KR20190062290A

KR20190062290A - 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20190062290A
Application number: KR1020180148846A
Authority: KR
Inventors: 서민구; 윤상원; 고성렬; 이준원; 박병순; 최은욱
Original assignee: (주)프로스테믹스
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-06-05
Also published as: KR102138495B1; WO2019103581A1

Abstract

본 발명은 다양한 용도로 사용될 수 있는 miRNA 중합체와 그 제조 방법을 제공하는 것으로, 보다 상세하게는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 목적하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥; 및 목적하는 제2 올리고뉴클레오티드 및 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;을 포함하며, 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있고, 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

Description

이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 및 그 제조 방법{miRNA polymer and the method for preparing the same}

본 발명은 다양한 용도로 사용될 수 있는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드와, 그 제조 방법에 관한 것이다.

마이크로 RNA(micro RNA; miRNA)는 18-25 뉴클레오티드(nucleotide, nt)로 구성된 작은 비-암호화 RNA로서, 표적 유전자의 3'-비번역 부위(untranslated region, UTR)에 결합하여 유전자 발현을 조절하고(Bartel DP, et al., Cell 116: 281-297, 2004; Lewis BP, et al., Cell 120: 15-20, 2005), 인트론(intron), 엑손(exon) 또는 유전자 간 부위(intergenic region)로부터 공정된다(Rodriguez A, et al., Genome Res14: 1902-1910, 2004). 첫째로, miRNA는 수천 개의 뉴클레오티드를 포함하는 초기 miRNA(pri-miRNA) 분자 내로 RNA 폴리머라아제 에 의해 전사된다. 그런 다음, pri-miRNA는 miRNA 전구체로 알려진 대략 70 nt 줄기 고리 중간체를 형성하기 위해 마이크로프로세서[DroshaRNase 엔도뉴클레아제 및 디조지증후군 부위 유전자 8 단백질(DroshaRNase endonuclease and DiGeorge syndrome region gene 8 protein, DGCR8)]에 의해 연속적으로 공정된다(Lee Y, et al., EMBO J21: 4663-4670, 2000; Zeng Y, et al., Proc Natl Acad Sci U S A100: 9779-9784, 2003). 그런 다음, pre-miRNA는 엑소폴틴-5(Exportin-5, EXP5)와 공동인자 Ran-GTP를 통해 핵으로부터 세포질로 이동되고, 여기서 pre-miRNA는 RNase 엔도뉴클레아제 다이서에 의해 18-25 nt 성숙 miRNA 듀플렉스(duplexe)로 공정된다(Lee Y, et al., EMBO J23: 4051-4060, 2004; Shenouda SK, et al., Cancer Metastasis Rev28: 369-378, 2009). 성숙 miRNA 듀플렉스는 RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC) 내로 아르고노트(Argonaute) 단백질과 단일 가닥 RNA로서 통합되고, 이는 표적 mRNA의 절단 또는 번역 억제 중 어느 하나를 유도한다(Diederichs S, et al., Cell131: 1097-1108, 2007; Hammond SM, et al., Nature404: 293-296, 2000; Martinez et al., Cell 110: 563-574, 2002).

본 발명은 다양한 용도로 사용될 수 있는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드와 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 용어 "혼성화(hybridization)"란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥의 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.

본 명세서에서 용어 "상보적"이라 함은 올리고뉴클레오타이드의 양 가닥이 염기쌍을 형성할 수 있음을 의미한다.　상보적 올리고뉴클레오타이드의 양 가닥은 왓슨-크릭 방식으로 염기쌍을 형성하여 이중 가닥을 형성한다. 본 발명에서 염기 U가 언급되는 경우, 별다른 언급이 없는 한 염기 T로 치환가능하다.

본 발명에서 상기 "올리고뉴클레오티드"는 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드 분자이며, 보다 바람직하게는 RNA 분자인 올리고리보뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드는 자연 발생 또는 변형된, 비-자연 발생 염기를 함유할 수 있고, 변형된 당, 포스페이트, 및/또는 말단을 함유할 수 있다. 예를 들어, 포스포디에스테르 연결 이외에도, 포스페이트 변형은 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 (가교 또는 비-가교), 포스포트리에스테르 및 포스포로디티오에이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결 단독, 포스포디에스테르 연결 단독, 또는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결의 조합을 갖는다.

관련 기술분야에 공지된 당 변형, 예컨대 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라 및 본원에 기재된 다른 것이 또한 제조되고 임의의 포스페이트 변형과 조합될 수 있다. 염기 변형의 예는 상기 올리고뉴클레오티드의 시토신 (예를 들어, 5-브로모시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-아이오도시토신)의 C-5 및/또는 C-6에 대한 전자-끄는 모이어티의 첨가 및 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 우라실 (예를 들어, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-아이오도우라실)의 C-5 및/또는 C-6에 대한 전자-끄는 모이어티의 첨가를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드의 회문식 서열에서의 염기 변형의 사용은 왓슨-크릭 염기 쌍형성을 위해 수반된 염기의 자기-상보성을 방해하여서는 안 된다. 그러나, 회문식 서열의 외부에서, 변형된 염기는 이러한 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 2'-O-메틸-우리딘 및 2'-O-메틸-시티딘은 회문식 서열의 외부에서 사용될 수 있는 반면에, 5-브로모-2'-데옥시시티딘은 회문식 서열 내부 및 외부 둘 다에서 사용될 수 있다. 회문식 서열의 내부 및 외부 둘 다에서 사용될 수 있는 다른 변형된 뉴클레오티드는 7-데아자-8-아자-dG, 2-아미노-dA, 및 2-티오-dT를 포함한다.

본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드는 포스페이트-변형된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 그의 일부는 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 안정화된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 포스페이트 연결 또는 비-포스페이트 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성은 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Matteucci "Oligonucleotide Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D.J. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY, 1997] 참조). 올리고뉴클레오티드에서 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 포스페이트 기)는, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 등일 수 있다. 상기-언급된 포스페이트 유사체의 제조 및 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드로의 그의 혼입은 이미 그 자체로 널리 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Peyrottes et al., Nucleic Acids Res, 24:1841-1848, 1996; Chaturvedi et al., Nucleic Acids Res, 24:2318-2323, 1996; 및 Schultz et al., Nucleic Acids Res, 24:2966-2973, 1996] 참조). 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성은 산화 단계가 황화 단계에 의해 대체된다는 것을 제외하고는 자연 발생 올리고뉴클레오티드에 대해 상기 기재된 것과 유사하다 (Zon "Oligonucleoside Phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190, 1993).

본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 (단독 또는 주요 당 성분으로서 리보스 함유), 데옥시리보뉴클레오티드 (주요 당 성분으로서 데옥시리보스 함유), 변형된 당 또는 당 유사체를 포함할 수 있다. 따라서, 리보스 및 데옥시리보스 이외에도, 당 모이어티는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 및 당 유사체 시클로펜틸기일 수 있다. 당은 피라노실 또는 푸라노실 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드에서, 당 모이어티는 바람직하게는 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-O-알킬(예: 메틸, 에틸)리보스의 푸라노시드이고, 당은 각 헤테로시클릭 염기에 아노머 배위로 부착될 수 있다. 당 변형은 2'-알콕시(예: 메톡시, 에톡시)-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-RNA, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 당 또는 당 유사체 및 이러한 당 또는 유사체가 그 자체로 헤테로시클릭 염기 (핵산 염기)에 부착되는 각 뉴클레오시드의 제조는 공지되어 있고, 따라서 여기서 기재될 필요는 없다. 당 변형은 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 제조에서 제조되고 임의의 포스페이트 변형과 조합될 수 있다.

본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드에 혼입된 헤테로시클릭 염기, 또는 핵산 염기는 자연 발생 주요 퓨린 및 피리미딘 염기 (즉 상기 언급된 바와 같은 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌) 뿐만 아니라, 상기 주요 염기의 자연 발생 및 합성 변형일 수 있다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이노신, 2'-데옥시우리딘 및 2-아미노-2'-데옥시아데노신 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들면 시험관 내 및 생체 내 개선된 효력 및 안정성을 포함한 각종 효과를 생성하는 것으로 당업계에 공지된 다양한 전략을 사용하여 변형될 수 있다. 그러한 전략 중에서 인공 핵산, 예를 들면 2'-O-메틸-치환된 RNA; 2'-플루오로-2'데옥시 RNA, 펩티드 핵산(PNA); 모르폴리노; 로킹된 핵산(LNA); 비로킹된 핵산(UNA); 가교된 핵산(BNA); 글리콜 핵산(GNA); 및 트레오스 핵산(TNA); 보다 일반적으로 핵산 유사체, 예를 들면 비시클릭 및 트리시클릭 뉴클레오시드 유사체이며, 이는 천연 발생 RNA 및 DNA와 구조적으로 유사하지만, 천연 발생 분자의 포스페이트 백본, 당 또는 핵염기 부분 중 하나 이상에서의 변형을 갖는다. 통상적으로, 유사체 핵염기는 무엇보다도 상이한 염기쌍 형성 및 염기 적층 성질을 부여한다. 그의 예는 4종의 캐논(canon) 염기와 쌍을 형성할 수 있는 보편적인 염기를 포함한다. 포스페이트-당 백본 유사체의 예는 PNA를 포함한다. 모르폴리노계 올리고머 화합물은 문헌[Braasch et al., Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002)] 및 미국 특허 제5,539,082호, 제5,714,331호, 제5,719,262호 및 제5,034,506호에 기재되어 있다.

본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드는 말단 단부에서 화학적 작용성 기로의 치환에 의하여 변형될 수 있다. 치환은 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 단부에서 수행될 수 있으며, 단량체의 센스 및 안티센스 가닥 둘다의 3' 단부에서 수행되는 것이 바람직하지만, 항상 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적 작용기는 예를 들면 술프히드릴 기(-SH), 카르복실 기(-COOH), 아민 기(-NH₂), 히드록시 기(-OH), 포르밀 기(-CHO), 카르보닐 기(-CO-), 에테르 기(-O-), 에스테르 기(-COO-), 니트로 기(-NO₂), 아지드 기(-N₃) 또는 술폰산 기(-SO₃H)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드로서,

목적하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥; 및

목적하는 제2 올리고뉴클레오티드 및 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;을 포함하며,

상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있고,

상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 하는 것으로, 서로 동일하거나 상이할 수 있으며 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않는다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 하는 것으로 알려진 miRNA(이하, '목적하는 제1 miRNA'라 한다.)의 전 사슬(full sequence) 또는 그 일부 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 하는 것으로 알려진 miRNA(이하, '목적하는 제2 miRNA'라 한다.)의 전 사슬(full sequence) 또는 그 일부 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 각각의 목적하는 miRNA로, 상기 목적하는 제1 miRNA 및 상기 목적하는 제2 miRNA는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명에서 상기 상기 목적하는 제1 miRNA 및 상기 목적하는 제2 miRNA 각각의 전 사슬의 길이는 특별히 제한하지는 않지만, 바람직하게는 18~25개의 뉴클레오티드(nucleotide: 이하, 'nt'라 한다.)의 길이일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드 각각은 성숙한 miRNA의 전 사슬 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체의 전 사슬 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 다만, 본 발명에서 상기 miRNA 전구체 또는 일차 miRNA를 구성하는 핵산 분자는 50 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65 내지 95nt 길이를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 miRNA 단편은, 목적하는 miRNA의 종자 서열(seed sequence)을 포함하거나, 상기 종자 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 miRNA를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "종자 서열(seed sequence)"이란 miRNA가 타겟을 인식할 때 완전한 상보성을 가지고 결합하는 miRNA 내 일부 영역의 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 miRNA가 타겟에 결합하기 위해 필수적으로 요구되는 부분이자 실질적으로 유효한 기능을 하는 부위이다.

본 발명에서 상기 miRNA 단편의 길이는 특별히 제한하지는 않지만, 바람직하게는 9~11 nt일 수 있다.

본 발명에서 상기 miRNA 단편은 목적하는 miRNA를 절단하여 제작하거나, 목적하는 miRNA의 어느 일 단편의 염기서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 미스 매칭(mis-matching) 뉴클레오티드 (즉, 비상보적 염기쌍)를 포함하여 버블 구조를 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 미스 매칭은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, 및 U:T로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 미스 매칭 뉴클레오티드를 포함하여 버블 구조를 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결되고, 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 바람직하게는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결되고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 두 가닥 각각은 제1 올리고뉴클레오티드(10) 및 제2 올리고뉴클레오티드(11)를 포함하고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에는, 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에는, 상기 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 두 가닥 각각은 제1 올리고뉴클레오티드(10) 및 제2 올리고뉴클레오티드(11)를 포함하고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 상기 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 연결될 수 있으나, 그 사이에 제1 링커로, 제1 링커 뉴클레오티드 또는 제1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으며, 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 연결될 수 있으나, 그 사이에 제2 링커로, 제2 링커 뉴클레오티드 또는 제2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있으며, 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 링커 및 제2 링커를 포함하는 경우, 이들은 이중 가닥 내에서 서로 대향하여 배치될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 제1 링커 및 제2 링커는 서로 상보적이거나 비상보적일 수 있고, 혹은 일부 서열이 미스 매칭되어 버블 구조를 형성할 수 있다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단은 제1 링커(300)를 통하여 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 연결될 수 있고, 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단은 제2 링커(300')를 통하여 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에 연결될 수 있다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단은 제1 링커(300)를 통하여 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 연결될 수 있고, 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단은 제2 링커(300')를 통하여 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 가닥의 5' 말단, 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에, 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 캡 뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드이거나, 목적하는 제1 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제1 캡 올리고뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 혹은 목적하는 제1 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 3 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드, 또는 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제2 가닥의 5' 말단, 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에, 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 캡 뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드이거나, 목적하는 제2 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제2 캡 올리고뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 혹은 목적하는 제2 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 3 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드, 또는 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이루고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에 상기 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 이때 상기 제1 가닥의 5' 말단인 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단에, 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)가 연장되고, 제2 가닥의 5' 말단인 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단에는, 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')가 연장될 수 있다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이루고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 이때 상기 제1 가닥의 5' 말단인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단에, 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)가 연장되고, 제2 가닥의 5' 말단인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단에는, 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')가 연장될 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 가닥의 3' 말단, 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단, 또는 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에, 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 말단 뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드이거나, 상기 목적하는 제1 miRNA의 3' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제1 말단 올리고뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 혹은 상기 목적하는 제1 miRNA의 3' 말단으로부터 1 번째 내지 3 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드, 또는 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제2 가닥의 3' 말단, 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단, 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에, 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 말단 뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드이거나, 상기 목적하는 제2 miRNA의 3' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제2 말단 올리고뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 혹은 상기 목적하는 제2 miRNA의 3' 말단으로부터 1 번째 내지 3 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드, 또는 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이루고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에 상기 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 이때 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)가 연장되고, 제2 가닥의 3' 말단인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에는 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')가 연장될 수 있다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이루고, 상기 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에 상기 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 이때 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)가 연장되고, 제2 가닥의 3' 말단인 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에는 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')가 연장될 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드; 및 상기 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드;를 포함하는 경우, 이들은 이중 가닥 내에서 서로 대향하여 배치될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드; 및 상기 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드;는 서로 상보적이거나 비상보적일 수 있고, 혹은 일부 서열이 미스 매칭되어 버블 구조를 형성할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드; 및 상기 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드;를 포함하는 경우, 이들은 이중 가닥 내에서 서로 대향하여 배치될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드; 및 상기 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드;는 서로 상보적이거나 비상보적일 수 있고, 혹은 일부 서열이 미스 매칭되어 버블 구조를 형성할 수 있다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 가닥의 5' 말단인 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)가 연장되고, 제2 가닥의 5' 말단인 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단에는 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')가 연장될 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 3' 말단인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에는 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')가 연장될 수 있다. 상기 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)는 상기 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')와 서로 대향하여 배치되고, 상기 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')는 상기 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)와 서로 대향하여 배치될 수 있다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 가닥의 5' 말단인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)가 연장되고, 제2 가닥의 5' 말단인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단에는 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')가 연장될 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 3' 말단인 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에는 제2 말단 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드(200')가 연장될 수 있다. 상기 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)는 상기 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')와 서로 대향하여 배치되고, 상기 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')는 상기 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)와 서로 대향하여 배치될 수 있다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에, 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단이 제1 링커(300)를 통하여 연결되어 제1 가닥을 이루고, 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단이 제2 링커(300')를 통하여 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 5' 말단인 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 5' 말단인 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단에는 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')가 연장될 수 있다.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단이 제1 링커(300)를 통하여 연결되어 제1 가닥을 이루고, 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단이 제2 링커(300')를 통하여 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 5' 말단인 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 5' 말단인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단에는 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')가 연장될 수 있다.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단이 제1 링커(300)를 통하여 연결되어 제1 가닥을 이루고, 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단이 제2 링커(300')를 통하여 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 3' 말단인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에는 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')가 연장될 수 있다.

도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단이 제1 링커(300)를 통하여 연결되어 제1 가닥을 이룰 수 있고, 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단이 제2 링커(300')를 통하여 연결되어 제2 가닥을 이룰수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 3' 말단인 제2 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에는 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')가 연장될 수 있다.

도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단이 제1 링커(300)를 통하여 연결되어 제1 가닥을 이룰 수 있고, 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단이 제2 링커(300')를 통하여 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 5' 말단인 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 5' 말단인 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단에는 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')가 연장될 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 3' 말단인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에는 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')가 연장될 수 있다. 이때, 상기 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)는 상기 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')와 서로 대향하여 배치되고, 상기 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')는 상기 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)와 서로 대향하여 배치되며, 상기 제1 링커(300)는 상기 제2 링커(300')와 서로 대향하여 배치될 수 있다.

도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 3' 말단에 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 5' 말단이 제1 링커(300)를 통하여 연결되어 제1 가닥을 이룰 수 있고, 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 3' 말단에 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 5' 말단이 제2 링커(300')를 통하여 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 5' 말단인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(20)의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 5' 말단인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(21)의 5' 말단에는 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')가 연장될 수 있다. 또한, 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1 올리고뉴클레오티드(10)의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)가 연장되고, 상기 제2 가닥의 3' 말단인 제2 올리고뉴클레오티드(11)의 3' 말단에는 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')가 연장될 수 있다. 이때, 상기 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드(100)는 상기 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드(200')와 서로 대향하여 배치되고, 상기 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드(100')는 상기 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드(200)와 서로 대향하여 배치되며, 상기 제1 링커(300)는 상기 제2 링커(300')와 서로 대향하여 배치될 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에 따르면, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드로서,

m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 a 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1 올리고뉴클레오티드 및 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥; 및

n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 b 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제2 올리고뉴클레오티드 및 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;을 포함하고,

상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있고,

상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있으며,

m 및 n은 각각 독립적으로 18 내지 25의 정수이고,

a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이며,

p는 10 내지 m의 정수이고,

q는 10 내지 n의 정수이다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드 각각은, 서로 동일하거나 상이한 목적하는 miRNA의 전 사슬 또는 그 단편을 포함하는 것으로, 보다 상세하게는 성숙한 miRNA, miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체의 전 사슬 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA(목적하는 제1 miRNA)와 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA(목적하는 제2 miRNA)는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드의 서열은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 2 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 2 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 미스 매칭 뉴클레오티드를 포함하여 버블 구조를 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열의 1 번째 내지 q-b 번째 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열의 1 번째 내지 q-b-1 번째 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열의 1 번째 내지 p-a 번째 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열의 1 번째 내지 p-a-1 번째 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 연결될 수 있으나, 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드 사이에 제1 링커로, 제1 링커 뉴클레오티드 또는 제1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 링커 뉴클레오티드는 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 p+1 번째 뉴클레오티드일 수 있다. 단, 여기서 상기 p는 10 내지 m-1의 정수일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 링커 올리고뉴클레오티드는 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 p+1 번째 내지 p+r 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 여기서 상기 r은 2 내지 4의 정수일 수 있다. 단, 여기서 상기 p는 10 이상의 정수이되, 그 최대값은 m-4 내지 m-2의 정수일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 직접적으로 연결될 수 있으나, 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드 사이에 제2 링커로, 제2 링커 뉴클레오티드 또는 제2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 링커 뉴클레오티드는 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 q+1 번째 뉴클레오티드일 수 있다. 단, 여기서 상기 q는 10 내지 n-1의 정수일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 링커 올리고뉴클레오티드는 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 q+1 번째 내지 q+s 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 여기서 상기 s는 2 내지 4의 정수일 수 있다. 단, 여기서 상기 q는 10 이상의 정수이되, 그 최대값은 n-4 내지 n-2의 정수일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 가닥의 5' 말단, 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 2 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열 또는 3 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열로 이루어지고, 이때 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 캡 뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지는 않으나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드이거나, 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제1 캡 올리고뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 혹은 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 3 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드, 또는 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제2 가닥의 5' 말단, 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 2 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열 또는 3 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열로 이루어지고, 이때 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 캡 뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지는 않으나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드이거나, 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제2 캡 올리고뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 혹은 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 3 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드, 또는 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제1 캡 뉴클레오티드 및 제2 캡 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드인 것이 타겟 유전자와의 상호 결합력을 높일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 캡 올리고뉴클레오티드 및 제2 캡 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드를 포함하는 것이 타겟 유전자와의 상호 결합력을 높일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 가닥의 3' 말단, 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 말단 뉴클레오티드의 서열을 특별히 제한하지는 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드이거나, 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 m 번째 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 말단 올리고뉴클레오티드의 서열을 특별히 제한하지는 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드를 포함하거나, 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 m-c 번째 내지 m 번째의 연속된 염기서열로 이루어질 수 있다. 여기서, 상기 c는 1 내지 3의 정수, 또는 1 또는 2의 정수일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 가닥의 3' 말단, 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단, 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 말단 뉴클레오티드의 서열을 특별히 제한하지는 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드이거나, 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 n 번째 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 말단 올리고뉴클레오티드의 서열을 특별히 제한하지는 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드를 포함하거나, 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 n-d 번째 내지 n 번째의 연속된 염기서열로 이루어질 수 있다. 여기서, 상기 d는 1 내지 3의 정수, 또는 1 또는 2의 정수일 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드로서,

목적하는 제1 miRNA 전구체의 어느 일 단편인 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 다른 일 단편인 제1-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥;

목적하는 제2 miRNA 전구체의 어느 일 단편인 제2-1 올리고뉴클레오티드 및 다른 일 단편인 제2-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;

목적하는 제1 miRNA 전구체의 또 다른 일 단편인 제1-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 가닥;

목적하는 제2 miRNA 전구체의 또 다른 일 단편인 제2-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 가닥을 포함하고,

상기 제1 가닥의 어느 일 말단은 상기 제2 가닥 또는 상기 제4 가닥의 어느 일 말단과 연결되며,

상기 제3 가닥의 어느 일 말단은 상기 제4 가닥 또는 상기 제2 가닥의 어느 일 말단과 연결되는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 제1 miRNA 전구체 및 제2 miRNA 전구체는 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 하는 것으로 알려진 miRNA(이하, '목적하는 miRNA'라 한다.)의 전구체로, 그 형상을 특별히 제한하지는 않으나 헤어핀(hairpin) 형상일 수 있다. 이를 구성하는 핵산 분자는 50 내지 150nt, 바람직하게는 60 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65 내지 95nt 길이를 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 miRNA 전구체 및 제2 miRNA 전구체는 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드 각각은 상기 제1 miRNA 전구체의 임의의 단편이고, 이들 서열은 서로 전혀 상이하거나, 일부 중복되거나, 동일할 수 있으며, 이들의 서열은 특별히 제한하지 않는다.

다만, 본 발명에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 miRNA 전구체에 연속하여 배치되되, 다이서(dicer)의 작용에 의해 절단될 수 있는 임의의 두 단편일 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드는 인체 내에서 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 수행하는 miRNA의 전 서열 또는 종자 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드, 제2-2 올리고뉴클레오티드 및 제2-3 올리고뉴클레오티드는 각각은 상기 제2 miRNA 전구체의 임의의 단편이고, 이들 서열은 서로 전혀 상이하거나, 일부 중복되거나, 동일할 수 있으며, 이들의 서열은 특별히 제한하지 않는다.

다만, 본 발명에서 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 miRNA 전구체에 연속하여 배치되되, 다이서의 작용에 의해 절단될 수 있는 임의의 두 단편일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드는 인체 내에서 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 수행하는 miRNA의 전 서열 또는 종자 서열을 포함할 수 있다.

도 17 내지 24는 본 발명의 일 실시예 따라 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체에서 제1-1 올리고뉴클레오티드(50a), 제1-2 올리고뉴클레오티드(50b) 및 제1-3 올리고뉴클레오티드(50c)의 배치의 일 예시를 나타낸 것으로, 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드(50a), 제1-2 올리고뉴클레오티드(50b) 및 제1-3 올리고뉴클레오티드(50c) 각각은 상기 제1 miRNA 전구체의 5'-3' 방향 또는 3'-5' 방향으로 연속하여 배치되는 임의의 세 절편일 수 있다. 여기서, 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드는 인체 내에서 상기 제1 miRNA 전구체로부터 절단되어 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 수행하는 miRNA의 전 서열 또는 종자 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드는, 이에 제한되는 것은 아니지만 상기 제1 miRNA 전구체 내에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드에 이웃하여 배치되는 단편으로, 다이서(dicer)의 작용에 의해 상기 1-1 올리고뉴클레오티드와 분리 및 절단될 수 있다. 또한, 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드는 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 헤어핀 형상의 제1 miRNA 내 루프(loop)에 위치하는 임의의 두 단편일 수 있다.

본 발명에서 도면으로 도시하지는 않았지만, 제2-1 올리고뉴클레오티드, 제2-2 올리고뉴클레오티드 및 제2-3 올리고뉴클레오티드 또한 상기 제2 miRNA 전구체의 5'-3' 방향 또는 3'-5' 방향으로 연속하여 배치되는 임의의 세 절편일 수 있다. 여기서, 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드는 인체 내에서 상기 제2 miRNA 전구체로부터 절단되어 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 수행하는 miRNA의 전 서열 또는 종자 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드는, 이에 제한되는 것은 아니지만 상기 제2 miRNA 전구체 내에서 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드에 이웃하여 배치되는 단편으로, 다이서(dicer)의 작용에 의해 상기 2-1 올리고뉴클레오티드와 분리 및 절단될 수 있다. 또한, 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드는 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 헤어핀 형상의 제1 miRNA 내 루프(loop)에 위치하는 임의의 두 단편일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 상기 제1 가닥에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드와 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드는 직접 연결될 수 있지만, 혹은 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드와 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드 사이에 제1-1 링커로, 제1-1 링커 뉴클레오티드 또는 제1-1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 제2 가닥에서 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드와 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드는 직접 연결될 수 있지만, 혹은 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드와 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드 사이에 제2-1 링커로, 제2-1 링커 뉴클레오티드 또는 제2-1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제3 가닥은 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 미스 매칭 뉴클레오티드를 포함하여 버블 구조를 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 제3 가닥에서 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 직접 연결될 수 있지만, 혹은 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드 사이에 제1-2 링커로, 제1-2 링커 뉴클레오티드 또는 제1-2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-1 링커 및 제1-2 링커를 포함하는 경우, 이들은 이중 가닥 내에서 서로 대향하여 배치될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 제1-1 링커 및 제1-2 링커는 서로 상보적이거나 비상보적일 수 있고, 혹은 일부 서열이 미스 매칭되어 버블 구조를 형성할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드는 서로 상보적이거나 비상보적일 수 있고, 혹은 일부 서열이 미스 매칭되어 버블 구조를 형성할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제4 가닥은 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 미스 매칭 뉴클레오티드를 포함하여 버블 구조를 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드와 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드는 직접 연결될 수 있지만, 혹은 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드와 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드 사이에 제2-2 링커로, 제2-2 링커 뉴클레오티드 또는 제2-2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-1 링커 및 제2-2 링커를 포함하는 경우, 이들은 이중 가닥 내에서 서로 대향하여 배치될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 제2-1 링커 및 제2-2 링커는 서로 상보적이거나 비상보적일 수 있고, 혹은 일부 서열이 미스 매칭되어 버블 구조를 형성할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드는 서로 상보적이거나 비상보적일 수 있고, 혹은 일부 서열이 미스 매칭되어 버블 구조를 형성할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 가닥의 어느 일 말단은 상기 제2 가닥 또는 상기 제4 가닥의 어느 일 말단과 연결될 수 있다. 바람직하게는 상기 제1 가닥의 3' 말단은 상기 제2 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제1 가닥의 3' 말단은 상기 제4 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제2 가닥의 3' 말단은 상기 제1 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제4 가닥의 3' 말단은 상기 제1 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제3 가닥의 어느 일 말단은 상기 제4 가닥 또는 상기 제2 가닥의 어느 일 말단과 연결될 수 있다. 바람직하게는 상기 제4 가닥의 3' 말단은 상기 제3 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제2 가닥의 3' 말단은 상기 제3 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제3 가닥의 3' 말단은 상기 제4 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제3 가닥의 3' 말단은 상기 제2 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있다.

도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1-1 올리고뉴클레오티드(50a)의 3' 말단에 제1-2 올리고뉴클레오티드(50b)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이루고, 제2-2 올리고뉴클레오티드(60b)의 3' 말단에 제2-1 올리고뉴클레오티드(60a)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 제1-3 올리고뉴클레오티드(50c)의 3' 말단에 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드(50a)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(70)의 5' 말단이 연결되어 제3 가닥을 이루고, 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드(60a)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(71)의 3' 말단에 제2-2 올리고뉴클레오티드(60b)의 5' 말단이 연결되어 제4 가닥을 이룰 수 있다. 이때 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1-2 올리고뉴클레오티드(50b)의 3' 말단에 상기 제2 가닥의 5' 말단인 제2-2 올리고뉴클레오티드(60b)의 5' 말단이 연결되어 하나의 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제4 가닥의 제2-3 올리고뉴클레오티드(60c)의 3' 말단에 상기 제3 가닥의 5' 말단인 제1-3 올리고뉴클레오티드(50c)의 5' 말단이 연결되어 다른 하나의 가닥을 이룰 수 있다.

도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1-1 올리고뉴클레오티드(50a)의 3' 말단에 제1-2 올리고뉴클레오티드(50b)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이루고, 제2-1 올리고뉴클레오티드(60a)의 3' 말단에 제2-2 올리고뉴클레오티드(60b)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 제1-3 올리고뉴클레오티드(50c)의 3' 말단에 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드(50a)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(70)의 5' 말단이 연결되어 제3 가닥을 이루고, 제2-3 올리고뉴클레오티드(60c)의 3' 말단에 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드(60a)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(71)의 5' 말단이 연결되어 제4 가닥을 이룰 수 있다. 이때 상기 제1 가닥의 3' 말단인 제1-2 올리고뉴클레오티드(50b)의 3' 말단에 상기 제4 가닥의 5' 말단인 제2-3 올리고뉴클레오티드(60c)의 5' 말단이 연결되어 하나의 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제2 가닥의 3' 말단인 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드(60b)의 3' 말단에 상기 제3 가닥의 5' 말단인 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드(50c)의 5' 말단이 연결되어 다른 하나의 가닥을 이룰 수 있다.

도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것으로, 제1-2 올리고뉴클레오티드(50b)의 3' 말단에 제1-1 올리고뉴클레오티드(50a)의 5' 말단이 연결되어 제1 가닥을 이루고, 제2-2 올리고뉴클레오티드(60b)의 3' 말단에 제2-1 올리고뉴클레오티드(60a)의 5' 말단이 연결되어 제2 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드(50a)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제1 연장 올리고뉴클레오티드(70)의 3' 말단에 제1-3 올리고뉴클레오티드(50c)의 5' 말단이 연결되어 제3 가닥을 이루고, 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드(60a)의 3'-5' 방향의 서열에 상보적인 제2 연장 올리고뉴클레오티드(71)의 3' 말단에 제2-3 올리고뉴클레오티드(60c)의 5' 말단이 연결되어 제4 가닥을 이룰 수 있다. 이때 상기 제1 가닥의 5' 말단인 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드(50b)의 5' 말단은 상기 제4 가닥의 3' 말단인 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드(60c)의 3' 말단이 연결되어 하나의 가닥을 이룰 수 있다. 또한, 상기 제3 가닥의 3' 말단인 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드(50c)의 3' 말단에 상기 제2 가닥의 5' 말단인 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드(60b)의 5' 말단이 연결되어 다른 하나의 가닥을 이룰 수 있다.

t 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제1 miRNA 전구체의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 A 번째 내지 B 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 B+e 번째 내지 B+f 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥;

u 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제2 miRNA 전구체의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 C 번째 내지 D 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-1 올리고뉴클레오티드 및 D+g 번째 내지 D+h 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;

상기 t 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제1 miRNA 전구체의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 B+w 번째 내지 B+x 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 가닥; 및

상기 u 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제2 miRNA 전구체의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 D+y 번째 내지 D+z 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 가닥을 포함하고,

상기 제3 가닥의 어느 일 말단은 상기 제4 가닥 또는 상기 제2 가닥의 어느 일 말단과 연결되고,

상기 t 및 u는 각각 독립적으로 60 내지 150의 정수이고,

상기 A 및 C는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이며,

상기 B 및 D는 각각 독립적으로 18 내지 25의 정수이고,

상기 e 및 g는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이며,

상기 f 및 h는 각각 독립적으로 5 내지 57의 정수이고,

상기 w 및 y는 각각 독립적으로 6 내지 62의 정수이며,

상기 x 및 z는 각각 독립적으로 11 내지 119의 정수일 수 있다.

다만, 본 발명에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 miRNA 전구체에 연속하여 배치되되, 다이서의 작용에 의해 절단될 수 있는 임의의 두 단편일 수 있다.

본 발명의 상기 제1 가닥에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제3 가닥은 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 상기 제4 가닥은 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서,

목적하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 준비하는 단계;

상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계; 및

상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 하는 것으로 알려진 목적하는 제1 miRNA의 전 사슬 또는 그 일부 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 하는 것으로 알려진 목적하는 제2 miRNA의 전 사슬 또는 그 일부 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 목적하는 제1 miRNA 및 상기 목적하는 제2 miRNA 각각의 전 사슬의 길이는 특별히 제한하지는 않지만, 바람직하게는 18~25개의 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드 각각은 상기한 바와 같이 성숙한 miRNA일 수 있으나, miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체의 전 사슬 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 다만, 본 발명에서 miRNA 전구체 또는 일차 miRNA를 구성하는 핵산 분자는 50 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65 내지 95nt 길이를 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 miRNA 단편은, 목적하는 miRNA의 종자 서열을 포함하거나, 상기 종자 서열과 90% 이상의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시키고, 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 바람직하게는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시키고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 가닥의 5' 말단, 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 가닥의 5' 말단, 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 직접적으로 연결시킬 수 있으나, 그 사이에 제1 링커로, 제1 링커 뉴클레오티드 또는 제1 링커 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 직접적으로 연결시킬 수 있으나, 그 사이에 제2 링커로, 제2 링커 뉴클레오티드 또는 제2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 가닥의 3' 말단, 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 말단 뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드이거나, 목적하는 제1 miRNA의 3' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제1 말단 올리고뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 혹은 목적하는 제1 miRNA의 3' 말단으로부터 1 번째 내지 3 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드, 또는 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제2 가닥의 3' 말단, 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단, 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 말단 뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드이거나, 목적하는 제2 miRNA의 3' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제2 말단 올리고뉴클레오티드의 서열은 특별히 제한하지 않으나, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 혹은 목적하는 제2 miRNA의 3' 말단으로부터 1 번째 내지 3 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드, 또는 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드; 및 상기 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드;를 연장하는 경우, 이들은 이중 가닥 내에서 서로 대향하여 배치될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드; 및 상기 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드;를 연장하는 경우, 이들은 이중 가닥 내에서 서로 대향하여 배치될 수 있다.

다만, 본 발명의 제조 방법에서 각 올리고뉴클레오티드를 합성하는 순서 및 합성된 각 올리고뉴클레오티드를 연결하는 순서는 특별히 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구체 예에 따르면, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법으로서,

m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 a 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1 올리고뉴클레오티드를 준비하는 단계;

n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 b 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제2 올리고뉴클레오티드를 준비하는 단계;

상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 포함하며,

상기 m 및 n은 각각 독립적으로 18 내지 25의 정수이고,

a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이며,

상기 p는 10 내지 m의 정수이고,

상기 q는 10 내지 n의 정수이다.

본 발명에서 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드 각각은 miRNA의 전 서열이거나 그 단편으로, 이때 성숙한 miRNA, miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체의 전 서열 또는 그 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA와 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열과 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열의 1 번째 내지 q-b 번째 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열의 1 번째 내지 q-b-1 번째 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 바람직하게는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제1 가닥의 5' 말단, 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단, 또는 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 가닥의 5' 말단, 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단, 또는 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시키기에 앞서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제1 링커 뉴클레오티드 또는 제1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 링커 올리고뉴클레오티드는 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 p+1 번째 내지 p+r 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 여기서 상기 r은 2 내지 4의 정수일 수 있다. 단, 여기서 상기 p는 10 이상이되, 그 최대값은 m-4 내지 m-2의 정수일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시키기에 앞서, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 제2 링커 뉴클레오티드 또는 제2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 링커 올리고뉴클레오티드는 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 q+1 번째 내지 q+s 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 여기서 상기 s는 2 내지 4의 정수일 수 있다. 단, 여기서 상기 p는 10 이상이되, 그 최대값은 n-4 내지 n-2의 정수일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제1 가닥의 3' 말단, 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 가닥의 3' 말단, 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장할 수 있다.

목적하는 제1 miRNA 전구체의 어느 일 단편인 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 다른 일 단편인 제1-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥을 준비하는 단계;

목적하는 제2 miRNA 전구체의 어느 일 단편인 제2-1 올리고뉴클레오티드 및 다른 일 단편인 제2-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥을 준비하는 단계;

목적하는 제1 miRNA 전구체의 또 다른 일 단편인 제1-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 가닥을 준비하는 단계;

목적하는 제2 miRNA 전구체의 또 다른 일 단편인 제2-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 가닥을 준비하는 단계; 및

상기 제1 가닥의 어느 일 말단을 상기 제2 가닥 또는 상기 제4 가닥의 어느 일 말단과 연결시키고, 상기 제3 가닥의 어느 일 말단을 상기 제4 가닥 또는 상기 제2 가닥의 어느 일 말단과 연결시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 miRNA 전구체 및 제2 miRNA 전구체는 목적하는 miRNA의 전구체로, 그 형상을 특별히 제한하지는 않으나 헤어핀(hairpin) 형상일 수 있다. 이를 구성하는 핵산 분자는 50 내지 150nt, 바람직하게는 60 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65 내지 95nt 길이를 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드는 인체 내에서 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 수행하는 miRNA의 종자 서열 또는 전장 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 제1 가닥에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 연결시키에 앞서, 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드 사이에 제1-1 링커로, 제1-1 링커 뉴클레오티드 또는 제1-1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 제2 가닥에서 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 연결시키에 앞서 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드 사이에 제2-1 링커로, 제2-1 링커 뉴클레오티드 또는 제2-1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 상기 제3 가닥은 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 미스 매칭 뉴클레오티드를 포함하여 버블 구조를 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 제3 가닥에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시키에 앞서, 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드 사이에 제1-2 링커로, 제1-2 링커 뉴클레오티드 또는 제1-2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 상기 제4 가닥은 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 미스 매칭 뉴클레오티드 또는 미스 매칭 올리고뉴클레오티드를 포함하여 버블 구조를 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 제4 가닥에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시키에 앞서, 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 사이에 제2-2 링커로, 제2-2 링커 뉴클레오티드 또는 제2-2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다.이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

t 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제1 miRNA 전구체의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 A 번째 내지 B 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 B+e 번째 내지 B+f 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥을 준비하는 단계;

u 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제2 miRNA 전구체의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 C 번째 내지 D 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-1 올리고뉴클레오티드 및 D+g 번째 내지 D+h 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥을 준비하는 단계;

상기 t 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제1 miRNA 전구체의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 B+w 번째 내지 B+x 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 가닥을 준비하는 단계;

상기 u 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제2 miRNA 전구체의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 D+y 번째 내지 D+z 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 가닥을 준비하는 단계; 및

상기 제1 가닥의 어느 일 말단을 상기 제2 가닥 또는 상기 제4 가닥의 어느 일 말단과 연결시키고, 상기 제3 가닥의 어느 일 말단을 상기 제4 가닥 또는 상기 제2 가닥의 어느 일 말단과 연결시키는 단계를 포함하며,

상기 t 및 u는 각각 독립적으로 60 내지 150의 정수이고,

상기 A 및 C는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이며,

상기 B 및 D는 각각 독립적으로 18 내지 25의 정수이고,

상기 e 및 g는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이며,

상기 f 및 h는 각각 독립적으로 5 내지 57의 정수이고,

상기 w 및 y는 각각 독립적으로 6 내지 62의 정수이며,

상기 x 및 z는 각각 독립적으로 11 내지 119의 정수일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 miRNA 전구체 및 제2 miRNA 전구체는 목적하는 miRNA 의 전구체로, 그 형상을 특별히 제한하지는 않으나 헤어핀(hairpin) 형상일 수 있다. 이를 구성하는 핵산 분자는 50 내지 150nt, 바람직하게는 60 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65 내지 95nt 길이를 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시키에 앞서, 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 사이에 제1-1 링커로, 제1-1 링커 뉴클레오티드 또는 제1-1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 제2 가닥에서 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시키에 앞서, 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드 사이에 제2-1 링커로, 제2-1 링커 뉴클레오티드 또는 제2-1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제3 가닥에서 제1-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장할 수 있다.

본 발명의 상기 제3 가닥에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시키에 앞서, 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 사이에 제1-2 링커로, 제1-2 링커 뉴클레오티드 또는 제1-2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제4 가닥에서 제2-3 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장할 수 있다.

본 발명에서 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 것으로, 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 염기서열로 이루어지도록 합성하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 상기 제4 가닥에서 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시킬 수 있고, 바람직하게는 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있고, 혹은 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 연결시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단을 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결시키에 앞서, 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 사이에 제2-2 링커로, 제2-2 링커 뉴클레오티드 또는 제2-2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함시킬 수 있다. 이때 구체적인 서열은 특별히 제한하지 않으며, 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드, 염기가 구아닌(guanine, G)인 뉴클레오티드, 염기가 시토신(cytosine, C)인 뉴클레오티드 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 가닥의 어느 일 말단은 상기 제2 가닥 또는 상기 제4 가닥의 어느 일 말단과 연결될 수 있다. 바람직하게는 상기 제1 가닥의 3' 말단은 상기 제2 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제1 가닥의 3' 말단은 상기 제4 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제2 가닥의 3' 말단은 상기 제1 가닥의 5' 말단에 연결되거나, 또는 상기 제4 가닥의 3' 말단은 상기 제1 가닥의 5'말단에 연결될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드는 타겟 유전자의 발현을 조절하여 목적하는 기능을 하는 miRNA, 그 전구체 또는 그 단편을 2가닥을 동시에 포함하면서 이들이 안정적인 이중 가닥의 형태를 유지할 수 있도록 하여, 각각의 miRNA를 단독으로 처리하였을 때 보다 타겟 부위로의 전달 효율을 현저히 높이고 그 기능 발현에 시너지 효과 또한 부여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예로, 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체 내 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드의 배치 구조를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예로, 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체 내 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드의 배치 구조를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예로, 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체 내 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드의 배치 구조를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예로, 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체 내 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드의 배치 구조를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예로, 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체 내 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드의 배치 구조를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예로, 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체 내 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드의 배치 구조를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예로, 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체 내 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드의 배치 구조를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예로, 헤어핀 형상의 제1 miRNA 전구체 내 제1-1 올리고뉴클레오티드, 제1-2 올리고뉴클레오티드 및 제1-3 올리고뉴클레오티드의 배치 구조를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 28은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 29는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에 따른 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 구조를 도시한 것이다.
상기 도 28 내지 32에서, PSI-502는 hsa-miR-6514-5p miRNA에 해당하고, PSI-503은 hsa-miR-503-3p miRNA에 해당할 수 있다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에서 SK-MEL28 암 세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 상기 암 세포의 세포 생존율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 일 실시예에서 SK-MEL28 암 줄기세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 콜로니의 수의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 일 실시예에서 SK-MEL28 암 줄기세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 상기 암 줄기세포의 세포 침윤능을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 일 실시예에서 SK-MEL28 암 줄기세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 상기 암 줄기세포의 줄기능(stemness)과 관련된 유전자인 Nanog의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명의 일 실시예에서 SK-MEL28 암 줄기세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 상기 암 줄기세포에서 발현이 억제되는 유전자인 TYRP1의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 일 실시예에서 SK-MEL28 암 세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 암 세포 50%의 사멸을 유도할 수 있는 농도(GI₅₀)를 측정하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 실시예에서 Malme-3m 암 세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 암 세포 50%의 사멸을 유도할 수 있는 농도(GI₅₀)를 측정하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 40은 본 발명의 일 실시예에서 A549 암 세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 암 세포 50%의 사멸을 유도할 수 있는 농도(GI₅₀)를 측정하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 41은 본 발명의 일 실시예에서 NCI-H460 암 세포에 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오티드를 처리한 뒤 암 세포 50%의 사멸을 유도할 수 있는 농도(GI₅₀)를 측정하여 그 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[준비예 1] 목적하는 miRNA 전구체의 준비

하기 표 1에 나타내는 염기서열로 이루어지는 hsa-miR-6514-5p miRNA 및 hsa-miR-503-3p miRNA 및 이들의 전구체를 준비하였다.

miRNA 종류	염기서열
hsa-miR-6514-5p miRNA	uauggaguggacuuucagcuggc (서열번호 3)
hsa-miR-503-3p miRNA	gggguauuguuuccgcugccagg (서열번호 4)
hsa-miR-6514-5p miRNA 전구체	uauggaguggacuuucagcuggcauuuacgagucagaguucuuacagagcugccuguucuuccacuccag(서열번호 35)
hsa-miR-503-3p miRNA 전구체	ugcccuagcagcgggaacaguucugcagugagcgaucggugcucugggguauuguuuccgcugccagggua(서열번호 36)

[실시예 1] 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 제작(PSI-50B-2.3)

도 28에 나타낸 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 보다 상세하게는, 우선 서열번호 3으로 표시되는 hsa-miR-6514-5p miRNA와 서열번호 4로 표시되는 hsa-miR-503-3p miRNA를 각각 제1 올리고뉴클레오티드와 제2 올리고뉴클레오티드로 준비하였다. 이후, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단으로부터, 상기 hsa-miR-503-3p miRNA의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열번호 5로 표시되는 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 합성 및 연결하였다. 또한, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단으로부터, 상기 hsa-miR-6514-5p miRNA의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열번호 6으로 표시되는 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 합성 및 연결하였다. 이렇게 합성된 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 중 제1 가닥은 서열번호 1로 표시되고, 제2 가닥은 서열번호 2로 표시된다(표 2).

miRNA 종류	염기서열
제1 가닥	uauggaguggacuuucagcuggcccuggcagcggaaacaauacccc (서열번호 1)
제2 가닥	gggguauuguuuccgcugccagggccagcugaaaguccacuccaua (서열번호 2)

[실시예 2] 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 제작(PSI-50A-2.3)

도 29에 나타낸 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 보다 상세하게는, 상기 hsa-miR-6514-5p miRNA의 5' 말단으로부터 1 내지 11번째 염기서열(서열번호 9)로 이루어지는 miRNA 단편에 해당하는 제1 올리고뉴클레오티드를 준비하고, hsa-miR-503-3p miRNA의 5' 말단으로부터 1 내지 12번째 염기서열(서열번호 10)로 이루어지는 miRNA 단편에 해당하는 제2 올리고뉴클레오티드를 준비하였다. 이후, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열번호 11로 표시되는 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 합성 및 연장하였다. 또한, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열번호 12로 표시되는 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 합성 및 연장하였다. 이렇게 합성된 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 중 제1 가닥은 서열번호 7로 표시되고, 제2 가닥은 서열번호 8로 표시된다(표 3).

miRNA 종류	염기서열
제1 가닥	uauggaguggaaaacaauacccc (서열번호 7)
제2 가닥	gggguauuguuuuccacuccaua (서열번호 8)

[실시예 3] 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 제작(PSI-50C-2.3)

도 30에 나타낸 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 보다 상세하게는, hsa-miR-6514-5p miRNA의 5' 말단으로부터 2 내지 11번째 염기서열로 이루어지는 miRNA 단편인 서열번호 15로 표시되는 제1 올리고뉴클레오티드를 준비하고, 이의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드로 염기가 우라실인 뉴클레오티드를 추가 연장하였다. 또한, hsa-miR-503-3p miRNA의 5' 말단으로부터 2 내지 12번째 염기서열로 이루어지는 miRNA 단편인 서열번호 16으로 표시되는 제2 올리고뉴클레오티드를 준비하고, 이의 5' 말단에 제2 캡 뉴클레오티드로 염기가 우라실인 뉴클레오티드를 추가 연장하였다. 또한, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열번호 17로 표시되는 제1 연장 뉴클레오티드를 합성 및 연장하고, 상기 제1 연장 뉴클레오티드의 3' 말단에는 상기 제2 캡 뉴클레오티드에 상보적인 염기가 아데닌인 뉴클레오티드를 제1 말단 뉴클레오티드로 추가 연장하였다. 또한, 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열번호 18로 표시되는 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 합성 및 연장한 뒤, 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제1 캡 뉴클레오티드에 상보적인 염기가 아데닌인 뉴클레오티드를 추가 연장하였다. 이렇게 합성된 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 중 제1 가닥은 서열번호 13로 표시되고, 제2 가닥은 서열번호 14로 표시된다(표 4).

miRNA 종류	염기서열
제1 가닥	uauggaguggaaaacaauaccca (서열번호 13)
제2 가닥	uggguauuguuuuccacuccaua (서열번호 14)

[실시예 4] 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 제작(PSI-50D-2.3)

도 31에 나타낸 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 보다 상세하게는, hsa-miR-6514-5p miRNA의 5' 말단으로부터 2 내지 11번째 염기서열로 이루어지는 miRNA 단편인 서열번호 21로 표시되는 제1 올리고뉴클레오티드를 준비하고, 이의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드로 염기가 우라실인 뉴클레오티드를 추가 연장하였다. 또한, hsa-miR-503-3p miRNA의 5' 말단으로부터 2 내지 11번째 염기서열로 이루어지는 miRNA 단편인 서열번호 22로 표시되는 제2 올리고뉴클레오티드를 준비하고, 이의 5' 말단에 제2 캡 뉴클레오티드로 염기가 우라실인 뉴클레오티드를 추가 연장하였다. 이후, 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 hsa-miR-6514-5p miRNA의 5' 말단으로부터 12번째 뉴클레오티드를 제1 링커 뉴클레오티드로 추가 연장하였고, 상기 제1 링커 뉴클레오티드에 이어서 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향에서 1번째 내지 9번째 염기서열에 상보적인 서열번호 23으로 표시되는 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 합성 및 연장하였다. 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에는 상기 hsa-miR-6514-5p miRNA의 5' 말단으로부터 22 내지 23번째(3' 말단으로부터 1 내지 2번째)의 연속된 올리고뉴클레오티드를 제1 말단 올리고뉴클레오티드로 추가 연장하였다. 또한, 제2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 hsa-miR-503-3p miRNA의 5' 말단으로부터 12번째 뉴클레오티드를 제2 링커 뉴클레오티드로 추가 연장하였고, 상기 제2 링커 뉴클레오티드에 이어서 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향에서 1번째 내지 9번째 염기서열에 상보적인 서열번호 24로 표시되는 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 합성 및 연장하였다. 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에는 상기 hsa-miR-503-3p miRNA의 5' 말단으로부터 22 내지 23번째(3' 말단으로부터 1 내지 2번째)의 연속된 올리고뉴클레오티드를 제2 말단 올리고뉴클레오티드로 추가 연장하였다. 이렇게 합성된 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 중 제1 가닥은 서열번호 19로 표시되고, 제2 가닥은 서열번호 20으로 표시된다(표 5).

miRNA 종류	염기서열
제1 가닥	uauggaguggacaacaauaccgc (서열번호 19)
제2 가닥	uggguauuguuuuccacuccagg (서열번호 20)

[실시예 5] 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드의 제작(PSI-50E-2.3)

도 32에 나타낸 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 보다 상세하게는, 상기 hsa-miR-6514-5p miRNA 전구체의 5' 말단으로부터 1 내지 23번째 염기서열(서열번호 27)로 이루어지는 제1-1 올리고뉴클레오티드와, 24번째 내지 34번째 염기서열(서열번호 28)로 이루어지는 제1-2 올리고뉴클레오티드를 준비하고, 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 연결하였다. 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드는 다이서 작용기에 의해 hsa-miR-6514-5p miRNA 전구체로부터 분리될 수 있다. 또한, hsa-miR-503-3p miRNA 전구체의 3' 말단으로부터 4 내지 26번째 염기서열(서열번호 30)로 이루어지는 제2-1 올리고뉴클레오티드와, 27번째 내지 33번째 염기서열(서열번호 31)로 이루어지는 제2-2 올리고뉴클레오티드를 준비한 뒤, 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 연결하였다. 여기서 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드 또한 다이서 작용기에 의해 hsa-miR-503-3p miRNA 전구체로부터 분리될 수 있는 것이다. 이후 상기 hsa-miR-6514-5p miRNA 전구체의 5' 말단으로부터 38번째 내지 48번째의 연속된 염기서열(서열번호 29)로 이루어지는 제1-3 올리고뉴클레오티드를 준비하고, 상기 hsa-miR-503-3p miRNA 전구체의 3' 말단으로부터 37번째 내지 45번째의 연속된 염기서열(서열번호 32)로 이루어지는 제2-3 올리고뉴클레오티드를 준비하였다. 이어서, 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열번호 33으로 표시되는 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장 합성하였다. 또한, 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에는 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열에 상보적인 서열번호 34로 표시되는 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 추가로 연장 합성하였다. 이후 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 연결하여 서열번호 25로 표시되는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 연결하여 서열번호 26으로 표시되는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(표 6). 상기 서열번호 25로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 상기 서열번호 26으로 표시되는 올리고뉴클레오티드는 서로 혼성화되어 이중 가닥을 이룰 수 있다.

miRNA 종류	염기서열
제1 가닥+제2 가닥	uauggaguggacuuucagcuggcauuuacgagucgugcucugggguauuguuuccgcugccagg (서열번호 25)
제3 가닥+제4 가닥	ccuggcagcggaaacaauaccccagugagcgaguucuuacagagccagcugaaaguccacuccaua (서열번호 26)

[준비예 1] 암 세포 및 암 줄기세포의 준비

ATCC로부터 SK-MEL28, MALME-3M, A549, NCI-H460 암 세포주를 구매한 뒤 배양하였다. SK-MEL28 암세포주는 B27 supplement와 성장 인자(FGF 및 EGF 20 ng/mL)가 첨가된 DMEM/F12 배지에서 배양하며 암 줄기세포를 유도하였다. 암 줄기세포 마커인 CD44+가 발현된 세포 만을 선별하여 약 2주 동안 배양하였다.

[실험예 1] 암 세포 및 암 줄기세포의 생존율 평가

리포펙타민(lipofectamine)을 이용하여 상기 준비예 1에서 준비된 SK-MEL28 암 세포 및 암 줄기세포에 상기 실시예 1 내지 5에서 준비된 5종의 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드를 9일 동안 도입한 뒤 세포 생존율의 변화를 비교하여 도 33에 나타내었다.

도 33에서 보는 바와 같이, 암 세포 및 암 줄기세포에 본 발명에 따른 올리고리보뉴클레오타이드를 처리하자 상기 암 세포 및 암 줄기세포의 생존율이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드는 암 세포 및 암 줄기세포의 증식 억제 및 사멸 유도 효과가 있음을 알 수 있다.

[실험예 2] 암 줄기세포의 증식 억제 평가

상기 실험예 1과 동일한 방법으로 상기 준비예 1에서 준비된 SK-MEL28 암 세포 및 암 줄기세포 각각에 상기 실시예 1 내지 5의 5종의 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드를 도입한 뒤 콜로니 수의 변화를 비교하여 도 34에 나타내었다.

도 34에서 보는 바와 같이, 암 세포 및 암 줄기세포에 본 발명에 따른 올리고리보뉴클레오타이드를 처리하자 상기 암 세포 및 암 줄기세포의 콜로니 수가 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드는 암 세포 및 암 줄기세포의 증식 억제 및 사멸 유도 효과가 매우 뛰어남을 알 수 있다.

[실험예 3] 암 줄기세포의 전이 억제 평가

상기 실험예 1과 동일한 방법으로 상기 준비예 1에서 준비된 SK-MEL28 암세포 및 암 줄기세포에 상기 실시예 1 내지 5에서 얻어진 5종의 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드를 도입한 뒤 세포의 침윤능의 변화를 비교하여 도 35에 나타내었다

도 35에서 보는 바와 같이, 암 세포 및 암 줄기세포에 본 발명에 따른 올리고리보뉴클레오타이드를 처리하자 암 줄기세포의 세포 침윤능이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드는 암 세포, 및 암 줄기세포의 세포 침윤능을 효과적으로 억제할 수 있는 것을 알 수 있다.

[실험예 4] 암 줄기세포의 분화 유도 평가

상기 실험예 1과 동일한 방법으로 상기 준비예 1에서 준비된 SK-MEL28 암세포 및 암 줄기세포 각각에 상기 실시예 1 내지 5의 5종의 올리고리보뉴클레오타이드를 도입한 뒤 올리고리보뉴클레오타이드가 도입된 암 줄기세포를 수확(harvesting)하여 RNA를 분리한 뒤 cDNA를 합성하고 하기 표 7에 나타낸 프라이머를 이용하여 qPCR 기법을 통해 Nanog 및 TYRP1 유전자의 실시간 증폭되는 사이클(cycle)을 수치화해 정량화 하였다. 그 결과는 도 36 및 37과 같다.

프라이머 이름	프라이머 서열
Nanog	Forward	CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA
Nanog	Reverse	CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC
TYRP1	Forward	TGGCCAAGTCGGGAGTTTAG
TYRP1	Reverse	CATACTGCGTCTGGCACGAA
GAPDH	Forward	AATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH	Reverse	TGGACTCCACGACGTACTCA

도 36에서 보는 바와 같이, SK-MEL28 암 줄기세포에 본 발명에 따른 올리고리보뉴클레오타이드를 처리하자 줄기능(stemness)과 관련된 유전자인 Nanog의 발현 수준이 현저히 저감된 것을 확인할 수 있었다.

한편, 도 37에서 보는 바와 같이, 암 줄기세포에서 그 발현이 억제된 TYRP1의 발현 수준은 증가한 것을 볼 수 있다.

이를 통하여 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드는 암 줄기세포의 줄기세포능(stemness)을 상실하도록 하는 효과가 있음을 알 수 있다.

[실험예 5] 암 세포의 증식 억제 평가

리포펙타민(lipofectamine)을 이용하여 상기 준비예 1에서 준비된 SK-MEL28, Malme-3m, A549, NCI-H460 암 세포 각각에 상기 실시예 1 내지 5의 5종의 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드를 농도별(0.01, 1, 10, 100, 1000, 10000 nM)로 도입한 뒤 세포 생존율의 변화를 측정하여 그 결과를 각각 도 38 내지 도 41에 나타내었다.

도 38 내지 도 41에서 보는 바와 같이, 암 세포에 본 발명에 따른 올리고리보뉴클레오타이드를 처리하자 상기 암 세포가 50% 정도 사멸되는 물질 농도가 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따른 이중 가닥의 올리고리보뉴클레오타이드는 암 세포의 증식 억제 및 사멸 유도 효과가 매우 뛰어남을 알 수 있다.

10: 제1 올리고뉴클레오티드
11: 제2 올리고뉴클레오티드
20: 제1 연장 올리고뉴클레오티드
21: 제2 연장 올리고뉴클레오티드
50a: 제1-1 올리고뉴클레오티드
50b: 제1-2 올리고뉴클레오티드
50c: 제1-3 올리고뉴클레오티드
60a: 제2-1 올리고뉴클레오티드
60b: 제2-2 올리고뉴클레오티드
60c: 제2-3 올리고뉴클레오티드
70: 제1 연장 올리고뉴클레오티드
71: 제2 연장 올리고뉴클레오티드
100: 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드
100': 제2 캡 뉴클레오티드 또는 제2 캡 올리고뉴클레오티드
200: 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드
200': 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드
300: 제1 링커
300': 제2 링커
[서열목록]
서열번호 1: 제1 가닥
5'-uauggaguggacuuucagcuggcccuggcagcggaaacaauacccc-3'
서열번호 2: 제2 가닥
5'-gggguauuguuuccgcugccagggccagcugaaaguccacuccaua-3'
서열번호 3: 제1 올리고뉴클레오티드
5'-uauggaguggacuuucagcuggc-3'
서열번호 4: 제2 올리고뉴클레오티드
5'-gggguauuguuuccgcugccagg-3'
서열번호 5: 제1 연장 올리고뉴클레오티드
5'-ccuggcagcggaaacaauacccc-3'
서열번호 6: 제2 연장 올리고뉴클레오티드
5'-gccagcugaaaguccacuccaua-3'
서열번호 7: 제1 가닥
5'-uauggaguggaaaacaauacccc-3'
서열번호 8: 제2 가닥
5'-gggguauuguuuuccacuccaua-3'
서열번호 9: 제1 올리고뉴클레오티드
5'-uauggagugga-3'
서열번호 10: 제2 올리고뉴클레오티드
5'-gggguauuguuu-3'
서열번호 11: 제1 연장 올리고뉴클레오티드
5'-aaacaauacccc-3'
서열번호 12: 제2 연장 올리고뉴클레오티드
5'-uccacuccaua-3'
서열번호 13: 제1 가닥
5'-uauggaguggaaaacaauaccca-3'
서열번호 14: 제2 가닥
5'-uggguauuguuuuccacuccaua-3'
서열번호 15: 제1 올리고뉴클레오티드
5'-auggagugga-3'
서열번호 16: 제2 올리고뉴클레오티드
5'-ggguauuguuu-3'
서열번호 17: 제1 연장 올리고뉴클레오티드
5'-aaacaauaccc-3'
서열번호 18: 제2 연장 올리고뉴클레오티드
5'-uccacuccau-3'
서열번호 19: 제1 가닥
5'-uauggaguggacaacaauaccgc-3'
서열번호 20: 제2 가닥
5'-uggguauuguuuuccacuccagg-3'
서열번호 21: 제1 올리고뉴클레오티드
5'-auggagugga-3'
서열번호 22: 제2 올리고뉴클레오티드
5'-ggguauuguu-3'
서열번호 23: 제1 연장 올리고뉴클레오티드
5'-aacaauacc-3'
서열번호 24: 제2 연장 올리고뉴클레오티드
5'-uccacucca-3'
서열번호 25
5'-uauggaguggacuuucagcuggcauuuacgagucgugcucugggguauuguuuccgcugccagg-3'
서열번호 26
5'-ccuggcagcggaaacaauaccccagugagcgaguucuuacagagccagcugaaaguccacuccaua-3'
서열번호 27: 제1-1 올리고뉴클레오티드
5'-uauggaguggacuuucagcuggc-3'
서열번호 28: 제1-2 올리고뉴클레오티드
5'-auuuacgaguc-3'
서열번호 29: 제1-3 올리고뉴클레오티드
5'-guucuuacaga-3'
서열번호 30: 제2-1 올리고뉴클레오티드
5'-gggguauuguuuccgcugccagg-3'
서열번호 31: 제2-2 올리고뉴클레오티드
5'-gugcucu-3'
서열번호 32: 제2-3 올리고뉴클레오티드
5'-agugagcga-3'
서열번호 33: 제1 연장 올리고뉴클레오티드
5'-gccagcugaaaguccacuccaua-3'
서열번호 34: 제2 연장 올리고뉴클레오티드
5'-ccuggcagcggaaacaauacccc-3'
서열번호 35: hsa-miR-6514-5p miRNA 전구체
5'-uauggaguggacuuucagcuggcauuuacgagucagaguucuuacagagcugccuguucuuccacuccag-3'
서열번호 36: hsa-miR-6514-5p miRNA 전구체
5'-ugcccuagcagcgggaacaguucugcagugagcgaucggugcucugggguauuguuuccgcugccagggua-3'

<110> PROSTEMICS CO., LTD. <120> miRNA polymer and the method for preparing the same <130> DPB174159.k01 <150> KR 10-2017-0159668 <151> 2017-11-27 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 1 uauggagugg acuuucagcu ggcccuggca gcggaaacaa uacccc 46 <210> 2 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 2 gggguauugu uuccgcugcc agggccagcu gaaaguccac uccaua 46 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 uauggagugg acuuucagcu ggc 23 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 4 gggguauugu uuccgcugcc agg 23 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 5 ccuggcagcg gaaacaauac ccc 23 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 6 gccagcugaa aguccacucc aua 23 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 7 uauggagugg aaaacaauac ccc 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 8 gggguauugu uuuccacucc aua 23 <210> 9 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 9 uauggagugg a 11 <210> 10 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 10 gggguauugu uu 12 <210> 11 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 11 aaacaauacc cc 12 <210> 12 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 12 uccacuccau a 11 <210> 13 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 13 uauggagugg aaaacaauac cca 23 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 14 uggguauugu uuuccacucc aua 23 <210> 15 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 15 auggagugga 10 <210> 16 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 16 ggguauuguu u 11 <210> 17 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 17 aaacaauacc c 11 <210> 18 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 18 uccacuccau 10 <210> 19 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 19 uauggagugg acaacaauac cgc 23 <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 20 uggguauugu uuuccacucc agg 23 <210> 21 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 21 auggagugga 10 <210> 22 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 22 ggguauuguu 10 <210> 23 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 23 aacaauacc 9 <210> 24 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 24 uccacucca 9 <210> 25 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 25 uauggagugg acuuucagcu ggcauuuacg agucgugcuc ugggguauug uuuccgcugc 60 cagg 64 <210> 26 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 26 ccuggcagcg gaaacaauac cccagugagc gaguucuuac agagccagcu gaaaguccac 60 uccaua 66 <210> 27 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 27 uauggagugg acuuucagcu ggc 23 <210> 28 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 28 auuuacgagu c 11 <210> 29 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 29 guucuuacag a 11 <210> 30 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 30 gggguauugu uuccgcugcc agg 23 <210> 31 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 31 gugcucu 7 <210> 32 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 32 agugagcga 9 <210> 33 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 33 gccagcugaa aguccacucc aua 23 <210> 34 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 34 ccuggcagcg gaaacaauac ccc 23 <210> 35 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 35 uauggagugg acuuucagcu ggcauuuacg agucagaguu cuuacagagc ugccuguucu 60 uccacuccag 70 <210> 36 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 36 ugcccuagca gcgggaacag uucugcagug agcgaucggu gcucuggggu auuguuuccg 60 cugccagggu a 71

Claims

이중 가닥의 올리고뉴클레오티드로서,
목적하는 제1 올리고뉴클레오티드 및 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥; 및
목적하는 제2 올리고뉴클레오티드 및 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;을 포함하며,
상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있고,
상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드 분자인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는,
인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)가 황 원소로 치환한 형태인 모노포스페이트(monophosphate), 디포스페이트(diphosphate), 트리포스페이트(triphosphate), 알킬포스포네이트(alkylphosphonate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포르아미데이트(phosphoramidate) 구조가 포함하는 형태;
DNA, PNA(petide nucleic acids), LNA(locked nucleic acid), UNA(unlocked nucleic acid), BNA(bridged nucleic acid), GNA(glycol nucleic acid) 또는 TNA(threose nucleic acid) 분자로 치환된 형태; 또는
당의 2'수산화기가 메틸가, 에틸기, 메톡시기, 에톡시기, 아미노기 또는 플루오르기로 치환된 형태인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오티드 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드는, 성숙한 miRNA, miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA), 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체의 전 사슬 또는 이들의 단편을 포함하는 것인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 서로 동일하거나 상이한, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오티드 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 길이는 18~25 nt인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오티드 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 길이는 9~11 nt인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
이중 가닥의 올리고뉴클레오티드로서,
m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 a 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1 올리고뉴클레오티드 및 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥; 및
n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 b 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제2 올리고뉴클레오티드 및 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;을 포함하고,
상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있고,
상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있으며,
m 및 n은 각각 독립적으로 18 내지 25의 정수이고,
a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 3의 정수이며,
p는 10 내지 m의 정수이고,
q는 10 내지 n의 정수인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오티드 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드는, 성숙한 miRNA, miRNA 전구체(miRNA precursor), 일차 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체의 전 사슬 또는 이들의 단편을 포함하는 것인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 m 개의 뉴클레오티드 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 m 개의 뉴클레오티드 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 2 번째 내지 p 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제2 올리고뉴클레오티드는 n 개의 뉴클레오티드 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
제2 올리고뉴클레오티드는 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 2 번째 내지 q 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드는 제2 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열의 1 번째 내지 q-b 번째 염기서열에 상보적인 서열로 이루어지는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드는 제1 올리고뉴클레오티드의 3'-5' 방향의 염기서열의 1 번째 내지 p-a 번째 염기서열에 상보적인 서열로 이루어지는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제1 가닥의 5' 말단에 제1 캡 뉴클레오티드 또는 제1 캡 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제16항에 있어서,
상기 제1 캡 뉴클레오티드는 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드이거나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제16항에 있어서,
상기 제1 캡 올리고뉴클레오티드는 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드를 포함하거나, 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제2 가닥의 5' 말단에 제2 캡 뉴클레오티드를 더 포함하는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제19항에 있어서,
상기 제2 캡 뉴클레오티드는 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 또는 2 번째 뉴클레오티드이거나, 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제19항에 있어서,
상기 제2 캡 올리고뉴클레오티드는 염기가 우라실(uracil, U)인 뉴클레오티드를 포함하거나, 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 1 번째 내지 2 번째의 연속하는 올리고뉴클레오티드인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오티드와 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드 사이에 제1 링커 뉴클레오티드 또는 제1 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제22항에 있어서,
상기 제1 링커 뉴클레오티드는 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 p+1 번째 뉴클레오티드이고, 상기 p는 10 내지 m-1의 정수인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제22항에 있어서,
상기 제1 링커 올리고뉴클레오티드는 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 p+1 번째 내지 p+r 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드이고, r은 2 내지 4의 정수이며, 상기 p의 최대값은 m-4 내지 m-2의 정수인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제2 올리고뉴클레오티드와 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드 사이에 제2 링커 뉴클레오티드 또는 제2 링커 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제25항에 있어서,
상기 제2 링커 뉴클레오티드는 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 q+1 번째 뉴클레오티드이고, 상기 q는 10 내지 n-1의 정수인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제25항에 있어서,
상기 제2 링커 올리고뉴클레오티드는 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 q+1 번째 내지 q+s 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드이고, 상기 s는 2 내지 4의 정수이며, 상기 q의 최대값은 n-4 내지 n-2의 정수인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제1 가닥의 3' 말단에 제1 말단 뉴클레오티드 또는 제1 말단 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서,
상기 제1 말단 뉴클레오티드는 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드이거나, 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 m 번째 뉴클레오티드인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제28항에 있어서,
상기 제1 말단 올리고뉴클레오티드는 상기 m 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 m-c 번째 내지 m 번째의 연속된 염기서열로 이루어지고, 상기 c는 1 내지 3인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제8항에 있어서,
상기 제2 가닥의 3' 말단에 제2 말단 뉴클레오티드 또는 제2 말단 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제31항에 있어서,
상기 제2 말단 뉴클레오티드는 상기 제1 캡 뉴클레오티드에 상보적인 염기가 아데닌(adenine, A)인 뉴클레오티드이거나, 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 n 번째 뉴클레오티드인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제31항에 있어서,
상기 제2 말단 올리고뉴클레오티드는 상기 n 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 miRNA의 5' 말단으로부터 n-d 번째 내지 n 번째의 연속된 염기서열로 이루어지고, 상기 d는 1 내지 3인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
이중 가닥의 올리고뉴클레오티드로서,
목적하는 제1 miRNA 전구체의 어느 일 단편인 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 다른 일 단편인 제1-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥;
목적하는 제2 miRNA 전구체의 어느 일 단편인 제2-1 올리고뉴클레오티드 및 다른 일 단편인 제2-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;
목적하는 제1 miRNA 전구체의 또 다른 일 단편인 제1-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 가닥;
목적하는 제2 miRNA 전구체의 또 다른 일 단편인 제2-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 가닥을 포함하고,
상기 제1 가닥의 어느 일 말단은 상기 제2 가닥 또는 상기 제4 가닥의 어느 일 말단과 연결되며,
상기 제3 가닥의 어느 일 말단은 상기 제4 가닥 또는 상기 제2 가닥의 어느 일 말단과 연결되는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제34항에 있어서,
상기 제1-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제1-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결되는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제34항에 있어서,
상기 제2-1 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제2-2 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결되는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제34항에 있어서,
상기 제3 가닥은 상기 제1-1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 제1 연장 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제34항에 있어서,
상기 제4 가닥은 상기 제2-1 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 제2 연장 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제37항에 있어서,
상기 제1-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제1 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결되는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
제37항에 있어서,
상기 제2-3 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단은 상기 제2 연장 올리고뉴클레오티드의 어느 일 말단에 연결되는, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.
이중 가닥의 올리고뉴클레오티드로서,
t 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제1 miRNA 전구체의 5' 말단으로부터 A 번째 내지 B 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-1 올리고뉴클레오티드 및 B+e 번째 내지 B+f 번째의 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥;
u 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제2 miRNA 전구체의 3' 말단으로부터 C 번째 내지 D 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-1 올리고뉴클레오티드 및 D+g 번째 내지 D+h 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 가닥;
상기 t 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제1 miRNA 전구체의 5' 말단으로부터 B+w 번째 내지 B+x 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제1-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 가닥; 및
상기 u 개의 뉴클레오티드(nt) 길이의 제2 miRNA 전구체의 5' 말단으로부터 D+y 번째 내지 D+z 번째 연속된 염기서열로 이루어지는 제2-3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 가닥을 포함하고,
상기 제1 가닥의 어느 일 말단은 상기 제2 가닥 또는 상기 제4 가닥의 어느 일 말단과 연결되며,
상기 제3 가닥의 어느 일 말단은 상기 제4 가닥 또는 상기 제2 가닥의 어느 일 말단과 연결되고,
상기 t 및 u는 각각 독립적으로 60 내지 150의 정수이고,
상기 A 및 C는 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이며,
상기 B 및 D는 각각 독립적으로 18 내지 25의 정수이고,
상기 e 및 g는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이며,
상기 f 및 h는 각각 독립적으로 5 내지 57의 정수이고,
상기 w 및 y는 각각 독립적으로 6 내지 62의 정수이며,
상기 x 및 z는 각각 독립적으로 11 내지 119의 정수인, 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드.