KR20190049902A - 교차 결합 영역 배향을 갖는 이원 가변 영역 항체-유사 결합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질로서, 상기 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 각 쌍의 폴리펩타이드들이, 교차 배향을 갖는 이원 가변 도메인들을 지닌, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 항원-유사 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

교차 결합 영역 배향을 갖는 이원 가변 영역 항체-유사 결합 단백질{DUAL VARIABLE REGION ANTIBODY-LIKE BINDING PROTEINS HAVING CROSS-OVER BINDING REGION ORIENTATION}
본 발명은, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질로서, 상기 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 각 쌍의 폴리펩타이드들이, 교차 배향을 갖는 이원 가변 도메인들을 지닌, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 항원-유사 결합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
자연 발생 IgG 항체는 2가이고 단일 특이적이다. 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 이특이적 항체는 재조합 기술을 이용하여 생산할 수 있고, 광범위한 임상 적용을 갖도록 계획된다. 완전 IgG 항체 분자가, 4개의 폴리펩타이드 쇄: 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 Y-형태의 분자임은 잘 알려져 있다. 각각의 경쇄는, 가변 또는 VL 도메인(또는 영역)으로서 알려져 있는 N-말단 도메인 및 불변(또는 CL) 도메인(불변 카파(Cκ) 또는 불변 람다(Cλ) 도메인)으로서 알려져 있는 C-말단 도메인의 2개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 중쇄는 항체의 클래스(class)에 따라 4개 또는 5개의 도메인으로 이루어진다. N-말단 도메인은 가변(또는 VH) 도메인(또는 영역)으로서 알려져 있고, 이는 제1 불변(또는 CH1) 도메인, 힌지 영역, 이어서 제2 및 제3 불변(또는 CH2 및 CH3) 도메인으로 이어진다. 조립된 항체에서, VL 및 VH 도메인은 함께 결합하여 항원 결합 부위를 형성한다. 또한, CL 및 CH1 도메인은 함께 결합하여 하나의 중쇄를 하나의 경쇄와 결합된 상태로 유지한다. 2개의 중-경쇄 이종이량체는 CH2와 CH3 도메인의 상호작용에 의해 그리고 2개의 중쇄 상의 힌지 영역 사이의 상호작용에 의해 함께 결합한다.
항체의 단백질용해성 소화는 항체 단편(Fab 및 Fab2)의 생산을 초래할 수 있다는 것이 알려져 있다. 전체 항체의 이러한 단편은 항원 결합 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 항체 단편은 재조합적으로 생산될 수 있다. 서로 결합된 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로만 이루어진 Fv 단편이 수득될 수 있다. 이들 Fv 단편은 항원 결합에 대해 1가이다. 대부분의 자연 발생 항체는 완전 결합 효능을 보유하기 위해 일반적으로 VH 및 VL 둘 다를 필요로 하지만, 각각의 가변 도메인(도메인 항체 또는 dAB; Ward et al., 1989, Nature 341(6242): 544-46) 및 각각의 상보성 결정 영역 또는 CDR(Williams et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(14): 5537-41) 등의 보다 작은 단편도 모 항체의 결합 특성을 보유하는 것으로 나타났다.
단일쇄 가변 단편(scFv) 작제물은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 포함된 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 도메인들은 충분한 길이(12개 초과의 아미노산 잔기)의 가요성 링커에 의해 분리되고, 이는 분자내 상호작용을 하도록 하여 상기 2개의 도메인들이 기능성 에피토프 결합 부위에 자기-조립하도록 한다(Bird et al., 1988, Science 242(4877): 423-26). 이들 작은 단백질(MW 약 25,000Da)은 일반적으로 단일 폴리펩타이드에서 이들의 항원에 대한 특이성 및 친화성을 보유하여, 보다 큰 항원-특이적 분자를 위한 편리한 빌딩 블록을 제공할 수 있다.
진단 및 치료요법에서 전체 항체 대신에 항체 단편을 이용하는 것의 이점은 이들의 보다 작은 크기에 있다. 이들은 전체 항체보다 덜 면역원성인 경향이 있고, 조직에 보다 잘 침투할 수 있다. 이러한 단편의 사용과 관련된 불리한 점은, 이들이 단지 1개의 항원 결합 부위를 가져 감소된 결합활성을 초래한다는 것이다. 추가로, 이들의 작은 크기로 인하여, 이들은 혈청으로부터 매우 급속하게 제거되고, 따라서 짧은 반감기를 나타낸다.
단일 분자 내의 2개의 항체의 항원 결합 부위를 조합하므로 2개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있는 이특이적 항체(BsAb)를 생산하는 것에 대해 관심이 있었다. 진단학적 목적을 위한 용도 이외에도, 이러한 분자는, 강한 이펙터 시스템을 환부에 재지시함으로써(여기서, 암성 세포는 메커니즘을 전개시켜 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC)과 같은 모노클로날 항체에 의해 유발된 정상 면역 반응을 억제한다), 또는 항체의 중화 활성 또는 자극 활성을 증가시킴으로써, 새로운 치료학적 용도를 위한 길을 열었다. 이러한 가능성은 일찍이 상기 이특이적 항체를 수득하기 위한 다수의 접근법을 유도하는 것으로 인식되었다. 치료학적 목적을 위한 상이한 표적 항원에 대한 2개의 전체 항체의 결합 특이성을 커플링하기 위한 초기 시도는 화학적으로 융합된 이형접합체 분자를 사용하였다(Staerz et al., 1985, Nature 314(6012): 628-31).
이특이적 항체는 본래, 각각 상이한 면역글로불린을 생산할 수 있는 2개의 하이브리도마를 융합함으로써 제조되었지만(Milstein et al., 1983, Nature 305(5934): 537-40), 세포 배양으로 제조된 종의 복잡성(10개까지의 상이한 종)은 곤란하고 고가인 정제를 초래하였다(George et al., 1997, THE ANTIBODIES 4: 99-141(Capra et al., ed., Harwood Academic Publishers)). 이러한 포맷을 이용하여, 동일한 세포에서(예를 들면, 2개의 하이브리도마의 쿼드로마 융합으로서 또는 조작된 CHO 세포에서) 마우스 IgG2a 및 래트 IgG2b 항체를 함께 생산하였다. 각각의 항체의 경쇄는 이들의 동족체 종의 중쇄와 우선적으로 결합하기 때문에, 주요 3종의 항체는 조립된다: 2개의 모 항체, 및 이들의 Fc 부분을 통해 결합하는, 각각의 하나의 중쇄/경쇄 쌍을 포함하는 2개의 항체의 이종이량체. 단백질 A에 대한 이종이량체의 결합 특성이 모 항체의 결합 특성과 상이하기 때문에 바람직한 이종이량체는 이러한 혼합물로부터 정제될 수 있다: 래트 IgG2b는 단백질 A에 결합하지 않고, 반면 마우스 IgG2a는 단백질 A에 결합한다. 결과적으로, 마우스-래트 이종이량체는 단백질 A에 결합하지만, 마우스 IgG2a 동종이량체보다 더욱 높은 pH에서 용출하고, 이것은 이특이적 이종이량체의 선택적 정제를 가능하게 한다(Lindhofer et al., 1995, J. Immunol. 155(1): 219-25). 얻어진 이특이적 이종이량체는 완전 비-사람이고, 따라서 고도로 면역원성이며, 이는 유해한 부작용(예를 들면, "HAMA" 또는 "HARA" 반응)을 갖고/갖거나 치료제를 중화시킬 수 있다. 포유동물 세포 배양으로부터 고수율로 쉽게 생산될 수 있는 우수한 특성을 갖는 조작된 이특이적 항체에 대한 요구가 남아 있었다.
상기 인용된 바와 같은 세포 융합으로부터 생산된 이특이적 항체 또는 이종접합체를 이용하여 얻어진 유망한 결과에도 불구하고, 몇몇의 인자들은 보다 큰 규모의 치료학적 용도에 대해 이들을 비현실적으로 만들었다. 이러한 인자들로는 생체내 이종접합체의 신속한 제거, 어느 한 유형의 분자를 생성하기 위해 필요한 실험실 집중 기술, 동종접합체 또는 단일-특이적 항체로부터의 이종접합체의 광범위한 정제를 위한 요구, 및 일반적으로 수득되는 저수율이 포함된다.
빈도를 증가시키면서 유전 공학을 이용하여 바람직한 세트의 결합 특성과 이펙터 기능을 갖는 항체 또는 항체 유도체가 고안, 변형, 및 생산되어 왔다. 항체 단편(Carter et al., 1995, J. Hematother. 4(5): 463-70; Pluckthun et al., 1997, Immunotechnology 3(2): 83-105; Todorovska et al., 2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 47-66) 및 전장 IgG 포맷(Carter, 2001, J. Immunol. Methods 248(1-2): 7-15) 둘 다로서의 BsAb의 효율적인 생산을 위한 다양한 재조합 방법이 개발되어 왔다.
2개의 상이한 scFv를 조합하는 것은 sc-BsAb 또는 Ta-scFv라고 칭하는 최소 분자량을 갖는 BsAb 포맷을 수득한다(Mack et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(15): 7021-25; Mallender et al, 1994, J. Biol. Chem. 269(1): 199-206). BsAb는, 류신 지퍼 등의 이량체화 기능성에 2개의 scFv를 유전적으로 융합함으로써 작제되어 왔다(Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148(5): 1547-53; de Kruif et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(13): 7630-34).
디아바디는 작은 2가의 이특이적 항체 단편이다. 상기 단편은, 동일한 폴리펩타이드 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루기에 너무 짧은(12개 미만의 아미노산 잔기) 링커를 이용함으로써 상기 동일한 폴리펩타이드 쇄 상의 VL에 연결된 VH를 포함한다. 상기 도메인들은 다른 쇄의 상보성 도메인과 분자간 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 이들 이량체성 항체 단편, 또는 "디아바디"는 2가이고 이특이적이다(Holliger et al., 1993, Proc. Natl., Acad, Sci, U.S.A. 90(14): 6444-48). 디아바디는 Fab 단편과 크기가 유사하다. 3 내지 12개 아미노산 잔기의 링커와 결합된 VH 및 VL 도메인의 폴리펩타이드 쇄는 우선적으로 이량체(디아바디)를 형성하고, 한편 0 내지 2개 아미노산 잔기의 링커를 이용하면 삼량체(트리아바디) 및 사량체(테트라바디)가 우선한다. 링커 길이 이외에, 올리고머화의 정확한 패턴은 가변 도메인의 배향뿐만 아니라 조성에도 의존하는 것으로 보인다(Hudson et al., 1999, J. Immunol. Methods 231(1-2): 177-89). 디아바디 분자의 최종 구조의 예측가능성은 매우 나쁘다.
sc-BsAb 및 디아바디-기반 작제물은 흥미로운 임상학적 잠재력을 나타내지만, 이러한 비-공유 결합 분자는 생리학적 조건 하에 충분히 안정하지 않다는 것이 나타났다. scFv 단편의 전체 안정성은 VL 및 VH 도메인의 내인성 안정성뿐만 아니라 도메인 계면의 안정성에도 의존한다. scFv 단편의 VH-VL 계면의 불충분한 안정성은 종종 비가역적 scFv 불활성화의 주요 요인으로서 제안되는 경우가 있었고, 이는, 펩타이드 링커에 의해 허용될 수 있는 계면의 일시적 개방이, 응집하여 불안정성 및 나쁜 생성 수율을 초래하는 소수성 패치를 노출시키기 때문이다(Worn et al., 2001, J. Mol. Biol. 305(5): 989-1010).
VH 및 VL 도메인 유래의 이특이적 2가의 항원-결합 단백질을 제조하는 대안의 방법은 미국 특허 제5,989,830호에 기술되어 있다. 이러한 이중 헤드 및 이원 Fv 입체구조(configuration)는, 2개의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 바이시스트로닉 벡터(bicistronic vector)를 발현시킴으로써 수득된다. 이원-Fv 입체구조에서, 2개의 상이한 항체의 가변성 도메인은 2개의 별도의 쇄(1개의 중쇄 및 1개의 경쇄) 상의 탠덤(tandem) 배향으로 발현되고, 여기서, 하나의 폴리펩타이드 쇄는 펩타이드 링커(VH1-링커-VH2)에 의해 분리된 일련의 2배의 VH를 갖고, 다른 폴리펩타이드 쇄는 펩타이드 링커(VL1-링커-VL2)에 의해 연결된 일련의 상보성 VL 도메인으로 이루어진다. 교차 이중 헤드 입체구조에서, 2개의 상이한 항체의 가변성 도메인은 2개의 별도의 폴리펩타이드 쇄(1개의 중쇄 및 1개의 경쇄) 상의 탠덤(tandem) 배향으로 발현되고, 여기서, 하나의 폴리펩타이드 쇄는 펩타이드 링커(VH1-링커-VH2)에 의해 분리된 일련의 2배의 VH를 갖고, 다른 폴리펩타이드 쇄는 반대 배향으로의 펩타이드 링커(VL2-링커-VL1)에 의해 연결된 일련의 상보성 VL 도메인으로 이루어진다. 작제물의 분자 모델링은 폭 30 내지 40Å(15 내지 20개의 아미노산 잔기)으로 충분히 긴 링커 크기를 제안하였다.
항체의 결합가(valency)를 증가시키는 것은 결합활성(avidity) 효과로 인한 항체의 기능적 친화성을 향상시키므로 흥미롭다. 증가된 결합가를 갖는 다가의 단백질 복합체(PPC: polyvalent protein complex)는 미국 특허 출원 공보 제US2005/0003403 A1호에 기재되어 있다. PPC는 일반적으로 서로 비스듬히 배열된 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 각각의 폴리펩타이드 쇄는 전형적으로 3개 또는 4개의 "v-영역"을 포함하고, 이는 반대측 폴리펩타이드 쇄 상의 상응하는 v-영역과 매칭되는 경우에 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 폴리펩타이드 쇄에 대해 6개 이하의 "v-영역"을 사용할 수 있다. 각각의 폴리펩타이드 쇄의 v-영역은 서로 선상으로 연결되고, 개재된 연결 영역(interspersed linking region)에 의해 연결될 수 있다. PPC의 형태로 배열되는 경우, 각각의 폴리펩타이드 쇄 상의 v-영역은 각각의 항원 결합 부위를 형성한다. 복합체는 하나 또는 몇몇의 결합 특이성을 포함할 수 있다.
Fc의 CH3 도메인에서 "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 돌연변이의 세트를 이용하는 Fc 이종이량체를 생산하기 위한 전략은 카터(Carter) 등에 의해 제안되었다(Ridgway et al., 1996, Protein Eng, 9(7): 617-21; Carter, 2011, J Immunol. Method 248(1-2): 7-15). 이들 돌연변이는, 이종이량체의 형성이, 포유동물 세포 배양물로부터 양호한 이종이량체 발현이 달성되는 동종이량체와 비교하여 바람직하도록, 구조적으로 보존된 소수성 코어 내의 CH3 도메인 계면 사이에 상보성을 팩킹(packing)하는 잔기의 변경을 초래한다. 이러한 전략은 보다 높은 이종이량체 수율을 초래하였지만, 동종이량체는 완전히 억제된 것은 아니었다(Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81).
구나세카란(Gunasekaran) 등은 CH3 도메인 계면에서의 전하 상보성을 변화시킴으로써 Fc 이종이량체의 형성을 유도하면서 소수성 코어 완전성을 보유하는 실행가능성을 탐구하였다(Gunasekaran et al., 2010, J. Biol. Chem. 285(25): 19637-46). 정전기 스티어링 메커니즘의 이점을 취하여, 이들 작제물은, 2쌍의 주변에 위치하는 하전된 잔기의 돌연변이를 통해 동종이량체의 최소 오염으로 Fc 이종이량체 형성의 효율적인 촉진을 나타냈다. 놉-인투-홀 디자인과는 대조적으로, 정전 반발력 메커니즘의 특성으로 인하여 동종이량체가 균일하게 억제되었지만, 완전하게 회피된 것은 아니었다.
데이비스(Davis) 등은, 추가의 쇄간 디설파이드 결합을 도입하지 않으면서 사람 IgG 및 IgA CH3 도메인의 β-가닥 절편을 서로 맞물리게 함(interdigitating)으로써 Fc 동종이량체를 이종이량체로 전환시키기 위한 항체 조작 접근법을 기술한다(Davis et al., 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23(4): 195-202). 포유동물 세포에 의한 SEEDbody(Sb) 융합 단백질의 발현은, 쉽게 정제되어 소량의 부가물을 제거하는 고수율로 Sb 이종이량체를 수득한다.
미국 특허 출원 공보 제US2010/331527 A1호는, 1개의 중쇄에 CH3 도메인 내의 돌연변이 H95R 및 Y96F를 도입하는 CH3 도메인의 이종이량체화에 기초한 이특이적 항체를 기술한다. 이들 아미노산 치환은 IgG3 서브타입의 CH3 도메인으로부터 기원하고, IgG1 골격을 이용하여 이종이량체화될 것이다. 모든 중쇄와 쌍을 이루는 경향이 있는 보통의 경쇄는 CH3 도메인일지라도 이종이량체화에 기초한 모든 포맷에 대해 필수 조건이다. 따라서, 총 3개의 유형의 항체가 생산된다: 순수한 IgG1 골격을 갖는 50%, 순수한 H95R 및 Y96F 돌연변이된 골격을 갖는 1/3, 및 2개의 상이한 중쇄를 갖는 1/3(이특이적). 단백질 A에 대한 이종이량체의 결합 특성이 모 항체의 결합 특성과 상이하기 때문에(IgG3-유도된 CH3 도메인은 단백질 A에 결합하지 않고, 반면 IgG1은 결합함) 바람직한 이종이량체가 이러한 혼합물로부터 정제될 수 있다. 결과적으로, 이종이량체는 단백질 A에 결합하지만, 순수한 IgG1 동종이량체보다 더욱 높은 pH에서 용출되고, 이는 이특이적 이종이량체의 선택적 정제를 가능하게 한다.
미국 특허 제7,612,181호는 미국 특허 제5,989,830호에 기재된 이원-Fv 포맷에 기초한 이원-가변-도메인 IgG(DVD-IgG) 이특이적 항체를 기술한다. 또한, 유사한 이특이적 포맷은 미국 특허 출원 공보 제US2010/0226923 A1호에 기재되어 있다. 이원-Fv의 각각의 쇄에의 불변 도메인(중쇄에 대해 CH1-Fc, 그리고 경쇄에 대해 카파 또는 람다 불변 도메인)의 첨가는 추가의 변형(즉, 안정성을 향상시키기 위한 불변 도메인의 명백한 첨가)을 전혀 필요로 하지 않고 기능성 이특이적 항체를 수득하였다. DVD-Ig/TBTI 포맷에서 발현된 몇몇의 항체는 제2(또는 최내측) 항원 결합 위치(Fv2)에 대한 위치 효과를 나타낸다. Fv2 위치에 의해 인식된 항원의 서열 및 특성에 따라, 이러한 항체 도메인은 이의 항원에 대해 감소된 친화성(즉, 모 항체와 비교하여 온-레이트의 손실)을 나타낸다. 이러한 관찰에 관한 하나의 가능한 설명은, VL1과 VL2 사이의 링커가 Fv2의 CDR 영역으로 돌출되어 Fv2가 보다 큰 항원에 다소 접근하기 어렵게 한다는 것이다.
미국 특허 제5,989,830호에 기재되어 있는 이특이적 항체 단편의 제2 입체구조는 2개의 쇄 상에서 발현되는 하기 배향의 가변 도메인을 갖는 교차 이중 헤드(CODH: cross-over double head)이다:
경쇄에 대해, VL1-링커-VL2, 및
중쇄에 대해, VH2-링커-VH1.
'830 특허는, 이특이적 교차 이중-헤드 항체 단편(작제물 GOSA.E)이 이원-Fv보다 더욱 높은 결합 활성을 보유한다('830 특허의 20페이지 20 내지 50째줄 참조)는 것을 개시하고, 추가로, 이러한 포맷이 가변 도메인 사이에 사용되는 링커에 의해 덜 영향을 받는다('830 특허의 20 내지 21페이지 참조)는 것을 개시한다.
본 발명은, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질로서, 2개의 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
로 나타내어지는 구조를 갖고,
2개의 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 II:
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc
로 나타내어지는 구조를 갖고,
여기서:
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 화학식 I의 폴리펩타이드와 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하는,
4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은, 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질로서,
제1 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
로 나타내어지는 구조를 갖고,
제2 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 II:
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1
로 나타내어지는 구조를 갖고,
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 제1 폴리펩타이드와 상기 제2 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하는,
2개의 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제공한다.
추가로, 본 발명은, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제조하는 방법으로서, 각각 VL 및 VH를 포함하는, 제1 표적 항원에 결합하는 제1 항체 가변 도메인 및 제2 표적 항원에 결합하는 제2 항체 가변 도메인을 식별하는 단계; 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나를 템플레이트 쇄로서 지정하는 단계; 상기 제1 항체 가변 도메인 또는 상기 제2 항체 가변 도메인의 VL을 VL1로서 지정하는 단계; 하기 화학식 I 및 화학식 II:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc
에 따라 VL2, VH1, 및 VH2를 지정하는 단계;
상기 L1, L2, L3, 및 L4에 대해 최대 및 최소 길이를 측정하는 단계; 상기 화학식 I 및 화학식 II의 폴리펩타이드 구조들을 생성하는 단계; 결합시에 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 제1 표적 항원 및 제2 표적 항원에 결합하는 화학식 I 및 화학식 II의 폴리펩타이드 구조들을 선택하는 단계를 포함하고;
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하는,
4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제조하는 방법으로서, 각각 VL 및 VH를 포함하는, 제1 표적 항원에 결합하는 제1 항체 가변 도메인 및 제2 표적 항원에 결합하는 제2 항체 가변 도메인을 식별하는 단계; 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나를 템플레이트 쇄로서 지정하는 단계; 상기 제1 항체 가변 도메인 또는 상기 제2 항체 가변 도메인의 VL을 VL1로서 지정하는 단계; 하기 화학식 I 및 화학식 II:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1
에 따라 VL2, VH1, 및 VH2를 지정하는 단계;
상기 L1, L2, L3, 및 L4에 대해 최대 및 최소 길이를 측정하는 단계; 상기 화학식 I 및 화학식 II의 폴리펩타이드 구조들을 생성하는 단계; 결합시에 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 제1 표적 항원 및 제2 표적 항원에 결합하는 화학식 I 및 화학식 II의 폴리펩타이드 구조들을 선택하는 단계를 포함하고;
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하는,
4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태는 하기 소정 실시형태의 보다 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 분명해질 것이다.
본 발명은, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질로서, 상기 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 각 쌍의 폴리펩타이드들이, 교차 배향을 갖는 이원 가변 도메인들을 지닌, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 항원-유사 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 가변 도메인들이 교차 배향으로 배치되고, 두 개의 가변 도메인 사이 및 가변 도메인과 불변 도메인 사이에 링커를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 제공한다.
도 1. TBTI 포맷에서, 이원 V 영역 입체구조 내의 항원 결합 도메인 Fv1 및 Fv2, 및 이들의 각각의 펩타이드 링커 LL 및 LH의 배열의 도식적 표현.
도 2. 교차 이원 가변(CODV) 입체구조 내의 항원 결합 도메인 Fv1(항-IL4) 및 Fv2(항-IL13), 및 이들의 각각의 펩타이드 링커들의 배열의 도식적 다이아그램(2D).
도 3. 항-IL4의 Fv 및 항-IL13의 Fv의 단백질-단백질 도킹에 의해 수득된 하나의 가능한 공간적 배열을 나타내는 Fv 항-IL4 및 Fab 항-IL13의 도식적 표현.
도 4. DVD-Ig 단백질-코팅된 칩 위에 2개의 항원을 순차적으로 또는 동시에 주사함에 의한 BIACORE 검정에서의 CODV 단백질의 4가의 이특이적 결합 능력의 평가. 순차적 주사에 의해 관찰된 최대 신호는 양쪽 항원의 동시-주사에 의해 수득될 수 있고, 이는 모든 결합 부위의 포화를 입증한다.
도 5. CODV 입체구조 내의 항원 결합 도메인 및 이들의 각각의 펩타이드 링커 LL(L1 및 L2) 및 LH(L3 및 L4)의 배열의 도식적 다이아그램(2D). 패널 A에서, 경쇄는 "선상 또는 템플레이트"로 정렬로 유지되고, 한편 중쇄는 "교차" 입체구조로 존재한다. 패널 B에서, 중쇄는 "선상 또는 템플레이트" 정렬로 유지되고, 경쇄는 "교차" 입체구조로 존재한다.
도 6. 경쇄 또는 중쇄가 "템플레이트"로서 사용되는지의 여부에 기초한 CODV-Ig 디자인의 도식적 표현.
도 7. 항-IL4 및 항-IL13 서열을 포함하는 TBTI/DVD-Ig 또는 CODV-Ig 분자의 비교.
도 8. NALM-6 세포를 이용한 세포독성 검정에서의 CODV-Fab 및 B-Fab 포맷의 비교.
컴퓨터 모델링은, 미국 특허 제5,989,830호의 교차 이중-헤드(CODH) 디자인이, 미국 특허 제7,612,181호의 이원-Fv 입체구조에 대해 시사된 제한 없이, 양쪽 결합 부위가 반대 방향을 향하는 복합체를 수득할 것임을 예측하였다. 특히, 컴퓨터 모델링은, 가변 도메인 사이의 아미노산 링커의 길이가 CODH 디자인에 관해서는 중요하지 않지만, 이원-Fv 디자인에서 양쪽 항원 결합 부위에의 완전한 접근을 허용하기 위해서는 중요함을 나타냈다. DVD-Ig/TBTI 포맷에 관해서, 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 각 쌍의 폴리펩타이드들이, 교차 배향을 갖는 이원 가변 도메인들을 지닌, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질을 형성하기 위해, 불변 도메인이 CODH 입체구조에 부착된 항체-유사 결합 단백질 작제물(즉, CODH-Ig)을 제조하였다. CODH-Ig 분자는 CODH 분자와 비교하여 (이원-Fv 분자에 비해 개선된 안정성을 지니는 DVD-Ig/TBTI와 같이) 현저히 개선된 안정성을 지닐 것으로 예측된다.
상기 가설을 시험하기 위해서, 미국 특허 출원 공보 제US2010/0226923 A1호에 기재된 항-IL4 및 항-IL13 항체 서열을 이용하여 CODH-Ig 분자를 제조하였다. CODH-Ig 분자는 각각의 폴리펩타이드 쇄 상의 가변 도메인을 분리하는 아미노산 링커의 길이에 관해서 US2010/0226923의 CODH 분자와 상이하였다. CODH-Ig 분자는 일시적 형질감염에 따른 세포에서 발현되었고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 이들의 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 프로필은 5 내지 10%의 응집 수준을 나타내었고, 기능성인 CODH-Ig 분자는 없었고, 따라서, CODH-Ig 분자의 표적 항원 전부에 결합할 수 있는 CODH-Ig 분자도 없었다. 항원 결합 활성의 결여는 정확한 파라토프 형성을 손상시키는 비적합한 링커 길이로 인한 중쇄 및 경쇄의 Fv-영역의 교란된 이량체화로 인한 것일 수 있었다. 그 결과, 항체-유사 결합 단백질의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다에 대한 2개의 가변 도메인 및 제2 가변 도메인 및 불변 도메인 사이의 삽입에 적합한 아미노산 링커를 확인하기 위한 프로토콜이 개발되었다. 이러한 프로토콜은 단백질-단백질 도킹(docking)의 상동성 및 FvIL4 및 FvIL13 영역의 각각의 실험 모델(각 모델에서, Fc1 도메인 포함), 및 FvIL4와 FvIL13 영역 사이 및 Fv와 불변 Fc1 영역 사이의 적절한 링커의 작제에 기초하였다.
표준 재조합 DNA 방법을 이용하여, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 작제하고, 이들 폴리뉴클레오타이드를 재조합 발현 벡터에 포함시키고, 이러한 벡터를 숙주 세포에 도입한다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.)]을 참조한다. 제조업자의 규정에 따라, 당해 분야에 일반적으로 확립된 바와 같이, 또는 본원에 기재된 바와 같이, 효소 반응 및 정제 기술을 행할 수 있다. 특정 정의가 제공되지 않는 경우, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약제 화학의 실험실 절차 및 기술과 관련하여 사용된 명명법은 당해 분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 유사하게, 종래 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형, 전달, 및 환자의 치료에 사용될 수 있다.
1. 일반적 정의
본 공개에 따라 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 10개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산 중합체를 나타낸다. 소정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 두 뉴클레오타이드의 유형 중 어느 하나의 변형된 형태일 수 있다. 이러한 변형으로는 브롬유리딘과 같은 염기 변형, 아라비노사이드 및 2',3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오타이드간 연결 변형이 포함된다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 특히 단일-가닥 및 이중-가닥 형태의 DNA를 포함한다.
"분리된 폴리뉴클레오타이드"는 게놈, cDNA 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 소정 조합이고, 이의 기원에 의해, 분리된 폴리뉴클레오타이드는: (1) 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 결합되어 있지 않거나(여기서, 분리된 폴리뉴클레오타이드는 자연에서 발견된다), (2) 폴리뉴클레오타이드에 연결되거나(자연에서는 이에 연결되지 않는다), (3) 보다 큰 서열의 부분으로서 자연에서 발생하지 않는다.
"분리된 폴리펩타이드"는: (1) 일반적으로 발견될 수 있는 것과 다른 적어도 몇몇 다른 폴리펩타이드를 포함하지 않거나, (2) 동일한 공급원 유래, 예를 들면, 동일한 종 유래의 다른 폴리펩타이드를 근본적으로 포함하지 않거나, (3) 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 결합된 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물, 또는 기타 재료 중 약 50% 이상으로부터 분리되었거나, (5) 자연에서 "분리된 폴리펩타이드"가 결합되지 않는 폴리펩타이드의 부분과 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 결합하지 않거나, (6) 자연에서 결합되지 않는 폴리펩타이드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동적으로 결합되거나, (7) 자연에서 발생하지 않는 것이다. 이러한 분리된 폴리펩타이드는 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 기타 RNA, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 암호화될 수 있다. 바람직하게, 분리된 폴리펩타이드는 이의 사용(치료학적, 진단학적, 예방학적, 연구 또는 기타)를 방해할 수 있는 자연 환경에서 발견되는 폴리펩타이드 또는 기타 오염물질을 실질적으로 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "사람 항체"는 사람 배선 면역글로불린 서열에 실질적으로 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 소정 실시형태에서, 사람 항체는, 마우스 및 래트와 같은 설치류, 및 토끼와 같은 토끼류에 한정되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 비-사람 포유동물에서 생산된다. 다른 실시형태에서, 사람 항체는 하이브리도마 세포에서 생산된다. 또 다른 실시형태에서, 사람 항체는 재조합적으로 생성된다.
자연 발생 항체는 전형적으로 사량체를 포함한다. 이러한 각각의 사량체는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 이루어지고, 각각의 쌍은 하나의 전장 "경"쇄(전형적으로 약 25kDa의 분자량을 갖는다) 및 하나의 전장 "중"쇄(전형적으로 약 50 내지 70kDa의 분자량을 갖는다)를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "중쇄" 및 "경쇄"는 표적 항원에 대해 특이성을 부여하기에 충분한 가변 도메인 서열을 갖는 임의의 면역글로불린 폴리펩타이드를 말한다. 전형적으로, 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노-말단 부분은, 전형적으로 항원 인식에 대한 책임이 있는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 도메인을 포함한다. 전형적으로, 각각의 쇄의 카복시-말단 부분은 이펙터 기능에 대한 책임이 있는 불변 도메인을 규정한다. 따라서, 자연 발생 항체에서, 전장 중쇄 면역글로불린 폴리펩타이드는 1개의 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 포함하고, 여기서, VH 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 존재하고, CH3 도메인은 카복실-말단에 존재하며, 전장 경쇄 면역글로불린 폴리펩타이드는 1개의 가변 도메인(VL) 및 1개의 불변 도메인(CL)을 포함하고, 여기서, VL 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 존재하고, CL 도메인은 카복실-말단에 존재한다.
사람 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류되고, 사람 중쇄는 전형적으로, 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고 각각 항체의 이소타입을 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE와 같이 규정한다. IgG는, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4에 한정되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 몇몇의 서브클래스를 갖는다. IgM은 IgM1 및 IgM2에 한정되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 서브클래스를 갖는다. IgA는 IgA1 및 IgA2에 한정되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 서브클래스로 유사하게 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 도메인은, 전형적으로 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해, 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역도 포함하는 중쇄와 연결된다. 예를 들면, 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함되어 있는 문헌[FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989)]을 참조한다. 각각의 경/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다. 자연 발생 항체의 가변 도메인은 전형적으로 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고도 칭하는 3개의 고가변성 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 쇄 유래의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되고, 이는 특이적 에피토프에 결합할 수 있다. 아미노-말단 내지 카복실-말단에서, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "고유의 Fc"는 항체의 소화로부터 얻어지거나 다른 방법에 의해 생성되는 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자를 말하고, 단량체성 또는 다량체성 형태에 관계없이 힌지 영역을 함유할 수 있다. 고유의 Fc의 본래의 면역글로불린 공급원은 사람 기원인 것이 바람직하고, IgG1 및 IgG2인 것이 바람직하지만 면역글로불린들 중 임의의 하나일 수 있다. 고유의 Fc 분자는 공유(즉, 디설파이드 결합) 및 비-공유 결합에 의해 이량체성 또는 다량체성 형태에 연결될 수 있는 단량체성 폴리펩타이드로 이루어진다. 고유의 Fc 분자의 단량체성 서브유닛 사이의 분자간 디설파이드 결합의 수는 클래스(예를 들면, IgG, IgA, 및 IgE) 또는 서브클래스(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, 및 IgGA2)에 따라 1 내지 4의 범위이다. 고유의 Fc의 한 예로는 IgG의 파파인 소화로부터 얻어진 디설파이드-결합된 이량체가 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "고유의 Fc"는 단량체, 이량체, 및 다량체 형태의 총칭이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "Fc 변이체"는 고유의 Fc로부터 변형되지만 여전히 재생 수용체(salvage receptor), FcRn(신생아 Fc 수용체)에 대한 결합 부위를 포함하는 분자 또는 서열을 말한다. 예시 Fc 변이체, 및 재생 수용체와의 이들의 상호작용은 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-사람 고유의 Fc로부터 사람화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 고유의 Fc는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에 대해 요구되지 않는 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 하나 이상의 고유의 Fc 부위 또는 잔기가 결여되어 있거나 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함하고, 이는: (1) 디설파이드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 부적합성, (3) 선택된 숙주 세포에서의 발현에 따른 N-말단 이종성(heterogeneity), (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 재생 수용체 이외의 다른 Fc 수용체에의 결합, 또는 (7) 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 영향을 미치거나 이들에 관여한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "Fc 도메인"은 고유의 Fc 및 Fc 변이체 및 상기 정의된 바와 같은 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 고유의 Fc 분자에 관해서, 용어 "Fc 도메인"은 전체 항체로부터 소화되거나 다른 방법에 의해 생성되는지에 관계없이 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체-유사 결합 단백질"은 하나 이상의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 비-자연 발생(또는 재조합) 분자를 말하고, 이는 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 2개의 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
로 나타내어지는 구조를 갖고,
2개의 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 II:
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc
로 나타내어지는 구조를 갖고,
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체-유사 결합 단백질"은 하나 이상의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 비-자연 발생(또는 재조합) 분자를 말하고, 이는 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
로 나타내어지는 구조를 갖고,
제2 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 II:
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1
로 나타내어지는 구조를 갖고,
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 제1 폴리펩타이드와 상기 제2 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. "재조합" 분자는 재조합 방법에 의해 제조되거나 발현되거나 생성되거나 분리된 것이다.
본 발명의 한 실시형태는 1개 내지 4개의 표적 항원에 대해 생물학적 및 면역학적 특이성을 갖는 항체-유사 결합 단백질을 제공한다. 본 발명의 다른 실시형태는 이러한 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 다른 실시형태는 이러한 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시형태는 이러한 항체-유사 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 제공한다(즉, 이러한 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 핵산 분자 또는 벡터를 포함함).
본원에서 사용되는 바와 같은 "스와프 능력(swapability)"은 CODV 포맷 내에서 폴딩 및 최고 결합 친화성이 보유되는 가변 도메인의 상호 변화 능력을 말한다. "완전 스와프 능력"은 CODV-Ig 또는 CODV-Fab에서 결합 친화성의 보유에 의해 입증되는 바와 같이 항체-유사 결합 단백질의 완전 기능성을 유지하면서 VH1 및 VH2 도메인 둘 다의 순서를 스와핑하고, 따라서 VL1 및 VL2 도메인의 순서를 스와핑하는(즉, 순서를 반전시키는) 능력을 말한다. 또한, 특정 CODV-Ig 또는 CODV-Fab 내의 VH 및 VL 지정은 최종 포맷에서 특정 단백질 쇄에 대한 도메인의 위치만을 나타낸다는 것에 주의해야 한다. 예를 들면, VH1 및 VH2는 모 항체에서 VL1 및 VL2 도메인으로부터 유도되어 항체-유사 결합 단백질에서 VH1 및 VH2 위치에 배치될 수 있다. 유사하게, VL1 및 VL2는 모 항체에서 VH1 및 VH2 도메인으로부터 유도되어 항체-유사 결합 단백질에서 VH1 및 VH2 위치에 배치될 수 있다. 따라서, VH 및 VL 지정은 모 항체에서 본 발명의 위치를 말하고, 본래 위치는 아니다. 따라서, VH 및 VL 도메인은 "스와핑가능성"이다.
"분리된" 항체-유사 결합 단백질은 이의 자연 환경의 구성성분으로부터 식별되고 분리되고/분리되거나 회수된 것이다. 이의 자연 환경의 오염물질 구성성분은 항체-유사 결합 단백질에 대한 진단학적 또는 치료학적 용도를 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은: (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 항체의 95중량% 초과로, 가장 바람직하게는 99중량% 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석장치(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 실버 스테인을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하의 SDS-PAGE를 이용하여 동종성으로 정제될 것이다. 항체-유사 결합 단백질의 하나 이상의 구성성분의 자연 환경은 나타내어지지 않을 것이므로 분리된 항체-유사 결합 단백질은 재조합 세포 내의 제자리에 항체-유사 결합 단백질을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된"은 우세하게 나타나는(즉, 몰 기준으로 조성물에서 임의의 다른 별도의 종보다 더욱 풍부한) 종인 화합물 또는 종을 말한다. 소정 실시형태에서, 실질적으로 정제된 분획은 상기 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 약 50% 이상(몰 기준)을 포함하는 조성물이다. 다른 실시형태에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%를 초과하여 포함할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 종은 조성물이 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진 본질적으로 동종성이 되도록 정제된다(조성물에서 오염물질 종은 종래 검출 방법에 의해 검출될 수 없다).
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항원" 또는 "표적 항원"은, 항체-유사 결합 단백질에 의해 결합될 수 있고, 추가로 이 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 말한다. 표적 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 항체-유사 결합 단백질에 의해 인식되는 각각의 표적 항원에 관해서, 항체-유사 결합 단백질은 표적 항원을 인식하는 온전한 항체와 경쟁할 수 있다. "다중특이적" 또는 "다기능성" 항체-유사 결합 단백질 이외의 다른 "2가의" 항체-유사 결합 단백질도 동일한 항원 특이성을 갖는 항원 결합 부위를 포함하는 것으로 이해된다.
이특이적 또는 이기능성 항체는, 전형적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위 또는 에피토프를 갖는 인공적인 하이브리드 항체이다. 이특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 F(ab') 단편의 연결에 한정되는 것은 아니지만 이들을 포함하는 다양한 방법에 의해서 생성될 수 있다.
F(ab) 단편은 전형적으로 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인을 포함하고, 여기서, F(ab) 단편의 VH-CH1 중쇄 부분은 다른 중쇄 폴리펩타이드와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다. 본원에서 사용되는 바와 같이, F(ab) 단편은, 아미노산 링커에 의해 분리된 2개의 가변 도메인을 포함하는 하나의 경쇄 및 아미노산 링커 및 CH1 도메인에 의해 분리된 2개의 가변 도메인을 포함하는 하나의 중쇄도 포함할 수 있다.
F(ab') 단편은, 전형적으로 하나의 경쇄 및 불변 영역(CH1과 CH2 도메인 사이)을 포함하는 하나의 중쇄의 일부를 포함하여, 2개의 중쇄 사이에 쇄간 디설파이드 결합을 형성하여 F(ab')2 분자가 형성되도록 한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질과 관련하여 어구 "생물학적 성질", "생물학적 특성", 및 용어 "활성"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 에피토프 친화성 및 특이성, 항원 표적(또는 표적화된 폴리펩타이드)의 활성을 길항하는 능력, 항체-유사 결합 단백질의 생체내 안정성, 및 항체-유사 결합 단백질의 면역원성 성질에 한정되는 것은 아니지만 이들을 포함한다. 항체-유사 결합 단백질의 다른 확인가능한 생물학적 성질 또는 특성은 예를 들면, 교차-반응성(즉, 일반적으로, 항원 표적의 비-사람 동족체와의 또는 다른 항원 표적 또는 조직과의 교차 반응성), 및 포유동물 세포에서의 단백질의 높은 발현 수준을 보존하는 능력이 포함된다. 상술의 성질 또는 특성은, ELISA, 경쟁 ELISA, 표면 플라스몬 공명 분석, 시험관내 및 생체내 중화 검정, 및 필요에 따라 사람, 영장류, 또는 임의의 다른 공급원을 포함한 상이한 공급원 유래의 조직 절편을 이용한 면역조직화학에 한정되는 것은 아니지만 이들을 포함한 당해 분야-인지된 기술을 이용하여 관찰되거나 측정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "면역학적 기능성 면역글로불린 단편"은 적어도 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 CDR을 포함하는 폴리펩타이드 단편을 말하고, 상기 CDR로부터 폴리펩타이드 단편이 유도되었다. 면역학적 기능성 면역글로불린 단편은 표적 항원에 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "중화" 항체-유사 결합 단백질은, 이것이 결합하는 표적 항원의 이펙터 기능을 차단하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 분자를 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 감소시킨다"는 표적 항원의 이펙터 기능의 약 60% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 85% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 감소를 의미한다.
용어 "에피토프"는 임의의 결정인자, 바람직하게는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 소정 실시형태에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑(grouping)을 포함하고, 소정 실시형태에서는 특이적 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체 또는 항체-유사 결합 단백질에 의해 결합된 항원의 영역이다. 소정 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은, 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인식하는 경우, 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 바람직한 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은, 평형 해리 상수가 ≤10-8인 경우, 보다 바람직하게는 평형 해리 상수가 ≤10-9인 경우, 및 가장 바람직하게는 해리 상수가 ≤10-10인 경우, 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
항체-유사 결합 단백질의 해리 상수(KD)는 예를 들면, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로, 표면 플라스몬 공명 분석은 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ)을 이용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 리간드(바이오센서 매트릭스 상의 표적 항원)와 분석물(용액 중의 항체-유사 결합 단백질) 사이의 실시간 결합 상호작용을 측정한다. 또한, 표면 플라스몬 분석은 분석물(바이오센서 매트릭스 상의 항체-유사 결합 단백질)을 고정화시켜 리간드(표적 항원)를 제시함으로써도 행할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "KD"는 특정 항체-유사 결합 단백질과 표적 항원 사이의 상호작용의 해리 상수를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "특이적으로 결합한다"는, 적어도 약 1×10-6M, 약 1×10-7M, 약 1×10-8M, 약 1×10-9M, 약 1×10-10M, 약 1×10-11M, 약 1×10-12M, 또는 그 이상의 Kd를 갖는 에피토프를 포함하는 항원에 결합하고/하거나 비특이적 항원에 대한 친화성보다 적어도 2배 큰 친화성을 갖는 에피토프에 결합하는, 항체-유사 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편의 능력을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "링커"는 경쇄 및 중쇄의 도메인에 충분한 이동성을 제공하여 교차 이원 가변 영역 면역글로불린으로 폴딩하기 위해 면역글로불린 도메인 사이에 삽입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 말한다. 링커는 서열 수준에서 각각 가변 도메인들 사이에서의 또는 가변 도메인과 불변 도메인 사이에서의 전이(transition)시에 삽입된다. 근사한 크기의 면역글로불린 도메인들이 잘 이해되므로 도메인들 사이의 전이가 확인될 수 있다. 도메인 전이의 정확한 위치는, 실험적 데이터에 의해 입증되는 바와 같이 또는 모델링 기술 또는 2차 구조 예측에 의해 추정될 수 있는 바와 같이, 베타-시트 또는 알파-헬릭스와 같은 2차 구조적 요소를 형성하지 않는 펩타이드 스트레치(stretch)의 위치를 결정함으로써 측정될 수 있다. 본원에 기재된 링커는 N-말단 VL1과 VL2 도메인 사이의 경쇄 상에 위치하는 L1; 및 VL2와 또한 경쇄 상에 존재하고 C-말단 CL 도메인 사이에 위치하는 L2로서 나타낸다. 중쇄 링커는 N-말단 VH2와 VH1 도메인 사이에 위치하는 L3; 및 VH1과 CH1-Fc 도메인 사이에 위치하는 L4로서 공지되어 있다. 링커 L1, L2, L3, 및 L4는 독립적이지만, 이들은 몇몇의 경우에 동일한 서열 및/또는 길이를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터"는 암호화 정보를 숙주 세포에 전이시키기 위해 사용되는 임의의 분자(예를 들면, 핵산, 플라스미드, 또는 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 벡터가 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 삽입될 수 있는 환형 이중-가닥 DNA 분자를 나타내는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈에 삽입될 수 있는 바이러스 벡터이다. 소정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포(예를 들면, 세균 기원의 복제를 갖는 세균성 벡터 및 에피솜성 포유동물 벡터) 내에서 자가 복제할 수 있다. 다른 벡터(예를 들면, 비-에피솜성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 마찬가지로 복제된다. 추가로, 소정 벡터는 이들이 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간략하게 "발현 벡터")로서 나타낸다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 이용하는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 플라스미드는 가장 흔히 사용되는 형태의 벡터이므로, 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "작동적으로 연결된"은 본원에서 플랭킹 서열(flanking sequence)의 배열을 나타내는 것으로 사용되고, 여기서, 기재된 바와 같은 플랭킹 서열은 이들의 일반적인 기능을 행하기 위해 구성되거나 조립된다. 따라서, 암호화 서열에 작동적으로 연결된 플랭킹 서열은 암호화 서열의 복제, 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수도 있다. 예를 들면, 암호화 서열은, 프로모터가 상기 암호화 서열의 전사를 지시할 수 있는 경우에 프로모터에 작동적으로 연결된다. 플랭킹 서열은 정확하게 기능하는 한 암호화 서열과 인접할 필요가 없다. 따라서, 예를 들면, 비번역된 전사 서열에 개입하는 것은 프로모터 서열과 암호화 서열 사이에 나타날 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 암호화 서열에 "작동적으로 연결된" 것으로 여겨질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 어구 "재조합 숙주 세포"(또는 "숙주 세포")는, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 재조합 숙주 세포 또는 숙주 세포는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 나타내는 것으로 의도된다. 돌연변이 또는 환경적 영향 중 어느 하나로 인하여 계대(succeeding generation)시에 소정 변형이 발생할 수 있으므로, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 이러한 세포는 여전히 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 발현시키기 위해 세균, 효모, 배큘로바이러스, 및 포유동물 발현 시스템(및 파지 디스플레이 발현 시스템)을 포함한 매우 다양한 숙주 세포 발현 시스템을 사용할 수 있다. 적합한 세균 발현 벡터의 예로는 pUC19가 있다. 항체-유사 결합 단백질을 재조합적으로 발현시키기 위해서, 항체-유사 결합 단백질의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 DNA 단편을 갖는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시켜, 폴리펩타이드 쇄가 숙주 세포 내에서 발현되고, 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배지에 분비되어, 이 배지로부터 항체-유사 결합 단백질을 회수할 수 있도록 한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "형질전환"은 세포의 유전적 특성의 변화를 말하고, 새로운 DNA를 포함하도록 변형된 경우의 세포는 형질전환된 것이다. 예를 들면, 세포의 본래 상태로부터 유전적으로 변형된 경우의 세포는 형질전환된 것이다. 형질전환에 따르면, 형질전환 DNA는 세포의 염색체로 물리적으로 통합함으로써 세포의 염색체와 재조합될 수 있거나, 또는 복제되지 않고 에피솜성 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 세포는, DNA가 세포의 분할과 함께 복제되는 경우에 안정하게 형질전환된 것으로 여겨진다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "형질감염"은 세포에 의한 이질성 또는 외인성 DNA의 흡수(uptake)를 말하고, 외인성 DNA가 세포 멤브레인 내부에 도입된 경우의 세포는 "형질감염"된 것이다. 다수의 형질감염 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 기술을 이용하여 하나 이상의 외인성 DNA 분자를 적합한 숙주 세포에 도입할 수 있다.
본원에서 사용되어 목표물에 적용되는 바와 같은 용어 "자연 발생"은 목표물이 자연에서 발견될 수 있고 사람에 의해 조작되지 않았다는 사실을 나타낸다. 예를 들면, 자연에서 공급원으로부터 분리될 수 있고 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 자연-발생이다. 유사하게, 본원에서 사용되는 바와 같은 "비-자연 발생"은 자연에서 발견되지 않는 목표물 또는 사람에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 목표물을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 20개의 종래 아미노산 및 이들의 약어는 종래 사용법에 따른다. 또한, 20개의 종래 아미노산의 입체이성체(예를 들면, D-아미노산); α-, α-이치환된 아미노산과 같은 비자연 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 기타 비종래 아미노산도 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 폴리펩타이드 쇄에 적합한 구성성분일 수 있다. 비종래 아미노산의 예로는 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들면, 4-하이드록시프롤린)이 포함된다. 본원에서 사용되는 폴리펩타이드 표기에서, 표준 사용 및 관례에 따라 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카복실-말단 방향이다.
자연 발생 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 기초하여 클래스들로 세분될 수 있다:
(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
(2) 극성 친수성: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;
(3) 지방족: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
(4) 지방족 소수성: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
(5) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(6) 산성: Asp, Glu;
(7) 염기성: His, Lys, Arg;
(8) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(9) 방향족: His, Trp, Tyr, Phe; 및
(10) 방향족 소수성: Phe, Trp, Tyr.
보존적 아미노산 치환은 이들 클래스들 중 하나의 구성원의 동일한 클래스의 다른 구성원과의 교환에 관련될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 이는 전형적으로 생물학적 시스템에서의 합성에 의해서보다는 화학적 펩타이드 합성에 의해 포함된다. 이들로는 펩타이드모방체(peptidomimetic) 및 기타 반전(reversed)되거나 역전(inverted)된 형태의 아미노산 잔기가 포함된다. 비-보존적 치환은 이들 클래스들 중 하나의 구성원의 다른 클래스 유래의 구성원과의 교환에 관련될 수 있다.
당해 분야 숙련가는 잘-공지되어 있는 기술을 이용하여 본 발명의 항체-유사 결합 단백질의 폴리펩타이드 쇄의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 당해 분야의 숙련가는 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 영역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않으면서 변화시킬 수 있는 폴리펩타이드 쇄의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 대안으로, 당해 분야 숙련가는 유사한 폴리펩타이들 사이에서 보존되는 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 추가로, 생물학적 활성에 대해 또는 구조에 대해 중요할 수 있는 영역조차도 생물학적 활성을 파괴하지 않으면서 또는 폴리펩타이드 구조에 악영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환이 행해질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "환자"는 사람 및 동물 대상체를 포함한다.
"장애"는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질을 이용한 치료가 이로울 수 있는 임의의 병태이다. "장애" 및 "병태"는 본원에서 상호교화적으로 사용되고, 환자가 의심스러운 장애에 취약하도록 하는 병리학적 병태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 치료학적 처치 및 예방학적 또는 방지성 측정 둘 다를 나타낸다. 치료를 필요로 하는 환자로는 장애를 갖는 환자뿐만 아니라 장애를 갖기 쉬운 환자 또는 장애를 방지하기 위한 환자가 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적 조성물" 또는 "치료학적 조성물"은 환자에게 적절하게 투여되는 경우 바람직한 치료학적 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "생리학적으로 허용되는 담체"는 항체-유사 결합 단백질의 전달을 달성하거나 향상시키기에 적합한 하나 이상의 제형 물질을 말한다.
하나 이상의 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"은 바람직한 치료학적 결과를 생산하기에 충분한 양 또는 용량을 말한다. 보다 구체적으로, 치료학적 유효량은 소정 기간 동안 치료되는 병태와 관련된 하나 이상의 임상학적으로 정의된 병리학적 프로세스를 억제하기에 충분한 항체-유사 결합 단백질의 양이다. 유효량은 사용되는 특이적 항체-유사 결합 단백질에 따라 다양할 수 있고, 또한, 치료되는 환자와 관련된 다양한 인자 및 병태 그리고 장애의 중증도에 의존한다. 예를 들면, 항체-유사 결합 단백질이 생체내 투여하기 위한 것인 경우, 환자의 연령, 체중, 및 건강뿐만 아니라 임상전 동물 작업에서 수득된 용량 반응 곡선 및 독성 데이터와 같은 인자들도 이들 인자들 사이에 존재하는 것으로 생각될 수 있다. 주어진 약제학적 조성물의 유효량 또는 치료학적 유효량의 측정은 당해 분야 숙련가의 능력 내이다.
본 발명의 한 실시형태는 약제학적으로 허용되는 담체 및 치료학적 유효량의 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
2. 항체-유사 결합 단백질
본 발명의 한 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 2개의 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
로 나타내어지는 구조를 갖고,
2개의 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 II:
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc
로 나타내어지는 구조를 갖고,
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 I:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
로 나타내어지는 구조를 갖고,
제2 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 II:
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1
로 나타내어지는 구조를 갖고,
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 제1 폴리펩타이드와 상기 제2 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 예를 들면, 사람, 뮤린, 또는 사람화된 항체를 포함한 임의의 사람 또는 비-사람 항체로부터 수득되거나 유도된 도메인 또는 서열을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 몇몇의 항체-유사 결합 단백질에서, L3 길이는 L1 길이의 2배 이상이다. 본 발명의 다른 항체-유사 결합 단백질에서, L4 길이는 L2 길이의 2배 이상이다. 본 발명의 몇몇의 항체-유사 결합 단백질에서, L1 길이는 L3 길이의 2배 이상이다. 본 발명의 다른 항체-유사 결합 단백질에서, L2 길이는 L4 길이의 2배 이상이다.
본 발명의 몇몇의 항체-유사 결합 단백질에서, L1은 3 내지 12개의 아미노산 잔기 길이이고, L2는 3 내지 14개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 1 내지 8개의 아미노산 잔기 길이이고, L4는 1 내지 3개의 아미노산 잔기 길이이다. 다른 항체-유사 결합 단백질에서, L1은 5 내지 10개의 아미노산 잔기 길이이고, L2는 5 내지 8개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 1 내지 5개의 아미노산 잔기 길이이고, L4는 1 내지 2개의 아미노산 잔기 길이이다. 바람직한 항체-유사 결합 단백질에서, L1은 7개의 아미노산 잔기 길이이고, L2는 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 1개의 아미노산 잔기 길이이고, L4는 2개의 아미노산 잔기 길이이다.
본 발명의 몇몇의 항체-유사 결합 단백질에서, L1은 1 내지 3개의 아미노산 잔기 길이이고, L2는 1 내지 4개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 2 내지 15개의 아미노산 잔기 길이이고, L4는 2 내지 15개의 아미노산 잔기 길이이다. 다른 항체-유사 결합 단백질에서, L1은 1 내지 2개의 아미노산 잔기 길이이고, L2는 1 내지 2개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 4 내지 12개의 아미노산 잔기 길이이고, L4는 2 내지 12개의 아미노산 잔기 길이이다. 바람직한 항체-유사 결합 단백질에서, L1은 1개의 아미노산 잔기 길이이고, L2는 2개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 7개의 아미노산 잔기 길이이고, L4는 5개의 아미노산 잔기 길이이다.
본 발명의 몇몇의 항체-유사 결합 단백질에서, L1, L3, 또는 L4는 0과 동일할 수 있다. 그러나, L1, L3 또는 L4가 0과 동일한 항체-유사 결합 단백질에서, 가변 영역과 불변 영역 사이의 또는 다른 쇄 상의 이원 가변 도메인들 사이의 상응하는 전이 링커는 0일 수 없다. 소정 실시형태에서, L1이 0과 동일하고 L3은 2개 이상의 아미노산 잔기이거나, L3이 0과 동일하고 L1은 1개 이상의 아미노산 잔기와 동일하거나, 또는 L4가 0과 동일하고 L2는 3개 이상의 아미노산 잔기이다.
본 발명의 소정 항체-유사 결합 단백질에서, L1, L2, L3 및 L4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커 중 적어도 하나는 1개 이상의 시스테인 잔기를 포함한다.
적합한 링커의 예로는 단일 글리신(Gly) 잔기; 디글리신 펩타이드(Gly-Gly); 트리펩타이드(Gly-Gly-Gly); 4개의 글리신 잔기를 갖는 펩타이드(Gly-Gly-Gly-Gly; 서열번호 25); 5개의 글리신 잔기를 갖는 펩타이드(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; 서열번호 26); 6개의 글리신 잔기를 갖는 펩타이드(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; 서열번호 27); 7개의 글리신 잔기를 갖는 펩타이드(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; 서열번호 28); 8개의 글리신 잔기를 갖는 펩타이드(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; 서열번호 29)가 포함된다. 펩타이드 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 30) 및 펩타이드 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 31)과 같은 다른 조합의 아미노산 잔기들이 사용될 수 있다. 다른 적합한 링커로는 단일 Ser, 및 Val 잔기; 디펩타이드 Arg-Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, 및 Ser-Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(서열번호 52), Thr-Val-Ala-Ala-Pro(서열번호 53), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(서열번호 54), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(서열번호 55), Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(서열번호 48), Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(서열번호 49), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(서열번호 50), 및 His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(서열번호 51)이 포함된다. 상기 열거된 예는 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하고자 의도된 것은 아니고, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 및 프롤린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 무작위로 선택된 아미노산을 포함하는 링커가 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에 적합한 것으로 밝혀졌다(실시예 12 참조).
링커 내의 아미노산 잔기의 동일성 및 서열은 링커 내에서 달성하기 위해 필요한 2차 구조적 요소의 유형에 따라 다양할 수 있다. 예를 들면, 글리신, 세린 및 알라닌은 최대 유연성을 갖는 링커에 대해 가장 우수하다. 글리신, 프롤린, 트레오닌 및 세린의 소정 조합은, 보다 경연성(rigid)이고 연장된 링커가 필요한 경우에 유용하다. 임의의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기와 조합하여 링커로서 간주하여 목적하는 특성에 의존하여 필요에 따라 보다 큰 펩타이드 링커를 작제할 수 있다.
본 발명의 소정 항체-유사 결합 단백질에서, VL1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고; VL2는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하며; VH1은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고; VH2는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 소정 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 하나 이상의 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 B7.1, B7.2, BAFF, BlyS, C3, C5, CCL11(에오탁신), CCL15(MIP-1d), CCL17(TARC), CCL19(MIP-3b), CCL2(MCP-1), CCL20(MIP-3a), CCL21(MIP-2), SLC, CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL25(TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL3(MIP-1a), CCL4(MIP-1b), CCL5(RANTES), CCL7(MCP-3), CCL8(mcp-2), CD3, CD19, CD20, CD24, CD40, CD40L, CD80, CD86, CDH1(E-카데린), 키티나제, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(GCSF), CTLA4, CX3CL1(SCYD1), CXCL12(SDF1), CXCL13, EGFR, FCER1A, FCER2, HER2, IGF1R, IL-1, IL-12, IL13, IL15, IL17, IL18, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1β, IL2, IL4, IL6, IL7, IL8, IL9, IL12/23, IL22, IL23, IL25, IL27, IL35, ITGB4(b 4 인테그린), LEP(렙틴), MHC 클래스 II, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TNF-a, TNFSF4(OX40 리간드), TNFSF5(CD40 리간드), Toll-유사 수용체, TREM1, TSLP, TWEAK, XCR1(GPR5/CCXCR1), DNGR-1(CLEC91), 및 HMGB1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 하나 이상의 항원 표적의 기능을 억제할 수 있다.
본 발명의 소정 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 이특이적이고 2개의 상이한 항원 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 이특이적이고, 각각의 경쇄-중쇄 쌍은 2개의 상이한 표적 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 보다 바람직한 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은, IL4와 IL13, IGF1R과 HER2, IGF1R과 EGFR, EGFR과 HER2, BK와 IL13, PDL-1과 CTLA-4, CTLA4와 MHC 클래스 II, IL-12와 IL-18, IL-1α와 IL-1β, TNFα와 IL12/23, TNFα와 IL-12p40, TNFα와 IL-1β, TNFα와 IL-23, 및 IL17과 IL23으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개의 상이한 항원 표적에 결합할 수 있다. 더욱 더 바람직한 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 항원 표적 IL4와 IL13에 결합할 수 있다.
본 발명의 소정 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 2.97 E+07의 온-레이트 및 3.30 E-04의 오프-레이트로 IL4에 특이적으로 결합하고, 1.39 E+06의 온-레이트 및 1.63 E-04의 오프-레이트로 IL13에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 3.16 E+07의 온-레이트 및 2.89 E-04의 오프-레이트로 IL4에 특이적으로 결합하고, 1.20 E+06의 온-레이트 및 1.12 E-04의 오프-레이트로 IL13에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질은, 각각 VL 및 VH를 포함하는, 제1 표적 항원에 결합하는 제1 항체 가변 도메인 및 제2 표적 항원에 결합하는 제2 항체 가변 도메인을 식별하고; 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나를 템플레이트 쇄로서 지정하고; 상기 제1 항체 가변 도메인 또는 상기 제2 항체 가변 도메인의 VL을 VL1로서 지정하고; 하기 화학식 I 및 화학식 II:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc
에 따라 VL2, VH1, 및 VH2를 지정하고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4에 대해 최대 및 최소 길이를 측정하고; 상기 화학식 I 및 화학식 II의 폴리펩타이드 구조들을 생성하고; 결합시에 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 제1 표적 항원 및 제2 표적 항원에 결합하는 화학식 I 및 화학식 II의 폴리펩타이드 구조들을 선택함으로써 제조되고;
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질은, 각각 VL 및 VH를 포함하는, 제1 표적 항원에 결합하는 제1 항체 가변 도메인 및 제2 표적 항원에 결합하는 제2 항체 가변 도메인을 식별하고; 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나를 템플레이트 쇄로서 지정하고; 상기 제1 항체 가변 도메인 또는 상기 제2 항체 가변 도메인의 VL을 VL1로서 지정하고; 하기 화학식 I 및 화학식 II:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1
에 따라 VL2, VH1, 및 VH2를 지정하고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4에 대해 최대 및 최소 길이를 측정하고; 상기 화학식 I 및 화학식 II의 폴리펩타이드 구조들을 생성하고; 결합시에 항체-유사 결합 단백질을 형성하는 제1 표적 항원 및 제2 표적 항원에 결합하는 화학식 I 및 화학식 II의 폴리펩타이드 구조들을 선택함으로써 제조되고;
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 제1 항체 가변 도메인 및 제2 항체 가변 도메인이 동일한 항체-유사 결합 단백질이 제조된다.
본 발명의 한 실시형태는, 세포에서
하기 화학식 I 및 화학식 II:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc
로 나타내어지는 구조를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함하고,
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하는, 항체-유사 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시형태는, 세포에서 하기 화학식 I 및 화학식 II:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1
로 나타내어지는 구조를 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함하고,
여기서:
상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이고;
여기서, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하는, 항체-유사 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
3. 항체-유사 결합 단백질의 용도
본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 하나 이상의 표적 항원의 검출 및 정량을 위한 임의의 공지의 검정 방법, 예를 들면, 경쟁 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에 사용할 수 있다. 항체-유사 결합 단백질은 사용되는 검정 방법에 적절한 친화성으로 하나 이상의 표적 항원에 결합할 것이다.
진단학적 적용을 위해, 소정 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질은 검출가능한 모이어티로 표지화될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성시킬 수 있는 임의의 것일 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 모이어티는 방사성동위원소, 예를 들면, 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In, 또는 67Ga; 형광성 또는 화학발광성 화합물, 예를 들면, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린; 또는 효소, 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 서양 고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다.
또한, 본 발명의 항체-유사 결합 단백질은 생체내 영상화에도 유용하다. 검출가능한 모이어티로 표지화된 항체-유사 결합 단백질은 동물에게, 바람직하게는 혈류로 투여되어 숙주에서의 표지화된 항체의 존재 및 위치를 검정할 수 있다. 항체-유사 결합 단백질은 핵 자기 공명법, 방사선법 또는 당해 분야에 공지되어 있는 기타 검출 방법에 의해 동물에서 검출가능한 임의의 모이어티로 표지화될 수 있다.
또한, 본 발명은 항체-유사 결합 단백질 및 생물학적 샘플 중의 표적 항원 수준을 검출하기 위해 유용한 기타 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 이러한 시약은 검출가능한 표지, 차단 혈청, 양성 및 음성 대조군 샘플, 및 검출 시약을 포함할 수 있다.
4. 항체-유사 결합 단백질 치료 조성물 및 이의 투여
항체-유사 결합 단백질을 포함하는 치료학적 또는 약제학적 조성물은 본 발명의 범위 내이다. 이러한 치료학적 또는 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 항체-유사 결합 단백질, 또는 항체-유사 결합 단백질-약물 접합체를, 투여 방식이 적합하게 선택된 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 제형 제제와의 혼합물로 포함할 수 있다.
허용가능한 제형 물질은 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에게 비독성인 것이 바람직하다.
약제학적 조성물은, 예를 들면, pH, 삼투압농도, 점도, 투명도, 색, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 해리 또는 방출 속도, 흡착, 또는 조성물의 침투를 변형시키거나 유지하거나 보존하기 위한 제형 물질을 포함할 수 있다. 적합한 제형 물질로는 아미노산(예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신), 항미생물제, 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 설파이트 나트륨, 또는 수소-설파이트 나트륨), 완충액(보레이트, 바이카보네이트, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트, 또는 기타 유기산), 벌크제(예를 들면, 만니톨 또는 글리신), 킬레이트제(예를 들면, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 착화제(예를 들면, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린, 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린), 충전재, 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 기타 탄수화물(예를 들면, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린), 단백질(예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린), 착색제, 착향료 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예를 들면, 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩타이드, 염-형성 상대이온(counterion)(예를 들면, 나트륨), 보존제(예를 들면, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소), 용매(예를 들면, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜(예를 들면, 만니톨 또는 소르비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제(예를 들면, 플루로닉; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 폴리소르베이트; 트리톤, 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 티록사팔), 안정성 개선제(예를 들면, 슈크로스 또는 소르비톨), 등장성 개선제(예를 들면, 알칼리 금속 할라이드 - 바람직하게는 나트륨 또는 칼륨 클로라이드 - 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약제학적 보조제(예를 들면, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) 및 이의 후속판 참조, 임의의 목적을 위해 참조로 본원에 포함)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
최적 약제학적 조성물은 예를 들면, 의도된 투여 경로, 전달 포맷, 및 목적하는 용량에 따라 당해 분야 숙련가에 의해 결정될 것이다. 이러한 조성물은 항체-유사 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다.
약제학적 조성물 중의 1차 비히클 또는 담체는 자연에서 수성 또는 비-수성으로 존재할 수 있다. 예를 들면, 주사에 적합한 비히클 또는 담체는 물, 생리학적 염수 용액, 또는 인공적 뇌척수액일 수 있고, 가능하게는 비경구 투여를 위해 조성물 중에 흔한 기타 물질로 보충될 수 있다. 중성 완충된 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수는 추가의 예시 비히클이다. 다른 예시 약제학적 조성물은 약 pH 7.0 내지 8.5의 Tris 완충액, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충액을 포함하고, 이는 추가로 소르비톨 또는 적합한 치환체를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, 항체-유사 결합 단백질 조성물은, 저장을 위해, 목적하는 정도의 순도를 갖는 선택된 조성물과 최적 제형 제제를 동결건조된 케이크 또는 수용액 형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 추가로, 항체-유사 결합 단백질은 슈크로스와 같은 적절한 부형제를 이용한 동결건조물(lyophilizate)로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 대안으로, 경구 전달과 같이 소화관을 통한 전달 또는 흡입을 위한 조성물이 선택될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 조성물의 제제는 당해 분야의 기술 범위 내이다.
제형 구성성분은 투여 부위에 허용가능한 농도로 존재한다. 예를 들면, 당해 조성물을 생리학적 pH로, 또는 약간 낮은 pH로, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 유지하기 위해 완충액을 사용한다.
비경구 투여가 고려되는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 치료학적 조성물은, 약제학적으로 허용되는 비히클에 목적하는 항체-유사 결합 단백질을 포함하는, 발연원-불포함의, 비경구적으로 허용가능한, 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은, 항체-유사 결합 단백질이 적절하게 보존된 멸균 등장성 용액으로서 제형화된 멸균 증류수이다. 또 다른 제제는, 목적하는 분자와, 생성물의 방출을 제어하거나 지연시키기 위해 제공되는 제제, 예를 들면, 주사가능한 마이크로스피어(microsphere), 바이오-에로더블 입자(bio-erodible particle), 중합체성 화합물(폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드, 또는 리포솜의 제형을 포함할 수 있고, 이는 이어서 데포 주사(depot injection)를 통해 전달될 수 있다. 또한, 하이알루론산도 사용할 수 있으며, 이는 순환시 지속 기간을 향상시키는 효과를 가질 수 있다. 목적하는 분자의 도입을 위한 다른 적합한 방법으로는 이식가능한 약물 전달 장치가 포함된다.
한 실시형태에서, 흡입용 약제학적 조성물이 제형화될 수 있다. 예를 들면, 항체-유사 결합 단백질은 흡입용 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 단백질 흡입 용액은 에어로졸 전달을 위한 추진제(propellant)를 이용하여 제형화될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 용액은 분무될 수 있다.
또한, 소정 제형은 경구 투여될 수 있음이 고려된다. 본 발명의 한 실시형태에서, 이러한 방식으로 투여되는 항체-유사 결합 단백질은 정제 및 캡슐과 같은 단일 용량 형태의 조제(compounding)로 관행적으로 사용되는 담체의 존재 또는 부재 하에 제형화될 수 있다. 예를 들면, 캡슐은 생체 이용률이 최대화되고 사전-시스템(pre-systemic) 열화가 최소화될 때 그 시점에 위장관에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 고안될 수 있다. 항체-유사 결합 단백질의 흡수를 촉진하기 위한 추가의 제제가 포함될 수 있다. 또한, 희석제, 착향료, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제, 및 바인더도 사용할 수 있다.
다른 약제학적 조성물은 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물 중에 유효량의 항체-유사 결합 단백질을 포함할 수 있다. 멸균수, 또는 다른 적절한 비히클에 정제를 용해시킴으로써, 용액을 단일-용량 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 비활성 희석제, 예를 들면, 칼슘 카보네이트, 나트륨 카보네이트 또는 바이카보네이트, 락토스, 또는 칼슘 포스페이트; 또는 결합제, 예를 들면, 전분, 젤라틴, 또는 아카시아(acacia); 또는 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
지연된-전달 또는 제어된-전달 제형으로 항체-유사 결합 단백질을 포함하는 제형을 포함한 본 발명의 추가의 약제학적 조성물은 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다. 다양한 기타 지연된- 또는 제어된-전달 수단을 제형화하기 위한 기술, 예를 들면, 리포솜 담체, 바이오-에로더블 미립자 또는 다공성 비드 및 데포 주사도 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다. 지연된-방출 제제의 추가의 예로는 성형품 형태(예를 들면, 필름 또는 미세캡슐)로의 반투과성 중합체 매트릭스가 포함된다. 지연된 방출 매트릭스로는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락티드, L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산이 포함될 수 있다. 또한, 지연된-방출 조성물은 당해 분야에 공지되어 있는 몇몇 방법 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 이러한 방법을 이용한 멸균은 동결건조 및 재구성 이전에 또는 그 이후에 행할 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조 형태로 또는 용액으로 저장될 수 있다. 추가로, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 억세스 포트(sterile access port)를 갖는 용기, 예를 들면, 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 니들에 의해 뚫을 수 있는 스톱퍼(stopper)를 갖는 바이알에 넣는다.
일단 약제학적 조성물을 제형화하면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서, 또는 탈수화되거나 동결건조된 분말로서 멸균 바이알 내에 저장할 수 있다. 이러한 제형은 레디-투-유즈(ready-to-use) 형태로 또는 투여 이전에 재구성을 요구하는 형태(예를 들면, 동결건조된 형태)로 저장될 수 있다.
본 발명은 또한 단일-용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트를 포함한다. 당해 키트는 각각 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기 둘 다를 함유한다. 또한, 단일 및 다중-챔버의 사전-충전된 시린지(예를 들면, 액체 시린지 및 동결건조 시린지)를 포함하는 키트도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
치료학적으로 사용되는 항체-유사 결합 단백질 약제학적 조성물의 유효량은 예를 들면, 치료학적 맥락 및 목표에 의존할 것이다. 당해 분야 숙련가는, 치료를 위한 적절한 용량 수준이 부분적으로, 전달되는 분자, 항체-유사 결합 단백질이 사용되는 지표, 투여 경로, 및 크기(체중, 신체 표면, 또는 기관의 크기) 및 환자의 상태(연령 및 일반적 건강)에 따라 다양할 것임을 이해할 것이다. 따라서, 임상의는 최적을 치료학적 효과를 수득하기 위해 용량을 적정하고 투여 경로를 변형시킬 수 있다. 전형적인 용량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 0.1㎍/kg으로부터 약 100mg/kg까지 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 다른 실시형태에서, 용량은 0.1㎍/kg 내지 약 100mg/kg; 또는 1㎍/kg 내지 약 100mg/kg; 또는 5㎍/kg, 10㎍/kg, 15㎍/kg, 20㎍/kg, 25㎍/kg, 30㎍/kg, 35㎍/kg, 40㎍/kg, 45㎍/kg, 50㎍/kg, 55㎍/kg, 60㎍/kg, 65㎍/kg, 70㎍/kg, 75㎍/kg, 내지 약 100mg/kg의 범위일 수 있다.
투약 빈도는 사용되는 제형에서의 항체-유사 결합 단백질의 약동학적 파라미터에 의존할 것이다. 전형적으로, 임상의는 목적하는 효과를 달성하는 용량에 이를 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로서, 경시에 따라 2회 이상의 용량(이는 동일한 양의 목적하는 분자를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 용량의 추가의 개선은 당해 분야 숙련가에 의해 일상적으로 이루어지고, 이는 이들에 의해 일상적으로 행해지는 일의 영역 내이다. 적절한 용량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인될 수 있다.
약제학적 조성물의 투여 경로는 공지의 방법에 따라, 예를 들면, 경구 경로; 정맥내, 복막내, 대뇌내(뇌실질내), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 포털내(intraportal) 또는 병변내 경로에 의한 주사를 통한 경로; 지연된 방출 시스템에 의한 경로; 또는 이식 장치에 의한 경로이다. 요구되는 경우, 조성물은 볼루스 주사 또는 주입에 의해 연속적으로, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 조성물은 바람직한 분자가 흡수되거나 캡슐화된 멤브레인, 스폰지, 또는 기타 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 당해 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관에 이식될 수 있고, 목적하는 분자의 전달은 확산, 지연된-방출 볼루스, 또는 연속적 투여를 통해 이루어질 수 있다.
5. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시형태의 예시, 및 이의 각종 용도이다. 이들은 단지 설명 목적을 위해 나타내는 것이고, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 구성되지 않아야 한다.
실시예 1. 이특이적 교차 이원 가변 영역 항체-유사 결합 단백질의 고안 및 조작
Fv 포맷에서의 교차 이원 가변 영역은 미국 특허 제5,989,830호에 기술되었고, 교차 이중 헤드(CODH) 입체구조로서 나타냈다. 교차 이중-헤드(CODH) 디자인이 반대측 방향을 향하는 양측 결합 부위와의 복합체를 초래하는 것으로 예측되는 분자 모델링은 제한 없이 이원-Fv 입체 구조를 제안하였다. CODH Fv 포맷은, 경쇄에 대해 CL 도메인을 그리고 중쇄에 대해 Fc 영역을 첨가함으로써 완전한 항체-유사 분자로 전환될 수 있는지를 측정하기 위해 실험되었다. 미국 특허 제7,612,181호 및 국제 공개 제WO 2009/052081호에 기재된 바와 같은 상응하는 이원 가변 도메인(DVD-Ig) 및 TBTI에 대한 유사한 전환은 성공적이었다. CODH 포맷에서의 가변 영역의 배열은 하기 구조로 나타내어지고, 이는 펩타이드 쇄의 아미노 내지 카복실 배향을 나타낸다:
(a) 경쇄: NH2-VL1-링커-VL2-COOH
(b) 중쇄: NH2-VH2-링커-VH1-COOH
상기 (a) 및 (b)에서의 가변 영역의 아미노 내지 카복실 말단 배열은 하기 (c) 및 (d)에 나타내어진 이원-Fv 입체구조에서의 배열과는 구별될 수 있다:
(c) 경쇄: NH2-VL1-링커-VL2-COOH
(d) 중쇄: NH2-VH1-링커-VH2-COOH
주의할 주요 차이점은 2개의 이원 가변 영역 입체구조에서 서로에 대해 상응하는 경쇄 및 중쇄 가변 영역(VH1/VL1 및 VH2/VL2)의 분명한 위치이다. 상응하는 VL1 및 VH1 도메인은 이원 가변 영역 입체구조에서 경쇄 및 중쇄의 N-말단 둘 다에 존재하였다. 대조적으로, 교차 입체구조에서, 한 쌍의 항체 가변 영역의 절반은 교차 입체구조에서의 단백질 쇄 내에서 공간적으로 분리되었다. 교차 입체구조에서, VL1 도메인은 단백질 경쇄의 N-말단에 존재할 수 있지만, 쌍을 이루는 VH1 도메인은 교차 입체구조 중쇄의 C-말단에 존재한다. 이원 가변 영역 입체구조에서 발견되는 VL1과 VH1 사이의 공간적 관계는 자연 항체에서 발견되는 배열이다.
이원 Fv 입체구조의 하나의 잠재적 이점은, 2개의 가변 영역을 분리하는 링커 LL이 Fv2 도메인의 항원 결합 부위로 돌출된다는 것이다(도 1 참조). 이러한 돌출은 항원 결합을 방해하여 Fv2에 대한 항원 2의 불안한 접근성을 초래할 수 있다. 이러한 불안한 접근성 또는 방해는 항원 결합을 방지할 수 있다. 추가로, 이러한 방해는 항원 2의 크기가 보다 큰 경우에 더욱 표명될 수도 있다. 실제로, DVD-Ig 분자의 결합 친화성 및 중화 능력은 항원 특이성이 N-말단 또는 C-말단에서 나타나는 것에 의존한다는 것이 미국 특허 제7,612,181호에 기재되어 있다. 미국 특허 제7,612,181호, 실시예 2를 참조한다.
따라서, 모 항체와 비교하여 항원 친화성의 손실이 이루어지지 않는 보다 안정한 항체-유사 결합 단백질을 생성하기 위해, 경쇄 상의 CL 도메인 및 중쇄 상의 Fc 영역을 갖는 교차 이원 가변 영역 분자가 고안되어 작제되었다. 이들 항체-유사 단백질을 형성하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 쇄의 아미노 내지 카복실 말단 배향이 나타내어진 하기에 나타내어진 구조를 갖는다:
(e) 경쇄: NH2-VL1-링커-VL2-CL-COOH
(f) 중쇄: NH2-VH2-링커-VH1-CH1-Fc-COOH
이러한 이특이적 항체-유사 단백질 디자인이 2개의 상이한 항원에 결합할 수 있는지를 평가하기 위해, IL4(모 사람화된 항-IL4) 및 IL13(모 사람화된 항-IL13)에 대해 특이적인 항체로부터 사전에 생성되고 사람화된 2개의 가변 영역을 사용하여 표 1에 나타낸 이특이적 항체-유사 분자를 작제하였다. 마우스 항체의 서열분석 및 사람화 프로세스는 국제 공개 제2009/052081호에 기재되었다(TBTI). 간략하게, 뮤린 항-IL13 클론 B-B13 및 뮤린 항-IL4 클론 8D4-8의 가변 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 아미노산 서열분석에 의해 측정되었다. 뮤린 서열은 사람화되었고, 이어서, 전문이 본원에 참조로 포함된 국제 공개 제WO 2009/052081호의 실시예 5에 기재된 바와 같이 뉴클레오타이드 서열로 역-번역되었다. 모 사람화된 항-IL4 VH 및 VL, 및 모 사람화된 항-IL13 VH 및 VL 서열이 조합되어, 표 1에 나타낸 바와 같이 배열되었다. 표 1의 1행의 단축 암호는 이들 항체-유사 결합 단백질의 논의를 간단히 하기 위해 생성되었다. 항체-유사 결합 단백질은 표 1에 나타낸 바와 같이 2개의 가변 영역 사이에 삽입된 링커의 크기가 상이하다. 표 1에 나타낸 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자는 역-번역된 모 항-IL4 및 항-IL13 항체로부터 생성되었다. CH1, CL, 및 Fc 도메인은 IGHG1(Genbank 수탁번호 569F4) 및 IGKC(GenBank 수탁번호 Q502W4)로부터 수득되었다.
[표 1]
Figure pat00001
표 2에 나타낸 단백질 조합은 일시적 형질감염에 의해 발현되었고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 각각의 경우에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피는 12% 미만의 응집(최대 7% 미만의 응집을 가짐)을 나타내었지만; IL4 또는 IL13 중 어느 하나에 결합하는 임의의 능력을 나타내는 교차 이중 헤드 면역글로불린은 전혀 발견되지 않았다. 그러나, 기능성 항체-유사 결합은 전혀 검출되지 않을 수 있고, 이러한 활성 결여의 이유는 확인되지 않을 수 있었다. 이러한 배열이 미국 특허 제7,612,181호 및 국제 공개 제 WO 2009/052081호에 기술된 이원 가변 영역 도메인 항체에 걸쳐 우수한 안정성을 나타낼 것이라는 점은 사전에 예측되었다.
[표 2]
Figure pat00002
실시예 2. 분자 모델링에 의한 CODV -Ig 단백질의 고안
Fc 및 CL1 도메인의 도입을 개선할 수 있는 교차 이중 헤드 입체구조를 이용하여 완전 기능성 항체-유사 단백질을 수득하기 위해, 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대해 불변 도메인과 가변 도메인 사이 및 이원 가변 도메인 사이의 상이한 링커의 포함 및 평가를 위한 분자 모델링 프로토콜을 개발하였다. 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 각각의 불변/가변 도메인 계면 사이 및 2개의 가변/가변 도메인 계면 사이의 고유한 링커의 첨가가 적절한 단백질 폴딩을 발생시켜 교차 이원 가변 영역 입체구조 내에 기능성 항체-유사 분자를 생성시킬 것인지가 의문이었다(도 2 참조). 즉, 4개의 독립적이고 고유한 링커 전체가 평가되었다(도 2 참조). 이러한 분자 모델링 프로토콜은 상동성 모델의 단백질-단백질 도킹, 및 각각 FvIL4와 FvIL13 영역 사이 및 Fv와 불변 또는 Fc 영역 사이의 적절한 링커와의 조합으로의 FvIL4 및 FvIL13 영역의 실험 모델을 기반으로 하였다.
독립적 링커에는 하기와 같이 고유 명칭이 지정되었다: L1은 경쇄 상의 N-말단 VL과 C-말단 VL 사이의 링커를 나타내고; L2는 경쇄 상의 C-말단 VL과 CL 사이의 링커를 나타내고; L3은 중쇄 상의 N-말단 VH와 C-말단 VH 사이의 링커를 나타내고; L4는 중쇄 상의 C-말단 VH와 CH1(및 Fc) 사이의 링커를 나타낸다. 명칭 VH 및 VL은 최종 포맷에서 특정 단백질 쇄 상의 도메인의 위치만을 나타낸다는 것에 주의해야 한다. 예를 들면, VH1 및 VH2는 모 항체에서 VL1 및 VL2 도메인으로부터 유도되어 CODV-Ig에서 VH1 및 VH2 위치에 놓일 수 있다. 마찬가지로, VL1 및 VL2는 모 항체에서 VH1 및 VH2 도메인으로부터 유도되어 CODV-Ig에서 VH1 및 VH2 위치에 놓일 수 있다. 따라서, VH 및 VL 명칭은 본 발명의 위치를 나타내고, 모 항체에서의 본래 위치를 나타내는 것이 아니다.
보다 상세하게, FvIL4의 상동성 모델은 PDB 엔트리 1YLD(경쇄) 및 1IQW(중쇄) 상에서 작제되었다. FvIL4 이량체는 IL13/항-IL13 FabIL13 복합체의 내부 결정 구조 상에서 재구성하고 최적화하였다. IL4에 의해 요구되는 체적의 추정값을 수득하기 위해, FvIL4에 결합되는 경우에 IL4(1RCB.pdb)의 결정 구조는 FvIL4의 상동성 모델에 도킹되었다. 이어서, 추가로 고려할 가치가 있는 22개의 복합체 추정 모델을 생성하였다.
동시에, FvIL4의 상동성 모델은 IL13/FabIL13 복합체의 내부 결정 구조로부터 추출된 FvIL13에 도킹되었다. 항원 결합 및 이원 가변 영역 면역글로불린에 대한 경우와 같은 불변 도메인의 위치에 대한 입체적 방해를 나타내지 않으면서 상대적으로 짧은 링커의 작제를 허용하는 하나의 우수한 용액이 발견되었다(도 3 참조). 이러한 배열에서, FvIL4(VL1)은 경쇄의 N-말단에 위치하였고, 이어서, 경쇄 C-말단 상에 FvIL13(VL2) 및 Fc(CL1)가 위치하였다. 중쇄 상에, FvIL13(VH2)은 N-말단에 위치하였고, 이어서, FvIL4(VH1) 및 불변 영역(CH1-CH2-CH3)이 위치하였다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 경쇄 모델은, VL1과 VL2 도메인 사이의 링커 L1 및 VL2와 CL1 도메인 사이의 링커 L2가 각각 1 내지 3개 및 0 내지 2개의 글리신 잔기 길이여야만 한다는 것을 제안하였다. 중쇄 모델은, VH2와 VH1 도메인 사이의 링커 L3 및 VH1과 CH1 도메인 사이의 링커 L4가 각각 2 내지 6개 및 4 내지 7개의 글리신 잔기 길이여야만 한다는 것을 제안하였다(표 3 및 도 2 참조). 이러한 실시예에서, 글리신은 링커에 대한 프로토타입 아미노산으로서 사용되었지만, 다른 아미노산 잔기는 링커로서 작용할 수도 있다. 제안된 모델의 구조적 안정성은 링커 입체구조의 최적화, 최소화, 및 분자 동역학 계산에 의해 확인되었다. 4개의 경쇄와 6개의 중쇄 작제물 사이의 체계적 조합은 24개의 가능한 교차 이원 가변 영역 이특이적 항-IL4 및 항-IL13 항체-유사 결합 단백질을 초래하였다(표 4 참조).
[표 3]
Figure pat00003
[표 4]
Figure pat00004
표 4에서, 접두사 "항"은 포함되지 않지만, IL13이 항-IL13을 나타내고 IL4가 항-IL4를 나타내는 것을 의미하도록 의도된다.
실시예 3. CODV -Ig 발현 플라스미드의 생성
표 4에 기재된 6개의 중쇄 및 4개의 경쇄의 가변 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 분자는 진아트(Geneart)(Regensburg, Germany)에서의 유전자 합성에 의해 생성되었다. 가변 경쇄 도메인은 제한 엔도뉴클레아제 ApaLI 및 BsiWI를 이용한 소화에 의해 불변 경쇄(IGKC, GenBank 수탁번호 Q502W4)에 융합되었고, 이어서, 듀로체 등(Durocher et al., 2002, Nucl. Acids Res. 30(2): E9)에 의해 기술된 pTT 벡터의 아날로곤인, 경쇄의 발현을 위한 포유동물 발현 플라스미드를 생성하는 에피솜성 발현 벡터 pFF의 ApaLI/BsiWI 부위에 라이게이션되었다.
가변 중쇄 도메인은, 이특이적 Fab를 생성하기 위해, 사람 불변 중쇄(IGHG1, GenBank 수탁번호 569F4)의 "Ted" 변이체, 또는 대안으로 사람 불변 IGHG1 유래의 6x His 태그된 CH1 도메인에 융합되었다. 이어서, VH 도메인은 제한 엔도뉴클레아제 ApaLI 및 ApaI를 이용하여 소화되었고, 이어서, 중쇄(각각 IgG1 또는 Fab)의 발현을 위한 포유동물 발현 플라스미드를 생성하는 에피솜성 발현 벡터 pFF의 ApaLI/ApaI 부위에의 라이게이션에 의해 각각 IGHG1 또는 His 태그된 CH1 도메인에 융합되었다.
실시예 4. CODV -Ig의 발현
상응하는 작제물의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 플라스미드는 이.콜라이 DH5a 세포에서 증식되었다. 형질감염에 사용된 플라스미드는 퀴아젠 엔도프리 플라스미드 메가 키트(Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit)를 이용하여 이.콜라이로부터 제조되었다.
프리스타일 배지(Freestyle Medium, 인비트로젠(Invitrogen))에서 성장하는 HEK 293-FS 세포를, 제조업자에 의해 기술된 바와 같이, 293fectin(인비트로젠) 형질감염 시약을 이용하여, 표 4에 나타낸 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 지시된 LC 및 HC 플라스미드로 형질감염시켰다. 7일 후, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 상청액을 0.22㎛ 필터에 통과시켜 입자를 제거하였다.
CODV-IgG1 작제물은 단백질 A 컬럼(HiTrap 단백질 A HP 컬럼, 쥐이 라이프 싸이언시즈(GE Life Sciences)) 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 100mM 아세테이트 완충액 및 100mM NaCl, pH 3.5를 이용한 컬럼으로부터의 용출 후, CODV-IgG1 작제물을 HiPrep 26/10 Desalting Colums를 이용하여 탈염시키고, PBS 중에서 1mg/mL의 농도로 제형화하고, 0.22㎛ 멤브레인을 이용하여 여과하였다.
이특이적 CODV Fab 작제물을 HiTrap IMAC HP 컬럼(쥐이 라이프 싸이언시즈) 상에서의 IMAC에 의해 정제하였다. 선상 구배를 갖는 컬럼으로부터의 용출(용출 완충액: 20mM 나트륨 포스페이트, 0.5M NaCl, 50 내지 500mM 이미다졸, pH 7.4) 후, 단백질 함유 분획을 모으고, HiPrep 26/10 Desalting Columns를 이용하여 탈염시키고, PBS 중에서 1mg/mL의 농도로 제형화하고, 0.22㎛ 멤브레인을 이용하여 여과하였다.
단백질 농도는 280nm에서의 흡광도 측정에 의해 측정하였다. 각각의 배치(batch)는 환원 및 비-환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하여 각각의 서브유닛의 및 단량체의 순도 및 분자량을 측정하였다.
Nunc F96-MaxiSorp-Immuno 플레이트를 염소 항-사람 IgG(Fc 특이적)[NatuTec A80-104A]로 코팅하였다. 항체를 카보네이트 코팅 완충액(50mM 나트륨 카보네이트, pH 9.6) 중에서 10㎍/ml로 희석하였고, 웰당 50μL로 분배하였다. 플레이트를 접착 테이프로 밀봉하였고, 4℃에서 밤새 저장하였다. 플레이트를 세척 완충액(PBS, pH 7.4 및 0.1% Tween20)으로 3회 세척하였다. 150μL의 차단 용액(1% BSA/PBS)을 각각의 웰에 분배하여 플레이트를 피복하였다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 100μL의 샘플 또는 표준물질(1500ng/ml 내지 120ng/ml의 범위)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 세척 완충액을 이용하여 3회 세척하였다. 1:10.000으로 희석된 100μL의 염소 항-사람 IgG-FC - HRP 접합체[NatuTec A80-104P-60]를 항온배양 용액(0.1% BSA, PBS, pH 7.4, 및 0.05% Tween20)을 이용하여 첨가하였다. 실온에서의 1시간 항온배양 후, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 100μL의 ABTS 기질(0.1M Na2HPO4, 0.05M 시트르산 용액 중의 10mg ABTS 정제(Pierce 34026), pH 5.0). 사용하기 전에 10μL의 30% H2O2/10ml의 기질 완충액의 첨가를 각각의 웰에 분배하였고, 색을 전개시켰다. 색이 전개된(약 10 내지 15분) 후, 50μL의 1% SDS 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 A405에서 판독하였다.
실시예 5. CODV -Ig 변이체의 특성확인
CODV-Ig 항체-유사 단백질 중쇄 및 경쇄가 쌍을 이루어 적절하게 폴딩되는지를 측정하기 위해, 분석적 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 응집 수준을 측정하였다. 분석적 SEC는, TSKgel G3000SWXL 컬럼(7.8mm×30cm) 및 TSKgel SWXL 가드 컬럼(토소 바이오싸이언스(Tosoh Bioscience))이 구비된 AKTA 익스플로러 10(쥐이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 이용하여 조립된 쌍에 대해 행하였다. 분석은 280nm에서 검출되는 250mM NaCl, 100mM Na-포스페이트, pH 6.7을 이용하여 1ml/분으로 수행하였다. 30μL의 단백질 샘플(0.5 내지 1mg/ml)을 컬럼에 적용하였다. 분자 크기를 추정하기 위해, 겔 여과 표준 혼합물(MWGF-1000, 씨그마 알드리치(SIGMA Aldrich))을 이용하여 컬럼을 캘리브레이션하였다. UNICORN 소프트웨어 v5.11을 이용하여 데이터 평가를 행하였다.
표 5는 표 4에 기재된 항-IL4 및 항-IL13 가변 영역 조합을 이용하여 이루어진 24개의 상이한 CODV-Ig 분자의 제1 세트의 결과를 나타낸다. 표 4에 지정된 암호는 표 4에 나타낸 인접한 구조를 나타낸다. 단백질이 생산되는 경쇄 및 중쇄의 쌍에 대하여, SEC를 이용하여 응집 수준을 측정하였다. 그 결과는 표 5에 나타내고, 여기서, LC4(L1 = 1; L2 = 2)는 6개의 중쇄 모두와 쌍을 이룸에 있어 가장 성공적이었다. LC4는 1과 동일한 링커 L1을 갖는 구조 IL4 VL-(Gly)-IL13 VL-(Gly2)-CL1에 상응하고, 여기서, 단일 아미노산 잔기는 이원 가변 영역 경쇄의 2개의 VL 도메인을 분리하였다. 또한, LC4는 2와 동일한 L2를 가졌고, 이는 중앙 VL 및 C-말단 CH1 사이의 Gly-Gly 디펩타이드 링커를 포함하였다.
[표 5]
Figure pat00005
CODV-Ig 분자가 생성된 경우, 중간 IL13 및 IL4 농도에서의 단일-농도 BIACORE 실험을 행하여 표적 항원에 대한 결합을 확인하였다. 표 4에 기재된 LC4:HC4 및 LC4:HC6 조합에 상응하는 CODV-Ig 항체-유사 분자는 표면 플라스몬 공명을 이용한 완전 운동역학적 분석의 평가를 위해 선택되었다.
표 5에 나타낸 바와 같이, CODV-Ig 분자의 대부분은 전혀 생성될 수 없거나 응집물로서만 생성될 수 있다(90% 이하). 하나의 크로마토그래피 단계 후에 허용되는 응집 수준(5 내지 10%)을 생성시키는 중쇄/경쇄 조합은 경쇄 IL4 VL(Gly)-IL13 VL-(Gly2)-CL1과 조합된 것이었다. 경쇄는 이들 CODV-Ig 변이체 내에서 가장 까다로운 쇄였고, 상이한 링커 조성물을 갖는 상이한 중쇄를 허용하기 위한 플랫폼으로서 작용하였다.
1. 운동역학적 분석
완전 운동역학적 분석을 위해 2쌍의 중쇄와 경쇄를 선택하였다. 재조합 사람 IL13 및 IL4를 케미콘(Chemicon, USA)으로부터 구매하였다. 정제된 항체의 운동역학적 특성확인은 BIACORE 3000(쥐이 헬쓰케어)에서의 표면 플라스몬 공명 기술을 이용하여 행하였다. 조사되는 항체의 포획 및 배향을 위한 종 특이적 항체(예를 들면, 사람-Fc 특이적 MAB 1302, 케미콘)를 이용한 포획 검정을 이용하였다. 포획 항체는 표준 절차를 이용하여 연구 등급 CM5 칩(쥐이 라이프 싸이언시즈) 상에 1차 아민 그룹(11000RU)을 통해 고정화되었다. 최대 분석물 결합 30RU를 초래할 수 있는 조절된 RU값을 갖는 분석된 항체를 10μL/분의 유속으로 포획하였다. 결합 운동역학은, 재조합 사람 IL4 및 IL13에 대해, HBS EP(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 및 0.005% 계면활성제 P20) 중에서 0 내지 25nM 사이의 농도 범위에 걸쳐, 30μL/분의 유속으로 측정하였다. 칩 표면은 10mM 글리신, pH 2.5를 이용하여 재생되었다. 운동역학적 파라미터는 BIAevaluation 프로그램 패키지 v4.1에서 유동 세포를 이용하여, 참조물로서의 포획 항체 없이 분석 및 계산하였다.
하기 표 6은 모 BB13(항-IL13) 및 8D4(항-IL4) 항체(IgG로서 발현됨)의 운동역학과 CODV-Ig 포맷 내의 각각의 도메인(표 4, 암호 LC4:HC4 및 LC4:HC6)의 비교를 나타낸다. 표 6에 나타낸 바와 같이, CODV-Ig 작제물은, 모 항-IL13 및 항-IL4 항체와 비교할 경우에 상응하는 항원에 대해 감소된 결합 특성을 나타내지 않았다. 동일한 Fv 서열을 이용한 DVD-Ig/TBTI 포맷에서 관찰된 온-레이트에서의 손실은 CODV-Ig 입체구조로 발생하지 않았다. 반대측을 향하는 결합 부위는 이특이적 항체-유사 입체구조를 이용하여 큰 항원에 결합하거나 상이한 세포를 가교시키는 것을 가능하게 해야만 하고, 또한 모 항체의 보다 넓은 선택에 적합할 수 있다. CODV-Ig의 추가의 이점은 항원 결합 부위에 링커 잔기에 전혀 돌출되지 않아 항원의 접근성을 감소시킨다는 것이었다.
[표 6]
Figure pat00006
2. CODV -Ig에 의한 부가의 항원 결합을 입증하기 위한 IL4 및 IL13 의 동시-주사
항원 둘 다의 부가의 결합을 조사하기 위해, 하나의 항원이 주사되고 직후에 래그 타임 후 다른 항원이 주사되는(IL4에 이어서 IL13 및 반대로) 위자드-드리븐(wizard-driven) 동시-주사 방법을 적용하였다. 얻어진 결합 수준은 동일한 농도의 항원 둘 다의 1:1 혼합물을 이용하여 달성된 결합 수준과 비교할 수 있었다. CODV-Ig 분자에 의한 IL4 및 IL13 항원 둘 다의 부가의 결합을 나타내기 위해서, 3회의 별도의 분석 사이클로 항원 둘 다의 동시-주사에 의해 CODV-Ig 조합[HC4:LC4]을 이용하여 BIACORE 실험을 행하였다(도 4 참조). 동시-주사는 3.125nM IL4/25nM IL13(및 반대로)으로 그리고 3.125nM IL4 및 25nM IL13의 1:1 혼합물로 이루어졌다. HBS-EP 완충액의 동시-주사는 참조물로서 이루어졌다. 800초의 시점에서, 항원 혼합물의 주사 또는 항원의 동시-주사 후, 동시-주사 순서에 관계없이 63RU의 동일한 결합 수준이 달성되었다. CODV-Ig 단백질이 제1 항원(IL4)에 의해 포화된 경우, 제2 항원(IL13)을 주사하였고, 제2 결합 신호를 관찰하였다. 항원 주사 순서가 반대인 경우에 이러한 관찰을 재생하였다. 이는 CODV-Ig에 의한 항원 둘 다의 부가의 결합 및 결합의 비-억제를 입증한다. 따라서, CODV-Ig 작제물은 모든 결합 부위를 동시에 포화시키는(즉, 4가를 나타내는) 항원 둘 다에 결합할 수 있었다(즉, 이특이성을 나타낼 수 있었다).
실시예 6. CODV - IgD 에 대한 링커 길이의 내성
각종 길이의 링커에 대한 내성은 경쇄 상의 L1, L2 및 중쇄 상의 L3 및 L4에 대한 링커 길이의 상이한 조합을 갖는 CODV-Ig 분자를 작제함으로써 평가하였다. CODV-Ig 작제물은, L3에 대해 1 내지 8개 잔기 사이의 범위 그리고 L4에 대해 0 또는 1개 잔기의 중쇄 링커 L3 및 L4를 이용하여 생성하였다. 중쇄는, N-말단 결합 도메인으로서 항-IL4을, 그리고 C-말단 결합 도메인으로서 항-IL13을, 이어서 CH1-Fc를 포함하였다. 경쇄 링커 L1 및 L2는 L1에 대해 3 내지 12개 잔기 및 L2에 대해 3 내지 14개 잔기의 범위였다. 경쇄는 N-말단 결합 도메인으로서 항-IL13을, 그리고 C-말단 결합 도메인으로서 항-IL4를, 이어서 CL1을 포함하였다.
1. CODV -Ig 변이체의 특성확인
응집 수준은 분석적 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정하였다. 분석적 SEC는, TSKgel G3000SWXL 컬럼(7.8mm×30cm) 및 TSKgel SWXL 가드 컬럼(토소 바이오싸이언스)이 구비된 AKTA 익스플로러 10(쥐이 헬쓰케어)를 이용하여 행하였다. 분석은 280nm에서 검출되는 250mM NaCl, 100mM Na-포스페이트, pH 6.7을 이용하여 1ml/분으로 수행하였다. 30μL의 단백질 샘플(0.5 내지 1mg/ml)을 컬럼에 적용하였다. 분자 크기를 추정하기 위해, 겔 여과 표준 혼합물(MWGF-1000, 씨그마 알드리치)을 이용하여 컬럼을 캘리브레이션하였다. UNICORN 소프트웨어 v5.11을 이용하여 데이터 평가를 행하였다.
재조합 사람 IL13 및 IL4를 케미콘(USA)으로부터 구매하였다. 재조합 사람 TNF-α(H8916-10㎍)은 시그마 알드리치로부터 구매하였고, 재조합 사람 IL-1β(201-LB/CF), 재조합 사람 IL-23(1290-IL/CF), 재조합 사람 EGFR(344 ER), 및 재조합 사람 HER2(1129-ER-50)는 알앤드디 시스템스(R&D Systems)로부터 구매하였다.
Biacore에 의한 운동역학적 결합 분석은 하기와 같이 행하였다. Biacore 3000(쥐이 헬쓰케어)에서의 표면 플라스몬 공명 기술을 정제된 항체의 상세한 운동역학적 특성확인에 사용하였다. 조사되는 항체의 포획 및 배향을 위한 종-특이적 항체(예를 들면, 사람-Fc 특이적 MAB 1302, 케미콘)를 이용한 포획 검정을 이용하였다. IL4 및 IL13 결합 운동역학의 측정을 위해, 실시예 10, 표 12에서와 같이 상응하는 CODV Fab를 항-사람 Fab 포획 키트(쥐이 헬쓰케어)를 이용하여 포획하였다. 포획 항체는 표준 절차를 이용하여 연구 등급 CM5 칩(쥐이 라이프 싸이언시즈) 상에 1차 아민 그룹(11000RU)을 통해 고정화되었다. 최대 분석물 결합 30RU를 초래할 수 있는 조절된 RU값을 갖는 분석된 항체를 10μL/분의 유속으로 포획하였다. 결합 운동역학은, 재조합 사람 IL4 및 IL13에 대해, HBS EP(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 및 0.005% 계면활성제 P20) 중에서 0 내지 25nM 사이의 농도 범위에 걸쳐, 30μL/분의 유속으로 측정하였다. 칩 표면은 10mM 글리신, pH 2.5를 이용하여 재생되었다. 운동역학적 파라미터는 BIAevaluation 프로그램 패키지 v4.1에서 유동 세포를 이용하여, 참조물로서의 포획 항체 없이 분석 및 계산하였다.
EGFR 및 HER2에 대한 CODV-Ig, CODV-Fab 및 TBTI의 결합 친화성은 Proteon XPR36 단백질 상호작용 검정 시스템(바이오래드(Biorad))를 이용하여 측정하였다. 항원은 GLC 센서 칩(바이오래드) 상에 아민 반응성 커플링에 의해 고정화되었다. PBSET 완충액(바이오래드) 중의 이특이적 항체 변이체의 희석 시리즈는 이중 참조로 하여 원-샷(one-shot) 운동역학 방식에서 동시에 분석하였다. 데이터는 질량 전이를 이용한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 모델 또는 2가의 분석물 모델 중 어느 하나로 Proteon Manager 소프트웨어 v3.0(바이오래드)을 이용하여 분석하였다.
표 7은 수율, 응집(크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같음), 및 상이한 크기 조합의 링커들을 갖는 CODV-Ig에 대한 결합 친화성 결과를 요약한다. 상기 결과는, L2가 0인 CODV-Ig 분자가 일반적으로 생성될 수 없었음, 또는 단백질이 생성되었음을 나타냈고, 고수준의 응집이 존재하였다(표 7에서의 배치 ID 번호 101, 102, 106 내지 111, 및 132 내지 137 참조). 따라서, 실시예 2로부터의 분자 모델링 예측과 대조적으로, 0과 동일한 L2가, 허용되는 범위 내에 존재하는 경우, 이들 결과는 VL2-CL 전이(또는 L2)가 하나 이상의 잔기의 링커를 필요로 한다는 것을 나타낸다(표 7 참조).
[표 7]
Figure pat00007
또한, 상기 기재된 CODV-Ig 링커 길이는 2개의 아미노산 잔기에서의 증가보다 1개의 아미노산 잔기에서의 증가에 더욱 민감성인 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 배치 ID 번호 103 및 104은 L2에서 1개의 아미노산 잔기가 상이하지만, 배치 ID 번호 103은 6배 이상의 응집을 나타내고, 배치 ID 번호 104는 보다 적은 응집 및 2배의 수율을 나타낸다. 대조적으로, L2에서 2개의 잔기가 상이한 배치 ID 번호 104 및 105는, 수율, 응집 및 결합과 관련하여 유사한 프로필을 나타냈다.
실시예 7. CODV -Ig에 대한 템플레이트 쇄로서의 중쇄
실시예 1 내지 실시예 5에서, 경쇄 상에서의 최적의 짧은 링커 크기는, 경쇄가 선상 배열에 잔존함으로써 템플레이트로서 작용하였음을 시사하였고, 중쇄가 교차 입체구조로 적절하게 폴딩되어 템플레이트 경쇄와 일치하도록 하기 위해서 중쇄 상에 보다 큰 링커가 요구되었음을 시사하였다(도 5, 패널 A 참조). 이어서, 짧은 링커가 중쇄 상에 특이적으로 위치하여 중쇄가 "템플레이트" 쇄가 되게 하는 중쇄 상의 선상 배열을 유지하는지의 여부, 및 패턴 자체가 반복되고, 보다 큰 링커가 요구되어 비-템플레이트 쇄가 적절하게 폴딩되어 템플레이트 중쇄를 수용할 수 있는지의 여부가 평가되었다(도 5, 패널 B 참조).
도 6은 "템플레이트"로서 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나를 갖는 것을 기반으로 하는 이들 CODV-Ig 디자인의 원칙을 설명한다. 이러한 개념의 일반적인 특성을 평가하기 위해, L3에 대해 1 내지 8개 잔기 사이의 범위 그리고 L4에 대해 0 또는 1개 잔기의 중쇄 링커 L3 및 L4를 이용하여 CODV-Ig 작제물을 생성하였다. 중쇄는, N-말단 결합 도메인으로서 항-IL4을, 그리고 C-말단 결합 도메인으로서 항-IL13을, 이어서 CH1-Fc를 포함하였다. 경쇄 링커 L1 및 L2는 L1에 대해 3 내지 12개 잔기 및 L2에 대해 3 내지 14개 잔기의 범위였다. 경쇄는 N-말단 결합 도메인으로서 항-IL13을, 그리고 C-말단 결합 도메인으로서 항-IL4를, 이어서 CL1을 포함하였다.
표 8은 수율, 응집(크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같음), 및 상이한 크기 조합의 링커들을 갖는 CODV-Ig에 대한 결합 친화성 결과를 요약하고, 여기서, 중쇄는 템플레이트 쇄로서 선상 배열을 유지하고, 경쇄는 교차 입체구조로 폴딩되도록 한다. 상기 결과는, L4가 0인 CODV-Ig 분자가 일반적으로 생성될 수 없었음, 또는 단백질이 생성되었음을 나타냈고, 고수준의 응집(L2가 0과 동일한 분자와 유사함)이 존재하였음 나타냈다(표 8에서의 배치 ID 번호 207 내지 209, 211 내지 212, 219 내지 224, 231 내지 236, 243 내지 252, 및 263 내지 266 참조). 하나의 예외는 배치 ID 번호 210이었고, 여기서, L1은 7이었고, L2는 5이었고, L3은 2이었고, L4는 0이었다. 이러한 배열은 충분한 양의 단백질을 생성하였고, 허용되는 수준의 응집 및 결합을 가졌으며, 이는 몇몇 조합의 링커 크기가 소정 상황에서 L4에서 0 길이 링커를 보상하는 것으로 밝혀질 수 있었음을 시사하였다.
[표 8]
Figure pat00008
Figure pat00009
표 7 및 표 8로부터의 결과는, 최적 폴딩을 가능하게 하기 위해서 가변 도메인과 불변 도메인 사이에 링커가 요구된다는 것을 명백하게 보여준다. 드문 배열에서만 0과 동일한 링커가 내성이었다(L1(LC)은 0이었던 배치 ID 번호 103 내지 105, 및 L4가 0이었던 배치 ID번호 210 참조). 그러나, 각각의 경우에, 다른 쇄 상의 가변 영역과 불변 영역 사이의 상응하는 전이 링커는 0일 수 없었다.
상기 결과는, 조합 L1=7, L2=5, L3=1, 및 L4=2가 중쇄가 템플레이트인 새로운 CODV-Ig를 최적화하기에 양호한 시작점이었다는 것을 나타냈다. 표 9의 범위는 2개의 모 항체로부터의 새로운 CODV-Ig를 성공적으로 조작하기 위한 합리적인 범위인 것으로 나타났다.
[표 9]
Figure pat00010
실시예 8. CODV-Ig 포맷의 범용적 적용성
새로운 항체-유사 결합 단백질을 조작하기 위한 CODV-Ig 포맷의 적합성을 평가하기 위해서, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R(1))에 대한 특이성을 갖는 다수의 존재하는 사람 및 사람화된 항체로부터의 가변 영역, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R(2))에 대한 제2 항체, 사람 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 종양 괴사 인자 - 알파(TNFα), 인터류킨 12 및 23(IL-12/23) 및 인터류킨 1베타(IL-1β)를 CODV-Ig 포맷에 포함시켰다(표 10 참조).
[표 10]
Figure pat00011
공지의 사람 및 사람화된 항체로부터의 항체 가변 영역을 이용하여 이특이적 항체-유사 결합 단백질을 고안하는데 있어서 CODV-Ig 포맷의 범용적 적용성을 시험하였다. 추가로, 소정 항체 가변 영역의 배치와 관련하여 중쇄 또는 경쇄 상의 N-말단 또는 C-말단에의 위치적 효과의 가능성을 실험하였다. L1=7, L2=5, L3=1, 및 L4=2를 갖는 링커 조성물을 갖는 CODV-Ig 분자의 디자인에 기초하여, 상이한 서열의 항체가 CODV-Ig 포맷에 도입되었다.
시판 HEK-블루 TNFα/IL1β 리포터 세포(인비보젠(InvivoGen))를 이용함으로써 IL1β 및 TNFα에 대한 이특이적 항체 또는 유도체의 활성을 측정하였다. IL1β 및 TNFα에 대한 항체 활성을 측정하기 위해서, 사이토카인을 다양한 농도의 항체와 함께 1시간 동안 사전-항온배양하고, 50,000 HEK 블루 TNFα/IL1β 세포에 첨가하였다. 사이토카인 매개된 SEAP의 유도는 24시간 후에 배양 상청액에서 QUANTI-블루 검정(인비보젠)을 이용하여 측정하였다.
표 11에 나타낸 바와 같이, 모든 작제물은 양호 내지 우수한 단백질 수율 및 허용되는 수준의 응집을 나타냈다(특히, 표 11의 배치 ID 번호 301 및 302 참조). 각각의 항체 가변 도메인에 대해 측정된 친화성은 공개되거나 기대되는 친화성 이내였다. 친화성이 평가된 경우에, 위치적 효과는 검출되지 않았다. 요약하면, 하기 표에 나타낸 바와 같이, 사용된 항체 가변 도메인을 이용하거나 또는 어느 하나의 항체 쇄 상의 이들 도메인을 이용한 어느 경우에도 위치적 효과는 나타나지 않았다.
[표 11]
Figure pat00012
실시예 9. CODV -Ig 포맷에서의 모 항체 친화성의 보유
항-IL4 및 항-IL13에 대해 동일한 항체 서열은, 얻어진 분자의 이들 입체구조, 링커의 위치, 및 친화성의 직접적 비교를 위해, TBTI/DVD-Ig 또는 CODV-Ig 포맷 중 어느 하나에 도입되었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 각각의 항체의 모 친화성은 CODV 포맷에서 유지되었다. 도 7의 상부 패널에 나타낸 바와 같이, 가변 영역이 TBTI/DVD-Ig 포맷에 배치된 경우, 내부 Fv2 위치에 위치된 IL4 항체의 친화성 강하는 항원에 결합하는 항체의 온-레이트의 감소로서 나타났다. 대조적으로, 모 항체와 비교하여 CODV-Ig 포맷에 대한 친화성의 손실은 없었다(도 7, 하부 패널 참조).
실시예 10. Fab 포맷에 대한 CODV -Ig의 적응성
이어서, CODV-Ig 포맷의 단편(예: Fab 단편) 제공 능력이 평가되었다. 2개의 상이한 가변 중쇄를 링커 L3을 통해 서로 융합시키고, 링커 L4에 의해 C-말단에서 연장시켰다. 이어서, 이러한 VH 복합체를, C-말단에서 6개의 히스티딘 잔기가 이어지는 힌지 영역으로부터 5개의 아미노산 서열 DKTHT(서열번호 60)를 갖는 IGHG1(GenBank 수탁번호 Q569F4)의 CH1 도메인에 융합시켰다. 2개의 상이한 가변 경쇄를 링커 L1을 통해 상응하는 중쇄에 교차 입체구조로 서로 융합시키고, 링커 L2에 의해 C-말단에서 연장시켰고, 이어서, 불변 카파 쇄(IGKC, GenBank 수탁번호 Q502W4)에 융합시켰다.
상기 기술한 바와 같이, Fab 단편은 일시적 형질감염에 의해 발현되었다. 형질감염 후 7일째에, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 10% vol/vol 1M Tris-HCl, pH 8.0을 첨가하고, 상청액을 0.22㎛ 필터를 통과시켜 입자를 제거하였다. Fab 단백질은 HisTrap 고성능 컬럼(쥐이 헬쓰케어)을 이용하여 포획하였고, 이미다졸 구배를 통해 용출하였다. 단백질 함유 분획을 모으고, PD-10 또는 세파덱스(Sephadex) 컬럼을 이용하여 탈염시켰다. 농축 및 멸균 여과(0.22㎛)된 단백질 용액을 1mg/ml로 조정하고 사용할 때까지 4℃로 유지하였다.
CODV 배향에서의 Fab-유사 분자가 응집하는 경향을 나타내지 않았고, 모 항체의 친화성을 보유하였다는 즉각적인 이점이 관찰되었다(표 12 참조). 배치 ID 번호 401 내지 421로부터의 결합 단백질 작제물들을, 템플레이트로서의 중쇄를 갖는 CODV-Ig 분자에서와 같이 항체 가변 영역이 배열된 항체-유사 단백질(401, 402, 406 및 407), CODV-Fab-유사 단편(402, 408, 413, 418, 및 421), TBTI/DVD-Ig 포맷에서의 4개의 도메인 항체-유사 분자(404, 409, 414, 및 419), 및 링커를 갖지 않는 CODV-Ig(405, 410, 415, 및 420)과 직접 비교하였다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 이러한 비교의 결과는, 가변 영역이 TBTI 또는 DVD-Ig 포맷에 포함되는 경우 모 항체와 비교하여 친화성의 손실이 존재하는 경향이 있음을 나타냈다. 대조적으로, CODV-Ig 및 CODV-Ig Fab-유사 포맷 둘 다는 보다 우수하게 모 친화성을 유지할 수 있었다. 상기 결과는 추가로, CODV-Ig 분자가 가변 영역 사이 및 가변 영역과 불변 도메인 사이에 링커를 요구한다는 것을 확인하였다(표 12 참조).
[표 12]
Figure pat00013
실시예 11. CODV -Ig 및 CODV Fab 내의 가변 도메인의 치환
T-세포 관련 접근에 있어서 CODV 포맷을 특성확인하기 위해, TCR 결합 부위(CD3엡실론) 및 CD19 결합 부위를 갖는 이특이적 CODV Fab-유사 결합 단백질(CODV-Fab)을 생성시켜, TBTI/DVD-Ig 포맷으로부터 유도된 이특이적 Fab(B-Fab)와 비교하였다. 결합 부위(TCR x CD19 vs. CD19 x TCR)의 배향의 중요성을 조사하기 위해, 상기 배향 둘 다를 각각의 결합 단백질에 대해 평가하였다.
결합 단백질은, 표적 세포로서의 NALM-6(CD19 발현) 세포 및 이펙터 세포로서의 1차 사람 T-세포를 이용한 세포독성 검정으로 특성확인하였다. CD3 양성 세포를 신선하게 제조된 사람 PBMC로부터 분리하였다. 이펙터 및 표적 세포를 10:1의 비율로 혼합하여, 지시된 농도의 이특이적 결합 단백질과 20시간 동안 항온배양하였다(도 8 참조). 아폽토시스성 표적 세포를 7-아미노액티노마이신 염색을 이용한 FACS-기반 검정으로 측정하였다.
입체구조 CD3-CD19(1060)에서의 B-Fab 포맷은, EC50이 3.7ng/ml인 NALM-6 세포를 향한 T-세포 매개된 세포독성을 유도하는데 있어서 활성인 것으로 나타났다. 유사하게, EC50이 3.2ng/ml인 CD19-CD3 CODV-Fab(1109)에 대해서도 고활성이 관찰되었다(도 8 참조).
CD19-CD3 배향으로의 B-Fab 분자의 입체구조(TBTI/DVD-Ig 포맷)의 교환(swap)은 상당한 활성의 손실을 초래하였다(도 8 참조). 상기 교환된 B-Fab 분자는 CODV-Ig Fab의 배향 및 B-Fab의 다른 배향 둘 다에 대해 최대인 농도에서 활성을 나타내지 않았다. CODV-Ig Fab 및 B-Fab의 한 배향에 대해, 최대 반응(1 내지 100ng/ml 사이의 범위)이 관찰되었다. B-Fab의 CD19-CD3 배향에 대해, 최대 농도(30㎍/ml)에서도 최적 세포독성 반응은 도달되지 않았다. 명백하게 대조적으로, CD3-CD19(1108)를 향한 CODV-Fab에서의 도메인의 배향의 변화는 이러한 검정에서 상당한 활성을 갖는 분자를 초래하였다(도 8 참조). CODV-Fab에서의 도메인 교환도 T-세포 매개된 세포독성의 유도를 감소시켰지만(인자 약 100에 의한 EC50의 증가), 이러한 효과는 B-Fab 포맷에서 나타내어진 것보다 훨씬 더 적게 나타났고, 분자는 최대 수준까지 세포독성을 유도할 수 있었다. 데이터는 대표값이었고, 3회의 독립 실험으로부터 수득되었다.
실시예 12. CODV -Ig 링커에 대한 아미노산 서열 동일성의 영향
링커 L1 내지 L4에 대한 링커 조성물의 영향을 조사하기 위해서, 배치 ID 204에 상응하는 최적화된 작제물(실시예 7 및 표 8 참조)을 선택하였다. 링커 길이는 L1, L2, L3, 및 L4에 대해 각각 7, 5, 1, 및 2개 잔기 길이로 설정되었다(표 13 참조). 시험 서열은, 자연 항체 VH와 CH1 도메인 사이, 또는 카파 또는 람다 경쇄의 항체 Fv와 CL 도메인 사이의 전이시에 자연 발생 링커로부터 유도되었다. 후보 서열은 각각 VH 및 CH1 도메인 전이로부터 유도되는 ASTKGPS(서열번호 48), 카파 및 람다 경쇄의 Fv 및 CL 도메인 전이로부터 유도된 RTVAAPS(서열번호 49) 및 GQPKAAP(서열번호 50)였다. 또한, 임의의 링커 조성물을 이용하여 하나의 작제물을 생성시켜 임의의 서열이 링커 L1 내지 L4에 잠재적으로 사용될 수 있음을 나타냈다. 이러한 링커 조성물은 아미노산 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 및 프롤린을 4개의 링커의 15개의 위치에 무작위 분포함으로써 수득되었다. 방향족 아미노산 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판뿐만 아니라 아미노산 메티오닌 및 시스테인은 의도적으로 배제시켜 응집의 잠재적 증가를 회피하였다.
배치 ID 번호 204에 대한 작제물의 3차원 모델을 생성시켜 적합성을 확보하거나 링커 조성물의 선택을 개선시켰다. 따라서, 3차원 모델에서 양 및 음 하전된 잔기가 인근에서 관찰되므로 링커 L3에 대해서는 세린이 선택되었다. 링커 L4에서의 잔기는 상기 모델에 의해 제안되는 바와 같은 이들 위치의 용매 노출에 적합하도록 선택되었다. 유사하게, L1 및 L2의 링커 조성물에 대해서도 예상되거나 예측되는 문제가 없었다. 링커 조성물에 대해 선택된 제안의 3차원 모델이 작제되었다.
표 12에 나타낸 바와 같이, 링커 조성물은 수율에 대해 현저한 영향을 가질 수 있다. L1 상의 람다 쇄로부터 유도된 서열(배치 ID 번호 505 내지 507을 배치 ID 번호 501 내지 503과 비교함)은 보다 생산적인 단백질 생성기였다(8배까지 증가). 실제로, 표 13, 배치 ID 번호 508에 나타낸 바와 같이, 무작위 생성을 기반으로 한 링커도 우수한 수율을 생성하였다. 따라서, 링커 조성물은 CODV-Ig 최적화 동안에 고려되는 하나의 파라미터여야 한다.
[표 13]
Figure pat00014
시판 HEK-블루 IL-4/IL-13 리포터 세포(인비보젠)에서 사이토카인 IL4 및 IL13에 대한 이특이적 항체 또는 유도체의 활성을 측정하였다. HEK-블루 IL-4/IL-13 세포는, IL-4 또는 IL13에 의한 STAT6 통로의 활성화를 모니터링하기 위해 고안된다. 둘 중 어느 하나의 사이토카인을 이용한 세포의 자극은 리포터 유전자 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP)의 생성을 초래하고, 이는 QUANTI-블루 검정을 이용하여 배양 상청액에서 측정될 수 있다. IL4 또는 IL13에 대한 항체 활성을 시험하기 위해서, 사이토카인을 다양한 농도의 항체와 함께 1시간 동안 사전-항온배양하고, 50,000 HEK 블루 IL-4/IL-13 세포에 첨가하였다. 사이토카인 매개된 SEAP의 유도는 항온배양 24시간 후에 세포 배양 상청액에서 QUANTI-블루 검정(인비보젠)을 이용하여 측정하였다.
실시예 13. CODV -Ig 링커에의 시스테인의 도입
공개된 데이터는, 비-자연 디설파이드 브릿지의 도입에 의해 항체 및 항체-유도된 단백질의 안정성이 증가될 수 있음을 시사한다(참조: Wozniak-Knopp et al., 2012, "Stabilisation of the Fc Fragment of Human IgG1 by Engineered Intradomain Disulfide Bonds," PLoS ONE 7(1): e30083). 사람 IgG1 항체로부터 유도되어 CODV-Ig 분자에 유전자조작된 동등한 Fc 단편이 쇄간 및 쇄내 디설파이드 브릿지의 도입에 의해 안정화될 수 있는지를 검사하기 위해서, CODV-Ig 작제물 배치 ID 번호 204(실시예 7)의 동등한 Fc 위치를 시스테인 잔기로 돌연변이유발시키고, 돌연변이 단백질을 과생산시키고, 정제하고, 특성확인하였다(표 14 참조).
표 14에 나타낸 바와 같이, 추가의 시스테인 잔기를 함유하는 돌연변이된 CODV-Ig 분자는 각각 CODV-Ig 작제물 배치 ID 번호 204의 융점 온도와 동일한 융점 온도를 가졌다.
추가로, 문헌[Brinkmann et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 7538-42]에 기재된 바와 같은 각각의 가변 도메인 상의 경쇄에 대해 카밧(Kabat) 위치 100에, 그리고 중쇄에 대해 위치 44에, 2개의 시스테인을 동시에 도입하였다. 이들 위치는 항체 폴드 내에 구조적으로 보존되므로, 개별 도메인의 완전성을 방해하지 않으면서 시스테인 치환에 내성인 것으로 나타났다.
표 15에 나타낸 바와 같이, 각각의 가변 도메인 상의 경쇄에 대해 카밧 위치 100에, 그리고 중쇄에 대해 위치 44에 시스테인 잔기가 도입된 CODV 및 CODV-Ig 작제물은, 이들 위치에 시스테인 잔기가 도입되지 않은 CODV 및 CODV-Ig 작제물보다 더욱 높은 융점 온도를 가졌다(예를 들면, 배치 ID 번호 704와 706 및 배치 ID 번호 713과 714 참조).
1. CODV 및 TBTI 변이체의 열안정성 측정
CODV 및 TBTI 변이체의 융점(Tm)은 시차 주사 형광측정기(DSF)를 이용하여 측정하였다. 샘플을 D-PBS 완충액(인비트로젠)에 0.2㎍/μl의 최종 농도로 희석시키고, 화이트 세미-스커트 96-웰 플레이트의 D-PBS 중에 SYPRO-Orange 염료의 40배 농축 용액(인비트로젠) 2μl에 첨가하였다. 모든 측정은 MyiQ2 실시간 PCR 기기(바이오래드)를 이용하여 이중으로 행하였다. Tm값은 iQ5 소프트웨어 v2.1을 이용한 융점 곡선의 음의 1차 도함수로부터 도출되었다.
이어서, 링커에 또는 가변 영역 내에 직접 시스테인 잔기를 도입하는 것의 효과를 검사하였다. 이러한 실시예에서, 배치 ID 번호 204(실시예 7 및 표 8)는 모델 CODV-Ig 결합 단백질로서 사용하였고, 시스테인은 L1, L3 또는 3차원 모델에 기초한 가변 영역에서 글리신에 대해 치환되었다. 하기 표 16에 나타낸 바와 같이, 결과는 시스테인 쌍의 도입이 수율 및 응집에 어떻게 영향을 미치는지를 나타낸다. 가시화된 돌연변이는 모두 모델링되어 디설파이드 결합이 적절하게 형성되고 모델에서 링커에 정확한 기하학적 구조 및 이들의 환경이 유지되었다는 것이 확인되었다. 그럼에도 불구하고, 배치 ID 번호 808은 우수한 수율을 나타냈고, 응집을 거의 나타내지 않았으므로, 적절한 시스테인 가교가 형성될 수 있었음을 시사하였다.
본 발명은 각종 실시형태의 관점에서 기술되었지만, 변이 및 변형이 발생할 것이라는 것이 당해 분야 숙련가에게 이해된다. 따라서, 첨부된 특허청구범위는 청구된 본 발명의 범위 내에 있는 이러한 모든 동등한 변이를 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 본원에 사용된 상기 섹션은 구성적 목적만을 위한 것이고, 기술된 대상체를 제한하는 것으로 구성되는 것은 아니다.
본원에 기재된 각각의 실시형태는 반대인 것으로 명백하게 나타내지 않는 한 임의의 다른 실시형태 또는 실시형태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 나타내어진 임의의 특징 또는 실시형태는, 반대인 것으로 명백하게 나타내지 않는 한 바람직하거나 유리한 것으로 나타내어진 임의의 다른 특징 또는 특징들, 또는 실시형태 또는 실시형태들과 조합될 수 있다.
본 출원에 인용된 모든 참조문헌은 본원에 참조에 의해 명확히 포함된다.
[표 14]
Figure pat00015
[표 15]
Figure pat00016
[표 16a]
Figure pat00017
[표 16b]
Figure pat00018
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> DUAL VARIABLE REGION ANTIBODY-LIKE BINDING PROTEINS HAVING CROSS-OVER BINDING REGION ORIENTATION <130> 11-414-WO <150> US 61/468,276 <151> 2011-03-28 <150> FR 1160311 <151> 2011-11-14 <160> 60 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody light chain (VL) from anti-IL4 <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized heavy chain V region (VH) from anti-IL4 antibody 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V-Ig having code HC10 <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 145 150 155 160 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 180 185 190 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 195 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Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His 85 90 95 Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 115 120 125 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val 130 135 140 Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 145 150 155 160 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg 165 170 175 Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 180 185 190 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr 195 200 205 Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 245 250 255 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 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Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 115 120 125 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser 130 135 140 Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 165 170 175 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 180 185 190 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr 195 200 205 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 225 230 235 240 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 245 250 255 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 260 265 270 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 275 280 285 Asp Ser Thr Tyr 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135 140 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 145 150 155 160 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 165 170 175 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 180 185 190 Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala 195 200 205 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 225 230 235 240 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 245 250 255 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 260 265 270 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 275 280 285 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 290 295 300 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 305 310 315 320 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 325 330 <210> 47 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain sequence for cross over dual V-Ig having code LC17 <400> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr 115 120 125 Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly 130 135 140 Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu 145 150 155 160 Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 165 170 175 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu 180 185 190 Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide linker <400> 59 Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly 1 5 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence from hinge region of IGHG1 <400> 60 Asp Lys Thr His Thr 1 5

Claims (1)

  1. 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 항체-유사 결합 단백질로서,
    2개의 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 I로 나타내어지는 구조를 갖고,
    2개의 폴리펩타이드 쇄는 하기 화학식 II로 나타내어지는 구조를 갖고,
    이때, 상기 화학식 I의 폴리펩타이드와 상기 화학식 II의 폴리펩타이드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하는, 항체-유사 결합 단백질.
    [화학식 I]
    VL1-L1-VL2-L2-CL
    [화학식 II]
    VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc
    상기 화학식 I 및 II에서,
    상기 VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
    상기 VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
    상기 VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
    상기 VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
    상기 CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
    상기 CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이고;
    상기 Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
    상기 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이다.
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