KR20190007567A - 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물 - Google Patents
민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 간 독성 동물 모델에 적용 시 간 손상 지표로 널리 알려진 AST(Aspartate Aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase) 값을 유의하게 감소시킴으로써, 간 손상에 의해 유발되는 산화적 스트레스로부터 간을 효과적으로 보호할 수 있으며, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 간 손상의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것으로서, 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것으로서, 특히 간 독성 동물 모델에 적용 시 간 손상 지표로 널리 알려진 ALT(Aspartate Aminotransferase) 및 AST(alanine aminotransferase) 값을 유의하게 감소시킴으로써, 간 손상에 의해 유발되는 산화적 스트레스로부터 간을 효과적으로 보호할 수 있으며, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 간 손상의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것이다.
간은 단백질 합성, 혈당 유지 및 해독과 같은 다양한 생리학적 활동을 수행하는 중요한 기관으로, 다양한 영양분의 대사 역시 담당하고 있다. 일반적으로 간 손상은 환경 유래의 독성 성분에 대량 노출되었을 때 유발되며, 경미한 일시적인 간 효소치의 상승에서부터 생명을 위협하는 간 섬유화, 간 경변 및 간암종에 이르기까지 광범위한 병리학적 변화를 수반할 수 있다. 현재까지 다양한 원인들이 간 손상의 주요 원인으로 주목 받아 왔으며, 이중 산화성 스트레스와 염증이 가장 중요한 원인으로 받아들여지고 있다. 화학 유기 용매인 CCl4에 의해 항산화 방어 시스템의 고갈에 따른 간질환이 유발됨에 따라, 현재 간 보호제 개발 및 간 질환의 병인론 연구에 CCl4 유발 간 손상 실험동물이 빈번히 사용되고 있다(Yang BY, Zhang XY, Guan SW, Hua ZC. Protective effect of procyanidin B2 against CCl4-induced acute liver injury in mice. Molecules. 2015;20:12250-65.; Zou J, Qi F, Ye L, Yao S. Protective Role of grape seed proanthocyanidins against CCl4 induced acute liver injury in mice. Med Sci Monit. 2016;22:880-9.).
실험동물에서 CCl4에 의한 간 손상은 노출량과 기간에 따라 다양한 병태를 나타낸다. 즉, 저용량의 CCl4는 Ca2
+ 이온 조절 능력의 소실, 지방 대사의 장애 및 염증성 사이토카인의 유리와 같은 일시적인 장애를 초래하나, 장기간의 CCl4 노출에 의해 지방산의 대사 장애가 초래되어, 간 섬유화와 경변 및 간암이 유발되는 것으로 알려져 있다(Cui Y, Yang X, Lu X, Chen J, Zhao Y. Protective effects of polyphenols-enriched extract from Huangshan Maofeng green tea against CCl4-induced liver injury in mice. Chem Biol Interact. 2014;220:75-83.). CCl4 유발 간 독성은 현재 간의 대사효소인 시토크롬 P-450에 의해 대사되는 환원성 탈할로겐화 반응에 의해 단백질 또는 지질과 결합할 수 있는 불안정한 트리클로로메틸 및 트리클로로메틸퍼옥실 라디칼을 형성하여, 지방 과산화와 간 세포 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다(Cheng N, Ren N, Gao H, Lei X, Zheng J, Cao W. Antioxidant and hepatoprotective effects of Schisandra
chinensis pollen extract on CCl4-induced acute liver damage in mice. Food Chem Toxicol. 2013;55:234-40.). 따라서 CCl4에 의해 생산되는 라디칼에 의한 산화 스트레스가 간 손상의 주요 기전으로 알려져 왔으며, 이들 라디칼에 의해 간 세포의 세포막 손상이 초래되어 간 효소치의 상승이 일어난다. 염증 또한 CCl4에 의한 간 손상을 악화시키는 또 다른 기전으로 알려져 있으므로(Ebaid H, Bashandy SA, Alhazza IM, Rady A, El-Shehry S. Folic acid and melatonin ameliorate carbon tetrachloride-induced hepatic injury, oxidative stress and inflammation in rats. Nutr Metab (Lond). 2013 3;10:20.; Yang BY, Zhang XY, Guan SW, Hua ZC. Protective effect of procyanidin B2 against CCl 4 -induced acute liver injury in mice. Molecules. 2015;20:12250-65.), CCl4 유발 간 손상 실험동물 모델에서 후보물질의 약효는 주로 항염 및 항산화 효과를 기반으로 한 조직병리 검사를 통해 평가되어 왔다(Ferreira EA, Gris EF, Felipe KB, Correia JF, Cargnin-Ferreira E, Wilhelm Filho D, Pedrosa RC. Potent hepatoprotective effect in CCl(4)-induced hepatic injury in mice of phloroacetophenone from Myrcia
multiflora. Libyan J Med. 2010;5.; Wang DH, Wang YN, Ge JY, Liu HY, Zhang HJ, Qi Y, Liu ZH, Cui XL. Role of activin A in carbon tetrachloride-induced acute liver injury. World J Gastroenterol. 2013;19:3802-9.).
간 보호 약물의 개발이 계속해서 진행되어 왔으나, 여전히 부작용이 적고, 강력한 간 보호 효과를 나타내는 약물의 개발이 필요한 실정으로, 현재 천연물을 이용한 간 보호 약물의 탐색이 활발히 진행되고 있다. 이중, 엉겅퀴(milk thistle, Silibum
marianum) 유래의 플라보노이드인 실리마린(silymarin)은 강력한 항산화 효과를 통해 간 보호 효과를 나타내는 대표적인 천연물 유래 간 보호 약물이며(Wellington K, Jarvis B. Silymarin: a review of its clinical properties in the management of hepatic disorders. BioDrugs. 2001;15:465-89.), CCl4 유발 간 손상 실험동물 모델에서도 강력한 항산화 효과를 통한 간 보호 효과를 나타내는 것으로 알려져 있어, 다양한 간 보호 약물 개발에 중요한 대조 약물로 이용 되고 있다(Ferreira EA, Gris EF, Felipe KB, Correia JF, Cargnin-Ferreira E, Wilhelm Filho D, Pedrosa RC. Potent hepatoprotective effect in CCl(4)-induced hepatic injury in mice of phloroacetophenone from Myrcia
multiflora. Libyan J Med. 2010;5.; Jain NK, Lodhi S, Jain A, Nahata A, Singhai AK. Effects of Phyllanthus
acidus (L.) Skeels fruit on carbon tetrachloride-induced acute oxidative damage in livers of rats and mice. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2011;9:49-56.; Wang R, Feng X, Zhu K, Zhao X, Suo H. Preventive activity of banana peel polyphenols on CCl(4)-induced experimental hepatic injury in Kunming mice. Exp Ther Med. 2016;11:1947-54.). 이러한 맥락에서, 본 실험에서도 실리마린을 대조 약물로 선정하였다.
본 발명은 간 독성 동물 모델에 적용시 간 손상 지표로 널리 알려진 AST(Aspartate Aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase) 값을 유의하게 감소시킴으로써, 간 손상에 의해 유발되는 산화적 스트레스로부터 간을 효과적으로 보호할 수 있으며, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 간 손상의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명에 따른 간기능 개선 효능을 갖는 조성물은 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
상기 민들레 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 및 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 극성용매로 민들레 뿌리, 전초, 바람직하게는 민들레의 잎을 추출한 것일 수 있다.
상기 레몬밤 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 및 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 극성용매로 레몬밤 전초, 바람직하게는 레몬밤의 잎을 추출한 것일 수 있다.
상기 조성물은 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 중량비로 민들레 추출물 : 레몬밤 추출물을 1 : 8 내지 8 : 1, 바람직하게는 1 : 1 내지 4로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 의약품 또는 식품일 수 있다.
도 1은 시험 물질 투여 후 CCl 4 투여에 의한 유발 급성 간 손상 후의 체중 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2 및 도 3은 시험 물질 투여 후 CCl 4 투여에 의한 유발 급성 간 손상 후의 간 육안 부검 소견 및 중량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 시험 물질 투여 후 CCl 4 투여에 의한 유발 급성 간 손상 후의 혈중 AST 및 ALT 함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 시험 물질 투여 후 CCl 4 투여에 의한 유발 급성 간 손상 후의 조직병리학적 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2 및 도 3은 시험 물질 투여 후 CCl 4 투여에 의한 유발 급성 간 손상 후의 간 육안 부검 소견 및 중량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 시험 물질 투여 후 CCl 4 투여에 의한 유발 급성 간 손상 후의 혈중 AST 및 ALT 함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 시험 물질 투여 후 CCl 4 투여에 의한 유발 급성 간 손상 후의 조직병리학적 변화를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
민들레(Taraxacum
officinale)는 국화과(Asteraceae)에 속하는 식물로 혈당 감소, 항염, 항암 및 심장보호 효과가 잘 알려져 있어, 전통적으로 다양한 간 질환, 담낭 장애, 소화기 장애, 류머티즘 관절염 등에 사용되어 왔다(Davaatseren M, Hur HJ, Yang HJ, Hwang JT, Park JH, Kim HJ, Kim MJ, Kwon DY, Sung MJ. Taraxacum official (dandelion) leaf extract alleviates high-fat diet-induced nonalcoholic fatty liver. Food Chem Toxicol. 2013;58:30-6.). 현재까지 타락신(taraxin), 타락세롤(taraxerol), 카페인산(caffeic acid), 플라보크산틴(flavoxanthin), 타락사신(taraxacin), 타락사스테롤(taraxasterol), 콜린(choline), 이눌린(inulin), 펙틴(pectin), 데사세틸마트리카린(desacetylmatricarin), 아킬린(achillin) 및 류코딘(leucodin)이 민들레의 주요 활성 성분으로 밝혀져 왔고(Gu JH, Kim SR, Lee JW, Park MY, Choi JY, Kim JD. Mouse single oral dose toxicity test of Taraxaci Herba aqueous extracts. Korean J. Oriental Physiology & Pathology. 2011;25:650-7.), 특히 민들레 추출물 의 간 보호 효과가 CCl4 유발 급성 간 손상 모델, 고지방 사료 공급 비알코올성 지방간 모델, 스트렙토조톡신(streptozotocin) 유발 당뇨병성 간 병증 모델 등을 통해 실험적으로 밝혀져 왔으며(Cho SY, Park JY, Park EM, Choi MS, Lee MK, Jeon SM, Jang MK, Kim MJ, Park YB. Alternation of hepatic antioxidant enzyme activities and lipid profile in streptozotocin-induced diabetic rats by supplementation of dandelion water extract. Clin Chim Acta. 2002;317:109-17.), CCl4 유발 간 섬유화에 대한 유효한 효과 역시 잘 알려져 있다(DomitroviR, Jakovac H, RomiZ, RaheliD, TadiZ. Antifibrotic activity of Taraxacum officinale root in carbon tetrachloride-induced liver damage in mice. J Ethnopharmacol. 2010;130:569-77.).
또한, 레몬밤(Melissa officinalis)은 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 식물로, 다양한 활성 플라보노이드(시나로사이드(cynaroside), 코스모신(cosmosin), 람노시트린(rhamnocitrin), 이소퀘르시트린(isoquercitrin)), 테르펜 및 트리테르펜산(triterpene acids: 우르솔산(ursolic acid) 및 올레아놀산(oleanolic acid))을 함유하고 있는 것으로 알려져 있고(Herodez SS, Hadolin M, Skerget M, Knez Z. Solvent extraction study of antioxidants from balm (Melissa
officinalis
L.) leaves. Food Chemistry. 200;80:275-82.), 정유, 카페인산 및 로즈마린산, 모노테르펜과 세스퀴테르펜, 페놀계 물질 및 탄닌 등의 활성성분 역시 레몬밤에서 분리 추출되었다. 현재까지 레몬밤 추출물의 항패혈증(Ulbricht C, Brendler T, Gruenwald J, Kligler B, Keifer D, Abrams TR, Woods J, Boon H, Kirkwood CD, Hackman DA, Basch E, Lafferty HJ; Natural Standard Research Collaboration. Lemon balm (Melissa
officinalis L.): an evidence-based systematic review by the Natural Standard Research Collaboration. J Herb Pharmacother. 2005;5:71-114.), 항바이러스), 항균 및 항산화 활성이 보고되어 왔으며, 레몬밤 추출물의 간 보호 효과 역시 랫트 고지혈증 모델 및 고콜레스테롤 랫트 모델에서 잘 알려져 있다(Bolkent S, Yanardag R, Karabulut-Bulan O, Yesilyaprak B. Protective role of Melissa officinalis L. extract on liver of hyperlipidemic rats: a morphological and biochemical study. J Ethnopharmacol. 2005;99:391-8, Ali Zarei1 , Saeed Changizi Ashtiyani, Soheila Taheri, Fateme Rasekh Comparison between effects of different doses ofofficinalisatorvastatin on the activity of liver enzymes in hypercholesterolemia rats. AJP 2014; 4(1) 15-23).
상기 민들레 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 및 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 극성용매, 바람직하게는 물로 민들레 전초, 바람직하게는 민들레의 잎을 추출하고 분무건조시켜 분말화한 것이다.
상기 레몬밤 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 및 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 극성용매, 바람직하게는 물로 레몬밤 전초, 바람직하게는 레몬밤의 잎을 추출하고 분무건조시켜 분말화한 것이다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.
이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안 될 것이다.
제조예
1:
레몬밤
잎 추출물 분말(LB)의 제조
레몬밤 잎을 수세 및 음건시킨 후, 레몬밤 잎 건물을 정확하게 30kg으로 정량한 뒤 깨끗하게 세척하고 원물:용매 = 3:20의 비율(kg:kg)로 추출기에 넣어 121℃, 0.15 Mpa에서 6시간 동안 추출하였으며, 이를 반복하여 총 2회 추출하였다. 상기 용매로는 물 또는 70% 에탄올(에탄올 또는 주정 알코올)을 사용하였다. 추출물을 여과를 통해 고형분을 제거한 후 여과액을 감압 농축하여 25 brix(±5 brix)의 농축물을 얻었다. 농축물 : 덱스트린 = 9:1 의 비율(kg:kg)로 섞어 스프레이드라이어(spray dryer)를 통해 분말화를 진행하였다.
제조예
2: 민들레 잎 추출물 분말(DL)의 제조
레몬밤 잎 대신 민들레 잎을 사용하고, 정확하게 30kg으로 정량한 뒤 깨끗하게 세척하고 원물:용매 = 3:20의 비율(kg:kg)로 추출기에 넣어 121℃, 0.15 Mpa에서 6시간 동안 추출하였으며, 이를 반복하여 총 2회 추출하였다. 상기 용매로는 물 또는 70% 에탄올(에탄올 또는 주정 알코올)을 사용하였다. 추출물을 여과를 통해 고형분을 제거한 후 여과액을 감압 농축하여 25 brix(±5 brix)의 농축물을 얻었다. 농축물 : 덱스트린 = 9:1 의 비율(kg:kg)로 섞어 스프레이드라이어(spray dryer)를 통해 분말화를 진행하였다.
실험 개요:
LB 및 DL 단독 조성물, 9 종의 LB 및 DL 복합 조성물 (LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성, g/g)을 각각 멸균 증류수에 용해시켜, 10 ㎖/g의 용량 (200 ㎎/㎏)으로 매일 1회씩 7일간 경구투여하고, 마지막 7회 경구투여 1 시간 후 0.5 ㎖/㎏의 CCl4를 단회 복강투여하여 급성 간 손상을 유발하였다. CCl4 투여 24시간 후, 간 육안 부검 소견, 간 중량, 혈중 AST 및 ALT 함량, 간 항산화 방어 시스템 지질 과산화, GSH 함량, SOD 및 CAT 활성간 조직의 조직병리학적 변화와 함께 관찰하였으며, 실험 전 기간인 7일 동안의 체중 및 증체량의 변화 역시 관찰하였다. 조직 병리학적으로 간 손상의 정도를 HAI grading score(Ishak K, Baptista A, Bianchi L, Callea F, De Groote J, Gudat F, Denk H, Desmet V, Korb G, MacSween RN, Phillips MJ, Portmannl BG, Paulsen H, Scheuer PJ, Schmid M, Thaler H. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 1995;22:696-9.), 간 실질 중 변성부위의 비율 (%/㎟),변성 간세포의 수 (cells/1000 간세포) 및 침윤 염증세포의 수 (cells/㎟)의 변화(Ki SH, Yang JH, Ku SK, Kim SC, Kim YW, Cho IJ. Red ginseng extract protects against carbon tetrachloride-induced liver fibrosis. J Ginseng Res. 2013;37:45-53.)를 기초로 평가하였다. 본 실험에서 이전의 보고에 준하여(Kang SJ, Choi BR, Kim SH, Yi HY, Park HR, Song CH, Ku SK, Lee YJ. Selection of the optimal herbal compositions of red clover and pomegranate according to their protective effect against climacteric symptoms in ovariectomized mice. Nutrients. 2016;8. pii: E447.), 각각의 LB 및 DL 단독 조성물과 비교하여 동시에 통계학적으로 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 약효 상승을 나타내는 복합 조성물의 시너지 효과를 나타내는 LB:DL 복합 조성물로 간주하였으며, 또한 대조 약물로서 항산화 효과에 의한 간 보호 효과가 이미 잘 알려져 있는 천연물 유래의 간 보호제인 실리마린 100 ㎎/㎏ 경구 투여군(Jain NK, Lodhi S, Jain A, Nahata A, Singhai AK. Effects of Phyllanthus
acidus (L.) Skeels fruit on carbon tetrachloride-induced acute oxidative damage in livers of rats and mice. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2011;9:49-56.)을 대조 약물군으로 이용하여 비교 평가하였다.
총 126 개체의 SPF/VAF Outbred CrljOri:CD1[ICR] 수컷 마우스(OrientBio, Seungnam, Korea)를 8일간 순화 후, 실험물질 투여 1일 전 측정한 체중(평균 35.07±1.62 g, 31.30 내지 39.30 g)을 기준으로 군당 8개체 씩, 총 14개 군으로 선별하여, 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 실험물질 투여 시작 및 최종 부검일 전 18시간 동안 절식시켰다(이때 음수는 제한하지 않았다).
군 분리 (총 14개군; 군 당 8개체)
- 정상 매체 대조군: 멸균 증류수 투여 후 올리브유 투여 정상 매체 대조군
- CCl4 대조군: 멸균증류수 투여 후, CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 급성 간 손상 매체 대조군
- 실리마린 100 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏투여 대조약물군
- LB 단독 조성물 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 실험군
- DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 실험군
- LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 총량 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 실험군 (9 종)
실험물질의 투여: LB 및 DL 적정량을 멸균 증류수에 용해시켜 10 ㎖/㎏의 용량으로 매일 1회씩 7일간 경구투여 하였다. 즉, LB 및 DL 단독 조성물에서는 각각 20 ㎎/㎖의 농도로 멸균 증류수에 용해시켜, 10 ㎖/㎏ (200 ㎎/㎏)의 용량으로 금속제 존데가 부착된 1 ㎖ 주사기를 이용하여, 경구투여 하였으며, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물에서는 10 ㎖의 증류수에 LB 및 DL 각각을 100:100, 66:134, 40:160, 28:172, 22:178, 134:66, 160:40, 172:28 및 178:22 ㎎:㎎씩 용해 시켜, 역시 10 ㎖/㎏ (총량 200 ㎎/㎏)의 용량으로 각각 경구 투여였다. 실리마린(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO, USA) 역시 10 ㎎/㎖의 농도로 멸균증류수에 용해시켜, 10 ㎖/㎏의 용량 (100 ㎎/㎏)으로 매일 1회씩 7일간 경구 투여하였다. 정상 매체 및 CCl4 대조군에서는 동일한 보정 및 투여 스트레스를 가하기 위해, 실험물질 (LB 및 DL 단독 조성물, 9 종의 LB:DL 복합 조성물 또는 실리마린) 대신 동일 용량의 매체만 동일한 방법으로 경구 투여하였다. 본 실험에 사용한 LB 및 DL 단독 조성물의 투여 용량은 이전의 민들레 추출물에 대한 다양한 실험동물 모델에서의 간 보호효과(Cho SY, Park JY, Park EM, Choi MS, Lee MK, Jeon SM, Jang MK, Kim MJ, Park YB. Alternation of hepatic antioxidant enzyme activities and lipid profile in streptozotocin-induced diabetic rats by supplementation of dandelion water extract. Clin Chim Acta. 2002;317:109-17.) 및 고지혈증 랫트에서 레몬밤 추출물의 간 보호 효과(Bolkent S, Yanardag R, Karabulut-Bulan O, Yesilyaprak B. Protective role of Melissa
officinalis L. extract on liver of hyperlipidemic rats: a morphological and biochemical study. J Ethnopharmacol. 2005;99:391-8, and Ali Zarei1 , Saeed Changizi Ashtiyani, Soheila Taheri, Fateme Rasekh Comparison between effects of different doses ofofficinalisatorvastatin on the activity of liver enzymes in hypercholesterolemia rats. AJP 2014; 4(1) 15-23).) 평가 실험들과 본 연구자 등의 이전 CCl4 유발 급성 간 손상 마우스 모델을 이용한 약효 탐색 연구를 기준으로 200 ㎎/㎏으로 산정하였으며, 단독 조성물과 약효 비교를 위해, 9 종의 LB:DL 복합 조성물의 투여 용량 역시 총량 200 ㎎/㎏으로 설정하였고, 실리마린의 투여 용량 100 ㎎/㎏ 역시 이전의 문헌(Jain NK, Lodhi S, Jain A, Nahata A, Singhai AK. Effects of Phyllanthus
acidus (L.) Skeels fruit on carbon tetrachloride-induced acute oxidative damage in livers of rats and mice. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2011;9:49-56.)을 바탕으로 하기 표 1과 같이 설정하였다.
| 군 | 동물 | 시험 물질(㎎/㎏) | 동물 번호 |
| 대조군 | 정상 마우스 | 증류수 및 올리브유 | M01~M08 |
| CCl4 마우스 | 증류수 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M09~M16 | |
| 비교군 | CCl4 마우스 | 실리마린 100㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M17~M24 |
| CCl4 마우스 | LB 단독 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M25~M32 | |
| CCl4 마우스 | DL 단독 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M33~M40 | |
| 실험군 | CCl4 마우스 | LB:DL = 1:1 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M41~M48 |
| CCl4 마우스 | LB:DL = 1:2 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M49~M56 | |
| CCl4 마우스 | LB:DL = 1:4 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M57~M64 | |
| CCl4 마우스 | LB:DL = 1:6 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M65~M72 | |
| CCl4 마우스 | LB:DL = 1:8 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M73~M80 | |
| CCl4 마우스 | LB:DL = 2:1 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M81~M88 | |
| CCl4 마우스 | LB:DL = 4:1 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M89~M96 | |
| CCl4 마우스 | LB:DL = 6:1 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M97~M104 | |
| CCl4 마우스 | LB:DL = 8:1 200㎎/㎏ 및 CCl4 0.5㎖/㎏ | M105~M112 | |
| CCl4 = 사염화탄소; LB = 레몬밤 잎 추출물; DL = 민들레 잎 추출물; LB:DL = 레몬밤 잎 추출과 민들레 잎 추출물의 혼합물 |
|||
급성 간 손상의 유발: 실리마린 100 ㎎/㎏ 또는 5 종류의 천연물 추출물 최종 7회 투여 1시간 후, CCl4(Sigma-Aldrich, St Louise, MO, USA)를 1:19 v/v(5%)로 올리브유(Sigma-Aldrich, St Louise, MO, USA)에 희석하여 10 ㎖/㎏의 용량 (CCl4
자체로서 0.5 ㎖/㎏)으로 26 G 바늘이 부착된 1 ㎖ 주사기를 이용, 단회 복강 투여하여, 급성 간 손상을 유발하였다. 한편 정상 매체 대조군에서는 CCl4 혼합액 대신 동일한 용량의 올리브유를 동일한 방법으로 투여하였다.
관찰항목: 체중 및 증체량, 간 육안 부검 소견, 간 중량, 혈중 AST 및 ALT 함량, 간 항산화 방어 시스템, 간 조직의 조직병리학적 변화
간의 항산화 방어 시스템: 지질 과산화 (MDA 함량), GSH 함량, SOD 및 CAT 활성
조직병리학적 변화: HAI(Histoloic activity index) grading score(표 2), 간 실질 중 변성부위의 비율 (%/㎟), 변성 간세포의 수 (cells/1000 간세포) 및 침윤 염증세포의 수 (cells/㎟)
| A. 융합성 괴사 | |
| 부재 | 0 |
| 국소 융합성 괴사 | 1 |
| 일부 영역에서 Zone 3 괴사 | 2 |
| 대부분의 영역에서 Zone 3 괴사 | 3 |
| Zone 3 괴사 + 산발적 문맥-중심 가교화 | 4 |
| Zone 3 괴사 + 다발적 문맥-중심 가교화 | 5 |
| 범폐소포형 괴사 | 6 |
| B. 국소 용균성 괴사, 세포자멸사 및 국소 염증 | |
| 부재 | 0 |
| 10배율 당 1개 이하 | 1 |
| 10배율 당 2 내지 4개 | 2 |
| 10배율 당 5 내지 10개 | 3 |
| 10배율 당 10개 초과 | 4 |
| HAI = 조직학적 활성 지수; HAI 등급 점수 = A=B | |
1. 체중의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중의 감소가 나타났으며, CCl4 투여 24시간 후 최종 희생일에 국한되어 인정되었으며, 이와 관련되어 7일간의 증체량 역시 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었다. 한편 실리마린 100 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 CCl4 투여 24시간 후 최종 희생일에서 인정되었으며, 7일간의 증체량 역시 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었다. 특히, LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 증체량의 증가가 동일한 순으로 인정되었다(표 3, 도 1).
| 군 | 하기 시점에서의 체중 | 체중 이득 [B-A] |
|||
| 시험물질 투여 1일차[A]* |
시험물질 투여 마지막 7일차 |
CCl4 처리 24시간 후[B]* | |||
| 대조군 | 정상 | 30.08±1.15 | 37.35±0.93 | 34.54±0.93 | 4.46±1.50 |
| CCl4 | 29.95±1.31 | 36.49±1.76 | 30.54±1.40a | 0.59±0.38e | |
| 비교군 | 실리마린 | 30.30±1.82 | 37.29±2.62 | 32.96±1.73c | 2.66±0.77eg |
| LB 단독 | 29.74±1.49 | 36.40±2.04 | 32.80±1.46bd | 3.06±0.52fg | |
| DL 단독 | 30.00±1.48 | 36.41±1.86 | 32.73±1.37bd | 2.73±0.71fg | |
| 실험군 [LB:DL] (g/g) |
1:1 | 30.21±2.49 | 36.90±3.23 | 33.96±2.67c | 3.75±0.62ghj |
| 1:2 | 30.21±1.69 | 36.21±1.80 | 33.00±1.64c | 3.09±0.88fg | |
| 1:4 | 30.15±1.76 | 36.21±1.96 | 33.19±1.80c | 3.04±0.78fg | |
| 1:6 | 30.24±1.00 | 36.75±1.94 | 33.23±1.43c | 2.99±0.72fg | |
| 1:8 | 29.70±1.00 | 36.69±1.57 | 32.73±1.40bd | 3.03±0.49fg | |
| 2:1 | 29.91±1.82 | 36.54±2.79 | 34.09±2.95c | 4.18±1.21ghi | |
| 4:1 | 29.88±1.42 | 36.99±1.63 | 33.83±1.87c | 3.95±0.77ghi | |
| 6:1 | 30.00±1.11 | 37.00±1.74 | 33.29±1.45c | 3.29±0.67g | |
| 8:1 | 29.99±0.74 | 36.48±1.39 | 33.26±1.37c | 3.28±1.16g | |
| 값들은 8개체의 마우스의 평균±표준편차로 표시됨(단위: g) * 모든 동물들은 밤새도록 절식시켰다(약 18시간; 음수는 제한하지 않음) LSD test에 의한 정상 대조와 비교하여 ap<0.01 및 bp<0.05 LSD test에 의한 CCl4 대조와 비교하여 cp<0.01 및 dp<0.05 MW test에 의한 정상 대조와 비교하여 ep<0.01 및 fp<0.05 MW test에 의한 CCl4 대조와 비교하여 gp<0.01 MW test에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 hp<0.05 MW test에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 ip<0.01 및 jp<0.05 LSD = Least-significant differences multi-comparison (약어에 대한 설명이 필요하여 추가 하였음) MW = Mann-Whitney U |
|||||
실험 전 기간인 7일 동안의 증체량은 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 -86.83%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 353.19, 421.28, 363.83, 538.30, 425.53, 417.02, 408.51, 414.89, 610.64, 572.34, 459.57 및 457.45%의 변화를 나타내었다.
2. 간 육안 부검 소견 및 중량의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 국소 결절화(nodule formation) 를 동반한 간 종대 소견을 나타내어, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 절대 및 상대 간 중량의 증가가 각각 인정되었으나, LB 단독 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 절대 및 상대 중량의 감소, 국소 결절화를 동반한 간 종대 소견의 현저한 감소를 나타내었고, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 절대 및 상대 중량의 감소, 국소 결절화를 동반한 간 종대 소견의 현저한 감소가 동일한 순으로 인정되었다(도 2 및 도 3).
도 2 및 도 5에서,
A = 정상 대조(증류수 및 올리브유 처리 마우스)
B = CCl4 대조(증류수 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
C = 비교(실리마린 100 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
D = LB(LB 단독 조성물 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
E = DL(DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
F = LB:DL = 1:1(LB:DL = 1:1 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
G = LB:DL = 1:2(LB:DL = 1:2 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
H = LB:DL = 1:4(LB:DL = 1:4 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
I = LB:DL = 1:6(LB:DL = 1:6 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
J = LB:DL = 1:8(LB:DL = 1:8 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
K = LB:DL = 2:1(LB:DL = 2:1 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
L = LB:DL = 4:1(LB:DL = 4:1 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
M = LB:DL = 6:1(LB:DL = 6:1 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
N = LB:DL = 8:1(LB:DL = 8:1 혼합 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 처리 마우스)
이다.
도 3에서,
LSD 시험에 의한 정상 대조와 비교하여 ap<0.01
LSD 시험에 의한 CCl4 대조와 비교하여 bp<0.01
LSD 시험에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 cp<0.01 및 dp<0.05
LSD 시험에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 ep<0.01
MW 시험에 의한 정상 대조와 비교하여 fp<0.01
MW 시험에 의한 CCl4 대조와 비교하여 gp<0.01
MW 시험에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 hp<0.01
MW 시험에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 ip<0.01
이다.
간 절대 중량은 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 49.40%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -14.85, -17.48, -16.70, -21.29, -18.48, -17.54, -17.14, -17.35, -24.92, -22.90, -17.04 및 -16.90%의 변화를 나타내었다.
간 상대 중량은 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 68.95%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -20.89, -23.06, -22.15, -28.96, -25.06, -23.91, -23.80, -22.84, -32.40, -30.22, -23.79 및 -23.59%의 변화를 나타내었다.
3. 혈중
AST
및 ALT 함량의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가가 각각 인정되었으나, DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 AST 및 ALT 함량의 감소를 나타내었고, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 AST 및 ALT 함량의 감소가 동일한 순으로 인정되었다 (도 4).
도 4에서,
LSD 시험에 의한 정상 대조와 비교하여 ap<0.01
LSD 시험에 의한 CCl4 대조와 비교하여 bp<0.01
LSD 시험에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 cp<0.01 및 dp<0.05
LSD 시험에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 ep<0.01
MW 시험에 의한 정상 대조와 비교하여 fp<0.01 및 gp<0.05
MW 시험에 의한 CCl4 대조와 비교하여 hp<0.01
MW 시험에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 ip<0.01
MW 시험에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 jp<0.01
이다.
혈중 AST 함량은 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 286.63%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -36.74, -45.92, -41.93, -53.69, -45.41, -44.25, -44.03, -43.05, -66.35, -58.71, -46.74 및 -44.68%의 변화를 나타내었다.
혈중 ALT 함량은 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 561.60%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -27.59, -49.54, -44.48, -58.39, -49.02, -47.82, -45.40, -44.89, -66.26, -60.63, -50.57 및 -50.23%의 변화를 나타내었다.
4. 간 조직 내 지질 과산화의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 MDA 함량의 증가, 즉 지질과산화의 증가가 인정되었으나, LB:DL = 1:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 MDA 함량의 감소를 나타내었고, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 조직 내 지질 과산화의 감소가 동일한 순으로 인정되었다 (표 4).
| 군 | 지질 과산화 (MDA nM/ 단백질 ㎎) |
GSH 함량 (nM/ ㎎ 단백질) |
효소 활성 | ||
| SOD (U/㎎ 단백질) |
CAT (U/㎎ 단백질) |
||||
| 대조군 | 정상 | 1.74±0.96 | 47.56±13.09 | 467.54±88.71 | 259.02±81.43 |
| CCl4 | 8.88±1.62a | 3.73±1.34g | 48.35±21.51g | 47.46±10.51g | |
| 비교군 | 실리 마린 |
6.03±0.91ac | 17.76±2.70gi | 173.39±34.64gi | 132.93±27.55gi |
| LB 단독 | 4.72±0.56ac | 26.98±4.44gi | 227.20±35.57gi | 166.33±21.39gi | |
| DL 단독 | 5.29±0.83ac | 22.56±6.59gi | 204.30±27.49gi | 140.33±37.26gi | |
| 실험군 [LB:DL] |
1:1 | 3.68±0.43acef | 33.69±5.26hikl | 282.36±31.64gijl | 192.20±14.75hikm |
| 1:2 | 4.88±0.81ac | 27.84±6.18gi | 225.81±31.38gi | 162.55±19.84gi | |
| 1:4 | 5.10±1.12ac | 26.82±4.27gi | 217.17±34.70gi | 161.88±37.03gi | |
| 1:6 | 5.45±1.28ac | 26.78±3.27gi | 208.31±40.47gi | 153.01±49.17gi | |
| 1:8 | 5.56±1.39ac | 25.81±6.38gi | 205.05±21.08gi | 148.73±33.97gi | |
| 2:1 | 2.81±0.38bcdf | 37.71±5.66ijl | 361.83±35.60gijl | 251.16±43.93ijm | |
| 4:1 | 3.58±0.62acef | 35.94±5.48ijl | 328.29±63.76gijl | 209.65±21.07ijm | |
| 6:1 | 4.80±0.77ac | 27.30±6.82gi | 232.49±42.82gi | 170.81±47.19gi | |
| 8:1 | 4.66±1.12ac | 26.28±3.72gi | 230.25±58.84gi | 166.51±38.29gi | |
| 값들은 8개체의 마우스의 평균±표준편차로 표시됨(단위: g) LSD 시험에 의한 정상 대조와 비교하여 ap<0.01 및 bp<0.05 LSD 시험에 의한 CCl4 대조와 비교하여 cp<0.01 LSD 시험에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 dp<0.01 및 ep<0.05 LSD 시험에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 fp<0.01 MW 시험에 의한 정상 대조와 비교하여 gp<0.01 및 hp<0.05 MW 시험에 의한 CCl4 대조와 비교하여 ip<0.01 MW 시험에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 jp<0.01 및 kp<0.05 MW 시험에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 lp<0.01 및 mp<0.05 |
|||||
간 조직 내 지질과산화는 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 510% 의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -32.10, -46.83, -40.50, -58.53, -45.03, -42.58, -38.61, -37.41, -68.33, -59.73, -46.00 및 -47.59%의 변화를 나타내었다.
5. 간 조직 내
GSH
함량의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 내인성 항산화제인 GSH 함량의 감소가 인정되었으나, LB:DL = 1:2 복합 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 GSH 함량의 증가를 나타내었고, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 조직 내 GSH 함량의 증가가 동일한 순으로 인정되었다 (표 4).
간 조직 내 GSH 함량은 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 -92.16%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 376.43, 623.88, 505.26, 803.89, 646.78, 619.38, 618.38, 592.42, 911.64, 864.29, 632.33 및 605.13%의 변화를 나타내었다.
6. 간 조직 내 SOD 활성의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 내인성 항산화 효소인 CAT 활성의 감소가 인정되었으나, LB:DL = 1:4 복합 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 CAT 활성의 증가를 나타내었고, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 CAT 활성의 증가가 동일한 순으로 인정되었다 (표 4).
간 조직 내 SOD 활성은 CCl4 대조조군에서 정상 매체 대조군에 비해 -89.66%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 258.64, 369.96, 322.59, 484.05, 367.09, 349.20, 330.88, 324.15, 648.44, 579.05, 380.90 및 376.26%의 변화를 나타내었다.
7. 간 조직 내 CAT 활성의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 내인성 항산화 효소인 CAT 활성의 감소가 인정되었으나, LB:DL = 1:6 복합 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 CAT 활성의 증가를 나타내었고, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 조직 내 CAT 활성의 증가가 동일한 순으로 인정되었다 (표 4).
간 조직 내 CAT 활성은 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 -81.68%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 180.10, 250.48, 195.70, 304.99, 242.72, 241.10, 222.41, 213.39, 429.23, 341.75, 259.93 및 250.86%의 변화를 나타내었다.
8. 조직병리학적 변화
CCl4 대조군에서는 간세포의 공포화, 간 세포내 지방소적의 축적 및 염증세포 침윤과 같은 소엽 중심성 괴사 소견이 관찰되어, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 변성율, 변성 간세포 수 및 침윤 염증세포 수의 증가와 이와 관련된 HAI score의 증가가 각각 인정되었으나, LB:DL = 1:8 복합 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) CCl4 유발 소엽 중심성 괴사 소견의 감소를 각각 나타내었고, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 간 변성율, 변성 간세포 수 및 간 실질 내 침윤 염증세포 수, HAI score의 감소가 동일한 순으로 인정되었다 (표 5, 도 5).
| 군 | HAI (최대 = 10) |
퇴화 영역의 면적 (%/㎟) | DE 간세포의 수 (cells/1000 간세포) |
침윤된 염증 세포의 수 (cells/㎟) |
|
| 대조군 | 정상 | 0.25±0.46 | 2.77±1.96 | 24.88±15.02 | 21.13±10.97 |
| CCl4 | 8.50±1.07a | 77.90±10.20f | 765.13±120.37f | 204.75±52.48f | |
| 비교군 | 실리 마린 |
5.00±1.20ac | 51.64±10.41fg | 508.88±107.33fg | 91.63±12.73fg |
| LB 단독 | 4.13±0.83ac | 44.76±10.08fg | 438.00±96.03fg | 70.00±12.65fg | |
| DL 단독 | 4.50±0.93ac | 50.38±10.20fg | 482.75±112.57fg | 80.13±18.38fg | |
| 실험군 [LB:DL] |
1:1 | 2.50±0.93acde | 31.27±6.26fghi | 295.75±66.28fghi | 48.63±10.91fghi |
| 1:2 | 4.00±1.07ac | 45.28±10.18fg | 448.63±106.92fg | 72.75±12.74fg | |
| 1:4 | 4.25±1.39ac | 46.65±10.31fg | 455.00±122.44fg | 76.13±12.31fg | |
| 1:6 | 4.38±1.19ac | 47.85±11.15fg | 474.25±118.03fg | 75.88±14.26fg | |
| 1:8 | 4.50±1.20ac | 48.26±10.46fg | 488.38±126.58fg | 77.13±10.67fg | |
| 2:1 | 1.50±0.53bcde | 21.33±4.17fghi | 194.13±49.75fghi | 33.63±11.44ghi | |
| 4:1 | 2.13±0.64acde | 27.89±6.30fghi | 260.63±62.13fghi | 43.88±12.19fghi | |
| 6:1 | 3.75±1.49ac | 41.71±15.54fg | 410.25±169.45fg | 67.50±15.33fg | |
| 8:1 | 3.63±1.41ac | 43.57±12.47fg | 407.88±137.03fg | 69.25±16.85fg | |
| 값들은 8개체의 마우스의 평균±표준편차로 표시됨(단위: g) LSD test에 의한 정상 대조와 비교하여 ap<0.01 및 bp<0.05 LSD test에 의한 CCl4 대조와 비교하여 cp<0.01 LSD test에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 dp<0.01 LSD test에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 ep<0.01 MW test에 의한 정상 대조와 비교하여 fp<0.01 MW test에 의한 CCl4 대조와 비교하여 gp<0.01 MW test에 의한 LB 단독 조성물과 비교하여 hp<0.01 MW test에 의한 DL 단독 조성물과 비교하여 ip<0.01 |
|||||
도 5에서
간 실질 중 변성부위의 비율은 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 2713.50%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -33.71, -42.54, -35.33, -59.86, -41.87, -40.11, -38.57, -38.05, -72.62, -64.20, -46.46 및 -44.07%의 변화를 나타내었다.
변성 간세포의 수는 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 2975.88%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -33.49, -42.75, -36.91, -61.35, -41.37, -40.53, -38.02, -36.17, -74.63, -65.94, -46.38 및 -46.69%의 변화를 나타내었다.
침윤 염증세포의 수는 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 869.23%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -55.25, -65.81, -60.87, -76.25, -64.47, -62.82, -62.94, -62.33, -83.58, -78.57, -67.03 및 -66.18%의 변화를 나타내었다.
HAI grading score 는 CCl4 대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 3300.00%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -41.18, -51.47, -47.06, -70.59, -52.94, -50.00, -48.53, -47.06, -82.35, -75.00, -55.88 및 -57.35%의 변화를 나타내었다.
화학 유기 용매인 CCl4에 의해 항산화 방어 시스템의 고갈에 따른 간질환이 유발됨에 따라, 현재 간 보호제 개발 및 간 질환의 병인론 연구에 CCl4 유발 간 손상 실험동물이 빈번히 사용되고 있다. 현재까지 간의 생리학적 중요성이 잘 알려짐에 따라, 간 보호 약물의 개발이 계속해서 진행되어 왔으나, 여전히 부작용이 적고, 강력한 간 보호 효과를 나타내는 약물의 개발이 필요한 실정으로, 현재 천연물을 이용한 간 보호 약물의 탐색이 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 발명자 등은 보다 효과적인 천연물 복합 간 기능 개선제 개발의 일환으로, 이미 간 보호 효과가 잘 알려져 있는 다양한 민들레 추출물과 레몬밤 추출물에 대한 간 보호 효과를 가장 일반적인 간 손상 실험동물 모델인 CCl4 유발 급성 간 손상 마우스 모델을 이용하여, 비교 평가한 결과, 실리마린 100 ㎎/㎏ 보다 비교적 우수한 LB 및 DL 200 ㎎/㎏의 항산화 활성을 통한 간 보호 효과를 확인하여, LB과 DL을 간 기능 개선을 위한 천연물 복합 기능성 식품 후보 물질로 선정하였다. 본 발명에서는 간 기능 개선 효과를 나타내는 LB과 DL의 최적 복합 조성 비율을 역시 CCl4 유발 급성 간 손상 마우스 모델을 이용하여, 선정하고자 하였다. 즉, LB 및 DL 단독 조성물, 9 종의 LB 및 DL 복합 조성물 (LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 복합 조성, g:g)을 각각 멸균 증류수에 용해시켜, 10 ㎖/g의 용량 (200 ㎎/㎏)으로 매일 1회씩 7일간 경구투여하고, 마지막 7회 경구투여 1 시간 후 0.5 ㎖/㎏의 CCl4를 단회 복강투여하여 급성 간 손상을 유발하였다. CCl4 투여 24시간 후, 간 육안 부검 소견, 간 중량, 혈중 AST 및 ALT 함량, 간 항산화 방어 시스템 지질 과산화, GSH 함량, SOD 및 CAT 활성 간조직의 조직병리학적 변화와 함께 관찰하였으며, 실험 전 기간인 7일 동안의 체중 및 증체량의 변화 역시 관찰하였다. 조직 병리학적으로 간 손상의 정도를 HAI grading score, 간 실질 중 변성부위의 비율 (%/㎟), 변성 간세포의 수 (cells/1000 간세포 및 침윤 염증세포의 수 (cells/㎟)의 변화를 기초로 평가하였다. 본 실험에서 각각의 LB 및 DL 단독 조성물과 비교하여 동시에 통계학적으로 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 약효 상승을 나타내는 복합 조성물을 시너지 효과를 나타내는 LB:DL 복합 조성물로 간주하였으며, 또한 항산화 효과에 의한 간 보호 효과가 이미 잘 알려져 있는 천연물 유래의 간 보호제인 실리마린 100 ㎎/㎏ 경구 투여군을 대조 약물군으로 이용하여 비교 평가하였다.
본 실험의 결과, 0.5 ㎖/㎏의 CCl4 단회 복강투여에 의해 현저한 체중 및 증체량의 감소, 간 육안 소 결절화 및 비대에 따른 간 중량의 증가, 혈중 AST 및 ALT 함량의 상승, 간 지질 과산화의 증가 및 내인성 항산화제 (GSH)와 항산화 효소 (SOD 및 CAT)의 고갈, 소엽 중심성 괴사에 따른 변형 HAI score의 증가, 즉 전형적인 산화 스트레스에 의한 소엽 중심성 급성 간 손상 소견이 인정되었다. 한편 이러한 CCl4 유발 산화 스트레스성 소엽 중심성 급성 간 손상 소견들이 모든 LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, 9 종의 LB:DL 복합 조성물 - LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 (g/g) 200 ㎎/㎏의 경구투여에 의해, 실리마린 100 ㎎/㎏ 투여군보다 우수한 정도로 일관성 있게 현저히 감소되었으며, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 CCl4에 의한 체중 및 증체량의 감소, 간 육안 소 결절화 및 비대에 따른 간 중량의 증가, 혈중 AST 및 ALT 함량의 상승, 간 지질 과산화의 증가 및 내인성 항산화제 (GSH)와 항산화 효소 (SOD 및 CAT)의 고갈, 소엽 중심성 괴사에 따른 변형 HAI score의 증가에 대한 억제 소견을 동일한 순으로 나타내었다. 따라서 적어도 본 실험의 조건하에서 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 (g/g) 복합 조성은 동일한 순서로 LB 및 DL의 항산화 방어시스템 활성을 통한 간 보호 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 것으로 판단되었으며, 이중 가장 우수한 효과를 나타낸 LB:DL = 2:1 (g/g)복합 조성물은 새로운, 보다 효과적인 천연물 복합 간 기능 개선제 개발로서의 개발 가능성이 특히 높을 것으로 판단되었다.
CCl4
투여에 의한 체중 감소는 CCl4 자체의 독성뿐만 아니라, 간 손상에 따른 이차적인 결과로 알려져 있어, CCl4에 의한 체중 감소 억제는 후보물질의 간 보호 효과를 간접적으로 판단할 수 있는 증거로 이용되어 왔다. 본 실험에 사용한 정상 매체 대조군의 마우스는 동일한 연령의 정상 ICR마우스의 체중 증가 범주 내에서 체중 증가를 각각 나타내었으나, CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 체중의 감소가 CCl4 투여 24시간 후 최종 희생일에 국한되어 인정되었으며, 이와 관련되어 7일간의 증체량 역시 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었다, 한편 실리마린 100 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 체중의 증가가 CCl4 투여 24시간 후 최종 희생일에서 인정되었으며, 7일간의 증체량 역시 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내었다. 특히, LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏과 모든 9 종의 LB:DL 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 실리마린 100 ㎎/㎏ 보다 더 우수한 CCl4에 의한 체중 감소 억제 효과가 인정되었고, LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 증체량의 증가가 동일한 순으로 인정되었다. 이러한 결과는, 적어도 본 실험의 조건하에서 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 (g/g) 복합 조성은 동일한 순서로 LB 및 DL의 CCl4에 의한 체중 감소 억제 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 직접적인 증거로 판단된다.
CCl4 투여 시 간의 육안 결절화 및 비대에 의한 간 중량의 증가가 초래되며, 본 실험의 결과에서도 CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 간 육안 결절화 및 비대에 따른 간 중량의 증가가 각각 인정되었다. 한편 LB 단독 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 간 절대 및 상대 중량의 감소, 국소 결절화를 동반한 간 종대 소견의 현저한 감소를 나타내었고, 특히 LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏과 모든 9 종의 LB:DL 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 실리마린 100 ㎎/㎏ 보다 더 우수한 CCl4에 의한 간 절대 및 상대 중량의 증가, 국소 결절화를 동반한 간 종대 소견의 억제 효과가 인정되었으며, LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 간 절대 및 상대 중량의 감소, 국소 결절화를 동반한 간 종대 소견의 현저한 감소가 동일한 순으로 인정되었다. 이러한 결과는, 적어도 본 실험의 조건하에서 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 (g/g) 복합 조성은 동일한 순서로 LB 및 DL의 CCl4유발 급성 간 손상에 대한 보호 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 간접적인 증거 중 하나로 판단된다.
일반적으로 AST 및 ALT는 간 손상을 판단하는 대표적인 혈액 생화학적 마커로 사용되어 왔으며, CCl4 유발 간 손상 시에도 현저한 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가가 수반되어 왔고, 본 실험의 결과에서도, CCl4 대조군에서 현저한 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가가 각각 인정되었다. 한편 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 혈중 AST 및 ALT 함량의 감소를 나타내었고, 특히 LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏과 모든 9 종의 LB:DL 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 실리마린 100 ㎎/㎏ 보다 더 우수한 CCl4에 의한 혈중 AST 및 ALT 상승 억제 효과가 인정되었으며, LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 혈중 AST 및 ALT 함량의 감소가 동일한 순으로 인정되었다. 이러한 결과는, 적어도 본 실험의 조건하에서 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 (g/g) 복합 조성은 동일한 순서로 LB 및 DL의 CCl4 유발 간 손상에 대한 보호 효과를 더욱 상승적으로 증가시킬 수 있는 또 다른 신뢰할 만한 증거로 판단된다.
다양한 임상 및 실험적 연구를 통해 CCl4에 의한 간 손상의 원인으로 산화 스트레스가 주목 받아 왔으며, 지질 과산화는 세포막의 산화적 파괴를 초래하는 자가촉매적 반응으로, 지질 과산화에 의한 세포막의 파괴는 세포 사멸과 함께 MDA로 대별되는 유독한 반응성 알데히드 대사산물 즉, 자유 라디칼의 형성을 촉진한다. 이렇게 형성된 다양한 반응성산소종(ROS) 들은 지질, 단백질 및 DNA을 포함한 다양한 생물학적 거대분자들의 산화 손상을 초래하고, 산화 스트레스는 또한 체 지방세포에 영향을 미쳐, 체지방량의 감소와 함께 체중의 감소를 동반한다. MDA는 지질 과산화의 최종 산물로, 지질 과산화의 측정 지표로 유용하게 이용되어 왔으며, CCl4 유발 간 손상 실험동물 모델에서도 간 조직 내 현저한 MDA 함량의 증가, 즉 지질 과산화가 초래되고, 본 실험의 결과에서도 CCl4 대조군에서 현저한 MDA 함량이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. GSH는 대표적인 내인성 항산화제의 일종으로 세포 내에서 비교적은 낮은 농도로 ROS를 제거하여 조직의 상해를 제어하는 것으로 알려져 있다. 또한 SOD 역시 내인성 항산화 효소로, 세포의 효소 방어 시스템의 일환으로 작용하며, CAT 역시 유독한 과산화수소(H2O2)를 무해한 물(H2O)로 변환 시키는 대표적인 내인성 항산화 효소이다. 현재 조직 내 항산화 효소인 SOD와 CAT의 활성 저하와 함께 내인성 항산화제인 GSH의 감소는 CCl4에 의해 유발되는 산화 스트레스에 의한 보상 작용의 실패를 의미한다. 본 실험의 결과, CCl4 대조군과 비교하여 현저한 간 지질과산화의 감소와 항산화 방어 시스템의 활성 GSH 함량, SOD 및 CAT 활성의 증가가 LB:DL = 1:2 복합 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서 인정되었고, 특히 LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏과 모든 9 종의 LB:DL 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 실리마린 100 ㎎/㎏ 보다 더 우수한 CCl4에 의한 간 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템의 감소 억제 효과가 인정되었으며, LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 간 지질 과산화의 억제 및 항산화 방어 시스템 활성 증가가 동일한 순으로 인정되었다. 이러한 결과는, 적어도 본 실험의 조건 하에서 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 (g/g) 복합 조성은 동일한 순서로 LB 및 DL의 항산화 활성에 의한 CCl4 유발 간 손상에 대한 보호 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 명확한 증거로 판단된다.
본 실험의 결과 0.5 ㎖/㎏의 CCl4단회 복강투여에 조직병리학적으로 간 세포의 공포화 (지방 소적 침윤) 및 팽대화(ballooning), 염증 세포의 침윤이 소엽 중심성성으로 인정되었으며, 변형 HAI scoring system, 간 변성율, 변성 간세포 수 및 침윤 염증세포 수에 대한 조직형태학적 방법을 이용하여 CCl4에 의한 조직병리학적 간 손상을 다시 한 번 확인하였다. 즉, CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 간 변성율, 변성 간세포 수 및 침윤 염증세포 수의 증가와 이와 관련된 HAI score의 증가가 각각 인정되었으나, LB:DL = 1:8 복합 조성물 200 ㎎/㎏을 포함한 모든 실험물질 투여군에서는 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 CCl4 유발 소엽 중심성 괴사 소견의 감소를 각각 나타내었고, 특히 LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏과 모든 9 종의 LB:DL 복합 조성물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 실리마린 100 ㎎/㎏ 보다 더 우수한 CCl4에 의한 간 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템의 감소 억제 효과가 인정되었으며, LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 간 변성율, 변성 간세포 수 및 간 실질 내 침윤 염증세포 수, HAI score의 감소가 동일한 순으로 인정되었다. 이러한 조직병리학적 결과는, 적어도 본 실험의 조건하에서 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 (g/g) 복합 조성은 동일한 순서로 LB 및 DL의 CCl4 유발 소엽 중심성 괴사에 대한 억제를 더욱 상승적으로 증가시키는 명확한 직접적인 증거로 판단된다.
이상의 결과, 적어도 본 실험의 조건 하에서 CCl4 유발 산화 스트레스성 소엽 중심성 급성 간 손상 소견들 - CCl4에 의한 체중 및 증체량의 감소, 간 육안 소 결절화 및 비대에 따른 간 중량의 증가, 혈중 AST 및 ALT 함량의 상승, 간 지질 과산화의 증가 및 내인성 항산화제 (GSH)와 항산화 효소 (SOD 및 CAT)의 고갈, 소엽 중심성 괴사에 따른 변형 HAI score의 증가가 모든 LB 및 DL 단독 조성물 200 ㎎/㎏, 9 종의 LB:DL 복합 조성물 - LB:DL = 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1 (g/g) 200㎎/㎏의 경구투여에 의해, 실리마린 100 ㎎/㎏ 투여군보다 우수한 정도로 일관성 있게 현저히 감소되었으며, 특히 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 복합 조성물 투여군에서는 각각의 LB 및 DL 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 CCl4
유발 산화 스트레스성
소엽
중심성 급성 간
손상에 대한 억제 소견을
동일한 순으로 나타내었다. 따라서 LB:DL = 2:1, 4:1 및 1:1 (
g
/
g
) 복합 조성은 동일한 순서로 LB 및 DL의 항산화 방어시스템 활성을 통한 간 보호 효과를 더욱 상승적으로 증가시키는 것으로 판단되었으며, 이중 가장 우수한 효과를 나타낸
LB:DL
= 2:1 (
g
/
g
) 복합 조성물은 금후
새로운 보다 효과적인
천연물 복합 간 기능 개선제 개발로서의 개발
가능성이 특히 높을
것으로 기대된다.
제조예
3: 수입
레몬밤
잎 추출물 분말의 제조
국산 레몬밤 잎 대신 수입 (프랑스) 레몬밤 잎을 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일하게 수행하여 갈색 분말로 추출물 분말(LB-F)을 수득하였다.
제조예
4: 민들레
전초
추출물 분말의 제조
국산 민들레 잎 대신 수입 (프랑스) 민들레 잎(DL-F), 수입 (프랑스) 민들레 뿌리(DR-F), 국산 민들레 뿌리(DR-K)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 제조예 2와 동일하게 수행하여 갈색 분말로 추출물 분말들을 수득하였다.
상기 제조예 3 및 제조예 4의 추출물 각각을 실리마린과 비교하여 상기한 실험들을 반복하였다.
즉, 5 종류의 천연물 추출물 (DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F)에 대한 간 보호 효과를 CCl4 유발 급성 간 손상 마우스 모델을 이용하여, 비교 평가하였다. 즉, 5 종류의 천연물 추출물 매일 1회씩 7일간 200 ㎎/㎏ 용량으로 각각 경구투여하고, 마지막 7회 경구투여 1 시간 후 0.5 ㎖/㎏의 CCl4를 단회 복강투여하여 급성 간 손상을 유발하였다. CCl4 투여 24시간 후, 간 육안 부검 소견, 간 중량, 혈중 AST 및 ALT 함량, 간 항산화 방어 시스템 지질 과산화, GSH 함량, SOD 및 CAT 활성간 조직의 조직병리학적 변화와 함께 관찰하였으며, 실험 전 기간인 7일 동안의 체중 및 증체량의 변화 역시 관찰하였다. 조직 병리학적으로 간 손상의 정도를 HAI grading score, 간 실질 중 변성부위의 비율 (%/㎟),변성 간세포의 수 (cells/1000 간세포) 및 침윤 염증세포의 수 (cells/㎟), ABC기반 면역조직화학적 방법을 통한 1000개의 간세포 중 세포자멸사 마커인 개열된 카스파아제-3 및 PARP, 일산화질소(NO) 관련 산화스트레스 마커인 NT 및 지질과산화 마커인 4-HNE 면역반응세포의 수적 변화 (cells/1000 간세포)를 기초로 평가하였으며, 실험결과는 항산화 효과에 의한 간 보호 효과가 이미 잘 알려져 있는 천연물 유래의 간 보호제인 실리마린 100 ㎎/㎏ 경구 투여군과 각각 비교하였다.
84 마리의 SPF/VAF Outbred CrljOri:CD1[ICR] 수컷 마우스 (OrientBio, Seungnam, Korea)를 7일간 순화 후, 실험물질 투여 1일전 측정한 체중 (평균 33.23±1.20 g, 30.40 내지 35.70 g)을 기준으로 군당 10마리씩, 총 8개 군으로 선별하여, 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 실험물질 투여 시작 및 최종 부검일 전 18시간 동안 절식하였다 (이때 음수는 제한하지 않았다).
군 분리 (총 6개군; 군 당 10마리)
정상 매체 대조군: 멸균 증류수 투여 후 올리브유 투여 정상 매체 대조군
CCl4
대조군: 멸균증류수 투여 후, CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 급성 간 손상 매체 대조군
실리마린 100 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏투여 대조약물군
DL-F 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 실험군
DR-F 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 실험군
DL 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 실험군
DR-K 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 실험군
LB-F 200 ㎎/㎏ 및 CCl4 0.5 ㎖/㎏ 투여 실험군
1. 체중의 변화
CCl4
대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중의 감소가 CCl4 투여 24시간 후 최종 희생일에 국한되어 인정되었으며, 이와 관련되어 7일간의 증체량 역시 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었다. 한편 LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 CCl4 투여 24시간 후 최종 희생일에서 인정되었으며, 7일간의 증체량 역시 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었다.
실험 전 기간인 7일 동안의 증체량은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 -66.34%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 192.31, 213.46, 175.96, 156.73, 164.42 및 248.08%의 변화를 나타내었다.
2. 간 육안 부검 소견 및 중량의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 국소 결절화(nodule formation) 를 동반한 간 종대 소견을 나타내어, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 절대 및 상대 간 중량의 증가가 각각 인정되었다. 한편 LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DL 및 DR-K 순으로 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 절대 및 상대 중량의 감소, 국소 결절화를 동반한 간 종대 소견의 현저한 감소가 각각 인정되었다.
간 절대 중량은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 48.89%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4
대조군에 비해 -14.02, -15.71, -11.63, -8.79, -6.83 및 -18.10%의 변화를 나타내었다.
간 상대 중량은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 61.36%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4
대조군에 비해 -19.37, -21.59, -16.29, -13.30, -12.04 및 -24.80%의 변화를 나타내었다.
3. 혈중
AST
및 ALT 함량의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가가 각각 인정되었다. 한편 LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 AST 및 ALT 함량의 감소가 각각 인정되었다.
혈중 AST 함량은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 341.72%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4
대조군에 비해 -37.64, -41.11, -31.63, -23.65, -28.68 및 -46.25%의 변화를 나타내었다.
혈중 ALT 함량은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 575.38%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4
대조군에 비해 -32.21, -41.37, -25.06, -17.18, -20.50 및 -51.58%의 변화를 나타내었다.
4. 간 조직 내 지질 과산화의 변화
CCl4 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 MDA 함량의 증가, 즉 지질과산화의 증가가 인정되었으나, LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 MDA 함량의 감소가 각각 인정되었다.
간 조직 내 지질과산화는 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 453.65%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -30.22, -35.80, -26.16, -18.70, -22.78 및 -46.13%의 변화를 나타내었다.
5. 간 조직 내
GSH
함량의 변화
CCl4
대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 내인성 상산화제인 GSH 함량의 감소가 인정되었으나, LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 GSH 함량의 증가 각각 인정되었다.
간 조직 내 GSH 함량은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 -92.38%의 변화를 나타내었으나, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 466.49, 608.69, 417.64, 212.72, 295.18 및 826.33%의 변화를 나타내었다.
6. 간 조직 내 CAT 활성의 변화
CCl4
대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 내인성 항산화 효소인 CAT 활성의 감소가 인정되었으나, LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 CAT 활성의 증가 각각 인정되었다.
간 조직 내 CAT 활성은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 -81.72%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 192.51, 226.54, 149.81, 82.26, 137.10 및 259.00%의 변화를 나타내었다.
7. 간 조직 내 SOD 활성의 변화
CCl4
대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 내인성 항산화 효소인 SOD 활성의 감소가 인정되었으나, LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 조직 내 SOD 활성의 증가 각각 인정되었다.
간 조직 내 SOD 활성은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 -85.83%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 206.34, 241.01, 174.59, 81.19, 103.50 및 308.91%의 변화를 나타내었다.
8. 조직병리학적 변화
CCl4
대조군에서는 간세포의 공포화, 간 세포내 지방소적의 축적 및 염증세포 침윤과 같은 소엽 중심성 괴사 소견이 관찰되어, 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 변성율, 변성 간세포 수 및 침윤 염증세포 수의 증가와 이와 관련된 HAI score의 증가가 각각 인정되었으나, 이러한 CCl4 유발 소엽 중심성 괴사 소견이 LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 (p<0.01 또는 p<0.05) 유의성 있게 억제 되었다.
간 실질 중 변성부위의 비율은 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 3455.34%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -37.30, -42.03, -33.71, -17.43, -25.53 및 -53.32%의 변화를 나타내었다.
변성 간세포의 수는 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 3562.39%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -33.61, -42.41, -33.97, -16.26, -23.25 및 -53.62%의 변화를 나타내었다.
침윤 염증세포의 수는 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 703.17%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -71.50, -73.04, -62.29, -38.70, -53.64 및 -76.88%의 변화를 나타내었다.
HAI grading score는 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 2866.67%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -49.44, -52.81, -41.57, -29.21, -34.83 및 -61.80%의 변화를 나타내었다.
9. 면역조직화학적 관찰
CCl4
대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 세포자멸사 마커인 개열된 카스파아제-3 및 PARP, NO 관련 산화스트레스 마커인 NT, 지질과산화 마커인 4-HNE 면역반응 간세포의 수적 증가가 인정되었으나, LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 CCl4 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 개열된 카스파아제-3, PARP, NT, 4-HNE 면역반응 간세포의 수적 감소가 각각 인정 되었다.
간 조직 내 카스파아제-3 면역반응세포의 수는 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 62808.33%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -48.11, -56.05, -41.01, -33.10, -38.89 및 -66.53%의 변화를 나타내었다.
간 조직 내 PARP 면역반응세포의 수는 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 15169.39%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -61.51, -62.51, -37.02, -20.78, -31.30 및 -68.02%의 변화를 나타내었다.
간 조직 내 NT 면역반응세포의 수는 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 2462.89%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -55.70, -59.01, -37.02, -19.87, -27.57 및 -65.70%의 변화를 나타내었다.
간 조직 내 4-HNE 면역반응세포의 수는 CCl4
대조군에서 정상 매체 대조군에 비해 4765.16%의 변화를 나타내었으며, 실리마린 100 ㎎/㎏, DL-F, DR-F, DL, DR-K 및 LB-F 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 각각 CCl4 대조군에 비해 -40.51, -42.43, -37.00, -18.51, -27.34 및 -68.59%의 변화를 나타내었다.
본 실험의 결과, 0.5 ㎖/㎏의 CCl4 단회 복강투여에 의해 현저한 체중 및 증체량의 감소, 간 육안 소 결절화 및 비대에 따른 간 중량의 증가, 혈중 AST 및 ALT 함량의 상승, 간 지질 과산화의 증가 및 내인성 항산화제(GSH)와 항산화효소(SOD 및 CAT)의 고갈, 소엽 중심성 괴사에 따른 변형 HAI score의 증가, 세포자멸사 마커인 개열된 카스파아제-3 및 PARP, NO 관련 산화스트레스 마커인 NT, 지질과산화 마커인 4-HNE 면역반응세포의 수적 증가, 즉 전형적인 산화 스트레스에 의한 소엽 중심성 급성 간 손상 소견이 인정되었다. 한편 이러한 CCl4 유발 산화 스트레스성 소엽 중심성 급성 간 손상 소견들이 LB-F, DL-F, 실리마린, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 일관성 있게 현저히 감소되었다. 따라서 적어도 본 실험의 조건 하에서 LB-F, LB-F, DL-F, DR-F, DR-K 및 DL 순으로 항산화 방어시스템의 활성을 통해 CCl4
유발 급성 간 손상에 매우 우수한 보호 효과를 나타내는 것으로 관찰되었으며, 특히 LB-F와 DL-F 200 ㎎/㎏은 실리마린 100 ㎎/㎏보다 우수한 간 보호 효과를 CCl4 유발 급성 간 손상 마우스 모델에서 나타내는 것으로 관찰되어, LB-F와 DL-F가 보다 효과적인 천연물 복합 간 기능 개선제 개발을 위한 후보물질로 적당할 것으로 판단된다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
(도면 부호 없음)
Claims (9)
- 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 간기능 개선 효능을 갖는 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 민들레 추출물이 물, 메탄올, 에탄올 및 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 극성용매로 민들레 전초를 추출한 것임을 특징으로 하는 간기능 개선 효능을 갖는 조성물. - 제 2 항에 있어서,
상기 민들레 추출물이 민들레의 잎을 추출한 것임을 특징으로 하는 간기능 개선 효능을 갖는 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 레몬밤 추출물이 물, 메탄올, 에탄올 및 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 극성용매로 레몬밤 전초를 추출한 것임을 특징으로 하는 간기능 개선 효능을 갖는 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 레몬밤 추출물이 물, 메탄올, 에탄올 및 이들 중 2종 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 극성용매로 레몬밤 잎을 추출한 것임을 특징으로 하는 간기능 개선 효능을 갖는 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 중량비로 민들레 추출물 : 레몬밤 추출물을 1 : 8 내지 8 : 1로 혼합된 것임을 특징으로 하는 간기능 개선 효능을 갖는 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 민들레 추출물 및 레몬밤 추출물을 중량비로 민들레 추출물 : 레몬밤 추출물을 1 : 1 내지 4로 혼합된 것임을 특징으로 하는 간기능 개선 효능을 갖는 조성물. - 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 간기능 개선 효능을 갖는 의약품.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 간기능 개선 효능을 갖는 식품.
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