KR20190017870A - 앱타머 쌍 선택 방법 - Google Patents

앱타머 쌍 선택 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20190017870A
KR20190017870A KR1020197000111A KR20197000111A KR20190017870A KR 20190017870 A KR20190017870 A KR 20190017870A KR 1020197000111 A KR1020197000111 A KR 1020197000111A KR 20197000111 A KR20197000111 A KR 20197000111A KR 20190017870 A KR20190017870 A KR 20190017870A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotides
pool
rna
target
oligonucleotide
Prior art date
Application number
KR1020197000111A
Other languages
English (en)
Inventor
준열 김
Original Assignee
프록시머티 바이오사이언시스, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프록시머티 바이오사이언시스, 엘엘씨 filed Critical 프록시머티 바이오사이언시스, 엘엘씨
Publication of KR20190017870A publication Critical patent/KR20190017870A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/501—Ligase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
    • C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
    • C12Q2541/101—Selex

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

유리 용액(free solution) 내에서 표적 분자에 대한 단일 또는 다수의 앱타머 쌍을 선택하는 방법이 개발되었다. 이들 방법은 하나 이상의 표적에 대한 앱타머 쌍을 선택하기 위한 신규한 협동적 진화 시도를 이용하며, 표적 결합시 하나 이상의 앱타머의 쌍 형성은 앱타머 증폭성(amplifiability)을 트리거(trigger)한다. 이러한 방식으로, 1회 또는 다수 라운드의 선택 과정을 통한 앱타머 리간드의 농축은 주로 유리 용액 내에서 앱타머의 표적-맞춤형의 밀접한 근접성을 기반으로 한다. 표적 결합 및 농축(enrichment)은 양성 또는 음성 선택 방법을 사용하여 커플링된다. 이들 기술은 일반적으로 많은 상이한 유형의 표적 분자에 적용가능할 수 있으며, 분석, 제조, 및 치료학적 목적을 위한 항체, 약물, 또는 다른 결합 분자에 대한 대안을 제공한다.

Description

앱타머 쌍 선택 방법
관련 출원에 대한 교차-참고
본 출원은 2016년 6월 17일자로 출원된, 미국 가특허원 일련 번호 제62/351,890호로부터의 우선권의 이익을 청구하며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 무작위처리된 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리로부터 출발하여, 목적한 표적(target)에 대해 선택적인, 쌍을 이룬 올리고뉴클레오타이드 앱타머(aptamer)를 수득하기 위한 방법, 시약, 및 키트(kit)에 관한 것이다.
발명의 배경
앱타머는 고친화성(high affinity)으로 목적한 특이적인 표적 모이어티(moiety)에 결합할 수 있는 단일 가닥 DNA, RNA 또는 폴리펩타이드 분자를 포함하는 작은 인공 리간드이다. 앱타머는 약 25년 동안 진단 및/또는 치료 목적으로 사용하기 위한 항체에 대한 강력한 대안으로서 고려되어 왔다. 앱타머는 일반적으로 목적한 표적에 대한 친화성 기반의 분할(partitioning)에 의해 후보 올리고뉴클레오타이드들의 랜덤 라이브러리를 스크리닝(screening)함으로써 수득된다. 앱타머들은 광범위한 pH 및 온도에 걸쳐 높은 구조적 안정성을 갖는데, 이는 앱타머들을 시험관내(in-vitro), 생체외(ex-vivo), 및 생체내(in-vivo) 적용이라는 넓은 스펙트럼에 있어 이상적인 시약이 되도록 한다.
1990년에, Tuerk 등 (Science 249, (1990) 505-510) 및 Ellington (Nature 346, (1990) 818-822, doi:10.1038/346818a0)은 진화 과정을 모사(mimic)하는 시험관내 방법을 개발하였다. 이러한 과정은 지수적 농축에 의한 리간드의 시스템적 진화(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment("SELEX"))로 불렸다. SELEX 과정은 변이, 선택, 및 복제를 이용하여 핵산 분자(즉, 올리고뉴클레오타이드)의 출발 풀(pool)로부터 높은 표적 친화성 및 특이성을 달성하는, 진화의 근본적인 개념을 활용한다. 일반적으로, 핵산(올리고뉴클레오타이드 DNA 또는 RNA) 앱타머의 선택을 위해, 크기가 약 20 내지 약 100개 뉴클레오타이드의 범위인 짧은 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리(약 1014 개의 상이한 서열)를 합성하여 변이를 달성한다. 각각의 올리고뉴클레오타이드는 적합한 증폭 반응, 예컨대, DNA용의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 또는 RNA용의 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 후속 증폭을 위한 프라이머 영역에 의해 플랭킹(flanking)된 내부 무작위 영역(internal random region)을 포함한다. 라이브러리 내의 다수의 고유한 서열로 인하여, 적어도 일부의 앱타머 분자가 특이적으로 그리고 친화성을 갖고 표적에 결합할 가능성이 높다. 다음에, 선택은 핵산 풀을 비드 위에 고정된 표적 분자와 함께 인큐베이션한 후, 비-결합 서열을 세척 제거함으로써 달성된다. 결합된 앱타머 분자는 용리되고 증폭됨으로써, 다음 라운드의 SELEX를 위한 투입물을 형성한다. 복제는 결합된 올리고뉴클레오타이드를 PCR 또는 일부 다른 증폭 방법을 사용하여 증폭시킴으로써 달성된다. SELEX의 라운드(즉, 선택에 이은 증폭)로부터 수득된 올리고뉴클레오타이드의 풀은, 표적 분자(들)에 강력하게 그리고 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드의 세트(즉, 핵산 앱타머)가 농축될 때까지, 다음 라운드의 SELEX에 대한 투입물로서 사용된다. 랜덤 라이브러리의 제조 및 친화성-기반 분할로 만든 앱타머에 있어서 최근의 기술적 진전은 항체에 대해 동등한 친화성을 갖는다.
이러한 기술은 무기 성분, 작은 유기 분자(Ellington, et al., 1990, Nature 346, 818-822, doi:10.1038/346818a0), 뉴클레오타이드(Sassanfar 1993, Nature 5;364(6437):550-3), 보조인자(cofactor)(Lorsch 1994, Biochemistry, 33(4):973-82), 핵산(Boiziau, et al., 1999, J Biol Chem. 30;274(18):12730-7), 아미노산(Majerfeld et al., 2005 J Mol Evol. 61(2):226-35), 탄수화물(Jeong et al., 2001, Biochem Biophys Res Commun. 16;281(1):237-43), 항생제(Wang 1996, Biochemistry, 35(38):12338-46.), 펩타이드(Ylera et al., 2002, Biochem Biophys Res Commun. 290(5):1583-8), 단백질(Tuerk, 1990 상기와 같음), 및 심지어 세포와 같은 복잡한 구조(Shangguan et al., 2006 Proc Natl Acad Sci USA. 103(32):11838-43)에 대한 DNA 또는 RNA 앱타머를 선택하는데 적용되어 왔다.
항체에 대한 앱타머의 장점은 시험관내 합성의 용이성, 유연한 변형, 광범위한 표적 범위, 재사용능, 및 고온/화학 안정성이다. 비-면역원성 및 해독제의 이용가능성이 치료 약물로서의 앱타머의 가치를 더한다.
일반적으로, 생물학적 정량(bioassay)은 검출 시 높은 민감도 및 특이도를 달성하기 위해 리간드의 쌍을 필요로 한다. 또한, 링크된 리간드 쌍은 리간드의 친화성 및 특이성을 향상시키는 새로운 리간드일 수 있다. 이와 관련하여, 항체는 지금까지는 앱타머보다 훨씬 뛰어나다. 항체의 쌍은 생성 전에 이들의 미리-설계된 항원 결합 부위로 인하여 상당히 용이하게 수득된다. 대조적으로, 전통적인 SELEX 방식의 근본적인 한계로 인하여 하나의 표적에 대한 상이한 결합 부위들을 갖는 앱타머들의 세트를 수득하는 것은 어렵다. 앱타머들은 결합 부위(들)에 대한 사전 지식없이 랜덤화된 라이브러리(randomized library)로부터 농축되었으므로, 현재 이용가능한 방법론을 사용하여 풀(pool) 내의 각각의 앱타머에 대한 결합 부위를 할당하는 것이 불가능하다.
종래의 앱타머 선택 방식에서, 앱타머-농축된 풀로부터 앱타머 쌍 선택은 개개의 앱타머의 확인 후의 후-선택 단계(post-selection step)로서 간주된다. 지금까지, 앱타머 쌍 선택을 위한 3개의 플랫폼만이 성공적이었다. 이들 모두는 "무차별 대입 기법("brute-force)" 전략을 기반으로 한다. 즉, (1) 단일의 앱타머를 선택하고 이의 결합 부위를 차단한 후, 다시 선택과정을 시작하여 다른 단일 앱타머를 선택하거나(Ochsner, et al., 2014, BioTechniques 56,125-133, doi:10.2144/000114134 and Csordas, et al., 2016, Anal. Chem 88, 10842-10847, doi: 10.1021/acs.analchem.6b03450), (2) 풀 또는 라이브러리에서 개개의 앱타머를 확인하고, 구축된 앱타머 매트릭스와의 동시적 결합을 쌍으로 테스트한다(Cho, M. et al., 2015, Analytical chemistry 87, 821-828, doi:10.1021/ac504076k). 상기 방식들 중 전자의 시도는 시간-소모적이고, 후자의 "숏-건(shot-gun)" 시도는 이의 성공을 위해 테스트되는 앱타머 매트릭스의 크기에 의존해야 하는데, 이는 비용과 관련된다.
전술한 바와 같이 비연계 방식의 시도는 앱타머 쌍을 발견하는데 있어서 엄청나게 높은 경제적 비용 및 낮은 효율을 야기하므로, 앱타머 쌍의 선택을 위한 속도 및 효율에 있어서의 개선이 장기간 지속적으로 요구되고 있다. 본 발명은 RNA 앱타머 쌍의 표적 맞춤형(target-driven) 선택을 위한 매우 효율적인 신규 방법을 제공하며, 여기서 RNA 앱타머는 목적한 동일한 표적에 선택적으로 결합할 수 있는 쌍으로서 동시에 선택된다.
본 발명은 쌍을 이룬 올리고뉴클레오타이드 앱타머를 농축하기 위한 앱타머 쌍 선택 방법, 시약 및 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 앱타머 쌍 선택 방법론은 목적한 표적에 결합한 올리고뉴클레오타이드의 쌍 만이 선택 과정 동안 남아 있게 함으로써 유리-용액 표적(free-solution target)에 대해 무작위 풀로부터 직접 앱타머 쌍을 선택한다. 본 발명을 통해, 앱타머가 쌍으로 동시에 선택될 수 있으며, 고비용, 저효율 및 지루한 작업흐름의 많은 현재의 문제점들을 완화시킨다. 본 발명의 균일한 특성은 멀티플렉스 능력(multiplexability), 확장성(scalability), 강건성(robustness), 및 매 라운드의 선택에서 모니터링의 용이성을 제공한다.
광의적으로, 본 발명은 목적한 표적에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 앱타머의 쌍을 분리하는 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(a) 서열이 무작위로 된 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리를 준비하는 단계,
(b) 목적한 표적에 대한 친화성 기반의 분할(partitioning)에 의해 (a)의 2개의 라이브러리 각각을 독립적으로 스크리닝하여, 상기 표적에 결합하는 올리고뉴클레오타이드들이 농축된, 올리고뉴클레오타이드들의 풀 A (pool A) 및 풀 B (pool B)를 각각 수득하는 단계,
(c) 상기 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들을 상기 표적, 및 커넥터 올리고뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션하여, 2개의 올리고뉴클레오타이드들, 상기 커넥터 및 상기 표적의 4개부 복합체(four part complex)를 형성하는 단계,
(d) 연결 효소(ligating enzyme)를 (c)의 산물에 가하여 상기 복합체의 올리고뉴클레오타이드들을 연결시켜, 연결된 올리고뉴클레오타이드(ligated oligonucleotide)를 형성시키는 단계, 및
(e) 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 (d)의 연결된 올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜, 2개의 올리고뉴클레오타이드 앱타머들을 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 수득된 올리고뉴클레오타이드 앱타머 쌍의 특이성이 최적화될 때까지 단계 (c)부터 (e)를 반복하여, 올리고뉴클레오타이드 쌍들을 하나 이상의 추가의 농축 주기(cycle of enrichment)에 적용시키는 단계를 더 포함하며, 여기서 (a), (b), (c) 및 (d)의 올리고뉴클레오타이드들은 RNA, DNA, 표 1에 나열된 변형된 뉴클레오타이드를 가진 DNA, 및/또는 표 1에 나열된 변형된 뉴클레오타이드를 가진 RNA이다.
또한, 상기 2개의 라이브러리 내의 상기 서열이 무작위로 된 올리고뉴클레오타이드들은 크기가 약 60개 내지 약 200개 뉴클레오타이드의 범위이며 내부 무작위 영역을 포함하고, 각각의 무작위 영역은 상기 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들의 각각의 5'-말단 및 3'-말단 상에 독립적으로 선택된 올리고뉴클레오타이드 태그들을 포함하는 프라이머 영역들에 의해 플랭킹되어 있다.
하나의 양상에서, 상기 친화성 기반의 분할은 지수적 농축에 의한 리간드의 시스템적 진화(SELEX), 또는 SELEX의 어떠한 변형이다. 일반적으로, 상기 표적은 펩타이드, 단백질, 핵산, 세포, 살아있는 조직의 성분, 유기 분자, 및 무기 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
보다 구체적인 구체예에서, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오타이드들로부터 출발하고, 목적한 표적에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 앱타머의 쌍을 분리하는 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(a) 크기가 약 60개 내지 약 200개 뉴클레오타이드의 범위인 무작위로 된 RNA 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리를 준비하는 단계,
(b) 목적한 표적에 대한 친화성 기반의 분할에 의해 (a)의 2개의 라이브러리 각각을 독립적으로 스크리닝하여, 상기 표적에 결합하는 RNA 올리고뉴클레오타이드들이 농축된, RNA 올리고뉴클레오타이드들의 풀 A 및 풀 B를 각각 수득하는 단계,
(c) 상기 풀 A 및 풀 B의 RNA 올리고뉴클레오타이드들을, 상기 표적, 및 2개의 올리고뉴클레오타이드들을 약 40개 내지 약 120개 뉴클레오타이드 크기 범위로 근접하게 유지하는 커넥터 올리고뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션하여, 2개의 올리고뉴클레오타이드들, 상기 커넥터 및 상기 표적의 4개부 복합체를 형성시키는 단계,
(d) 리가아제 효소(ligase enzyme)를 (c)의 인큐베이션된 복합체에 가하여, 상기 표적에 결합된 풀 A로부터의 RNA 올리고뉴클레오타이드와 풀 B로부터의 RNA 올리고뉴클레오타이드 사이에 공유결합성 연결을 형성시키는 단계,
(e) 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 (d)의 연결된 RNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜 2개의 RNA 앱타머들을 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계,
(f) 풀 A의 RNA 앱타머(앱타머 A)를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드와 풀 B의 RNA 앱타머(앱타머 B)를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 분리하기 위해 선택된 프라이머들로 (e)의 DNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭시키는 단계,
(g) (f)의 DNA 올리고뉴클레오타이드들을 시험관내 전사에 적용시켜 RNA 올리고뉴클레오타이드 앱타머 쌍을 생성하는 단계를 포함하되,
각각의 개별 라이브러리의 올리고뉴클레오타이드들은 내부 무작위 영역을 포함하고, 각각의 무작위 영역은 상기 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들의 각각의 5'-말단 및 3'-말단 상에 독립적으로 선택된 올리고뉴클레오타이드 태그들을 포함하는 프라이머 영역들에 의해 플랭킹되어 있다.
추가의 양상에서, 상기 프라이머들은 길이가 적어도 15개 뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 길이가 약 20개 뉴클레오타이드이다.
상기 방법은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해, 연결된 RNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜 2개의 RNA 앱타머들을 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 것을 더 포함한다.
추가의 양상에서, RNA 올리고뉴클레오타이드 앱타머를 생성하기 위한 시험관내 전사의 단계는 RNA 앱타머들을 인코딩하는 2개의 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드들의 5'-말단에 적합한 프로모터를 도입한 후 선택적으로 수행된다. 예를 들어, 상기 프로모터는 T7 프로모터일 수 있다.
추가의 양상에서, 상기 방법은 단계 (c) 이후에, 프라이머들을 포함하는 혼성화된 2개의 올리고뉴클레오타이드들인 어댑터들 또는 프라이머 듀플렉스들을 추가하여, 풀 내의 고정된 올리고뉴클레오타이드들을 연장시키는 것을 더 포함한다.
추가의 양상에서, 상기 방법은 단계 (f) 이후에, 알칼리성 조건 하에서 풀 B의 일부를 가수분해하는 것을 더 포함한다.
보다 구체적인 구체예에서, 본 발명은 목적한 표적에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 앱타머의 쌍을 분리하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은,
(a) 크기가 약 60개 내지 약 200개 뉴클레오타이드의 범위인 무작위로 된 RNA 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리를 준비하는 단계,
(b) 목적한 표적에 대한 친화성 기반의 분할에 의해 (a)의 2개의 라이브러리 각각을 독립적으로 스크리닝하여, 상기 표적에 결합하는 RNA 올리고뉴클레오타이드들이 농축된, RNA 올리고뉴클레오타이드들의 풀 A 및 풀 B를 각각 수득하는 단계,
(c) 상기 풀 A 및 풀 B의 RNA 올리고뉴클레오타이드들을, 상기 표적, 및 2개의 올리고뉴클레오타이드들을 약 40개 내지 약 120개 뉴클레오타이드 크기 범위로 근접하게 유지하는 커넥터 올리고뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션하여, 2개의 올리고뉴클레오타이드들, 상기 커넥터 및 상기 표적의 4개부 복합체를 형성시키는 단계,
(d) 프라이머들을 포함하는 혼성화된 2개의 올리고뉴클레오타이드들인 어댑터들 또는 프라이머 듀플렉스들을 추가하여, 풀 내의 고정된 올리고뉴클레오타이드들을 연장시키는 단계,
(e) 리가아제 효소(ligase enzyme)를 (d)의 인큐베이션된 복합체에 가하여, 상기 표적에 결합된 풀 A로부터의 올리고뉴클레오타이드와 풀 B로부터의 올리고뉴클레오타이드 사이, 그리고 각각의 풀로부터의 올리고뉴클레오타이드와 어댑터 사이에 공유결합성 연결을 형성시키는 단계,
(f) 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 (e)의 연결된 올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜 2개의 RNA 앱타머들을 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계,
(g) 풀 A의 RNA 앱타머(앱타머 A)를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드와 풀 B의 RNA 앱타머(앱타머 B)를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 분리하기 위해 선택된 프라이머들로 (f)의 DNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜 RNA 앱타머들을 인코딩하는 2개의 이중-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드들을 생성하는 단계,
(h) 알칼리성 조건 하에서 풀 B의 일부를 가수분해하는 단계, 및
(i) 단계 (g) 및 (h)의 생성물을 시험관내 전사에 적용시켜 RNA 올리고뉴클레오타이드 앱타머가 농축된 풀을 생성하는 단계를 포함하되,
각각의 개별 라이브러리의 올리고뉴클레오타이드들은 내부 무작위 영역을 포함하고, 각각의 무작위 영역은 상기 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들의 각각의 5'-말단 및 3'-말단 상의 올리고뉴클레오타이드 태그, 및 4개 내지 6개의 고정된 뉴클레오타이드들의 올리고뉴클레오타이드 태그를 포함하는 적어도 하나의 프라이머 영역에 의해 플랭킹되어 있다.
도 1은 도 1에 기술된 방법을 사용한 제1 라운드의 앱타머 쌍 선택에서 표적-의존적인 RNA 앱타머 쌍의 풀 농축(pool enrichment)을 나타낸다. 도 1a는 플라스미노겐을 사용한 결과를 나타낸다. 도 1b는 사람 상보체 7을 사용한 결과를 나타낸다.
도 2는 1μL의 샘플 내의 사람 혈청 단백질 nM을 사용한 표적-의존적인 RNA 앱타머 쌍의 풀 농축을 나타낸다.
도 3은 혼합된 앱타머 풀(풀 A 및 풀 B, 1:1 몰비)의 해리 상수(KD)를 나타내는 그래프로서, 제0 라운드 및 제3 라운드의 앱타머 쌍 풀의 해리 상수를 비교하고 있다.
도 4는 리간드로서 앱타머 쌍 풀을 사용한 근접 연결 어세이(PLA)의 민감도를 나타내는 그래프이다. 1μL의 샘플 내의 사람 혈청 단백질 nM을 사용한 결과로서, 제0 라운드, 제2 라운드 및 제3 라운드의 앱타머 쌍 풀을 비교하고 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 바람직한 구체예가 기술될 것이지만, 본 발명이 이러한 구체예로 한정되지는 않는다. 변화 및 변형이 이루어질 수 있고, 당해 분야의 통상의 기술자라면 이러한 변화 및 변형을 할 수 있다.
광의로, 본 발명은 목적한 동일한 표적에 선택적으로 결합할 수 있는 앱타머의 쌍들로서 동시 선택되는 RNA 앱타머 쌍들의 표적 맞춤형 선택을 제공한다. 표적은 어떠한 생체물질, 생체분자 및/또는 앱타머에 대한 선택적인 결합에 대해 민감한 다른 조성물 또는 물질일 수 있으며, 제한없이, 펩타이드, 단백질, DNA 또는 RNA 분자, 세포, 살아있는 조직의 성분, 유기 분자, 및/또는 무기 분자, 독소, 바이러스, 세균을 포함한다.
본 발명의 공정은 무작위로 된 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리를 생성함으로써 출발한다.
상기 올리고뉴클레오타이드들은 약 60 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 범위의 크기일 수 있고, 20 내지 100개의 뉴클레오타이드 크기 범위인 무작위로 된 RNA를 포함할 수 있다. 무작위로 된 RNA 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리는 친화성 기반의 분할에 의해 사전-스크리닝되는데, 2개의 라이브러리는 각각의 5'-말단 및 3'-말단에서 상이한 RNA 서열에 의해 플랭킹된다. 이는 SELEX 방법을 적용하여 달성될 수 있고, 또는 상기 라이브러리는 목적한 표적에 대한 다른 공지된 친화성 기반의 방법에 의해 사전-스크리닝될 수 있다. 앱타머를 스크리닝하는 방법은 예를 들면, WO 2000/056930 A1호에 기술되어 있다.
본 발명의 경우, 예컨대 무작위로 된 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리로 출발하여, 수개 라운드(예컨대, 제1 라운드 내지 제6 라운드)를 통한 SELEX 만을 수행함으로써, 목적한 표적에 선택적으로 결합할 수 있는 분자가 농축된 올리고뉴클레오타이드 분자들의 풀(풀 A 및 풀 B)를 생성한다.
2개의 프라이머에 의해 플랭킹된 무작위 라이브러리로부터 RNA 앱타머 쌍 선택의 개략도(반응식 1)
반응식 1은 쌍을 이룬 RNA 올리고뉴클레오타이드 앱타머 후보들이 표적의 존재 하에서 모집된 후 다음 라운드의 선택을 위한 풀로서 준비되는 과정을 나타낸다. 복합체 내에서 표적 및 뉴클레오타이드 커넥터와 협동하여 결합된 올리고뉴클레오타이드들은 증폭(예컨대, RT-PCR)을 위해 우선적으로 "표지"될 것이다. 표적 분자는 풀 A에서 기원한 앱타머 및 풀 B로부터 출발한 이의 쌍이 되는 앱타머를 모집한다.
라이브러리 A 및 B로부터 농축된 풀들로부터의 올리고뉴클레오타이드들을 목적한 표적과 함께 커넥터 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 인큐베이션한다. 커넥터 올리고뉴클레오타이드는 풀 A의 올리고뉴클레오타이드들의 3'-말단 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들의 5'-말단에 대해 상보성이므로, 풀 A 및 풀 B로부터의 RNA 올리고뉴클레오타이드들은 목적한 표적과 혼합될 때 120개 염기쌍까지 근접하여 유지될 수 있다. 커넥터 올리고뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 50개의 뉴클레오타이드의 크기 범위의 올리고뉴클레오타이드이거나, 또는 보다 특별하게는 약 18개 내지 약 22개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
2개의 프라이머에 의해 플랭킹된 무작위 라이브러리로부터 RNA 앱타머 쌍 선택의 개략도
패널 1은 RNA 앱타머 쌍 선택을 위한 투입 RNA의 제조를 나타내고;
패널 2는 후보 RNA 올리고뉴클레오타이드들이 앱타머인 경우 표적 의존성 결합(joining) 및 이어지는 RT-PCR에 의한 증폭을 나타내며;
패널 3은 선택적인 증폭, 시험관내 전사, 탈포스포릴화 및 앱타머 폴딩의 유도에 의해, 2개의 RNA 앱타머들을 인코딩하는 연결 증폭물로부터의 풀 A 및 풀 B의 유리(liberation)를 나타낸다.
[반응식 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
일단 올리고뉴클레오타이드가 목적한 표적에 특이적으로 결합할 것으로 나타나면, 용어 "앱타머"가 적용된다. 풀 A 및 풀 B로부터 기원한 올리고뉴클레오타이드들은 표적-앱타머 쌍 복합체를 이루기 위해 3개 분자 상호작용(풀 A로부터의 앱타머, 풀 B로부터의 앱타머 및 표적)을 형성한다. 상기 표적-앱타머 쌍 복합체는 올리고뉴클레오타이드들의 사전-설계된 올리고머성 테일(tail)을 통해, 짧은 올리고뉴클레오타이드 커넥터에 대해, 모집된 앱타머 쌍의 혼성화 에너지를 크게 향상시킨다. 특히, 풀 A의 RNA 올리고뉴클레오타이드 상의 3' 태그 및 풀 B의 RNA 올리고뉴클레오타이드 상의 5'-태그는 커넥터 올리고뉴클레오타이드에 혼성화될 영역이다. 풀 A의 RNA 올리고뉴클레오타이드 상의 5' 태그 및 풀 B의 RNA 올리고뉴클레오타이드 상의 3' 태그는, 풀 A 및 풀 B로부터 각각 선택된 올리고뉴클레오타이드들이 연결(ligation)에 의해 결합(joining)된 후, 선택적인 증폭을 위해 프라이머들이 결합하는 영역이다.
리간드의 쌍을 얻는 장점은, 표적화된 2개의 상이한 리간드를 표적 모이어티(moiety)의 상이한 결합 부위(예컨대, 에피토프)에 적용시킴으로써, 훨씬 더 큰 수준의 민감성 및 선택성이 어세이 또는 임상 적용에서 달성될 수 있다는 것이다. 이는 협동적 안정화, 또는 "근접성 효과"의 결과이다. 근접성 효과는 표적 결합으로 인하여 커넥터 근처의 앱타머들의 쌍의 상승된 농도를 가져온다. 이러한 근접성은 짧은 올리고뉴클레오타이드 커넥터에 근접한 2개의 앱타머들 쌍의 혼성화 에너지를 향상시킨다.
커넥터 올리고뉴클레오타이드와 복합체화(complexed)되는 경우, 4개-분자 복합체(올리고뉴클레오타이드 커넥터에 혼성화된 표적-앱타머 쌍 복합체)가 생성된다. 이후에 4개-분자 복합체는 예컨대, RNA 또는 DNA 리가아제와 같은 리가아제 효소를 첨가함으로써 연결 반응을 일으켜, 쌍을 이룬 앱타머들 사이에 공유결합성 연결을 형성하여 증폭을 위해 이들을 "표지(marking)"한다. 모집된 앱타머들의 쌍을 인코딩하면서 연결된 생성물은 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들을 특이적으로 인식하는 프라이머들의 쌍을 사용하여, 예컨대, RT-PCR에 의해 우선적으로 증폭시킨다. 이러한 선택 과정은 표적-앱타머 쌍 복합체가 정량적으로 비례하는 양으로, 연결된 앱타머들로 전환되는 결과를 가져온다.
상기 단계들 모두는 유리 용액(free solution) 내에서 진행하여, 증폭 전에 풀의 물리적 분할(즉, 세척)이 불필요하도록 하게 한다. 선택 과정은 후속하는 효소 반응을 사용하여, 연결된 생성물 풀로부터 2개의 앱타머 풀을 동원함으로써 다수의 라운드 동안 반복, 즉 되풀이된다. 이러한 효소 반응은 DNA 집단을 변화시키는 주요 선택 압력으로서 역할은 하지 않는다.
변형된 뉴클레오타이드의 시험관 내 RNA 또는 DNA 선택으로의 도입은 뉴클레아제 분해에 대한 선택된 핵산의 증가된 안정성, 증진된 친화성, 연장된 화학 기능성, 및 증가된 라이브러리 다양성과 같은 많은 잠재적인 장점을 부여한다. 새로운 염기쌍 형성에 의한 변형의 도입은, 변형되지 않은 뉴클레오타이드 염기쌍 형성에 의해 제한되지 않는, 추가의 화학적 및 기능적 특성을 잠재적으로 제공할 수 있다. 또한 변형된 뉴클레오타이드 풀은 선택된 앱타머의 전체적인 결합 친화성을 잠재적으로 증가시킬 수 있다. 앱타머-표적 결합은 일반적으로 극성의 수소 결합, 및 전하-전하 상호작용에 의해 매개된다. 대조적으로, 단백질-단백질 상호작용에 기여하는 소수성 접촉은 제한된다. 따라서, 아미노산 측쇄를 모사하는 기능성 그룹의 첨가는 화학적 다양성을 확장시키고 앱타머의 결합 친화성을 향상시킬 수 있다.
리보오스 2'-OH의 변형은 RNA의 안정성을 증가시키는 하나의 선택적인 시도이다. 2'-플루오로(2'-F), DNA(2'-H), 2'-O-메틸(2'-OMe)과 같은 작은 전기음성 2' 치환들은 허용성이 좋고, 일반적으로 RNA 뉴클레아제 내성을 향상시키면서 RNA 열안정성 및 구조에 현저히 영향을 미치지 않으므로 가장 광범위하게 사용된다. 불소 치환(2'-F)은 dsRNA 듀플렉스(duplex)를 약간 안정화시키며(변형당 T m의 ~1℃ 상승), 허용성이 가장 좋은 변형 유형이다. 2'-F 외에, 2'-OMe 변형은 또한 RNA 구조 내에서 허용성이 좋고 리보핵산에 대한 뉴클레아제 내성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 사용되는 2' 치환들은 리보핵산, 포스포티오에이트, 포스포디티오에이트; EA, 2'-아미노에틸, 데옥시리보핵산, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸, 2'-데옥시-2'-플루오로-β-D-아라비노핵산, 4'-C-하이드록시메틸-DNA, 잠금(locked) 핵산, 2',4'-카보사이클릭-LNA-잠금된 핵산, 옥세탄-LNA, 잠금되지 않은(unlocked) 핵산, 4'-티오리보핵산, 2'-데옥시-2'-플루오로-4'-티오리보핵산, 2'-O-Me-4'-티오리보핵산, 2'-플루오로-4'-티오아라비노핵산, 알트리톨 핵산, 헥시톨 핵산을 포함한다.
본 발명에서 고려되는 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형(phosphorothioate internucleotide linkage modification), 당 변형, 핵산 염기 변형 및/또는 포스페이트 골격 변형을 선택적으로 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 하기의 문헌(이의 내용은 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 것들과 같은, 천연의 포스포로디에스테르 골격 또는 포스포로티오에이트 골격 또는 선택적으로 LNA(잠금 핵산), PNA(펩타이드 골격을 지닌 핵산), CpG 올리고머 등을 포함하는 다른 변형된 골격 유사체를 포함할 수 있다(Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, May 6-8, 2002, Las Vegas, NV and Oligonucleotide & Peptide Technologies, 18th & 19th November 2003, Hamburg, Germany).
또한 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 1에 나열된 것들을 포함하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 적합한 것으로 공지된 뉴클레오타이드 유사체 및 유도체도 선택적으로 포함할 수 있다.
선택적인 치환을 위한 대표적인 뉴클레오타이드 유사체 및 유도체
N-((9-베타-D-리보푸란노실퓨린-6-일)-카바모일)트레오닌 N6-이소펜테닐아데노신 우리딘-5-옥시아세트산
2'-O-메틸-5-메틸우리딘 1-메틸 아데노신 8-옥소아데노신
2'-O-메틸우리딘 1-메틸 구아노신 이소구아노신
위부톡신(Wybutoxine) 1-메틸 이노신 2-아미노아데노신
3-(3-아미노-3-카르복시-프로필)우리딘 2,2-디메틸구아노신 2-아미노-6-클로로퓨린리보시드
잠금(Locked)-시티딘 2-메틸구아노신 8-아자아데노신
잠금-티민 2-메틸아데노신 6-클로로퓨린리보시드
잠금-메틸시티딘 3-메틸시티딘 5-요오도시티딘
4-아세틸시티딘 5-메틸시티딘 5-요오도우리딘
5-(카르복시히드록시메틸)우리딘 N6-메틸아데노신 5-메틸시티딘
2'-O-메틸슈도우리딘 7-메틸구아노신 5-메틸우리딘
D-갈락토실케오신 5-메틸아미노메틸우리딘 4-티오우리딘
2'-O-메틸구아노신 잠금-아데노신 O6-메틸구아노신
이노신 잠금-구아노신 2-티오우리딘
5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘 잠금-우리딘 5,6-디히드로우리딘
베타-D-만노일케오신 위부톡시신(Wybutoxisine) 2-티오시티딘
5-메톡시우리딘 슈도우리딘 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘
2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신 케오신 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘
N-((9-베타_D-리보푸란노실퓨린-6-일)N-메틸카바모일)트레오닌 2-티오시티딘
우리딘-5-옥시아세트산-메틸에스테르 5-메틸-2-티오우리딘
본 발명에서 고려되는 올리고뉴클레오타이드의 변형은 예를 들면, 소망하는 중합체에 대한 올리고뉴클레오타이드의 공유결합성 연결을 허용하는 기능성 그룹 또는 기능성 모이어티(moieties)를 지닌 선택된 뉴클레오타이드의 추가 또는 이의 치환, 및/또는 올리고뉴클레오타이드에 추가의 전하, 분극성(polarizability), 수소 결합, 정전기적 상호작용, 및 기능성을 도입하는 기능성 모이어티의 추가 또는 치환을 포함한다. 이러한 변형은 2'-위치 당 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 엑소사이클릭(exocyclic) 아민에서 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모우라실 또는 5-요오도우라실의 치환, 골격 변형, 메틸화, 이소염기인 이소시티딘 및 이소구아닌과 같은 염기쌍 조합, 및 유사한 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 범위에서 고려되는 올리고뉴클레오타이드는 또한 3' 및/또는 5' 캡 구조(cap structure)를 포함할 수 있다. 하기 문헌에 기술된 뉴클레오사이드 유사체의 예를 참고한다(Freier & Altmann, 1997, Nvcl. Acid Res.; 25, 4429-4443 and Uhlmann, 2000, Curr. Opinion in Drag Development, 3(2), 293-213).
어떠한 이론에 구애되지 않고, 본 발명은 다음의 몇가지 장점을 포함한다:
- 본 발명의 RNA 앱타머 쌍 선택은 앱타머 쌍을 찾기 위해 특성화된 앱타머 풀을 필요로 하지 않는다. 2개의 구별되는 표적 결합 부위를 갖는 앱타머들이 2개의 풀에서 입수될 수 있는 한, 본 발명의 RNA 앱타머 쌍 선택은 하나의 풀에서 앱타머를 수득하고 다른 풀에서 이와 쌍을 이룬 앱타머를 수득한다. 이는 앱타머들의 특성을 물려받은 앱타머 쌍의 균일한 선택을 허용한다.
- 선택 과정은 표적의 존재/부재시 생산된 연결 증폭산물의 양을 통해, 즉, 연속적이고 정량적인 평가를 통해 각각의 라운드에서 용이하게 모니터링된다(참고: 도 1, 도 2 및 도 4).
- 정제되지 않고 서열분석되지 않은 앱타머들의 풀은 최종 RNA 앱타머 쌍 선택 라운드 직후, 근접성 연결 어세이(proximity ligation assay)(도 4 참조)와 같은 샌드위치 어세이에 즉시 사용할 수 있다. 이는 폴리클로날 항체(보다 큰 배치별 변화(batch-to-batch)를 갖더라도)의 쌍과 유사한, 저렴한 대안을 제공한다.
- 본 발명의 RNA 앱타머 쌍 선택은 다수의 후-선택 단계들을 불필요하게 한다(예컨대, 2차원 앱타머 매트릭스에 의해 쌍으로 조합하는 스크리닝). 앱타머 쌍을 스크리닝하기 위한 쌍 매칭(pairwise matching)은 연결된 생성물(ligated product)을 서열분석함으로써 단순히 수행된다. 선택은 단지 몇 라운드의 RNA 앱타머 쌍 선택 후에 완료되면 된다. 본 발명의 기술은 근접성 효과, 즉, 표적의 존재 하에서 2개의 풀의 앱타머들의 엔트로피 안정화된, 협동적 진화(cooperative evolution)를 기반으로 한다. Zhang 등 (Angewandte Chemie (2013) doi:10.1002/anie.201210022)은 표적의 존재 하에 근접성 어세이에서의 DNA 조립이 2개 프로브의 국재적 농도를 ~4× 105 배 증가시킨다고 기술하였다. 이러한 수치로 출발하여, 1012 개의 무작위 서열들 내에 수백 개의 앱타머가 존재한다고 가정하는 경우, 무작위 서열들에 대한 앱타머 쌍들의 몰 비는 단지 2개 라운드의 RNA 앱타머 쌍 선택 후 1:1이 될 수 있다. 다른 연구(Liu et al., Journal of the American Chemical Society (2014) doi:10.1021/ja412934t)에서는, 결합 친화성이 Kd = 0.2 nM 내지 3.2 μM의 범위인 5개의 앱타머가 67,858개의 가능한 조합 중에 존재할 수 있다고 추정하였다. 풍부성에 대한 이러한 추정으로부터 출발하여, 앱타머 쌍을 찾기 위한 RNA 앱타머 쌍 선택 라운드의 필요한 수는 최대 3이다.
하나의 프라이머에 의해 플랭킹된 무작위 라이브러리로부터 RNA 앱타머 쌍 선택의 개략도(반응식 2)
반응식 2에 나타낸 앱타머 쌍 선택 개략도는 선택 동안 고정된 서열의 참여를 최소화하므로, 선택된 앱타머는 길이가 짧고 변형시 더 유연성을 갖는다. 표준 SELEX 공정을 통해 확인된 앱타머는 일반적으로 60 내지 120개의 뉴클레오타이드를 포함하는데, 이는 30 내지 70개의 뉴클레오타이드 길이의 무작위 영역(randomized regions)과, 각 측단(each side)에 있는 ∼15 내지 25개의 뉴클레오타이드의 고정된 프라이머 부위로 이루어진다. 그러나 트렁케이션(truncation) SELEX는 30 내지 40개의 무작위로 된 뉴클레오타이드 서열의 각 측단에 약 4 내지 6개의 고정된 뉴클레오타이드를 필요로 하여, 후-선택 단계들(post-selection steps)를 단순화시킨다. 본 발명의 앱타머 쌍 선택 플랫폼에 적용된 이러한 트렁케이션 SELEX 기술은 WO 2000/056930 A1호에 기술되어 있다. 본 발명의 RNA 라이브러리는 라이브러리 A의 5'-말단(1b) 및 라이브러리 B의 3'-말단(4b) 상에 6개 뉴클레오타이드 길이의 고정된 서열로 플랭킹된다. 이것만으로는 성공적인 증폭을 위한 프라이머로 제공되기에 충분히 길지 않다. 선택 후, 이들은 사전-어닐링된 이중 가닥 어댑터(1a-1a'-1b' 및 4a-4a'-4b') 내의 브리지(bridging) 올리고뉴클레오타이드를 위한 혼성화 부위로서 기능한다. 연결 후, 풀 A의 연결부(1a+1b)는 정방향 프라이머 부위일 뿐만 아니라 이의 3' 말단에 T7 프모로터도 포함한다. 풀 B의 연결부(4a+4b)는 PCR용 역방향 프라이머 부위이다. 4a'에서의 우리딘(U)은, 풀 B가 시험관내 전사에 적용되어 이에 상응하는 RNA 풀을 생성하기 전에, 알칼리성 조건 하의 프라이머 제거를 허용한다.
하나의 프라이머에 의해 플랭킹된 무작위 라이브러리로부터 RNA 앱타머 쌍 선택의 개략도(반응식 2):
- 패널 1은 RNA 앱타머 선택을 위한 투입 RNA의 제조를 나타낸다.
- 패널 2는 RNA가 앱타머인 경우 표적 의존성 앱타머 결합을 나타낸다.
- 패널 3은 선택적인 증폭 및 풀 B의 알칼리성 가수분해에 의해 2개의 RNA 앱타머들을 인코딩하는 연결물로부터의 풀 A 및 풀 B의 유리(liberation)를 나타낸다.
- 패널 4는 RNA 앱타머를 인코딩하는 DNA 풀로부터 RNA 풀의 제조를 나타낸다.
[반응식 2]
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예
본 발명의 선택된 구체예는 다음의 실험 및 비교 실시예를 참고로 보다 상세히 기술될 것이다. 이들 실시예는 단지 예시 목적이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: SELEX에 사용될 무작위 RNA 라이브러리의 제조
5'-말단 및 3'-말단 모두에서 상이한 태그들에 의해 플랭킹되고 무작위로 된 서열들을 갖는 2개의 단일 가닥 DNA 라이브러리(즉, 라이브러리 A 및 라이브러리 B)를 이중 가닥 DNA 라이브러리로 전환시키고, 3개 라운드의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭시켰다. 증폭된 이중 가닥 DNA 라이브러리를 4개의 상이한 종류의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(즉, dATP, dGTP, 2'-플루오로-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트)의 혼합물 내에서 시험관내 전사에 적용시켜 상응하는 RNA 라이브러리를 생성하였다. 그런 다음, 각각의 라이브러리 내의 RNA에 대해 5'-RNA 폴리포스파타제를 사용하여 RNA의 5'-말단에서 탈포스포릴화하였다. 94℃에서 5분 동안 가열한 후 22℃로 냉각시켜 이들 탈포스포릴화된 RNA 풀로부터 다음 라운드 선택을 위한 투입 풀을 제조하였다.
실시예 2: 3개의 사람 혈청 단백질을 사용한 RNA 앱타머 쌍 선택의 확인
표적 마다, 5'-말단 및 3'-말단 모두에서 상이한 태그들에 의해 플랭킹되는 2개의 무작위 라이브러리를 SELEX에 적용시켜 앱타머 풀을 농축시켰다(도 1). 사람 플라스미노겐 또는 상보체 7을 사용한 제5 라운드의 SELEX 후에, 제1 라운드의 RNA 앱타머 선택에서, 농축된 앱타머 풀의 쌍(즉, 풀 A 및 풀 B)을 상이한 양의 표적과 함께 인큐베이션하였다. 후속되는 연결(ligation) 및 증폭에 있어서, 연결된 생성물에 의해 RNA 앱타머의 쌍이 물리적으로 링크되었는지를 겔 전기영동으로 확인할 수 있다.
도 1에서, 전기영동도(電氣泳動圖)(전기영동 분리 결과들의 플롯팅)의 피크 영역은 풀 A 및 풀 B로부터의 2개의 RNA 올리고뉴클레오타이드들이 공유결합으로 서로 연결되고, 이후 역전사되어 증폭된 DNA 올리고뉴클레오타이드의 양을 나타낸다. 따라서 피크 영역에서 표적-의존적 증가는 표적 단백질이 제1 RNA 앱타머 쌍 선택 동안에 근방에서 더 많은 RNA 올리고뉴클레오타이드들을 모집하는 것을 나타낸다. 근접성 연결 어세이에서 표적 단백질에 의한 프로브(probe)의 근접성 효과를 고려할 때, 전술한 바와 같은 모집(recruitment)은 RNA 올리고뉴클레오타이드들이 앱타머들의 쌍인 경우 훨씬 용이하게 수행되는 것을 이론적으로 설명한다. (패널 A) 사람 플라스미노겐에 의한 RNA 앱타머 쌍 농축(aptamer pair enrichment) 및 (패널 B) 사람 상보체 7에 의한 RNA 앱타머 쌍 농축이 나타나 있다.
다른 혈청 단백질을 사용한 앱타머 농축은, 무작위 라이브러리로부터의 RNA 앱타머 쌍 선택의 개략도에 나타난 트렁케이션 SELEX를 이용하여 수행되었다. 2개 라운드의 앱타머 농축 후, 풀 A 및 풀 B를 앱타머 쌍 선택에 적용시켰다. 도 4는 풀의 쌍이 표적 단백질에 대해 반응하는 방식을 보여주는데, RNA 결합(joining)의 결과로서 2개의 RNA 올리고뉴클레오타이드들을 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드의 양으로 나타낼 수 있다. 사람 혈청 단백질은 RNA 결합을 향상시키고, 이로써 25nM 단백질을 사용한 경우 연결되어 증폭된 이중 가닥 DNA의 양을 1.8 배까지 증가시켰다. 50nM 단백질을 사용한 경우 연결된 증폭물의 양이 감소된 것은 표적 단백질의 과도한 양이 표적-맞춤형 앱타머 결합에 부정적으로 영향을 미침을 나타낸다.
도 3은 1:1 몰 비로 혼합된 풀 A 및 풀 B의 해리 상수(KD)를 나타낸다. 도시된 2개의 혼합된 풀은 (1) 어떠한 앱타머 쌍 선택에도 적용시키지 않은 것과, (2) 제3 라운드의 앱타머 쌍 선택에 의해 농축된 것이다. 2개의 혼합된 풀 사이에서 구분되지 않는 KD 값은, 쌍을 이루는 앱타머가 앱타머 쌍 선택의 라운드 동안 풀 A 및 풀 B 각각에서 유지되는 것을 나타낸다.
도 4는 프로브로서 3개의 상이한 앱타머 쌍 풀인, (1) 앱타머 쌍 선택에 적용되지 않은 풀 A 및 풀 B, (2) 제2 라운드의 앱타머 쌍 선택에 의해 농축된 풀 A 및 풀 B, 및 (3) 제3 라운드의 앱타머 쌍 선택에 의해 농축된 풀 A 및 풀 B를 사용하여 수행한 PLA의 민감도를 나타낸다. 앱타머 쌍 선택에 적용되지 않은 앱타머 풀은 사람 혈청 단백질에 전혀 반응하지 않았다. 제3 라운드의 앱타머 쌍 선택에 의해 농축된 앱타머 풀은, 제2 라운드의 앱타머 쌍 선택에 의해 농축된 앱타머 풀 보다 훨씬 더 민감하게 사람 혈청 단백질에 반응하였다. 이는 쌍을 이룬 앱타머가 선택 라운드가 진행되면서 추가로 농축됨을 나타낸다.
실시예 3: 제공된 표적의 존재 하에서 앱타머 쌍 선택 플랫폼을 최적화하는 본 발명의 용도
각각의 라운드의 선택에서 앱타머 쌍 농축을 모니터링하는 것은 다음 라운드의 선택에 적용되는 선택 압력을 조절할 수 있도록 한다. 예를 들면, 선택 압력은 연결 생성물(ligated product)의 양에 있어서의 실질적인 증가가 관찰될 때까지 선택 라운드에서 일정하게 유지될 수 있다. 그런 다음, 후속되는 선택에서 풀의 쌍을 적은 양의 표적과 같은 훨씬 엄격한 조건(stringent condition)에 노출시켜, 하나의 풀 내의 농축된 앱타머들이 서로 경쟁하도록 함으로써 다른 풀 내의 이들의 쌍을 찾도록 한다. 궁극적으로, 이는 최고의 앱타머 쌍을 얻기 위한 선택 라운드의 회수를 단축시킨다.
또한 본 발명은 앱타머 쌍 선택을 위한 초기 풀의 이해를 향상시킨다. 수개의 상이한 초기 풀(예컨대, 제3, 제5, 및 제7 라운드의 앱타머-농축된 풀)을 일정한 양의 표적 단백질에 동시에 적용시켜 앱타머 쌍을 찾는데 있어서 높은 성공률을 기대할 수 있다. 예를 들면, 단지 제3 라운드의 풀이 앱타머 쌍을 찾는데 있어서 양성의 결과를 나타낸 경우, 음성의 결과(예컨대, 제5 및 제7 라운드의 앱타머-농축된 풀)는 개개의 앱타머에 의해 과경쟁한 앱타머 쌍인 것으로 해석된다. 제7 라운드의 풀 만이 양성의 결과를 나타낸 경우, 앱타머 쌍 선택 라운드를 추가하는 것은 제3 및 제5 라운드 앱타머-농축된 풀 둘 모두에서 긍정적인 결과를 제공할 수 있다. 이러한 유형의 데이타는 초기 풀에서 요구되는 앱타머-농축 주기의 수에 있어서 어떠한 공통성(consensus)을 제공하지 않지만, 상기 데이타는 개개 앱타머-농축 단계에서 허용되는 PCR 주기 최대치를 제안함으로써 PCR 오류와 같은 시스템적 오차를 크게 줄이는데 도움을 준다.
앱타머-농축된 풀은 근접성 연결 어세이(PLA)를 사용하여 초기에 평가되는데, 이는 본 발명의 앱타머 쌍 선택 방식과 호환성이 높다. 본 발명의 기술에서 앱타머 쌍 선택을 위한 플랫폼으로서 사용된 PLA를 개시하고 있는 특허 공보는 다음과 같다. US 7306904 B2호는 PLA에 대한 최초 출원된 특허이다. US 2008/0293051 A1호는 프로브로서 RNA를 사용하는 PLA를 교시한다. 상기 어세이는 RNA가 프로브로서 사용되고, RNA 리가아제가 DNA 리가아제 대신 사용되는 것을 제외하고는 US 7306904 B2호에 개시된 것과 동일하다. 본 발명의 기술에 사용된 고정된 서열의 참여를 최소화하기 위한 트렁케이션 SELEX를 개시하고 있는 공보는 WO 2000/056930 A1호이다. 또한 PLA 어세이는 고도로 민감하고, 일반적으로 낮은 애토몰(attomole) 범위에서 검출 한계(LOD)를 나타낸다.
그리고, 앱타머-농축된 풀의 PLA 역학적 범위에 대한 스크리닝을 수행한다. PLA 반응(qPCR 판독)을 평가하는 동안 단백질 양은 1 amol로부터 1 nmol(10-18 내지 10-9 mol)까지 다수의 차수 크기에 걸쳐 변한다. 상기 어세이의 대략적인 역학적 범위를 결정한 후, 상기 어세이 범위를 추가로 세밀하게 하고 PLA를 이와 같이 협소화된 범위(적어도 10개의 상이한 단백질 농도)에 걸쳐 수행한다. 궁극적으로, LOD, LOQ, 역학적 범위, 및 민감도와 같은 성능 메트릭스(metrics)를 측정한다.
선택된 쌍은 선택 라운드 동안에 협동적으로 진화될 수 있으므로, 연결된 이중 가닥 DNA를 서열분석함으로써 풀로부터의 앱타머 쌍 확인이 이루어질 것으로 기대된다. 연결된 이중 가닥 DNA로부터 얻은 RNA는 폴딩 메카니즘이 앱타머의 공유결합성 연결에 의해 영향받지 않는 경우라면 2개의 RNA 앱타머들로부터 물려받은 친화성 및 특이성을 향상시키는 신규한 리간드일 수 있다.
참고문헌의 포함
다수의 공보들이 상기와 같이 인용되어 있으며, 이들 모두는 이들의 전문이 본원의 명세서에 참고로서 통합된다.

Claims (19)

  1. (a) 서열이 무작위로 된 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리를 준비하는 단계,
    (b) 목적한 표적에 대한 친화성 기반의 분할(partitioning)에 의해 (a)의 2개의 라이브러리 각각을 독립적으로 스크리닝하여, 상기 표적에 결합하는 올리고뉴클레오타이드들이 농축된, 올리고뉴클레오타이드들의 풀 A (pool A) 및 풀 B (pool B)를 각각 수득하는 단계,
    (c) 상기 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들을 상기 표적, 및 커넥터 올리고뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션하여, 2개의 올리고뉴클레오타이드들, 상기 커넥터 및 상기 표적의 4개부 복합체(four part complex)를 형성하는 단계,
    (d) 연결 효소(ligating enzyme)를 (c)의 산물에 가하여 상기 복합체의 올리고뉴클레오타이드들을 연결시켜, 연결된 올리고뉴클레오타이드(ligated oligonucleotide)를 형성시키는 단계, 및
    (e) 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 (d)의 연결된 올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜, 2개의 올리고뉴클레오타이드 앱타머들을 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계를 포함하는, 목적한 표적에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 앱타머의 쌍을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    수득된 올리고뉴클레오타이드 앱타머 쌍의 특이성이 최적화될 때까지 단계 (c)부터 (e)를 반복하여, 올리고뉴클레오타이드 쌍들을 하나 이상의 추가의 농축 주기(cycle of enrichment)에 적용시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (a), (b), (c) 및 (d)의 올리고뉴클레오타이드들은 DNA인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    (a), (b), (c) 및 (d)의 올리고뉴클레오타이드들은 RNA인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (a), (b), (c) 및 (d)의 올리고뉴클레오타이드들은 표 1에 나열된 변형된 뉴클레오타이드를 가진 DNA인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (a), (b), (c) 및 (d)의 올리고뉴클레오타이드들은 표 1에 나열된 변형된 뉴클레오타이드를 가진 RNA인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 서열이 무작위로 된 올리고뉴클레오타이드들은 크기가 약 60개 내지 약 200개 뉴클레오타이드의 범위이며 내부 무작위 영역을 포함하고, 각각의 무작위 영역은 상기 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들의 각각의 5'-말단 및 3'-말단 상에 독립적으로 선택된 올리고뉴클레오타이드 태그들을 포함하는 프라이머 영역들에 의해 플랭킹된 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 친화성 기반의 분할은 SELEX, 또는 SELEX의 변형인 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표적은 펩타이드, 단백질, 핵산, 세포, 살아있는 조직의 성분, 유기 분자, 및 무기 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  10. (a) 크기가 약 60개 내지 약 200개 뉴클레오타이드의 범위인 무작위로 된 RNA 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리를 준비하는 단계,
    (b) 목적한 표적에 대한 친화성 기반의 분할에 의해 (a)의 2개의 라이브러리 각각을 독립적으로 스크리닝하여, 상기 표적에 결합하는 RNA 올리고뉴클레오타이드들이 농축된, RNA 올리고뉴클레오타이드들의 풀 A 및 풀 B를 각각 수득하는 단계,
    (c) 상기 풀 A 및 풀 B의 RNA 올리고뉴클레오타이드들을, 상기 표적, 및 2개의 올리고뉴클레오타이드들을 약 40개 내지 약 120개 뉴클레오타이드 크기 범위로 근접하게 유지하는 커넥터 올리고뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션하여, 2개의 올리고뉴클레오타이드들, 상기 커넥터 및 상기 표적의 4개부 복합체를 형성시키는 단계,
    (d) 리가아제 효소(ligase enzyme)를 (c)의 인큐베이션된 복합체에 가하여, 상기 표적에 결합된 풀 A로부터의 RNA 올리고뉴클레오타이드와 풀 B로부터의 RNA 올리고뉴클레오타이드 사이에 공유결합성 연결을 형성시키는 단계,
    (e) 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 (d)의 연결된 RNA 올리고뉴클레오타이드(ligated RNA oligonucleotide)를 증폭시켜, 2개의 RNA 앱타머들을 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계,
    (f) 풀 A의 RNA 앱타머(앱타머 A)를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드와 풀 B의 RNA 앱타머(앱타머 B)를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 분리하기 위해 선택된 프라이머들로 (e)의 DNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭시키는 단계,
    (g) RNA 앱타머들을 인코딩하는 2개의 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드들의 5'-말단에 프로모터를 도입한 후, (f)의 DNA 올리고뉴클레오타이드들을 시험관내 전사에 적용시켜 RNA 올리고뉴클레오타이드 앱타머 쌍을 생성하는 단계를 포함하되,
    각각의 개별 라이브러리의 올리고뉴클레오타이드들은 내부 무작위 영역을 포함하고, 각각의 무작위 영역은 상기 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들의 각각의 5'-말단 및 3'-말단 상에 독립적으로 선택된 올리고뉴클레오타이드 태그들을 포함하는 프라이머 영역들에 의해 플랭킹되어 있는, 목적한 표적에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 앱타머의 쌍을 분리하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 프라이머들은 길이가 적어도 15개 뉴클레오타이드인 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 프라이머들은 길이가 약 20개 뉴클레오타이드인 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 친화성 기반 분할은 SELEX, 또는 SELEX의 변형인 방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 표적은 펩타이드, 단백질, 핵산, 세포, 살아있는 조직의 성분, 유기 분자, 및 무기 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 프로모터는 T7 프로모터인 방법.
  16. (a) 크기가 약 60개 내지 약 200개 뉴클레오타이드의 범위인 무작위로 된 RNA 올리고뉴클레오타이드들의 2개의 라이브러리를 준비하는 단계,
    (b) 목적한 표적에 대한 친화성 기반의 분할에 의해 (a)의 2개의 라이브러리 각각을 독립적으로 스크리닝하여, 상기 표적에 결합하는 RNA 올리고뉴클레오타이드들이 농축된, RNA 올리고뉴클레오타이드들의 풀 A 및 풀 B를 각각 수득하는 단계,
    (c) 상기 풀 A 및 풀 B의 RNA 올리고뉴클레오타이드들을, 상기 표적, 및 2개의 올리고뉴클레오타이드들을 약 40개 내지 약 120개 뉴클레오타이드 크기 범위로 근접하게 유지하는 커넥터 올리고뉴클레오타이드와 함께 인큐베이션하여, 2개의 올리고뉴클레오타이드들, 상기 커넥터 및 상기 표적의 4개부 복합체를 형성시키는 단계,
    (d) 프라이머들을 포함하는 혼성화된 2개의 올리고뉴클레오타이드들인 어댑터들 또는 프라이머 듀플렉스들을 추가하여, 풀 내의 고정된 올리고뉴클레오타이드들을 연장시키는 단계,
    (e) 리가아제 효소(ligase enzyme)를 (d)의 인큐베이션된 복합체에 가하여, 상기 표적에 결합된 풀 A로부터의 올리고뉴클레오타이드와 풀 B로부터의 올리고뉴클레오타이드 사이, 그리고 각각의 풀로부터의 올리고뉴클레오타이드와 어댑터 사이에 공유결합성 연결을 형성시키는 단계,
    (f) 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 (e)의 연결된 올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜, 2개의 RNA 앱타머들을 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 단계,
    (g) 풀 A의 RNA 앱타머(앱타머 A)를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드와 풀 B의 RNA 앱타머(앱타머 B)를 인코딩하는 DNA 올리고뉴클레오타이드를 분리하기 위해 선택된 프라이머들로 (f)의 DNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜, RNA 앱타머들을 인코딩하는 2개의 이중-가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드들을 생성하는 단계,
    (h) 알칼리성 조건 하에서 풀 B의 일부를 가수분해하는 단계, 및
    (i) 단계 (g) 및 (h)의 생성물을 시험관내 전사에 적용시켜 RNA 올리고뉴클레오타이드 앱타머가 농축된 풀을 생성하는 단계를 포함하되,
    각각의 개별 라이브러리의 올리고뉴클레오타이드들은 내부 무작위 영역을 포함하고, 각각의 무작위 영역은 상기 풀 A 및 풀 B의 올리고뉴클레오타이드들의 각각의 5'-말단 및 3'-말단 상의 올리고뉴클레오타이드 태그, 및 4개 내지 6개의 고정된 뉴클레오타이드들의 올리고뉴클레오타이드 태그를 포함하는 적어도 하나의 프라이머 영역에 의해 플랭킹되어 있는, 목적한 표적에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 앱타머의 쌍을 분리하기 위한 방법.
  17. 제18항에 있어서,
    상기 친화성 기반 분할은 SELEX, 또는 SELEX의 변형인 방법.
  18. 제18항에 있어서,
    상기 표적은 펩타이드, 단백질, 핵산, 세포, 살아있는 조직의 성분, 유기 분자, 및 무기 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 프로모터는 T7 프로모터인 방법.
KR1020197000111A 2016-06-17 2017-06-16 앱타머 쌍 선택 방법 KR20190017870A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662351890P 2016-06-17 2016-06-17
US62/351,890 2016-06-17
PCT/US2017/037856 WO2017218881A1 (en) 2016-06-17 2017-06-16 Method for aptamer pair selection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20190017870A true KR20190017870A (ko) 2019-02-20

Family

ID=60663832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197000111A KR20190017870A (ko) 2016-06-17 2017-06-16 앱타머 쌍 선택 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20190106698A1 (ko)
EP (1) EP3472357A4 (ko)
JP (1) JP2019521680A (ko)
KR (1) KR20190017870A (ko)
CN (1) CN109661466A (ko)
CA (1) CA3037855A1 (ko)
WO (1) WO2017218881A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109321564A (zh) * 2018-10-30 2019-02-12 廖世奇 一种融合蛋白核酸适配体筛选方法及试剂盒
JP2022543668A (ja) 2019-08-09 2022-10-13 ナットクラッカー セラピューティクス， インコーポレイテッド マイクロ流体装置およびその使用方法
CN110578010A (zh) * 2019-09-03 2019-12-17 集美大学 四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列及其筛选方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6261774B1 (en) * 1990-06-11 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Truncation selex method
US5637459A (en) * 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US6682886B1 (en) * 1994-04-28 2004-01-27 Gilead Sciences, Inc. Bivalent binding molecules of 7 transmembrane G protein-coupled receptors
SE516272C2 (sv) * 2000-02-18 2001-12-10 Ulf Landegren Metoder och kit för analytdetektion mha proximitets-probning
CN101144814A (zh) * 2007-10-22 2008-03-19 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 应用适配子型试剂检测、鉴定和/或定量化合物的方法
AU2010248380B2 (en) * 2009-05-15 2013-12-19 Nec Solution Innovators, Ltd. Aptamer that recognizes peptide
US9765375B2 (en) * 2013-06-28 2017-09-19 General Electric Company Methods for developing binding-elements and uses thereof
MX361451B (es) * 2013-09-24 2018-12-06 Somalogic Inc Detección objetivo de múltiples aptámeros.

Also Published As

Publication number Publication date
CN109661466A (zh) 2019-04-19
EP3472357A1 (en) 2019-04-24
WO2017218881A1 (en) 2017-12-21
EP3472357A4 (en) 2020-01-22
US20190106698A1 (en) 2019-04-11
CA3037855A1 (en) 2017-12-21
JP2019521680A (ja) 2019-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kohlberger et al. SELEX: Critical factors and optimization strategies for successful aptamer selection
Thiviyanathan et al. Aptamers and the next generation of diagnostic reagents
Ochsner et al. Systematic selection of modified aptamer pairs for diagnostic sandwich assays
US11841371B2 (en) Proteomics and spatial patterning using antenna networks
Young et al. Mirror‐image oligonucleotides: history and emerging applications
US7544793B2 (en) Making nucleic acid sequences in parallel and use
EP3083957B1 (en) Production of encoded chemical libraries
JP7086855B2 (ja) 連結された二重鎖標的捕捉
JP2024038253A (ja) 連結型ライゲーション
Oliveira et al. Improving aptamer performance with nucleic acid mimics: de novo and post-SELEX approaches
Chan et al. Chemical modifications for a next generation of nucleic acid aptamers
JP2012198225A (ja) 標的分子の検出法
Freund et al. A two-residue nascent-strand steric gate controls synthesis of 2′-O-methyl-and 2′-O-(2-methoxyethyl)-RNA
Dausse et al. HAPIscreen, a method for high-throughput aptamer identification
US20190106698A1 (en) Method for aptamer pair selection
US11078489B2 (en) Methods and compositions for backscattering interferometry
Ma et al. Synthetic genetic polymers: advances and applications
EP3093342B1 (en) Rna micro-array for detecting interaction between protein and rna containing a higher order structure
Majumdar et al. Increasing the functional density of threose nucleic acid
Luo et al. Ultrasensitive sensing of T4 PNK phosphatase activity through establishing a novel transcription-based signal amplification platform
Sahayasheela et al. RNA G-quadruplex in functional regulation of noncoding RNA: Challenges and emerging opportunities
EP3519571B1 (en) Compositions, methods and systems for identifying candidate nucleic acid agent
Chen et al. Bottlebrush DNA-Primed Rolling Circle Amplification for Sensitive Detection of Biomolecules
US20220026429A1 (en) Compositions and methods of altering a nucleic acid with ribonuclease
US20100047875A1 (en) Making nucleic acid sequences in parallel and use