KR20190039580A

KR20190039580A - 당단백질 재구성을 위한 엔도글리코시다제 돌연변이체 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR20190039580A
Application number: KR1020197007861A
Authority: KR
Inventors: 난-홍 린; 린-야 후앙; 사친 에스 시바타레; 리-추 첸; 치-훼이 웡; 충-이 우; 팅 쳉
Original assignee: 초 파마 인크.; 난-홍 린; 아카데미아 시니카
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2017-08-23
Publication date: 2019-04-12
Also published as: US20180057804A1; JP6965350B2; IL264873B1; EP3532090A1; US10407673B2; CA3034876C; IL264873A; EP3532090A4; WO2018039373A1; US20180298361A1; TWI727884B; IL264873B2; CN110234341A; KR102166120B1; TWI727883B; US10000747B2; TW202117012A; TW202115251A; TW201823455A; CA3034876A1

Abstract

EndoS2의 돌연변이체는 야생형 EndoS2의 서열(서열번호 1)에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 상기 하나 이상의 돌연변이는 잔기 133-143, 잔기 177-182, 잔기 184-189, 잔기 221-231, 및/또는 잔기 227-237 내에 위치하는 펩티드 영역에 존재하며, 상기 EndoS2의 돌연변이체는 야생형 EndoS2의 것에 비해 가수분해 활성이 더 낮고, 글리코실전이반응 활성이 더 높다. EndoS2의 돌연변이체를 사용하여 공학적으로 조작된 당단백질을 제조하는 방법은 활성화된 올리고사카라이드를 당단백질 수용체에 커플링시키는 단계를 포함한다. 활성화된 올리고사카라이드는 글리칸 옥사졸린이다.

Description

당단백질 재구성을 위한 엔도글리코시다제 돌연변이체 및 그의 사용 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 발명은 2016년 8월 24일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/378,806호를 우선권으로 주장하며, 그 개시 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 명확히 정의된 광범위 N-글리칸을 갖는 당단백질 또는 글리코펩티드를 합성하기 위한, 향상된 글리코실전이반응 활성 및 감소된 가수분해 활성을 나타내는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes) 유래 엔도글리코시다 S2(EndoS2)의 선택된 돌연변이체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 하나 이상의 실시양태는 또한 이펙터 기능의 개선을 위해 Fc-도메인에서 균질한 글리칸 조성물을 형성하도록 치료용 항체의 글리칸을 효율적으로 재구성하기 위한 EndoS2 돌연변이체의 용도에 관한 것이다.

1986년에 최초 치료용 모노클로날 항체 요법이 승인된 이래로, 이러한 부류의 생물약제 제품의 상업적 파이프라인이 가장 강력하고 활발하게 이어져 오고 있다 (1). 2015년 초부터 현재까지, 암, 자가면역 및 감염성 질환을 비롯한 다양한 질환 치료를 위해 미국 또는 유럽에서 총 47개의 모노클로날 항체 제품이 승인되었다. 현재의 승인 비율이 계속된다면, 2020년까지 약 70개의 모노클로날 항체 제품이 시장에 출시될 것이며, 전 세계적으로 거의 1250억 달러의 매출을 올리게 될 것이다 (2). 이들의 임상 활성을 위해 Fc-매개 이펙터 기능에 의존하는 모노클로날 항체 치료제에서, Fc 도메인에서의 N-글리칸의 조성이 안전성 또는 유효성에 결정적인 것으로 나타났다 (3). 다양한 당화 상태가 또한 약력학 및 약물동력학적 특성에 영향을 미치는데 연루되는 한편, 다른 Fc 글리칸 구조 요소는 면역 거부 반응에 관여할 수 있다. 그러나, Fc-당화를 조절하는 방법은 여전히 도전적이다.

전형적인 IgG는 가요성 영역을 통해 불변 영역(Fc)에 연결된 2개의 항원-결합 단편(Fab)으로 구성된다. Fab 도메인은 항원 인식을 담당하는 반면, Fc 도메인의 Asn297에서의 N-글리칸은 이펙터 세포상의 각각의 Fcγ 수용체(예컨대 FcγRIIIa 및 FcγRIIb) 및 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 비롯해, 이펙터 기능을 활성화시키는 보체의 C1q 성분과 상호작용한다 (5-7). 거의 모든 치료용 항체는 보존된 아스파라긴 잔기(N297)에서의 각각의 동종이량체 Fc 도메인에서 N-당화된다. 이들 N-연결된 글리칸은 30 가지 이상의 상이한 당 형태를 생성하며, 코어 헵타사카라이드는 코어 푸코스(Fuc), 양분 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 말단 갈락토스(Gal) 및 말단 시알산(Sia)으로 차별적으로 구성될 수 있는 상당한 구조적 이종성을 갖는 전형적인 이-안테나형 복합체 타입이다 (8-9). 따라서 N-글리칸의 조성은 Fc 도메인의 구조에 영향을 미쳐서 항체의 안정성, 약물동력학적 프로파일, 면역원성, 이펙터 기능, 항체-매개 염증 및 보체 활성화를 조절할 수 있다 (10). 예를 들어, 코어 푸코스의 부재뿐만 아니라이 양분 GlcNAc 부분의 부착은 이펙터 세포상의 FcγIIIa 수용체(FcγRIIIa)에 대한 항체의 친화도를 현저히 향상시켜 표적의 더 나은 제거를 가져온다 (10-11). 또한, 항체 및 정맥 내 면역글로불린(IVIG)의 부성분인 말단 a-2,6-시알릴화 글리칸은 항염증성을 향상시키는 최적화된 구조이다 (12-13).

N-당화는 재조합 발현 시스템에 따라 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입을 포함한 글리칸 구조의 현저한 이질성을 종종 초래하는 가장 복잡한 번역 후 변형 중 하나이다 (14-15). 상업적으로 이용가능한 치료용 항체는 전형적으로 그의 각각의 치료 활성에 대해 최적이 아닌 당형태의 혼합물로서 존재한다. 최근에, 당조작 기술이 효능 향상을 위해 Fc 당화를 제어하는데 큰 관심이 모아지고 있다. 가장 일반적인 방법 중 하나는 발현 숙주에서의 합성 경로의 생체 내 공학이다. 그러나, 이 방법으로 생성된 당형태는 제한적이며, 원하는 당형태에 대한 완전한 제어가 이루어질 수 없다. 당화 이질성을 다루기 위한 또 다른 방법은 IgG의 당화 부위에서 제1 GlcNAc 또는 Fuc-GlcNAc 만을 남기기 위해 모든 이질적인 N-글리칸을 푸코시다제 매개로 잘라 없애거나 없애지 않고 엔도글리코시다제 [엔도-N-아세틸 글루코사미니다제(ENGase)]를 시용하는 것이며, 이에 이어 옥사졸린의 형태로 명확히 정의된 활성화된 글리칸은 GlcNAc 수용체로 다시 전달되어 천연 β-1,4 결합을 형성할 수 있다 (16).

엔도글리코시다제, EndoS 및 EndoS2는 인간 병원체 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes)로부터 유래된 18 가지 글리코시드 가수분해효소(GH) 패밀리이며, 최근 치료용 항체의 당조작에 대한 관심의 대상이 되었다 (17-18). EndoS와 EndoS2는 불과 37%의 서열 동일성에도 불구하고 인간 IgG의 N-연결 글리칸의 코어 내 두 N-아세틸 글루코사민(GlcNAcs) 사이에서 β-1,4 결합의 가수분해를 촉매화한다. 또한, 두 효소 모두 IgG Fc 도메인에서 복합체 타입 글리칸을 제거한다. 그러나, EndoS2는 EndoS에 비해 하이브리드 및 올리고만노스 구조를 더 많이 가수분해할 수 있다 (19). 더욱이, 기질로서 당-옥사졸린의 존재하에서 GH18 및 GH85의 일부 엔도글리코시다제는 글리코신타제(glycosynthases)로 변해 키토바이오스 연결을 촉매화한다. 그러나, 이들 글리코신타제 효소의 고유 가수분해 활성은 전체 수율을 감소시킨다.

효소 활성에 대한 추가 개선은 EndoS 돌연변이체 D233Q 및 D233A를 포함한 엔도글리코시다제 돌연변이체의 개발로 이어진다 (16). 이것은 GH18 내 ENGase: D-X-E의 활성 부위에서 중요한 모티프로 드러났다. 이 모티프는 인접한 그룹 참여와 함께 이중 치환 반응을 이용하는 ENGase의 촉매작용 메커니즘을 지원한다. 이 메커니즘에서, GlcNAc의 2-아세트아미드기는 아노머 중심에서 이탈기를 대체할 친핵체로서 작용하여 Asp의 카복실레이트에 의해 촉진되는 옥사졸리늄 이온 중간체를 형성한다. 촉매 잔기인 글루타메이트는 이탈성 아글리칸기를 양성자화하고 친핵성 H₂O를 탈양성자화시켜 옥사졸리늄 이온 중간체의 가수분해를 유도함으로써 가수분해산물을 형성하는 일반적인 산/염기로서 작용한다. E의 N-말단측에 있는 제2 잔기인 아스파테이트의 카복실레이트는 옥사졸리늄 이온 중간체의 형성을 촉진하고 안정화시키는 것으로 제안되었다. EndoS의 D233Q 돌연변이는 글리코실전이반응을 개선하고 가수분해 활성을 감소시키는 것으로 입증되었다.

상술된 EndoS 돌연변이체는 지금까지 알려진 가장 우수한 글리코신타제이다. 이들은 균질 항체의 합성 가능성이 높다. 그러나, 일반적으로 출발 물질을 생성물로 완전히 전환시키는데 많은 양의 효소가 필요하다. 따라서, 대규모 효소 생산 및 반응 후 잔류하는 효소 내용물을 제거하기 위한 다운스트림 정제는 지루하고 노동 집약적이어서, 전체적인 당조작적 처리 비용을 더 높이는 결과를 초래한다. 또한, EndoS 돌연변이체의 글리코실전이반응 활성은 특히 대칭 이-안테나형 복합체 타입 당형에 국한되고, GlcNAc 상의 α-1,3-푸코스, Gal 상의 α-1,2-푸코스, 연장된 폴리 LacNAc 모티프 및 말단의 비대칭 시알릴화된 안테나와 같은 추가의 고유 변경을 가지는 광범위 고 만노스, 하이브리드 및 삼- 및 사-안테나형 복합체 타입에 대해서는 아니다.

EndoS2는 광범위한 IgG 글리칸을 가수분해할 가능성이 있기 때문에, IgG 당조작 분야에 큰 관심을 불러 일으켰다. EndoS 및 EndoS2의 서열 정렬 결과에 기초해, EndoS2의 D184 부위는 EndoS의 D233 부위와 동일한 것으로 추측된다. 따라서 EndoS2의 돌연변이체 포멧인 이 D184 부위가 글리코실전이반응 활성을 증가시키고 EndoS2의 가수분해 활성을 감소시킬 것으로 예상된다. 상기 선행 기술에 비추어 볼 때, 야생형 EndoS2의 활성 부위 부근에서 부위 특이적 돌연변이유발에 의한 EndoS2의 글리코신타제 활성을 개선시키는 것이 유리할 것이다. 우수한 글리코신타제 활성 및 감소된 가수분해 활성을 갖는 EndoS2 돌연변이체가 본원에 제공된다. 보다 중요하게는, 본 발명의 신규한 EndoS2 돌연변이체는 광범위 기질을 제공하고, 활성화된 글리칸 옥사졸린 형태로 고 만노스, 하이브리드 및 이- 및 삼-안테나의 복합체 타입인 N-글리칸을 전달할 수 있다. 본 발명의 EndoS2 돌연변이체는 생물학적 및 구조적 연구를 위해 항염증 활성을 얻을 것이 기대되는 특히 완전 시알릴화된 다중-안테나형인 당형의 다양한 당화 동질 항체의 생산을 용이하게 한다.

발명의 요약

본 발명의 실시양태는 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 광범위한 N-글리칸에 대해 우수한 글리코실전이반응 활성 및 감소된 가수분해 활성을 나타내는 EndoS2의 선택된 돌연변이체에 관한 것이다. 이들 EndoS2 돌연변이체는 균질하게 당화된 글리코펩티드, 당단백질 및 치료용 항체 또는 그의 Fc 단편을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 실시양태는 항체-Fc 영역에서 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입 당형으로 치료용 항체 및 그의 Fc 단편의 효율적인 글리칸 재구성을 가능하게 한다. 당조작된 항체는 약리학적 특성뿐만 아니라 FcγIIIA 결합 및 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 등과 같은 그의 이펙터 기능의 향상으로 이어질 수 있다. 또한, 본 발명의 실시양태에 따라서 치료용 항체, 특히 그의 이펙터 기능에서 항염증 활성을 얻을 것으로 기대되는 고도로 시알릴화된 복합체 타입 당형의 다양한 Fc 당화의 효과를 신속하게 조사할 수 있는 것이 가능하다.

일 양태에서, 본 발명은 돌연변이체가 적어도 80% 이상의 상동성을 가지며, 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 광범위한 N-글리칸에 대한 푸코실화 및 비푸코실화된 GlcNAc 수용체 모두에 대해 개선된 글리코실전이반응 활성을 나타내고, 푸코실화 및 비푸코실화된 GlcNAc 수용체에 활성화된 올리고사카라이드 공여체의 효율적인 전달을 가능하게 하여 글루코펩티드 또는 당단백질 또는 치료용 항체의 새로운 균질 당형을 형성하는 EndoS2 돌연변이체를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 현저한 글리코실전이반응 활성을 나타내지만 가수분해 활성이 감소된 EndoS2 돌연변이체를 제공하며, 상기 돌연변이는 바람직하게는 T138D(서열번호 6), T138E(서열번호 7), T138F(서열번호 8), T138H(서열번호 9), T138K(서열번호 10), T138L(서열번호 11), T138M(서열번호 12), T138N(서열번호 13), T138Q(서열번호 14), T138R(서열번호 15), T138V(서열번호 16), T138W(서열번호 17), D182Q(서열번호 2), D226Q(서열번호 3), T227Q(서열번호 4), 및 T228Q(서열번호 5)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 T138, D182, D226, T227, 및 T228에서 돌연변이를 포함하는 부위 특이적 돌연변이를 포함한다.

추가 양태에서, 본 발명은 활성화된 올리고사카라이드 공여체를 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc 수용체로 전달하기 위해 EndoS2 돌연변이체의 현저한 글리코실전이반응 활성을 제공하면서도, 낮은 가수분해 활성을 제공하고, 여기서 활성화된 올리고사카라이드 공여체는 합성 글리칸 옥사졸린을 포함한다. 일 실시양태에서, 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 다양한 N-글리칸을 포함하는 합성 글리칸 옥사졸린은 하기 식을 가진다:

상기에서, R¹은 -H 또는 β-1,4 결합을 통해 부착된 N-아세틸 글루코사민이고, R²및 R³은 동일하거나 상이하고 독립적으로 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된다:

또 다른 양태에서, 본 발명은 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc-수용체에서 글리코실전이반응을 위한 EndoS2 돌연변이체를 제공하며, 여기서 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc-수용체는 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc-펩티드, 단백질 및 IgG Fc 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc-IgG에서 글리코실전이반응을 위한 EndoS2 돌연변이체를 제공하며, 여기서 IgG는 모노클로날 항체이고 세툭시맙, 리툭시맙, 뮤로모납-CD3, 아브식시맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, 팔리비주맙, 인플릭시맙, 트라스투주맙, 겜투주맙 오조가마이신, 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 아달리무맙, 오말리주맙, 토시투모맙, I-131 토시투모맙, 에팔리주맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 나탈리주맙, 에타너셉트, IGN101, 볼로식시맙, 항-CD80 mAb, 항-CD23 mAb, CAT-3888, CDP-791, 에랍투주맙, MDX-010, MDX-060, MDX-070, 마투주맙, CP-675,206, CAL, SGN-30, 자놀리무맙, 아데카투무맙, 오레고보맙, 니모투주맙, ABT-874, 데노수맙, AM 108, AMG 714, 폰톨리주맙, 다클리주맙, 골리무맙, CNTO 1275, 오클렐리주맙, HuMax-CD20, 벨리무맙, 에프라투주맙, MLN1202, 비실리주맙, 토실리주맙, 오클렐리주맙, 세톨리주맙 페골, 에쿨리주맙, 펙셀리주맙, 아브식시맙, 및 라니비지무맙으로 이루어진 군 중에서 선택된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc-펩티드, 단백질 및 IgG 또는 IgG-Fc 단편의 재구성 방법을 제공하며, 이 방법은 펩티드/단백질/항체-GlcNAc 수용체 또는 Fc 단편을 제공하는 단계 및 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes) EndoS2 돌연변이체의 촉매 작용하에 활성화된 올리고사카라이드 공여체와 반응시켜 이종 당화 상태를 갖는 선재 펩티드, 단백질 및 모노클로날 항체의 실질적으로 순수한 당형태를 제조하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 치료용 IgG 또는 이의 Fc 단편의 글리칸 재구성을 위한 EndoS2 돌연변이체의 사용 방법을 제공하며, 이 방법은

A. 이종 N-글리칸을 가지는 천연 또는 재조합 코어 푸코실화 또는 비푸코실화 치료용 IgG 또는 IgG-Fc 단편을 박테리아 알파 푸코시다제와 함께 또는 없이 엔도글리코시다제(야생형 EndoS2)로 처리하여 두 환원 말단 GlcNAc 잔기 사이의 결합을 가수분해하여 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc-IgG 수용체를 형성하는 단계;

B. 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes) EndoS2 돌연변이체를 사용하여 활성화된 올리고사카라이드 공여체 형태의 예정된 광범위 올리고사카라이드 빌딩 단위를 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc-IgG에 전달하여 글리코실전이반응을 통해 천연 베타 1,4 결합을 재구성함으로써 예정된 올리고사카라이드를 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 IgG 또는 이의 Fc 단편에 부착시키는 단계를 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 Fc 영역의 각 부위에서 동일한 N-글리칸 구조를 갖는 IgG 분자를 포함하는 푸코실화 또는 비푸코실화된 당-조작된 항체 또는 항원 결합 단편의 조성물을 제공하며, 여기서 글리칸은 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 것이고, 다음으로 이루어진 군 중에서 선택되며:

또 다른 양태에서, 본 발명은 개질되지 않은 항체와 비교하여, FcγIIIA 및 ADCC에 대한 결합과 같은 이펙터 기능이 개선된 당조작된 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 환자에서 암을 치료하기 위한, 본원에 기재된 당-조작된 항체의 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다.

암의 예로는 B 세포 림프종, NHL, 전구 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프성 백혈병(CLL)/소림프성 림프종(SLL), B 세포전림프성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 저등급, 중간 등급 및 고등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 타입 변연부 B 세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 비장 타입 변연부 B 세포 림프종, 털세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식후 림프세포 증식 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역형성 대세포 림프종(ALCL)을 들 수 있으나, 이로만 제한되지는 않는다.

본 발명은 세툭시맙, 리툭시맙, 뮤로모납-CD3, 아브식시맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, 팔리비주맙, 인플릭시맙, 트라스투주맙, 겜투주맙 오조가마이신, 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 아달리무맙, 오말리주맙, 토시투모맙, I-131 토시투모맙, 에팔리주맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 나탈리주맙, 에타너셉트, IGN101, 볼로식시맙, 항-CD80 mAb, 항-CD23 mAb, CAT-3888, CDP-791, 에랍투주맙, MDX-010, MDX-060, MDX-070, 마투주맙, CP-675,206, CAL, SGN-30, 자놀리무맙, 아데카투무맙, 오레고보맙, 니모투주맙, ABT-874, 데노수맙, AM 108, AMG 714, 폰톨리주맙, 다클리주맙, 골리무맙, CNTO 1275, 오클렐리주맙, HuMax-CD20, 벨리무맙, 에프라투주맙, MLN1202, 비실리주맙, 토실리주맙, 오클렐리주맙, 세톨리주맙 페골, 에쿨리주맙, 펙셀리주맙, 아브식시맙, 및 라니비지무맙으로 이루어진 군 중에서 선택되는 항체의 당-조작을 구상한다.

본 발명의 다른 양태 및 이점은 하기의 설명 및 첨부된 청구 범위로부터 명백해질 것이다.

도 1은 야생형 EndoS2 및 부위 특이적 돌연변이 유발을 위해 선택된 잠재적인 아미노산 잔기의 서열을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시양태에 따른 EndoS2 돌연변이체의 아미노산 서열 T138D(서열번호 6), T138E(서열번호 7), T138F(서열번호 8), T138H(서열번호 9), T138K(서열번호 10), T138L(서열번호 11), T138M(서열번호 12), T138N(서열번호 13), T138Q(서열번호 14), T138R(서열번호 15), T138V(서열번호 16), T138W(서열번호 17), D182Q(서열번호 2), D226Q(서열번호 3), T227Q(서열번호 4), 및 T228Q(서열번호 5)를 나타낸다.
도 3에서 (A) 카톤은 EndoS와의 정렬에 기초한 EndoS2의 촉매 도메인의 추정 제3, 제4, 제5 번째 β-시트를 나타낸다. 적색으로 표시된 촉매 잔기 E186은 일반적인 산/염기로 작용하는 반면, E186 주변의 돌연변이된 아미노산 부위는 청색으로 표시된다. (B) 야생형 EndoS2의 글리칸 가수분해 활성 및 시판중인 리툭시맙을 기질로 사용하여 각 부위에서 선별된 돌연변이체. EndoS2 돌연변이체(52 nM)를 시판 리툭시맙(52 μM)과 반응시키고, 120 분 동안 인큐베이션한 후, SDS-PAGE로 분석하였다. 원래의 리툭시맙(Rtx-글리칸)의 상대 백분율이 표시된다. 돌연변이 D184Q를 비교용으로 사용하였다.
도 4는 수용체로 GlcNAc-리툭시맙(67.5 μM)을, 공여체로 α-2,6 시알릴화 이-안테나형 복합체 타입 글리칸(SCT)-옥사졸린(2.5 mM)을 사용하여 각 부위에서 선택된 돌연변이체(67.5 nM) 및 야생형 EndoS2의 글리코실전이반응 활성을 나타낸다. 반응물을 2 시간 동안 인큐베이션하고 SDS-PAGE로 분석하였다. Fc 영역에서 α-2,6 시알릴화된 이-안테나형 복합체 타입 글리칸을 가진 리툭시맙(Rtx-SCT)의 상대 백분율을 나타내었다. 돌연변이 D184Q를 비교용으로 사용하였다.
도 5는 수용체로 GlcNAc-리툭시맙을, 공여체로 α-2,6 시알릴화 이-안테나형 복합체 타입 글리칸(SCT)-옥사졸린을 사용한 경우 T138에서 돌연변이체의 글리코실전이반응 활성 비교를 나타낸다. T138 돌연변이체(67.5 nM), GlcNAc-리툭시맙(67.5 μM) 및 SCT-옥사졸린(2.5 mM)을 포함하는 반응물을 2 시간 동안 인큐베이션하고 SDS-PAGE로 분석하였다. Fc 영역에서 α-2,6 시알릴화된 이-안테나형 복합체 타입 글리칸을 가진 리툭시맙(Rtx-SCT)의 상대 백분율을 나타내었다.
도 6은 수용체로 GlcNAc-리툭시맙을, 공여체로 글리칸-옥사졸린(G1 내지 G4)을 사용한 경우 고 만노스 타입 Man₅GlcNAc₂(글리칸 G1), Man₉GlcNAc₂(글리칸 G2) 및 하이브리 시리즈 글리칸(G3 및 G4)에 대한 EndoS2의 선택된 변이체의 글리코실전이반응 활성을 나타낸다. 반응 진행을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 모니터하였다. 레인 1: 마커; 레인 2: GlcNAc-리툭시맙; 시간점은 분으로 표시되고; 산물%는 하단에 표시된다.
도 7은 말단 갈락토스 잔기를 갖는 삼-안테나형 복합체 타입 글리칸 G5 및 말단 α-2,6 시알산을 갖는 G6에 대한 EndoS2의 선택된 돌연변이체의 글리코실전이반응 활성을 나타낸다. 반응은 수용체로서 GlcNAc-리툭시맙을, 공여체 기질로서 글리칸-옥사졸린(G4-G5)을 사용하여 수행하였다. 반응 진행을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 모니터하였다. 레인 1: 마커; 레인 2: GlcNAc-리툭시맙; 시간점은 분으로 표시되고; 산물%는 하단에 표시된다.
도 8은 일련의 2-안테나형 복합체 타입 구조에 대한 EndoS2의 선택된 돌연변이체의 글리코실전이반응 활성을 나타낸다. 글리칸 G7은 말단 디-갈락토스를 갖는 이-안테나형이고, 글리칸 G8은 양분된 GlcNAc 및 말단 디-갈락토스를 갖는 이-안테나형이고, 글리칸 G9는 두 말단 갈락토스 중 하나에 알파 1,2-푸코스를 갖는 이-안테나형이고 글리칸 G10은 GlcNAc 및 말단 디-갈락토스 모두에 알파 1,3 푸코스를 갖는 이-안테나형이다. 글리코실전이반응은 수용체로서 GlcNAc-리툭시맙을, 공여체 기질로서 글리칸-옥사졸린(G7-G10)을 사용하여 수행하였다. 반응 진행을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 모니터하였다. 레인 1: 마커; 레인 2: GlcNAc-리툭시맙; 시간점은 분으로 표시된다.
도 9는 말단 갈락토스 잔기를 갖는 이-안테나형 복합체 타입 글리칸 G7 및 말단 α-2,6 시알산을 갖는 G16에 대한 EndoS2의 선택된 돌연변이체의 글리코실전이반응 활성을 나타낸다. 반응은 수용체로 Fuc(α-1,6)-GlcNAc-리툭시맙을, 공여체 기질로 글리칸-옥사졸린(G4 및 G16)을 사용하여 수행하였다. 반응 진행을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 모니터하였다. 레인 1: 마커; 레인 2: GlcNAc-리툭시맙; 시간점은 분으로 표시되고; 산물%는 하단에 표시된다.
도 10은 광범위한 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입 글리칸에 대한 EndoS2의 선택된 돌연변이체의 기질 특이성을 나타낸다.
도 11은 Fc 영역에서 다양한 당형을 갖는 리툭시맙의 구조를 나타낸다. 당형은 일련의 고 만노스, 하이브리드 및 이- 및 삼-안테나형 복합체 타입 구조를 포함한다.
도 12는 당조작된 리툭시맙(Rtx G1-G16), GlcNAc-리툭시맙 및 시판 리툭시맙의 SDS PAGE 분석을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 실시양태는 산물 가수분해가 거의 없거나 무시할 정도로 고 만노스, 하이브리드 또는 복합체 타입의 광범위 N-글리칸을 활성화된 올리고사카라이드 옥사졸린으로부터 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAc-펩티드, 단백질 또는 IgG로 전달하기 위해 현저한 글리코실전이반응 활성을 나타내는 EndoS2의 선택된 돌연변이체에 관한 것이다. 신규 EndoS2 돌연변이체는 동질적으로 당화된 정의된 다양한 당형을 갖는 글리코펩티드, 당단백질 및 치료용 항체 및 이의 Fc 단편을 제공하기 위해 효율적으로 작용한다. 또한, 본 발명의 실시양태는 약리학적 특성뿐만 아니라 FcγIIIA 결합 및 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 등과 같은 이펙터 기능이 향상된 당조작된 항체를 제공할 수 있다. 본 발명의 실시양태는 또한 치료용 항체의 다양한 Fc 당화가 그의 이펙터 기능에 미치는 효과에 대한 신속한 조사를 가능하게 한다.

이하의 설명에서는, 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부 도면이 참조되고, 본 발명의 실시양태가 실시될 수 있는 특정 실시예로 기술된다. 이들 실시양태는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있을 정도로 상세히 설명되며, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다른 실시양태가 계획될 수 있고 구조적, 논리적 및 전기적 변화가 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이하의 예시적인 실시양태의 설명은 제한된 의미로 해석되어서는 안되며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해 한정된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이하에서는 바람직한 방법 및 재료가 설명된다. 본 명세서에 구체적으로 언급된 모든 문헌 및 특허는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 문헌에 보고된 화학 물질, 세포주, 벡터, 동물, 기기, 통계 분석 및 방법론을 기술하고 공개하는 것을 포함하여 모든 목적을 위해 참고로 포함된다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 당해 기술 분야의 기술 수준을 나타내는 것으로 간주되어야 한다. 본 발명이 선행 발명에 의한 그러한 개시를 보다 더 이전에 일어난 것으로 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 발명의 재료 및 방법을 기술하기에 앞서, 방법, 프로토콜, 재료 및 시약은 다양할 수 있기 때문에 본 발명이 기재된 특정 방법, 프로토콜, 재료 및 시약들로 한정되는 것으로 이해하여서는 안된다. 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시양태만을 설명하기 위한 것이며, 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

정의

본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 것을 알아야 한다.

본원에서 사용된 용어 "글리칸"은 폴리사카라이드, 올리고사카라이드 또는 모노사카라이드를 지칭한다. 글리칸은 당 잔기의 단량체 또는 중합체일 수 있고 선형 또는 분지형일 수 있다. 글리칸은 천연 당 잔기(예: 글루코스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 뉴라민산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 헥소스, 아라비노스, 리보스, 크실로스 등) 및/또는 개질된 당(예: 2'-플루오로리보스, 2'-데옥시리보스, 포스포만노스, 6'-설포 N-아세틸 글루코사민 등)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "푸코스", "코어 푸코스" 및 "코어 푸코스 잔기"는 상호 교환하여 사용되며 N-아세틸 글루코사민에 연결된 α-1,6-위치에서의 푸코스를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "N-글리칸", "N-연결된 글리칸", "N-연결된 당화", "Fc 글리칸" 및 "Fc 당화"는 상호 교환하여 사용되며, Fc-함유 폴리펩티드 내 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc)에 의해 부착된 N-연결된 올리고사카라이드를 지칭한다. 용어 "Fc-함유 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 항체와 같은 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "당화 패턴" 및 "당화 프로파일"은 상호 교환하여 사용되며 효소적 또는 화학적으로 당단백질 또는 항체로부터 방출되고, 예를 들어 LC-HPLC 또는 MALDI-TOF MS 등을 사용하여 그의 탄수화물 구조에 대해 분석된 N-글리칸 종의 특징적인 "지문"을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Current Analytical Chemistry, Vol. 1, No. 1(2005), pp. 28-57]에서의 보고가 참조되며; 그 전문은 본원에 참고로 인용된다.

본원에서 사용된 용어 "당조작된 Fc"는 Fc 영역상의 N-글리칸이 효소적 또는 화학적으로 변형되거나 공학적으로 처리된 것을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "Fc 당조작"은 당조작된 Fc를 제조하는데 사용되는 효소적 또는 화학적 과정을 지칭한다.

Fc 영역의 당화 프로파일과 관련하여 "균질한", "균일한", "균일하게" 및 "균질성"이라는 용어는 상호 교환하여 사용되며 바람직한 하나의 N-글리칸 종에 의해 대표되는 전구체 N-글리칸이 전혀 없는 단일 당화 패턴을 의미하는 것으로 의도된다.

"IgG", "IgG 분자", "모노클로날 항체", "면역글로불린" 및 "면역글로불린 분자"는 상호 교환하여 사용된다.

본원에서 사용된 용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타낸다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체(이들 수용체의 대립형질 변이체 및 택일적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 주로 그의 세포질 도메인이 다른 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 활성 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(M. Daeeron Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)의 보고 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34(1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)]에 기재되어 있다. 향후 동정되어야 할 것을 비롯한 기타 FcR은 본원에서 "FcR"이라는 용어에 의해 포괄된다. 이 용어에는 태아에게 모체 IgG를 전달시키는데 관여하는 신생아 수용체 FcRn도 포함된다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249(1994)).

본원에서 사용된 용어 "이펙터 기능"은 Fc 수용체 또는 리간드와 항체 Fc 영역의 상호작용으로부터 비롯되는 생화학적 반응을 지칭한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 이펙터 기능은 당업계에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살상(NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)상에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-함유 표적 세포에 특이적으로 결합하도록 하여 후속적으로 세포독소로 표적 세포를 사멸시킬 수 있도록 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 상기 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키고 상기 사멸을 위해 절대적으로 요구된다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)]의 464쪽에 있는 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 제5,500,362호 또는 미국 특허 제5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관 내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 상기 검정을 위해 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살상(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, 문헌[Clynes et al. PNAS(USA) 95:652-656(1998)]에 기재된 것과 같은 동물 모델에서 생체 내 평가될 수 있다.

시판중이고/이거나 현재 임상 시험에서 다양한 단계에 있는 치료 단백질의 약 2/3는 모노클로날 항체이며, 이들 중에는 30개의 항체 및 그 유도체가 상이한 증상, 주로 신생물 질환, 염증 및 자가 면역질환의 치료용으로 승인을 받았다. 그러나, 천연 및 재조합 당단백질의 글리칸 미소불균질성은 당단백질-기반 약물을 개발하는데 주요 장벽이 되고 있다. 단백질 또는 항체 발현 동안 전형적으로 펜던트 올리고사카라이드의 구조만이 상이한 당형의 혼합물로서 생성되며, 상이한 생물학적 활성을 가질 수 있는 당화 상태를 제어하는 것은 매우 어렵다. 최근에 치료용 항체의 당조작에 큰 관심을 모으고 있는 두 가지 효소는 인간 병원체인 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes) 유래의 EndoS 및 EndoS2이다(Collin and Olsen 2001; Sjoegren et al., 2013). 효소는 항체에 N-연결된 글리칸을 가수분해하여 면역글로불린 G(IgG)의 이펙터 기능을 폐지하는 박테리아 면역 회피 인자로 처음 발견되었다.

IgG의 각 CH2 도메인상의 복합 N-연결된 올리고사카라이드는 Fc 영역의 구조 및 따라서 Fc 수용체와의 상호작용에 결정적이다(Krapp et al., 2003; Woof and Burton 2004). IgG-Fc 도메인의 올리고사카라이드 사슬은 다수의 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc) 및 만노스(Man) 잔기, 및 종국에 갈락토스(Gal) 및 푸코스(Fuc) 잔기뿐만 아니라 시알산(Sia 또는 N-아세틸뉴라민산에 대해 NANA)을 함유한다. α1-6 Fuc가 있거나 없는 GlcNAc는 Asn297에 부착된다. GlcNAcβ1-4는 이 제1 GlcNAc에 부착된다. 그 후 2개의 Manα1-6 및 Manα1-3 암(arm)이 부착된 manβ1-4가 발견되었다. 두 암은 Galβ1-4가 부착되거나 부착되지 않을 수 있는 추가적인 GlcNAcβ1-2를 포함한다. 따라서, 탄수화물 사슬은 G0, G1 및 G2 당형을 각각 정의하는 0, 1 또는 2개의 갈락토스 잔기를 함유할 수 있다. 양분 GlcNAcβ1-4의 존재 및 시알산을 갖는 말단 갈락토스 잔기 또는 심지어 Galα1-3 잔기 중 하나 또는 양자의 캡핑을 포함하는 추가의 변이가 발생한다. 엔도글리코시다제로의 Fc-글리칸의 효소적 절단은 Fc 영역을 변형시켜서 Fcγ 수용체에 대한 IgG 결합을 현저히 감소시킨다(Allhorn et al. 2008). 37%의 서열 동일성에도 불구하고, EndoS와 EndoS2는 모두 인간 IgG의 N-연결된 글리칸의 코어에서 두 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc) 사이의 β-1,4 결합의 가수분해를 촉매화한다. 그러나, 복합체 타입 글리칸 외에도 EndoS2는 EndoS와 비교하여 하이브리드 및 올리고만노스 구조를 더 큰 정도로 가수분해한다(Sjogren et al., 2015).

첫 항체 요법이 1980년대에 도입된 이래, 240개 이상의 치료용 항체가 임상 시험에서 사용되었으며, 이 분야는 꾸준히 확대되고 있다(Chan and Carter 2010). 항체 기능에 대한 IgG-Fc 글리칸의 역할은 성장하는 모노클로날 치료용 항체 분야에서 큰 관심을 받고 있다. 따라서, 치료용 항체의 효능을 향상시키기 위해, 주요 초점은 선택된 Fcγ 수용체와 특이적으로 상호작용하는 Fc-글리칸을 조작하는 쪽으로 이동하고 있다. (Sondermann et al., 2013; Bournazos et al. 2014; Monnet et al. 2014; Quast and Luenemann 2014). 이펙터 기능에 현저한 영향을 미치는 중요한 일부 글리칸 변경은 다음과 같다: i) FcγRIIa에 대한 증가된 친화도를 유도하여 항체 의존성 세포독성을 증가시키는 환원 말단 GlcNAc 잔기에 부착된 코어 푸코스 잔기의 결여(Iidaet al., 2006); ii) 수지상 세포 및 대식세포에서 DC-SIGN 수용체와의 증가된 상호작용을 통해 IgG의 항염증 반응을 증가시키는 것으로 주장된 IgG 상의 시알산이 풍부한 글리칸(Anthony et al., Anthony and Ravetch 2010; Pincetic et al. 2014); iii) 양분 GlcNAc의 함유는 부모의 대응물과 비교하여 강한 ADCC를 유도한다. IgG의 Fc-당화 상태를 제어하는 생물공학 도구의 최근 개선으로 정의된 당형을 갖는 치료용 항체의 개발이 용이해졌다. 따라서, 본 발명의 EndoS2 돌연변이체는 기능적 및 구조적 연구를 위해 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 광범위한 N-글리칸을 부착시킬 목적의 펩티드, 단백질 및 항체의 당조작 분야에서 큰 진보이다.

본 발명의 특징 및 이점이 다음의 비제한적인 실시예에 의해 보다 충분히 설명된다. 당업자는 이들 실시예가 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다른 변형 및 변경이 가능하다는 것을 이해할 것이다.

실시예

펩티드, 치료 단백질 및 온전한 IgG 또는 이의 Fc 단편의 당조작을 위한 EndoS2 돌연변이체의 생성.

지금까지는, 가수분해 동안 옥사졸리늄 이온 중간체 형성의 촉진에 관여하는 주요 아스파라긴(Asn) 잔기의 부위-지정 돌연변이유발에 의해, EndoA, EndoM 및 EndoD를 포함한 일부 GH85 엔도글리코시다제(ENGases)로부터 글리코신타제의 예들이 제조되었다.

스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes) 유래 EndoS는 EndoF1, EndoF2 및 EndoF3을 또한 포함하는 글리코시드 가수분해효소 계열 18(GH18)에 속한다. 이들 GH18 효소는 인간 IgG 상의 아스파라긴-연결된 이-안테나형 글로블린을 절단하여 모노-GlcNAc 항체를 생성하는 효율적인 가수분해 활성으로 잘 알려져 있다. EndoS는 또한 글리신 옥사졸린을 기질로 사용하여 키토바이오스 연결을 합성하는데 글리코신타제로 작용할 수 있지만, 이들 효소의 본질적인 가수분해 활성은 합성 당단백질의 수율을 상당히 감소시키는 주요 장애물이 된다. 효소 활성의 추가 개선으로 EndoS D233Q를 비롯한 엔도글리코시다제 돌연변이가 개발되었다. 이것은 GH18 내 ENGase: D-X-E의 활성 부위상에 중요한 모티프를 제공한다. 이 모티프는 인접 그룹 참여와 함께 이중 치환 반응을 사용하는 ENGase 상의 촉매 작용 메커니즘을 지원한다. 이 메커니즘에서, GlcNAc의 2-아세트아미드기는 Asp의 카복실레이트에 의해 촉진되는 옥사졸리늄 이온 중간체의 형성과 함께, 아노머 중심에서 이탈기를 치환시키는 친핵체로서 작용한다. 촉매 잔기인 글루타메이트는 이탈성 아글리칸기를 양성자화하고 친핵성 H₂O를 탈양성자화시켜 옥사졸리늄 이온 중간체의 가수분해를 유도함으로써 가수분해산물을 형성하는 일반적인 산/염기로서 작용한다. E의 N-말단측에 있는 2 잔기인 아스파테이트의 카복실레이트는 옥사졸리늄 이온 중간체의 형성을 촉진하고 안정화시키는 것으로 제안되었다. 이러한 EndoS의 D의 Q로의 돌연변이는 글리코실전이반응을 개선하고 가수분해 활성을 감소시키는 것으로 입증되었다.

돌연변이체 EndoS D233Q 및 D233A는 균질한 항체의 합성 가능성이 높지만 효율적인 반응을 위해서는 다량의 효소 첨가가 필요하다. 효소 제조 및 반응 후 효소를 제거하기 위한 이후 단계는 지루하고 노동 집약적이다. 최근, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes)의 다른 혈청형에서 새로운 효소 EndoS2가 동정되었다. EndoS-촉매화 과정에서와 같이 복합체 타입의 N-글리칸 상의 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 활성 외에, EndoS2는 EndoS보다 훨씬 더 많이 하이브리드 및 올리고만노스 구조를 절단할 수 있다(Jonathan et al., 2013 and 2015).

EndoS2는 EndoS와 단지 37% 만의 서열 동일성을 공유하며, 이 구조는 촉매 도메인에서 공통적인(β/α)₈ 배럴 구조를 채택한다. 이들 두 효소의 정렬에 기초해, EndoS2의 제4 β-시트에 위치한 잔기 E186은 EndoS의 일반적인 산/염기 D235에 해당한다.

EndoS2의 글리코실전이반응의 촉매 효율을 조사하기 위해, 촉매 부위 근처의 아미노산의 전환이 글리코실전이반응 활성을 조절할 수 있는지에 대해 시험하였다. 촉매 도메인에 근접해 있는 잔기 몇개를 선택하고 부위-지정 돌연변이유발에 의해 돌연변이화시켰다. 돌연변이된 잔기에는 제3 β-시트 상에 T138, 제4 β-시트 상에 D182 및 제5 β-시트 상에 D226, T227 및 T228이 포함된다(도 3A). 시험된 EndoS2 돌연변이체는 T138D(서열번호 6), T138E(서열번호 7), T138F(서열번호 8), T138H(서열번호 9), T138K(서열번호 10), T138L(서열번호 11), T138M(서열번호 12), T138N(서열번호 13), T138Q(서열번호 14), T138R(서열번호 15), T138V(서열번호 16), T138W(서열번호 17), D182Q(서열번호 2), D226Q(서열번호 3), T227Q(서열번호 4), 및 T228Q(서열번호 5)를 포함한다(도 2 및 표 1). 대장균에서 His-tag 융합 단백질로서 고 수율로 발현된 이러한 돌연변이체는 Ni-NTA 친화성 칼럼으로 정제될 수 있다. 활성 부위 근처의 돌연변이가 글리코실전이반응 활성을 현저하게 개선시키고 엔도글리코시다제 활성을 감소시킴으로써 현저한 글리코신타제 효율로 이어진다는 것이 관찰되었다. 또한, 이들 돌연변이체는 활성화된 글리칸 옥사졸린으로부터 탈당화된 온전한 항체로 복합체 타입 N-글리칸을 전달할 수 있으며, 산물의 가수분해는 무시할 정도이다.

하기 표 1은 다양한 EndoS2 돌연변이체의 서열을 나타낸다.

본 발명의 실시양태에 따라, 신규 EndoS2 돌연변이체는 서열번호 2 내지 17의 서열로부터 선택된 서열을 포함한다. 이들 돌연변이체는 향상된 글리코실전이반응 활성 및 감소된 가수분해 활성을 나타낸다. 따라서, 이들은 활성화된 올리고사카라이드 공여체를 푸코실화되거나 비푸코실화될 수 있는 코어 GlcNAc-수용체로 효율적으로 전달할 수 있다.

일부 바람직한 실시양태에 따라, EndoS2 돌연변이체는 서열번호 2 내지 17의 서열과 적어도 80%(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%)의 서열 동일성을 갖고, 목적하는 글리코실전이반응 활성을 가지며, 글리코실전이반응 활성을 갖는 이의 단편을 가질 수 있다

다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EndoS2 돌연변이체는 돌연변이 부위가 잔기 133-143, 잔기 177-187 및 잔기 221-233으로 이루어진 군에서 선택된 영역에 위치한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 EndoS2 돌연변이체는 T138D(서열번호 6), T138E(서열번호 7), T138F(서열번호 8), T138H(서열번호 9), T138K(서열번호 10), T138L(서열번호 11), T138M(서열번호 12), T138N(서열번호 13), T138Q(서열번호 14), T138R(서열번호 15), T138V(서열번호 16), T138W(서열번호 17), D182Q(서열번호 2), D226Q(서열번호 3), T227Q(서열번호 4), 및 T228Q(서열번호 5)를 포함한다.

EndoS2 및 이의 돌연변이체의 글리칸 가수분해 활성

EndoS2 돌연변이체의 글리칸 가수분해 활성을 시판 리툭시맙을 기질로 사용하여 측정하였다. 치료용 항-CD20 모노클로날 항체인 리툭시맙을 모델 mAb로서 사용하여 EndoS2 돌연변이체의 가수분해 활성 및 잠재적인 글리코실전이반응 활성을 조사하였다. 시판 리툭시맙의 주요 Fc 글리칸은 G0F, G1F 및 G2F 당형으로 명명된 0-2 갈락토스 부분을 갖는 코어-푸코실화된 이-안테나형 복합체 타입의 올리고사카라이드이다. 리툭시맙을 야생형 EndoS2 및 EndoS2 돌연변이체로 1:1000의 몰비(효소:리툭시맙)로 처리하였다. 글리칸 가수분해 공정을 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 모니터링하였다.

야생형 EndoS2로의 처리에 의해 신속한 탈당화로 당화 부위(N297)에서 상응하는 GlcNAc-Fc N-글리칸이 생성되었다. 이러한 결과는 온전한 IgG 상의 야생형 EndoS2의 현저한 Fc 글리칸 가수분해 활성을 확인하고, mAb의 당화 재구성에 대한 제1 단계(가수분해)에서의 유용성을 의미한다. 그러나, EndoS2 돌연변이체로의 처리는 야생형(WT) EndoS2와 비교하여 가수분해 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 특히, T138 및 D226의 돌연변이체는 2 시간의 인큐베이션 기간동안 N-글리칸 가수분해 능력이 극히 낮거나 거의 없고 D182Q의 돌연변이는 WT EndoS2와 비교하여 반응 속도가 60배 이상 감소된 것으로 나타났다. 이 결과는 잔기 D182, T138 및 D226이 글리코시드 가수분해효소 활성에 결정적임을 제시한다(도 3).

공여체 기질로서 2,6 시알릴화된 이-안테나형 복합체 타입(SCT) 옥사졸 린을 사용한 EndoS2 및 그의 돌연변이체의 글리코실전이반응 가능성.

이어서, 도 4에 도시된 바와 같이, 수용체로서 GlcNAc-리툭시맙을, 공여체 기질로서 알파-2,6-시알릴화된 이-안테나형 복합체 타입(SCT) 옥사졸린을 사용하여 EndoS2 및 이의 돌연변이체의 글리코실전이반응 능력을 조사하였다. 당화 재구성 과정을 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 모니터하였다. GlcNAc-리툭시맙 및 SCT-옥사졸린(공여체/수용체, 1:1, 중량비)과 야생형 EndoS2 및 이의 돌연변이체(효소/항체, 1:1000, 몰비)의 배양에 의해 SDS-PAGE에 의해 모니터된 바와 같이 야생형 EndoS2에 대해 상응하는 글리코실전이반응 산물의 일시 형성이 나타났는데, 이는 아마도 야생형 효소에 의한 산물의 신속한 인시츄 가수분해에 의한 것으로 보인다. 가수분해 능력 상실에도 불구하고, 모든 선택된 돌연변이체(T138Q, D182Q, D226Q, T227Q 및 T228Q)는 유의적인 글리코실전이반응 활성을 가졌다. 이러한 결과는 EndoS2 돌연변이체가 산물 가수분해없이 복합체 타입 N-글리칸과 함께 탈당된 온전한 IgG를 당화할 수 있게 하는 새로운 효율적인 글리코신타제임을 제시한다.

T138에서의 다양한 아미노산 잔기가 글리코실전이반응 활성에 미치는 영향.

강력한 글리코실전이반응 활성을 나타내나 가수분해 활성이 결여된 부위 T138에서의 최적의 아미노산 잔기를 동정하기 위해, 이 부위에서 다양한 돌연변이를 수행하였다. 이어 이들 돌연변이체의 글리코실전이반응 능력을 수용체로서 GlcNAc-리툭시맙을, 공여체 기질로서 알파-2,6-시알릴화된 이-안테나형 복합체 타입(SCT) 옥사졸린을 사용하여 조사하였다(도 5). T138(67.5 nM)에서의 다양한 돌연변이체를 67.5 μM GlcNAc-리툭시맙 및 2.5 mM SCT-옥사졸린과 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 산물을 SDS-PAGE로 분석하고, GlcNAc-리툭시맙(IgG) 및 리툭시맙-SCT(IgG-글리칸)의 상대 백분율을 도 5에 나타내었다. 시험한 돌연변이체 중에서, T138E, T138R, T138W, T138M, 및 T138Q가 최대 글리코실전이반응 효능을 제공하였다.

고 만노스 , 하이브리드 및 복합체 타입의 광범위 N- 글리칸을 사용한 EndoS2 돌연변이체의 글리코실전이반응 효율.

인간 IgG 분자는 그의 각각의 Fc CH2 도메인 상에 N-글리칸을 함유한다. 이러한 글리칸은 고-만노스, 하이브리드 및 복합체 타입을 포함한다. Fc N-글리칸 조성이 항체의 프로-염증 및 항염증 활성의 중요한 결정 인자임이 입증되었다. 예를 들어, 코어 푸코스의 부재뿐만 아니라 양분 GlcNAc 부분의 부착은 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)에 관여하는 FcγIIIa 수용체(FcγRIIIa)에 대한 항체의 친화성을 현저히 향상시킨다. 고 만노스 글리칸을 함유하는 재조합 IgG 분자는 인간 혈액에서 신속히 제거되고 열 안정성이 감소된 것으로 나타났다. 또한, 고 만노스 및 하이브리드 글리칸을 함유하는 IgG 분자는 CH2 도메인에서 보다 높은 구조 유연성을 보였다. 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입 Fc-글리칸을 가지는 IgG를 생성하기 위한 가장 일반적인 방법은 포유류, 식물 및 효모 숙주 세포를 비롯한 다양한 발현 시스템을 사용하는 것이다. 그러나, 그러한 발현 시스템은 종종 단일 글리칸 구조보다는 당형의 혼합물을 제공한다. 따라서 생물물리학 및 구조 연구를 위한 치료용 항체의 순수 당형을 얻는 것은 글리칸 공학 분야에서 중요하다. 그래서 펩티드, 단백질 및 IgG의 GlcNAc 수용체에 상이한 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 글리칸을 효율적으로 전달할 수 있는 글리코신타제가 필요하다.

다음으로, 일련의 고 만노스 하이브리드 및 복합체 타입의 글리칸 옥사졸린을 사용하여 본 발명의 EndoS2 돌연변이체의 글리코실전이반응 능력을 평가하였다(표 2). 결과는 시알릴화된 복합체 타입의 N-글리칸 옥사졸린 이외에, EndoS2 돌연변이체가 항체 당조작을 위해 Man₅GlcNAc-옥사졸린(G1), Man₉GlcNAc-옥사졸린(G2), 하이브리드 시리즈 글리칸 G3 및 G4, 및 이- 및 삼-안테나형 복합체 시리즈 글리칸 G5-G16을 전달하여 상응하는 균질 당형의 형성을 유도하는데 동등하게 효율적임을 제시한다. 리툭시맙이 이 연구의 모델 항체로 사용되었다. 그러나 당업자라면 다른 당단백질이 또한 유사한 방식으로 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 결과는 시알릴화된 복합체 타입의 N-글리칸 옥사졸린 외에도, EndoS2 돌연변이체가 고 만노스, 하이브리드 및 삼-안테나형 복합체 타입의 글리칸을 전달하는데 동등하게 효율적이었음을 제시한다.

표 2는 EndoS2의 선택된 돌연변이체의 글리코실전이반응 활성을 평가하기 위해 사용된 다양한 글리칸 옥사졸린의 구조를 기술한다.

복합체 타입 글리칸은 Man-GlcNAc-GlcNAc 코어 상에 존재하는 안테나의 수에 기초하여 이-, 삼- 및 사-안테나형으로 분류된다. 글리칸의 벌키한 특성 때문에, 이-안테나형 글리칸-옥사졸린을 수용하는 글리코신타제가 삼- 또는 사-안테나형 글리칸-옥사졸린을 수용할 수 있는 것은 아주 드문 일이다. 이러한 새로운 EndoS2 돌연변이체의 효과를 입증하기 위해, 일련의 복합체 타입 글리칸 옥사졸린(표 2)을, 리툭시맙이 모델 항체로 사용된 글리코실전이반응에 사용하였다. 결과가 도 7 내지 8에 나와 있다. 이들 결과는 다양한 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 글리칸을 IgG-Fc 영역으로 전달하는데 EndoS2 글리코신타제 돌연변이체의 현저한 글리코실전이반응 효율을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 EndoS2 글리코신타제 돌연변이체는 이들 새로운 돌연변이체는 산물 가수분해 활성이 없기(또는 최소이기) 때문에 그의 이펙터 기능을 향상시키기 위한 상이한 치료용 항체의 효율적이고 완전한 글리코실전이반응을 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입을 비롯한 광범위한 N-글리칸으로 우수한 글리코실전이반응 활성을 나타내는 EndoS2의 선택된 돌연변이체를 개시한다.

바람직한 실시양태에서, 표 2에서 일반식으로 나타낸 바와 같이, 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 N-글리칸은 활성 옥사졸린 형태이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고 만노스 타입 N-글리칸은 Man₃GlcNAc, Man₅GlcNAc,Man₆GlcNAc,Man₇GlcNAc,Man₈GlcNAc, 및 Man₉GlcNAc로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 고 만노스 타입 N-글리칸은 Man₅GlcNAc이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하이브리드 타입 N-글리칸은 α-1,3 암 상에 적어도 하나의 α-2,6- 또는 α-2,3 말단 시알산을 포함하며, 여기서 알파-1,6 암은 트리만노스 잔기를 함유한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하이브리드 타입 N-글리칸은 알파-1,3 암 상에 적어도 하나의 말단 갈락토스를 포함하며, 여기서 알파-1,6 암은 트리만노스 잔기를 함유한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하이브리드 타입 N-글리칸은 α-1,3 암 상에 적어도 하나의 말단 GlcNAc를 포함하며, 여기서 알파-1,6 암은 트리만노스 잔기를 함유한다.

일부 실시양태에서, 복합체 타입 글리칸은 이-, 삼- 및 사-안테나형 복합체 타입이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 α-2,6 또는 α-2,3 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 2개의 α-2,6 및/또는 α-2,3 말단 시알산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 말단 갈락토스 또는 GlcNAc를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 2개의 말단 갈락토스 및/또는 GlcNAc를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 알파-1,2-푸코스를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 2개의 알파-1,2-푸코스를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 알파-1,3-푸코스를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 2개의 알파-1,3-푸코스를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 양분 GlcNAc를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 LacNAc 반복 단위를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 2개의 LacNAc 반복 단위를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 삼-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 α-2,6 또는 α-2,3 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 3개의 α-2-6 및/또는 α-2,3 말단 시알산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 삼-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 말단 갈락토스 또는 GlcNAc를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 3개의 말단 갈락토스 및/또는 GlcNAc를 포함한다.

일부 실시양태에서, 복합체 타입 글리칸은 α-1,3 또는 α-1,6 암 상에 비대칭 안테나를 포함하는 이- 및 삼-안테나형 복합체 타입이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하이브리드 및 이- 및 삼-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 α-2,6 또는 α-2,3 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 하이브리드 및 이- 및 삼-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 α-2,6 말단 시알산을 포함한다.

이펙터 기능의 개선을 위해 다양한 비- 푸코실화된 당형을 제공하기 위한 리툭시맙의 당조작.

리툭시맙은 주로 B 세포 림프종 95%의 표면에서 발견되는 CD20 단백질을 표적으로 하는 모노클로날 항체이다. 리툭시맙은 B 세포를 파괴하므로 과도한 수의 B 세포, 과활성 B 세포 또는 기능 장애가 있는 B 세포를 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용된다. 리툭시맙은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생산되는데, 종종 유사한 생물학적 특성을 나타내지 않을 수 있는 당화 패턴의 이종 혼합물을 전달한다. 항체 내 Fc 당화의 다양성은 Fc 이펙터 기능의 다양성으로 이어질 수 있다. 따라서, Fc 글리칸 내 이러한 이질성은 Fc 수용체 및 C1q에 대한 IgG 분자의 결합에 영향을 미치고 그에 따라 항체 이펙터 기능에 영향을 줌으로써 환자에서 안전성 문제일 수 있는 바람직하지 않은 영향을 유발할 수 있는 기능적 결과를 갖는다.

따라서, 개선된 항-CD20 항체로 모노클로날 항체 치료를 개선할 필요가 있다. 당화 패턴의 이종 혼합물에서 몇 가지 특이적인 당형이 목적하는 생물학적 기능을 부여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 복합체 타입 당형의 경우, 코어 푸코스 및 양분 GlcNAc와 같은 몇몇 변형을 제외하고, 외부 GlcNAc상의 알파-1,2 푸코스, 갈락토스 상의 알파-1,3 푸코스, 폴리 LacNAc 모티프 및 삼- 및 사안테나형과 같은 다수의 고유 변형은 생물학 활성에 대한 그의 영향에 대해 결코 조사된 적이 없다. 따라서, 치료 목적을 위해 목적하는 당형으로서 명확히 정의된 글리칸 구조 및 서열을 함유하는 치료용 항체를 생성하는 것이 매우 중요하다.

치료용 모노클로날 항체와 비교하여, 보다 강력한 생물학적 활성을 나타내는 최적화된 당형을 갖는 기능적으로 활성인 항-CD20 당조작된 항체가 본원에 기술되어 있다.

본 발명은 Fc 당조작에 의해 항-CD20 모노클로날 항체로부터 생성될 수 있는 새로운 부류의 항-CD20 항체를 특징으로 한다. 개별적인 항-CD20 당조작된 항체는 균질한 집단을 포함하고 명확히 정의된 글리칸 구조 및 서열을 갖는 동일한 Fc 글리칸을 함유한다. 본 발명에 따른 당조작된 항-CD20 항체는 그의 모 항체로서 세포막 상에 인간 CD20 항원의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또한, 동일한 항체의 균질 집단은 모두 동일한 이펙터 결합 부위를 갖는다.

본원에서 사용된 용어 "모 항체"는 항-CD20 당조작 항체의 생성에 사용되는 항-CD20 모노클로날 항체를 지칭한다. 모 항체는 포유류 세포 배양물, 피키아 파스 토리스(Pichia pastoris) 또는 곤충 세포주와 같은 세포 배양에 의해 수득될 수 있다. 바람직하게는, 모 항체는 포유류 세포 배양물에서 생성된다. 예시적인 모 항체로는 리툭시맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 오클렐리주맙, 11B8 또는 7D8(WO2004/035607에 개시됨)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 예시적인 항-CD20 당조작된 항체는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항-CD20 당조작된 항체는 각각 리툭시맙의 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 포함한다.

하기 표 3은 리툭시맙의 중쇄 및 경쇄 서열을 나타낸다.

일부 실시양태에서, N-글리칸은 리툭시맙의 Fc 영역의 Asn-297에 부착된다.

본 발명에 따른 N-글리칸은 고 만노스, 하이브리드 및 이- 및 삼-안테나형 복합체 타입 구조를 가질 수 있으며, 여기서 N-글리칸 구조는 하기 일반식을 가진다:

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 N-글리칸은 α-2,3 및/또는 α-2,6 시알산을 갖거나 갖지 않는 "양분 "GlcNAc, α-1,2 푸코스, α-1,3 푸코스를 포함하는 추가의 사슬 내 치환을 가질 수 있으며, 연장된 폴리 LacNAc 모티프일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하이브리드 타입 N-글리칸은 α-1,3-암 상에 적어도 하나의 α-2,6 또는 α-2,3 말단 시알산, 또는 적어도 하나의 말단 갈락토스, 또는 적어도 하나의 말단 GlcNAc를 포함하는 반면, α-1,6 암은 트리만노스 잔기를 포함한다.

일부 실시양태에서, 복합체 타입 글리칸은 이-, 삼- 또는 사-안테나형 복합체 타입이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 알파-1,2 푸코스를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 2개의 알파-1,2 푸코스를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 알파-1,3 푸코스를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 2개의 알파-1,3 푸코스를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 삼-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 적어도 하나의 α-2,6 또는 α-2,3 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, N-글리칸은 3개의 α-2,6 및/또는 α-2,3 말단 시알산을 포함한다.

일부 실시양태에서, 복합체 타입 글리칸은 α-1,3 또는 α-1,6 암 중 어느 하나 상에 비대칭 안테나를 포함하는 이-, 삼- 또는 사-안테나형 복합체 타입이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 하이브리드 및 이- 또는 삼-안테나형 복합체 타입 N-글리칸은 α-2,6 또는 α-2,3 말단 시알산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 하이브리드 및 이-, 삼- 및 사-복합체 타입 N-글리칸은 α-2,6 말단 시알산을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 실시양태에 따른 N-글리칸은 코어 푸코스를 함유하지 않는다.

표 4는 항-CD20 당조작된 항체에서의 예시적인 N-글리칸을 기술한다. 본원의 실시양태는 본원에 기술된 임의의 N-글리칸을 포함하거나 제외할 수 있다.

당조작된 리툭시맙의 생물학적 기능

다양한 항체의 Fc-당화는 ADCC, CDC 및 순환 반감기를 비롯한 이펙터 매개 기능에 크게 영향을 미친다. ADCC 증강은 치료용 항체 약물 효능을 향상시키는데 주요 전략이다. 그것은 약물 비용 절감이라는 혜택을 위해 유효 약물 용량을 낮출 수 있는 잠재력을 갖고 있다. 본원에 기재된 당조작된 항-CD20 항체는 인간 CD20 발현 세포에 대해 세포자멸사를 비롯한 세포 성장 억제 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 당조작된 항-CD20 항체는 모 항체와 비교하여 보다 강력한 세포 성장 억제 활성을 나타낸다.

FcγRIIIA와 당조작된 리툭시맙 간 결합

표 5는 항-CD20 당조작된 항체 및 리툭시맙의 전형적인 FcγRIIIA 결합을 기술한다.

FcγRIIIA 결합은 당 업계에 공지된 검정법을 사용하여 측정될 수 있다. 예시적인 검정법이 실시예에 기재되어 있다. Fc 수용체 결합은 항-CD20 당조작된 항체 대 리툭시맙의 상대 비율로서 결정될 수 있다. 예시적인 실시양태에서 Fc 수용체 결합은 적어도 2.5배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배 또는 20배, 30배 또는 그 이상 증가한다. 고 만노스 시리즈 Man₉GlcNAc₂ 당형은 유망한 결합을 제공할 수 없다. 그러나 Man₅GlcNAc₂ 당형은 변형되지 않은 리툭시맙보다 더 우수하다. 두 하이브리드 타입의 당형은 모두 FcγRIIIA와의 결합을 2 내지 3배 정도만 향상시킬 수 있을 뿐이었다. 흥미롭게도, 원래의 리툭시맙과 비교하여, 이- 및 삼-안테나형을 포함하여 모든 복합체 타입은 30배 이상 향상된 FcγRIIIA와의 결합을 제공하였다. GlcNAc 상에 알파-1,3 푸코스를 갖는 것은 FcγRIIIA 결합에 큰 영향을 주지 않았다. 그러나, 1,2 푸코스는 결합을 약간 감소시켰다. 또한, 삼-안테나형 당형에 존재하는 것과 같이 다중 안테나를 갖는 것은 결합에 큰 기여를 하지 못했다. 하지만 증가된 시알산 함량을 가진 글리칸은 항염증 활성을 가질 수 있다고 판단된다.

리툭시맙과 비교하여, 결합 데이터는 당조작된 항-CD20 항체, 특히 복합체 당형을 갖는 것이 FcγRIIIA에 대해 더 강한 결합 친화성을 나타냄을 보여주었다.

당조작된 리툭시맙의 ADCC 활성

본 발명에 따른 당조작된 리툭시맙의 ADCC 활성은 모 항체의 ADCC 활성에 비해 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 9배, 보다 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 12배 증가된 ADCC 활성, 바람직하게는 적어도 20배, 가장 바람직하게는 적어도 30배 증가된 ADCC 활성을 갖는다.

표 6은 선택된 당조작된 항-CD20 항체 및 시판 리툭시맙에 대한 예시적인 향상된 ADCC 활성을 기술한다. 예시적인 검정법은 실시예에 기재되어 있다.

당형	R²	EC₅₀ [ng/mL]	최대 세포용해(%)	배수
시판 리툭시맙	0.987	13.55	27.79	1
Rtx-G5	0.946	2.181	32.02	6.55
Rtx-G6	0.954	2.927	39.18	4.6
Rtx-G14	0.942	2.323	38.76	5.8
Rtx-G15	0.968	1.911	37.98	7.0

본 발명에 의해 개시된 일련의 항-CD20 당조작된 항체, 특히 복합체 당형을 갖는 것은 모 항체인 리툭시맙과 비교하여 향상된 ADCC 활성을 나타낸다. 본 발명의 당조작된 항체는 B 세포 또는 B 세포에 의해 생산된 항체가 관여하는 B 세포-매개 악성 종양 및 면역 질환용 치료제로서 우수한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 생각된다. 본 발명의 목적은 항-CD20 당조작된 항체를 치료제 개발에 사용하는 것이다.

종합하면, 항-CD20 당조작된 항체는 리툭시맙에 비해 향상된 ADCC 활성 및 더 강한 FcγRIIIA 결합 친화성을 나타낸다. 본 발명의 당항체는 단독으로, 또는 2종 이상의 상기 항체를 포함하는 조성물에서, 선택적으로 화학요법과 같은 다른 치료법과 병용하여 우수한 임상 반응을 제공할 수 있다. ADCC 향상된 항-CD20 당조작된 항체는 B 세포 림프종 및 다른 질환에 대해 대안적인 치료를 제공할 수 있다. 증가된 이펙터 기능은 보다 낮은 농도와 보다 적은 빈도로 투여되어 항체 독성의 잠재성 및/또는 항체 내성의 발달 감소를 의미하므로, 본 발명의 당조작된 항체는 유리하게도 현재의 투여 경로 및 현재의 치료 요법을 변경시키는데 사용될 수 있다. 또한, 개선된 이펙터 기능은 이전에 재조합 숙주 시스템에서 생성된 상응하는 항-CD20 모노클로날 항체로의 치료에 저항성이거나 불응성이었던 임상 징후를 치료하는 새로운 접근법을 제시한다.

항-CD20 항체의 당조작 방법

본 발명의 항-CD20 당조작된 항체는 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 전임상 또는 임상 개발 중에 있는 임의의 항-CD20 모노클로날 항체("모 항체")로부터 Fc 당조작에 의해 생성시킬 수 있다. Fc 당조작은 효소적으로 또는 화학적으로 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 모 항체는 리툭시맙이다.

본 발명의 당조작된 항체에서 N-글리칸은 바람직하게는 탈푸코실화된다.

본원에는 항-CD20 당조작된 항체와 같은 당조작된 항체를 제조하기 위한 개선된 방법이 개시되어 있다. 본 발명의 방법은 (a) 항-CD20 모노클로날 항체를 α-푸코시다제 및 엔도글리코시다제와 접촉시켜 단일 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc)을 갖는 탈푸코실화 항체를 생성시키는 단계, 및 (b) 탄수화물 부분을 적절한 조건하에서 GlcNAc에 첨가하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따른 항-CD20 모노클로날 항체는 리툭시맙이다.

임의의 적합한 엔도글리코시다제를 사용하여 N-글리칸의 올리고사카라이드의 가변 부분을 절단할 수 있다. 본원에서 사용된 엔도글리코시다제의 예에는 EndoS2가 포함된다.

본 발명의 방법에서 단계 (a)는 단일 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc)을 갖는 탈푸코실화 항체를 유도한다. 이어, EndoS2 돌연변이체는 GlcNAc에 선택된 광범위 탄수화물 부분을 부가하여 당 사슬을 연장하도록 글리코실전이반응을 매개한다. 따라서 당항체의 균질한 집단이 생성될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 트랜스글리코실라제의 예는 서열번호 2 내지 17의 서열을 갖는 EndoS2의 선택된 돌연변이를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 실시양태에 따른 탄수화물 부분은 하기 화학식을 갖는 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 다양한 N-글리칸을 포함할 수 있다:

일부 실시양태에서, 탄수화물 부분은 당 옥사졸린이다.

적합한 조건은 또한 적어도 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 70 분, 80 분, 90 분 또는 100 분, 바람직하게는 60 분 미만 동안 반응 혼합물을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 인큐베이션은 바람직하게는 실온, 보다 바람직하게는 약 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃, 40 ℃ 또는 45 ℃, 가장 바람직하게는 약 37 ℃에서 수행된다.

약학적 제형

본 발명의 항체를 포함하는 치료 제형은 목적하는 순도를 갖는 항체를 하나 이상의 임의적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed(1980))와 혼합함으로써 수용액, 동결건조 또는 다른 건조 제형의 형태로 저장용으로 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며. 인산염, 시트르산염, 히스티딘 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 금속 복합체(예: ZN-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

본원의 제형은 또한 서로에게 악영향을 미치지 않는 보완 활성을 갖는 것들이 포함되지만 이에 제한되지는 않는, 치료할 특정 증상에 필요한 복수의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합하여 존재한다.

활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 각각 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에 도입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)]에 기재되어 있다.

생체 내 투여에 사용되는 제형은 무균이어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 본 발명의 면역글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투막 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로서는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-L-하이드록시부티르산을 들 수 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 분자 방출이 가능하지만, 특정의 하이드로겔은 더 짧은 시간 동안만 단백질을 방출한다. 캡슐화된 면역글로불린이 장시간 체내에 남아있는 경우, 37 ℃에서 수분에 노출되면 변성되거나 응집되어 생물학적 활성이 상실되고 면역원성이 변할 수 있다. 관련 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 짤 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디설파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면 설프하이드릴 잔사를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 매트릭스를 개발함으로써 안정화를 이룰 수 있다.

동결건조 전 제형에서 항체의 양은 목적하는 용량 부피, 투여 방식(들) 등을 고려하여 결정된다. 선택된 단백질이 온전한 항체(전장 항체)인 경우, 약 2 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 바람직하게 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 및 가장 바람직하게 약 20 내지 30 mg/mL가 예시적인 출발 단백질 농도이다. 단백질은 일반적으로 용액 중에 존재한다. 예를 들어, 단백질은 약 4 내지 8의 pH 및 바람직하게 약 5 내지 7의 pH에서 pH-완충된 용액 중에 존재할 수 있다. 예시적인 완충액은 히스티딘, 인산염, 트리스, 시트르산염, 숙신산염 및 다른 유기산을 포함한다. 완충제 농도는 예를 들어, 완충제 및 제형(예를 들어, 재구성된 제형의)의 목적하는 등장성에 따라 약 1 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 바람직한 완충제는 하기 입증된 바와 같이, 동결보호 성질을 가질 수 있다는 점에서 히스티딘이다. 숙신산염이 또 다른 유용한 완충제인 것으로 나타났다.

동결보호제는 동결건조전 제형에 첨가된다. 바람직한 실시양태에서, 동결보호제는 수크로스 또는 트레할로스와 같은 비-환원 당이다. 동결건조전 제형 중 동결보호제의 양은 일반적으로 재구성시 수득한 제형이 등장성이도록 하는 것이다. 그러나, 고장성의 재구성된 제형이 또한 적합할 수 있다. 추가로, 동결보호제의 양은 허용되지 않은 양의 단백질의 분해/응집이 동결건조시 일어날 정도로 너무 낮아서는 안된다. 동결보호제가 당(예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스)이고 단백질이 항체인 경우, 동결건조전 제형 중에 예시적 동결보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 바람직하게는 약 30 mM 내지 약 300 mM, 및 가장 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 100 mM이다.

단백질 대 동결보호제의 비율은 각각의 단백질 및 동결보호제 조합을 위해 선택된다. 항체가 선택된 단백질이고 당(예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스)이 높은 단백질 농도를 갖는 등장성의 재구성된 제형을 생성하기 위한 동결보호제인 경우, 동결보호제 대 항체의 몰비는 약 100 내지 약 1500몰의 동결보호제 대 1몰 항체 및 바람직하게는, 약 200 내지 약 1000몰의 동결보호제 대 1몰 항체, 예를 들어, 약 200 내지 약 600몰의 동결보호제 대 1몰 항체일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 동결건조 전 제형에 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 대안적으로, 또는 추가로, 계면활성제는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형에 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 설페이트(SDS); 소듐 라우릴 설페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔니도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUAT^TM 계열(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체(예를 들어, Pluronics, PF68 등)와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 첨가되는 계면활성제의 양은 이것이 재구성된 단백질의 응집을 감소시키고 재구성 후 미립자의 형성을 최소화하도록 하는 정도이다. 예를 들어, 계면활성제는 약 0.001 내지 0.5%, 및 바람직하게는 약 0.005 내지 0.05%의 양으로 동결건조전 제형 중에 존재할 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서 동결보호제(예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스) 및 벌크제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신)의 혼합물이 동결건조전 제형 제제에 사용된다. 벌크제는 과도한 포켓이 안에 없는 균일한 동결건조된 케이크의 제조를 가능하게 한다.

문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)]에 기재된 것들과 같은 다른 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제가 동결건조 전 제형(및/또는 동결건조된 제형 및/또는 재구성된 제형)에 포함될 수 있으되, 단, 이들은 제형의 목적하는 특징에 부정적인 영향을 미치지 않아야 한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고 다음을 포함한다: 추가의 완충제; 보존제; 공용매; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 생분해성 중합체, 예를 들어, 폴리에스테르; 및/또는 염-형성 반대이온, 예를 들어, 나트륨.

본원에 기재된 약학적 조성물 및 제형은 바람직하게는 안정하다. "안정한" 제형/조성물은 여기의 항체가 저장시 이의 물리적 및 화학적 안정성 및 통합성을 필수적으로 보유하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석적 기술은 당 업계에서 이용가능하고 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs.(1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90(1993)]에서 검토되었다. 안정성은 선택된 시기 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다.

생체 내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균되어야 한다. 이것은 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 성취된다. 대안적으로, 전체 혼합물의 멸균성은, 예를 들어, 약 30 분 동안 약 120 ℃에서 단백질을 제외한 성분들을 오토클레이빙하여 이룰 수 있다.

단백질, 동결보호제 및 다른 임의의 성분들을 함께 혼합한 후, 제형은 동결건조시킨다. Hull50®(Hull, USA) 또는 GT20®(Leybold-Heraeus, Germany) 동결건조제와 같은 많은 상이한 동결건조제가 상기 목적을 위해 이용가능하다. 동결건조는 제형을 동결시키고 이어서 1차 건조를 위해 적합한 온도에서 동결된 내용물로부터 얼음을 승화시킴에 의해 성취된다. 이 조건하에서, 산물의 온도는 제형의 공융점 미만 또는 붕괴 온도 미만이다. 전형적으로, 1차 건조를 위한 선반 온도는 전형적으로 약 50 내지 250 mTorr 범위의 적합한 압력에서 약 -30 내지 25 ℃ 범위이다(단, 생성물은 1차 건조 동안에 동결된 상태로 유지된다). 제형, 샘플을 보유하는 컨테이너(예를 들어, 유리 바이알)의 크기 및 유형 및 액체 용적이 주로 수시간 내지 수일(예를 들어, 40 내지 60 시간)의 범위일 수 있는 건조를 위해 요구되는 시간을 지정할 것이다. 2차 건조 단계는 주로 컨테이너의 유형 및 크기 및 사용되는 단백질의 유형에 따라 약 0 내지 40 ℃에서 수행될 수 있다. 그러나, 본원에서 2차 건조 단계는 필요치 않을 수도 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 동결건조 상의 전체 물 제거에 걸친 선반 온도는 약 15 내지 30 ℃(예를 들어, 약 20 ℃)일 수 있다. 2차 건조를 위해 요구되는 시간 및 압력은 예를 들어, 온도 및 다른 파라미터에 의존하여 적합한 동결건조된 케이크를 생성시키는 것일 것이다. 2차 건조 시간은 생성물에서 목적하는 잔류 수분 수준에 의해 지정되고 전형적으로 적어도 약 5시간(예를 들어, 10 내지 15 시간) 걸린다. 압력은 1차 건조 단계 동안에 사용되는 것과 동일할 수 있다. 동결건조 조건은 제형 및 바이알 크기에 따라 다양할 수 있다.

일부 경우에, 컨테이너 내의 단백질 제형을 동결건조시키는 것이 바람직할 수 있고 여기서, 단백질의 재구성이 전달 단계를 피하기 위해 수행될 것이다. 상기 경우에 컨테이너는 예를 들어, 3, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알일 수 있다. 일반적으로, 동결건조는 수분 함량이 약 5% 미만 및 바람직하게는 약 3% 미만인 동결건조된 제형으로 이어질 것이다.

요구되는 단계에서, 전형적으로 단백질을 환자에게 투여하는 시점에, 동결건조된 제형은 재구성된 제형에서 단백질 농도가 적어도 50 mg/mL, 예를 들어, 약 50 mg/mL 내지 약 400 mg/mL, 보다 바람직하게는 약 80 mg/mL 내지 약 300 mg/mL, 및 가장 바람직하게는 약 90 mg/mL 내지 약 150 mg/mL이 되도록 희석제로 재구성될 수 있다. 재구성된 제형에서 이러한 높은 단백질 농도는 재구성된 제형의 피하 전달이 의도되는 경우 특히 유용할 것으로 판단된다. 그러나, 다른 투여 경로, 예를 들어, 정맥 내 투여를 위해, 재구성된 제형 중에 더 낮은 농도의 단백질이 요구될 수 있다(예를 들어, 재구성된 제형에서 약 5 내지 50 mg/mL, 또는 약 10 내지 40 mg/mL 단백질). 특정 실시양태에서, 재구성된 제형에서 단백질 농도는 동결건조전 제형에서보다 훨씬 더 높다. 예를 들어, 재구성된 제형에서 단백질 농도는 동결건조전 제형의 약 2 내지 40배, 바람직하게는 3 내지 10배 및 가장 바람직하게는 3 내지 6배(예를 들어. 적어도 3배 또는 적어도 4배)일 수 있다.

재구성은 완전한 수화를 보장하기 위해 일반적으로 약 25 ℃의 온도에서 수행되지만, 필요하다면 다른 온도가 사용될 수 있다. 재구성을 위해 요구되는 시간은 예를 들어, 희석제의 유형. 부형제(들)의 양 및 단백질에 좌우된다. 예시적인 희석제는 멸균수, 세균억제 주사용수(BWFI), pH 완충 용액(예를 들어, 인산염 완충 식염수), 멸균 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 상기 희석제는 임의로 보존제를 함유한다. 예시적 보존제는 상기된 바와 같고, 벤질 또는 페놀 알콜과 같은 방향족 알콜이 바람직한 보존제이다. 사용되는 보존제의 양은 단백질 및 보존제 효능 시험과 함께 양립성에 대한 상이한 보존제 농도를 평가하여 결정된다. 예를 들어, 보존제가 방향족 알콜(예를 들어, 벤질 알콜)인 경우, 이것은 약 0.1 내지 2.0%의 양 및 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5%의 양, 가장 바람직하게는 약 1.0 내지 1.2%의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게, 상기 재구성된 제형은 크기가 >10㎛인 바이알당 6000개 미만의 입자를 갖는다.

치료적 적용

본원에 기재된 당조작된 항체는 암에 걸린 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 치료 방법은 본원에 기재된 당조작된 항체 또는 약학 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 암의 예로서는 B 세포 림프종, NHL, 전구 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프성 백혈병(CLL)/소림프성 림프종(SLL), B 세포전림프성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 저등급, 중간 등급 및 고등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 타입 변연부 B 세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 비장 타입 변연부 B 세포 림프종, 털세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질 세포 골수종, 이식후 림프세포 증식 질환, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 역형성 대세포 림프종(ALCL)을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 암은 비호지킨 림프종과 같은 B-세포 림프종이다.

또한, 본원에 기재된 당조작된 항체는 자가면역 또는 염증성 질환이 있는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 치료 방법은 본원에 기재된 당조작된 항체 또는 약학 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 자가면역 또는 염증성 질환의 예로서는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병(TTP), 자가면역 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신증, IgM 다발성신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노드 증후군, 크론 질환, 궤양성 대장염, 위염, 하시모토 갑상선염, 강직성 척추염, C형 간염-관련 냉각글로불린 혈관염, 만성 초점 뇌염, 유천포창, 혈우병 A, 막증식성 사구체신염, 성인 및 소아 피부근염, 성인 다발성근염, 만성 두드러기, 1차 담즙성 간경변증, 시속신경수염, 그레이브 갑상선 질환, 유천포창, 막증식성 사구체신염, 처그-스트라우스 증후군, 천식, 건선 관절염, 피부염, 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 뇌염, 포도막염, 습진, 죽상동맥경화증, 백혈구 접착 결핍, 소아 발병 당뇨병, 라이터 질환(Reiter's disease), 베체트 질환(Behcet's disease), 용혈성 빈혈, 아토피 피부염, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 오멘 증후군(Omenn's syndrome), 만성 신부전증, 급성 감염성 단핵증, HIV 및 헤르페스-관련 질환, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군(Sjorgen's syndrome) 및 사구체신염, 피부근염, ANCA, 재생불량성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 백혈구 감소증, 캐슬맨 증후군(Castleman's syndrome), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 고형 기관 이식 거부, 이식 대 숙주 질환(GVHD), 자가면역 간염, 림프구 간질 폐렴(HIV), 폐쇄 세기관지 기질화 폐렴(비-이식체), 귈랑-바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 대형 혈관 혈관염, 거대 세포(타카야수) 동맥염, 중간 혈관 혈관염, 가와사키 질환, 및 다발동맥염 결절을 들 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

특정 실시양태에서, 자가면역 또는 염증성 질환은 류마티스 관절염이다.

이러한 치료 방법에서, 항-CD20 당조작된 항체는 단독으로 또는 제2 항체와 같은 제2 치료제 또는 화학요법제 또는 면역억제제와 병용 투여될 수 있다. 제2 항체는 CD20 또는 상이한 B 세포 항원 또는 NK 또는 T 세포 항원에 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명의 실시양태가 하기 특정 실시예로 보다 상세히 설명될 것이다. 당업자는 이러한 특정 실시예들이 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다른 수정 및 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 EndoS2 돌연변이체는 항체를 비롯한 임의의 당단백질 또는 글리코펩티드를 당조작하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 특정 실시예는 항-CD20 항체를 사용한다. 그러나 당업자는 다른 당단백질 또는 항체가 또한 유사한 방식으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

재료 및 방법

모노클로날 항체는 상업적 공급원으로부터 입수되었거나 사내에서 생산되었다. 고 만노스, 하이브리드 및 복합체 타입의 N-글리칸은 이전에 보고된 절차에 따라 합성되었다. (20, 21).

EndoS2 및 돌연변이체의 클론 작제 , 과발현 및 정제.

스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes) GAS NZ131으로부터 EndoS2 코딩 유전자, ndoS2를 합성하고 pET28a 발현 벡터에 서브클로닝하였다. ndoS2의 신호 펩티드 서열(아미노산 1-36)을 그 N-말단상의 His₆-태그로 대체시켰다. 제조자의 지시(Agilent Technologies)에 따라 부위-지정 돌연변이유발에 의해 ndoS2의 돌연변이체를 생성하고 ndoS2 발현 벡터를 주형으로 하고 프라이머로 목적하는 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이어서, 증폭된 DNA를 DpnI로 처리하고 DH5α 적격 세포로 형질전환하였다. 돌연변이된 서열을 DNA 시퀀싱(Genomics)으로 확인하였다. 발현을 위한 BL21(DE3) 적격 세포로의 형질전환 후, 세포를 0.1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)로 유도하고, His₆ 태그를 갖는 재조합 EndoS2 돌연변이 단백질을 20 ℃에서 16 시간 동안 발현시키고 30 분 동안 6500 rpm에서 원심분리하여 펠렛화하였다. 세포를 용해 완충액(30 mM HEPES, pH 8.0, 300 mM NaCl)에 재현탁시키고, 초음파 처리기(10 분, 4s-on/5s-off, ChromTech)를 사용하여 파괴시켰다. 총 세포 용해물을 10000 rpm으로 45 분 동안 원심분리하고, 가용성 재조합 EndoS2 및 돌연변이 단백질을 Ni-NTA 칼럼(GE Healthcare)을 갖춘 고정화된 금속-이온 크로마토그래피로 정제하였다. 용출된 단백질 분획을 수집하고, Amicon 초원심분리 필터를 사용하여 저장 완충액(30 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM NaCl)에 대해 10 kDa로 농축하였다. 농축 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고, 단백질 농도를 Nano-Drop 2000c 분광광도계를 사용해 정량화하였다. 야생형 EndoS2의 과생산 수율은 약 35 mg/L이었고 돌연변이체의 수율은 약 25 mg/L이었다.

시판 리툭시맙으로부터 GlcNAc- 리툭시맙의 제조.

1.25 ml의 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 중 리툭시맙(상업적 공급원로부터 2.5 mg)을 37 ℃에서 22 시간 동안 EndoS2(125 μg) 및 푸코시다제(2.5 mg)와 함께 인큐베이션하였다. SDS-PAGE 분석으로 확인하여 중쇄상의 N-펩티드의 완전한 절단 후, 반응 혼합물을 20 mM 인산나트륨(pH 7.0)으로 예비평형화시킨 1 ml 단백질 A-아가로스 수지 칼럼상에서 친화성 크로마토그래피하였다. 세척 후, 결합된 IgG를 50 mM 글리신 HCl(pH 3.0) 10 ml로 용출시켰다. 용출 분획을 1M Tris-Cl(pH 8.3)으로 즉시 중화시키고 원심 여과(Amicon 초원심 필터)에 의해 농축시켜 GlcNAc-리툭시맙(1.93 mg)을 수득하였다. 산물을 트립신화하고, 나노스프레이 LC/MS를 사용하여 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR 및 EEQYNSTYR을 분석하여 GlcNAc-리툭시맙의 당화 패턴을 확인하였다.

글리칸 - 옥사졸린의 제조

물(300 내지 500 ㎕) 중 각각의 글리칸(3-5 mg), 2-클로로-1,3-디메틸이미다졸리늄 클로라이드(DMC)(6-10 mg) 및 Et₃N(10-20 ㎕)의 용액을 4 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0.05% 수성 Et₃N으로 용리되는 Sephadex G-25 칼럼상에서 겔 여과 크로마토그래피하였다. G1-G16 산물(글리칸 옥사졸린)을 함유하는 분획을 합하고 동결건조하여 백색 분말을 얻었다(2.5-4 mg, 수율 약 80-90%).

EndoS2 및 이의 돌연변이체의 가수분해 활성 분석.

100 mM HEPES 완충액(pH 7.0) 중 52 μM 리툭시맙(400 μg) 및 52 nM EndoS2 또는 그의 선택된 돌연변이 단백질을 함유하는 용액을 37 ℃에서 700 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션하였다. 지정된 시점에, 2 μg의 분취량을 취해 10% SDS-PAGE로 분석하였다. 가수분해된 글리칸을 함유하는 리툭시맙은 PAGE 상에서 더 빠른 이동을 보일 것이다. SDS-PAGE 상의 밴드 강도에 기초해 Image J 소프트웨어를 사용하여 가수분해 산물의 상대 백분율을 계산하였다(도 3).

공여체 기질로서 SCT- 옥사졸린을 사용한 EndoS2 및 이의 돌연변이체의 글 리코실전이반응 활성 검정.

100 mM HEPES 완충액(pH 7.0) 중 67.5 μM 모노 GlcNAc-리툭시맙 (400 μg) 및 2.5 mM 시알릴화된 복합체 타입 글리칸 (SCT)-옥사졸린 (200 μg)을 함유하는 용액을 67.5 nM EndoS2 또는 선택된 돌연변이 단백질과 함께 37 ℃에서 700 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션하였다. 지정된 시점에, 2 μg 분취량을 취해 10% SDS-PAGE로 분석하였다. 당화된 리툭시맙은 PAGE 상에서 더 느린 이동을 보일 것이다. SDS-PAGE 상의 밴드 강도에 기초해 Image J 소프트웨어를 사용하여 리툭시맙-SCT의 상대 백분율을 계산하였다.

EndoS2 돌연변이체를 사용하여 다양한 글리칸 옥사졸린으로 GlcNAc- 리툭시맙의 글리코실전이반응 .

일반적인 절차: 100 mM HEPES 완충액(pH 7.0) 중 EndoS2 돌연변이체(16.8 μM) 및 GlcNAc-리툭시맙(2 mg, 0.337 mM)의 혼합물에 글리칸 옥사졸린(2-3 mg)을 첨가하고, 1-2 시간 동안 700 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 0.1 mM의 EDTA 용액을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 단백질 A 친화성 칼럼에 이어 아마니온 교환 칼럼 capto Q로 정제하여 목적 산물인 항-CD20 당조작된 리툭시맙을 수집하였다. 산물을 트립신화하고, 나노스프레이 LC/MS를 사용하여 글리코펩티드, TKPREEQYNSTYR 및 EEQYNSTYR을 분석하여 목적하는 당화 패턴을 확인하였다.

표 7은 각각의 리툭시맙 당형 제조를 위한 최적화된 반응 세목을 기술한다.

출발 물질	리툭시맙 당형	EndoS2 돌연변이체	효소 비	글리칸 옥사졸린	글리칸의 양	반응 시간
GlcNAc- 리툭시맙 (2 mg, 0.337 mM)	Rtx-G1	D226Q	16.8 μM	G1	2 mg	30 분
	Rtx-G2	T138Q	33.7 μM	G2	3 mg	30 분
	Rtx-G3	D182Q	16.8 μM	G3	2 mg	30 분
	Rtx-G4	D226Q	16.8 μM	G4	2 mg	60 분
	Rtx-G5	D182Q	16.8 μM	G5	3 mg	30 분
	Rtx-G6	D138Q	33.7 μM	G6	3 mg	30 분
	Rtx-G7	T138Q	16.8 μM	G7	2 mg	30 분
	Rtx-G8	T138Q	16.8 μM	G8	2 mg	30 분
	Rtx-G9	D182Q	16.8 μM	G9	2 mg	30 분
	Rtx-G10	D182Q	16.8 μM	G10	2 mg	30 분
	Rtx-G11	D182Q	16.8 μM	G11	2 mg	60 분
	Rtx-G12	D182Q	16.8 μM	G12	2 mg	60 분
	Rtx-G13	D138Q	16.8 μM	G13	2 mg	30 분
	Rtx-G14	D182Q	16.8 μM	G14	3 mg	60 분
	Rtx-G15	D182Q	16.8 μM	G15	2 mg	60 분
	Rtx-G16	D182Q	16.8 μM	G15	2 mg	60 분

당조작된 항-CD20 항체의 FcγRIIIA에 대한 결합 친화성

FcγIIA 수용체에 대한 리툭시맙의 재구성된 당형의 친화성을 ELISA로 조사하였다.

마이크로타이터 플레이트(Corning^® 96 웰 투명 평저 폴리스티렌 고 결합, # 9018)를 4 ℃에서 밤새 50 mM 중탄산염/탄산염 코팅 완충액(pH 10)에서 희석된 50 ng/웰의 재조합 가용성 FcγRIIIA로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBST(PBS 중 0.05% Tween 20)로 3회 세척하고 PBST 중의 5% BSA로 실온에서 1 시간 동안 블록킹하였다. 2% BSA/PBST에서 100 μg/ml의 농도로 시작하여 연속 8회 희석하여 당조작된 항체(Rtx G1-G16)의 결합 활성을 중복 측정하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 3회 세척하였다. 다음에, 2% BSA/PBST 중의 양고추냉이 과산화효소(Jackson immune, #109-035-088)에 접합된 염소 항-인간 IgG를 웰 당 100 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척한 후, 웰 당 100 ㎕의 TMB 기질(eBioscience, #00-4201-56)을 첨가하고, 생성된 플레이트를 암소에서 실온으로 15 분 동안 인큐베이션하였다. ELISA 판독기(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도 값을 측정하였다.

당조작된 항-CD20 항체의 ADCC 활성

항체 매개 ADCC를 칼세인 방출 검정법을 사용하여 평가하였다. Raji 세포(인간 버킷 림프종 세포주)를 표적 세포로서 BCRC로부터 수득하였다. Ficoll-Paque(GE healthcare)를 이펙터 세포로 사용하여 건강한 지원자의 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. 표적 세포(1×10⁶/ml)를 10 μM 칼세인-아세톡시메틸 에스테르(Thermo Fisher Scientific)로 37 ℃에서 30 분간 표지하였다. 세척 후, 표지화된 표적 세포를 웰당 50 ㎕ 중에 1×10⁴ 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 분배하였다. 다양한 농도의 항체와 이펙터 세포(웰 당 2.5×10⁵)를 25:1의 E/T 비로 첨가하였다. 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 침강시키고, 상등액 150 ㎕를 수집한 다음, 형광 마이크로플레이트 판독기로 분석하여 칼세인 방출을 측정하였다. 최대 방출을 위해, 세포를 1% Triton X-100으로 용해시켰다. 배양 배지 백그라운드의 형광값을 실험 결과의 값에서 제하였다.

본 발명이 제한된 수의 실시양태와 관련하여 설명되었지만, 당업자라면 본 개시의 이점을 가지고 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다른 실시양태가 구상될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 한정되어야 한다.

참고문헌

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640 Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp 645 650 655 Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly 660 665 670 Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile 675 680 685 Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu 690 695 700 Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe 705 710 715 720 Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala 725 730 735 Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys 740 745 750 Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met 755 760 765 Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr 770 775 780 Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu 785 790 795 800 Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala 805 810 815 Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg 820 825 830 Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Asp 835 840 <210> 18 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 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Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Arg Gly Glu Cys 210

Claims

야생형 엔도글리코시다제 S2(EndoS2)의 서열(서열번호 1)에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 야생형 EndoS2 보다 가수분해 활성이 더 낮으며, 야생형 EndoS2 보다 글리코실전이반응 활성이 더 높은 EndoS2의 돌연변이체로서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 잔기 133-143, 잔기 177-182, 잔기 184-189, 잔기 221-231, 및/또는 잔기 227-237 내에 위치하는 펩티드 영역에 존재하는 EndoS2의 돌연변이체.
제1항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 잔기 T138, D182, D226, T227, 및/또는 T228에 위치하는 것인 EndoS2의 돌연변이체.
제1항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 T138D, T138E, T138F, T138H, T138K, T138L, T138M, T138N, T138Q, T138R, T138V, T138W, D182Q, D226Q, T227Q, 및 T228Q로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 EndoS2의 돌연변이체.
제1항에 있어서, 돌연변이는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인 EndoS2의 돌연변이체.
활성화된 올리고사카라이드를 당단백질 수용체에 커플링시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 EndoS2의 돌연변이체를 사용하여 공학적으로 조작된 당단백질을 제조하는 방법.
제5항에 있어서, 활성화된 올리고사카라이드는 글리칸 옥사졸린인 것인 방법.
제5항에 있어서, 글리칸 옥사졸린은 하기 화학식을 갖는 N-글리칸을 포함하는 것인 방법:

상기에서, R¹은 -H 또는 β-1,4 결합을 통해 부착된 N-아세틸 글루코사민이고, R²및 R³은 동일하거나 상이하고 독립적으로 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된다:
제5항에 있어서, 당단백질 수용체는 GlcNAc 모노사카라이드를 함유하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 당단백질 수용체는 비푸코실화된 GlcNAc-수용체인 것인 방법.
제5항에 있어서, 당단백질 수용체는 글리코펩티드, 당단백질, 항체 또는 이의 단편인 것인 방법.
제5항에 있어서, 당단백질 수용체는 코어 푸코실화 또는 비푸코실화된 GlcNAC-IgG 수용체 또는 이의 단편인 것인 방법.
제5항에 있어서, GlcNAC-IgG 수용체는 세툭시맙, 리툭시맙, 뮤로모납-CD3, 아브식시맙, 다클리주맙, 바실릭시맙, 팔리비주맙, 인플릭시맙, 트라스투주맙, 겜투주맙 오조가마이신, 알렘투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 아달리무맙, 오말리주맙, 토시투모맙, I-131 토시투모맙, 에팔리주맙, 베바시주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 나탈리주맙, 에타너셉트, IGN101, 볼로식시맙, 항-CD80 mAb, 항-CD23 mAb, CAT-3888, CDP-791, 에랍투주맙, MDX-010, MDX-060, MDX-070, 마투주맙, CP-675,206, CAL, SGN-30, 자놀리무맙, 아데카투무맙, 오레고보맙, 니모투주맙, ABT-874, 데노수맙, AM 108, AMG 714, 폰톨리주맙, 다클리주맙, 골리무맙, CNTO 1275, 오클렐리주맙, HuMax-CD20, 벨리무맙, 에프라투주맙, MLN1202, 비실리주맙, 토실리주맙, 오클렐리주맙, 세톨리주맙 페골, 에쿨리주맙, 펙셀리주맙, 아브식시맙, 라니비지무맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 모노클로날 항체로부터 유래된 것인 방법.
제5항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 당단백질.
제13항의 당단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
유효량의 제14항에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하는, 암 치료방법.