JP6999659B2 - 遺伝子サイレンシングにおける向上または遺伝子サイレンシングに関する向上 - Google Patents
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Description
本発明は、二本鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の制御に関する。特に、本発明は、外来に投与された二本鎖ＲＮＡ（すなわち、標的生体の外部から、かつ、比較的厳しい環境条件下で）の、その生体における遺伝子発現をサイレンシングする能力を増強する方法に関する。本発明はまた、本方法において用いられる組成物、および、本方法における、特にｄｓＲＮＡといったポリヌクレオチドとカチオン性ポリマーとを含む錯体における正電荷を「クエンチ」する公知の薬剤の使用に関する。
潜在的に遺伝子発現をサイレンシングするＲＮＡ干渉の現象は周知である。
ＲＮＡは比較的不安定であり、細胞外においても偏在的に存在する例えばリボヌクレアーゼによって急速に分解されることが可能である。標的生体に対する直接的なｄｓＲＮＡの適用、または、標的生体が存在する生息地に対する外来性の投与を介したｄｓＲＮＡの適用に伴う問題は、ＲＮＡの低い安定性に対する懸念である。
外来性の適用とは、標的生体が取り込み可能であるような標的生体への適用、または、ｄｓＲＮＡが標的生体とは異なる第１の生体中において産生され、第１の生体もしくはｄｓＲＮＡを含むその一部が標的生体によって取り込まれるような標的生体への適用であって、いずれにおいても、前記ｄｓＲＮＡが、ｄｓＲＮＡによって構成されているものに相当するヌクレオチド配列を含む遺伝子の転写後サイレンシングをもたらすことが可能であるような適用を意味する。
外来性の適用は内在性の産生とは区別されるものであり、内在性の産生とは、標的生体中の細胞中における、標的化遺伝子の転写後サイレンシングが可能である二本鎖ＲＮＡの産生（一般に、適切な非相同配列からの発現を介する）を意味する。
外来性に適用されたｄｓＲＮＡは一般に、短期間の間（おそらくは適用後数日間以内）に関連する生物学的効果をもたらすことが可能であるが、ｄｓＲＮＡは、例えば土壌において、さらに、投与される環境における正確な条件に応じて、約１２～２４時間未満の半減期を典型的に有するために、一般的に効果は急速に低減してしまう。
ｄｓＲＮＡをカプセル化するか、または、ｄｓＲＮＡの安定性を高めるポリマーとｄｓＲＮＡとを結合させることによりｄｓＲＮＡを安定化させ、これにより作用期間を延長させるものを含む種々の解決策がこの問題に対して提示されている。このような安定化されたｄｓＲＮＡはそれ自体に問題が無いわけではないが、しかしながら、ｄｓＲＮＡとカチオン性ポリマーとにより形成された錯体が、生息地に存在する荷電粒子によって結合されるか、または、そうでなくてもこのような荷電粒子に結合し得る限りにおいては、その利用可能性が低減されるか、または、生息地中における錯体の移動であって、典型的には、標的生体が位置する場所への移動が妨げられてしまう。この問題は、ｄｓＲＮＡが最初に適用された場所から遠ざかる標的生体の移動によって悪化してしまう。
それ故、本発明は、一方では、所望される生物学的効果をもたらすことが可能であるようｄｓＲＮＡを十分に安定化させるという問題、および、他方では、このようにして安定化されたｄｓＲＮＡの利用可能性を維持することを可能とし、または、標的生体が位置している生息地内で移動するもしくは移動されることを可能とするという問題に対する解決策に関する。
本発明によれば、カチオン性ポリマーおよびポリヌクレオチドにより形成された錯体を含む組成物の土壌中に存在する負電荷（negatively charged）分子に対する結合を阻害または実質的に低減する方法であって、組成物に、錯体上の正電荷を実質的に中和することが可能であるクエンチング剤を含ませるステップを含む方法が提供されている。
本発明の組成物の特に好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドはｄｓＲＮＡであり、ポリマーはポリアミンであり、および、クエンチング剤はモノアルデヒドまたはモノエポキシドである。
本発明の特に好ましい実施形態において、ポリマーは、直鎖もしくは分岐鎖ポリエチレンイミン、ポリペプチドまたはカチオン性多糖類である。
本発明の特に好ましい実施形態において、ポリマーは直鎖または分岐鎖ポリエチレンイミンである。
本発明の特に好ましい実施形態において、負電荷粒子はフミン酸を含む。
本発明はまた、地下植物有害生物による外寄生の防除方法であって；
ａ）カチオン性ポリマーおよびｄｓＲＮＡにより形成された錯体を含む組成物、
ｂ）クエンチング剤でａ）に係る錯体の表面に露出した正電荷を実質的に中和するステップ、ならびに
ｃ）ｂ）に係る組成物を土壌に適用するステップ、
を含み、ｄｓＲＮＡが、前記地下植物有害生物における標的遺伝子の転写後サイレンシングをもたらす、方法を提供する。
ａ）カチオン性ポリマーおよびｄｓＲＮＡにより形成された錯体を含む組成物、
ｂ）クエンチング剤でａ）に係る錯体の表面に露出した正電荷を実質的に中和するステップ、ならびに
ｃ）ｂ）に係る組成物を土壌に適用するステップ、
を含み、ｄｓＲＮＡが、前記地下植物有害生物における標的遺伝子の転写後サイレンシングをもたらす、方法を提供する。
地下植物有害生物としては、例えば幼生期といったライフサイクルの少なくとも一部において土壌中に生息する有害生物が挙げられる。
地下有害生物としては、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｂｅｅｔｌｅ））、線虫、ハリガネムシおよびウジ、ならびに、細菌および真菌などの適切な土壌病原体からなる群におけるものが挙げられる。
好ましくは、地下有害生物は、ディアブロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）種である。
本発明はまた、ポリヌクレオチドおよびカチオン性ポリマーを含む錯体における残存正電荷（positively charged）基を実質的に中和するためのクエンチング剤の使用を提供する。
本発明はまた、カチオン性ポリマーおよびポリヌクレオチドにより形成された錯体と、錯体において残存する表面に露出した正電荷基を実質的に中和可能であるクエンチング剤とを含む組成物を提供し、ここで、ポリマーは、分岐または線状ポリエチレンイミン、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、カチオン性多糖類、ポリアミドアミン、アミン基を含むリシン、ヒスチジンおよびアルギニンなどのアミノ酸のポリマーおよびコポリマー、ならびに、ポリアミンからなる群から選択される。
本発明の特に好ましい実施形態において、組成物中に存在するカチオン性ポリマーは分岐または線状ポリエチレンイミンである。
錯体とは、２つ以上の構成分子化合物（イオン性または非荷電）が関与する緩い会合によって形成される分子化合物を意味する。
カチオン性ポリマーおよびポリヌクレオチドが錯体を形成する場合、ポリヌクレオチドにおける正味負電荷は、カチオン性ポリマーの表面に露出した正電荷基のすべての相殺または「中和」には不十分であり得、結果的に、錯体は表面に露出した残存する正電荷基を含んでいる。
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり得る。ＲＮＡはｄｓＲＮＡであり得るが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または、ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングが可能であるいずれかの他のＲＮＡ分子でもあり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドはｄｓＲＮＡである。
好ましくは、ｄｓＲＮＡは、標的生体中の標的遺伝子と同等または補完的である、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、または、それ以上のヌクレオチドを含む。
好適な標的遺伝子は、転写後サイレンシングが標的生体に有害な影響を有するものである。例えば、成長に関する変化、発育阻止、死亡率の増加、生殖能力の低下もしくは繁殖力の低下、摂食行動もしくは動作の低下もしくは休止、または、変態段階の発達の低下もしくは休止である。
カチオン性ポリマーは、分岐または線状ポリエチレンイミン、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、カチオン性多糖類、ポリアミドアミン、ならびに、第三級アミノ基を含むリシンおよびアルギニンなどのアミノ酸のポリマーからなる群から選択され得る。あるいは、カチオン性ポリマーは、ポリアミン、または、少なくとも５つのアミン基を含む分岐ポリアミンであり得る。スペルミン、スペルミジン、プトレシンおよびカダベリンなどの単純なポリアミンは、ポリヌクレオチドがｄｓＲＮＡである場合には特に好ましくない。これは、このような単純なポリアミンとｄｓＲＮＡとによって形成された錯体に残存するいずれかの電荷を中和するためにクエンチング剤を使用すると、錯体の解離を生じさせてしまう可能性があるためである。
組成物の好ましい実施形態において、錯体は細胞ライセート中に含まれているか、または、無傷細胞中において形成されており、および、クエンチング剤が添加されている。
クエンチング剤に関しては、アミンと反応してその正電荷をクエンチすることが可能である単一の基を含有するいずれかのものであれば十分であるが、イソシアネート、モノエポキシド、モノエステル、モノカルボン酸、一無水物、モノアルデヒドおよびピロカーボネートを含む、いく種かのクエンチング剤が好ましい。
しかしながら、特に好ましいクエンチング剤は、モノアルデヒドまたはモノエポキシドである。モノアルデヒドは、水溶性または水不溶性であり得る。本発明の組成物中に存在する水溶性モノアルデヒドとしては、メタナール、エタナール、プロパナール、ブタナール、ペンタナールおよびヘキサナールが挙げられる。好ましい水不溶性モノアルデヒドとしては、ヘプタナール、オクタナールおよびデカナールが挙げられる。好ましいモノエポキシドとしては、１～約１０の範囲の重合度を有するポリエチレングリコールグリシジルエーテルが挙げられる。
クエンチング剤は、土壌中に存在するものなどの負電荷粒子に錯体が実質的に結合しないよう、錯体におけるいずれかの残存する表面に露出した正電荷基を実質的にクエンチするために十分な量で組成物中に存在しているべきであり、フミン酸がその一例である。配合化学に係る当業者は、これらの量がどの程度であるかを容易に判定できる立場にあるが、典型的には、クエンチング剤は、一価クエンチング剤のモル数が錯体中に存在するアミンのモル数の約１０％～約１９０％に等しくなるような量で組成物中に存在する（クエンチング反応に係る第一級アミンは二価であるが、第二級アミンは一価であることが認識される）。
ポリヌクレオチドがｄｓＲＮＡである場合、これは、真核細胞中の遺伝子のｍＲＮＡの配列と実質的に同等である配列を含む。特に、真核生物は、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｂｅｅｔｌｅ））、線虫、ハリガネムシおよびウジから群から選択される昆虫、ならびに、細菌および真菌などの適切な土壌病原体であり得る。ポリヌクレオチドおよびカチオン性ポリマーを含む錯体中における残存する正電荷の中和により、錯体が適用される負電荷を含有する基剤上またはその中における錯体のさらに自由な移動が可能となる。
ネクイムシの幼虫が存在している生息地に土壌潅注の一部として殺虫剤を含む組成物が適用される場合には、コーンルートワームの防除は全体的に効果的であることは必ずしも必須ではないことが周知である。考えられる１つの理由は、土壌中における殺虫性組成物の利用可能性または移動性が、全体としての有効成分および／または殺虫性配合物と適用先である土壌の荷電成分との間に係る静電的および／または他の結合性相互作用によって妨げられてしまう場合があるということである。利用可能性とは、有効成分が、固体成分に吸着されているのではなく、土壌の水相に残っていることを意味する。
本発明は、以下の非限定的な実施例からさらに明確になるであろう。
以下の略語が用いられている：
－％ ｗ／ｗ＝総重量の関数としての割合
ＯＤＵ＝光学密度単位（６００ｎｍにおける吸光度）
ＰＢＳ緩衝剤＝リン酸緩衝生理食塩水緩衝剤
ＢＰＥＩ ２５ｋＤ＝分子量２５ｋＤ（２５０００ｇ／ｍｏｌ）の分岐ポリエチレンイミン
－％ ｗ／ｗ＝総重量の関数としての割合
ＯＤＵ＝光学密度単位（６００ｎｍにおける吸光度）
ＰＢＳ緩衝剤＝リン酸緩衝生理食塩水緩衝剤
ＢＰＥＩ ２５ｋＤ＝分子量２５ｋＤ（２５０００ｇ／ｍｏｌ）の分岐ポリエチレンイミン
実施例１．
対照サンプルＡ．１０μＬのＩＶＴ ｄｓＲＮＡ（公称１ｍｇ／ｍＬ）を、ｂＰＥＩ（分岐ポリエチレンイミン）６０ｋＤａのＰＢＳ緩衝剤中の１０％溶液（１３μＬ）と組み合わせた。これをＰＢＳ中に５００μＬの総体積に希釈し、次いで、１０ｍｇコロイダルシリカ［Ａｅｒｏｓｉｌ ２００，Ｅｖｏｎｉｋ］と組み合わせた。サンプルを２０００ｒｐｍで短時間の間遠心分離にかけ、上澄を回収した。１μＬの１％ヘパリン．Ｎａ塩を添加して、ｂＰＥＩ－ｄｓＲＮＡをすべて脱錯化した。電気泳動ゲル上を泳動させたところｄｓＲＮＡに相当するバンドは視認されず、すべての錯体がコロイダルシリカに結合していたことが示された。
対照サンプルＡ．１０μＬのＩＶＴ ｄｓＲＮＡ（公称１ｍｇ／ｍＬ）を、ｂＰＥＩ（分岐ポリエチレンイミン）６０ｋＤａのＰＢＳ緩衝剤中の１０％溶液（１３μＬ）と組み合わせた。これをＰＢＳ中に５００μＬの総体積に希釈し、次いで、１０ｍｇコロイダルシリカ［Ａｅｒｏｓｉｌ ２００，Ｅｖｏｎｉｋ］と組み合わせた。サンプルを２０００ｒｐｍで短時間の間遠心分離にかけ、上澄を回収した。１μＬの１％ヘパリン．Ｎａ塩を添加して、ｂＰＥＩ－ｄｓＲＮＡをすべて脱錯化した。電気泳動ゲル上を泳動させたところｄｓＲＮＡに相当するバンドは視認されず、すべての錯体がコロイダルシリカに結合していたことが示された。
テストサンプルＢ．このサンプルは、コロイダルシリカと組み合わせる前に、ＰＢＳ緩衝剤中のクエンチペンタナール１０％溶液（２５μＬ）を添加し、周囲条件下で１時間反応させたことを除き、対照サンプルＡと同じく調製した。この場合、遊離ｄｓＲＮＡに相当するバンドが視認され、バンド強度は、合計ｄｓＲＮＡの約２５％がｂＰＥＩ－ｄｓＲＮＡ錯体の形態でコロイダルシリカに結合していなかったことを示していた。
実施例２．
ＰＥＩ（＝ポリエチレンイミン）でコーティングされた細胞は、土壌中におけるｄｓＲＮＡの安定性が向上し得る。しかしながら、細胞のＰＥＩコーティングは、土壌中の酸基に対するアミン基の相互作用に起因する、土壌に対する細胞の強固な吸着を生じさせ得る。これによって、土壌易動性およびＣＲＷに対するｄｓＲＮＡの送達が損なわれ得る。ＰＥＩコーティングをグルタルアルデヒドまたはモノアルデヒド（ペンタナール）と反応させることにより、ＰＥＩ上の遊離アミン基が、土壌との相互作用が低減されるようクエンチされ得る。しかしながら、グルタルアルデヒドによるクエンチングは、ある程度の凝集をもたらし、これが土壌易動性を損なわせ得る。以下に示すとおり、モノアルデヒド処理は凝集をもたらさず、従って、遊離アミンをクエンチするための好ましい方法であり得る。
ＰＥＩ（＝ポリエチレンイミン）でコーティングされた細胞は、土壌中におけるｄｓＲＮＡの安定性が向上し得る。しかしながら、細胞のＰＥＩコーティングは、土壌中の酸基に対するアミン基の相互作用に起因する、土壌に対する細胞の強固な吸着を生じさせ得る。これによって、土壌易動性およびＣＲＷに対するｄｓＲＮＡの送達が損なわれ得る。ＰＥＩコーティングをグルタルアルデヒドまたはモノアルデヒド（ペンタナール）と反応させることにより、ＰＥＩ上の遊離アミン基が、土壌との相互作用が低減されるようクエンチされ得る。しかしながら、グルタルアルデヒドによるクエンチングは、ある程度の凝集をもたらし、これが土壌易動性を損なわせ得る。以下に示すとおり、モノアルデヒド処理は凝集をもたらさず、従って、遊離アミンをクエンチするための好ましい方法であり得る。
１．無傷細胞（事前に０．００２％ ｗ／ｗ／ＯＤＵグルタルアルデヒドで処理し、次いで、洗浄した）をＰＢＳ緩衝剤中の１２ＯＤＵ／ｍＬで再度懸濁させ、１ｍＬアリコートに分割した。
２．ＢＰＥＩ ２５ｋＤ溶液を、２％ ｗ／ｗ ＢＰＥＩ（ｐＨ約１１）および１．２５％ ｗ／ｗ ＢＰＥＩ（ｐＨ約７）で調製した。
３．以下のとおり各無傷細胞アリコートをＢＰＥＩ溶液で処理し、所見を報告した：
アリコート１：ＢＰＥＩ（ｐＨ１１）を０．１％ ｗ／ｗ最終ＢＰＥＩ濃度に添加し、次いで、０．２％グルタルアルデヒドで処理した。直後に、激しい凝集が観察された。
アリコート１：ＢＰＥＩ（ｐＨ１１）を０．１％ ｗ／ｗ最終ＢＰＥＩ濃度に添加し、次いで、０．２％グルタルアルデヒドで処理した。直後に、激しい凝集が観察された。
アリコート２：ＢＰＥＩ（ｐＨ１１）を０．１％ ｗ／ｗ最終ＢＰＥＩ濃度に添加し、次いで、０．２％ペンタナールで処理した。凝集は観察されなかった。
アリコート３：ＢＰＥＩ（ｐＨ７）を０．１％ ｗ／ｗ最終ＢＰＥＩ濃度に添加し、次いで、０．２％グルタルアルデヒドで処理した。直後に、凝集が観察されたがアリコート１ほど激しくはなく、視認による評価で凝集粒子の粒径は小さかった。
アリコート４：ＢＰＥＩ（ｐＨ７）を０．１％ ｗ／ｗ最終ＢＰＥＩ濃度に添加し、次いで、０．２％ペンタナールで処理した。凝集は観察されなかった。
実施例３．
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の修飾
エポキシ－官能基化ＰＥＧによるＰＥＩのＰＥＧ化
二官能基化ＰＥＧ中のエポキシ基の半数がクエンチングされることを目標として、ＰＥＧ－ジグリシジルエーテル（５００Ｄ）を先ずトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７）によりクエンチして単官能基化ＰＥＧを得た。これは、ＰＥＧにおけるエポキシ基の半数との反応を目標とする比率でＰＥＧ－ジグリシジルエーテルの２０％トリス－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７）を混合し、続いて、高温で一晩インキュベーションすることにより行った。このようにして得た単官能基化ＰＥＧを、ＰＥＩにおける第一級アミンの種々のレベルのＰＥＧ化（通常、第一級アミンの３０％、６０％および９０％クエンチングを目標とする）を目標とした比率で、分岐ＰＥＩ溶液（ｐＨ７に調節した）と混合した。ＰＥＩにおける第一級アミンの実際のクエンチングレベルは、比色ＴＮＢＳＡ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイを行うことにより判定した。実際に得られたＰＥＧ化レベルは以下のとおりであり（表１）、これらは、予測どおり、数々の考えられる理由のために公称目標からある程度異なっており、この理由には、二官能性ＰＥＧの単官能性への転換は特異反応ではなく、第一級アミンの利用可能性を阻止する立体障害によるものであるということが含まれる。公称および実際のクエンチングレベル間の差異は、実際のクエンチングレベルの範囲に及ぶよう設計されたため、実験の結果に影響しない。
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の修飾
エポキシ－官能基化ＰＥＧによるＰＥＩのＰＥＧ化
二官能基化ＰＥＧ中のエポキシ基の半数がクエンチングされることを目標として、ＰＥＧ－ジグリシジルエーテル（５００Ｄ）を先ずトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７）によりクエンチして単官能基化ＰＥＧを得た。これは、ＰＥＧにおけるエポキシ基の半数との反応を目標とする比率でＰＥＧ－ジグリシジルエーテルの２０％トリス－ＨＣｌ溶液（ｐＨ７）を混合し、続いて、高温で一晩インキュベーションすることにより行った。このようにして得た単官能基化ＰＥＧを、ＰＥＩにおける第一級アミンの種々のレベルのＰＥＧ化（通常、第一級アミンの３０％、６０％および９０％クエンチングを目標とする）を目標とした比率で、分岐ＰＥＩ溶液（ｐＨ７に調節した）と混合した。ＰＥＩにおける第一級アミンの実際のクエンチングレベルは、比色ＴＮＢＳＡ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイを行うことにより判定した。実際に得られたＰＥＧ化レベルは以下のとおりであり（表１）、これらは、予測どおり、数々の考えられる理由のために公称目標からある程度異なっており、この理由には、二官能性ＰＥＧの単官能性への転換は特異反応ではなく、第一級アミンの利用可能性を阻止する立体障害によるものであるということが含まれる。公称および実際のクエンチングレベル間の差異は、実際のクエンチングレベルの範囲に及ぶよう設計されたため、実験の結果に影響しない。
ジエチルピロカーボネートによるＰＥＩの修飾
ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）による第一級アミンの様々なレベルのクエンチング（とりわけ、２５％、５０％および７５％の目標クエンチング）を目標として、ｐＨ７に調節したＰＥＩ溶液にＤＥＰＣを直接添加することにより、ＤＥＰＣを伴う反応によりＰＥＩにおける第一級アミンをクエンチした。ＰＥＩにおける第一級アミンの実際のクエンチングレベルは、比色ＴＮＢＳＡ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイを行うことにより判定した。実測されたＤＥＰＣ修飾の実際のレベルは以下のとおりであり（表２）、また、上記のとおり、標的化および実際のクエンチングレベル間の矛盾は実験の結果に影響しない。
ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）による第一級アミンの様々なレベルのクエンチング（とりわけ、２５％、５０％および７５％の目標クエンチング）を目標として、ｐＨ７に調節したＰＥＩ溶液にＤＥＰＣを直接添加することにより、ＤＥＰＣを伴う反応によりＰＥＩにおける第一級アミンをクエンチした。ＰＥＩにおける第一級アミンの実際のクエンチングレベルは、比色ＴＮＢＳＡ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイを行うことにより判定した。実測されたＤＥＰＣ修飾の実際のレベルは以下のとおりであり（表２）、また、上記のとおり、標的化および実際のクエンチングレベル間の矛盾は実験の結果に影響しない。
実施例４．
土壌に対する修飾ＰＥＩ対未修飾ＰＥＩの結合親和性の評価
未修飾ＰＥＩ溶液およびＰＥＧ化またはＤＥＰＣによる修飾ＰＥＩの溶液を、２：１（溶液：土壌）ｗｔ／ｗｔの比率で１時間、土壌と共にインキュベートした。テストした溶液の濃度はＰＥＩの０～０．０８％で様々であった。土壌インキュベーションの後、土壌を遠心分離によりＰＥＩ溶液から分離した。溶液中に残った未結合のＰＥＩをＴＮＢＳＡアッセイにより評価した。ＰＥＩの土壌に対する結合プロファイルを等温線を結合することにより表した（図１）。ＰＥＩにおける第一級アミンクエンチングのレベルは、説明文中の括弧中の数字で示した。
土壌に対する修飾ＰＥＩ対未修飾ＰＥＩの結合親和性の評価
未修飾ＰＥＩ溶液およびＰＥＧ化またはＤＥＰＣによる修飾ＰＥＩの溶液を、２：１（溶液：土壌）ｗｔ／ｗｔの比率で１時間、土壌と共にインキュベートした。テストした溶液の濃度はＰＥＩの０～０．０８％で様々であった。土壌インキュベーションの後、土壌を遠心分離によりＰＥＩ溶液から分離した。溶液中に残った未結合のＰＥＩをＴＮＢＳＡアッセイにより評価した。ＰＥＩの土壌に対する結合プロファイルを等温線を結合することにより表した（図１）。ＰＥＩにおける第一級アミンクエンチングのレベルは、説明文中の括弧中の数字で示した。
実施例５．
ｄｓＲＮＡ－ＰＥＩ錯体の結合親和性
ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ライセートを、以下のとおりＰＥＩ溶液と混合した：ライセートを２５ＯＤ／ｍＬに希釈し、ＰＥＩ溶液を、０．７５％の最終濃度でライセートに添加した。ライセートｄｓＲＮＡ－ＰＥＩ錯体溶液を２．５倍にさらに希釈し、２：１（溶液：土壌）ｗｔ／ｗｔの比率で１時間、土壌と共にインキュベートした。未配合のライセート溶液を対照として用いた。その後、土壌を遠心分離によりペレット化し、ポリアニオンを添加することにより上澄中の未結合全ＲＮＡを錯体から抽出してＰＥＩからｄｓＲＮＡを脱錯化し、続いて、ＲＮＡＺｏｌ ＲＴ抽出を行った。サンプルの上澄中に存在する全ＲＮＡ濃度をＵＶ－Ｖｉｓ分光分析により定量化した（図２）。
ｄｓＲＮＡ－ＰＥＩ錯体の結合親和性
ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ライセートを、以下のとおりＰＥＩ溶液と混合した：ライセートを２５ＯＤ／ｍＬに希釈し、ＰＥＩ溶液を、０．７５％の最終濃度でライセートに添加した。ライセートｄｓＲＮＡ－ＰＥＩ錯体溶液を２．５倍にさらに希釈し、２：１（溶液：土壌）ｗｔ／ｗｔの比率で１時間、土壌と共にインキュベートした。未配合のライセート溶液を対照として用いた。その後、土壌を遠心分離によりペレット化し、ポリアニオンを添加することにより上澄中の未結合全ＲＮＡを錯体から抽出してＰＥＩからｄｓＲＮＡを脱錯化し、続いて、ＲＮＡＺｏｌ ＲＴ抽出を行った。サンプルの上澄中に存在する全ＲＮＡ濃度をＵＶ－Ｖｉｓ分光分析により定量化した（図２）。
実施例６
修飾ＰＥＩで形成した錯体中のライセート－ｄｓＲＮＡの安定性の評価
ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ライセートを、以下のとおりＰＥＩ溶液と混合した：ライセートを５０ＯＤ／ｍＬに希釈し、ＰＥＩ溶液を、０．５％（１×ＰＥＩ）または１．５％（３×ＰＥＩ）の最終濃度でライセートに添加した。ライセートｄｓＲＮＡ－ＰＥＩ錯体溶液を、３７℃で一晩、リボヌクレアーゼＩＩＩと共にインキュベートした。ポリアニオンを添加することにより全ＲＮＡを錯体から抽出して、ＰＥＩからｄｓＲＮＡを脱錯化し、続いて、ＲＮＡＺｏｌ ＲＴ抽出を行った。ｄｓＲＮＡのインテグリティをアガロースゲル電気泳動法（図３および４）を用いて評価した。
修飾ＰＥＩで形成した錯体中のライセート－ｄｓＲＮＡの安定性の評価
ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ライセートを、以下のとおりＰＥＩ溶液と混合した：ライセートを５０ＯＤ／ｍＬに希釈し、ＰＥＩ溶液を、０．５％（１×ＰＥＩ）または１．５％（３×ＰＥＩ）の最終濃度でライセートに添加した。ライセートｄｓＲＮＡ－ＰＥＩ錯体溶液を、３７℃で一晩、リボヌクレアーゼＩＩＩと共にインキュベートした。ポリアニオンを添加することにより全ＲＮＡを錯体から抽出して、ＰＥＩからｄｓＲＮＡを脱錯化し、続いて、ＲＮＡＺｏｌ ＲＴ抽出を行った。ｄｓＲＮＡのインテグリティをアガロースゲル電気泳動法（図３および４）を用いて評価した。
実施例７
修飾ＰＥＩで形成した錯体中のｄｓＲＮＡの生体利用率の評価
人工ウェスタンコーンルートワーム飼料－取り込みバイオアッセイを、修飾ＰＥＩで形成した錯体、および、ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートで実施した。リボヌクレアーゼを含まない水を用いてライセート配合物を希釈し、均質になるまでボルテックス混合で等量の飼料と十分に混合した（０．５ｍｌの飼料および０．５ｍｌの希釈した配合溶液）。３回の反復を各配合物種について実施し、各反復プレートについて、およそ１２匹の新生幼虫を加えた。プレートを室温でインキュベートした。アッセイ期間中、死亡率を１日置きに記録した。最終的な死亡率が図５および６に示されており、クエンチされた錯体の向上した活性が示されている。この所見は、土壌中におけるバイオアッセイによっても裏付けられた。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕カチオン性ポリマーとポリヌクレオチドとの間で形成された錯体を含む組成物の土壌中に存在する負電荷分子に対する結合を阻害または実質的に低減する方法であって、前記錯体における表面に露出した正電荷を実質的に中和することが可能であるクエンチング剤を前記組成物に含ませる工程を含む、方法。
〔２〕前記ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡであり、前記ポリマーが、ポリアミンであり、前記クエンチング剤が、モノアルデヒドである、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記ポリマーが、直鎖もしくは分岐鎖ポリエチレンイミン、ポリペプチドまたはカチオン性多糖類である、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記負電荷粒子が、フミン酸を含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕地下植物有害生物の外寄生を防除する方法であって；
ａ）カチオン性ポリマーとｄｓＲＮＡとの間で形成された錯体を含む組成物を提供する工程、
ｂ）クエンチング剤でａ）の前記錯体の表面に露出した正電荷を実質的に中和する工程、ならびに
ｃ）ｂ）の前記組成物を土壌に適用する工程、
を含み、前記ｄｓＲＮＡが、前記地下植物有害生物における標的遺伝子の転写後サイレンシングをもたらす、方法。
〔６〕前記地下植物有害生物が、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｂｅｅｔｌｅ））、線虫、ハリガネムシおよびウジ、ならびに細菌および真菌などの適切な土壌病原体からなる群から選択される、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記地下植物有害生物が、ディアブロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）種の昆虫である、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕ポリヌクレオチドおよびカチオン性ポリマーを含む錯体における残存正電荷基を実質的に中和するための、クエンチング剤の使用。
〔９〕カチオン性ポリマーとポリヌクレオチドとの間で形成された錯体と、前記錯体において残存する表面に露出した正電荷基を実質的に中和することが可能であるクエンチング剤とを含む組成物であって、前記ポリマーが、分岐または線状ポリエチレンイミン、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、カチオン性多糖類、ポリアミドアミン、アミン基を含むリシン、ヒスチジンおよびアルギニンなどのアミノ酸のポリマーおよびコポリマー、ならびにポリアミンからなる群から選択され、表面に露出した正電荷基が、中和されなければ土壌への前記錯体の吸着をもたらす、組成物。
〔１０〕前記ポリマーが、分岐または線状ポリエチレンイミンである、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕前記ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡである、前記〔９〕または〔１０〕に記載の組成物。
〔１２〕前記ポリマーが、ポリアミンである、前記〔９〕～〔１１〕に記載の組成物。
〔１３〕前記ポリアミンが、少なくとも５つのアミン基を含む直鎖および分岐ポリアミンからなる群から選択される、前記〔１２〕に記載の組成物。
〔１４〕前記錯体が、細胞ライセート中に含まれているか、または無傷細胞内で形成されており、前記クエンチング剤が添加されている、前記〔９〕～〔１３〕に記載の組成物。
〔１５〕前記クエンチング剤が、イソシアネート、モノアルデヒド、モノエポキシド、モノエステル、モノカルボン酸、一無水物、およびアミンと反応性である単一の基を含む他の分子からなる群から選択される、前記〔９〕～〔１４〕に記載の組成物。
〔１６〕前記モノアルデヒドが、水溶性である、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔１７〕前記モノアルデヒドが、メタナール、エタナール、プロパナール、ブタナール、ペンタナールおよびヘキサナールからなる群から選択される、前記〔１６〕に記載の組成物。
〔１８〕前記モノアルデヒドが、実質的に水不溶性である、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔１９〕前記モノアルデヒドが、ヘプタナール、オクタナールおよびデカナールからなる群から選択される、前記〔１８〕に記載の組成物。
〔２０〕土壌中に存在するものなどの負電荷粒子に前記錯体が実質的に結合しないよう、前記錯体における十分な残存する正電荷基をクエンチするのに十分な量で前記モノアルデヒドを含有する、前記〔１５〕～〔１９〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２１〕前記ポリヌクレオチドが、真核細胞における遺伝子のｍＲＮＡの配列と実質的に同一である配列を含むｄｓＲＮＡである、前記〔９〕～〔２０〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２２〕前記真核生物が、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｂｅｅｔｌｅ））、線虫、ハリガネムシおよびウジからなる群から選択される昆虫、ならびに細菌および真菌などの適切な土壌病原体である、前記〔２１〕に記載の組成物。
〔２３〕ポリヌクレオチドとカチオン性ポリマーとを錯化する工程、およびクエンチング剤を添加することによって前記錯体中における残存する正電荷をクエンチングする工程を含む、前記〔９〕～〔２３〕のいずれか一項に記載の組成物を形成する方法。
修飾ＰＥＩで形成した錯体中のｄｓＲＮＡの生体利用率の評価
人工ウェスタンコーンルートワーム飼料－取り込みバイオアッセイを、修飾ＰＥＩで形成した錯体、および、ｄｓＲＮＡを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートで実施した。リボヌクレアーゼを含まない水を用いてライセート配合物を希釈し、均質になるまでボルテックス混合で等量の飼料と十分に混合した（０．５ｍｌの飼料および０．５ｍｌの希釈した配合溶液）。３回の反復を各配合物種について実施し、各反復プレートについて、およそ１２匹の新生幼虫を加えた。プレートを室温でインキュベートした。アッセイ期間中、死亡率を１日置きに記録した。最終的な死亡率が図５および６に示されており、クエンチされた錯体の向上した活性が示されている。この所見は、土壌中におけるバイオアッセイによっても裏付けられた。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕カチオン性ポリマーとポリヌクレオチドとの間で形成された錯体を含む組成物の土壌中に存在する負電荷分子に対する結合を阻害または実質的に低減する方法であって、前記錯体における表面に露出した正電荷を実質的に中和することが可能であるクエンチング剤を前記組成物に含ませる工程を含む、方法。
〔２〕前記ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡであり、前記ポリマーが、ポリアミンであり、前記クエンチング剤が、モノアルデヒドである、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記ポリマーが、直鎖もしくは分岐鎖ポリエチレンイミン、ポリペプチドまたはカチオン性多糖類である、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記負電荷粒子が、フミン酸を含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕地下植物有害生物の外寄生を防除する方法であって；
ａ）カチオン性ポリマーとｄｓＲＮＡとの間で形成された錯体を含む組成物を提供する工程、
ｂ）クエンチング剤でａ）の前記錯体の表面に露出した正電荷を実質的に中和する工程、ならびに
ｃ）ｂ）の前記組成物を土壌に適用する工程、
を含み、前記ｄｓＲＮＡが、前記地下植物有害生物における標的遺伝子の転写後サイレンシングをもたらす、方法。
〔６〕前記地下植物有害生物が、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｂｅｅｔｌｅ））、線虫、ハリガネムシおよびウジ、ならびに細菌および真菌などの適切な土壌病原体からなる群から選択される、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記地下植物有害生物が、ディアブロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）種の昆虫である、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕ポリヌクレオチドおよびカチオン性ポリマーを含む錯体における残存正電荷基を実質的に中和するための、クエンチング剤の使用。
〔９〕カチオン性ポリマーとポリヌクレオチドとの間で形成された錯体と、前記錯体において残存する表面に露出した正電荷基を実質的に中和することが可能であるクエンチング剤とを含む組成物であって、前記ポリマーが、分岐または線状ポリエチレンイミン、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、カチオン性多糖類、ポリアミドアミン、アミン基を含むリシン、ヒスチジンおよびアルギニンなどのアミノ酸のポリマーおよびコポリマー、ならびにポリアミンからなる群から選択され、表面に露出した正電荷基が、中和されなければ土壌への前記錯体の吸着をもたらす、組成物。
〔１０〕前記ポリマーが、分岐または線状ポリエチレンイミンである、前記〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕前記ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡである、前記〔９〕または〔１０〕に記載の組成物。
〔１２〕前記ポリマーが、ポリアミンである、前記〔９〕～〔１１〕に記載の組成物。
〔１３〕前記ポリアミンが、少なくとも５つのアミン基を含む直鎖および分岐ポリアミンからなる群から選択される、前記〔１２〕に記載の組成物。
〔１４〕前記錯体が、細胞ライセート中に含まれているか、または無傷細胞内で形成されており、前記クエンチング剤が添加されている、前記〔９〕～〔１３〕に記載の組成物。
〔１５〕前記クエンチング剤が、イソシアネート、モノアルデヒド、モノエポキシド、モノエステル、モノカルボン酸、一無水物、およびアミンと反応性である単一の基を含む他の分子からなる群から選択される、前記〔９〕～〔１４〕に記載の組成物。
〔１６〕前記モノアルデヒドが、水溶性である、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔１７〕前記モノアルデヒドが、メタナール、エタナール、プロパナール、ブタナール、ペンタナールおよびヘキサナールからなる群から選択される、前記〔１６〕に記載の組成物。
〔１８〕前記モノアルデヒドが、実質的に水不溶性である、前記〔１５〕に記載の組成物。
〔１９〕前記モノアルデヒドが、ヘプタナール、オクタナールおよびデカナールからなる群から選択される、前記〔１８〕に記載の組成物。
〔２０〕土壌中に存在するものなどの負電荷粒子に前記錯体が実質的に結合しないよう、前記錯体における十分な残存する正電荷基をクエンチするのに十分な量で前記モノアルデヒドを含有する、前記〔１５〕～〔１９〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２１〕前記ポリヌクレオチドが、真核細胞における遺伝子のｍＲＮＡの配列と実質的に同一である配列を含むｄｓＲＮＡである、前記〔９〕～〔２０〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔２２〕前記真核生物が、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｂｅｅｔｌｅ））、線虫、ハリガネムシおよびウジからなる群から選択される昆虫、ならびに細菌および真菌などの適切な土壌病原体である、前記〔２１〕に記載の組成物。
〔２３〕ポリヌクレオチドとカチオン性ポリマーとを錯化する工程、およびクエンチング剤を添加することによって前記錯体中における残存する正電荷をクエンチングする工程を含む、前記〔９〕～〔２３〕のいずれか一項に記載の組成物を形成する方法。
Claims (21)
- カチオン性ポリマーとポリヌクレオチドとの間で形成された錯体を含む組成物の土壌中に存在する負電荷分子に対する結合を阻害または実質的に低減する方法であって、前記錯体における表面に露出した正電荷を実質的に中和することが可能であるクエンチング剤を前記組成物に含ませる工程を含む、方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡであり、前記ポリマーが、ポリアミンであり、前記クエンチング剤が、モノアルデヒドである、請求項１に記載の方法。
- 前記ポリマーが、直鎖もしくは分岐鎖ポリエチレンイミン、ポリペプチドまたはカチオン性多糖類である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記負電荷分子が、フミン酸を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 地下植物有害生物の外寄生を防除する方法であって；
ａ）カチオン性ポリマーとｄｓＲＮＡとの間で形成された錯体を含む組成物を提供する工程、
ｂ）クエンチング剤でａ）の前記錯体の表面に露出した正電荷を実質的に中和する工程、ならびに
ｃ）ｂ）の前記組成物を土壌に適用する工程、
を含み、前記ｄｓＲＮＡが、前記地下植物有害生物における標的遺伝子の転写後サイレンシングをもたらす、方法。 - 前記地下植物有害生物が、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ヴィルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）（ウェスタンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）（ノーザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ウンデキムプンクタタ・ホワルディ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）（サザンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・ヴィルギフェラ・ゼアエ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｚｅａｅ）（メキシカンコーンルートワーム）、ディアブロティカ・スペキオサ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）（ウリムシ（ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｂｅｅｔｌｅ））、線虫、ハリガネムシおよびウジ、ならびに細菌および真菌などの適切な土壌病原体からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
- 前記地下植物有害生物が、ディアブロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）種の昆虫である、請求項６に記載の方法。
- ポリヌクレオチドおよびカチオン性ポリマーを含む錯体における残存正電荷基を実質的に中和するための、クエンチング剤の使用であって、前記クエンチング剤及び前記錯体が土壌中で使用される、クエンチング剤の使用。
- カチオン性ポリマーとポリヌクレオチドとの間で形成された錯体と、前記錯体において残存する表面に露出した正電荷基を実質的に中和することが可能であるクエンチング剤とを含む、土壌への適用のための組成物であって、前記ポリマーが、分岐または線状ポリエチレンイミン、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、カチオン性多糖類、ポリアミドアミン、アミン基を含むリシン、ヒスチジンおよびアルギニンなどのアミノ酸のポリマーおよびコポリマー、ならびにポリアミンからなる群から選択され、表面に露出した正電荷基が、中和されなければ土壌への前記錯体の吸着をもたらす、組成物。
- 前記ポリマーが、分岐または線状ポリエチレンイミンである、請求項９に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡである、請求項９または１０に記載の組成物。
- 前記ポリマーが、ポリアミンである、請求項９～１１のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ポリアミンが、少なくとも５つのアミン基を含む直鎖および分岐ポリアミンからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
- 前記錯体が、細胞ライセート中に含まれているか、または無傷細胞内で形成されており、前記クエンチング剤が添加されている、請求項９～１３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記クエンチング剤が、イソシアネート、モノアルデヒド、モノエポキシド、モノエステル、モノカルボン酸、一無水物、およびアミンと反応性である単一の基を含む他の分子からなる群から選択される、請求項９～１４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記モノアルデヒドが、水溶性である、請求項１５に記載の組成物。
- 前記モノアルデヒドが、メタナール、エタナール、プロパナール、ブタナール、ペンタナールおよびヘキサナールからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
- 前記モノアルデヒドが、実質的に水不溶性である、請求項１５に記載の組成物。
- 前記モノアルデヒドが、ヘプタナール、オクタナールおよびデカナールからなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
- 土壌中に存在するものなどの負電荷粒子に前記錯体が実質的に結合しないよう、前記錯体における十分な残存する正電荷基をクエンチするのに十分な量で前記モノアルデヒドを含有する、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、真核細胞における遺伝子のｍＲＮＡの配列と実質的に同一である配列を含むｄｓＲＮＡである、請求項９～２０のいずれか一項に記載の組成物。
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