KR20190020486A - 진토닌을 포함하는 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

진토닌을 포함하는 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물, 진토닌 및 활성 작용제를 포함하는 조성물, 및 진토닌 및 활성 작용제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 활성 작용제를 개체에 전달하기 위한 방법을 제공한다.

Description

진토닌을 포함하는 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물 및 그의 용도{Composition for increasing permeability of blood vessel comprising gintonin and use thereof}

진토닌을 포함하는 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물, 진토닌 및 활성 작용제를 포함하는 조성물, 및 진토닌 및 활성 작용제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 활성 작용제를 개체에 전달하기 위한 방법에 관한 것이다.

인삼은 한국, 중국 및 일본에서 널리 사용되어 왔다. 인삼의 활성 성분으로는 진세노시드가 알려져 있다.

진토닌(gintonin)은 인삼에서 발견된 지질당단백질이다. 진토닌은 에를리히 복수 종양(Ehrlich Ascites Tumor: EAT) 세포에서 세포 내 유리 칼슘 이온 즉, Ca^{2 +}의 수준을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Pyo et al., J Ginseng Res, 35, 92-103, 2011).

그러나, 진토닌이 혈관 투과성을 증가시킨다는 것을 알려진 바 없다.

일 양상은 진토닌을 포함하는 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 진토닌 및 활성 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 양상은 진토닌 및 활성 작용제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 활성 작용제를 개체에 전달하기 위한 방법을 제공한다.

다른 양상은 활성 작용제를 개체에 전달하기 위한 방법에 사용하기 위한 진토닌의 용도를 제공한다.

다른 양상은 활성 작용제를 개체에 전달하는데 사용하기 위한 진토닌을 제공한다.

제1 양상은 진토닌을 포함하는 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 진토닌은 인삼 유래 당지질단백질일 수 있다. 상기 진토닌의 주요 성분 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid: LPA)과 인삼 단백질의 복합체이다. 상기 인삼 단백질은 인삼 주요 라텍스-유사 단백질151(Ginseng major latex like protein 151: GLP151) 및 인삼 리보뉴클레아제-유사 저장 단백질을 포함한다. GLP151은 Betv1 수퍼패밀리 중 하나로서 LPA 결합 단백질이다. GLP151는 C-말단 H147 및 H148에 LPA 결합 도메인을 가질 수 있다. 진토닌은 리소포스파티드산 수용체(LPAR)에 높은 친화성 및 선택적으로 결합할 수 있다. 상기 LPA는 LPA C_{18 :2}를 포함한다. 상기 LPA는 메탄올 중에서 추출하는 것 없이 단백질 성분으로부터 해리되지 않는 정도로 강하게 결합되어 있는 것일 수 있다. 상기 LPA 중 아실기는 탄소 원자 수 10 내지 30개, 10 내지 26개, 10 내지 24개, 10 내지 22개, 12 내지 30개, 14 내지 26개, 16 내지 24개, 14 내지 22개, 또는 16 내지 20개의 것일 수 있다.

상기 진토닌은 혈관내피 세포와 혈관내피 세포 사이의 밀접 접합(tight junction)을 약화시켜 혈관의 투과성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 진토닌은 혈관 내벽의 투과성을 증진시키기 위한 투과 증진제로서 사용되는 것일 수 있다. 상기 진토닌은 혈관 내벽의 투과성을 증진시키기에 유효한 양으로 포함된 것일 수 있다. 상기 진토닌은 활성 작용제와 조합되는 경우, 상기 활성 작용제의 투여 계획 예를 들면, 투여 기간, 또는 투여 기간에 따라 투여되는 것일 수 있다.

상기 진토닌은 LPAR, 예를 들면 LPA1R에 결합하는 것일 수 있다. 상기 진토닌은 LPA 신호 경로를 개시하는 것일 수 있다.

상기 혈관은 뇌혈관 또는 망막 혈관일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 혈관은 혈관내피 세포와 혈관내피 세포 사이의 밀접 접합이 강하여 물질을 통과시킬 수 없거나 적게 통과시키는 것일 수 있다. 상기 혈관은 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier: BBB)를 형성하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 활성 작용제를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 활성 작용제는 상기 뇌혈관 또는 망막 혈관의 내막을 통하여 투과하지 못하는 것으로 알려져 있거나 투과하지 못하는 물질일 수 있다. 또한, 상기 활성 작용제는 상기 뇌혈관 또는 망막 혈관의 내막을 통하여 적은 양으로만 투과하여 다른 투과 보조제의 존재 없이는 효과적인 양으로 전달될 수 없는 물질일 수 있다.

상기 활성 작용제는 약제학적 활성 작용제, 진단적 활성 작용제 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 약제학적 활성 작용제는 알츠하이머를 제외한 신경퇴행성 질환, 신경 정신성 질환, 뇌 종양, 망막 질환, 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 및 뇌졸증(stroke)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 약제, 신경영양인자(neurotrophic factor), 또는 성장인자인 것일 수 있다.

상기 진단적 활성 작용제는 이미징제, 자기적 활성 작용제, 또는 방사성 활성 작용제일 수 있다. 상기 이미징제는 형광체 또는 형광체를 생성하게 하는 물질일 수 있다. 자기적 활성 작용제는 자성입자와 같은 자성을 띠는 물질일 수 있다. 상기 방사성 활성 작용제는 방사성을 띠는 원자, 분자, 또는 모이어티일 수 있다.

상기 활성 작용제는 소분자, 단백질, 다당류, 핵산, 지질 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 소분자는 중합체가 아닌 분자일 수 있다. 상기 분자는 유기 화합물 분자일 수 있다. 상기 단백질은 당이 있거나 없는 것일 수 있다. 글리코단백질은 예를 들면 EPO일 수 있다. 상기 단백질은 분자량 500 Da 내지 1000 kDa, 500 Da 내지 500 kDa,500 Da 내지 100 kDa, 500 Da 내지 500 kDa, 1 kDa 내지 500 kDa, 5 kDa 내지 500 kDa, 10 kDa 내지 500 kDa, 또는 20 kDa 내지 500 kDa의 것일 수 있다. 상기 다당류는 덱스트란, 또는 전분일 수 있다. 상기 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 핵산은 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 조성물은 상기 활성 작용제의 뇌 안, 척수(spinal cord), 또는 망막 안으로의 전달을 촉진하기 위한 것일 수 있다.

상기 진토닌 및 상기 활성 작용제는 동시, 또는 별개로 투여되는 것일 수 있다. 상기 진토닌 및 상기 활성 작용제는 단일 조성물로서 투여될 수 있다. 상기 투여는 상기 진토닌을 먼저 투여한 후, 상기 활성 작용제를 투여하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 활성 작용제는 상기 진토닌 투여 후 30 분 이내, 20 분 이내, 15 분 이내, 10 분 이내, 또는 5 분 이내에 투여되는 것일 수 있다. 상기 활성 작용제는 상기 진토닌 투여 후 예를 들면, 1 분 내지 30 분, 1 분 내지 20 분 이내, 1 내지 5 분, 5 분 내지 15 분 이내, 5 분 내지 10 분, 또는 3 분 내지 15분 내에 투여되는 것일 수 있다. 상기 투여는 상기 활성 작용제를 먼저 투여한 후, 상기 진토닌을 투여하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 진토닌은 상기 활성 작용제 투여 후 30 분 이내, 20 분 이내, 15 분 이내, 10 분 이내, 또는 5 분 이내에 투여되는 것일 수 있다. 상기 진토닌은 상기 활성 작용제 투여 후 예를 들면, 1 분 내지 30 분, 1 분 내지 20 분 이내, 1 내지 5 분, 5 분 내지 15 분 이내, 5 분 내지 10 분, 또는 3 분 내지 15분 내에 투여되는 것일 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로, 또는 진단적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 약제학적, 또는 진단학적 조성물일 수 있다.

약제학적으로 또는 진단적으로 허용가능한 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.

제2 양상은 진토닌 및 활성 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 조성물에 있어서, 상기 활성 작용제는 약제학적 활성 작용제, 진단적 활성 작용제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 조성물은 약제학적, 또는 진단학적인 것일 수 있다. 상기 조성물은 약제학적으로, 또는 진단학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 진토닌, 활성 작용제, 담체, 투여방법 및 제형에 대하여는 제1 양상에서 설명한 바와 같다.

제3 양상은 진토닌 및 활성 작용제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 활성 작용제를 개체에 전달하기 위한 방법을 제공한다.

상기 방법에서, 진토닌, 및 활성 작용제는 제1 양상에서 설명한 바와 같다.

상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 BBB 부위, 예를 들면, 뇌, 척수, 또는 망막에 국소적으로 적용하는 것일 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 뇌, 척수, 또는 망막 질병을 가진 개체일 수 있다.

상기 투여는 진토닌 및 활성 작용제는 개체당 각각 일당 0.01 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다.

상기 진토닌 및 상기 활성 작용제는 동시, 또는 별개로 투여되는 것일 수 있다. 상기 진토닌 및 상기 활성 작용제는 단일 조성물, 또는 별개의 조성물로서 투여될 수 있다. 상기 투여는 상기 진토닌을 먼저 투여한 후, 상기 활성 작용제를 투여하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 활성 작용제는 상기 진토닌 투여 후 30 분 이내, 20 분 이내, 15 분 이내, 10 분 이내, 또는 5 분 이내에 투여되는 것일 수 있다. 상기 활성 작용제는 상기 진토닌 투여 후 예를 들면, 1 분 내지 30 분, 1 분 내지 20 분 이내, 1 내지 5 분, 5 분 내지 15 분 이내, 5 분 내지 10 분, 또는 3 분 내지 15분 내에 투여되는 것일 수 있다. 상기 투여는 상기 활성 작용제를 먼저 투여한 후, 상기 진토닌을 투여하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 진토닌은 상기 활성 작용제 투여 후 30 분 이내, 20 분 이내, 15 분 이내, 10 분 이내, 또는 5 분 이내에 투여되는 것일 수 있다. 상기 진토닌은 상기 활성 작용제 투여 후 예를 들면, 1 분 내지 30 분, 1 분 내지 20 분 이내, 1 내지 5 분, 5 분 내지 15 분 이내, 5 분 내지 10 분, 또는 3 분 내지 15분 내에 투여되는 것일 수 있다.

상기 방법은 물질 또는 증상의 존재를 진단하기 위한 것 또는 증상을 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 물질 또는 증상은 뇌, 망막, 또는 척수에 존재하는 것일 수 있다.

상기 활성 작용제는 약제학적 활성 작용제, 또는 진단적 활성 작용제일 수 있다. 상기 방법은 약제학적으로, 또는 진단학적으로 허용가능한 담체를 함께 투여하는 것일 수 있다.

상기 진토닌은 상기 혈관의 투과성을 증가시키기에 유효한 양으로 투여되는 것일 수 있다.

제4 양상은 활성 작용제를 개체에 전달하기 위한 방법에 사용하기 위한 진토닌의 용도를 제공한다. 상기 용도는 혈관을 통하여 개체에게 전달하기 위한 것일 수 있다. 상기 혈관은 뇌, 척수, 또는 망막 혈관일 수 있다.

제5 양상은 활성 작용제를 개체에 전달하데 사용하기 위한 진토닌을 제공한다.

일 양상에 따른 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물에 의하면, 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 진토닌 및 활성 작용제를 포함하는 조성물에 의하면, 활성 작용제를 효율적으로 전달할 수 있다.

다른 양상에 따른 활성 작용제를 개체에 전달하기 위한 방법에 의하면, 활성 작용제를 개체에 효율적으로 전달할 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 형광 FPR552-진토닌이 HBMVEC에 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 2a 및 2b는 진토닌이 HBMVEC의 형태학적 변화에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 3a 내지 도 3e는 진토닌은 LPA 수용체 신호 및 Rho 관련 키나제 신호 전달에 의해 매개되는 HBMVEC의 신속한 시험 관내 투과화를 유도한다는 것을 나타내는 도면이다. 도 3f는 진토닌과 LPA에 의한 70kDA TexRed-dextran의 투과성을 시간별로 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a 및 4b는 HBMVEC의 진토닌-매개된 투과성화는 접합 단백질의 파괴를 통해 이루어지며 발현 수준의 하향 조절을 수반하지 않는다는 것을 나타내는 도면이다.
도 5a 내지 도 5c는 진토닌이 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 생체 내 투과성화(permeabilization)와 뇌에서 큰 분자 축적을 유도한다는 것을 나타내는 도면이다.
도 6은 진토닌이 에리스로포이에틴 (EPO)의 뇌 전달을 향상시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 7a 내지 도 7c은 진토닌이 신경세포, 교세포 및 내피 세포에 결합한다는 것을 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 진토닌이 혈관 투과성에 미치는 효과의 확인

1. 재료 및 방법

(1) 재료

진토닌은 이전에 보고된 방법에 따라 Panax ginseng으로부터 crude gintonin을 준비하였다 (Choi SH, et al. J Ginseng Res. 2011; 35(4):471-478). 시험 관내 연구에서, 진토닌은 디메틸 술폭시드(DMSO)에 용해시켰다. LPA C_18:1(1-올레오일-2-히드록시-sn-글리세로-3-인산)은 Avanti Polar Lipids, Inc.(AL)로부터 구입하였다. Flamma 552 vinylsulfone (FPR 552)과 Flamma 675 vinylsulfone (FPR 675)은 BioActs (Incheon, South Korea)에서 구입하였다. 사용된 1 차 항체는 토끼 항-NeuN (Abcam, Cambridge, MA), 토끼 항-이온화 칼슘-결합 아답터 분자 1 (Iba-1, WAKO, Chuo-Ku, 일본), 마우스 항-CD11b (Serotec, Oxford, UK), 토끼 항-신경 섬유성 산성 단백질(anti-glial fibrillary acidic protein) (GFAP; DACO, Carpinteria, CA), 마우스 항-APC/CC1 (Millipore, Billerica, MA), 토끼 항-NG2 (Millipore), 토끼 항-VE-카트헤린(Cadherin)(Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 마우스 항-클라우딘-5 (Thermoscientific, Waltham, MA), 마우스 항-혈소판 내피 세포 접착 분자 (PECAM1) 및 토끼 항-피브로넥틴 항체 (이상, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 포함하였다. 사용된 2차 항체는 Cy3-결합 마우스/토끼 면역 글로불린(Ig) G 항체 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 포함하였다. Life Technologies (Carlsbad, CA)로부터 TEX-RED-덱스트란 (70 kDa) 및 플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC)-덱스트란 (10 kDa)을 구입하였다. 인간 뇌 혈관내피세포 (HBMVECs)는 Cell Systems (Kirkland, WA)로부터 구입하였다. 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.

(2) HBMVEC 배양

Cell Systems에서 얻은 HBMVEC은 대부분의 시험 관내 분석(in vitro assay)에 사용되었다. 간략하게, 세포를 트립신처리하고 계대를 위해 5 분 동안 200g에서 회전시켰다. 세포를 플라스틱 플레이트, 덮개 유리(cover glasses) 또는 Cell Systems에서 번들 키트로서 제공한 부착 요소 (4Z0-210)로 코팅된 다공성 막 위에 도말하였다. 이들 1 차 세포는 그 이후 특성을 상실하기 때문에, 8 계대 수 미만의 세포만 시험 관내 분석을 위해 사용되었다.

(3) 세포 내 진토닌 축적 분석

HBMVEC는 부착 인자로 코팅된 덮개 유리에서 100 % 컨플루언시에 도달할 때까지 배양하였다. 세포를 37 ℃에서 5, 15, 30, 60, 및 120 분 동안 Flamma 675 접합된 진토닌 1 μg/ml로 처리하였다. 얼음 냉각 PBS를 가하여 반응을 정지시켰다. 세포를 얼음 냉각 PBS로 2 회 세척하고 4 % PFA로 15 분간 고정시켰다. 세포를 얼음 냉각 PBS로 2 회 더 세척하고 0.2 % Triton X/PBS로 2 분간 침투시켰다(permeabilized). 세포를 실온에서 30 분 동안 Alexa Fluor (AF) 568 접합 Phalloidin과 함께 배양하고 PBS로 두 번 세척하였다. 세포는 DAPI를 가진 Prolong^® Gold로 덮개 유리에 탑재되었다(cover slipped). 이미지는 Zeiss Axio Imager M1 현미경을 사용하여 캡처하였다.

(4) LPA 수용체 공동- 위치화 (co-localization) 분석

HBMVEC는 부착 인자로 코팅된 덮개 유리에서 100 % 컨플루언시에 도달할 때까지 배양하였다. 세포를 1 μg/ml의 Flamma 675 접합된 진토닌으로 15 분 및 120 분 동안 37 ℃에서 500ul 배지 중에서 배양하였다. 얼음 냉각 PBS를 가하여 반응을 정지시켰다. 세포를 얼음 냉각 PBS로 2 회 세척하고 4 % PFA로 15 분간 고정시켰다. 세포를 얼음 냉각 PBS로 2 회 더 세척하고 0.2 % Triton X/PBS로 2 분간 침투시켰다. 세포를 4 ℃에서 밤새 항-LPA 수용체 항체(1 : 500, Santa Cruz Biotechnology, CA, Cat # SC-515680)와 함께 배양하고 PBS로 두 번 세척하였다. 세포를 실온에서 1 시간 동안 Alexa Fluor 488 접합된 2 차 항체로 추가 배양하고 PBS로 2 회 세척하였다. 세포는 DAPI를 가진 Prolog Gold로 덮개 유리에 탑재되었다. 이미지는 Zeiss Axio Imager M1 현미경을 사용하여 캡처하였다.

(5) 세포 접합(cell junction) 파괴 분석

HBMVEC은 100 % 컨플루언시에 이를 때까지 부착 인자로 코팅된 덮개 유리에서 배양하였다. 세포를 다른 농도의 진토닌 (0.01-10 μg/ml)과 양성 대조군으로 LPA (0.001-1 μg/ml)와 함께 15 분 동안 처리하였다. LPA 수용체 또는 Rho-연관 키나제 저해(Rho-Associated Kinase inhibition) 분석을 위해, 세포를 15 분 동안 Ki16425 또는 Y27632 (1μM)로 500 μl 배지 중에서 배양하고, 1㎍/ml의 진토닌으로 15 분 동안 500 μl 배지 중에서 배양하였다. 얼음 냉각 PBS를 가하여 반응을 정지시켰다. 세포를 얼음 냉각 PBS로 2 회 세척하고 4 % PFA로 15 분간 고정시켰다. 세포를 얼음 냉각된 PBS로 2 회 더 세척하고 0.2 % Triton X/PBS로 2 분간 투과시켰다. 세포를 실온에서 30 분 동안 Alexa Fluor568 접합 Phalloidin과 함께 배양하고 PBS로 두 번 세척하였다. 세포는 DAPI를 가진 Prolog Gold로 덮개 유리에 탑재되었다. 이미지는 Zeiss Axio Imager M1 현미경을 사용하여 캡처하였다.

(5) 시험 관내 텍사스 레드 - 덱스트란 투과도 분석

HBMVEC은 부착 인자로 코팅된 다공성 막에서 100 % 컨플루언시에 도달 할 때까지 배양하였다. 세포를 미리-데워진 HBSS 함유 24 웰 플레이트로 옮기고, 4 시간 동안 추가로 인큐베이션하여 순응시켰다. 상단 챔버 (유선상 말씀드렸던 것처럼, 제품명/ 구입처를 기재해 주십시오)에서 70 kDa Texas Red-Dextran 100 μg/ml은 서로 다른 시간 지점 (1, 5, 15, 30 분)에서 다른 농도의 진토닌 (0.01-100 μg/ml)과 혼합하고 HBSS 50 μl를 각 시점에서 하단 챔버에서 수집하였다. LPA 수용체 또는 Rho-연관 키나제 저해 분석을 위해, 세포를 15 분 동안 Ki16425 또는 Y27632 (1μM)로 1000ul 배지 중에서 배양하여 전처리하고, 15 분 동안 1㎍/ml의 진토닌으로 1000ul 배지 중에서 배양하여 추가로 처리하고 50㎕의 HBSS를 하부 챔버로부터 수집하였다. 텍사스 레드-덱스트란의 농도를 형광 분석기로 분석하였다.

(6) 시험관 밀접 접합 파괴 분석(tight junction disruption assay)

HBMVEC은 100 % 컨플루언시에 이를 때까지 부착 인자로 코팅된 덮개 유리에서 배양하였다. 세포를 15 분 동안 다양한 농도의 진토닌 (1 μg/ml)으로 1000ul 배지 중에서 배양하여 처리하였다. 얼음 냉각 PBS를 가하여 반응을 정지시켰다. 세포를 얼음 냉각 PBS로 2 회 세척하고 4 % PFA로 15 분간 고정시켰다. 세포를 얼음 냉각된 PBS로 2 회 더 세척하고 0.2 % Triton X/PBS로 2 분간 투과시켰다. 세포를 4 ℃에서 밤새 항-VE-Cadherin으로 배양하고 PBS로 2 회 세척하였다. 세포를 실온에서 1 시간 동안 AF488 접합된 2 차 항체 및 AF568 접합된 phalloidin과 함께 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 DAPI를 가진 Prolog Gold로 덮개 유리에 탑재되었다. 이미지는 Zeiss Axio Imager M1 현미경을 사용하여 캡처하였다.

(7) 웨스턴 블롯 분석

HBMVEC를 24-웰 플레이트에서 100 % 컨플루언시를 나타낼 때까지 배양하고 최대 4 시간 동안 백일해 독소(pertussis toxin)로 처리하였다.

세포를 용해 완충액으로 용해시키고, 8 % 소듐 도데실 설페이트 (SDS)-폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 겔에 로딩시키고 100V에서 1 시간 동안 전기영동시켰다. 샘플을 400 mA에서 4 시간 동안 니트로셀룰로스 막에 전기 블로팅하였다. 블롯을 4 ℃에서 20 분간 1 % 소혈청알부민(BSA)/트리스 완충 식염수-트윈 (Tween) 20 (TBST)으로 차단하고 4 ℃에서 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 블롯을 TBST로 2 회 (각각 5 분) 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 양 고추 냉이 퍼옥시다아제 (HRP)-접합된 2 차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 블롯은 향상된 화학 발광 (ECL) 용액으로 현상하였고 X 선 필름에 노출되었다.

(8) 생체 내 실험을 위한 동물 준비

이 연구는 국립 동물 실험 동물 보호 지침에 따라 수행되었으며 모든 실험 절차는 건국 대학교 생물 의학 연구소 기관 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 : 16-206)에 의하여 허가되었다. BL6 마우스와 수컷 스프라그돌리 (Sprague Dawley) 랫트는 잭슨 연구소 (Jackson laboratory)에서 구입하여 건국 대학교 동물 시설에 사육하였다.

(9) 생체 내 FITC-덱스트란 투과도 분석

생체 내 분석을 위해, 생쥐를 다른 시점에서 10-kDa FITC-덱스트란과 함께 10 mg/kg의 진토닌을 PBS에 녹여 사용하였다. 대조군으로서, LPA를 10-Da FITC Dextran과 함께 PBS에 녹여 사용하였다. 도파민의 위-신경전달물질(pseudo-neurotransmitter)인 형광성 가짜 신경전달물질(fluorescent false neurotransmitter)(FFN) 202에 대한 진토닌에 의해 유도된 투과성을 시험하기 위해, 대조군과 함께 FFN202와 함께 진토닌 10 mg/kg을 5 분 동안 주사하였다. 생쥐를 안락사시키고 얼음 냉각 인산염 완충 식염수 (PBS)로 관류시켰다. 뇌를 잘라내고 Tris-HCl (pH 8.0)에서 갈았다. 용해물을 12,000xg에서 회전시키고, 상등액을 동일한 부피의 메탄올로 유지시키고 침전시키고, 12,000xg에서 20 분 동안 원심 분리시켰다. 상등액을 수집하고, 10-kDa FITC-덱스트란의 농도를 형광 플레이트 판독기(fluorimetric plate reader)를 사용하여 측정하였다.

(10) 뇌척수액 ( CSF )과 혈장의 에리트로포이에틴 (EPO) 분석

수컷 Sprague Dawley 랫트 (8 주령, 220-250 g)를 정맥 내 주사를 통하여 진토닌 (30 mg/kg) 또는 LPA C_18:1 (6 mg/kg)과 EPO (3000 U/kg, CJ HealthCare, Korea)로 처리하였다.

처리군은 비히클, 진토닌 단독, EPO 단독, EPO + 진토닌 그룹 또는 EPO + LPA C_18:1을 포함하였다. 다른 그룹을 Ki16425 (30 mg/kg)로 30 분간 복강 내 주사하여 전처리 한 후, EPO + 진토닌을 투여하였다. 주입 3 시간 후 CSF 샘플을 cisterna magna로부터 수집하였다. 랫트를 유도 챔버(induction chamber)에 넣고 30 % O₂/70 % N₂O 중 1.5 % 이소플루란으로 마취시켰다. 마취된 랫트를 정위 장치 (stereotaxic apparatus)에 넣고 귀와 후두골(occipital bone) 위 사이의 정중선 절개를 하였다. 경부-척추 근육이 위치확인되고 환추후두막(atlano-occipital membrane)이 노출된 후, 막을 30 게이지 바늘로 찔러서 CSF를 주사기에 넣었다. CSF 또는 혈장 중의 EPO 농도는 인간 EPO 면역 검정 키트인 Quantikine IVD (R & D systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 측정하였다.

(11) 생체 내 면역 형광 분석

HBMVEC를 100 % 컨플루언시에 도달할 때까지 커버슬립 상에서 배양하였다. 세포를 다른 농도의 진토닌으로 incubation하였다. 다른 시간 지점에서 그 하위-분획(sub-fraction) 및 샘플 세포를 4 % 파라포름알데히드 (PFA)로 20 분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS로 세척하고 0.2 % Triton-X로 5 분 동안 투과성으로 만들고 PBS로 2 회 세척하였다. 세포를 5 % 염소 혈청으로 차단하고 1 차 항체와 함께 밤새 배양하였다. 세포를 PBS로 2 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 형광 표지된 2 차 항체와 함께 배양하였다. 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 함유하는 Prolong^®-gold로 덮개 유리에 탑재되었다.

뇌 절편을 얻기 위해, 쥐 (그룹당 n = 3 ~ 4)를 케타민 및 질라진(xylazine)으로 마취시키고 얼음 냉각된 PBS로 관류시켰다(perfused). 뇌를 절개하여 최적의 절삭 온도(optimum cutting temperature: OCT) 용액에 넣고 액체 질소로 급속 동결한 다음 분석할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다. 뇌를 저온 유지 장치(cryostat)로 절단하고 (두께 8 μm) 4 % PFA로 15 분간 고정시켰다. 뇌를 5 % 염소 혈청으로 실온에서 20 분간 차단하고, 4 ℃에서 밤새 항-클라우딘 5 (1 : 200)로 인큐베이션하고 PBS로 두 번 세척하였다. 절편을 실온에서 1 시간 동안 형광색소(fluorochrome)-접합된 2 차 항체로 염색하고 PBS로 두 번 세척하였다. 마지막으로 슬라이드를 DAPI가 포함된 Vectashield로 덮었다(coverslipped). 이미지는 Zeiss Axio Imager M1 현미경을 사용하여 캡처하였다.

FPR675-진토닌의 세포 분포를 조사하기 위해, 쥐 (그룹당 n = 3-4)를 안와후 정맥(retro-orbital vein)을 통해 FPR675-진토닌 (1 mg/100 μl)로 주사하였다. FPR675-진토닌 처리 30 분 전에 Ki16425 (30 mg/kg)를 복강 내 주사를 통하여 전처리하였다. 실험 종료시, 마우스를 에틸 에테르로 마취시키고, 뇌를 식염수 및 4 % PFA로 관류시킨 후 또는 관류하지 않고 잘라내었다. 뇌를 4 ℃에서 같은 고정액으로 2 일간 사후-고정시킨(post-fixed) 후 PBS 중 10 %, 20 %, 30 %의 자당에서 48 시간 동안 4 ℃에서 연속적으로 동결 보존하였다. 연속 관상 절편(sequential coronal sections) (두께 30 μm)을 뇌량(corpus callosum)의 앞쪽(anterior aspect)부터 시작하여 전체 줄무늬체(striatum) (bregma, 1.40-1.30 mm)을 따라 진행하면서 모델 CM3050S freezing microtome (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)에서 획득하였다. 면역 형광 염색을 위해, 관상 절편을 1 차 항체와 함께 밤새 4 ℃에서 배양하였다. 절편을 실온에서 1 시간 동안 Cy3-접합된 마우스 또는 토끼 IgG 항체와 배양하고, Vectashield와 함께 덮개 유리에 장착하고, 공 촛점 영상(confocal imaging) (LSM 5 PASACAL; Carl Zeiss, Germany)에 의해 시각화 하였다.

2. 결과

(1) 진토닌은 세포질 영역에 붙어 HBMVECs 에서 LPA1 수용체와 공존한다

진토닌은 LPA들과 인삼 단백질의 복합체로 이루어져 있다. 진토닌의 LPA C_18:2는 인삼의 주요 라텍스 단백질 151과 연관(associated)되어 있기 때문에 먼저 진토닌 단백질 성분을 FPR552 및 FPR675와 같은 형광 염료로 다음과 같이 표지하였다. 진토닌과 각각의 FPR552 vinylsulfone 혹은 FPR675 vinylsulfone을 1:5의 몰비로 carbonate/bicarbonate (pH 9.0)의 용액에서 섞은 다음 FPR552-gintonin 혹은 FPR675-gintonin conjugate가 형성되도록 1시간 동안 반응시켰다. Sephadex PD10 column (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA)을 이용하여 FPR552-gintonin 혹은 FPR675-gintonin conjugate가 형성안 된 free FPR552 혹은 FPR675 vinylsulfone을 제거하였다. 칼럼을 통하여 모아진 FPR552-gintonin 혹은 FPR675-gintonin conjugate을 10 K MWCO을 이용하여 conjugate들이 1 mg/ml이 될 때까지 농축시키고 동결 건조하였다. FPR552-gintonin 혹은 FPR675-gintonin conjugate의 수율은 약 7%이었다. 시험관 내 실험을 위한 형광 FPR552-진토닌 또는 생체 내 실험을 위한 형광 FPR675-진토닌을 생산하였다 (도 1 및 2).

FPR552-진토닌이 HBMVEC에 직접 결합하는지를 결정하기 위해, 우리는 먼저 형광 FPR552-진토닌으로 HBMVEC의 단층을 처리하였다.

도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 형광 FPR552-진토닌으로 HBMVEC를 처리하면 시간에 따라 5 분에서 최대 2 시간 동안 세포질에 상기 작용제가 결합되어 진토닌이 HBMVEC에 직접 결합한다는 것을 알 수 있다. HBMVEC는 또한 인간 LPA1-3 수용체 아형을 발현한다. 우리는 이들 세포의 FPR552-진토닌 결합 부위가 HBMVEC의 주요 LPA 수용체인 LPA1 수용체와 공존하는지(co-localize)를 조사하였다.

도 1c 및 도 1d에 나타낸 바와 같이, 일부 FPR552-진토닌 결합 부위는 HBMVEC에 의해 발현된 LPA1 수용체와 공존하며, FPR552-진토닌이 HBMVEC 상의 LPA1 수용체에 결합한다는 것을 나타낸다. brain endothelial cell에서의 LPA receptor는 세포질 내의 endosomal trafficking pathway에 존재하는 것으로 알려져 있다.

도 1a 내지 도 1d는 형광 FPR552-진토닌이 HBMVEC에 결합하는 것을 나타낸 도면이다. 도 1a 및 도 1b에서, HBVEC를 2 시간까지 다른 시점에서 형광 FPR552-진토닌 (녹색)으로 처리하였다. 세포를 AF 594-접합 Phalloidin (Red)으로 염색하고 DAPI (Blue)로 대조 염색하였다. 막대 = 75 μm.

도 1c 및 도 1d에서, HBVEC를 형광성 FPR552-진토닌 (Red)으로 15 분 및 2 시간 동안 처리하였다. 세포를 고정시키고, 투과성으로 만들고, 항-LPA1 수용체 (적색)로 염색하고, DAPI (청색)로 대조 염색하였다. 상단 패널의 박스 영역의 이미지를 확대하여 하단 패널에 표시하였다. 진토닌과 LPA 수용체의 공존은 백색 화살표로 표시하였다. 막대-상부 및 하부 패널에 대해 각각 75 및 10 μm.

(2) 진토닌을 이용한 HBMVEC 의 처리는 LPA 수용체와 ROCK 키나제 경로를 통한 형태학적 변화를 유도한다.

또한, 우리는 진토닌이 HBMVEC에서 형태학적 변화를 유도할 수 있는지 조사하였다. 진토닌은 용량 의존적으로 HBMVEC에서 형태학적 변화를 유도하였다 (도 2a 및 도 2b). 흥미롭게도, 진토닌에 의해 유도된 형태 변화는 HBMVEC에서 다소 불규칙적이었고, 일부 HBMVEC는 다른 세포와 중첩되었고 세포의 단층보다 더 강하게 염색되었다 (도 2a, 상부 패널). 유사하게, LPA C_{18 :1}에 의한 HBMVEC에 대한 처리는 HBMVEC에서 농도 의존적 방식으로 형태학적 변화를 유도하였다 (도 2a, 하부 패널). 그러나, 상기 진토닌에 의해 유도된 형태학적 변화와 세포 중첩은 LPA1/3 수용체 길항제 Ki16425와 ROCK 키나제 억제제 Y27632에 의해 차단되어 이러한 효과가 LPA 수용체-ROCK 키나제 경로에 의해 매개되는 것으로 나타났다 (도 2b).

도 2a 및 2b는 진토닌이 HBMVEC의 형태학적 변화에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 2a에서 HBVEC의 단일층을 다른 농도의 진토닌을 15 분 동안 처리하였다. 세포를 고정시키고 AF594-접합된 Phalloidin (적색)으로 염색하고, DAPI (청색)로 대조 염색하였다. 도 2b에서, LPA 수용체 및 Rho GTPase-연관 키나제 억제제인 Ki16425 및 Y27632로 각각 전처리한 후 1 차 HBVEC를 진토닌으로 처리하였다. 세포를 고정시키고, 투과성으로 만들고, AF594-접합된 Phalloidin (적색)으로 염색하고, DAPI (청색)로 대조 염색하였다. 막대 = 100 μm.

(3) HBMVEC 의 진토닌 처리는 용량 의존적이며 시간 의존적인 방식으로 큰 분자의 투과성을 증가시킨다.

진토닌이 HBMVEC에서 빠른 형태학적 변화를 유도하기 때문에, 진토닌이 HBMVEC 단일층의 투과성을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 이것은 세포 간 접합(cell-to-cell junctions)을 통한 큰 분자의 통과를 검사하는 모델 세포 시스템이다. 우리는 진토닌으로 HBMVEC의 처리가 처리 1 분 후에 시작하는 70-kDa TexRed-dextran에 대한 투과성을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 이 효과는 최대 15 분 동안 지속되었고 그 후 약해지고 30 분에 기저 수준에 도달하였다. 흥미롭게도, 우리는 진토닌이 매개하는 투과성 증가가 진토닌의 고농도(10 μg/ml)에서 1 분(도 3a)에서 시작되었고, 진토닌의 더 낮은 농도(0.01 μg/ml)에 의하여 5 분에서 시작하였다 (도 3b). 다시 진토닌이 매개하는 투과성 증가가 15 분에서 진토닌의 고농도에서 관찰되었는데 (도 3c), 진토닌의 효과가 빠르고, 짧고, 가역적임을 시사한다 (도 3d). 진토닌-매개된 70-kDa Tex-Red-dextran 침투에서 LPA 수용체의 관련성을 더 조사하기 위해, 우리는 LPA1/3 수용체 길항제인 Ki16425를 사용하였다. 우리는 70-kDa TexRed-dextran의 투과성이 Ki16425 처리에 의해 차단된다는 것을 관찰하였고,이는 70-kDa TexRed-dextran 투과의 진토닌 매개 증가가 LPA 수용체 신호 전달(LPA receptor signaling)에 의하여 매개된다는 것을 나타낸다 (도 3e). 또한, ROCK 키나제 억제제인 Y27362의 효과를 조사한 결과, 진토닌-매개된 HBMVEC의 70-kDa Tex-Red-dextran 침투가 차단되었음을 확인하였다 (도 3e). 진토닌과 LPA에 의한 70-kDa TexRed-dextran의 투과성을 비교한 결과 LPA와 비슷한 패턴을 보이나, 70-kDa TexRed-dextran의 투과성에 대하여 진토닌의 효과가 조금 더 먼저 일어나고, 조금 더 늦게까지 지속이 되는 것을 관찰하였다 (도 3f). 사용한 LPA 농도와 비교하기 위하여 진토닌의 분자량을 약 67 kDa (Hwang et al. Mol Cells. 2012; 33(2):151-62.)로 계산 한다면 진토닌 1 ug/ml은 몰수로 계산할 경우 약 67 nM에 해당되어 LPA보다 약 15 배 정도 적은 양에 해당되는 것임에도 불구하고 70-kDa TexRed-dextran의 투과성에 있어서 LPA보다 더 좋은 효과를 보여주고 있다. 이러한 결과는 진토닌 처리가 신속한 세포 골격 재구성을 유도하고 세포 간 접합부 공간을 증가시켜 LPA 수용체-ROCK 키나제 신호 전달 경로를 통해 HBMVEC에서 70kDa TexRed-덱스트란 투과를 증가시키는 것을 나타낸다.

도 3a 내지 도 3e는 진토닌은 LPA 수용체 신호 및 Rho 관련 키나제 신호 전달에 의해 매개되는 HBVEC의 신속한 시험 관내 투과화를 유도한다는 것을 나타내는 도면이다. 도 3a 내지 도 3e에서, 다공성 멤브레인 (0.4 μm)에서 배양된 1 차 HBVEC를 70-kDa TexRed-1과 함께 1 (도 3a), 5 (도 3b), 15 (도 3c) 및 30 (도 3d) 분까지 다른 농도의 진토닌으로 처리하였다. 덱스트란. 하부 웰의 배지를 수집하고, 하부 웰로 이동하는 70-kDa TexRed-Dextran의 농도를 형광 측정법(fluorimetry)을 사용하여 분석하였다. 도 3f에서 시간별 70-kDa TexRed-Dextran 투과성에 대한 진토닌 (1 ug/ml)과 LPA C_18:1 (1 uM) 비교 실험 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM) (n = 4)로 표현되었다. * 및 **는 각각 P <0.05 및 P <0.01를 나타낸다. 도 3e에서, 15 분 동안 Ki16425 또는 Y27632로 전처리하고 진토닌 (적절한 대조군과 함께)으로 15 분간 처리한 1 차 HBVEC에 관한 것이다. 하부 웰의 배지를 수집하고, 하부 웰로 이동하는 70-kDa TexRed-Dextran의 농도를 형광 측정법을 사용하여 분석하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM) (n = 4)로 표현되었다. **는 P <0.01를 나타낸다.

(4) BBB의 투과성은 그 발현 수준을 변화시키지 않고 부착체 ( adherens ) 및 밀접 접합 단백질(tight junction protein)의 조기 느슨함(early looseness)으로 인해 증가한다.

우리는 진토닌이 HBMVEC의 형태학적 변화를 통해 큰 분자의 시험관 내 투과성을 증가시키는 것을 관찰했기 때문에 진토닌이 HBMVEC의 밀접 접합(tight junction) 또는 부착 접합(adherens junction) 단백질을 억제하거나 하향 조절할 수 있는지 여부를 조사하였다. 우리는 5 분 동안 진토닌으로 HBMVEC의 단일층을 처리하고 VE-Cadherin으로 염색하였다. VE-Cadherin은 갭-접합 단백질의 대표적인 부착체(adherens)이다. 우리는 진토닌이 세포-세포 상호 작용을 느슨하게 하고, 갭-접합 단백질 VE-Cadherin의 분포를 변화시키고, 처리되지 않은 대조군과 비교하여 HBMVEC 사이의 밀접 접합의 개방을 극적으로 증가시킬 수 있음을 발견하였다 (도 4a). 이 결과는 진토닌이 갭 접합을 열고 HBMVEC의 세포 간 침투성을 증가시키고, 진토닌이 매개하는 큰 분자의 투과성 증가는 접합성 단백질의 파괴를 통해 이루어진다는 가능성을 높여 준다. 우리는 면역 형광 분석에서 접합 분자의 파괴를 관찰했기 때문에 2 시간 동안 진토닌 처리에 의한 접합 분자 (VE-Cadherin 및 Claudin-5)의 파괴가 접합 단백질의 농도에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 Western blot 분석을 수행하였다. 우리는 각각 부착(adhesion)과 접합성 분자를 구성하는 VE-cadherin과 Claudin-5의 발현이 유의적으로 영향을 받지 않음을 발견하고, 이는 진토닌에 의한 HBMVEC 파괴가 HBMVEC의 형태학적 변화에 의해 매개되고 갭 접합 단백질의 발현 수준의 변화에 의해서가 아니라는 것을 나타낸다(도 4b).

도 4a 및 4b는 HBVEC의 진토닌-매개된 투과성화는 접합 단백질의 파괴를 통해 이루어지며 발현 수준의 하향 조절을 수반하지 않는다는 것을 나타내는 도면이다. 도 4a에서, HBVEC를 진토닌 (각각 1 μg/ml)으로 15 분간 처리하였다. 세포를 고정시키고, 투과성으로 만들고, 항-VE-Cadherin (녹색) 및 AF594-접합 Phalloidin (적색)으로 염색하고 DAPI (청색)으로 대조 염색하였다. 막대 = 75 μm. 도 4b에서, HBVEC를 진토닌 (1 μg/ml)으로 90 분 동안 처리하였다. 세포를 NP-40 세포 용해 완충제로 용해시키고 10 % 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 겔에 1 시간 동안 로딩하고 니트로셀룰로오스 종이에 옮기고 항-VE-Cadherin 및 항-Claudin-5 항체와 함께 인큐베이션하여 그 발현 수준 분석을 하였다. 대표 결과는 세 가지 독립적인 실험에서 제공되었다. 글리세르알데히드-3-데히드로게나제 (GAPDH)를 로딩 대조군으로 사용하였다.

(5) 진토닌은 또한 저분자 및 고 분자량 분자의 생체 내 뇌 전달을 신속하게 향상시킨다.

우리는 HBMVEC 갭-접합의 개방을 통한 시험관 내 BBB 투과성의 극적이고 빠른 증가를 관찰했기 때문에 진토닌이 세포주위 경로(paracellular pathway)를 통해 뇌에 저 분자량 분자와 고 분자량 분자의 전달을 증가시킬 수 있는지를 조사하였다. 우리는 안와후 정맥을 통해 10-kDa FITC-dextran과 함께 1-100 mg/kg 진토닌을 주사하였고 시간 경과에 따라 뇌에서 10 kDa FITC-dextran의 축적을 관찰하였다 (도 5a). 흥미롭게도, 진토닌 처리는 대조군 비히클 처리와 비교하여 Claudin-5의 염색 패턴 변화를 유발하였고, 진토닌의 저용량으로 5 분에 10 kDa FITC-dextran이 뇌에 축적되기 시작하였다. 이 효과는 최대 15 분 동안 유지되었다 (도 5b 및 c). 진토닌의 효과는 처리 후 30 분에 완하되었다. 이는 양성 대조군으로 사용된 LPA 주사의 동력학과 유사하게, BBB의 생체 내 개통에 대한 진토닌의 효과는 일찍 발생한다는 것을 암시한다 (도 5c). 또한, BBB를 여는 데 필요한 진토닌의 유효 용량은 10 mg/kg까지 증가되었지만, 진토닌은 더 높은 용량에서 효과가 없었다 (도 5d). 이는 수용체 포화가 빨라서, 높은 용량(dosage)에서 진토닌의 효과를 관찰하지 못할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 5d).

도 5a 내지 도 5c는 진토닌이 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 생체 내 투과성화(permeabilization)와 뇌에서 큰 분자 축적을 유도한다는 것을 나타내는 도면이다. 도 5a에서, 진토닌은 진토닌 (10 mg/kg)과 함께 또는 없이 10-kDa fluorescein isothiocyanate (FITC) Dextran을 15 분간 주사하고 얼음-냉각 인산 완충 식염수 (PBS)로 관류하였다. 절편을 급속 냉동하고, 잘라내어 형광 현미경으로 시각화하였다. 막대 = 500 μm. 도 5b에서, 15 분 동안 진토닌과 함께 또는 없이 10-kDa-FITC Dextran으로 처리된 마우스로부터 수집한 뇌 절편을 항-클라우딘 5 (녹색)로 염색하고 DAPI로 대조 염색하였다 (청색). 막대 = 25 μm. 도 5c에서, 마우스를 다른 시점에서 10-kDa FITC-덱스트란과 함께 10 mg/kg 진토닌과 함께 또는 없이 처리하였고, 그 뇌를 수집하고 갈았다. 10-kDa FITC-덱스트란을 추출하고 그 농도를 형광 측정법으로 분석하였다. LPA (1 mg/kg)를 양성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM) (n = 3)로 표현된다. **는 P <0.01를 나타낸다. 도 5d에서, 마우스를 15 분 동안 10-kDa FITC-덱스트란과 함께 다양한 농도의 진토닌과 함께 또는 없이 처리하고, 그 뇌를 잘라내고 균질화시켰다. 10-kDa FITC-덱스트란을 추출하고 그 농도를 형광 측정법을 사용하여 결정하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM) (n = 3)로 표현된다. **는 P <0.01를 나타낸다.

우리는 또한 진토닌이 형광성 위(false) 도파민 신경전달물질인 FFN202가 흑질(substantia nigra)에 진입하는 것에 미치는 영향을 조사하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 진토닌은 FFN202의 축적을 유도하였다. 또한 우리는 진토닌이 저산소 조건 하에서 외부 침투(external permeation)로부터 뇌를 보호하는 것으로 알려진 에리트로포이에틴 (분자량, 34 kDa)에 미치는 영향을 조사하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 진토닌과 쥐의 꼬리 정맥을 통한 에리트로포이에틴의 정맥 내 공동 투여는 에리트로포이에틴 단독 투여에 비해 뇌척수 내에서 41.4±5.5 %의 에리스로포이에틴 수준을 유의적으로 증가시켰다. LPA C_{18 :1} (양성 대조군)은 또한 에리트로포이에틴 수준을 28.6±7.5 % 증가시켰다. 진토닌과 에리트로포이에틴의 동시 투여에 대한 반응과 비교하여, 진토닌-매개된 에리트로포이에틴 투과성 증가는 LPA1/3 수용체 길항제인 Ki16425에 의해 41.4±5.5 % 억제되었다. 그러나, 진토닌과 에리트로포이에틴의 병용 투여는 혈장 에리트로포이에틴 수준에 영향을 미치지 않았다 (도 6). 이러한 결과는 진토닌이 낮은 분자량과 높은 분자량을 갖는 생체 활성 성분의 뇌 투과성을 선택적으로 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

도 6은 진토닌이 에리스로포이에틴 (EPO)의 뇌 전달을 향상시킨다는 것을 나타내는 도면이다. 대조군 비히클, EPO (3000 U/kg), 진토닌 (GT, 30 mg/kg) + EPO (3000 U/kg), LPA (6 mg/kg) + EPO (3000 U/kg) 또는 진토닌 (GT) 단독을 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. GT + EPO로 처리하기 30 분 전에 Ki16425 (30 mg/kg, i.p.)를 주사하였다. 뇌척수액 (A) 또는 혈장 (B)의 총 EPO 수준을 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)로 분석하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM) (n = 4)로 표현된다. * p <0.005, ** p <0.001 대 대조군; #p <0.001 대 진토닌 + EPO; ## p <0.01 vs. EPO.

(6) 진토닌 자체는 뇌에 진입하여 신경 세포(neuron), 성상 세포( astrocyte ) 및 희소돌기아교세포( oligodendrocyte )와 같은 뇌 실질 세포( parenchymal cell)에 결합한다.

형광 FPR525-진토닌은 HBMVEC에 시간 의존적으로 결합하고 (도 1), HBMVEC의 형태학적 변화를 통해 갭-접합을 유도하고 (도 2 및 4), 작고 큰 분자량의 분자를 LPA 수용체를 통한 시험관 내 및 생체 내 전달을 향상시킨다 (도 3, 5 및 6). 그러나, 진토닌이 뇌 전달을 향상시키는 데 단순한 역할을 하는지 또는 진토닌 자체가 동시에 뇌에 들어갈 수 있는지 여부는 분명하지 않다. 이 질문에 답하기 위해 우리는 형광 RPR675-진토닌을 안와후 정맥을 통해 투여하고 FPR675-진토닌의 세포 내 분포 및 뇌에서의 위치를 조사하였다. 강한 형광 FPR675-진토닌 형광은 주로 주입 후 30 분, 1 시간 및 3 시간에 식염수로 관류하지 않고 뇌의 세포 및 혈관 구조에서 시간 의존적 방식으로 관찰되었다 (도 7A-D). 식염수에 의한 관류는 뇌 조직에 대한 비특이적 결합을 제거하기 위해 수행되었다. 관류로 인하여 형광 강도가 감소되었지만, 강도는 세포 및 혈관 구조에서 높게 유지되었다 (도 7E). 따라서, 나머지 형광 신호가 LPA 수용체와 관련이 있는지를 확인하기 위해 FPA675-진토닌 주사 30 분 전에 LPA1/3 수용체 길항제인 Ki16425를 복강 내 전처리하였다. 흥미롭게도, FPR675-진토닌 형광 신호는 Ki16425 전처리 후 뇌 절편에서 거의 관찰되지 않았다 (도 7F). 이 결과는 뇌에서의 FPR675-진토닌 결합이 Ki16425-민감성임을 시사하므로, 이중 면역 형광 염색법을 사용하여 FPR675-진토닌의 세포 분포를 조사하였다. 우리는 FPR675-진토닌 형광이 대뇌 피질의 신경세포에 대해 NeuN (+)(도 7G), 성상 교세포에 대하여 Iba-1 및 CD11b (+)(도 7H와 I), 성상세포에 대하여 GFAP (+)(도 7J), 희소돌기아교세포에 대하여 CC-1 및 NG2 (+)(도 7K 및 L), 혈관내피세포에 대하여 PECAM-1 및 피브로넥틴 (+)(도 7M 및 N)과 공존한다는 것을 발견하였다, 그러나, 발현 수준은 Ki16425로 전처리한 후에는 거의 구분할 수 없었다 (데이터는 나타내지 않음). 우리는 또한 FPR675-진토닌 형광이 24 시간 간격으로 반복 처리 (2 회)로 축적되었는지 여부를 조사하였다. FPR675-진토닌을 사용한 두 번째 처리 후 24 시간에 형광 강도와 세포 분포는 단일 처리 후 3 시간 (도 70-R)과 유사하였다. 이는 진토닌이 뇌의 신경세포와 교세포(glia)에 결합하지만 반복된 처리 후에 축적되지 않는다는 것을 나타낸다. 요약하면, 이 결과들은 진토닌 자체가 뇌의 혈관내피세포에서 진토닌에 의해 유도된 형태학적 변화와 함께 갭 접합이 열리면 동시에 뇌에 들어갈 수 있음을 나타낸다. 따라서 진토닌은 이중 작용을 갖는다 : 1) 외인성 분자의 뇌 전달의 일시적인 촉진 및 2) 진토닌 자체의 뇌내 진입

도 7a 내지 도 7c은 진토닌이 신경세포, 교세포 및 내피 세포에 결합한다는 것을 나타내는 도면이다. 도 7a 내지 도 7c의 A-F에서, 생쥐 (그룹당 n = 3 ~ 4)를 안와후 정맥(retroocular vein)을 통해 식염수 (A) 또는 FPR675-진토닌 (1 mg/100 μl 생리 식염수; B-F)로 처리하였다. 식염수와 고정액(fixative)으로 관류없이 30 분 (B), 1 시간 (C), 3 시간 (D) 후, 또는 3 시간 후 관류 (E) 후 뇌를 제거하였다. 생쥐를 FPR675-진토닌으로 처리하기 30 분 전에 Ki16425 (30mg/kg)로 복강 내 전처리하고, 3 시간 후 (F) 뇌 절편을 관류하여 제조하였다. (G-N) FPR675-진토닌 처리 후 3 시간부터, 뇌 절편을 신경 세포에 대한 항-NeuN 항체 (G), 교세포에 대한 항-Iba-1 (H) 및 항-CD11b (I) 항체, 희소돌기아교세포에 대한 항-CC-1 (K) 및 항-NG2 (L) 항체, 및 내피 세포에 대한 항-PECAM-1 (M) 및 항-피브로넥틴 (N) 항체로 염색하였다. (O 및 P) 24 시간 간격으로 두 번째 FPR675-진토닌 처리 24 시간 후, 뇌 절편은 관류 (O)와 함께 준비되었다. FPR675-진토닌 처리 30 분 전에 Ki16425 (30 mg/kg)를 복강 내 전처리하고 관류 (P)와 함께 절편을 준비하였다. (Q-V) 24 시간 간격으로 두 번째 FPR675-진토닌 처리 24 시간 후, 관류된 절편을 항-NeuN (Q), Iba-1 (R), GFAP (S), CC-1 (T ), PECAM-1 (U) 및 피브로넥틴 항체 (V)로 염색하였다. 막대 = 100 μm.

이상의 실험 결과로부터, 진토닌은 BBB 통한 활성 성분의 전달을 촉진하는데 사용될 수 있다는 것이 확인되었다.

Claims (19)

1. 진토닌을 포함하는 혈관의 투과성을 증가시키는데 사용하기 위한 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 활성 작용제를 더 포함하는 것인 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 활성 작용제는 약제학적 활성 작용제, 진단적 활성 작용제 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
4. 청구항 2에 있어서, 상기 활성 작용제는 소분자, 단백질, 다당류, 핵산 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
5. 청구항 2에 있어서, 상기 활성 작용제는 분자량이 1kDa 내지 500kDa인 것인 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 진토닌은 혈관내피 세포와 혈관내피 세포 사이의 밀접 접합(tight junction)을 약화시켜 혈관의 투과성을 증가시키는 것인 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 혈관은 뇌혈관 또는 망막 혈관인 것인 조성물.
8. 청구항 3에 있어서, 상기 활성 작용제의 뇌 안, 척수(spinal cord), 또는 망막 안으로의 전달을 촉진하기 위한 것인 조성물.
9. 청구항 3에 있어서, 약제학적으로, 또는 진단적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것인 조성물.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 약제학적 활성 작용제는 알츠하이머를 제외한 신경퇴행성 질환, 신경 정신성 질환, 뇌 종양, 망막 질환, 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 및 뇌졸증(stroke)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 약제, 신경영양인자(neurotrophic factor), 또는 성장인자인 것인 조성물.
11. 청구항 2에 있어서, 상기 진토닌 및 상기 활성 작용제는 동시, 또는 별개로 투여되는 것인 조성물.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 진토닌은 LPA1R에 결합하는 것인 조성물.
13. 청구항 1에 있어서, 상기 진토닌은 LPA 신호 경로를 개시하는 것인 조성물.
14. 진토닌 및, 알츠하이머를 제외한 신경퇴행성 질환, 신경 정신성 질환, 뇌 종양, 망막 질환, 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 및 뇌졸증(stroke)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 약제, 신경영양인자(neurotrophic factor), 또는 성장인자를 포함하는 약학 조성물.
15. 청구항 14에 있어서, 진단적 활성 작용제를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
16. 청구항 14에 있어서, 약제학적으로, 또는 진단학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
17. 청구항 14에 있어서, 상기 진단적 활성 작용제는 이미징제, 자기적 활성 작용제, 또는 방사성 활성 작용제인 것인 조성물.
18. 청구항 14에 있어서, 상기 진토닌 및 상기 약제는 동시, 또는 별개로 투여되는 것인 조성물.
19. 진토닌 및 활성 작용제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 활성 작용제를 개체에 전달하기 위한 방법.

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