유무에 따른 염색비율 값(fold change)을 이용하여 내성균을 판별하고자 하였다.
먼저 세포 염색을 이용한 IMP 내성 판별법에 염색비율 값을 적용하여 내성균 판별을 보완할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 도 12에서 AB 염색 시 IMP 여부에 따라 얻어진 FI 값들 간 비율(ABIMP+/ABIMP- = 항생제를 처리하였을 때의 FI 값/항생제를 처리하지 않았을 때의 FI 값)을 그래프로 나타내었다(도 15). 그 결과, 모두 민감성 균주로 이미페넴 처리 시 모든 균종이 사멸하는 바, 생균을 염색하는 AB를 처리하였을 때, IMP+에서의 FI 값보다 IMP-에서의 FI 값이 높게 나타났으며 모든 균주의 ABIMP+/ABIMP- 값이 < 1 임을 확인할 수 있었다. 또한 예상했던 대로 균주마다 AB에 의해 염색되는 정도가 다르기 때문에 민감성 균주임에도 다양한 염색비율 값이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 현상을 통해 확실한 민감성 균주지만 AB에 의한 사균과 생균의 염색 차이가 가장 작은, 즉 1보다 작은 염색비율 값을 보이는 민감성 균주들 중 가장 높은 염색비율 값을 가지는 ATCC 25922(ABIMP+/ABIMP- = 0.29) 균주를 이용하여 염색비율 값 0.29를 고-민감성 기준값으로 설정하였다.
상기 방법을 통하여 AB에 의한 염색 반응성이 다양한 균주들도 확실하게 내성 여부를 판별을 할 수 있었다. 설정된 고-민감성 기준값을 나머지 7종의 균주에 적용시킨 결과, 모두 고 민감성 균주로 판별되었다. 특히 염색비율 값으로 개선된 이중 염색법을 이용하였을 때, ATCC 11775 및 NCCP 16054가 민감성 균주로 판별된 바(도 15), 기존의 배양법에 근거한 내성판별 검사 결과와 일치하는 것을 확인하였다.
5-2) 내성 기준값
내성 균주의 판별을 위한 기준값을 결정하기 위해 IMP 내성임을 확인한 4종의 균주를 이용하였다. 내성균 4종을 대상으로 AB 염색 시 IMP 여부에 따라 얻어진 FI 값들 간 비율(ABIMP+/ABIMP- = 항생제를 처리하였을 때의 FI 값/항생제를 처리하지 않았을 때의 FI 값)을 그래프로 나타내었다(도 16). 모두 내성을 나타내는 균주임에도 AB로 염색되는 정도가 다르기 때문에 각기 다른 염색비율 값을 나타내게 된다. 이론 상 내성 균주라면 항생제의 유무와 관계없이 균이 동일하게 잘 자라기 때문에 염색비율 값이 1이 나오게 된다. 그러나 모든 내성 균주의 내성 정도가 동일하다고 단정 지을 수 없으며, 이로 인해 고농도의 항생제가 처리되었을 경우 어느 정도 생장 저해 효과 또는 일부 사멸 효과가 나타날 가능성이 있다. 따라서 내성 균주라 하더라도 항생제를 처리하였을 때 보다 항생제를 처리하지 않았을 때 AB에 의해 더 높은 염색이 될 수 있다.
이러한 점을 반영하여 ABIMP+/ABIMP- 값이 1 근처의 값으로 확실한 내성균이지만 항생제를 처리하였을 때, AB에 의한 염색 정도가 약화되는 가능성으로 인해 가장 낮은 ABIMP+/ABIMP- 값을 나타내는 균주 A48(ABIMP+/ABIMP- = 0.95)을 이용하여 내성 기준값을 0.95로 설정하였다. 설정된 기준값을 나머지 3종의 균주에 적용시킨 결과, 모두 내성균으로 판별되었다(도 16).
6) 염색비율 값으로 보정된 이미페넴 내성균 판별법을 다양한 임상균에 적용하여 항생제 내성 진단법의 정확도 평가
염색비율 값으로 보정된 세포 이중 염색법을 이용하여 내성 진단법의 실효성을 평가하기 위해, 카바페넴에 내성이 빈번하게 발생하는 4종의 100개의 균주를 대상으로 개선된 내성 진단법을 적용하여 이미페넴에 대한 내성 판별 결과를 기존 이중 염색법에 의한 결과와 비교하였다. 분석대상으로 한 총 100개의 균주의 내성 여부는 MIC 값을 통해 확인하였으며, MIC에 근거한 배양법 기반 내성 결과와 본 발명에서 개발된 진단법의 결과 간 일치정도를 분석하였다. 기존 개발된 이중 염색법을 이용하여 내성 여부를 판별한 결과, PI 염색으로 판별했을 때의 내성진단 정확도는 70%였고, AB 염색으로 판별했을 때의 내성진단 정확도는 42.5%였다. 그 중 내성이 빈번하게 발생하는 A. baumannii에서 내성진단 정확도는 PI 염색으로 판별하였을 때 40%로 낮았으며, AB 염색으로 판별했을 때는 15%로 진단 및 판별의 어려움이 존재하였다(표 2, 도 17).
반면, 동일한 균주들을 염색비율 값으로 보완하여 개선된 염색법을 이용하여 내성 여부를 판별한 결과, PI 염색으로 판별했을 때의 내성진단 정확도는 85%였고, AB 염색으로 판별했을 때의 내성진단 정확도는 66.3%였다. 그 중 내성이 빈번하게 발생하는 A. baumannii에서 내성진단 정확도는 PI 염색으로 판별하였을 때 90%였며, AB 염색으로 판별했을 때는 60%로 기존 이중 염색법으로 판별할 때보다 훨씬 높은 정확도를 나타내는 것을 확인하였다(표 3, 도 18).
따라서 염색비율 값으로 개선된 이중 염색법을 이용하는 경우 이미페넴 내성을 보다 정확하게 판별할 수 있어 기존의 이중 염색법의 한계를 극복할 수 있음을 확인하였다.
정확도(%) A. baumannii
(40 균주)		 P. aeruginosa
(20 균주)		 E. coli
(20 균주)		 K. pneumoniae
(20 균주)
PI 40 60 95 85
AB 15 5 75 75
정확도(%) A. baumannii
(40 균주)		 P. aeruginosa
(20 균주)		 E. coli
(20 균주)		 K. pneumoniae
(20 균주)
PI 90 75 100 75
AB 60 25 95 80
7) 염색비율 값을 이용한 세포 이중 염색법에 의한 내성균 진단기술의 보완 및 임상균 적용
염색비율 값을 이용하여 4 종의 이미페넴 내성 다발성 병원균을 대상으로 기존에 개발하였던 세포 이중 염색법을 이용한 내성균 진단법을 보완하였다. 염색비율 값을 적용시키기 위해 내성 유무가 밝혀진 14종의 표준균주를 대상으로 내성과 민감성 균주를 판별할 수 있는 염색비율의 기준값을 결정하였다. 이를 여러 임상균에 적용시킨 결과, 기존의 세포 이중 염색법으로 판단했을 때 보다 높은 내성진단 정확도를 나타내는 것을 확인하였다. 이중 내성이 빈번하게 발생하는 A. baumannii에서의 내성을 평가하는데 특화되었음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (17)

  1. 항생제가 포함된 배지, 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI) 및 알라마르 블루(Alamar blue)를 포함하는 항생제 내성균의 신속 진단 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항생제는 카바페넴계 항생제인 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 키트.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 카바페넴계 항생제는 이미페넴, 메로페넴, 베타미프론, 실라스타틴, 파니페넴, 도리페넴, 바이아페넴 및 테비페넴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 키트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항생제 내성균은 항생제 저항성을 가진 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 선택되는 어느 하나 이상의 세균인 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 키트.
  5. 1) 항생제가 포함된 배지에서 세균을 배양하는 단계;
    2) 상기 세균이 포함된 배양액의 흡광도를 측정하는 단계;
    3) 상기 세균에 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI)을 처리하고 PI 형광도를 측정하는 단계;
    4) 상기 단계 3)에서 형광도 측정이 끝난 세균에 알라마르 블루(Alamar blue; AB)를 처리하고 AB 형광도를 측정하는 단계; 및
    5) 상기 단계 3)의 PI 형광도를 단계 2)의 흡광도로 나누어 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도를 계산하는 단계;
    를 포함하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 1)에서, 상기 항생제는 8 ㎍/ml 내지 70 ㎍/ml로 포함되는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 1)에서, 상기 세균은 1 X 108 CFU/ml 내지 1 X 1010 CFU/ml로 존재하는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 2)에서, 흡광도는 세균을 4 내지 8시간 동안 배양한 후 OD600에서 측정된 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 4)에서, AB 형광도가 6,000 이상 60,000 이하인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 5)에서, 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도가 0.001 이상 5,000 이하인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 단계 5) 이후, 단계 4)의 AB 형광도 또는 단계 5)의 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도를 항생제가 포함되지 않은 조건에서의 AB 형광도 또는 세균 증식 속도로 보정된 PI 형광도로 나누어 AB 또는 PI의 염색비율 값을 계산하는 단계;를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 PI의 염색비율 값이 2.00 이하인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단하거나, PI의 염색비율 값이 2.00 초과인 경우, 세균에 항생제 민감성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 AB의 염색비율 값이 0.95 미만인 경우, 세균에 항생제 민감성이 있는 것으로 판단하거나, AB의 염색비율 값이 0.95 이상인 경우, 세균에 항생제 내성이 있는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  14. 제 5 항에 있어서, 상기 항생제는 카바페넴계 항생제인 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 카바페넴계 항생제는 이미페넴, 메로페넴, 베타미프론, 실라스타틴, 파니페넴, 도리페넴, 바이아페넴 및 테비페넴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  16. 제 5 항에 있어서, 상기 신속 진단 방법은 1시간 내지 12시간 내에 이루어지는 것을 특징으로 하는, 항생제 내성균의 신속 진단 방법.
  17. 제 5 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항생제 내성균은 항생제 저항성을 가진 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)에서 선택되는 어느 하나 이상의 세균인 것을 특징으로 하는 항생제 내성균의 신속 진단 방법.

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