KR20190041959A

KR20190041959A - 고효율 줄기세포 선별을 위한 grp78 유래 펩타이드

Info

Publication number: KR20190041959A
Application number: KR1020180122816A
Authority: KR
Inventors: 박윤신; 박윤정; 정종평; 이주연
Original assignee: 주식회사 나이벡; 서울대학교산학협력단; 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-13
Filing date: 2018-10-15
Publication date: 2019-04-23
Also published as: US20200369753A1; CN111727374A; CN111727374B; EP3696547A1; WO2019074343A1; EP3696547A4; US11760792B2; KR102210543B1

Abstract

본 발명은 고효율 줄기세포 선별을 위한 GRP78 유래 펩타이드 및 그 이용에 관한 것으로, 보다 자세하게는 세포 표면의 GRP78 단백질의 결합부위 (binding domain)에 결합할 수 있는 GRP78 유래 펩타이드를 표지자로 활용하여 고효율의 줄기세포 선별에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GRP78의 아미노산 서열 중, 고효율의 줄기세포를 인식할 수 있는 특정 아미노산 서열을 포함하는 GRP78 유래 펩타이드는 노화되지 않은 고효율의 줄기세포만을 선별하는 것이 가능하다. 또한, GRP78 유래 펩타이드를 줄기세포에 처리 또는 도입하면 줄기세포의 효율을 증진시킬 수 있으므로, 치료 효능이 우수한 줄기세포 치료제 제조에 유용하다.

Description

고효율 줄기세포 선별을 위한 GRP78 유래 펩타이드 {Peptide derived from GRP78 for Selecting Highly Efficient Stem Cell}

본 발명은 고효율 줄기세포 선별을 위한 GRP78 유래 펩타이드 및 그 이용에 관한 것으로, 보다 자세하게는 세포 표면의 GRP78 단백질의 결합부위 (binding domain)에 결합할 수 있는 GRP78 유래 펩타이드를 표지자로 활용하여 고효율의 줄기세포 선별에 관한 것이다.

최근 배아줄기세포, 성체줄기세포 등의 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킴으로써, 세포치료법(cell therapy)으로서의 활용 가능성에 관한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 다분화능이 있는 배아줄기세포는 다양한 세포로 분화됨으로써 세포치료제로 주목되었지만 배아줄기세포를 활용함에 있어 윤리적인 문제점 때문에 실질적으로 세포 치료로 사용하기에 어려움을 가지고 있다. 이러한 윤리적인 문제점을 회피하기 위하여 성체줄기세포를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Trends in Neurosciences 23:450, 2000).

성체줄기세포는 타인에게 이식할 때 감염의 위험이나 분화능력이 상대적으로 떨어지는 단점이 있지만, 세포 수를 많이 얻을 수는 있으며, 의학적으로 적용하기에 대단히 안전하다는 특징이 있다. 구체적으로, 장기재생을 위해 몸 안에 이식하여도 암이 발생하지 않으며, 성인의 몸속에 있었기 때문에 면역거부반응이 발생하지 않아 자기 자신의 세포를 사용하는 자가 이식(autologous transplantation)이 가능하다. 또한, 주변조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화능력(site-specific differentiation)이 있고, 미분화 상태에서 주입하여도 암을 유발하지 않기 때문에 이식된 이후 당장 필요한 세포를 만들어내는 것 이외에도 나중에 필요한 미분화 상태의 줄기세포를 다시 만들어서 저장하는 자가 재생산(self-renewal) 능력이 있는 장점이 있다 (JACC: Basic to Translational Science 2:702-716, 2017).

줄기세포의 치료제로의 개발과정 중, 최적 치료효과를 갖는데 필요한 세포 숫자를 획득하기 위해서는 분리한 줄기세포를 오랜 기간 배양하는 과정이 필수적이다. 장기간의 배양으로 인해 노화된 세포가 다수 혼재된 상태 혹은 다양한 단계의 계대별 세포가 혼재된 상태로 치료제 개발이 수행될 수 밖에 없다. 이는 줄기세포 치료제의 안정성, 유효성 뿐만 아니라, 정도 관리에 문제점을 야기할 수 있다 (European Cells and Materials 31:136-159, 2016). 따라서, 성체줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발을 위해서는, 장기간의 배양으로 인해 혼재되어 있는 노화 세포를 선별하는 과정이 필요하다. 실제 줄기세포치료제의 정도 관리를 위한 다각적인 노력들이 지속되고 있지만, 명확한 지표물질로 확립된 것은 미비한 실정이다.

한편, GRP78은 HSP 70 family chaperone 단백질로 ER lumen내 존재한다. 이는 ER 내로의 단백질 수송/전달에 관한 중요한 인자이며 세포내 칼슘 항상성 유지에 핵심이 되는 기능성 단백질이다. 이 단백질은 두 개의 도메인으로 연결되어 있는데 하나는 ER내 뉴클레오타이드, 더욱 자세하게는 ATP를 결합하여 분해하는 도메인이며 (Nuecleotide binding domain, NBD), 다른 하나는 ATPase등의 대사효소 및 대사관련 단백질 및 대사기질 (예: ADP)과 결합하는 기질 결합기능성 도메인 (Substrate binding domain, SBD) 이다 (Gene 618:14-23, 2017). 이들은 세포내의 칼슘농도 및 세포내 ATP농도에 따라 대사가 진행될 때 ATP를 분해하면서 ER 내외의 에너지 대사 및 칼슘대사를 조절한다.

이에, 본 발명자들은 노화된 줄기세포를 제거하고, 고효율의 줄기세포만을 선별할 수 있는 표지 물질을 찾아내고자 예의 연구 노력한 결과, 장기간의 배양 기간 동안 성체줄기세포를 배양하면서 계대 기간이 경과함에 따라 포도당 대사와 연관된 GRP78이라는 단백질이 노화와 관련된 줄기세포의 표지물질로 사용될 수 있음을 확인하고, 또한 GRP78 단백질을 세포로 주입하여 GRP78 단백질 효과를 증진시킬 수 있음을 확이하고, 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 성체줄기세포를 활용한 줄기세포 치료제의 개발 및 이의 품질 관리를 위한 지표 물질인 GRP78의 아미노산 서열 중, 고효율의 줄기세포를 인식할 수 있는 특정 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 GRP78 단백질의 효과를 증진시킬 수 있는 펩타이드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 효능이 우수한 줄기세포 치료제 제조를 위해, 상기 펩타이드를 이용한 고효율의 줄기세포를 선별 방법 또는 줄기세포의 효율 증진 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 고효율 줄기세포 선별용 또는 줄기세포 효율 증진용 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 이용한 고효율의 줄기세포를 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 줄기세포에 처리하여 줄기세포의 효율을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 줄기세포의 효율 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 GRP78의 아미노산 서열 중, 고효율의 줄기세포를 인식할 수 있는 특정 아미노산 서열을 포함하는 GRP78 유래 펩타이드는 노화되지 않은 고효율의 줄기세포만을 선별하는 것이 가능하다. 또한, GRP78 유래 펩타이드를 줄기세포에 처리 또는 도입하면 줄기세포의 효율을 증진시킬 수 있으므로, 치료 효능이 우수한 줄기세포 치료제 제조에 유용하다.

도 1은 젊은 세포와 노화된 세포를 대상으로 단백체 분석 결과 유의적인 변화를 보이는 단백질의 목록이다.
도 2는 노화된 세포에서 유의적으로 감소한 경향을 보인 GRP78 단백질의 MALDI-TOF-TOF 분석결과 규명된 펩타이드 피크 그림이다.
도 3은 MALDI-TOF-TOF 분석결과, GRP78 인식 부위로 조사된 야생형 펩타이드 서열 및 변이형 펩타이드 서열이다.
도 4는 단백질 구조 및 서열분석 결과, GRP78 단백질 전체 서열 중 인산화 및 산화반응 가능성이 있는 것으로 조사된 펩타이드 서열이다.
도 5는 GRP78 유래 펩타이드 중 핵내 뉴클레오티드에 결합하는 펩타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 GRP78 유래 펩타이드 중 기타 기질에 결합하는 펩타이드 서열을 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 성체 줄기세포의 노화 진행에 따른 단백체 변화를 조사하여, 노화된 줄기세포에서 발현 변화가 유의한 GRP78 (Glucose-regulated protein 78)을 동정하였다. 젊은 고효율의 줄기세포와 비교하여 노화된 줄기세포에서는 GRP78 유전자 및 단백질의 발현이 유의하게 감소하였다. 이에, GRP78 단백질내 아미노산 서열을 MALDI-TOF/TOF로 분석하여, GRP78 인식 부위로 조사된 야생형 펩타이드 서열 및 변이형 펩타이드 서열을 얻고, 단백질 구조 및 서열을 분석하여 GRP78 단백질 전체 서열 중 인산화 및 산화반응 가능성이 있는 펩타이드 서열을 얻었다. 또한, Endoplasmic reticulum chaperone BiP 단백질을 활용하여 핵내 뉴클레오티드에 결합하는 GRP78 선별용 펩타이드 및 기타 기질에 결합하는 GRP78 선별용 펩타이드를 합성하였다.

본 발명의 GRP78 유래 펩타이드는 세포 표면 표지자로 활용하여 세포 표면에 있는 GRP78 단백질의 결합부위 (binding domain)에 결합시켜 GRP78를 표지하는 세포를 선별할 수 있으며, GRP78 단백질의 발현이 감소한 세포에 GRP78 유래 펩타이드를 처리 또는 도입시켜 GRP78 단백질 효과 증진을 도모할 수 있다.

따라서, 본 발명은 일관점에서, 서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 고효율 줄기세포 선별용 또는 줄기세포 효율 증진용 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 GRP78 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 GRP78의 염기서열 및 아미노산 서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다 (예: GenBank Accession AAA52614.1).

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 GRP78의 1-32 부위를 인식하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 1-32 야생형 인식부위 (WT): MEHRTRSWALGLSILGFFALLFSAGFVQQAHA (서열번호 1), 1-32 변이형 인식부위 (KO1): MEHRNRSWALGLSILGFFALLFSAGFVQQAHA (서열번호 2) 및 1-32 변이형 인식부위 (KO2): MDHRNRSWALGLSILGFFALLFSAGFVQQAHA (서열번호 3)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 GRP78 단백질의 인산화 또는 산화 반응 부위를 인식하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 139-152 TFAPEEISAMVLTK (서열번호 4), 186-197 DAGTIAGLNVMR (서열번호 5) 및 325-336 AKFEELNMDLFR (서열번호 6)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 7 내지 14의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 GRP78의 125-280 부위인 것을 특징으로 할 수 있고, GRP78이 조절하는 핵내 ATP를 인식하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 KPYIQVDIGGGQTKTFAPEEISA (서열번호 7), MVLTKMKETAEAYLGKKVTH (서열번호 8), AVVTVPAYFNDAQRQAT (서열번호 9), KDAGTIAGLNVMRIINEPTAAA (서열번호 10), IAYGLDKREGEKNILVFDLGGG (서열번호 11), TFDVSLLTIDNGVFEV (서열번호 12), VATNGDTHLGGEDFDQRV (서열번호 13), MEHFIKLYKKKTGKDVRK (서열번호 14)인 것을 특징으로 할 수 있다.

GRP78은 ER (endoplasmic reticulum) 내에서 ATP와 칼슘의 항상성을 조절하고, ATP가 뉴클레오타이드이므로, 상기 서열번호 7 내지 14의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 NBD (nucleotide-binding domain)를 가지는 펩타이드인 것이 바람직하며, ER 내에서 ATP와 칼슘의 항상성을 조절하여 줄기세포의 효율을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 15 내지 18의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 GRP78의 420-500 부위인 것을 특징으로 할 수 있고, GRP78이 조절하는 핵내 ATP 분해산물인 기타 기질을 인식하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 CPLTLGIETVGGVMTKLIPR (서열번호 15), NTVVPTKKSQIFSTASDNQP (서열번호 16), TVTIKVYEGERPLTKDNHLL (서열번호 17), GTFDLTGIPPAPRGVPQIEVT (서열번호 18)인 것을 특징으로 할 수 있다.

GRP78은 ER (endoplasmic reticulum) 내에서 ATP와 칼슘의 항상성을 조절하고, ATP의 분해과정을 촉진하므로, 상기 서열번호 15 내지 18의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 SBD (substrate-binding domain)를 가지는 펩타이드인 것이 바람직하며, ATP 분해산물과 결합할 수 있도록 하는 기질에 결합하여 줄기세포의 효율을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 GRP78 단백질을 세포표면에 발현하는 줄기세포의 선별할 수 있으며, 노화 또는 외부 자극에 의해 GRP78 단백질의 세포내 발현이 감소한 줄기세포의 세포질 내로 본 발명의 펩타이드를 도입하여 고효율의 줄기세포를 선별하고, 줄기세포능을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 (Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W H Freeman and Co, NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되지만(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al, Eds, CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds, IRL Press, Oxford, England, 1989), 이들로 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al, Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al, J Biol Chem, 255:12073-12080, 1990

본 발명에 있어서, 상기 고효율의 줄기세포는 GRP78을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 고효율의 줄기세포는 노화되지 않은 젊은 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "줄기세포"란, 동물의 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm) 및 외배엽(ectoderm) 유래의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency), 또는 조직 또는 기능에 있어 밀접하게 관련된 세포로 분화할 수 있는 다분화능(multipotency)을 가지는 세포를 의미한다. 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.

본 발명에서 용어, "성체줄기세포"란 각 조직 내 존재하는 줄기세포를 분리해 체외에서 배양한 것으로 다분화능(multipotency)을 가지는 세포를 의미하며, 골수줄기세포, 망막줄기세포, 망막 내 뮐러아교세포, 신경줄기세포 등이 있다. 상기 줄기세포는 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함하는 포유 동물 유래일 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이다.

본 발명에서 용어, "노화"는 개체 연령 증가 또는 계대수의 증가로 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 감소하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "계대(passage)"란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양 배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법에서, 배양용기를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 의미하며, 한 차례 배양용기 교체 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대 (passage)라고 한다. 본 발명에서 계대수가 낮은 또는 젊은 (young) 계대의 줄기세포는 분화능력 또는 치료효과가 높은 줄기세포를 의미하며, 계대수가 높은 또는 노화된 (old) 계대의 줄기세포는 분화능력 또는 치료효과가 낮은 줄기세포를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 젊은 (young) 계대란 계대수가 0 내지 3일 수 있으며, 바람직하게는 0 내지 2일 수 있다. 또한, 노화된 (old) 계대란 계대수가 15 내지 25일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 25일 수 있다.

본 발명에서 젊은 (young) 줄기세포란 계대수가 0 내지 3일 수 있으며, 바람직하게는 0 내지 2일 수 있다. 또한, 노화된 (old) 줄기세포란 계대수가 15 내지 25일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 25일 수 있다.

즉, 본 발명의 "노화된 줄기세포"란 계대수의 증가로 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 감소한 줄기세포를 의미하며, "고효율의 줄기세포"란 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 매우 높아서 세포치료제로 효능이 우수한 줄기세포를 의미한다. 다시 말하면, "고효율의 줄기세포"란 젊은 계대의 줄기세포와 동등한 분화능력 또는 증식능력을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 이용한 고효율의 줄기세포를 선별하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, (a) GRP78 특이적인 펩타이드에 형광물질을 결합시키는 단계; (b) 상기 형광물질이 결합된 펩타이드를 줄기세포에 결합시키는 단계; 및 (c) 형광 현미경을 이용하여 GRP78을 발현하는 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성되고, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 상기 단백질 수준을 측정하는 제재를 포함하는 진단 키트일 수 있으며, 이때 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 상기 단백질에 특이적인 항체이다. 따라서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 키트는, 예컨대, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 포함하는 마커 검출용 키트일 수 있으며, 이러한 키트는 "항원-항체 복합체"를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예컨대, 표지된 2차 항체, 발색단 (chromophores), 효소(예: 항체와 접합) 및 그의 기질 등을 포함할 수도 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

아울러, 상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석방법으로는 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니며 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 줄기세포에 처리 또는 도입시켜 줄기세포의 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 효율이 증진된 줄기세포는 GRP78을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 용어, 줄기세포의 "효율 증진"이란 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 증가하는 것을 의미한다. "고효율의 줄기세포" 또는 "효율이 증진된 줄기세포"란 성체 줄기세포의 분화능력 또는 증식능력이 매우 높아서 세포치료제로 효능이 우수한 줄기세포를 의미한다. 다시 말하면,"고효율의 줄기세포" 또는 "효율이 증진된 줄기세포"란 젊은 계대의 줄기세포와 동등한 분화능력 또는 증식능력을 나타내는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 펩타이드의 처리 또는 도입은 세포 배양 배지에 직접 처리하거나, 배양용 생체재료와 혼합하여 처리할 수 있고, 생체재료란 합성고분자 또는 천연고분자를 말한다.

본 발명에 있어서, 합성고분자는 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콘 및 폴르프로필렌 글리콜인 것이 바람직하며, 천연고분자는 비트로넥틴, 콜라겐, 젤라틴, 알긴산, 황산 콘드로이틴, 피브로넥틴 및 세포외기질 단백질인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 포함하는 줄기세포의 효율 증진용 조성물에 관한 것이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 단백체 분석을 통한 GRP78 단백질의 변화 및 동정

성체 줄기세포의 노화 진행에 따른 단백체 변화를 살펴보기 위해 계대별로 배양한 각 세포 펠렛을 이용하여 단백체 분석을 시행하였다.

(1) 단백질 추출(protein sample preparation)

시료로부터 단백질 추출은 다음과 같이 진행되었다. 시료에 7M urea, 2M Thiourea, 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1%(w/v) dithiothreitol (DTT), 2%(v/v) pharmalyte, 1mM benzamidine로 구성된 2DE lysis solution과 혼합하였다. 그리고, 단백질 추출을 위해서 1시간 동안 vortexing 하였으며, 25℃에서 12,000rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 상층액을 이차원전기영동의 시료로 사용하였다. 단백질의 농도 측정은 Bradford 법으로 수행하였다.

(2) 이차원전기영동(2D electrophoresis)

일차 Isoelectric focusing(IEF)를 위하여 IPG strips은 7M urea, 2M thiourea, 2% 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1% dithiothreitol(DTT), 1% pharmalyte로 구성된 reswelling 용액으로 상온에서 12-16시간 정도 reswelling 되었다. Strip 당 시료는 각각 100ug씩을 사용하였으며, Amersham Biosciences 사의 Multiphore II system을 이용하여 제조회사의 사용메뉴얼을 준수하여 20℃에서 IEF를 수행하였다. IEF 조건은 150V에서 3,500V까지의 도달시간을 3시간 되게 하였으며, 3,500V에서 26시간 지속되도록 하여 최종적으로 96kVh 가 되도록 설정하였다.

이차적으로 SDS-PAGE를 수행하기 전에 IPG Strips을 1% DTT를 함유한 equilibration buffer(50mM Tris-Cl, pH6.8, 6M urea, 2% SDS, 30% glycerol)로 10분간 incubation 하였으며, 곧바로 2.5% iodoacetamide를 함유한 equilibration buffer로 10분간 더 incubation 하였다. Equilibration이 완료된 strips을 SDS-PAGE gels(20x24cm, 10-16%) 위에 배열시키고, Hoefer DALT 2D system(Amersham Biosciences)을 이용하여 20℃에서 최종적으로 1.7kVh가 되게 전개하였다. 이차원전기영동이 완료된 이차원 젤의 단백질은 Oakley(Anal. Biochem. 1980, 105:361-363) 등의 방법에 따라 은염색으로 시각화되었으며, 질량분석기에 의한 단백질 동정을 위하여 glutaraldehyde 처리 단계는 생략되었다. 은염색된 이차원 젤은 AGFA 사의 Duoscan T1200 스캐너로 스캐닝되어 확장자가 TIFF 인 파일의 형태로 컴퓨터에 저장되었다.

(3) 이미지분석(image analysis)

스캐닝된 이미지로부터 단백질 spots의 발현변화 확인을 위한 정량적인 분석은 PDQuest software(version 7.0, BioRad)를 이용하여 수행하였다. 각 spot의 quantity는 total valid sopts의 intensity로 평준화(normalization)되었으며, 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현변화를 보이는 단백질 spots인 Glucose-regulated protein 78(이하 GRP78)을 선정하였다 (도 1).

실시예 2: MALDI - TOF / TOF 분석결과 획득한 GRP78 단백질내 아미노산 서열 분석

2DE분석에서 선정된 단백질 spot을 50% acetonitrile로 washing후 진공건조한 뒤, trypsin을 이용한 in-gel digestion을 실시하였다. BRUKER AUTOFLEX SPEED with LIFT^TM ion optics를 이용하여 분해된 샘플을 분석하였다. 분석된 펩타이드의 질량크기 및 서열 분석결과는 MASCOT search 결과형식으로 제시되었다 (도 2).

실시예 3: GRP78 특이적인 인식 관련 서열

MALDI-TOF-TOF분석결과, GRP78 인식 부위로 조사된 야생형 펩타이드 서열과, 이의 발명자에 의해 개발된 변이형 펩타이드 서열을 도 3에 나타내었다.

1-32 야생형 인식부위 (WT): MEHRTRSWALGLSILGFFALLFSAGFVQQAHA(서열번호 1)

1-32 변이형 인식부위 (KO1): MEHRNRSWALGLSILGFFALLFSAGFVQQAHA(서열번호 2)

1-32 변이형 인식부위 (KO2): MDHRNRSWALGLSILGFFALLFSAGFVQQAHA(서열번호 3)

GRP78 단백질의 첫 번째 아미노산부터 32번째 아미노산 서열로 야생형으로 선택하여 변이형 서열을 선정하였다.

실시예 4: 인산화반응 서열

단백질 구조 및 서열분석 결과, GRP78 단백질 전체 서열 중 인산화 및 산화반응 가능성이 있는 것으로 조사된 펩타이드 서열을 도 4에 나타내었다. 본 실시예에서는 GRP78 단백질의 결합부위 (binding domain)를 갖거나 주요 기능기 (functional domain)를 가질 것으로 예측되는 부위를 선별하여 합성하였다.

139-152 TFAPEEISAMVLTK (서열번호 4)

186-197 DAGTIAGLNVMR (서열번호 5)

325-336 AKFEELNMDLFR (서열번호 6)

실시예 5: GRP78 펩타이드 합성

GRP78 선별용 펩타이드를 합성하기 위하여, 654개 아미노산으로 구성된 Endoplasmic reticulum chaperone BiP [Homo sapiens] (NP_005338.1) (서열번호 19) 단백질을 활용하였다. 또한, 상기 서열 외에 GRP78 결합 도메인인 WIFPWIQL (서열번호 20)을 포함하는 여러 서열을 이용할 수 있다. 자세한 기타 정보는 https://www.uniprot.org/uniprot/P11021에 포함되어 있다.

GRP78 선별용 펩타이는 펩타이드 합성기 (Apex 396, AAPPTec, Louisville, KY, USA)를 사용하여 대량으로 합성하였다. 합성된 펩타이드를 Vydac C18 컬럼 및 0.1 % TFA를 함유하는 물/아세토나이트릴 구배를 사용하여 역상 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 정제하였다. 합성된 펩타이드의 순도는 98% 이상일 때 활용하며, 동결 건조시킨 다음, 사용 시까지 -80 ℃에서 암실에 보관하였다.

(1) 핵내 뉴클레오티드에 결합하는 펩타이드

핵내 뉴클레오티드에 결합하는 GRP78 선별용 펩타이드를 합성하기 위하여, GRP78의 125-280 서열을 함유하는 뉴클레오티드, 아미노산 서열이거나 다음의 서열을 함유하는 것으로 선별하였다.

GRP78의 구조 내 단백질 중 NBD (Nuecleotide binding domain)은 두 개의 큰 구형 도메인 (I, II)으로 나뉘고, 각각의 도메인은 다시 A,B의 서브도메인으로 나뉜다. 즉, NBD는 IA, IB, IIA, IIB의 서열로 나뉘게 되는데 서열번호 7 내지 8은 IA를, 서열번호 9내지 10은 IB, 서열번호 11 내지 12는 IIA, 서열번호 13내지 14는 IIB를 함유하고 있다. 상기 펩타이드는 세포내 GRP78이 조절하는 ATP (뉴클레오타이드)를 인식하여 결합한다.

서열 8종은 다음과 같으며 도 5에 기재하였다.

KPYIQVDIGGGQTKTFAPEEISA (서열번호 7)

MVLTKMKETAEAYLGKKVTH (서열번호 8)

AVVTVPAYFNDAQRQAT (서열번호 9)

KDAGTIAGLNVMRIINEPTAAA (서열번호 10)

IAYGLDKREGEKNILVFDLGGG (서열번호 11)

TFDVSLLTIDNGVFEV (서열번호 12)

VATNGDTHLGGEDFDQRV (서열번호 13)

MEHFIKLYKKKTGKDVRK (서열번호 14)

상기 서열번호 7 내지 8의 펩타이드는 N 말단으로부터 순서대로 F-moc 고체상 화학합성방법(Solid phase peptide synthesis)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척하고, 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 MALDI-TOF 분석을 이용하여 분자량을 확인하였다.

(2) 기타 기질에 결합하는 펩타이드

기타 기질에 결합하는 GRP78 선별용 펩타이드를 합성하기 위하여, GRP78의 420-500 서열이거나 다음의 서열을 함유하는 것으로 선별하였다.

GRP78의 서열 중 SBD (substrate binding domain)는 ATP가 분해될 때 ATP가 GRP 78의 NBD에 결합하고 나면, 구조상의 변화가 일어나 NBD에서 일어나는 분해과정을 촉진하도록 한다. SBD는 두 개의 도메인으로 나뉘는데, SBD알파와 SBD베타로 나뉘며 각각 서열번호 15 내지 16 및 17 내지 18이 두 개의 도메인을 나타내도록 하였다. 상기 펩타이드는 GRP78이 조절하는 ATP가 분해되어 생성되는 분해산물과 결합하는 기질과 결합하는 펩타이드로, 분해과정을 더욱 촉진할 수 있다.

서열 4종은 다음과 같으며 도 6에 기재하였다.

CPLTLGIETVGGVMTKLIPR (서열번호 15)

NTVVPTKKSQIFSTASDNQP (서열번호 16)

TVTIKVYEGERPLTKDNHLL (서열번호 17)

GTFDLTGIPPAPRGVPQIEVT (서열번호 18)

상기 서열번호 15 내지 18의 펩타이드는 F-moc 고체상 화학합성방법(Solid phase peptide synthesis)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척하고, 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였다. 정제된 펩타이드는 MALDI-TOF 분석을 이용하여 분자량을 확인하였다.

실시예 6: 합성 GRP78 펩타이드를 이용한 줄기세포 선별

실시예 3 내지 5에서 합성된 펩타이드를 이용하여 고효율의 줄기세포를 선별하기 위해, 형광표지된 GRP78 펩타이드를 이용하였다. 즉, 세포 표면의 GRP78 단백질을 발현하는 세포를 선별하거나, 또는 세포내 핵 및 기타 기질에서의 GRP78 단백질에 형광물질을 표지하여 형광표지된 GRP78 펩타이드를 세포질로 주입하여 세포투과도 및 세포내 분포변화를 평가하였다.

형광 펩타이드의 투과도를 평가하기 위해서는 세포를 12-well 플레이트에서 5% CO₂의 가습 챔버에서 37℃로 배양하여 접착된 후, 배양 배지를 제거하였다. GRP78 펩타이드를 최적의 농도로 세포에 첨가하고, 대조군 세포를 PBS로 처리하였다. 5% CO₂에서 가습 챔버에서 37℃에서 2시간 및 8시간 배양한 후, 세포를 PBS로 조심스럽게 3회 세척하고, 30 분 동안 DAPI와 함께 배양하여 핵 분포를 관찰하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 형광 현미경 (OLYMPUS IX-70)으로 형광 이미징을 사용하여 분석하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation Nano Intelligent Biomedical Engineering Corporation. co. Ltd <120> Peptide derived from GRP78 for Selecting Highly Efficient Stem Cell <130> P18-B234 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 1 Met Glu His Arg Thr Arg Ser Trp Ala Leu Gly Leu Ser Ile Leu Gly 1 5 10 15 Phe Phe Ala Leu Leu Phe Ser Ala Gly Phe Val Gln Gln Ala His Ala 20 25 30 <210> 2 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 2 Met Glu His Arg Asn Arg Ser Trp Ala Leu Gly Leu Ser Ile Leu Gly 1 5 10 15 Phe Phe Ala Leu Leu Phe Ser Ala Gly Phe Val Gln Gln Ala His Ala 20 25 30 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 3 Met Asp His Arg Asn Arg Ser Trp Ala Leu Gly Leu Ser Ile Leu Gly 1 5 10 15 Phe Phe Ala Leu Leu Phe Ser Ala Gly Phe Val Gln Gln Ala His Ala 20 25 30 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 4 Thr Phe Ala Pro Glu Glu Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 5 Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly Leu Asn Val Met Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 6 Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 7 Lys Pro Tyr Ile Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe 1 5 10 15 Ala Pro Glu Glu Ile Ser Ala 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 8 Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Val Thr His 20 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 9 Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala 1 5 10 15 Thr <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 10 Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn 1 5 10 15 Glu Pro Thr Ala Ala Ala 20 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 11 Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val 1 5 10 15 Phe Asp Leu Gly Gly Gly 20 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 12 Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly Val Phe Glu Val 1 5 10 15 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 13 Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Gln 1 5 10 15 Arg Val <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 14 Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys Lys Thr Gly Lys Asp Val 1 5 10 15 Arg Lys <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 15 Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met Thr Lys 1 5 10 15 Leu Ile Pro Arg 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 16 Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser 1 5 10 15 Asp Asn Gln Pro 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 17 Thr Val Thr Ile Lys Val Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp 1 5 10 15 Asn His Leu Leu 20 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 <400> 18 Gly Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro 1 5 10 15 Gln Ile Glu Val Thr 20 <210> 19 <211> 654 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Endoplasmic reticulum chaperone BiP <400> 19 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly 20 25 30 Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly 35 40 45 Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser 50 55 60 Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys 85 90 95 Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile 100 105 110 Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile 115 120 125 Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu 130 135 140 Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe 165 170 175 Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly 180 185 190 Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Thr Ala 195 200 205 Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Thr Leu Val Phe Asp 210 215 220 Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly 225 230 235 240 Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu 245 250 255 Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys 260 265 270 Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu 275 280 285 Arg Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln 290 295 300 Ala Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu 305 310 315 320 Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg 325 330 335 Ser Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys 340 345 350 Lys Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile 355 360 365 Pro Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro 370 375 380 Ser Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val 385 390 395 400 Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu 405 410 415 Leu Asp Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val 420 425 430 Met Thr Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser 435 440 445 Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys 450 455 460 Val Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly 465 470 475 480 Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln 485 490 495 Ile Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr 500 505 510 Ala Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn 515 520 525 Asp Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp 530 535 540 Ala Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp 545 550 555 560 Thr Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile 565 570 575 Gly Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu 580 585 590 Thr Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His 595 600 605 Gln Asp Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu 610 615 620 Glu Ile Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro 625 630 635 640 Pro Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Ile 645 650 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRP78 binding domain <400> 20 Trp Ile Phe Pro Trp Ile Gln Leu 1 5

Claims

서열번호 1 내지 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열로 표시되는 고효율 줄기세포 선별용 또는 줄기세포의 효율 증진용 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 GRP78 유래인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 GRP78의 1-32 부위를 인식하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 GRP78 단백질의 인산화 또는 산화 반응 부위를 인식하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 7 내지 14의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 GRP78이 조절하는 핵내 ATP를 인식하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 15 내지 18의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 GRP78이 조절하는 핵내 ATP 분해산물을 인식하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 고효율의 줄기세포는 GRP78을 발현하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 펩타이드를 이용한 고효율의 줄기세포를 선별하는 방법.
제8항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) GRP78 특이적인 펩타이드에 형광물질을 결합시키는 단계;
(b) 상기 형광물질이 결합된 펩타이드를 줄기세포에 결합시키는 단계; 및
(c) 형광 현미경을 이용하여 GRP78을 발현하는 줄기세포를 선별하는 단계.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 고효율의 줄기세포 선별용 키트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 펩타이드를 줄기세포에 처리하여 줄기세포의 효율을 증진시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 효율이 증진된 줄기세포는 GRP78을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 줄기세포의 효율 증진용 조성물.