KR20190049091A - 오리엔티아 쯔쯔가무시 균주의 표면 단백질 tst56에 대해 특이적으로 결합하는 변형된 rna 압타머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가을철 급성 발열성 질환 중 하나인 쯔쯔가무시증(Tsutsugamushi disease)의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia Tsutsugamushi) 균주의 표면단백질 TST56에 특이적으로 결합하는 변형된 RNA 압타머(Aptamer)에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 오리엔티아 쯔쯔가무시 균주의 표면 단백질 TST56에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 포함하는 단일가닥 핵산 압타머를 제공하고 그 염기 중 우라실(U) 및 시토신(C)의 2'히드록실기가 플루오르로 치환되어 있는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 가짐으로써 쯔쯔가무시증의 주요 원인이 되는 쯔쯔가무시 균의 검출에 유용한 변형된 RNA 압타머를 제공한다.

Description

오리엔티아 쯔쯔가무시 균주의 표면 단백질 TST56에 대해 특이적으로 결합하는 변형된 RNA 압타머{Modified RNA aptamer specifically binding to surface protein TST56 of the orientia tsutsugamushi Kato strain}
본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균주의 표면 단백질 TST56에 특이적으로 결합하는 변형된 RNA 압타머에 관한 것이다.
최근 20여년간 신종 및 재출현 감염병에 의한 유행이 세계적으로 인류에게 직접적인 보건의 위해를 끼침과 동시에 막대한 사회, 경제 피해를 초래하는 경우가 점차 빈발하고 있으며 이런 신종 감염병의 약 75%는 인수공통 또는 매개체 관련 감염병이 차지한다.
최근 발생빈도가 급속히 증가는 보이는 인수공통 감염병 중 쯔쯔가무시증, 렙토스피라증, 발진열 등으로 대표되는 가을철 급성열성질환은 공통적으로 열이 나면서 감기몸살과 같은 증상이 생기며 적절한 치료를 하지 않을 경우 여러 가지 합병증이 생겨 사망할 수 있는 질환이다.
2009년 이후 매년 증가하고 있는 쯔쯔가무시증은 진드기티푸스, 덤불티푸스, 초원열, 잡목열 등으로 불리는 발열성 질환의 일종으로 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)에 의해 감염된 털진드기의 유충이 사람을 물 때 그 미생물이 인체 내로 들어가 혈액과 림프(액)을 통해 전신에 퍼져 발열과 혈관염을 유발하는 감염질환이다.
쯔쯔가무시증의 주요 발생국은 한국, 일본, 중국, 대만, 필리핀 등의 아시아 지역과 러시아 극동지역, 호주 북부 지역이 포함되어 있다. 쯔쯔가무시증의 감염균주는 발생 지역에 따라 다양한 유전형으로 존재하며, 일본에서 유래된 Kato종의 경우 Gilliam과 Karp와 더불어 대표적인 균주에 속한다.(비특허문헌 1,2 참조)
쯔쯔가무시와 같은 급성열성 질환의 진단은 가피와 발진 등 특징적인 소견을 보여 임상적으로 진단할 수도 있으나 실제로 쯔쯔가무시병 환자에서 발진이나 가피가 동반되지 않은 경우도 종종 발생하므로 임상증상만으로 쯔쯔가무시병을 진단하기 어려운 경우도 많아, 혈청학적 진단 방법, 유전자 검출법이나 균분리 등으로 확진한다.
혈청학적 진단은 가장 흔히 사용되는 진단법으로 혈액 중에 특정 감염으로 인하여 생긴 항체가 존재하는지를 조사해서 진단하는 검사법으로 항원이 포함된 슬라이드에 일차적으로 환자의 혈청 내 면역 항체가 결합하고, 이차적으로 면역항체에 이차 형광항체가 결합하게 되어 현미경을 통해 특정 단백질이 형광으로 염색되어 있는 것을 확인하는 간접면역 형광시험법(Indirect immunofluorescent antibody, IFA), 간접면역형광검사법과 유사하나, 형광이 결합된 이차항체 대신에 이차 항체에 효소를 결합시킨 후, 간단한 기질 용액에 의해서 색깔이 변하면 흡광도를 측정하여 정량하는 효소면역 측정법(Indirect immunoperoxidase test) 등이 있으나 숙련된 전문가, 고가의 장비, 오랜 시간 등이 걸리는 단점이 있다. 추가로 환자의 혈액에 존재하는 균을 세포배양을 이용하여 분리하거나 쥐를 이용하여 균을 분리하는 균분리, 혈액 내 균으로부터 유전자를 추출하고 증폭시켜서 형광으로 진단하는 PCR에 의한 유전자 검출법(PCR test, Nested PCR test) 등이 있으나 이 또한 시간이 오래 걸리고 숙련된 전문가, 고가의 장비가 필요하다.
급성열성질환 중 렙토스피라증, 쯔쯔가무시증, 발진열은 유사임상을 보이는 감별진단이 필요한 질환으로 특히, 대증적인 치료 외에 초기에 항생제를 치료하지 않을 경우 패혈성 쇼크, 호흡 부전, 신부전, 의식저하 등의 합병증이 생기거나 사망에 이르는 경우도 있어 신속 정확한 조기진단이 매우 중요하다.
특히, 쯔쯔가무시증은 발생 초기에는 항생제 치료가 가능하나 치료시기를 놓치면 합병증으로 인한 치사율이 30%에 달하며, 쯔쯔가무시증에서 나타나는 가장 큰 특징인 가피가 없는 경우가 환자의 40%를 차지하기 때문에 오진으로 인한 잘못된 치료를 받거나 방치하여 악화되는 경우가 빈번하다. 종래의 진단법들에서 살펴본 바와 같이 신속정확하고 전문인력의 도움없이도 어디서든 검사할 수 있는 간편함과 객관적인 해석이 가능한 혈청학적 진단법 기반의 신속 진단이 꼭 필요하다. 종래의 혈청학적 진단법은 감염자의 혈액에서 항원 단백질과 반응하는 항체를 검출하는 방법으로 다른 항원과의 비특이적인 반응에 의한 교차반응이 빈번하게 나서 민감도와 특이도가 낮은데 이를 개선할 필요성이 있다.
압타머는 단백질 항체와 달리 3차원을 인지하는 결합구조로 표적 단백질과 높은 특이도와 친화도를 갖기 때문에 교차 반응을 최소화 할 수 있다. 또한 압타머는 단백질인 항체 분자에 비해 열적, 화학적 안정성이 높으며 내구성이 뛰어나기 때문에 의약적인 목적뿐만 아니라 진단 등의 체외 활용에도 이용될 수 있는 장점을 가지고 있다. 주로 동물세포에서 생산이 진행되기 때문에 생산성이 낮은 항체에 비해 유기합성으로 생산하는 압타머는 대량 생산이 용이해 생산 용이성과 수가 측면에서 장점이 있고 변함없는 품질을 유지할 수 있다.
가을철 급성 열성 질환인 쯔쯔가무시증의 진단에 용이한 압타머를 발굴하여 기존 항체를 대체한다면 종래의 혈청학적 진단법의 단점을 개선할 수 있다.
널리 알려진 바와 같이 핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체로서, 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로서 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)으로 이루어져 있다.
핵산은 단일가닥이나 이중가닥으로 존재하는데, 단일가닥은 특정한 물리적인 조건에서 뉴클레오티드들 간의 수소결합 및 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.
일반적으로 DNA와 RNA와 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소로서의 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다.
핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.
핵산이 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 핵산들을 선별되고 있다.
특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법을 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponentialenrichment)라 하고, 이렇게 선별된 산물인 핵산을 통상 압타머라고 칭한다(비특허문헌 3 참조).
이런 SELEX를 통하여 자연 상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다.
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본 발명은 가을철 급성 열성 질환인 쯔쯔가무시증의 진단용 변형된 RNA 압타머 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균주의 표면 단백질 TST56에 특이적으로 결합하며, U(우라실)과 C(시토신)의 2' 히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 또는 2를 갖는 표면 단백질 특이 결합 성질의 변형된 RNA 압타머를 제공한다.
이상에서 설명한 본 발명에 따른 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 TST56 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 변형된 RNA 압타머에 의하면, 본 발명의 변형된 RNA 압타머와 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 TST56 표면 단백질의 특이적인 결합 및 결합양상을 검출하여 쯔쯔가무시증을 보다 신속하고 정확하게 진단할 수 있으므로, 쯔쯔가무시증 환자에게 보다 나은 양질의 의료 서비스를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 His-tag이 부착된 TST56 단백질 정제 산물의 SDS-PAGE 도면으로 T6 내지 T11은 단백질 정제과정의 분획 시료를 나타낸 것이다.
도 2는 SELEX 각 10개의 반복(Round)당 PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동 도면이며, 1번째 반복(1R) 내지 10번째 반복(10R)한 시료의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 T7 RNA 중합효소 프로모터 부분이 제거된 PCR 단편의 아가로스 겔 전기영동 도면으로 SELEX 5번째(1)와 10번째(2) 시료의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 NGS 서열 분석에 대한 통계 표이며, 분석된 서열의 최대 빈도수, 분석된 서열의 총 종류 수, 시료당 총 분석 서열 수를 나타낸 것이다.
도 5는 NGS 서열 분석에 대한 통계 도면이며, 분석된 서열의 최대 빈도수, 분석된 서열의 총 종류 수, 시료당 총 분석 서열 수를 도표화 한 것이다.
도 6은 염기서열 1에 대한 RNA 압타머 2차구조 도면으로, 염기서열의 구조도와 깁스 자유 에너지 값을 나타낸 것이다.
도 7은 염기서열 2에 대한 RNA 압타머 2차구조 도면으로, 염기서열의 구조도와 깁스 자유 에너지 값을 나타낸 것이다.
본 발명은 가을철 급성 열성 질환인 쯔쯔가무시증 진단에 유용한 변형된 RNA 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 변형된 RNA 압타머는 쯔쯔가무시증의 원인균 중 하나인 오리엔티아 쯔쯔가무시의 Kato종에 존재하는 표면단백질 TST56에 대하여 특이적으로 결합한다.
본 발명에 따른 변형된 RNA 압타머는 각 서열의 염기 중 우라실(U)과 시토신(C)의 2'히드록실기가 플루오르기로 치환되어 있는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함한다. 이러한 염기 구조의 변형은 RNA 분해효소에 저항성이 있는 변형된 RNA를 제조하기 위함이다.
상기 서열번호 1과 2의 RNA 압타머 염기서열은 아래와 같다.
5' GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCGCCGCGUUGUUCAAUCAUCGUGUCCGUAUCAGUGCGUUUC
CAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC 3' (서열번호 1)
5' GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCAUGUGACCGCUGUCCAUUUUUAGACCGUAACAUUUGGAUC
CAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC 3' (서열번호 2)
이하, 첨부도면과 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 구체적인 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.
실시예 1: 쯔쯔가무시증의 항원 표면 단백질 제작
쯔쯔가무시증의 원인이 되는 오리엔티아 쯔쯔가무시 Kato 종에 존재하는 TST56 표면 단백질의 유전정보(GeneBank acession number:M63382.1)를 기초로 Primer 1과 2를 제작하고 PCR 단편을 증폭하였다.(비특허문헌 4 참조)
상기번호 Primer 1과 2의 염기 서열은 아래와 같다.
5' CCGGCGATGGCCATGAAAAAAATTATGTTAATTG 3' (Primer 1)
5' GGTGGTGGTGCTCGAGGAAGTTATAGCGTACACC 3' (Primer 2)
해당 유전자 PCR 단편을 pET22b 발현 벡터의 NcoI과 XhoI 제한효소 자리에 삽입하였다. 유전자가 삽입된 벡터의 XhoI 제한효소 자리에 발현 단백질의 불용성화를 줄이기 위해 양 말단이 XhoI 제한효소 자리로 설계된 IF2 도매인 단편을 추가하였다. 유전자와 C-말단에 IF2 도메인이 삽입된 벡터를 대장균에 형질전환하여 아미노산 서열 C-말단에 6개의 히스티딘 말단(His-tag)이 부착된 단백질을 생산하였다(도면 1).
실시예 2: RNA 압타머 라이브러리 제작
SELEX 과정으로 TST56 단백질에 결합하는 RNA 압타머를 선별하기 위하여 40개의 무작위 서열을 포함하며 양 끝에 특정 서열을 갖는 92 개의 단일 올리고 뉴클레오티드 서열을 설계하였다. 합성된 단일 올리고 뉴클레오티드 단편을 주형으로 RNA 라이브러리를 제조하기 위하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 DNA 라이브러리를 증폭하였다. PCR 증폭 과정에는 단일 올리고 뉴클레오티드 서열의 특정 서열을 포함한 Primer 3과 4를 사용하였으며, RNA 합성을 위하여 Primer 3에 T7 RNA 중합효소의 프로모터 부분을 포함시켰다.
상기번호 Primer 3과 4의 염기 서열은 아래와 같다.
5' GGGGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG 3' (Primer 3)
5' GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG 3' (Primer 4)
PCR 증폭 과정의 구성 시약으로 0.25 μM Primer 3과 0.25 μM Primer 4, 10X PCR 버퍼, 200 μM dNTP 혼합물, DNA Taq 중합효소(BioFact) 5 유닛을 혼합하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 반응 시킨 후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 설정하여 20 사이클을 반복한 뒤 72℃에서 5분동안 반응시키는 방법으로 다양한 DNA 라이브러리를 제조하였다.
T7 중합효소의 프로모터를 포함하는 DNA 라이브러리를 주형으로 T7 RNA 중합효소(Epicentre Technologies)를 이용하여 RNA 라이브러리를 제조하였다. RNA 분해효소에 대한 저항성을 지니기 위하여 CTP와 UTP의 2'히드록시기가 플루오르기로 치환된 피리미딘 염기(Epicentre Technologies)를 사용하여 시험관 내 전사과정을 수행하였다.(비특허문헌 5 참조)
시험관 내 전사과정은 RNA 라이브러리를 제조하기 위해 DNA 라이브러리, 10X 전사버퍼, 5 mM DTT, 5 mM ATP, GTP, 2'-F CTP, 2'-F UTP, T7 중합효소 혼합물(Epicentre Technologis)을 혼합한 후 37℃에서 4시간동안 반응하였다. 합성된 RNA 시약에 DNaseI(Epaicentre Technologies)을 첨가하고 37℃에서 15분간 반응시켜 주형으로 사용한 DNA를 제거한 후 Ethanol 침전법으로 RNA 라이브러리를 제작하였다.
RNA 라이브러리는 A와 G, 그리고 2'히드록시기가 플루오르기로 치환된 C와 U의 염기가 N40 위치에 각각 같은 몰로 혼입된 아래의 서열을 갖는다.
상기번호 염기서열 3의 RNA 라이브러리 서열은 아래와 같다.
5' GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCN40CAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC 3' (염기서열3)
실시예 3: SELEX를 이용한 RNA 압타머 발굴
SELEX 기술을 활용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시의 표면 단백질 TST56에 결합하는 RNA 압타머를 분리하였다. (비특허문헌 6, 7 및 8 참조)
이하 SELEX 방법은 아래와 같다.
Ni-NTA 아가로스 비드와 반응하는 비특이적 RNA를 제거하기 위하여 150 pmol의 RNA 라이브러리와 Ni-NTA 아가로스 비드를 200 ㎕의 결합 완충액(30 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM dithiothreitol, and 1 % BSA)과 혼합하여 실온에서 20분동안 반응시켰다. 반응 후 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 결합 완충액에 RNA 라이브러리와 TST56 단백질을 Ni-NTA 비드와 혼입하고 실온에서 20 분간 반응시켰다. Ni-NTA 아가로스 비드에 TST56 단백질과 RNA 복합체를 400 ㎕ 결합완충액으로 5번 씻어내고 95℃에서 5분간 가열하여 단백질로부터 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 역전사 효소(BioFact)로 반응시킨 후 PCR을 통하여 첫번째 SELEX 산물을 얻었다. 위의 과정을 총 10번 반복하고 각 반복마다 PCR 단편을 얻어 서열 분석에 사용하였다.(도면 2)
실시예 4: SELEX 산물을 이용한 NGS 서열 분석
SELEX 반복 과정으로 얻은 5 번째와 10번째 PCR 산물을 NGS 서열분석에 사용하여 TST56 단백질과 반응하는 압타머의 염기서열을 분석하였다.(비특허문헌 9 참조)
NGS 서열 분석에 SELEX의 PCR 산물을 사용하기 위해 T7 RNA 중합효소의 프로모터 부분을 제거한 Primer 5를 제작하였다.
상기번호 primer 5의 염기 서열은 아래와 같다.
5'GCGGAAGCGTGCTGGGCC3' (Primer 5)
PCR 증폭 과정의 구성 시약으로 0.25 μM Primer 4와 0.25 μM Primer 5, 10X PCR 버퍼, 200 μM dNTP 혼합물, DNA Taq 중합효소(BioFact) 5 유닛을 혼합하였으며, 95℃에서 5분간 반응 시킨 후 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 10 사이클을 반복한 뒤 72℃에서 5분동안 반응시키는 방법으로 PCR 단편을 얻었다.(도면 3)
NGS 서열 분석의 결과로 92개의 RNA 염기서열을 지닌 서열번호 1과 서열번호 2의 RNA 압타머들을 발굴하였다.
NGS 결과로 SELEX의 5번째와 10번째 산물에서 분석된 서열의 최대 빈도수, 분석된 서열의 총 종류 수, 시료당 총 분석 서열 수를 확인하였으며(도면 4), 이와 같은 결과를 도표로 나타내었다.(도면 5) 이에 대한 결과로 SELEX의 반복 횟수가 증가될수록 SELEX 산물에 포함된 특이 서열의 빈도수가 증가하는 것과 분석된 서열의 총 종류 수가 증가하므로 비특이적인 서열이 제거되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 5: RNA 2차구조 확인
염기서열 1과 염기서열 2의 RNA 2차 구조를 mfold 프로그램을 통하여 예측하였으며, 이에 대한 각 구조의 깁스 자유 에너지 값을 도출하였다.(비특허문헌 10 참조)
염기서열 1에 대한 RNA 2차 구조는 3가지의 형태로 확인되며, 깁스 자유 에너지 값은 각각 -35.8(kcal/mol), -34.6, -34.2로 안정한 값을 가진다.(도면 6) 염기서열 2의 경우도 1가지 형태의 RNA 2차 구조를 형성하며 -34.9(kcal/mol)의 깁스 자유 에너지 값을 지닌 구조이다.(도면 7) 염기서열 1과 염기서열 2의 92개 RNA 염기서열들은 스템루프(Stem-loop)의 형태의 안정한 구조를 이루고 있다.
<110> BIOIS <120> TST56 <130> T-1 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orientia tsutsugamushi <400> 1 gggagagcgg aagcgugcug ggccgccgcg uuguucaauc aucguguccg uaucagugcg 60 uuuccauaac ccagaggucg auggaucccc cc 92 <210> 2 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orientia tsutsugamushi <400> 2 gggagagcgg aagcgugcug ggccauguga ccgcugucca uuuuuagacc guaacauuug 60 gauccauaac ccagaggucg auggaucccc cc 92 <210> 3 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Aptamer sequence <400> 3 gggagagcgg aagcgugcug ggccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnncauaac ccagaggucg auggaucccc cc 92

Claims (2)

  1. 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 TST56 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 변형된 RNA 압타머
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1 또는 2의 우라실(U) 및 시토신(C)은 2'히드록실기가 플루오르기로 치환된 형태의 변형된 RNA 압타머
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