KR20190058604A - 유전자 침묵의 개선 또는 이와 관련된 개선 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지하 식물 해충에 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 켄칭 작용제를 이용하여 양으로 하전된 잔기를 실질적으로 켄칭시킴으로써 토양에 대한 폴리뉴클레오티드 및 양이온성 중합체를 포함하는 조성물의 결합을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 양이온성 중합체, 폴리뉴클레오티드 및 켄칭 작용제를 포함하는 조성물을 포함한다.

Description

유전자 침묵의 개선 또는 이와 관련된 개선
본 발명은 이중 가닥 RNA에 의한 유전자 발현의 제어에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 표적 유기체에서 유전자 발현을 침묵시키기 위해 외인성으로(즉, 표적 유기체 외부 및 상대적으로 가혹한 환경 조건하에서) 투여된 이중 가닥 RNA의 능력을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 사용하기 위한 조성물, 및 폴리뉴클레오티드, 상세하게는 dsRNA, 및 양이온성 중합체를 포함하는 복합체에서 양전하를 "켄칭"시키는 공지된 작용제의 상기 방법에서의 용도에 관한 것이다.
잠재적으로 유전자 발현을 침묵시키는 RNA 간섭 현상은 널리 공지되어 있다.
RNA는 비교적 불안정하고, 예를 들어, 세포 외부에도 편재하는 리보뉴클레아제에 의해 빠르게 분해될 수 있다. 표적 유기체에 직접 또는 그들이 존재하는 장소에 외인성 투여를 통한 dsRNA의 적용시의 문제는 RNA의 빈약한 안정성에 관한 것이다.
외인성 적용은, 유기체가 그것을 혼입할 수 있거나, dsRNA가 표적 유기체와는 상이한 제1 유기체에서 생성되고, 표적 유기체가 제1 유기체, 또는 dsRNA를 포함하는 그의 일부를 혼입하여 상기 dsRNA가 dsRNA에 의해 포함된 것에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 전사 후 침묵을 어느 쪽으로든 초래할 수 있도록 하는 방식으로 표적 유기체에 적용되는 것을 의미한다.
외인성 적용은 내인성 생성과 구별된다(내인성 생성은 표적 유전자를 전사 후 침묵시킬 수 있는 이중 가닥 RNA의 표적 유기체의 세포에서의 (일반적으로 적절한 이종성 서열로부터의 발현을 통한) 생성을 의미함).
외인성으로 적용된 dsRNA는 일반적으로 단기간 내에(아마 적용 후 최대 수일동안) 관련있는 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 반면에, 상기 효과는 투여되는 세부 환경 조건에 의존하는 것에 더하여, 예를 들어, 토양에서 전형적으로 약 12 내지 24시간 미만의 반감기를 갖는 dsRNA로 인해 일반적으로 급속히 감소한다.
dsRNA를 캡슐화하거나 그렇지 않으면 이를 이의 안정성을 향상시켜, 이에 따라 증가된 작용 지속기간을 제공하는 중합체에 결합시킴으로써 dsRNA를 안정화시키는 것을 포함하는, 상기 문제에 대한 다양한 해법이 제안되었다. 그러나, 상기 안정화된 dsRNA는, 이와 양이온성 중합체 사이에 형성된 복합체가 장소 내 또는 장소에 존재하는 하전된 입자에 의해 결합되거나 그렇지 않으면 상기 하전된 입자에 결합할 수 있어 이의 이용 가능성을 감소시키거나 장소를 통한 통상적으로 표적 유기체가 위치하는 부위로의 복합체의 이동을 방해하는 한, 그 자체에 문제가 없지는 않다. 이러한 문제는 dsRNA가 처음 적용되는 부위로부터 멀어지는 표적 유기체의 이동에 의해 악화된다.
따라서, 본 발명은 한편으로 원하는 생물학적 효과를 발휘할 수 있도록 충분히 dsRNA를 안정화시키고, 다른 한편으로 이에 따라 안정화된 dsRNA를 이용 가능하게 유지시키거나, 표적 유기체가 위치하는 장소 내로 이동시키거나 이동되도록 하는 문제에 대한 해법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 토양에 존재하는 음으로 하전된 분자에 대한 양이온성 중합체와 폴리뉴클레오티드 사이에 형성된 복합체를 포함하는 조성물의 결합을 억제하거나 실질적으로 감소시키는 방법이 제공되며, 이는 복합체 상의 양전하를 실질적으로 중화시킬 수 있는 켄칭 작용제를 조성물에 포함시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물의 특히 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 dsRNA이고, 중합체는 폴리아민이고, 켄칭 작용제는 모노-알데하이드 또는 모노에폭시드이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 중합체는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민, 폴리펩티드 또는 양이온성 다당류이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 중합체는 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민이다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 음으로 하전된 입자는 휴민산을 포함한다.
본 발명은 또한,
a) 양이온성 중합체와 dsRNA 사이에 형성된 복합체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계,
b) a)의 복합체의 표면-노출된 양전하를 켄칭 작용제로 실질적으로 중화시키는 단계, 및
c) b)의 조성물을 토양에 적용하는 단계를 포함하는, 지하 식물 해충 감염을 제어하는 방법을 제공하며,
상기 dsRNA는 상기 지하 식물 해충의 표적 유전자의 전사 후 침묵을 초래한다.
지하 식물 해충은 이의 생애 주기의 적어도 일부, 예를 들어, 유충 단계 동안 토양에 존재하는 해충을 포함한다.
지하 해충은 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera)(웨스턴 옥수수 뿌리벌레(Western corn rootworm)), 디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi)(노던 옥수수 뿌리벌레(Northern corn rootworm)), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi)(서던 옥수수 뿌리벌레(Southern corn rootworm)), 디아브로티카 비르기페라 제아에(Diabrotica virgifera zeae)(멕시코 옥수수 뿌리벌레(Mexican corn rootworm)), 디아브로티카 스페시오사(Diabrotica speciosa)(조롱박 벌레(cucurbit beetle)), 선충류(nematodes), 방아벌레(wireworm) 및 유충(grub)으로 구성된 군으로부터의 지하 해충 및 적절한 토양 병원균, 예를 들어, 박테리아 및 진균을 포함한다.
바람직하게는, 지하 해충은 디아브로티카 종이다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드 및 양이온성 중합체를 포함하는 복합체 내의 양으로 하전된 잔여 기를 실질적으로 중화시키기 위한 켄칭 작용제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 양이온성 중합체와 폴리뉴클레오티드 사이에 형성된 복합체, 및 복합체 상에 표면-노출된 양으로 하전된 잔여 기를 실질적으로 중화시킬 수 있는 켄칭 작용제를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 중합체는 분지형 또는 선형 폴리에틸렌이민, 이미다졸 함유 중합체, 키토산, 양이온성 다당류, 폴리아미도아민, 아민기를 포함하는 리신, 히스티딘 및 아르기닌과 같은 아미노산의 중합체 및 공중합체, 및 폴리아민으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 조성물에 존재하는 양이온성 중합체는 분지형 또는 선형 폴리에틸렌이민이다.
복합체라 함은 2개 이상의 성분의 분자 존재물(이온성 또는 비전하)를 수반하는 느슨한 회합에 의해 형성된 분자 존재물을 의미한다.
양이온성 중합체 및 폴리뉴클레오티드가 복합체를 형성하는 경우, 폴리뉴클레오티드 상의 순(net) 음전하는 양이온성 중합체 상에 표면-노출된 양으로 하전된 모든 기를 반작용시키거나 "중화"시키기에 불충분할 수 있어, 그 결과로 복합체는 표면-노출된 양으로 하전된 잔여 기를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. RNA는 dsRNA일 수 있으나, 이는 또한 siRNA, miRNA 또는 RNAi 유전자 침묵을 일으킬 수 있는 임의의 다른 RNA 분자일 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 dsRNA이다.
바람직하게는, dsRNA는 표적 유기체에서 표적 유전자와 동일하거나 이와 상보적인 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다.
적합한 표적 유전자는 전사 후 침묵이 표적 유기체에 대한 유해한 효과를 갖는 것이다. 예를 들어, 성장 변화, 기절, 사망률 증가, 생식 능력 감소 또는 번식력 감소, 영양 거동 또는 운동의 감소 또는 정지, 또는 변태 단계 발달의 감소 또는 정지.
양이온성 중합체는 분지형 또는 선형 폴리에틸렌이민, 이미다졸 함유 중합체, 키토산, 양이온성 다당류, 폴리아미도아민, 및 3차 아미노기를 포함하는 리신 및 아르기닌과 같은 아미노산의 중합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 양이온성 중합체는 적어도 5개의 아민기를 포함하는 폴리아민 또는 분지형 폴리아민일 수 있다. 간단한 폴리아민, 예를 들어, 스퍼민, 스퍼미딘, 푸트레신 및 카다버린은 폴리뉴클레오티드가 dsRNA인 경우에 특히 바람직하지 않은데, 이는 상기 간단한 폴리아민과 dsRNA 사이에 형성된 복합체에 대한 임의의 잔여 전하를 중화시키기 위한 켄칭 작용제의 사용이 복합체를 해리시킬 수 있기 때문이다.
조성물의 바람직한 구현예에서, 복합체는 세포 용해질 내에 포함되거나, 온전한 세포 내에서 형성되고, 켄칭 작용제가 거기에 첨가된다.
켄칭 작용제와 관련하여, 아민 상의 양전하를 켄칭시키기 위해 아민과 반응할 수 있는 단일기를 함유하는 무엇이든 충분하나, 이소시아네이트, 모노-에폭시드, 모노-에스테르, 모노-카르복실산, 모노-무수물, 모노-알데하이드 및 피로카르보네이트를 포함하는 일부 작용제가 바람직하다.
그러나, 특히 바람직한 켄칭 작용제는 모노-알데하이드 또는 모노에폭시드이다. 모노-알데하이드는 수용성이거나 수 불용성일 수 있다. 본 발명의 조성물에 존재하는 수용성 모노-알데하이드는 메타날, 에타날, 프로파날, 부타날, 펜타날 및 헥사날을 포함한다. 바람직한 수 불용성 모노-알데하이드는 헵타날, 옥타날, 및 데카날을 포함한다. 바람직한 모노에폭시드는 1 내지 약 10의 중합도를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 글리시딜 에테르를 포함한다.
켄칭 작용제는 복합체 내의 임의의 표면-노출된 양으로 하전된 잔여 기를 실질적으로 켄칭시키기에 충분한 양으로 조성물에 존재해야 하며, 이에 따라 상기 복합체는 토양에 존재하는 것과 같은 음으로 하전된 입자에 실질적으로 결합하지 않으며, 그 중 휴민산이 그 예이다. 숙련된 제형 화학자는 이들 양이 무엇인지 용이하게 결정할 수 있는 위치에 있으나, 통상적으로 이들은 1가 켄칭 작용제의 몰수가 복합체에 존재하는 아민의 몰수의 약 10% 내지 약 190%와 동등한 양으로 조성물에 존재하다(1차 아민은 켄칭 반응에 대해 2가인 반면, 2차 아민은 1가임을 인지).
폴리뉴클레오티드가 dsRNA인 경우, 이는 진핵 세포에서 유전자의 mRNA의 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 상세하게는, 진핵생물은 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(웨스턴 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 바르베리(노던 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(서던 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 비르기페라 제아에(멕시코 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 스페시오사(조롱박 벌레), 선충류, 방아벌레 및 유충으로 구성된 군으로부터 선택되는 곤충 및 적절한 토양 병원균, 예를 들어, 박테리아 및 진균일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 양이온성 중합체를 포함하는 복합체에서의 잔여 양전하의 중화는 복합체가 음전하를 함유하는 기질(복합체가 이에 적용됨) 상에서 또는 이를 통해서 더욱 자유롭게 이동하는 것을 가능하게 한다.
옥수수 뿌리 벌레의 제어는 살충제를 포함하는 조성물이 토양 관주의 일부로서 뿌리 벌레 유충을 포함하는 장소에 적용되는 경우에 반드시 완전히 효과적일 필요는 없는 것이 널리 공지되어 있다. 하나의 가능한 이유는 토양을 통한 살충 조성물의 이용 가능성 또는 이동이 활성 성분 및/또는 전체로서의 살충 제형과 그것이 적용되는 토양의 하전된 성분 사이의 정전기적 및/또는 다른 결합 상호작용에 의해 방해될 수 있다는 점이다. 이용 가능성이라 함은 활성 성분이 고체 성분에 흡수되는 대신 토양의 수성상에 남아 있음을 의미한다. 본 발명은 하기 비제한적인 실시예(들)로부터 추가로 명백해질 것이다.
도 1. 페길화 및 DEPC-처리 PEI 둘 모두는 변형되지 않은 PEI에 비해 결합 친화성이 저하되었다.
도 2. 페길화 PEI로 제조된 복합체는 토양에 덜 강하게 결합하여 토양 인큐베이션 후 상층액에 남는다. 페길화의 정도가 높을수록, 토양에 대한 복합체의 결합 친화성이 낮아진다.
도 3. 변형된 PEI(페길화 PEI)로 제조된 복합체에서의 용해질 dsRNA의 안정성. dsRNA는 페길화 PEI로 제조된 복합체에서 안정적이다.
도 4. 변형된 PEI(DEPC-처리 PEI)로 제조된 복합체에서의 용해질 dsRNA의 안정성. dsRNA는 DEPC-처리 PEI로 제조된 복합체에서 안정적이다.
도 5. CRW의 사망률은 변형되지 않은 PEI로 제조된 복합체와 비교하여 dsRNA가 페길화 PEI와 복합체화되는 경우에 개선되며, 이는 변형된 복합체에서의 dsRNA의 개선된 생체이용률을 제시한다.
도 6. CRW의 사망률은 변형되지 않은 PEI로 제조된 복합체와 비교하여 dsRNA가 DEPC-PEI와 복합체화되는 경우에 개선되며, 이는 변형된 복합체에서의 dsRNA의 개선된 생체이용률을 암시한다. PEI에서의 더 높은 변형 수준은 생체이용률이 개선되도록 한다.
하기 약어가 사용된다:
- % w/w = 전체 중량의 함수로서의 백분율
ODU = 광학 밀도 단위(600 ㎚에서의 흡광도)
PBS 완충액 = 인산염 완충 염수 완충액
BPEI 25kD = 분자량 25 kD의 분지형 폴리에틸렌이민(25000 g/㏖)
실시예 1.
대조군 샘플 A. 공칭 1 ㎎/㎖의 10 ㎕의 IVT dsRNA를 PBS 완충액 중 13 ㎕의 bPEI(분지형 폴리에틸렌이민) 60kDa의 10% 용액과 조합하였다. 이를 PBS 중에서 500 ㎕ 전체 부피로 희석시킨 후, 10 ㎎의 콜로이드 실리카[Aerosil 200, Evonik]와 조합하였다. 샘플을 2000 rpm에서 원심분리기에서 간단히 회전시키고, 상층액을 수집하였다. 1 ㎕의 1% 헤파린.Na 염을 첨가하여, 임의의 bPEI-dsRNA를 탈착시켰다. 전기영동 겔에서 영동시, dsRNA에 해당하는 밴드는 보이지 않았고, 이는 복합체 모두가 콜로이드 실리카에 결합되었음을 나타낸다.
시험 샘플 B. 이러한 샘플을 콜로이드 실리카와 조합하기 전, PBS 완충액 중 켄칭 펜타날 10% 용액 25 ㎕를 첨가하고, 1시간 동안 주위 조건하에서 반응시키는 것을 제외하고는 대조군 샘플 A와 동일한 방식으로 제조하였다. 이러한 경우, 자유 dsRNA에 해당하는 밴드가 보였고, 밴드 강도는 전체 dsRNA의 약 25%가 bPEI-dsRNA 복합체의 형태로 콜로이드 실리카에 결합되지 않았음을 나타내었다.
실시예 2.
PEI(=폴리에틸렌이민) 코팅된 세포는 토양에서 dsRNA의 안정성을 개선시킬 수 있다. 그러나, 세포의 PEI 코팅은 아민기와 토양의 산성기의 상호작용으로 인해 세포를 토양에 강하게 흡착시킬 수 있다. 이는 CRW에 대한 dsRNA의 토양 이동성 및 전달을 손상시킬 수 있다. PEI 코트와 글루타르알데하이드 또는 모노알데하이드(펜타날)를 반응시킴으로써, PEI 상의 자유 아민기가 켄칭되어 토양과의 이들의 상호작용이 감소될 수 있다. 그러나, 글루타르알데하이드를 이용한 켄칭은 어느 정도의 면상침전(flocculation)을 발생시키며, 이는 토양 이동성을 손상시킬 수 있다. 하기 제시되는 바와 같이, 모노알데하이드 처리는 면상침전을 발생시키지 않으며, 따라서 자유 아민을 켄칭시키기 위한 바람직한 방식일 수 있다.
1. 온전한 세포(ODU 글루타르알데하이드 당 0.002% w/w로 사전 처리한 후, 세척함)를 PBS 완충액 중 12 ODU/㎖로 재현탁시키고, 1 ㎖ 분취액으로 나누었다.
2.　BPEI 25 kD 용액을 2% w/w BPEI(약 pH 11) 및 1.25% w/w BPEI(약 pH 7)로 제조하였다.
3.　각각의 온전한 세포 분취액을 BPEI 용액을 이용하여 하기와 같이 처리하고, 관찰을 기록하였다:
분취액 1: BPEI(pH 11)를 0.1% w/w 최종 BPEI 농도로 첨가한 후, 0.2% 글루타르알데하이드로 처리하였다. 즉시 심한 면상침전이 관찰되었다.
분취액 2: BPEI(pH 11)를 0.1% w/w 최종 BPEI 농도로 첨가한 후, 0.2% 펜타날로 처리하였다. 면상침전이 관찰되지 않았다.
분취액 3: BPEI(pH 7)를 0.1% w/w 최종 BPEI 농도로 첨가한 후, 0.2% 글루타르알데하이드로 처리하였다. 분취액 1과 같이 심하지는 않지만 즉시 면상침전이 관찰되었고, 면상침전물의 입자 크기는 시각적으로 평가시 더 작았다.
분취액 4: BPEI(pH 7)를 0.1% w/w 최종 BPEI 농도로 첨가한 후, 0.2% 펜타날로 처리하였다. 면상침전이 관찰되지 않았다.
실시예 3.
폴리에틸렌이민(PEI)의 변형
에폭시-관능화된 PEG에 의한 PEI의 페길화
PEG-디글리시딜 에테르(500D)를 이(di)-관능화 PEG에서 에폭시기의 절반의 켄칭을 표적화 하기 위해 Tris-HCl(pH7)로 먼저 켄칭시켜 일(mono)-관능화 PEG를 생성시켰다. 이를, 반응을 표적화하는 비의 20% Tris-HCl 용액(pH 7)의 PEG-디글리시딜 에테르와 PEG 상의 에폭시기의 절반을 혼합한 후, 상승된 온도에서 밤새 인큐베이션함으로써 수행하였다. 이에 따라 획득된 mon-관능화 PEG를 PEI 상의 일차 아민의 다양한 수준의 페길화를 표적화(공칭상 일차 아민의 30%, 60% 및 90% 켄칭을 표적화함)하는 비로 분지된 PEI 용액(pH 7로 조정됨)과 혼합하였다. PEI 상의 일차 아민의 켄칭의 실제 정도를 비색 TNBSA (2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉) 검정을 수행하여 결정하였다. 획득된 실제 페길화는 하기와 같았고(표 1), 예상된 바와 같이, 일-기능성으로의 이-기능성 PEG의 전환이 특이적 반응이 아니고, 일차 아민의 이용 가능성을 차단하는 입체 장애로 인한 것을 포함하는 여러 가능한 이유로 공칭 표적화와 다소 상이하다. 켄칭의 공칭 정도와 실제 정도 사이의 차이는 실험의 결과에 영향을 미치지 않는데, 이는 실험이 켄칭의 실제 정도의 범위에 걸쳐 있도록 설계되었기 때문이다.
Figure pct00001
표 1
디에틸피로카르보네이트에 의한 PEI의 변형
DEPC에 의한 일차 아민의 다양한 켄칭 수준을 표적화(공칭상 25%, 50% 및 75% 켄칭을 표적화함) 하도록 pH 7로 조정된 PEI 용액으로의 DEPC의 직접 첨가에 의한 디에틸피로카르보네이트(DEPC)와의 반응에 의해 PEI 상의 일차 아민을 켄칭시켰다. PEI 상의 일차 아민의 실제 켄칭 정도를 비색 TNBSA (2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉) 검정을 수행하여 결정하였다. 측정된 DEPC 변형의 실제 수준은 다음과 같았고(표 2), 상기 논의된 바와 같이, 켄칭의 표적화 정도와 실제 정도 사이의 불일치는 실험의 결과에 영향을 미치지 않는다.
Figure pct00002
표 2
실시예 4.
토양에 대한 변형된 PEI 대 변형되지 않은 PEI의 결합 친화성 평가
변형되지 않은 PEI 용액 및 페길화 또는 DEPC에 의해 변형된 PEI의 용액을 1시간 동안 2:1(용액:토양) wt/wt의 비로 토양과 함께 인큐베이션하였다. 시험된 용액의 농도는 0 내지 0.08%의 PEI로 다양하였다. 토양 인큐베이션 후, 토양을 원심분리에 의해 PEI 용액으로부터 분리시켰다. 용액에 남아 있는 결합되지 않은 PEI를 TNBSA 검정으로 평가하였다. 토양에 대한 PEI의 결합 프로파일은 결합 등온선에 의해 표시되었다(도 1). PEI에서의 일차 아민 켄칭의 수준은 범례에서 괄호 내의 숫자로 표시된다.
실시예 5.
dsRNA-PEI 복합체의 결합 친화성
dsRNA를 발현하는 에스케리치아 콜라이(E. coli) 세포 용해질을 다음과 같이 PEI 용액과 혼합하였다: 용해질을 25 OD/㎖로 희석시키고, PEI 용액을 용해질에 0.75%의 최종 농도로 첨가하였다. 용해질 dsRNA-PEI 복합체 용액을 2.5배 추가 희석시키고, 1시간 동안 2:1의 용액:토양 wt/wt 비로 토양과 함께 인큐베이션하였다. 제형화되지 않은 용해질 용액을 대조군으로 사용하였다. 이후, 토양을 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 상층액 내의 결합되지 않은 전체 RNA를 다중음이온의 첨가에 의해 복합체로부터 추출하여 PEI로부터 dsRNA를 탈착시킨 후, RNAZol RT 추출하였다. 샘플의 상층액에 존재하는 전체 RNA 농도를 UV-Vis 분광법으로 정량하였다(도 2).
실시예 6
변형된 PEI로 제조된 복합체에서의 용해질-dsRNA의 안정성 평가
dsRNA를 발현하는 에스케리치아 콜라이 세포 용해질을 다음과 같이 PEI 용액과 혼합하였다: 용해질을 50 OD/㎖로 희석시키고, PEI 용액을 용해질에 0.5%(1X PEI) 또는 1.5%(3X PEI)의 최종 농도로 첨가하였다. 용해질 dsRNA-PEI 복합체 용액을 37℃에서 밤새 RNAse III와 함께 인큐베이션하였다. 전체 RNA를 다중음이온의 첨가에 의해 복합체로부터 추출하여 PEI로부터 dsRNA를 탈착시킨 후, RNAZol RT 추출하였다. dsRNA의 온전성을 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 평가하였다(도 3 및 도 4).
실시예 7
변형된 PEI로 제조된 복합체에서의 dsRNA의 생체이용률 평가
인공 웨스턴 옥수수 뿌리벌레 식이-포함 생물학적 검정을 변형된 PEI 및 dsRNA를 발현하는 에스케리치아 콜라이 용해질로 제조된 복합체에 대해 수행하였다. 용해질 제형을 RNAse 비함유 물을 이용하여 희석시키고, 균일해질 때까지 볼텍스-혼합에 의해 동일량의 식이(0.5 ㎖ 식이 및 0.5 ㎖ 희석 제형 용액)와 함께 잘 혼합하였다. 각각의 제형 유형 및 각각의 복제 플레이트에 대해 3회의 복제를 수행하였고, 약 12개의 신생아 유충을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 인큐베이션하였다. 검정 기간 동안 격일로 사망률을 기록하였다. 최종 사망률이 도 5 및 도 6에 제시되며, 이는 켄칭된 복합체의 개선된 활성을 나타낸다. 이러한 발견은 또한 토양에서의 생물학적 검정에 의해 확인되었다.
도면 설명
도 1. 페길화 및 DEPC-처리 PEI 둘 모두는 변형되지 않은 PEI에 비해 결합 친화성이 저하되었다.
도 2. 페길화 PEI로 제조된 복합체는 토양에 덜 강하게 결합하여 토양 인큐베이션 후 상층액에 남는다. 페길화의 정도가 높을수록, 토양에 대한 복합체의 결합 친화성이 낮아진다.
도 3. 변형된 PEI(페길화 PEI)로 제조된 복합체에서의 용해질 dsRNA의 안정성. dsRNA는 페길화 PEI로 제조된 복합체에서 안정적이다.
도 4. 변형된 PEI(DEPC-처리 PEI)로 제조된 복합체에서의 용해질 dsRNA의 안정성. dsRNA는 DEPC-처리 PEI로 제조된 복합체에서 안정적이다.
도 5. CRW의 사망률은 변형되지 않은 PEI로 제조된 복합체와 비교하여 dsRNA가 페길화 PEI와 복합체화되는 경우에 개선되며, 이는 변형된 복합체에서의 dsRNA의 개선된 생체이용률을 제시한다.
도 6. CRW의 사망률은 변형되지 않은 PEI로 제조된 복합체와 비교하여 dsRNA가 DEPC-PEI와 복합체화되는 경우에 개선되며, 이는 변형된 복합체에서의 dsRNA의 개선된 생체이용률을 암시한다. PEI에서의 더 높은 변형 수준은 생체이용률이 개선되도록 한다.

Claims (23)

  1. 토양에 존재하는 음으로 하전된 분자에 대한 양이온성 중합체와 폴리뉴클레오티드 사이에 형성된 복합체를 포함하는 조성물의 결합을 억제하거나 실질적으로 감소시키는 방법으로서, 복합체 상에 표면-노출된 양전하를 실질적으로 중화시킬 수 있는 켄칭 작용제를 조성물에 포함시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 dsRNA이고, 중합체가 폴리아민이고, 켄칭 작용제가 모노-알데하이드인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중합체가 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민, 폴리펩티드 또는 양이온성 다당류인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 음으로 하전된 입자가 휴민산(humic acid)을 포함하는 방법.
  5. a) 양이온성 중합체와 dsRNA 사이에 형성된 복합체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계,
    b) a)의 복합체의 표면-노출된 양전하를 켄칭 작용제로 실질적으로 중화시키는 단계, 및
    c) b)의 조성물을 토양에 적용하는 단계를 포함하는, 지하 식물 해충 감염을 제어하는 방법으로서,
    상기 dsRNA가 상기 지하 식물 해충의 표적 유전자의 전사 후 침묵을 초래하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 지하 식물 해충이 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(Diabrotica virgifera virgifera)(웨스턴 옥수수 뿌리벌레(Western corn rootworm)), 디아브로티카 바르베리(Diabrotica barberi)(노던 옥수수 뿌리벌레(Northern corn rootworm)), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(Diabrotica undecimpunctata howardi)(서던 옥수수 뿌리벌레(Southern corn rootworm)), 디아브로티카 비르기페라 제아에(Diabrotica virgifera zeae)(멕시코 옥수수 뿌리벌레(Mexican corn rootworm)), 디아브로티카 스페시오사(Diabrotica speciosa)(조롱박 벌레(cucurbit beetle)), 선충류(nematodes), 방아벌레(wireworm) 및 유충(grub) 및 적절한 토양 병원균, 예를 들어, 박테리아 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 지하 식물 해충이 디아브로티카 곤충인 방법.
  8. 폴리뉴클레오티드 및 양이온성 중합체를 포함하는 복합체 내의 양으로 하전된 잔여 기를 실질적으로 중화시키기 위한 켄칭 작용제의 용도.
  9. 양이온성 중합체와 폴리뉴클레오티드 사이에 형성된 복합체, 및 복합체 상에 표면-노출된 양으로 하전된 잔여 기를 실질적으로 중화시킬 수 있는 켄칭 작용제를 포함하는 조성물로서, 중합체가 분지형 또는 선형 폴리에틸렌이민, 이미다졸 함유 중합체, 키토산, 양이온성 다당류, 폴리아미도아민, 아민기를 포함하는 리신, 히스티딘 및 아르기닌과 같은 아미노산의 중합체 및 공중합체, 및 폴리아민으로 구성된 군으로부터 선택되고, 그렇지 않다면 표면-노출된 양으로 하전된 기가 토양에 대한 복합체의 흡착을 야기하는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 중합체가 분지형 또는 선형 폴리에틸렌이민인 조성물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 dsRNA인 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 폴리아민인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 폴리아민이 적어도 5개의 아민기를 포함하는 선형 및 분지형 폴리아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체가 세포 용해질에 포함되거나 온전한 세포 내에서 형성되고 켄칭 작용제가 그에 첨가되는 조성물.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 이소시아네이트, 모노 알데하이드, 모노-에폭시드, 모노-에스테르, 모노-카르복실산, 모노-무수물 및 아민과 반응성인 단일기를 함유하는 다른 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 모노 알데하이드가 수용성인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 모노 알데하이드가 메타날, 에타날, 프로파날, 부타날, 펜타날 및 헥사날로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 모노-알데하이드가 실질적으로 수 불용성인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 모노-알데하이드가 헵타날, 옥타날, 및 데카날로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 토양에 존재하는 것과 같은 음으로 하전된 입자에 실질적으로 결합하지 않도록 복합체에서 양으로 하전된 충분한 잔여 기를 켄칭시키기에 충분한 양의 모노-알데하이드를 함유하는 조성물.
  21. 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 진핵 세포 내의 유전자의 mRNA의 서열과 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 dsRNA인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 진핵생물이 디아브로티카 비르기페라 비르기페라(웨스턴 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 바르베리(노던 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디(서던 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 비르기페라 제아에(멕시코 옥수수 뿌리벌레), 디아브로티카 스페시오사(조롱박 벌레), 선충류, 방아벌레 및 유충으로 구성된 군으로부터 선택되는 곤충 및 적절한 토양 병원균, 예를 들어, 박테리아 및 진균인 조성물.
  23. 폴리뉴클레오티드 및 양이온성 중합체를 복합체화시키는 단계 및 켄칭 작용제의 첨가에 의해 복합체 내의 잔여 양전하를 켄칭시키는 단계를 포함하는, 제9항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하는 방법.
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