KR20190050235A - 생활성 입자와 나노구조가 통합된 스캐폴드를 이용한 혈관 및 골 형성 촉진 방법 - Google Patents

생활성 입자와 나노구조가 통합된 스캐폴드를 이용한 혈관 및 골 형성 촉진 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드를 이용하는 골 또는 혈관 형성 유도방법; 줄기세포 또는 내피세포의 배양방법; 및 골 또는 혈관 형성용 조성물에 관한 것이다.

Description

생활성 입자와 나노구조가 통합된 스캐폴드를 이용한 혈관 및 골 형성 촉진 방법{Method of stimulating osteogenesis and angiogenesis using 3D scaffolds with integrated nanofibrous structure and bioactive nanoparticles}
본 발명은 생활성 입자와 나노구조가 통합된 스캐폴드를 이용한 혈관 및 골 형성 촉진 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드를 이용하는 골 또는 혈관 형성 유도방법; 줄기세포 또는 내피세포의 배양방법; 및 골 및 혈관 형성용 조성물에 관한 것이다.
조직 공학은 손상되고 병이 있는 조직을 치료하기 위한 임상적으로 효과적인 대용품을 개발하는 것을 목표로 하는 분야이다. 특히, 골 조직 공학은 임상 요구 사항을 충족시키기 위해 가장 광범위하게 연구된 분야 중 하나이다. 골 조직 공학의 난제 중 하나는 뼈가 고도로 혈관화된 조직이므로 혈관화된 골 이식체를 만드는 것이다. 특히, 혈관 형성을 가능하게 하면서 골 형성을 하는 줄기 세포를 전달하는 것은 혈관화 골 조직 공학에 중요하다. 따라서 많은 연구자들이 스캐폴드를 활용해왔다.
특히, 3 차원(3D) 스캐폴드는 경조직 공학에서 (i) 세포 고정, 이동 및 성장을 위한 매트릭스를 제공하고, (ii) 영양분 및 산소 공급을 통해 신생 혈관 형성을 유도하며, (iii) 골 형성 및 분화를 위해 치료용 분자를 공급하는 등의 중요한 역할을 하여 왔다. 스캐폴드는, 물리화학 및 생물학적 특성, 예를 들어, 표면 상에 형성된 나노/마이크로형상, 부착되는 단백질, 및 포함된 생활성 약물을 스캐폴드의 기능을 시너지화하도록 조심스럽게 조정되어야 한다. 그 중에서도, 나노구조는 혈관형성과 줄기 세포의 골 형성을 포함하여 세포의 운명을 변화시키는데 특별한 영향을 미친다. 본래의 뼈의 ECM은 포매된 하이드록시아파타이드 무기 나노결정과 콜라겐 섬유 네트워크로 구성된다. 이러한 이유로, 다양한 유형의 생체 재료, 특히 생체 고분자, 생활성 무기물 및 이들의 복합체가 골 재생용 나노섬유 스캐폴드로 개발되었다.
KR 2010-0091945 A
본 발명은 3D 스캐폴드를 이용한 골 또는 혈관 형성 유도방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 3D 스캐폴드를 이용한 줄기세포 또는 내피세포의 배양방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 3D 스캐폴드를 유효성분으로 포함하는, 골 또는 혈관 형성용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1양태는 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드에 분리된 줄기세포 또는 내피세포를 적재하여 배양하는 단계를 포함하는, 골 또는 혈관 형성 유도방법을 제공한다.
본 발명의 제2양태는 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드에 분리된 줄기세포 또는 내피세포를 적재하여 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 내피세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 제3양태는 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하고 매크로 기공을 갖는 3D 스캐폴드; 및 상기 스캐폴드에 적재된 분리된 줄기세포 또는 내피세포를 포함하는, 골 또는 혈관 형성용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
종래 줄기세포의 경우 부착하여 생존하는 특성 때문에 평평한 바닥이 있는 플라스크에서 2차원으로 부착식 배양을 한다. 이러한 배양 방법은 줄기세포의 고유성질인 분화와 복제 능력을 감소시키고 부착식으로 계대 배양을 할 경우에는 세포 손실과 오염이 발생할 수 있다. 또한, 세포치료제로 줄기세포를 이용하기 위해서는 1.0×108 세포수 이상의 세포가 요구되어 배양 면적이 제한된 2차원 배양 방법으로 대량의 세포를 얻는 것은 경제성이 낮다. 세포치료제로 줄기세포를 이용하기 위해서는 충분한 양의 세포를 얻을 수 있는 배양 방법이 중요하게 요구된다.
본 발명자들은 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드를 고안하고, 골 조직 공학에 대한 적용 가능성을 연구하였다. 먼저, 나노섬유형 구조체에 생활성 유리 나노입자가 첨가된 형태의 스캐폴드는 표면적, 단백질 흡착력, 수친화성 및 치료 이온 방출 능력을 증가시켜, 세포 부착, 골 형성 및 혈관형성과 같은 세포의 유리한 반응을 유도할 수 있음을 확인하였다. 특히, 상기 스캐폴드에 줄기세포 또는 내피세포를 포함시켜 배양한 결과, 스캐폴드의 나노구조는 매우 높은 표면적을 제공하여 줄기세포의 초기 부착과 성장을 유도하고, 골형성 및 성숙을 가속화하고, 나노구조 및 생활성 유리 나노입자가 내피세포 기능 및 생체 내 혈관 신생을 유도함을 확인하였다.
따라서, 나노섬유형 구조체에 생활성 유리 나노입자가 첨가된 형태의 스캐폴드에 줄기세포 또는 내피세포를 적재하여 배양할 경우 나노 형상 신호(나노섬유형 구조체)와 생활성 나노입자 신호(BGn)의 시너지화 효과가 나타남을 확인하였다. 이러한 효과는 다른 종류의 스캐폴드에 비해 현저히 우수한 효과였다. 본 발명의 스캐폴드는 골의 회복 또는 재생에 사용될 수 있는 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.
본 발명에서, “나노섬유형 구조체”는 나노섬유형 스캐폴드의 골격을 형성하는 구조체를 의미한다.
나노섬유형 구조체는 생체친화성 고분자 물질로 이루어지며, 고분자 물질은 매크로기공을 지닌 나노섬유형 스캐폴드를 제조할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV), 폴리락트산, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리프로필렌퓨머레이트, 폴리다이옥세논 또는 이들의 공중합체를 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 폴리락트산(poly(lactic acid))을 사용하였다.
본 발명에서, 나노섬유형 구조체는 반대 상(counter phase)으로서 캠핀을 이용한 상분리법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 첨가된 캠핀은 쉽게 고화되어 고분자와 혼합된 상을 형성한 후, 승화를 통해 기공이 생성되고 결국 매크로기능을 갖는 나노섬유형 구조체를 형성할 수 있다. 나노섬유형 구조체를 생성하는 가장 일반적인 방법은 전기 방사(electrospinning)지만, 전기 방사는 시선(line-of-sight) 방법이므로 세공 간격이 작은 수도(pseudo-3D) 구조를 만드므로, 3D 네트워크의 세포 인식 및 빠른 세포 침투를 제한하는 문제가 있다. 즉, 조직 공학에서는 전기방사 공정을 사용할 경우 3D 구조를 얻는데 어려움이 있었다. 그러나, 본 발명은 상분리법을 이용하여 나노섬유형 구조를 3D 다공성 스캐폴드의 표면 상에 부가하였다. 상분리 방법은 고도의 나노섬유 네트워크를 갖는 3 차원 다공성 스캐폴드를 생성할 수 있다.
상분리된 나노섬유형 3D 스캐폴드는 거대 세포 채널을 통한 세포 침투를 허용하면서 세포에 나노섬유형 표면 형상 신호를 제공하는 것으로 나타났다. 본 발명의 일 실시예에서, 나노섬유형 표면의 poly (lactic acid) 스캐폴드에서 배양된 MSC(Fib(B))는 조밀한 표면의 스캐폴드(Den 및 Den(B))에서보다 높은 골 형성 분화 수준을 나타내도록 유도되었다(도 10).
본 발명에서, “나노섬유형 구조체로 네트워크화”된다는 것은 본 발명의 스캐폴드는 도 1에서 보는 바와 같이 나노섬유의 네트워크로 이루어진 3차원 구조체인 것을 의미한다.
본 발명에서, "생활성 유리 나노입자(bioactive glass nanoparticle: BGnp)"란, 실리콘, 칼슘, 인 등의 무기성분으로 구성된 스캐폴드용 생활성 나노입자를 의미한다.
상기 BGnp는 문헌 [Kim, J.-J. et al., Mater. Chem. Phys. 2014]에서 약간 수정한 소노-보조 졸-겔 공정(sono-assisted sol-gel method)에 의해 제조할 수 있다. 졸-겔 공정은 고도의 메조다공성 구조를 가능하게 하여 표면적과 나노 공간을 증가시켜 궁극적으로 약물과 유전자의 적재 및 전달을 가능하게 한다.
구체적으로, PEG 용액에 칼슘을 포함하는 화합물과 실리콘을 포함하는 화합물을 가하여 반응시킴으로써, PEG, 칼슘 및 실리콘이 응결된 응집체를 수득하고, 상기 응집체를 소결시켜서, PEG를 제거함으로써 제조할 수 있다.
BGnp는 생물학적 상호작용을 위해 초기에는 친수성 나노부위를 제공할 뿐만 아니라 Si 및 Ca 이온을 안정적으로 전달할 수 있다. Si4+ 및 Ca2+ 이온의 방출은 세포 증식, 혈관형생 및 골 형성의 유도와 같은 효과를 가져올 수 있다.
상기 BGnp의 조성은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 실리콘과 칼슘을 75 내지 95:25 내지 5(몰비)의 비율로 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 80 내지 90:20 내지 10(몰비)의 비율로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 85:15(몰비)로 포함할 수 있다. 또한, 상기 BGnp는 100 nm 미만의 직경을 가질 수 있고, 바람직하게는 약 90 내지 100 nm 크기(평균 84.1 ± 14.2 nm)를 가질 수 있다. 또한, 0.08 내지 0.12 ㎤/g의 기공 부피, 3.5 nm 내지 4.0 nm의 메조기공 직경을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 내부에는 0.1 ± 0.04 ㎤/g 의 평균부피 및 3.8 ± 0.06nm의 평균직경을 갖는 공극이 형성되며, 56.6 ± 0.06nm ㎡/g의 평균 표면적(surface area)을 나타내는 구형입자일 수 있다. 또한, ζ-포텐셜 값이 30 내지 25 mV 값을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, BGn의 메조기공 직경의 분포는 3.8 nm의 평균값을 보이고, BGn의 ζ- 포텐셜 값은 -27 mV로 매우 음의 값인 것으로 나타났다(도 2c). 이는 표면에 많은 실라놀기(Si-OH 기)가 존재하기 때문으로, 이러한 BGn의 음전하 특성은 스캐폴드 표면에서의 단백질 흡착이 증가시킬 수 있다.
상기 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드에 포함되는 BGnp의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 나노섬유형 구조체의 총 중량에 대하여 1 내지 40중량%일 수 있고, 보다 바람직하게는 10 내지 30중량%일 수 있으며, 가장 바람직하게는 10 내지 20중량%일 수 있다.
생활성 유리 나노입자를 포함하는 3D 스캐폴드의 제조시 염 침출법을 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 생활성 유리 나노입자를 공용매 내에서 잘 분산한 후, 캄펜 및 PLDLA를 첨가하여 얻어진 혼합물 슬러리에 수용성 염 입자로서 NaCl 입자를 채운 다음, 동결 건조시킨 후 NaCl 입자를 완전히 침출하여 복합 스캐폴드를 제조하였다.
상기 제조된 스캐폴드의 특성을 분석한 결과, 모든 스캐폴드는 내부에 200-300 μm 크기의 매크로기공이 형성되었다. FT-IR 분석 결과. 생활성 유리 나노입자를 포함하는 3D 스캐폴드는 고도로 다공성인 것으로 확인되었다.
생활성 유리 나노입자를 포함하는 3D 스캐폴드는 높은 표면적, 수친화성 및 이온 방출력을 나타낸다.
표면적의 BET 측정 결과, 나노 섬유 구조의 스캐폴드(Fib 및 Fib(B))는 조밀한 표면의 스캐폴드(Den 및 Den(B))과 비교하여 더 큰 루프 면적과 더 높은 흡착/탈착 체적을 나타내어, 더 큰 나노/마이크로기공 구조 및 더 높은 표면적을 가짐이 확인되었다(도 6a).
또한, 스캐폴드의 수친화성을 접촉각 시험으로 조사한 결과, BGn을 포함하는 스캐폴드의 접촉각은 세포 부착에 유리한 범위(60-65°)로 감소하였다(도 6c). 이로부터 나노섬유형 구조에 BGn을 통합한 구조의 스캐폴드는 세포 부착에 유리함을 알 수 있다.
또한, 스캐폴드의 이온 방출력을 시험한 결과, 나노 섬유 구조의 스캐폴드(Fib 및 Fib(B))는 조밀한 표면의 스캐폴드(Den 및 Den(B))과 비교하여 동일한 기간 동안 더 많은 양의 이온 방출 거동을 나타내어(도 7). 줄기세포의 증식 및 골 형성 분화, 및 내피 세포의 혈관형성을 포함하는 세포 반응을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 스캐폴드는 적재된 줄기세포 또는 내피세포의 스캐폴드로의 접착, 확장 또는 3차원 스캐폴드 내부로의 침투력이 생활성 유리 나노입자를 포함하지 않는 나노섬유형 3차원 스캐폴드에 비하여 향상된 것일 수 있다.
본 발명자들은 나노섬유형 구조체에 생활성 유리 나노입자가 첨가된 형태의 스캐폴드는 표면적, 단백질 흡착력, 수친화성 및 치료 이온 방출 능력이 향상되어, 줄기세포 또는 내피세포의 배양에 사용될 경우, 세포 부착, 골 형성 및 혈관형성과 같은 세포의 유리한 반응을 유도할 가능성을 예측하였다.
이에, 또한, 본 발명의 제1양태는 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드에 분리된 줄기세포 또는 내피세포를 적재하여 배양하는 단계를 포함하는, 골 또는 혈관 형성 유도방법을 제공한다.
본 발명의 제2양태는 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드에 분리된 줄기세포 또는 내피세포를 적재하여 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 내피세포의 배양방법을 제공한다.
이때, 사용된 나노섬유형 구조체 및 생활성 유리 나노입자는 상술한 바와 동일하다.
줄기세포는 자신과 같은 능력의 세포를 만드는 자기복제능력과 특정한 세포로 분화되는 능력을 가지는 세포로 조직이나 장기를 재생할 수 있고, 장기 이식 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있어 재생의학에 적합하다. 구체적으로, 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)는 부착성 을 가지는 성체줄기세포의 한 종류로 뼈, 연골, 지방과 같은 근골격계 세포들로 분화할 수 있는 다분화능을 가진 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 체외배양이 용이하고 증식 능력이 뛰어나며 원하는 조직으로의 분화가 가능하여 퇴행성 관절염과 척수손상, 심근경색, 당뇨 질환 등의 치료에 이용되고 있다. 바람직하게는, 줄기세포로 치수 줄기세포(DPSC)를 사용할 수 있다. 치수 줄기세포(DPSC)는 지방 형성, 연골 형성, 골 형성, 치아 형성 및 신경 원성 계통을 포함하여 다계통 분화능을 나타내므로, 조직 공학에서 많은 세포 유형의 원천으로 연구되고 있다.
본 발명자들은 나노섬유형 구조체에 생활성 유리 나노입자가 첨가된 형태의 스캐폴드에 줄기세포를 배양한 결과, 초기 세포 고정 및 확산이 향상되고, 포함된 BGn에 의해 부착된 세포가 확산되도록 유도되었음을 확인하였고(도 8), 뼈 관련 유전자의 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과 다른 스캐폴드에서 배양한 경우보다 유전자의 발현이 현저하게 증가함을 확인하였으며(도 10a), 단백질 분비에 있어서 나노섬유형 구조체와 BGn 간의 시너지 효과를 확인하였다(도 10b).
또한, 나노섬유형 구조체에 생활성 유리 나노입자가 첨가된 형태의 스캐폴드에 내피세포를 배양한 결과, 스캐폴드의 나노섬유형 구조체 표면이 생체 내에서 혈관 형성을 가속화시킴을 확인하였고, 스캐폴드로부터의 BGn(이온 방출)의 간접적 신호가 세포 이동 및 관형 네트워크 형성과 같은 혈관 형성에서의 시험관 내피 기능을 유도하는데 결정적인 역할을 함을 확인하였으며(도 12a), 쥐 피하 조직에서 체내 혈관형성 평가를 통해 섬유성 스캐폴드 그룹(Fib 및 Fib(B))의 조직 침투는 현저히 향상됨을 확인하였다(도 13b).
도 14에 물리화학적 성질과 관련하여 스캐폴드에서 명백한 일련의 생물학적 사건이 개략적으로 도시되어있다. 3D 매크로-다공성 스캐폴드-나노섬유 형상 및 BGn으로 구현된 두 가지 구성 요소는 각각 생물물리학적 및 생화학적 신호를 나타낸다. 한편, 나노섬유 표면은 매우 높은 표면적을 제공하여 단백질 흡착, 빠른 세포 고정 및 퍼짐을 유도하여 궁극적으로 MSC가 골을 형성하게 할 수 있다. 나노섬유형 구조체는 또한 세포와 조직의 침범, 및 신생 혈관 형성을 촉진시킬 수 있다. 한편, 이온 방출성 생활성 나노입자는 더 많은 생물학적 상호작용을 위해 초기에는 친수성 나노부위를 제공할 뿐만 아니라 Si 및 Ca 이온을 안정적으로 전달할 수 있다. 그 결과, MSC 부착 및 골 형성을 유도할 뿐만 아니라 세포 이동, 관형 네트워크 형성, 및 신혈관 형성과 같은 내피세포 기능을 활성화할 수 있다. 이러한 사건들은 양 신호를 통해 대부분 시너지적으로 발생하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 BGn 및 나노섬유가 통합된 스캐폴드는 골 조직 공학에서 유용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하고 줄기세포 또는 내피세포를 적재한 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드를 유효성분으로 포함하는, 골 및 혈관 형성용 조성물을 제공한다.
본 발명의 나노섬유형 구조체에 생활성 유리 나노입자가 첨가된 형태의 스캐폴드는 줄기세포 또는 내피세포를 적재하여 배양할 경우 나노 형상 신호(나노섬유형 구조체)와 생활성 나노입자 신호(BGn)의 시너지화 효과를 나타내므로, 골의 회복 또는 재생에 사용될 수 있는 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드에 줄기세포 또는 내피세포를 적재하고 배양할 경우, 줄기세포의 초기 부착과 성장을 유도하고, 골형성 및 성숙을 가속화하고, 나노구조 및 생활성 유리 나노입자가 내피세포 기능 및 생체 내 혈관 신생이 유도될 수 있다.
본 발명에 따라 줄기세포 또는 내피세포를 배양할 경우 줄기세포 부착 및 골 형성 유도 뿐만 아니라 세포 이동, 관형 네트워크 형성 및 신혈관 형성과 같은 내피세포 기능의 활성화가 나노 형상 신호(나노섬유형 구조체)와 생활성 나노입자 신호(BGn)의 시너지 작용에 의해 이루어질 수 있다.
도 1은 본 발명의 골 형성 및 혈관형성 유도를 위한 생활성나노입자 및 나노섬유형 구조체가 통합된 3D 스캐폴드의 z-스택 형광 이미지 및 모식도이다.
도 2는 BGn의 특성이다: (a) mesoporous 구조와 nanospheres를 보여주는 TEM 이미지. (b) N2 흡착/탈착 곡선, 및 BET 방법에 의한 삽도 내 공극 크기 분포. (c) BGn 속성의 요약.
도 3은 수은 침지법에 의해 측정된 스캐폴드 별 기공 크기 분포도이다.
도 4는 (a)실리콘 및 칼슘의 SEM-EDX 원자 맵핑 및 스펙트럼; 및 (b) 스캐폴드의 FT-IR 분석 결과이다.
도 5는 SEM에 의해 관찰된 스캐폴드의 형태이다(저해상도 및 고해상도).
도 6은 스캐폴드의 나노 구조 및 친수성 특성을 나타낸 것이다: (a) BET 측정에 의한 N2 흡착/탈착 등온선. 측정된 표면적이 그래프에 기록되었다. (b) 스캐폴드 상의 단백질(Cyt C) 적재량. (c) 수 접촉각에 의해 측정된 친수성. 멤브레인 유형으로 준비된 시료를 사용하여 20 초에 기록된 접촉각.
도 7은 ICP-AES로 측정한, BGn의 존재로 인한 스캐폴드로부터 이온(실리콘 및 칼슘 이온) 방출 양상을 나타낸 것이다. 매 시간마다 방출되는 이온은 표와 같이 요약되었다.
도 8은 스캐폴드에 대한 MSC 부착 거동을 나타낸 것이다: (a) 4 시간 동안 스캐폴드 상에 부착된 세포들을 보여주는 CLSM이미지(파란색의 핵에 대해서는 DAPI이고 빨간색의 F-actin의 경우에는 팔로이딘). (b) 이미지로부터 정량화된 세포 수(파란 막대)와 확산 영역(적색 점선). (c) CCK 방법에 의해 분석된 세포 부착. (d) p-FAK, FAK 및 인테그린 β1의 웨스턴 블롯 분석. 밴드 강도는 β-actin 강도로 정규화되었음. 그룹간에 나타난 유의차(일원 분산 분석(n=3)에 의해, * p<0.05 및 ** p<0.01).
도 9는 14 일 동안의 스캐폴드 내에서의 MSC 확산 및 이동(침투)을 나타낸 것이다: (a) CCK 분석에 의한 세포 증식. (b) 그림과 같이 공 촛점 z-스태킹으로 분석된 세포 침투. (c) 계량된 침투 깊이. (일원 분산 분석(n=3)에 의해 * p<0.05 및 ** p<0.01, n = 3).
도 10은 스캐폴드 내의 MSC 골 형성에 관한 것으로, (a) 7 일 및 14 일에 정량적 PCR에 의해 수행한 OCN, OPN, BSP, 및 ALP를 포함하는 골 형성 관련 유전자의 발현 결과이고, (b) 면역 세포 화학 법에 의해 7 일 및 14 일에 분석된 OPN 및 BSP 단백질 분비 결과이다. (일원 분산 분석(n=3)에 의해, * p<0.05 및 ** p<0.01).
도 11은 alizarin red S(ARS) 염색법을 사용하여 배양 중 칼슘 침착 수준으로 21 일 및 28 일 동안 측정한 스캐폴드 내의 MSC 무기화 양상을 나타낸 것이다: (a) ARS 염색 후 세포-스캐폴드의 사진. (b) ARS 염색을 용출한 후의 정량화 결과. 결과는 각 그룹에 대한 스캐폴드 만으로(w/o 세포) 정규화되었다. (일원 분산 분석(n=3)에 의해 * p<0.05 및 ** p<0.01).
도 12는 스캐폴드에 반응하는 내피 세포(HUVEC)에 관한 것으로, (a) 24 시간에서 트랜스웰 멤브레인을 사용하는 스크래치 테스트에 의한 세포 이동 분석 결과이고, (b) 스크래치 영역으로 이동된 세포의 정량화 결과이고(n = 7), (c) 매트리겔상에 지지되는 세포의 관 유사 네트워크 형성을 보여주는, 3 시간 및 6 시간의 관형 네트워킹 분석 분석 결과이고, (d) 원 수의 정량화 결과이고, (e) 노드 수의 정량화 결과이다. 데이터는 10의 임의 필드에서 계수됨(일원 분산 분석(n=10)에 의해 * p<0.05 및 ** p<0.01).
도 13은 쥐 피하 조직에 2 주 및 4 주간 이식하여 검사한, 스캐폴드에 대한 생체 내 조직 반응을 나타낸 것이다: (a) 측정에 사용된 H&E 염색 이미지. (b) 스캐폴드에 대한 세포 및 조직 침범을 염색된 세포/조직 면적(%)을 정량화하여 확인한 결과. (c) 신 혈관을 나타내는 확대 이미지. (d) 신혈관의 마커(적색)인 CD31의 면역 조직 화학 염색 이미지. (e) 혈액세포 부위/조직 면적을 정량화한 혈관 수. (일원 분산 분석(n=4)에 의해, * p<0.05 및 ** p<0.01).
도 14는 골 형성에 도움이 되는 세포의 혈관 신생 및 골 형성에 시너지 효과를 낼 수 있는 BGn 생화학 및 나노섬유 위상 (생물 물리학) 신호가 있는 현재 개발된 3D 스캐폴드의 개략도이다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 BGn-통합 나노섬유형 스캐폴드가 궁극적으로 골 결손의 성공적인 재생에 기여하는 세포의 혈관형성 및 골 형성에 효과적일 수 있다고 가설을 세웠다. 이 가설을 증명하기 위해, 우리는 먼저 개발한 스캐폴드의 물리화학적 성질의 유의한 변화를 관찰하고, 각각 골 형성과 혈관형성에 관여하는 중간엽 줄기 세포 및 내피 세포와의 상호 작용을 조사하고, 마지막으로 조직 침범 및 신생 혈관 형성을 시험하였다.
재료
폴리에틸렌 글리콜(PEG; (C2H4)nH2O, Mn = 10000), 칼슘 나이트레이트 테트라하이드레이트(CN; Ca(NO3)2·4H2O), 메탄올(무수, 99.8 %, CH3OH), 암모니아(NH4OH) 및 테트라에틸 오르소실리케이트(TEOS; Si(OCH3)4)를 Sigma사로부터 구입하여 생활성 유리 나노입자를 제조하였다. 3D 스캐폴드 용 매트릭스로 Poly-L/D-락티드산(PLDLA, ESOMER @ LR 708, L-락티드 : D, L-락티드 몰비 = 70:30, Mn = 910 000, Evonic, Germany)를 사용했다.
1,4-디옥산(C4H8O2, Sigma)과 클로로포름(CHCl3, Dae-Jung)을 공용매로서 사용하고, 캄펜(2,2-디메틸-3-메틸렌-비시클로 [2.2.1] 헵탄; C10H16, Sigma)을 스캐폴드 내에 나노 섬유 구조를 생성시키는데 사용하였다.
염화나트륨(NaCl, Dae-Jung)을 매크로기공을 생성시키는 포로겐으로 사용하였다. 알리자린 레드 에스(ARS, C14H7NaO7S, Sigma)를 사용하여 칼슘을 염색하였고, 세틸피리디늄 클로라이드(CPC; C21H38ClN·H2O, 시그마)를 사용하여 칼슘 양의 정량화를 위한 ARS 염색을 제거하였다.
제조예 1: 생활성 유리 나노입자의 제조
BGn(85 몰% SiO2-15 몰% CaO)을 문헌 [Kim, J.-J. et al., Mater. Chem. Phys. 2014]에서 약간 수정한 소노 보조 졸 겔법(sono-assisted sol-gel method)으로 제조하였다.
간략하게, CN을 먼저 PEG-메탄올 알칼리 용액에 용해시킨 후, 초음파반응기(LH700 W 초음파 발생기, Ulsso Hitech)를 사용하여 10초 온/10초 오프 사이클의 고출력 초음파를 가하면서 메탄올 용액 중에 TEOS(Ca/Si의 몰비=15/85)를 적가하였다. 형성된 백색 침전물을 5000 rpm(Mega17 R 원심분리기, 한일사이언스)으로 원심분리하여 수집하고, 증류수 및 에탄올로 완전히 세척하였다. 얻어진 분말을 600 ℃에서 공기 중에서 1 ℃/128 분의 승온 속도로 열처리하였다.
제조예 2: 스캐폴드의 제조
4 가지 유형의 3D 스캐폴드를 제조하였다: 조밀한 표면(Den), BGn 함유 조밀한 표면(Den(B)), 나노섬유형 표면(Fib), 및 BGn 함유 나노섬유형 표면(Fib(B)), 특히, 나노섬유형 표면 구조의 스캐폴드는 상분리 과정에서 캄펜을 사용하여 제조하였다. 구체적으로, 0.3 g의 PLDLA를 10 ml의 공용매(중량비 4의 1,4-디옥산/클로로포름)에 용해시킨 다음, 1.2 g의 캄펜을 첨가하여 나노섬유형 구조체를 제조하였다.
본 발명의 복합 스캐폴드(Fib(B))의 경우, 다음과 같이 제조하였다. 60 mg의 BGn을 공용매 내에서 잘 분산한 후, 캄펜 및 PLDLA를 첨가한 다음, 얻어진 혼합물 슬러리를 원통형 플라스틱 바이얼에 붓고, 체질하여 수집한 200-500㎛ 크기의 NaCl 입자를 채웠다. 시료를 하룻밤 동안 -20 ℃에서 동결시킨 다음 3 일 동안 동결 건조시켰다. 매일 증류수를 갈아주며 100rpm으로 교반하면서 증류수 중에서 스캐폴드로부터 NaCl 입자를 완전히 침출하여 매크로기공을 지닌 복합 스캐폴드를 제조하였다. 상이한 스캐폴드의 제조에 사용된 각 성분의 비를 하기 표 1에 기재하였다.
스캐폴드 형태 약자 공용매 중PLDLA w/v% BGn(w/w%, w.r.t. PLDLA) 캄펜(w/w%, w.r.t. PLDLA)
조밀 Den 10 - -
조밀하고 BGn 포함 Den(B) 10 20 -
나노섬유형 Fib 10 - 400
나노섬유형이고 BGn 포함 Fib(B) 10 20 400
실험예 1: 특성 분석
BGn의 형태를 투과 전자 현미경(TEM; JEM-3010, JEOL)으로 관찰하였다. 메조다공성 구조 및 기공 크기 분포를 N2 흡착/탈착 등온선을 사용하여 Brunauer-Emmett-Teller(BET; Quantachrome) 방법으로 분석하였다. 상기 4 가지 유형의 스캐폴드의 형태를 주사형 전자 현미경(SEM; S-3000H, Hitachi)으로 측정하였다. 또한, 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR, 640-IR, Varian)을 사용하여 화학 결합 상태를 결정하였다. 에너지분산형 X-선 분광기(EDX, Bruker)를 사용하여 시료의 원자 구성을 검출했다. 4 가지 유형의 스캐폴드의 마이크로/나노기공 구조 특성을 수은 세공계(PM33, Quantachrome)를 사용하여 분석하였다. 스캐폴드의 표면적을 전술한 바와 같이 BET 방법으로 평가하였다. 시료의 친수성 특성을 Phoenix300 분석기를 이용한 수 접촉각 측정으로 조사하였다.
접촉각의 측정을 위해, 시료를 막 형태로 준비하였다. 이를 위해 NaCl 입자의 사용없이 금형에 혼합 용액을 주입한 후 -20 ℃에서 동결시킨 다음 3 일 동안 동결 건조하여 얇은 막(약 1 mm 두께)을 얻었다. CCD 카메라를 이용하여 물방울의 이미지를 얻었다. 스캐폴드의 압축 기계적 성질을 보편적인 시험기(Instron 5966, USA)를 사용하여 500 N로드 셀을 사용하여 0.5 mm/min의 교차 헤드 속도 하에 평가하였다. 원통형으로 준비한 각 시편(직경 10mm × 높이 20mm)을 증류수 (n = 5)에 담근 후 젖은 상태에서 시험하였다.
스캐폴드의 단백질 적재 능력을 시토크롬 C(Cyt C)를 모델 단백질로 사용하여 시험하였다. 각 스캐폴드를 Cyt C 100 μg을 함유하는 증류수 1 mL에 담갔다. 1 일 후, 상등액을 수집하고 BCA 분석 키트(Thermoscientific Co.)로 정량하였다.
관찰 결과, 생활성 유리 나노입자를 포함하는 스캐폴드는 다공성이고 나노섬유형이었다. BGn의 TEM 이미지(도 2a)는 직경이 100 nm 미만(평균 84.1 nm)인 나노구체 형태를 보여주었으며, 고배율 이미지는 전체적으로 고도의 메조다공성 구조이었다. 나노 입자의 N2 흡착 탈착 곡선은 히스테리시스 루프를 보여주었다. 이 히스테리시스 루프는 전형적으로 메조다공성 물질에서 발견되는 IV 형 등온선으로 간주된다. BGn의 메조기공 직경의 분포는 3.8 nm의 평균값을 보였다(삽도에 도시됨). BGn의 ζ-포텐셜 값은 -27 mV로 매우 음의 값이며, 이는 표면에 많은 Si-OH 기가 존재하기 때문이다(도 2c).
모든 종류의 스캐폴드는 매크로다공성이었으며, 기공 직경이 수백마이크로미터(수은 침지법에 의해 측정된 도 3에 도시된 기공 크기 분포와 같이, 대부분 200-300 ㎛)이고, 골 조직 내성장에 유리한 것으로 여겨지는 구조였다. 모든 스캐폴드의 기공도는 90.0-91.2 %의 평균값과 거의 유사하다.
스캐폴드의 표면 마이크로구조는 조밀한 군 및 섬유상 군 간에 현저한 차이가 존재하였으며, 캄펜으로 생산된 "Fib"과 "Fib(B)" 스캐폴드는 "Den"과 "Den(B)" 스캐폴드에서는 쉽게 관찰되지 않는 고도의 나노섬유성이었다. 이러한 결과로부터 캄펜이 스캐폴드에 나노섬유 네트워크를 형성하는데 결정적인 역할을 함을 알 수 있다(도 5).
표면을 자세히 살펴본 결과, 나노섬유형 구조체(Fib 및 Fib(B)의 경우), 및 표면 상의 BGn의 존재(Den(B) 및 Fib(B)의 경우)가 명확하게 확인되었다. BGn에 할당된 Si와 Ca의 원자 신호는 EDS 맵핑 및 신호 피크에서 잘 나타났다(도 4a).
FT-IR 분석 결과(도 4b) Den(B) 및 Fib(B) 스캐폴드의 경우 465 cm-1에서 Si-O-Si 밴드를 나타내고, 1182 cm-1 (C-O), 1360-1450 cm-1 (C-O-H), 및 1752 cm-1 (C=O)에서 PLDLA 관련 밴드를 나타냈다. 이러한 결과는 BGn을 포함하는 나노복합 스캐폴드가 매우 다공성임을 입증한다. 특히 캄펜으로 제조된 스캐폴드는 나노섬유형 구조체로서, 스캐폴드에 특유의 물리화학적 특성을 제공하는 것으로 여겨진다. 습윤 조건에서 압축 하중을 가함으로써 스캐폴드의 기계적 특성을 평가하였다.
모든 그룹은 초기 직선 탄력성, 고원 및 조밀화와 같은 유사한 행동을 보여주었는데, 이것은 전형적으로 스폰지 유형의 고분자 스캐폴드에서 관찰되는 것이다. 응력-변형 곡선(조밀점에서의 탄성 계수와 응력 및 변형값)에 기초하여 얻은 기계적 특성은 모든 그룹에서 비슷했지만, 조밀한 스캐폴드는 섬유형 스캐폴드보다 약간 높은 고밀도 응력을 나타냈으며 BGn-통합 스캐폴드는 순수한 고분자 스캐폴드보다 약간 높은 탄성 계수를 보였다.
나노구조로 인한 스캐폴드의 표면적 특성을 N2 흡착/탈착 등온선 곡선(도 6a)으로 조사했다. 모든 스캐폴드는 흡착 및 탈착 체적에 있어서 명확한 차이를 나타내며, 히스테리시스 루프 유사 패턴을 나타냈다. 나노 섬유 구조의 스캐폴드(Fib 및 Fib(B))는 조밀한 표면의 스캐폴드(Den 및 Den(B))과 비교하여 더 큰 루프 면적과 더 높은 흡착/탈착 체적을 나타내어, 더 큰 나노/마이크로기공 구조 및 더 높은 표면적을 시사한다. 표면적의 BET 측정 결과 나노섬유형 스캐폴드는 유의적으로 더 높은 값을 나타냈다: Fib(B)의 경우 12.8m2/g, Fib의 경우 10.2m2/g, Den(B)의 경우 3.7m2/g, Den의 경우 4.2m2/g.
나노섬유형 구조체 및 BGn 존재와 관련된 향상된 표면적을 반영하기 위한 또 다른 실험으로 단백질 흡착 연구를 수행하였다. 스캐폴드의 표면과 이온 상호 작용을 한다고 간주되는 매우 양전하를 띠는 모델 단백질로 Cyt C를 선택하였다. 나노섬유형 구조체 또는 BGn은 Cyt C의 스캐폴드에 대한 흡착을 유의하게 증가시켰고, 스캐폴드에 둘 다 포함되었을 때 가장 높은 수준 수준을 나타냈다: Fib(B)는 46 μg, Fib는 19 μg, Den(B)는 18 μg, 및 Den은 3 μg이었다(도 6b). 나노섬유형 형상 및 BGn 존재의 향상 효과는 가스 흡착보다 단백질 흡착에서 보다 더 분명히 관찰되었다. 이는 단백질의 이온 성질(비활성 N2 가스 대비) 및 그 결과 가능한 특정 화학적 상호 작용 때문일 수 있다. 흥미롭게도, 단백질 흡착을 증가시키는 BGn의 역할은 명백한데(조밀한 경우 및 섬유형인 경우 모두), 이것은 가스 흡착에서 쉽게 발견되지 않았다. BGn의 더 많은 하전 특성(많은 실라놀기로 인해)은 이에 기인할 수 있으며, 이러한 발견은 단백질과의 생물학적 상호 작용에서 스캐폴드 표면에서의 BGn의 가능한 역할을 시사한다.
다음으로, 스캐폴드의 수친화성을 접촉각 시험으로 조사했다. 접촉각은 73.5°(Den)>67.1°(Fib)>65.8°(Den(B))>61.5°(Fib(B))이었다(도 6c). 이는 나노섬유형 구조체 및 BGn 구성이 스캐폴드의 친수성을 높이는데 핵심적인 역할을 수행함을 입증한다. 60-65°로 감소된 수접촉각은 세포 부착에 유리한 표면 조건을 제공할 수 있다. 실제로, 물에 담가 24 시간에 측정하였을 때 스캐폴드의 물 흡수능 또한 나노섬유 및 BGn-통합 스캐폴드로의 물 흡수가 유의하게 증가함을 보였다. 따라서, 나노섬유형 구조체의 스캐폴드가 표면적과 친수성을 크게 향상시켰으며, BGn의 통합은 수친화성을 더욱 증가시키고, Fib(B) 스캐폴드가 물의 확산을 선호하고, 가수 분해 및 관련 이온 방출을 촉진할 수 있음을 알 수 있다.
실험예 2: 이온 방출 시험
BGn이 포함된 스캐폴드로부터 실리콘 및 칼슘 이온의 방출량을 유도결합 플라스마 원자 방출 분광기(ICP-AES, OPTIMA 4300 DV, PerkinElmer)를 사용하여 검출하였다. 이를 위해 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄과 1 N HCl(트리스-염산 완충액)으로 pH 7.4로 완충된 10 mL의 탈이온수에 스캐폴드 20 mg를 담그고 최대 28 일 동안 37 ℃에서 유지시켰다. 분석을 위해, 모든 시점(1, 3, 7, 14, 21 및 28 일)에서, 상등액을 수집하였다.
방출된 이온의 누적량을 ICP-AES로 분석했다. Si 이온은 최대 28 일 동안 시간에 따라 점진적으로 방출되었고, 그 기간 동안 Den(B)보다 Fib(B)의 경우 더 많은 양이 기록되었다. 28 일까지 방출된 총량은 Den(B) 및 Fib(B)의 경우 각각 약 0.88 mM(24.64 ppm) 및 1.08 mM(30.24 ppm)이었다. Ca 이온 방출은 Si 이온과 유사한 패턴을 따르는 것으로 관찰되었지만, Ca 이온 방출량은 그 기간 동안 Si 이온보다 높았다. 28 일까지 방출된 총량은 Den(B) 및 Fib(B)의 경우 각각 약 2.15 mM(85 ppm) 및 2.50 mM(100 ppm)이었다(도 7).
이러한 이온 방출 거동은 60 % SiO2/36 % CaO/4 % P2O5(몰%), 75 % SiO2/25 % CaO(몰%) 및 66 % SiO2/27 % CaO/7 % P2O5(몰%) 조성 입자를 포함하는 다른 생활성 유리에서 잘 인식되었다. 유리 네트워크 형성제인 Si보다 Ca 같은 양이온이 더 꾸준히 방출하였다.
그 후, 이온 방출을 일일 방출량으로 전환시켰다. Fib(B)의 경우, Ca 이온은 7일까지 매일 약 220 μM 방출된 후, 28일까지 약 90 μM 방출되었다. Si 이온은 7일까지 매일 약 90 μM 방출된 후, 28일까지 약 40 μM 방출되었다(도 7).
이러한 이온들의 방출 속도는 조골세포 및 MSC의 증식 및 그 후의 골 형성 분화 및 내피 세포의 혈관형성을 포함하는 세포 반응을 유도하는 것으로 보고되었다. 특히 실리콘 이온은 골 형성과 혈관형성을 유도하는 것으로 널리 보고되었다.
따라서, 본 발명의 BGn-통합 스캐폴드는 Si 및 Ca 이온 방출에 기인한 치료능을 가짐을 알 수 있다.
실험예 3: 세포 생존력 평가
5 주령의 수컷 스프라그-다울리 쥐(Sprague-Dawley rat)로부터 MSC를 분리하였다. 골수를 0.1 % 콜라게나제 타입 I을 함유한 행크 완충 염 용액(HBSS; Gibco)을 사용하여 쥐의 경골 및 대퇴골로부터 골수를 흡인하였다. 그 다음, 1500 rpm에서 원심분리하여 효소 용액으로부터 단핵 세포를 수집한 다음 10 % 소 태아 혈청(FBS, Hyclone, Thermo), 100 U/mL 페니실린 및 100 μL/mL 스트렙토마이신(모두 시그마사 제조)로 보충된 α-최소필수배지(α-MEM, Gibco) 중에서 37 ℃에서 7 일 동안 5 % CO2가 포함된 가습 분위기에서 배양하였다. 배지는 2-3 일마다 교체하였다.
3D 스캐폴드의 세포 행동을 결정하기 전에 BGn의 독성을 시험하였다. 5 × 103 개의 MSC를 96 웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 24 시간 후, 부착되지 않은 세포를 씻어내고 BGn을 0, 20, 40, 80, 160 및 320 μg/mL의 농도로 각 웰에 처리하였다. 세포 계수 키트(CCK) 분석을 사용하여 24 시간 및 48 시간에서 세포 생존 능력을 측정하였다. 간략하게, 작업 용액(CCK 용액: 배지의 비율 = 1:10) 100 μL를 각 웰에 처리한 후 어두운 곳에서 2 시간 동안 배양했다. 작업 용액 80 μL를 새 플레이트로 옮기고, iMark 마이크로 플레이트 판독기(BioRad)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도를 검출했다.
스캐폴드 시험을 위해, 1 × 105 개의 MSC를 각각 스캐폴드(직경 5mm × 높이 3mm)에 분주하고, 5 % CO2로 가습한 37 ℃의 배양기 중 성장 배지(10 % FBS 및 10 % P/S를 함유하는 α-MEM)에서 배양하였다. 모든 시험에서 3 번째 계통의 MSC를 사용하고 수확할 때까지 2 ~ 3 일마다 배지를 리프레쉬하였다. 24 시간 후, 스캐폴드를 96 웰 플레이트의 새로운 웰로 옮기고 3 일, 7 일 및 14 일의 기간 동안 배양하였다. 각 시점에서 스캐폴드를 PBS로 2 회 세척하고, 전술한 바와 같이 CCK 분석을 수행하였다. 세포는 조밀한 구조보다 나노섬유형 구조체에서 유의하게 높은 생존력을 보였으며, 세포 수와 비슷한 결과를 보였다(도 8c).
실험예 4: 세포 부착성 평가
쥐의 골수에서 유래된 MSC를 나노섬유형 생활성 스캐폴드에서 배양하고, 초기 부착 거동을 조사하였다. 구체적으로, MSC의 부착 거동을 측정하기 위해, 부착 분자의 형태학, 퍼짐 면적, 생존력 및 발현, 즉 국소부착키나제(focal adhesion kinase, FAK) 및 인테그린 β1을 배양 초기 단계(4 시간)에 조사하였다. 세포의 형태를 관찰하기 위해, 스캐폴드에 부착된 세포를 실온에서 10 분 동안 4 % 파라-포름알데히드(PFA) 중에서 고정시킨 다음, 0.1 % triton X 100으로 삼투화시킨 다음, PBS로 3 회 세척하고 1 % BSA로 30 분동안 차단하였다. 세포를 팔로이딘으로 실온에서 45 분 동안 염색한 후 PBS로 3 회 세척하였다. 핵을 DAPI(Invitrogen)로 실온에서 5 분 동안 염색한 다음, 공초점 레이저주사현미경(CLSM; Zeiss 700)으로 관찰하였다.
부착 분자(FAK 및 그 인산화된 형태인 pFAK, 및 인테그린 β1)의 발현을 제조자의 지시에 따라 ibind 웨스턴 블롯 시스템을 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 조사하였다. 사용된 일차 항체는 마우스 항-β-액틴(sc-47778, 산타 크루즈), 토끼 항-FAK(sc-557, 산타 크루즈), 염소 항-pFAK(sc-16662, 산타 크루즈) 및 마우스 항-인테그린 β1(sc-13590, 산타 크루즈)이었다. 그 다음 블롯을 HRP(Horseradish peroxidase)-컨쥬게이트된 2 차 IgG(Immunoglobulin G)와 함께 배양하고, 강화 화학 발광(ECL, Invitrogen) 검출 시약을 사용하여 밴드 신호를 검출하였다. LAS-1000 미니 이미지 분석기(GE)를 이용하여 ECL 처리된 막을 가시화하였다. 정량 농도측정을 ImageJ 소프트웨어(NIH)에 의한 밴드 이미지로부터 수행하였다.
FAK는 MSC의 세포 내 부착 시그널링에 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 인테그린 서브세트 β1(주로 α5β1에서)은 주변 매트릭스의 MSC 인식에 중요한 수용체 중 하나이다. 모든 분자의 밴드 강도는 나노섬유형 구조체 및/또는 BGn을 갖는 스캐폴드에서 배양될 때 세포에서 더 높은 수준으로 발현되었다. β-액틴으로 정규화된 정량화된 데이터는 Fib(B), Fib, Den(B) 및 (Den)의 내림차순으로 더욱 명확하게 표현되었다. 특히, 그룹 간의 차이는 pFAK 및 β-액틴 발현에서 명백했지만 FAK에서는 약간의 차이만 나타났다. Fib(B)에 의한 유도는 Den에 의한 유도의 11 배 (β-액틴)와 4 배(pFAK) 만큼 높았다(도 8d).
ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여, 얻은 이미지로부터 세포 확산 면적 및 세포수를 결정하였다.
세포 수와 세포 확산 면적을 검토한 결과, 499 개의 조밀한 스캐폴드와 비교하여, 나노섬유형 스캐폴드(BGn을 포함하거나 포함하지 않음)는 세포골격이 더 잘 확장된 세포 수가 더 많았다. 나노섬유형 스캐폴드(Fib 및 Fib(B))는 조밀한 구조의 스캐폴드(필드 당 14.1 및 16.4 세포)보다 세포 수 (필드 당 19.6 및 26.5 세포 수)가 유의하게 높았다(도 8b).
또한, 세포 확산 영역은 조밀한 스캐폴드보다 나노섬유형 스캐폴드에서 유의하게 더 컸다. 흥미롭게도, BGn를 포함시킨 결과 세포 확산 영역이 증가하였다. 결과적으로, 영역은 987.9 μm2(Fib(B))>653.0 μm2(Fib)>358.6 μm2 (Den(B))>156.1 μm2(Den)의 순이었다.
이러한 결과는 나노섬유형 구조체가 초기 세포 고정 및 확산을 향상시킬 수 있고, 포함된 BGn에 의해 부착된 세포가 확산되도록 유도되었음을 입증하였다. 조사 결과 나노구조 및 BGn 조성에 의해 정착보다 확산 과정에 더 큰 영향을 나타냄을 알 수 있다.
세포는 나노섬유형이거나 치밀한 표면의, BGn을 포함하거나 포함하지 않거나, 스캐폴드 상에서 최대 14일의 시간 동안 활발하게 성장하였다. 특히, Fib(B) 스캐폴드는 세포 증식을 보다 유의하게 촉진시켰다(도 9a).
7 일과 14 일째 z-스택 형광 이미지로 세포 침투를 관찰하였다(도 9b). 정량화했을 때, BGn을 함유한 스캐폴드는 BGn이 없는 경우(약 150-200 μm)와 비교하여, 14 일째 Fib(b)에서 약 450 μm, Den(B)에서 약 350 μm의 더 유의하게 높은 침투 깊이를 보였다(도 9c). 특히 Fib(B)에서 더 생존하고 잘 증식하는 세포는 기공 채널을 통해 더 잘 침투할 수 있다. Fib(B)의 BGn 포매된 나노섬유 네트워크는 BGn과 나노섬유 효과로 인하여 사상위족 발달에 보다 효과적인 기질을 제공하여 세포가 빠르게 교차 및 이동하는 것을 가능하게 하는 것으로 여겨진다. 따라서 나노 크기의 섬유와 BGn은 사상위족 프로세스를 위한 일종의 나노인지(nanorecognition) 부위를 제공하는 것으로 여겨진다.
실험예 5: 골 형성 평가
유전자의 발현 확인에 의한 골 형성 평가
골 형성 배지(성장 배지 + 10mM β-글리세로포스페이트, 50㎍/mL 아스코르브산, 및 10nM 덱사메 존, 모두 Sigma 사)에서 MSC를 배양하여 골 형성을 유도하였다. 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR), 면역 염색 및 ARS에 의해 골 형성을 분석하였다. 스캐폴드 내에서 MSC를 7 일 및 14 일 동안 배양한 후, 알칼리 인산가수분해 효소(ALP), 오스테 오폰틴(OPN), 골 시알로프로테인(BSP) 및 오스테오칼신(OCN)을 포함하는 뼈 관련 유전자의 발현을 qRT-PCR로 확인하였다.
간략하게, 첫 번째 가닥 cDNA는 제조사의 지시에 따라 PCR 용 SuperScript 첫 번째 가닥 합성 시스템(Bioneer)을 사용하여 500 ng의 RNA로부터 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 반응 혼합물을 50 μL로 만들었다. 총 cDNA 중 50 ng을 사용하여 SYBR GreenER qPCR SuperMix 시약(Invitrogen)을 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 시료로부터 증폭된 내인성 레퍼런스로서 글리세르알데히드 3-인산탈수소 효소(GAPDH)를 사용하여 ΔΔCt 방법을 사용하여 상대적 전사량을 계산하였다. 폴드 변화는 이어서, 2ΔΔCt로부터 폴드 변화량을 결정하였다. 유전자의 프라이머 서열을 하기 표 2에 요약하였다.
Figure pat00001
다른 그룹들 중에서, Fib(B)는 특히 7 일째에 모든 유전자에 대해 가장 높은 수준을 나타내었다. 다른 그룹과 관련하여 ALP, OPN, BSP 및 OCN의 경우 각각 5.3 배, 3.2 배, 2.4 배, 1.8 배 높게 유도되었다(도 10a).
단백질 분비 확인에 의한 골 형성 평가
골 형성 단백질(대표적으로 선택된 OPN 및 BSP)의 분비를 7 일과 14 일째에 면역 세포 화학법으로 질적으로 확인하였다. 시료를 1 차 항체 항래빗(OPN sc-20788 및 BSP sc-292394)에서 4 ℃에서 밤새 항온 배양한 다음 PBS로 2 회 세척한 후 2 차 항래빗-FITC 항체로 처리하였다. 팔로이딘과 DAPI를 사용하여 세포를 공염색하였다. 형광 신호는 CLSM에 의해 형광 신호를 검출하였다. 21 일과 28 일에 ARS에 의해 세포 무기화를 평가하였다. 고정된 세포를 실온에서 30 분 동안 2 % w/v ARS 수용액(pH 4.1-4.3)에 침지시켰다. 증류수로 완전히 세척한 후, 염색된 시료를 디지털 카메라로 촬영하였다. 그 후, ARS 염색을 10 mM 인산나트륨(pH 7) 중에서 1 시간 동안 10 % w/v CPC로 용출시켰다. 이어서 용리액의 흡광도를 iMark 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 595 nm에서 판독하였다. 세포없는 스캐폴드를 광학 정량화를 위한 대조군으로 사용하였다.
OPN의 경우, BGn(Den(B) 및 Fib(B))의 존재는 높은 수준의 단백질 분비를 가능하게 하고, 나노섬유형 구조체(Fib 및 Fib(B))는 분비를 더욱 유도하였다. 14 일째는 7 일째보다 더 유의하게 유도되었다. BSP의 분비는 스캐폴드 유형 및 배양 시간과 관련하여, OPN과 비슷한 경향: Den<Fib<Den (B)<Fib(B)을 보였다(도 10b).
마지막으로, 골 형성의 성숙은 세포 무기화에 의해 평가되었다. 세포 배양 스캐폴드는 21 일과 28 일 째에 ARS로 염색한 다음 광학적으로 시각화하였다(도 11a). ARS는 옅은 붉은 색으로 다소 순수한 스캐폴드를 염색하였지만, 무기화된 세포는 완전히 다르게(진한 적색으로) 염색된 것으로 나타났다. 명백하게, Den(B)와 Fib(B) 스캐폴드는 어두운 붉은 염색을 나타내었고, 배양 시간이 증가함에 따라 염색 밀도가 증가했다. 그룹을 정량적으로 비교하기 위해 염색을 용출시켰다. BGn을 통합한 스캐폴드는 두 기간 모두에서 세포 무기화를 유의하게 향상시켰다(도 11a).
총합적으로, MSC의 골 형성과 성숙은 뼈 관련 유전자와 단백질의 발현, 및 칼슘 무기화 수준에 의해 분석된 바와 같이 스캐폴드의 유형에 크게 의존하는 것으로 입증되었다. 분명히, 나노섬유 및 BGn-통합 스캐폴드는 점진적으로 MSC가 조골세포로 전환되고, 석회화되도록 유도하였다. 이러한 결과는 실질적인 골 형성, 즉 7 일에서의 mRNA 수준, 14 일에서의 단백질 분비 및 21-28 일에서의 칼슘 침착을 겪는 세포의 시간 순차 과정에서 잘 입증되었다. 나노섬유형 구조체는 골 형성을 향상시키는데 긍정적인 역할을 하는 것처럼 보이지만, BGn이 관련되었을 때 시너지 역할을 하는 것이 분명하였다. 또한, BGn의 효과는 배양 기간이 3-4 주일 때 후속 무기화 단계에서 더욱 실질적으로 나타났다. BGn으로부터의 Ca와 Si와 같은 이온 방출은 가속화된 무기화를 위한 충분한 이온 소스를 제공하는 배양기간에서 계속된다(도 7에 근거). ICP 분석으로부터 추론되는, Ca 및 Si 이온의 방출된 양은 줄기/선조 세포의 골 형성을 유도할 수 있는 치료 창에 위치한다. Ca 이온은 인산 칼슘 형성의 직접적인 소스가 될 수 있는 반면, Si 이온은 무기물 형성 속도를 높이거나 무기물 생성물을 안정화시키는 것으로 알려져 있다.
실험예 6; 내피 세포의 혈관형성 평가
인간의 제대정맥 내피세포(HUVECs)를 이용하여 세포의 혈관형성을 분석하였다. 세포를 내피세포 성장키트-VEGF 배지(PCS-100-041, ATCC 1차 세포 용액)에서 37 ℃, 5 % CO2를 함유한 가습 분위기에서 배양하였다. 트랜스웰 삽입물(Corning, 353097)을 사용하는 간접 분석에 의해 HUVEC의 혈관형성 행동에 관한 스캐폴드의 효과를 조사하였다. 스크래치 테스트에 의해 세포의 이동 능력을 평가하였다. 1 × 105 HUVEC를 24 웰 플레이트의 각 웰 상에 접종하였다. 1 일 후, 부착된 HUVEC를 노란색 팁을 사용하여 긁어낸 후 다른 유형의 각 스캐폴드를 포함하는 트랜스웰 삽입물을 배치하였다. 24 시간 동안 배양한 후, 역광현미경(IX-71, Olympus)을 사용하여 세포를 촬영하고, 스크래치된 영역으로 이동된 세포의 수를 세었다. HUVEC의 관형 네트워크 형성 능력을 매트리겔(356234, BD Bioscience) 매트릭스를 사용하여 평가하였다. 제조사의 규격에 따라 37 ℃에서 1 시간 동안 24 웰 플레이트의 각 웰 상에 매트리겔을 코팅하였다. 1 × 105 개의 세포를 매트리겔 코팅 웰에 뿌린 다음 스캐폴드를 포함한 트랜스웰 삽입물을 놓았다. 역광현미경을 사용하여 3 시간 및 6 시간 째에 세포를 촬영하였다. 10 개의 임의적 현미경 필드를 취하여 가지점들(마디들)과 메쉬 모양의 원들(원) 수를 측정했다. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
도 12a에서 보는 바와 같이, 24 시간 동안, 세포는 BGn(Den 및 Fib)이 없는 것들보다 BGn-함유 스캐폴드(Den(B) 및 Fib(B))에 의해 더 활발하게 긁힌 영역을 향해 이동하였다. 이동된 세포의 정량화는 BGn이 있는 그룹과 BGn이 없는 그룹 간에 유의한 차이를 보여주었다: 225 ± 27.5(Fib(B))191 ± 31.8(Den(B))>147.2 ± 21.1(Fib)138.6 ± 13.9(Den)(도 12b).
세포 분극에 의해 시작된 내피 세포 이동은 혈관 형성의 전제 조건이며, 이동된 내피 세포는 관형 네트워크를 형성하고 혈관 내로 성숙한다. 매트리겔 상에 형성된 내피 관형 네트워크를 추가로 분석하였다. 3 시간과 6 시간에 찍은 광학 이미지는 BGn이 없는 것보다 BGn을 포함하는 스캐폴드 그룹(Den(B) 및 Fib(B))에서 더 심오한 혈관 유사 네트워킹을 보였다(도 12c). 혈관형성 능력을 정량적으로 측정하기 위해 원형과 노드 수를 포함한 관형 네트워크의 몇 가지 핵심 매개 변수를 측정했다. BGn을 함유한 스캐폴드 그룹은 두 기간 모두에서 BGn 없는 것보다 유의하게 높은 원과 노드 수를 나타냈다(도 12d). 이와 같은 결과는 스캐폴드로부터의 BGn(이온 방출)의 간접적 신호가 세포 이동 및 관형 네트워크 형성과 같은 혈관 형성에서의 시험관 내피 기능을 유도하는데 결정적인 역할을 한다는 것을 입증한다.
실험예 7: 쥐 피하 조직에서 체내 혈관형성 평가
12 주령의 수컷 스프라그-다울리 쥐를 사용하여 체내 조직 적합성 및 신생 혈관 형성능을 평가하였다. 시험에 사용한 스캐폴드 군은 Den, Den(B), Fib, 및 Fib(B)이고, 군 마다 4개의 시료를 주입하였다. 스캐폴드를 사용하기 전에 산화에틸렌 가스를 사용하여 살균하였다. 랫트의 중추골 부위에 원통 모양의 스캐폴드(5mm × 3mm)를 피하 주입하였다. 케타민 HCl(80 mg/kg 체중) 및 크실라진(10 mg/kg 체중)의 근육 주사로 동물을 마취시켰다. 등 부위의 피부를 면도하고 알콜 및 포비돈 용액으로 처리하였다. 바드-파커 메스(bard-parker scalpel)에 # 10 블레이드를 장착하고 길이 2cm의 절개를 한 다음, 아기 메츠바움 가위(baby metzenbaum scissors)로 4개의 포켓을 피하로 형성했다. 시료를 포켓에 이식하고 4-0 비흡수성 모노필라멘트 봉합사 물질(Prolene)로 봉쇄하였다.
2 주 및 4 주 후에, 동물을 희생시키고, 이식된 스캐폴드 및 주변 조직을 조직학적 분석을 위해 제거하였다. 수확한 조직 시료를 실온에서 24 시간 동안 4 % 완충된 포름알데히드에 담그고, 등급된 계열의 에탄올로 처리하고, 파라핀에 매립하고, 마이크로톰으로 절단한 다음, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 광학현미경 하에서의 관찰에 기초하여, 세포 및 조직 침범을 포함하는 세포의 스캐폴드에 대한 반응(염색된 세포 및 분비된 ECM 성분의 수준) 및 신혈관 형성(원형 조직에서 수집된 적혈구로 표시되는)을 분석하고 비교하였다. 또한 새로 형성된 혈관을 확인하기 위해 CD31(sc-376764, Santa Cruz)으로 조직 시료를 면역 조직 화학 염색하였다.
도 13a에서 보는 바와 같이, 2 주 및 4 주째에 획득된 H&E 염색 이미지는 다양한 종류의 스캐폴드 내에서 생체 내 세포 및 조직 반응을 보여주었다. 모든 스캐폴드는 우수한 조직 적합성을 보였으며, 매우 제한된 수의 염증 세포를 보였으나, 스캐폴드 전체에 섬유 아세포와 내피 세포와 같은 조직 형성 세포의 주요 개체군을 보였다. 조직/세포 침입 영역에서 그룹 간의 명확한 차이가 나타났다. 섬유성 스캐폴드 그룹(Fib 및 Fib(B))의 조직 침투는 현저하게 빨랐으며, 2 주 이내에 침입 지역의 거의 60.4-70.3 %를 나타내었으며, 이는 조밀한 스캐폴드와 대조된다(약 25.0-28.8 %)(도 13b). 4 주 후에 조직 침범은 실질적으로 향상되었다: Den(B) 군 (~74 %)에서는 가장 유의한 증가가 나타났으며, Fib와 Fib(B) 그룹에서는 거의 ~87 %의 영역이 조직으로 침범되었다. 그러나 Den 그룹은 여전히 매우 제한적인 조직 침범(~32 %)을 보였고, 2 주에 관찰된 수준에서 약간의 개선을 보였다. 결과는 나노섬유형 구조체 및 BGn 성분이 세포 이동 및 조직 형성을 돕는다는 것을 뒷받침한다.
이러한 결과에는 몇 가지 이유가 있을 수 있다. 스캐폴드의 향상된 친수성(도 6 참조)은 생물학적 단백질 및 세포의 전도도를 증가시킬 수 있다(도 8의 스캐폴드 내에서 향상된 세포 이동으로 입증됨). 또한 제공된 신호(특히 BGn)는 Si와 Ca 이온의 방출을 통해 원위 세포에서 화학 유인 물질 역할을 할 수 있다(도 12의 내피 세포 이동에 대한 간접 효과에 의해 입증됨). 스캐폴드의 분해는 세포/조직 침입 영역의 계산에 영향을 줄 수 있지만, 스캐폴드 부분은 오직 ~10 % (모든 그룹에 대해 ~ 90 %의 다공성 수준)를 차지하기 때문에 최소일 수 있다. 결론적으로, 조직 침투 결과는 생체 내 세포 이식 및 조직 통합을 촉진하기 위한 스캐폴드의 능력을 반영하는 것으로 간주된다. 조직학적 이미지에서 또 다른 주목할 만한 발견은 신혈관 형성이다(도 13c). 새로 형성된 조직 부위를 면밀히 조사한 결과, H&E 염색 조직 시료에서 발견되는 혈관의 전형적인 특징인 원형 세관 유사 조직(화살표로 표시)으로 둘러싸인 응집된 적혈구의 어두운 적색 얼룩이 나타났다. 스캐폴드에서 신혈관 형성을 추가로 확인하기 위해, CD31 면역 조직 화학 염색을 실행하였다. 대표 이미지(도 13d)에서 볼 수 있듯이, 혈관 밀도와 분포는 H&E 염색 이미지에서 관찰된 것과 유사하였다. H&E 염색으로 정량화한 신혈관의 수는 그룹간에 유의한 차이를 보였다(도 13e). 나노섬유 스캐폴드(Fib 및 Fib(B))가 초기 단계(2 주)에 더 많은 혈관을 형성하는 반면, BGn을 포함하는 조밀한 스캐폴드(Den(B))는 4 주차에 나노섬유와 유사한 수준에 도달했다. 모든 그룹 중에 나노섬유형 구조체 및 BGn 함유 스캐폴드가 가장 빠르고 가장 많은 신생 혈관 형성을 나타냈다. 피하 조직에서의 생체 내 혈관 형성은 내피 기능(이동 및 관형 네트워크 형성)의 유도에 있어서의 BGn의 생체 외 역할을 뒷받침한다. 또한, 생체 내 발견은 혈관형성에 관한 나노섬유 형태의 효과를 강조한다.
통계 분석
데이터는 평균치이고, 표준편차는 평균 ± 1이다. 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 유의차를 결정하였다. 유의성은 p <0.05 (*) 또는 p <0.01 (**)에서 고려되었다. 또한 본페로니 사후검정(Bonferroni post-hoc test)을 이용한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 다중 비교의 통계 분석에 사용하였다.

Claims (11)

  1. 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드에 분리된 줄기세포 또는 내피세포를 적재하여 배양하는 단계를 포함하는, 골 또는 혈관 형성 유도방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 유리 나노입자는 실리콘과 칼슘을 75 내지 95:25 내지 5(몰비)의 비율로 포함하고, 직경이 100 nm 미만인 나노구조체이며, 0.08 내지 0.12 ㎤/g의 기공 부피 및 3.5 nm 내지 4.0 nm의 메조기공 직경을 가지고, ζ-포텐셜 값이 30 내지 25 mV 값을 갖는 것인, 골 또는 혈관 형성 유도방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 200 내지 300 ㎛의 기공크기를 갖는 것인, 골 또는 혈관 형성 유도방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 수접촉각이 60 내지 65°인 것인, 골 또는 혈관 형성 유도방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 적재된 줄기세포 또는 내피세포의 스캐폴드로의 접착, 확장 또는 3차원 스캐폴드 내부로의 침투력이 생활성 유리 나노입자를 포함하지 않는 나노섬유형 3차원 스캐폴드에 비하여 향상된 것인, 골 또는 혈관 형성 유도방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 나노섬유형 구조체는 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV), 폴리락트산, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리프로필렌퓨머레이트, 폴리다이옥세논, 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 이루어진 것인, 골 또는 혈관 형성 유도방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 생활성 유리 나노입자의 함량은 나노섬유형 구조체의 총 중량에 대하여 1 내지 40중량%인 것인, 골 또는 혈관 형성 유도방법.
  8. 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하는 매크로기공을 갖는 3D 스캐폴드에 분리된 줄기세포 또는 내피세포를 적재하여 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 내피세포의 배양방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 나노섬유형 구조체는 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리하이드록시발레르에이트(PHV), 폴리락트산, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리프로필렌퓨머레이트, 폴리다이옥세논, 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 물질로 이루어진 것인, 배양방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 생활성 유리 나노입자는 실리콘과 칼슘을 75 내지 95:25 내지 5(몰비)의 비율로 포함하고, 직경이 100 nm 미만인 나노구조체이며, 0.08 내지 0.12 ㎤/g의 기공 부피 및 3.5 nm 내지 4.0 nm의 메조기공 직경을 가지고, ζ-포텐셜 값이 30 내지 25 mv 값을 갖는 것인, 배양방법.
  11. 나노섬유형 구조체로 네트워크화되고 생활성 유리 나노입자를 포함하고 매크로 기공을 갖는 3D 스캐폴드; 및 상기 스캐폴드에 적재된 분리된 줄기세포 또는 내피세포를 포함하는, 골 또는 혈관 형성용 조성물.
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