KR20190027530A - Sp-pcr 기반의 마이크로 디바이스, 제조방법 및 이를 이용한 타겟 증폭 및 검출방법 - Google Patents

Sp-pcr 기반의 마이크로 디바이스, 제조방법 및 이를 이용한 타겟 증폭 및 검출방법 Download PDF

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Abstract

SP-PCR 기반의 마이크로 디바이스, 제조방법 및 이를 이용한 타겟 증폭 및 검출방법이 개시된다. 본 발명의 일 구체예에 따른 SP-PCR 기반의 마이크로 디바이스는 열가소성 플라스틱(폴리카보네이트)으로 형성되는 마이크로 챔버의 표면을 폴리에틸렌이민 및 글루타르알데히드로 처리하여 아민-개질된 프라이머를 고정시킬 수 있도록 반응성 표면을 형성시킨다. 이에 따라 비교적 단순한 형태의 SP-PCR 증폭이 가능한 마이크로 디바이스를 제공할 수 있다. 나아가 PCR 시약에 포함되는 역방향 프라이머에 표지 물질을 결합시킴으로써, PCR 증폭 이후에 마이크로 챔버에 대하여 바로 형광 검출을 수행할 수 있는 바, 간편하고 효율성 있는 진단 분석이 가능하다.

Description

SP-PCR 기반의 마이크로 디바이스, 제조방법 및 이를 이용한 타겟 증폭 및 검출방법{MICRO DEVICE BASED SOLID-PHASE POLYMERASE CHAIN REACTION, MANUFACTURING METHOD AND SP-PCR METHOD USING THE SAME}
본 발명은 마이크로 디바이스, 제조방법 및 이를 이용한 SP-PCR 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SP-PCR(Solid-phase PCR) 기반의 마이크로 디바이스, 제조방법 및 이를 이용한 타겟 증폭 및 검출방법에 관한 것이다.
핵산 기반의 시험 방법은 분자 레벨에서의 해로운 미생물의 진단에 중요한 역할을 하고 있다. 특히 중합효소연쇄반응(PCR)은 생의학 및 생화학 연구 분야의 대부분의 분자 진단 방법으로 널리 이용된다. 근래 랩온어칩(LOC) 기술분야에서는 PCR에 관련된 다른 기능적 요소들의 소형화 및 통합화에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 관련하여 SP-PCR(고체상 PCR)은 DNA 증폭 및 진단을 동시에 수행할 수 있는 특성을 가지는 바, 통합 랩온어칩 플랫폼 개발에 적용될 수 있는 유망한 후보 중 하나다.
기존 SP-PCR 랩온어칩 플랫폼에 대한 연구개발은 고체-지지 프라이머들의 고정화를 위한 고체 지지체의 표면 개질과 고정화된 앰플리콘들로부터 신호를 가장 효과적으로 수집할 수 있는 진단 시스템의 향상에 집중되어 있으나, 여전히 개선할 점들이 많이 남아 있다. 예컨대 기존 연구들에서는 ) 프라이머의 고정화를 위해 지지체 표면에 코팅되는 코폴리머의 합성과정이 지나치게 복잡하거나 과도한 시간이 소요되고, ) 고체상 프라이머의 그라프팅을 위한 플라스틱 지지체의 개질이 복잡하거나 까다롭고, ) 표면의 플라즈마 활성을 위해 거대한 장치가 요구되는 등의 문제점들이 있다. 특히 이러한 기존 연구 내용들은 상대적으로 자원이 빈약한 실험실 환경에서 사용 가능하거나 휴대성 있는 SP-PCR 마이크로 디바이스에 적용되기에는 충분치 않다.
따라서 증폭 및 진단 분석의 높은 효율성을 유지하면서 보다 단순한 형태로 마이크로 디바이스를 제작하고, 프라이머 고정화를 위해 고체 지지체를 신뢰성 있게 개질할 수 있는 방안이 요구된다.
비특허문헌 1: F.Damin et al, Biosens. Bioelectron., 2016, 78, 367. 비특허문헌 2: J.Hoffmann et al, RSC Adv., 2012, 2, 3885. 비특허문헌 3: T.Q.Hung et al, Biosens. Bioelectron., 2017, 90, 217.
본 발명은 PCR을 수행하고, PCR 직후 형광 검출이 가능한 SP-PCR 마이크로 디바이스, 제조방법 및 이를 이용한 타겟 증폭 및 검출방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 열가소성 플라스틱으로 형성되는 것으로, PCR(중합효소 연쇄반응) 및 형광 검출이 수행되는 1 이상의 마이크로 챔버가 형성되는 하부 기판; 및 열가소성 플라스틱으로 형성되어 하부 기판의 상부에 결합되는 것으로, 마이크로 챔버로 미세유체를 유입시키는 인렛 포트와 미세유체를 유출시키는 아웃렛 포트가 형성되는 상부 기판을 포함하고, 상기 마이크로 챔버는 상부 표면에 폴리에틸렌이민으로 형성되는 제1 코팅층과, 상기 제1 코팅층의 상부 표면에 글루타르알데히드로 형성되어 마이크로 챔버에 도입되는 샘플 유체 내의 아민-개질된 프라이머들을 표면에 고정시키는 제2 코팅층을 포함하는 SP-PCR 마이크로 디바이스가 제공될 수 있다.
이 때, 상기 열가소성 플라스틱은 폴리카보네이트일 수 있다.
또한, 상기 하부 기판에는 상기 인렛 포트와 연결되어 마이크로 챔버로 미세유체를 유입시키는 인렛 채널과, 상기 아웃렛 포트와 연결되어 마이크로 챔버로부터 미세유체를 유출시키는 아웃렛 채널이 형성될 수 있다.
또한, 상기 마이크로 챔버로 도입되는 PCR 시약은 순방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 상기 역방향 프라이머에는 표지 물질이 결합될 수 있다.
이 때, 상기 PCR 시약에서 상기 순방향 프라이머의 함유량보다 역방향 프라이머의 함유량이 4배 이상 높을 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, a) 제1 폴리카보네이트 기판 상에 1 이상의 마이크로 챔버를 형성하고, 제2 폴리카보네이트 기판을 제1 폴리카보네이트의 상부에 접합하는 단계; b) 마이크로 챔버 내로 폴리에틸렌이민 수용액을 도입하고 유지함으로써 마이크로 챔버의 표면 상에 제1 코팅층을 형성하는 단계; 및 c) 상기 폴리에틸렌이민 수용액을 제거한 후, 마이크로 챔버 내로 글루타르알데히드 용액을 도입하고 유지함으로써 제1 코팅층의 표면 상에 제2 코팅층을 형성하는 단계를 포함하는 SP-PCR 마이크로 디바이스 제조방법이 제공될 수 있다.
이 때, 상기 폴리에틸렌이민 수용액의 농도는 5%(w/t)이고, 상기 글루타르알데히드 용액은 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)를 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 SP-PCR 마이크로 디바이스를 이용한 타겟 증폭 및 검출방법으로써, a) 마이크로 챔버 내로 아민-개질된 프라이머(말단에 아민기를 포함함)를 포함하는 샘플 유체를 도입시키고 유지하여, 상기 아민-개질된 프라이머들을 제2 코팅층에 고정시키는 단계;b) 마이크로 챔버 내로 PCR 시약(순방향 프라이머 및 형광 물질이 결합된 역방향 프라이머를 포함)을 도입시키고, 마이크로 챔버의 온도를 제어하여 SP-PCR 증폭을 일으키는 단계; 및 c) SP-PCR 증폭 이후, 상기 PCR 시약을 배출시키고 상기 제2 코팅층에 고정된 타겟 앰플리콘들의 형광 신호를 형광 모듈을 통해 검출하는 단계를 포함하는 타겟 증폭 및 검출방법이 제공될 수 있다.
이 때, 상기 PCR 시약은 상기 순방향 프라이머의 함유량보다 역방향 프라이머의 함유량이 4배 이상 높을 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 SP-PCR 마이크로 디바이스는 열가소성 플라스틱(폴리카보네이트)으로 형성되는 마이크로 챔버의 표면을 폴리에틸렌이민(PEI) 및 글루타르알데히드(GA)로 처리하여 아민-개질된 프라이머를 고정시킬 수 있도록 반응성 표면을 형성시킨다. 이에 따라 비교적 단순한 형태의 SP-PCR 증폭이 가능한 마이크로 디바이스를 제공할 수 있다. 나아가 PCR 시약에 포함되는 역방향 프라이머에 표지 물질을 결합시킴으로써, PCR 증폭 이후에 마이크로 챔버에 대하여 바로 형광 검출을 수행할 수 있는 바, 간편하고 효율성 있는 진단 분석이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 SP-PCR 기반의 마이크로 디바이스를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 도 1의 마이크로 챔버를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 SP-PCR 마이크로 디바이스를 이용하여 SP-PCR 및 형광 검출을 수행하는 과정을 나타내는 개념도이다.
도 4는 실시예, 비교예 1 및 비교예 2의 물 접촉각 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 PEI의 농도 및 개질 시간과 아민 기능기의 농도의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 6은 마이크로 디바이스 상에 PCR 앰플리콘들이 고정화되는 것을 개략적으로 나타내는 개념도와, 마이크로 디바이스의 형광 이미지들을 나타낸다.
도 7은 PEI 및 GA가 코팅된 마이크로 디바이스 상에 PCR 앰플리콘들이 고정화된 상태와 써멀 사이클링 조건을 개략적으로 나타내는 개념도와, 마이크로 디바이스의 형광 이미지들을 나타낸다.
도 8은 SP-PCR 수행 결과를 나타낸다.
도 9는 마이크로 디바이스에 고정화 된 앰플리콘들의 형광 이미지를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 하기의 설명은 본 발명을 구체적인 예시를 들어 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 기술적 사상이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니다. 그리고 첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 기술적 사상이 첨부된 도면에 한정되는 것은 아니다.
첨부된 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것으로, 본 발명의 기술적 사상이 첨부된 도면에 한정되는 것은 아니다. 도면에서 각 부재의 두께나 크기 등은 설명의 편의 등을 위해 과장, 생략, 개략적으로 도시될 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 위치관계나 방향은 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 첨부된 도면을 기준으로 한다.
본 명세서에 기재된 본 발명 구조에 대한 설명에서 공간에 대한 설명이나 위치관계에 대한 설명은 본 발명을 이루는 구성요소들 간의 상대적인 위치를 의미하는 것이다. 또한 특별히 언급하지 않는 한, 하나의 구성요소와 다른 구성요소 사이의 공간에는 또 다른 구성요소가 존재할 수 있다. 예를 들어 본 명세서에서 하나의 구성요소의 "상부에" 또는 "위에" 다른 구성요소가 위치함을 언급하고 있는 경우, 하나의 구성요소의 바로 위에 다른 구성요소가 위치하는 경우 뿐만 아니라, 하나의 구성요소와 다른 구성요소들 사이에 또 다른 구성요소가 위치하는 경우까지를 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 SP-PCR 기반의 마이크로 디바이스(이하, 마이크로 디바이스)를 개략적으로 도시한 도면이다. 도 1을 참조하면, 마이크로 디바이스(100)는 하부 기판(110) 및 상부 기판(120)을 포함할 수 있다. 하부 기판(110)에는 1 이상의 마이크로 챔버(130)가 형성될 수 있다. 마이크로 디바이스(100)는 전체적으로 플레이트(plate) 형으로 형성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상부 기판(120)은 하부 기판(110)의 상부에 접합된다.
하부 기판(110) 및 상부 기판(120)은 각각 열가소성 플라스틱 소재로 형성될 수 있다. 일 구체예에 있어서 하부 기판(110) 및 상부 기판(120)은 광 투과성을 갖는 열가소성 플라스틱 소재로 형성될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 하부 기판(110) 및 상부 기판(120)은 폴리카보네이트(PC) 기판 일 수 있다.
하부 기판(110) 및 상부 기판(120)의 접합 내지 결합은 통상의 방식을 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들면 결합 부재를 이용한 기계적 결합방식, 접착제를 이용한 방식을 이용하여 이루어질 수 있다. 예컨대 접착제를 이용하는 방식에 있어서 상기 접착제는 하부 기판(110)과 상부 기판(120)을 상호 접합시키는 데에 충분한 접착성을 가지면 충분하고 특정 종류의 접착제로 한정되는 것은 아니다. 접착제의 종류를 예시하면, 고무계 접착제, 아크릴 수지계 접착제, 실리콘계 접착제, 광학계 접착제, 가열성 접착제 등이 있다. 접착제의 형태를 예시하면, 감압 접착 테이프, 열 활성 접착 테이프, 화학적 활성 접착 테이프, 광 활성 접착 테이프 등이 있다. 다른 예로 핫 엠보싱 공정을 이용하는 방식을 설명하면, 하부 기판(110)의 상부에 상부 기판(120)을 배치한 후에 양 기판을 개별적으로 가열하고 압착시킴으로써 하부 기판(110)에 상부 기판(120)을 접합시킬 수 있다.
상부 기판(120)에는 인렛 포트(121)와 아웃렛 포트(122)가 형성될 수 있다. 인렛 포트(121)를 통해 미세유체가 유입되며, 아웃렛 포트(122)를 통해 미세유체가 유출될 수 있다. 이와 같은 인렛 포트(121) 및 아웃렛 포트(122)는 통상의 방법을 통해 형성될 수 있다. 예를 들면 기계적 천공, 레이저 천공, 화학적 에칭, 플라즈마 식각 등과 같이 당업계에서 그 원리가 알려진 방법을 이용할 수 있다.
또한 인렛 포트(121)에는 인렛 튜브(140)가 결합되고, 아웃렛 포트(122)에는 아웃렛 튜브(150)가 결합될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 인렛 튜브(140) 및 아웃렛 튜브(150)는 적절한 외경 및 내경을 갖는 실리콘 튜브로 형성될 수 있다. 도면에 도시되지는 않았으나 인렛 튜브(140) 및 아웃렛 튜브(150)는 펌프 시스템(pump system)과 연결될 수 있다. 펌프 시스템은 미세 유체를 이동시키는 구동력을 제공하는 것으로, 구체적으로는 미세 유체를 마이크로 챔버(130)로 도입시키거나 마이크로 챔버(130)로부터 배출시키는 구동력을 제공할 수 있다. 펌프 시스템은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 시린지 펌프(syringe pump) 등을 사용할 수 있다.
하부 기판(110)에는 1 이상의 마이크로 챔버(130)가 형성될 수 있다. 도 1에서는 하부 기판(110)에 마이크로 챔버(130)가 3개 형성된 경우를 도시하고 있으나, 하부 기판(110)에 형성되는 마이크로 챔버(130)의 개수는 그보다 많거나 적을 수 있다. 마이크로 챔버(130)는 높이를 갖는 원형으로 형성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대 마이크로 챔버(130)는 다각형 형태로 형성될 수도 있다. 마이크로 챔버(130)에서는 PCR(중합효소연쇄반응)이 수행된다. 나아가 마이크로 챔버(130)는 형광 검출이 이루어지는 공간으로 기능한다. 여기에서 형광 검출은 광학 모듈을 통해 특정 대상 분석물을 검출하는 방법을 의미한다. 형광 검출에 사용되는 광학 모듈로는 공초점 현미경, 형광 현미경, 형광계, 형광 스캐너, 플로우사이토미터 등과 같이 당업계에 알려진 장치를 이용할 수 있다.
상부 기판(120)이 하부 기판(110)의 상부를 덮도록 결합함에 따라, 마이크로 챔버(130)는 상부 기판(120)에 의해 폐쇄된 형태를 가질 수 있다. 마이크로 챔버(130)의 형성은 통상적인 방법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 레이저 컷팅, 컷팅 플로팅 가공법, 컷팅 프린팅법, 선반 가공법 등이 있으며, 이들 각각의 기술 원리 및 세부 기술적 사항은 당업계에 알려져 있다.
하부 기판(110)에는 인렛 채널(111)과 아웃렛 채널(112)이 추가적으로 형성될 수 있다. 인렛 채널(111) 및 아웃렛 채널(112)은 마이크로 챔버(130)와 연통되도록 형성될 수 있다. 마이크로 챔버(130)가 복수개 형성되는 경우, 인렛 채널(111) 및 아웃렛 채널(112) 역시 이에 상응하도록 복수개가 형성될 수 있다. 인렛 채널(111)의 일단은 상부 기판(120)의 인렛 포트(121)와 연통되며, 인렛 채널(111)의 타단은 마이크로 챔버(130)와 연통된다. 아웃렛 채널(112)의 일단은 상부 기판(120)의 아웃렛 포트(122)와 연통되며, 아웃렛 채널(112)의 타단은 마이크로 챔버(130)와 연통된다.
마이크로 챔버(130)의 상부에는 제1 코팅층 및 제2 코팅층이 마련된다. 관련하여 도 2는 도 1의 마이크로 챔버(130)를 도시한 도면이다(도 1에 표시된 Ⅱ의 확대도에 해당함).
도 2를 참조하면, 마이크로 챔버(130)의 상부 표면에는 제1 코팅층(131)이 형성되며, 제1 코팅층(132)의 상부 표면에는 제2 코팅층(132)이 형성된다.
제1 코팅층(131)은 폴리에틸렌이민(PEI)으로 형성될 수 있다. 구체적으로 제1 코팅층(131)은 폴리에틸렌이민의 아민 기능기들이 마이크로 챔버(130)의 상부 표면과 반응하여 우레탄 결합(urethane linkage)을 형성하는 아미노 분해(aminolysis) 반응을 통해 그라프트 됨으로써 형성될 수 있다. 보다 구체적으로 마이크로 챔버(130)에 폴리에틸렌이민 수용액을 접촉시키면, 마이크로 챔버(130)를 이루는 폴리카보네이트가 아미노 분해 반응에 의해 카보네이트 주쇄(backbone)가 절단된다. 그리고 이를 통해 폴리카보네이트와 폴리에틸렌이민의 아민 기능기 사이에 우레탄 결합이 형성된다. 이러한 우레탄 결합의 형성은 마이크로 챔버(130)의 표면에 대하여 사전 전처리 공정(예컨대 표면 산화 공정)이 요구되지 않는다는 점에서 상대적으로 간편하다. 한편, 폴리에틸렌이민은 PC 표면(마이크로 챔버)의 기능화와 관련하여 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)보다 안정적인 결합을 형성할 수 있다. 왜냐하면 폴리에틸렌이민은 1,2,3차 아민이 대략 1:2:1의 비율로 함유되어 있어 1차 아민의 결합으로 이루어지는 APTES보다 높은 아민 함량을 가지기 때문이다(1,2차 아민은 후술할 글루타르알데히드와 반응하게 됨).
제2 코팅층(132)은 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 형성될 수 있다. 구체적으로 제2 코팅층(132)은 글루타르알데히드가 폴리에틸렌이민의 아민 기능기들과 반응함으로써 제1 코팅층(131)의 상부 표면을 활성화시킨다. 즉, 제2 코팅층(132)을 형성함으로써 제1 코팅층(131)의 표면은 마이크로 챔버(130) 내로 도입되는 샘플 유체(30) 내의 아민-개질된 프라이머들을 고정시킬 수 있는 반응성 표면이 될 수 있다. 여기에서 샘플 유체(30)는 검출하고자 하는 검체(검출될 샘플 내 분자 또는 기타 물질을 포함)를 함유하는 유체(fluid) 형태의 샘플을 의미한다. 샘플 유체(30)는 아민-개질된 프라이머들을 포함하며, 여기에서 아민-개질된 프라이머는 말단에 아민 성분을 포함하는 프라이머를 의미한다. 마이크로 챔버(130)로 샘플 유체(30)가 도입되면 제2 코팅층(132)의 표면에는 아민-개질된 프라이머들이 고정화 된다(도 2에서 133으로 표기). 이와 관련해서는 구체적으로 후술한다.
한편, 도면에 도시되지는 않았으나 마이크로 디바이스(100)의 하부에는 히터가 배치될 수 있다. 히터는 PCR 증폭을 위한 열원을 제공할 수 있다. 히터의 예로는 구리 가열 블록, 박막 히터, 적외선 장치, 할로겐 램프, 마이크로웨이브, 백금 레지스터, 또는 유도 가열 장치 등을 들 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명에 따른 SP-PCR 마이크로 디바이스(이하, 마이크로 디바이스)의 동작에 대하여 설명한다. 관련하여, 도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 SP-PCR 마이크로 디바이스를 이용하여 SP-PCR 및 형광 검출을 수행하는 과정을 나타내는 개념도이다.
(1) 마이크로 디바이스(100)의 마이크로 챔버(130) 내로 샘플 유체를 도입시키고 소정 시간 유지한다(예컨대 50℃에서 1시간). 이 때, 샘플 유체 내의 아민-개질된 프라이머들이 마이크로 챔버(130)의 상부 표면(구체적으로는 제2 코팅층)과 반응함으로써 상부 표면에 고정된다. 이후 미반응된(미고정된) 프라이머들의 제거를 위하여 마이크로 챔버는 세척 및 건조될 수 있다.
(2) 이어, 마이크로 챔버(130) 내로 PCR 시약을 도입시키고 소정 시간 유지한다. 상기 PCR 시약은 반응 버퍼, dNTPs, Taq 중합효소, 프라이머 등을 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 순방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하며, 특히 역방향 프라이머에는 적당한 표지 물질이 결합될 수 있다. 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 함유 비율은 상이할 수 있으며, 일 구체예에 있어서 역방향 프라이머가 순방향 프라이머보다 다량 함유될 수 있다. 보다 구체적으로, 역방향 프라이머는 순방향 프라이머보다 4배 가량 더 함유될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 표지 물질은 형광 물질일 수 있다. 형광 물질의 예로는 엄벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC), 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA), 디클로로트리아지닐아민플루오레신(dichlorotriazinylamine fluorescein), 단실클로라이드(dansyl chloride), 양자점(quantum dots), 피코에리스린(phycoerythrin), FAM(fluorecein amidite) 등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein), 알 렉사플로어계 (alexa fluor) 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등이 있으며, 이 중 1종 이상이 사용될 수 있다. 형광 물질은 형광 염료(fluorescence dyes)의 형태를 가질 수 있다.
(3) 마이크로 디바이스(130)의 하부에 배치된 히터를 사용하여 PCR 증폭을 위한 열적 사이클에 따라 열원을 이용하여 마이크로 챔버(130)의 온도를 제어하면, 마이크로 챔버(130) 내부에서는 SP-PCR 증폭이 일어난다. 이에 따라 마이크로 챔버(130)의 상부 표면에 고정된 아민-개질된 프라이머들이 증폭되어 고정화 된 앰플리콘들을 생성시킨다. 구체적으로는 우선 마이크로 챔버(130) 내에서 액상 증폭(liquid-phase amplification)이 일어나 주어진 여러 앰플리콘들을 형광 염료에 부착시키고, 순방향 프라이머들의 제한된 수가 고갈된 후에 고상 증폭(solid-phase amplification)이 지배적으로 일어난다. 그 결과 고체 지지체(마이크로 챔버)에 공유결합을 통해 부착되는 앰플리콘들이 형성되고, 마이크로 챔버내의 형광 신호를 수집함으로써 타겟 앰플리콘들의 검출을 가능하게 한다. 한편, 액상 증폭은 고상 증폭보다 대개 효율적으로 진행되는데 이는 수성 프라이머의 자유로운 특성 때문이다. 고상 증폭의 경우 고체-지지체에 조밀하게 부착된 프라이머들의 입체장해(steric hindrance)에 의해 방해받는다. 따라서 고상 증폭에서 보다 높은 효율성을 달성하기 위해서는, 순방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율이 중요하다. 본 발명의 발명자들은 순방향 프라이머보다 역방향 프라이머의 비율이 대략 4배 정도 높을 때, 고상 증폭이 가장 효율적으로 이뤄짐을 발견하였다. 이는 낮은 농도의 순방향 프라이머가 SP-PCR과 연관된 입체장해 를 감소시키고, 수성 프라이머와 표면에 그라프트된 프라이머 사이의 경쟁을 최소화시키기 때문인 것으로 보인다.
(4) 이어 PCR 시약을 배출시키고, 마이크로 챔버(130)를 세척 및 건조한 후에 형광 모듈을 이용하여 마이크로 챔버(130)에 대하여 형광 검출을 수행할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 SP-PCR 마이크로 디바이스는 열가소성 플라스틱으로 형성되는 마이크로 챔버의 표면을 폴리에틸렌 이민 및 글루타르알데히드로 처리하여 아민-개질된 프라이머를 고정시킬 수 있도록 반응성 표면을 형성시킨다. 이에 따라 비교적 단순한 형태의 SP-PCR 증폭이 가능한 마이크로 디바이스를 제공할 수 있다. 나아가 PCR 시약에 포함되는 역방향 프라이머에 표지 물질을 결합시킴으로써, PCR 증폭 이후에 마이크로 챔버에 대하여 바로 형광 검출을 수행할 수 있는 바, 간편하고 효율성 있는 진단 분석이 가능하다.
이하에서는 본 발명의 실시예 및 시험예에 대하여 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 시험예에 의해 본 발명이 한정되지 않음은 자명하다.
실시예 및 시험예
1. 마이크로 디바이스의 제조 및 샘플, 시약의 준비
(1) 마이크로 디바이스의 제조
폴리카보네이트 기판(이하, PC 기판. 2mm 두께, Goodfellow社)에 마이크로 챔버가 CNC 마이크로밀링 머신을 이용하여 형성되었다. 마이크로 챔버가 형성된 PC 기판은 이소프로필 알코올로 초음파 세척되었고 압축 공기로 완전히 건조되었다. 또 다른 PC 기판을 상부에 덮은 후 핫 엠보싱 공정(145℃, 0.1 MPa, 15분)을 통해 양 기판을 접합하여 마이크로 디바이스를 제조하였다.
실시예: 마이크로 챔버 표면의 표면 개질을 위하여 마이크로 챔버에 5%(w/t) 폴리에틸렌이민 수용액(이하, PEI 수용액. PEI의 Mw는 25,000임, Sigma-Aldrich社)을 수용시키고 상온에서 1시간 동안 유지하였다. 이후 PEI 수용액이 제거되었고, 마이크로 챔버는 초순수(DI water)로 세척되고 압축공기를 통해 건조되었다. 다음으로 마이크로 챔버에 2.5%(v/v)의 글루타르알데히드 용액(이하, GA 용액. 25wt% 수용액, Sigma-Aldrich社)을 수용시키고 상온에서 2시간 동안 유지하였다. GA 용액은 환원제(reducing agent)로 기능하는 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride, Sigma-Aldrich社) 10mM을 함유하는 인산 완충액(phosphate buffer, pH 7.0)에서 희석되었다. 이후, 활성화 된 마이크로 챔버의 표면은 비반응된 GA를 제거하기 위하여 인산 완충액(pH 7.0)으로 철저히 세척되었고, 압축 공기로 완전히 건조되었다.
(2) 샘플 유체 및 PCR 시약의 준비
샘플 유체: 3 종류의 아민-개질된 프라이머 용액이 제조되었다. 상기 프라이머 용액은 대표적 식품매개 병원균(foodborne pathogen)인 살모넬라균(Salmonella app.; 샘플 1), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus; 샘플 2)과, 대표적 해양 미세조류인 코클로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides; 샘플 3)을 각각 포함하였다. 상기 프라이머 용액은 인산 완충액(pH 7.0)에서 제조되었으며, 농도는 0.5 μM 이었다.
한편, 상기 식품매개 병원균에 있어서, 살모넬라균 및 황색포도상구균의 액체 배양은 NB(Nutrient Broth, Becton Dickinson社) 및 MHB(Mueller Hinton Broth, Becton Dickinson社 및 Neogen社) 배지에서 각각 이루어졌다(37℃, 16시간, OD=1). 하룻밤 동안 배양한 배양액의 1mL가 수집되었으며, DNA 추출을 위해 15,000X g에서 원심분리되었다. 유전체 DNA(gDNA)의 추출 및 정제는 Wizard Genomic DNA 정제 키트(Promega社)를 사용하여 수행되었다. 또한, 조류 샘플에 있어서, 코클로디니움 폴리크리코이데스가 해양으로부터 직접 수집되었고(2013년), 조류 gDNA가 RNeasy 소형 키트(Qiagen社)를 이용하여 추출되었다. 추출된 gDNA는 2~8℃에서 저장되었다. 상술한 병원균 및 미세조류의 구체적인 내용은 하기 [표 1]과 같다.
샘플 타겟 유전자 앰플리콘 크기 프라이머 시퀀스(5'-3')
살모넬라균
(Salmonella app.)		 invA 113bp invA-F: AAAACATATGCTGGACCAACTGGAAGC
invA-R: Alexa 647-GTTCGCTTAACAAACGCTGCAAAACTT
invA-immobilized primer: NH2-C6-AAAACATATGCTGGACCAACTGGAAGC
황색포도상구균
(S. aureus)		 nuc 207bp nuc-F: ACACCTGAAACAAAGCATCC
nuc-R: Alexa 488-TAGCCAAGCCTTGACGAACT
nuc-immobilized primer: NH2-C6-ACACCTGAAACAAAGCATCC
코클로디니움 폴리크리코이데스
(C. polykrikoides)		 Large subunit ribosomal RNA(LSU rRNA) 153bp LSU rRNA-F: AATGGCGAACGAACAGGGAA
LSU rRNA-R: Alexa 488-GCTGCAGATTGACAAACGGG
LSU rRNA-immobilized primer: NH2-C6-AATGGCGAACGAACAGGGAA
PCR 시약: PCR 시약(20㎕)은 DNA 주형(template) 10ng, Taq 반응 버퍼액(10x), dNTP 10mM, BSA(bovine serum albumin, V fraction, Sigma-Aldrich社) 1.5 mg mL-1, 순방향 프라이머 100nM, 형광 염료로 라벨링된 역방향 프라이머 400 nM, Taq DNA 폴리머라제 1.25U를 포함하였다. 이 때, 상기 역방향 프라이머의 경우 프라이머의 종류에 따라 다른 형광 염료를 사용하였다. 구체적으로, 살모넬라균(샘플 1)의 경우 적색 형광 염료(제품명: Alexa 647)를, 황색포도상구균(샘플 2)과 코클리디니움 폴리크리코이데스(샘플 3)의 경우 녹색 형광 염료(제품명: Alexa 488)를 사용하였다.
2. 물 접촉각(water contact angle)의 측정
마이크로 디바이스의 마이크로 챔버 표면의 개질이 성공적으로 이루어졌는지를 확인하기 위하여, PEI 코팅 전(비교예 1), PEI 코팅 후(비교예 2), 그리고 PEI 및 GA 코팅 후(실시예)에 각각 마이크로 디바이스의 표면의 물 접촉각을 측정하였다. 물 접촉각의 측정은 Phoenix 300 접촉각 분석기(Surface Electro Optics, 한국)를 통해 정적법(sessile drop method)으로 이루어졌다. 얻어진 결과는 Image Pro 300 소프트웨어로 분석되었다. 측정은 5회 이루어졌으며, 평균값을 산출하였다.
도 4는 실시예, 비교예 1 및 비교예 2의 물 접촉각 측정 결과를 나타내는 도면이다. 비교예 1(PEI 코팅 전)의 물 접촉각은 대략 80.1°±0.96°이었고, 비교예 2(PEI 코팅 후)는 물 접촉각이 상당히 감소하여 대략 32.8°±4.55°이었다. 실시예(PEI 및 GA 코팅 후)의 경우 비교예 2보다 물 접촉각이 약간 상승하여 대략 53.5°±5.41°이었다. 이와 같은 PC 기판 표면의 젖음성(wettability) 변화는 PEI 및 GA가 성공적으로 PC 기판의 표면을 개질시켰음을 확인시켜준다.
보다 구체적으로, PC 기판의 표면에 결합되는 조밀한 아민기의 양전하로 인해 PC 기판의 표면은 친수성을 띠게 된다. 아민 기능기들은 PC 사슬의 카보네이트 주쇄와 직접 반응하여 안정적인 우레탄 결합을 형성한다. 따라서 별도의 전처리 과정(예컨대 표면 산화 공정) 없이도 PC 기판의 표면 개질이 간단한 방법으로 이루어질 수 있는 장점을 갖는다. 한편, PEI로 코팅된 PC 기판에 GA를 처리하면 상대적으로 소수성 표면을 띠게 변화한다. GA의 탄화수소 사슬 때문이다. 소듐 시아노보로하이드라이드는 알데히드와 아민 기능기들 사이에 안정적이고 비가역적인 쉬프 염기(schiff base) 결합을 형성하는데 이용된다. 이와 같은 환원제(소듐 시아노보로하이드라이드)는 아민-개질된 올리고뉴클레오티드의 컨쥬게이션(conjugation)에 이용 가능한 유리된 알데히드가 남는 동안 쉬프 염기를 타겟으로 한다.
3. PC 기판 상의 아민 밀도(amine density)의 정량화
PEI가 코팅된 PC 기판의 표면 상(구체적으로는 마이크로 챔버의 표면)에서의 아민 기능기들의 밀도를 정량화하기 위하여, 아민과 반응할 수 있는 FITC(fluorescein-5-isothiocyanate, Sigma-Aldrich社)를 사용하여 형광 측정이 수행되었다. 표준 곡선(standard curve)은 0.1 mg mL-1 FITC와 반응되는 PEI(0~50nmol)의 농도들을 체크함으로써 생성되었고, 산출된 형광 신호를 측정하였다. PC 기판에 코팅된 아민기들의 실제 밀도는 PEI가 코팅된 PC 기판을 FITC로 염색하고 상기 표준 곡선과 형광 신호를 비교함으로써 정량화 되었다. 형광 신호는 GelDoc Ez System(Bio-Rad) 및 Image Lab 4.0 SW(Bio-Rad)를 이용하여 검출 및 분석되었다.
도 5는 PEI의 농도 및 개질 시간과 아민 기능기의 농도의 관계를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 X축은 PEI의 농도(1%, 5%, 10%)와 개질 시간(30분, 45분, 60분)을 나타내고, Y축은 PC 기판 상에 그라프트된 아민 기능기들의 최종 밀도를 나타낸다. 도 5를 참조하면, 표면 아민 밀도는 PEI 농도 및 개질 시간(modification time)이 증가할수록 증가하는 경향을 보였다. 다만, PEI의 농도가 10%이고 개질 시간이 45분 내지 60분 범위에 있는 경우에는 표면 아민 밀도가 감소하는 것을 확인하였다. 이는 높은 PEI 농도와 긴 개질 시간이 PEI의 강한 고분자 얽힘(polymer entanglement)을 일으켜, PEI에 코팅된 아민기와 FITC 사이의 상호 작용과 PC 기판 상에 코팅된 PEI의 최종 아민 밀도를 감소시키기 때문인 것으로 생각된다. 5% PEI에서 60분 개질 후의 아민 밀도는 37.13±0.91 nmol cm-2에 해당하며, 이는 다른 조건들보다 비교할 때 가장 높은 바, 최적의 PEI 농도 및 개질 시간으로 선택되었다.
4. SP-PCR 및 형광 검출
실시예에 따른 마이크로 디바이스의 마이크로 챔버에 아민-개질된 프라이머들을 고정화시킨 후, 미반응된 프라이머를 제거하기 위하여 SSC(0.1x saline sodium citrate, Biosesang社) 및 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate, Sigma-Aldrich社)로 세척되었다. 이어 상기 마이크로 챔버는 상온에서 1시간 동안 2 mg mL-1 BSA(bovine serum albumin)가 채워진 채로 유지되었다. 이후 마이크로 챔버는 초순수로 세척되었고 압축 공기로 완전히 건조되었다. 이후 상기 마이크로 챔버 내로 PCR 시약을 도입하고, 인렛 튜브와 아웃렛 튜브를 클램프를 사용하여 폐쇄하였다. 마이크로 디바이스는 써멀사이클러의 히트 블록 상에 배치되었다. 관련하여 상기 히트 블록(flat type)은 상용화 된 써멀사이클러(Gene-Touch TC-E-96GA, Bioer社)와의 호환을 위해 특별히 제작되었으며, 마이크로 디바이스의 표면 온도는 적외선 카메라(FLIR Thermovision A320)를 통해 측정되었다. 온도 분포를 평가하기 위해 마이크로 챔버의 영역 내에서 10개의 지점(spot)이 무작위로 선택되었고, 평균 온도는 ThermaCAM Research 2.8 SW를 사용하여 분석되었다.
SP-PCR은 5분간 100에서 초기 열변성(denaturation)이 수행되었고, 이어서 30 써멀 사이클이 수행되었다(구체적으로는 100℃에서 35초, 63℃에서 35초, 76℃에서 35초). 한편, 3종의 타겟(샘플 1 내지 3)의 증폭은 동일한 결합(annealing) 온도(63℃)에서 수행되었다. SP-PCR 후에, 마이크로 챔버는 세척, 건조되었고 적합한 형광 필터들을 통해 관찰되었다.
또한 비교예에 있어서, DNA의 증폭은 프라이머의 사전 고정화 과정을 제외하고는 동일한 형태를 갖는 마이크로 디바이스에서도 수행되었다. 수득된 PCR 앰플리콘들은 아가로스 겔 영동법에 의해 교차 검증되었다. 상기 앰플리콘들은 브롬화 에티듐 염료(etidium bromide dye, Dynebio社)로 염색되었으며 Gel Doc EZ 시스템을 이용하여 검출되었다.
(1) 마이크로 디바이스의 앰플리콘 고정화능의 확인
도 6은 마이크로 디바이스 상에 PCR 앰플리콘들이 고정화되는 것을 개략적으로 나타내는 개념도와, 마이크로 디바이스의 형광 이미지들을 나타낸다. 도 6a는 PEI 및 GA가 코팅된 마이크로 디바이스 상에 PCR 앰플리콘들이 고정화 되는 것을 개략적으로 모사한 개념도이고, 도 6b는 마이크로 디바이스의 이미지이다. 도 6c는 PCR 앰플리콘이 고정화 된 PEI 및 GA가 코팅된 마이크로 디바이스(실시예)의 형광 이미지이고, 도 6e는 PCR 앰플리콘의 고정화 전의 형광 이미지이다. 도 6d는 PEI 및 GA가 코팅되지 않은 마이크로 디바이스(비교예)의 형광 이미지이다.
도 6c를 참조하면, 고정화된 앰플리콘들의 강한 녹색 형광이 관찰됨을 확인할 수 있는 바, 마이크로 챔버에 아민-개질된 PCR 앰플리콘들이 성공적으로 고정되었음을 알 수 있다. 이는 도 6d(비교예의 형광 이미지) 및 도 6e(앰플리콘 고정화 전 형광 이미지)와 비교하면 보다 확연하다.
(2) 표면 코팅 안정성(surface coating stability)의 분석
SP-PCR가 수행되기 위한 핵심 조건 중 하나는 고정화된 프라이머와 표면 코팅층 사이의 화학적 결합이 가수분해와 써멀 사이클링 조건의 열적 열화를 견딜 수 있어야 한다는 것이다. 따라서 써멀 사이클링 조건(thermal cycling condition) 하에서의 PC 기판 상의 표면 코팅의 안정성을 분석하기 위하여 PEI 및 GA가 코팅된 마이크로 챔버에 오프-칩에서 증폭된 PCR 앰플리콘들이 고정화되었다. 상기 PCR 앰플리콘은 5' 및 3' 말단에 각각 아민기와 형광 염료(Alexa 488)를 갖도록 형성되었다. 이후 상기 마이크로 챔버는 PCR 버퍼 용액과 물로 채워졌으며 SP-PCR에 이용되는 써멀 사이클링 조건에 놓여졌다. 상기 고정화된 앰플리콘들의 형광 신호는 열처리 전후에 측정되었다. 표면 코팅의 열적 안정성을 평가하기 위함이다. 형광 신호는 Olympus IX71 역 형광 현미경을 사용하여 측정되었고, ProgRes Capture Pro 2.8 SW(Jenoptik)으로 분석되었다.
PC 상의 기능화된 1차 아민은 증폭 반응 동안 잠재적으로 가수분해를 겪고, 이는 PC를 소수성 특성을 갖도록 되돌릴 수 있다고 알려져 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 PEI로 코팅된 PC에서는 이와 같은 소수성 특성 회복 현상이 무시할 수 있을 정도임이 확인되었다(심지어 40 PCR 사이클 이후에도 무시 가능한 정도임). 이는 PEI와 PC 사이의 상호작용이 1,2차 아민 모두에서 발생하는 바, 그 결과 PEI와 PC 사이에 보다 안정적인 우레탄 결합이 형성되기 때문인 것으로 생각된다.
나아가 써멀 사이클링 조건 하에서 PEI 및 GA가 코팅된 마이크로 챔버와 그라프트된 아민-개질된 PCR 앰플리콘들이 추가적으로 평가되었다. 관련하여 도 7은 PEI 및 GA가 코팅된 마이크로 디바이스 상에 PCR 앰플리콘들이 고정화된 상태와 써멀 사이클링 조건을 개략적으로 나타내는 개념도와, 마이크로 디바이스의 형광 이미지들을 나타낸다. 도 7a, 7b는 PEI 및 GA가 코팅된 마이크로 디바이스 상에 PCR 앰플리콘들이 고정화된 모습을 모사하고 있으며, 써멀 사이클링 조건을 그래프로 나타내고 있다(X축은 시간, Y축은 온도). 도 7c, 7d는 열처리 전 후의 형광 이미지를 나타내며, 그 아래에는 열처리 전 후에 따른 형광 세기를 그래프로 나타내고 있다.
도 7c 및 7d를 참조하면, 열처리 후에 측정된 형광 세기(fluorescence intensity)가 다소 감소된 것을 확인할 수 있는데(열처리 후의 형광 세기가 열처리 전의 형광 세기의 약 85.3% 수준임), 이는 열처리 후에도 마이크로 챔버의 표면과 이에 고정화된 앰플리콘들이 상당히 안정적으로 결합되어 있음을 시사한다.
(3) DNA 증폭 효율성 분석
실시예(PEI 및 GA 코팅)와 비교예(코팅 없음)에 해당하는 마이크로 디바이스를 이용하여 각각 동일한 조건 하에서 SP-PCR을 수행하였다. 도 8은 SP-PCR 수행 결과를 나타낸다. 도 8은 살모넬라균(Salmonella app.)의 invA 유전자, 황색포도상구균(S. aureus)의 nuc 유전자, 코클로디니움 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)의 LSU rRNA 유전자의 증폭 결과를 보여준다. Lane 2,5,8은 비교예에 해당하는 마이크로 디바이스에서의 결과이며, Lane 3,6,9는 실시예에 해당하는마이크로 디바이스에서의 결과다. 도 8을 참조하면, 비교예 및 실시예의 타겟 밴드의 세기가 거의 유사함을 확인할 수 있으며, 이는 마이크로 챔버의 표면을 코팅하는 것이 DNA 증폭 효율성을 저하시키지 않음을 보여준다.
(4) 증폭 및 형광 검출 결과
도 9는 마이크로 디바이스에 고정화 된 앰플리콘들의 형광 이미지를 나타낸다. 도 9a는 적색 형광 염료(제품명: Alexa 647)가 사용된 살모넬라균(Salmonella app.; 샘플 1)의 형광 이미지다. 도 9b는 녹색 형광 염료(제품명: Alexa 488)가 사용된 황색포도상구균(Staphylococcus aureus; 샘플 2)의 형광 이미지이고, 도 9c는 마찬가지로 녹색 형광 염료(제품명: Alexa 488)가 사용된 코클로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides; 샘플 3)의 형광 이미지다. 한편, 도 9d, 9e, 9f는 비교를 위한 것으로 각각 샘플 1~3에서 형광 염료가 라벨링되지 않은 경우의 형광 이미지를 나타낸다. 도 9로부터 본 발명에 따른 마이크로 디바이스에서 DNA 증폭과 형광검출이 연속적으로 이루어질 수 있음을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 구현예들에 대하여 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 기술의 구체적 적용에 따른 단순한 설계변경, 일부 구성요소의 생략, 단순한 용도의 변경 등 본 발명을 다양하게 변형할 수 있을 것이며, 이러한 변형 역시 본 발명의 권리범위 내에 포함됨은 자명하다.
100: 마이크로 디바이스
110: 하부 기판
120: 상부 기판
130: 마이크로 챔버
131: 제1 코팅층
132: 제2 코팅층

Claims (10)

  1. 열가소성 플라스틱으로 형성되는 것으로, PCR(중합효소 연쇄반응) 및 형광 검출이 수행되는 1 이상의 마이크로 챔버가 형성되는 하부 기판; 및
    열가소성 플라스틱으로 형성되어 하부 기판의 상부에 결합되는 것으로, 마이크로 챔버로 미세유체를 유입시키는 인렛 포트와 미세유체를 유출시키는 아웃렛 포트가 형성되는 상부 기판을 포함하고,
    상기 마이크로 챔버는 상부 표면에 폴리에틸렌이민으로 형성되는 제1 코팅층과, 상기 제1 코팅층의 상부 표면에 글루타르알데히드로 형성되어 마이크로 챔버에 도입되는 샘플 유체 내의 아민-개질된 프라이머들을 표면에 고정시키는 제2 코팅층을 포함하는 SP-PCR 마이크로 디바이스.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 열가소성 플라스틱은 폴리카보네이트인 SP-PCR 마이크로 디바이스.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 하부 기판에는 상기 인렛 포트와 연결되어 마이크로 챔버로 미세유체를 유입시키는 인렛 채널과, 상기 아웃렛 포트와 연결되어 마이크로 챔버로부터 미세유체를 유출시키는 아웃렛 채널이 형성되는 SP-PCR 마이크로 디바이스.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 마이크로 챔버로 도입되는 PCR 시약은 순방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 상기 역방향 프라이머에는 표지 물질이 결합되는 SP-PCR 마이크로 디바이스.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 PCR 시약에서 상기 순방향 프라이머의 함유량보다 역방향 프라이머의 함유량이 4배 이상 높은 SP-PCR 마이크로 디바이스.
  6. a) 제1 폴리카보네이트 기판 상에 1 이상의 마이크로 챔버를 형성하고, 제2 폴리카보네이트 기판을 제1 폴리카보네이트의 상부에 접합하는 단계;
    b) 마이크로 챔버 내로 폴리에틸렌이민 수용액을 도입하고 유지함으로써 마이크로 챔버의 표면 상에 제1 코팅층을 형성하는 단계; 및
    c) 상기 폴리에틸렌이민 수용액을 제거한 후, 마이크로 챔버 내로 글루타르알데히드 용액을 도입하고 유지함으로써 제1 코팅층의 표면 상에 제2 코팅층을 형성하는 단계를 포함하는 SP-PCR 마이크로 디바이스 제조방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 폴리에틸렌이민 수용액의 농도는 5%(w/t)인 SP-PCR 마이크로 디바이스 제조방법.
  8. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서,
    상기 글루타르알데히드 용액은 소듐 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride)를 함유하는 SP-PCR 마이크로 디바이스 제조방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 SP-PCR 마이크로 디바이스를 이용한 타겟 증폭 및 검출방법으로써,
    a) 마이크로 챔버 내로 아민-개질된 프라이머(말단에 아민기를 포함함)를 포함하는 샘플 유체를 도입시키고 유지하여, 상기 아민-개질된 프라이머들을 제2 코팅층에 고정시키는 단계;
    b) 마이크로 챔버 내로 PCR 시약(순방향 프라이머 및 형광 물질이 결합된 역방향 프라이머를 포함)을 도입시키고, 마이크로 챔버의 온도를 제어하여 SP-PCR 증폭을 일으키는 단계; 및
    c) SP-PCR 증폭 이후, 상기 PCR 시약을 배출시키고 상기 제2 코팅층에 고정된 타겟 앰플리콘들의 형광 신호를 형광 모듈을 통해 검출하는 단계를 포함하는 타겟 증폭 및 검출방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 PCR 시약은 상기 순방향 프라이머의 함유량보다 역방향 프라이머의 함유량이 4배 이상 높은 타겟 증폭 및 검출방법.
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