KR20190005037A

KR20190005037A - 이황화 결합으로 가교된 환원 응답성 지질 나노구조체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20190005037A
Application number: KR1020170085566A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 장홍; 김진아
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2017-07-05
Publication date: 2019-01-15
Also published as: KR102009722B1

Abstract

본 발명은 내부 수상채널에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 외부 환원조건에 감응하여 지질 나노구조체 내에 함유하고 있는 유효성분의 방출 제어를 용이하게 할 수 있는 특징이 있다.

Description

이황화 결합으로 가교된 환원 응답성 지질 나노구조체 및 그 제조방법{Reduction-responsive Lipid Nanostructures Crosslinked by Disulfide Linkage and Methods Thereof}

본 발명은 환원 응답성을 가진 지질 나노구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상세하게는, 지질 나노구조체의 내부 수상채널에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 것으로, 환원 환경에 감응하여 지질 나노구조체 내 함유하고 있는 유효성분의 방출 제어를 용이하게 할 수 있는 환원 응답성 지질 나노구조체, 지질 나노구조체의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

지질 분자는 생체에서 유래된 특징으로 인해 높은 생체적합성을 가지고 있으며, 분자의 양친매성 특성으로 인해 기타 소재 대비 비교적 간단한 제조공정을 통해 나노구조체(nanostructures)를 형성할 수 있는 장점이 있다. 상기 지질 나노구조체는 HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) 및 팩킹 파라미터(packing parameter) 등의 분자적 성질로부터 라멜라 구조, 실린더 구조, 마이셀 구조 등 다양한 형태의 나노구조가 형성될 수 있다.

모노올레인(Monoolein, MO)은 팩킹 파라미터가 1보다 조금 큰 값을 지닌 양친매성 지질 분자(amphiphiles)로서 수상에서 나노구조체를 형성한다 [Kulkarni, C. V. et al. Physical Chemistry Chemical Physics 2011, 13(8), 3004-3021.]. 나노구조체는 모노올레인 이중층과 그 이중층으로 둘러 싸여져 있는 수상 채널을 포함하고 있으며, 상기 수상 채널의 지름은 약 2-3 nm를 형성하고 있다.

모노올레인 나노구조체는 투명하고 광학적으로 등방성 (optically isotropic)이다. 모노올레인 나노구조체에서 물이 차지하는 비율은 28% 내지 40%이다. 모노올레인 나노구조체는 수상채널과 지질 매트릭스를 포함하고 있기 때문에, 수용성 유효성분과 지용성 유효성분을 모두 함유할 수 있는 장점이 있다.

선행기술에서는 모노올레인 나노구조체의 수상채널에 알지네이트(Alginate)와 실크 피브로인(silk fibroin)을 포함시킴으로써 pH 응답성 나노구조체를 개발한 바 있다.(Kwon, T. K. et al. Biomacromolecules 2010, 12(2), 466-471.) 상기 선행기술에서는 pH값이 실크피브로인 등전점보다 낮을 때는 실크피브로인은 알지네이트와 콤플렉스 코아서베이트(complex coacervate)를 형성하여 용질이 수상채널에서 확산하는 것을 저해한다. 반면 pH값이 피브로인의 등전점 보다 높게 증가하면, 코아서베이트가 용해되어 사라지고 용질의 확산이 촉진되게 된다.

다른 선행기술에서는 모노올레인 나노구조체의 수상채널에 LCST 및 UCST를 가진 열 민감성 고분자를 함유시킴으로써 온도 응답성 나노구조체를 개발한 바 있다.(Zhang, H. et al. Journal of Industrial and Engineering Chemistry 2016, 36, 215-223.) 온도가 상전이 온도(LCST 및 UCST)이상으로 증가하거나 이하로 감소할 때 고분자의 용해도가 변하기 때문에 용질의 확산도(diffusivity)가 변하게 된다.

지질 나노구조체를 이용한 용질의 확산을 조절하는 선행기술로는 앞서와 같이 pH나 온도에 감응하여 용질의 확산속도를 조절하는 것이었으나, 지질 나노구조체를 유효성분 전달체로 효과적으로 사용하기 위해서는 다양한 환경에 감응할 수 있는 기능의 개발이 필요한 실정이다.

특히, 나노구조체의 외부 환경, 즉 산화 또는 환원 환경에 감응하여 용질의 방출속도를 조절할 수 있는 기술개발이 필요하지만 현재까지 지질 나노구조체를 이용하여 산화 또는 환원 환경에 감응하여 용질을 방출할 수 있는 전달체의 기술은 개발되지 못했다.

Kwon, T. K. et al. Biomacromolecules 2010, 12(2), pp. 466-471 Zhang, H. et al. Journal of Industrial and Engineering Chemistry 2016, 36, pp. 215-223.

본 발명의 목적은 환원 환경에 감응할 수 있는 지질 나노구조체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 수상채널에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 구조를 포함하는 지질 나노구조체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 환원 환경에 감응할 수 있는 유효성분 전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 지질 나노구조체를 이용하여 환원제 또는 pH의 감응에 따라 내부 수상채널 밖으로 방출되는 유효성분의 양을 조절하는 것을 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 소수성으로 개질된 이온성 고분자, 상기 이온성 고분자와 반대 전하를 가진 이온성 이황화물 및 모노올레인으로부터 지질 나노구조체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 지질 나노구조체는 내부 수상채널에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체에 있어, 지질 나노구조체에 포함되는 지질은 모노올레인 큐빅상을 포함하는 지질 나노구조체일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체에 있어, 지질 나노구조체에 포함되는 이온성 고분자는 소수성으로 개질된 것을 포함하는 지질 나노구조체일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체에 있어, 지질 나노구조체에 포함되는 이황화 결합은 이온성 고분자와 정전기적으로 결합된 2 이상의 연결기 사이에 개재되는 것을 포함하는 지질 나노구조체일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체에 있어, 지질 나노구조체에 포함되는 이황화 결합은 하나의 분자 내에 이온기를 2개 이상 포함하고 이황화 결합을 포함하는 화합물을 통해 형성되며, 상기 화합물의 이온기와 이온성 고분자의 이온기는 서로 반대 전하를 가진 것을 포함하는 지질 나노구조체일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체에 있어, 지질 나노구조체는 환원제 또는 pH에 감응하여 내부 수상채널 밖으로 방출되는 유효성분을 포함하는 지질 나노구조체일 수 있다.

본 발명은 상술한 지질나노구체를 포함하는 유효성분 전달체를 포함한다.

본 발명에 따른 유효성분의 방출방법은, 내부 수상채널에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 지질 나노구조체를 이용하여 환원제 또는 pH의 감응에 따라 내부 수상채널 밖으로 방출되는 유효성분의 양을 조절하는 환원 응답성 유효물질의 방출방법을 포함한다.

본 발명에 따른 지질 나노구조체의 제조방법은, 소수성으로 개질된 이온성 고분자 및 상기 이온성 고분자와 반대 전하를 가진 이온성 이황화물을 포함하는 고분자 수용액을 제조하는 단계; 및 상기 고분자 수용액을 모노올레인 용액에 첨가하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체의 제조방법에 있어, 모노올레인 용액은 모노올레인을 30 내지 70℃에서 가열하여 용융된 것을 포함하는 제조방법일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체의 제조방법에 있어, 상기 고분자 수용액은 유효성분을 더 포함하는 제조방법일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체의 제조방법에 있어, 모노올레인 100 중량부에 대하여, 상기 이온성 고분자 및 상기 이온성 이황화물이 각각 0.01 내지 10 중량부 포함되는 제조방법일 수 있다.

본 발명에 따른 지질 나노구조체는 내부 수상채널에 함유된 용질의 방출 제어가 용이한 장점을 가진다.

또한, 본 발명에 따른 지질 나노구조체는 외부 환경, 즉 산화 또는 환원 환경에 감응하여 용질의 방출속도를 제어할 수 있으며, 상세하게는 환원제 또는 pH 변화에 감응하여 환원적 환경 하에서는 용질의 확산속도를 증가시킬 수 있고, 산화 환경에서는 용질의 확산속도를 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 지질 나노구조체는 이온성 고분자를 내부 수상채널에 고정화하고 반대 전하를 가지고 있는 이온성 이황화물에 의해 가교됨으로써, 이온성 고분자가 포함되지 않은 지질 나노구조체에 비하여 향상된 구조 안정성을 가질 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 지질 나노구조체의 제조방법은 10 nm 이하의 수상채널이 내부에 존재하는 나노구조체를 간단한 제조공정을 통해 제공할 수 있다.

도 1은 환원 응답성 모노올레인 나노구조체(reduction-responsive monoolein nanostructure)의 모식도를 나타낸 것이다. (A)는 가교제(DTPA)에 의한 HmPEI의 가교 때문에 수상채널을 통한 용질의 확산도가 낮은 경우를 나타내며, (B)는 나노 구조체가 환원적 환경에 노출되는 경우 가교제(DTPA)가 환원되어 파괴되고 수상패널을 통한 용질의 확산도가 증가하여 방출이 촉진되는 경우를 나타낸다.
도 2에서 (A)는 HmPEI(1:2)의 ¹H NMR 스펙트럼이고, (B)는 HmPEI(1:5)의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 3에서 (A)는 MONS(0/0)입자의 TEM사진이고, (B)는 MONS(2/2)입자의 TEM사진이고, (C)는 MONS(10/10)입자의 TEM사진이고, (D)는 MONS(20/20)입자의 TEM사진이다.
도 4에는 MONS(0/0)입자로부터의 auramine O의 방출율을 나타낸 그래프이다. ●는 DTT 농도가 0 mM일 때, ○는 DTT 농도가 1 mM일 때, ▼는 DTT 농도가 10 mM 일 때이다.
도 5는 MONS(2/2)입자로부터의 auramine O의 방출율을 나타낸 그래프이다. ●는 DTT 농도가 0 mM일 때, ○는 DTT 농도가 1 mM일 때, ▼는 DTT 농도가 10 mM 일 때이다.
도 6은 MONS(10/10)입자로부터의 auramine O의 방출율을 나타낸 그래프이다. ●는 DTT 농도가 0 mM일 때, ○는 DTT 농도가 1 mM일 때, ▼는 DTT 농도가 10 mM 일 때이다.
도 7은 MONS(20/20)입자로부터의 auramine O의 방출율을 나타낸 그래프이다. (A), (B), (C) 및 (D)에서 ●는 DTT 농도가 0 mM일 때, ○는 DTT 농도가 1 mM일 때, ▼는 DTT 농도가 10 mM 일 때이다.

이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명의 지질 나노구조체, 이의 제조방법 및 이의 용도를 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다. 이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 발명에서 별다른 정의가 없는 한 ‘모노올레인’은 팩킹 파라미터(packing parameter)가 1보다 조금 큰 글리세롤 모노올레이트(glycerol monooleate; monoolein; 1-oleoyl-rac-glycerol)을 의미한다.

본 발명에서 별다른 정의가 없는 한 ‘큐빅상’은 상기 모노올레인이 수상에서 등방성 구조를 갖는 것을 의미한다. 상기 큐빅상은 광학적으로 투명하고, 지질 매트릭스 내에 상호 가로지르는 수상채널을 가지는 것을 의미할 수 있다. 상기 수상채널은 모노올레인의 이중층에 의해 분리되며, 수상채널 내에 수용성 화합물을 포함할 수 있다. 상기 수상채널은 비한정적으로 직경이 10 nm 이하일 수 있으며, 구체적으로는 2 nm 내지 7nm인 것일 수 있으나, 수상채널의 직경은 수상의 환경에 따라 변화할 수 있는 것이므로 상기 직경에 제한되지 않는다.

본 발명에서 별다른 정의가 없는 한 용질은 지질 나노구조체의 골격을 형성하는 물질을 제외한 물질을 의미하는 것으로, 매질에 용해성을 가지는 단분자 화합물, 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 상기 용질은 ‘유효성분’ 또는 ‘생리활성성분’과 동등한 의미를 가질 수 있으며, 비한정적으로 수용성 단분자 화합물, 수용성 펩티드 또는 수용성 단백질이 예시될 수 있다.

본 발명에서 별다른 정의가 없는 한, ‘고정화’는 이온성 고분자가 지질 나노구조체의 수상채널의 외층에 물리적 인력 또는 반데르발스 힘을 통해 결합된 것을 의미할 수 있으며, 상기 결합을 유도하기 위해 일례로 이온성 고분자는 소수성으로 개질된 것일 수 있다. 비한정적으로, 이온성 고분자가 소수성으로 개질되는 것은 이온성 고분자의 백본(backbone)에 곁가지(branch)의 형태로 소수성 치환기가 결합되는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 발명자는 수상채널을 가지는 큐빅상에 포집된 유효성분을 내부의 수상채널 밖으로 방출함에 있어서, 상기 유효성분이 단시간 내 방출되어 성능이 저하되거나 효과 지속성을 확보할 수 없는 문제점을 인식하고, 장시간 동안 유효성분을 방출하고 동시에 산화 및 환원 환경을 감응하여 유효성분의 방출량 및 방출속도를 제어할 수 있는 지질 나노구조체에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, 지질 나노구조체 내의 내부 수상채널에 이온성 고분자를 고정화시키고, 상기 이온성 고분자를 이황화 결합으로 가교시킴으로써 상기 지질 나노구조체가 산화 및 환원 환경에 감응하여 유효성분의 방출량 및 방출속도를 제어할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명에 따른 지질 나노구조체에 대해 상술한다.

본 발명의 지질 나노구조체는 내부에 수상채널을 포함하고 있으며, 상기 수상채널은 비한정적으로 직경이 10 nm 이하일 수 있으며, 구체적으로는 2 nm 내지 7nm인 것일 수 있으나, 수상채널의 직경은 수상의 환경에 따라 변화할 수 있는 것이므로 상기 직경에 제한되지 않는다.

상기 지질 나노구조체의 지질 분자는 바람직하게 모노올레인일 수 있으며, 팩킹 파라미터가 약 1을 충족하는 지질분자라면 특정 분자에 제한받지는 않는다.

상기 이온성 고분자는 지질 나노구조체 내부에 존재하는 수상채널에 위치할 수 있고, 수상채널의 외층에 고정화된 형태로 존재한다. 이온성 고분자의 전하는 양이온성(positive) 또는 음이온성(negative) 전하를 가질 수 있으며, 바람직하게는 양이온성 전하를 가진 양이온성 고분자일 수 있다.

상기 이온성 고분자의 비한정적인 일례로, 음이온성 고분자의 경우 잔기로서, 카르복실산기, 설폰산기, 포스페이트기 및 그의 염에서 선택되는 음이온성 잔기를 반복단위 내에 포함하는 중합체일 수 있으며, 비한정적인 일례로 알지네이트(Alginate), 히알루론산(Hyarulonic acid), 폴리글루타믹산(Polyglutamic acid), (메트)아크릴산계 중합체, 폴리(스티렌 설포네이트)계 중합체, 폴리(이소프로페닐 포스페이트)계 중합체 및 그의 공중합체일 수 있다.

양이온성 고분자의 경우 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, 4차 아민 및 그의 염에서 선택되는 양이온성 잔기를 반복단위 내에 포함하는 중합체일 수 있으며, 비한정적인 일례로 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine), 폴리라이신(Polylysine), 폴리아르기닌(Polyarginine), 폴리히스티딘(Polyhistidine), 키토산(chitosan) 및 그 유도체 또는 공중합체에서 선택될 수 있다.

상기 이온성 고분자의 중량평균분자량은 비한정적으로 400 내지 100,000g/mol일 수 있으며, 바람직하게는 1,000 내지 50,000g/mol일 수 있다. 상기 범위를 만족하는 경우, 지질 분자와 균질하게 혼합될 수 있으며, 나노구조체의 수상채널의 외층에 안정되게 고정화될 수 있으며, 추가적인 가교 구조의 형성에 의해 유효성분의 방출 제어 성능 구현에 유리할 수 있으나 이는 비한정적인 일예일 뿐 상기 수치범위에 제한받지 않는다.

상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 것이며, 내부 수상채널의 외층에 고정화된 이온성 고분자가 가교됨에 따라 용질의 확산을 효과적으로 저해할 수 있다. 상세하게, 이황화 결합으로 가교되지 않은 이온성 고분자의 경우 지질 나노구조체의 내부 수상채널을 통해 빠르게 용질이 외부로 확산되는 반면, 가교된 이온상 고분자의 경우 확산 저항을 발생시켜 용질의 확산량 및 확산속도가 낮아져 용질의 서방성을 달성할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 지질 나노구조체에 있어, 지질 나노구조체에 포함되는 지질은 모노올레인 큐빅상을 포함하는 지질 나노구조체일 수 있다. 모노올레인은 팩킹 파라미터가 약 1을 가지는 지질분자로서 물과 용융 혼합시 자기조립을 통해 안정한 큐빅상을 형성할 수 있다.

상기 이온성 고분자의 소수성 개질은 이온성 고분자의 백본(backbone)에 곁가지(branch)의 형태로 소수성 치환기가 결합되는 것을 의미할 수 있다. 바람직하게는 아실할로겐 화합물을 사용하는 것일 수 있으며, 상기 아실할로겐 화합물은 지방족 아실할로겐 화합물일 수 있다. 구체적으로, C5~C18 아실할로겐일 수 있으며, 비한정적인 일예로 펜타노일클로라이드, 헥사노일클로라이드, 헵타노일클로라이드, 옥타노일클로라이드, 노나노일클로라이드 및 데카노일클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 아실할로겐화합물이 이온성 고분자와 반응함으로써 공유결합되면서 아실화가 될 수 있으며, 최종적으로 이온성 고분자의 반응성 잔기의 일부가 소수기로 치환된 이온성 고분자를 얻을 수 있다.

상기 이온성 고분자를 소수성으로 개질하는 방법으로는, 구체적으로, 이온성 고분자를 비양자성 유기용매(aprotic solvent)에 투입하고 아실할로겐 화합물을 서서히 첨가하는 단계를 통하여 반응 생성물을 얻을 수 있다. 상기 반응은 6 시간 내지 24 시간 동안 얼음 욕조(ice bath)에서 수행될 수 있으며, 반응 종류 후 상기 반응 생성물을 비용매에 투입하여 침전된 생성물을 공지의 수단을 통해 분리 및 정제하여 최종 생성물을 얻을 수 있다. 상기 비양자성 용매는 바람직하게는 디클로로메탄, 클로르포름 등에서 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 이온성 고분자의 반복단위중 소수기가 치환된 반복단위의 몰분율은 0.2 몰% 내지 50 몰%일 수 있으며, 바람직하게는 1 몰% 내지 20 몰%일 수 있다. 상기 수치범위 이하에서는 이온성 고분자가 내부 수상채널의 외층에 안정적으로 결합하지 않을 수 있으며, 상기 수치범위 이상에서는 치환된 소수기 사이의 소수성 상호작용이 더 가속화되어 내부 수상채널에 고정화되기보다는 이온성 고분자가 마이셀화되는 것이 더 선호되어 바람직하지 않을 수 있다. 상기 수치범위 내에서 이온성 고분자가 내부 수상채널에 안정적으로 고정화될 수 있어 가장 바람직하다.

본 발명의 비한정적인 일예로, 양이온성 고분자로 폴리에틸렌이민이 사용되고 헥사노일클로라이드과 반응할 경우, 소수성 개질된 이온성 고분자는 폴리에틸렌이민의 반복단위에 존재하는 2차아민기의 질소 원자에 헥사노일기가 아미드 결합을 통해 결합되어, 최종적으로 헥실기가 아미드 결합을 통해 반복단위 내의 질소원자에 결합됨으로써, 소수성으로 개질된 폴리에틸렌이민이 제조될 수 있다.

상기 소수성으로 개질된 이온성 고분자는 소수성 상호작용에 의해 소수기는 내부 수상채널을 형성하는 지질 분자의 소수성 이중층 내에 위치하고, 이온성 고분자 백본은 내부 수상채널에 위치하는 형태를 가짐으로써 이온성 고분자가 안정되게 내부 수상채널에 고정화될 수 있도록 작용할 수 있다.

상기 이황화 결합은 이온성 고분자를 가교시키는 연결기로서 작용하되, 이황화 결합을 포함하면서 이온성 고분자와 직접적으로 결합되는 관능기는 상기 이온성 고분자의 전하와 반대 전하를 가진 관능기일 수 있다. 상기 결합은 반대 전하를 가진 이온기 사이에서 발생하는 정전기적 상호작용에 의한 것이다. 이황화 결합을 연결기로서 중간에 개재하고 이온성 고분자를 가교하기 위해서는 이온성 고분자와 정전기적으로 결합된 연결기가 2 이상이어야 하며, 비한정적으로 2 이상 6 이하일 수 있으나, 이는 예시적인 범위일 뿐 이에 제한받지 않는다.

상기 고분자 용액에서 이온성 이황화물의 이온성 기와 소수성으로 개질된 이온성 고분자의 이온성 기의 몰비는 1:0.25 내지 1:10일 수 있으며, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:8, 가장 바람직하게는 1:1 내지 1:4일 수 있다.

상기 수치범위보다 낮은 비율에서는 이온성 이황화물의 양이 상대적으로 많아서 잉여 이온성 이황화물이 이온성 고분자에 결합되지 않고 자유분자(free molecule)로 존재하게 되며, 상기 수치범위보다 높은 비율에서는 이온성 이황화물의 양이 상대적으로 적어서 이온성 고분자의 가교반응이 효과적이지 않을 수 있다.

상기 하나의 분자 내에 이온기를 2개 이상 포함하고 이황화 결합을 포함하는 화합물은 상기 이온기를 2개 이상 6개 이하 일 수 있으나, 이는 예시적인 범위일 뿐 이에 제한받지 않는다. 상기 이온기의 전하는 이온성 고분자의 전하와 반대 전하를 가진 것이다. 상기 화합물의 비한정적인 일례로, 시스타민(cystamine), 디티오프로피온산(dithioproionic acid; DTPA), 디티오글리콜산(dithiodiglycolic acid; DTGA), 3-아미노페닐 디설파이드(4-Aminophenyl disulfide) 등에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한받지 않는다.

본 발명의 지질 나노구조체는 환원 응답성 지질 나노구조체로서, 비환원적 환경에서는 용질을 적게 방출하고 환원적 환경에서는 용질을 많이 방출하는 특징을 가지고 있다. 본 발명의 일예로, 환원제의 첨가 시 이황화결합은 환원 환경에 노출됨에 따라 티올기(-SH)로 환원될 수 있으며, 결과적으로 가교구조(-S-S-)가 파괴될 수 있다. 또한 용액의 pH를 중성 내지 염기 영역으로 조절함에 따라 마찬가지로 티올기로 환원되어 가교구조가 파괴될 수 있으며, 비한정적인 일 예로 pH는 8 이상일 수 있다.

상기 환원제는 이황화결합을 환원시킬 수 있는 화합물이라면 제한받지 않으며, 화합물 내에 티올기를 포함하는 C1~C10 지방족 티올계 화합물일 수 있다. 치환 또는 비치환 C1~C10 지방족 티올계 화합물의 비한정적인 일 예로, 머캡토에탄올(mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 2-머캡토에틸아민(2-Mercaptoethylamine-HCl), 시스테인(cystein) 및 이의 염에서 선택될 수 있으나 이에 제한받지 않는다.

본 발명은 상술한 지질 나노구조체를 포함하는 유효성분 전달체를 포함하며, 또한 본 발명에 따른 유효성분의 방출방법은, 내부 수상채널에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 지질 나노구조체를 이용하여 환원제 또는 pH의 감응에 따라 내부 수상채널 밖으로 방출되는 유효성분의 양을 조절하는 환원 응답성 유효물질의 방출방법을 포함한다.

본 발명의 유효성분 전달체는 지질 나노구조체의 내부 수상채널 내에 용질을 포함할 수 있으며, 상기 용질은 유효성분 또는 생리활성성분일 수 있다. 상기 유효성분으로는 비한정적인 일예로 항암제, 항생제, 항진균제, 항박테리아제, 항산화제, 미백제, 소염제, 혈당강하제 등 다양한 생리활성 성분을 포함할 수 있으며, 이는 일예일 뿐 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 내부 수상채널 내에 용질을 포함함에 따라 유효성분 전달체로 사용될 수 있으며, 바람직하게는, 본 발명의 지질 나노구조체의 내부 수상채널 내에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자가 이황화 결합으로 가교됨에 따라 내부 수상채널로부터 외부의 매질 방향으로 느린 용질 확산속도를 구현할 수 있는 장점이 있다. 나아가 비환원적 환경에서는 이황화 결합으로 가교된 내부 수상채널 구조에 의해 낮은 용질 방출량 또는 낮은 확산속도를 나타내며, 환원적 환경에서는 가교구조가 파괴됨에 따라 높은 용질 방출량 또는 높은 확산속도를 나타냄으로써, 용질의 방출 속도 및 방출량을 제어할 수 있는 장점을 가진다.

상기 지질 나노구조체의 제조방법에서, 모노올레인 100 중량부에 대하여 소수성으로 개질된 이온성 고분자 및 상기 이온성 이황화물은 각각 0.01 내지 10 중량부, 바람직하게는 각각 0.05 내지 2 중량부 포함되어 혼합될 수 있다. 상기 범위를 만족하는 경우 유효성분의 방출 제어 성능을 구현하는데 효과적일 수 있다.

상기 고분자 수용액은 소수성으로 개질된 이온성 고분자; 및 상기 이온성 고분자와 반대 전하를 가진 이온성 이황화물을 포함하는 수용액이며, 상기 수용액은 물 또는 버퍼 용액일 수 있다. 상기 버퍼 용액은 비한정적인 일예로, 포스페이트 버퍼(Phosphate buffer system; PBS)일 수 있고, 농도는 0.1 내지 100 mM이며 좋게는 1 내지 20 mM일 수 있다. 버퍼의 pH는 중성 영역이 바람직하며, 비한정적인 일예로 6.5 내지 7.5일 수 있다.

이온성 이황화물과 소수성으로 개질된 이온성 고분자의 혼합 수용액에서 이온성 이황화물과 이온성 고분자의 농도의 합은 0.1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.2 중량% 내지 10 중량%, 가장 바람직하게는 0.3 중량% 내지 5 중량%이다. 상기 수치범위보다 낮은 농도에서는 가교밀도가 너무 낮아서 이황화물의 환원여부에 상관없이 수상채널을 통한 용질의 확산도가 거의 일정하기 때문에 환원 응답성 방출을 기대하기 어렵고 높은 방출속도를 나타내게 된다. 한편 상기 수치범위보다 높은 농도에서는 용해도 한계로 인하여 이온성 이황화물과 소수성으로 개질된 이온성 고분자가 수상에 용해하기 어렵고 또는 용해된다고 하더라도 점도가 너무 높아 모노올레인 용융액을 수화하기 어려운 문제점이 있다. 상기 0.3 중량% 내지 5 중량%의 농도 범위에서는 제조단계에서 적절한 점도를 유지하여 모노올레인 용융액을 효과적으로 수화할 수 있을 뿐만 아니라 환원 응답성 방출 제어효과를 나타낼 수 있어 바람직하다.

상기 모노올레인 용액은 모노올레인을 30 내지 70℃에서 가열하여 용융된 것을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 50 내지 60℃에서 가열하여 용융된 것일 수 있고, 선택적으로 물 등의 용매를 더 포함할 수 있다.

상기에서 제조된 모노올레인 용액에 상기 이온성 이황화물과 상기 이온성 고분자를 포함하는 고분자 수용액을 첨가하여 혼합시키는 수화하는 단계를 포함한다.

상기 고분자 수용액으로 모노올레인 용융액을 수화 또는 혼합시키는 단계에서, 상기 고분자 수용액과 모노올레인의 중량비는 2:8 내지 6:4, 바람직하게는 2.5:7.5 내지 5:5, 가장 바람직하게는 3:7 내지 4:6일 수 있다. 상기 수치범위보다 낮은 중량비에서는 수용액의 양이 너무 적어서 모노올레인 나노구조체가 형성되기 어렵고, 상기 수치범위보다 높은 중량비에서는 수용액의 양이 너무 많아서 모노올레인 나노구조체가 형성된다고 하더라도 모든 수용액이 나노구조체에 흡수되지 않기 때문에 이온성 이황화물과 이온성 고분자가 나노구조체의 수상채널에 효율적으로 함유되지 않아 바람직하지 않을 수 있다.

상기 고분자 수용액은 모노올레인 용액에 혼합하기 전에 가온된 모노올레인 용액의 온도와 유사한 온도로 가온한 후 혼합하는 방법일 수 있다. 이때, 상기 고분자 수용액을 상기 모노올레인 용액에 첨가하여 혼합시키는 방법은 가온된 모노올레인 용액 상부에 상기 고분자 수용액을 서서히 첨가한 후 정치 상태에서 혼합을 유도하는 것일 수 있다. 상기 방법으로부터 내부 수상채널이 균일하게 형성된 지질 나노구조체를 얻을 수 있다. 구체적으로, 모노올레인 용액 상부층에 상기 고분자 수용액층이 형성되도록 하여 계면에서부터 상기 모노올레인 용액과 폴리비닐알콜계 수용액의 혼합이 이루어질 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 나아가 이러한 혼합은 밀폐된 분위기 하에서 실시하는 것이 안정적인 큐빅상을 확보하고 흡착 효율 측면에서 효과적이다.

상기 혼합단계 이후 상온으로 냉각하여 투명한 겔상이 얻어질 때까지 추가적으로 정치하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 유효성분은 용질에 포함되는 성분이며, 수상채널 상에 유입되는 수용성 물질일 수 있다. 상기 유효성분은 본 발명의 지질 나노구조체가 산화 또는 환원 환경에 감응시 방출되는 물질로서, 상기 용질은 수용성 유효성분 또는 수용성 생리활성성분일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 소수성 개질된 폴리에틸렌이민(HmPEI)의 합성

중량평균분자량이 1,800인 폴리에틸렌이민(PEI) 5g을 100ml의 둥근 바닥 플라스크에 담긴 디클로로메탄 30ml에 용해시키고, 트리에틸아민 0.2ml를 PEI 용액에 첨가하였다. 병행하여, 0.747g 또는 1.868g의 헥사노일 클로라이드(hexanoyl chloride)를 10ml의 디클로로 메탄에 각각 녹였다. 헥사노일 클로라이드 용액을 얼음수조에 담겨 있는 용기에 함유되어 있는 PEI/트리에틸아민 혼합 용액에 천천히 첨가 하였다. 반응 혼합물 중 PEI와 헥사노일 클로라이드의 몰비는 1:2와 1:5이었다.

반응 혼합물을 담고 있는 용기를 얼음 수조에 넣고 12 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응 생성물(hydrophobically modified poly(ethylene imine), HmPEI)을 석출시키기 위해서, 반응 혼합물을 1000 ml 비이커에 함유된 디에틸에테르 600 ml에 부었다. 침전물을 여과지(Whatman No 2)를 사용하여 여과시켜 분리하였다. 정제하기 위하여 여과를 통해서 얻어진 케익(걸러진 고체)을 디클로로메탄에 용해시키고 비용매(non-solvent)를 이용하여 다시 침전시켰다.

정제된 HmPEI를 40 ℃의 항온 항습기에서 건조시켰다. PEI와 헥사노일 클로라이드의 몰비가 1:2 및 1:5 인 반응 혼합물을 이용하여 얻은 HmPEI를 각각 HmPEI (1:2)와 HmPEI (1:5)로 명명하였다.

HmPEI (1:2)와 HmPEI (1:5) 각각을 D₂O에 용해시키고 ¹H NMR 스펙트럼을 400 MHz ¹H주파수에서 작동하는 a Bruker Advance 400 spectrometer (400 MHz, Karlsruhe, Germany)에서 얻었다. 도 2는 HmPEI (1:2) 및 HmPEI (1:5)의 ¹H NMR 스펙트럼을 도시한다. 헥사노일 클로라이드의 신호에 대해서 살펴보면, 메틸기는 0.80 ppm에서, 메틸렌기는 1.25 ppm에서, 카르보닐기 옆에 있는 메틸렌기는 1.50 ppm에서 발견되었다.

PEI의 ¹H NMR 스펙트럼을 살펴보면, 에틸렌 그룹은 2.40ppm - 2.85ppm의 범위에서 발견되었다. PEI의 에틸렌 신호의 면적 및 헥사노일 클로라이드의 메틸렌 시그널의 면적을 이용하여 계산한 결과에 따르면 HmPEI(1:2)와 HmPEI(1:5)의 에틸렌 이민 단위/헥사노일 클로라이드의 몰비는 1:0.024와 1:0.131이었다. PEI의 중량평균 분자량은 1800이므로 HmPEI(1:2)와 HmPEI(1:5)의 PEI/헥사노일 클로라이드의 몰비는 각각 1:1.0과 1:5.1로 계산되었다.

[실시예 2] HmPEI와 디티오프로피온산(dithiopropionic acid; DTPA)를 함유하는 모노올레인 나노구조체(monoolein nanostructre, MONS)의 제조

2.3g의 모노올레인을 10 ml의 유리 바이알에 넣고 55 ℃의 항온조에서 녹였다. HmPEI 농도 : DTPA 농도가 각각 0 mg/ml : 0 mg/ml, 2 mg/ml : 2 mg/ml, 10 mg/ml : 10 mg/ml 및 20 mg/ml : 20 mg/ml이 되도록 HmPEI와 DTPA를 PBS (10 mM, pH 7.4)에 함께 용해시켰다.

모노올레인 용융액의 온도(약 50 ℃)와 동일한 온도로 예열된 HmPEI / DTPA 혼합 용액 1ml을 모노올레인 용융액 위에 조심스럽게 첨가하고 투명 겔이 형성 될 때까지 25℃에서 유지 하였다. 방출실험을 위한 나노구조체를 제조할 때는 HmPEI 및 DTPA 이외에 auramine O를 PBS (10 mM, pH 7.4)에 용해시켜서 농도가 0.5 mg/ml가 되게 하였고 그 혼합 수용액을 모노올레인 용융액을 수화시키는데 사용하였다.

HmPEI 농도:DTPA 농도가 각각 0 mg/ml : 0 mg/ml, 2 mg/ml : 2 mg/ml, 10 mg/ml : 10 mg/ml 및 20 mg/ml : 20 mg/ml인 HmPEI/DTPA 혼합용액을 이용하여 제조한 모노올레인 나노구조체를 각각 MONS (0/0), MONS (2/2), MONS (10/10), 그리고 MONS (20/20)이라 명명하였다.

투과전자현미경(TEM) 사진의 측정을 위해, 6 ㎖의 Pluronic F127 용액 (1 % (w/v) in PBS (10 mM pH 7.4))에 500mg의 나노구조체 (MONS (0/0), MONS (2/2), MONS (10/10), MONS (20/20))를 넣고 욕조형 초음파기 (VC 505, Sonic & Materials, USA)를 이용하여 30 % 에너지 강도로 20초 동안 초음파를 가하고 20 동안 초음파를 멈추는 펄스 식의 초음파 에너지 주입으로 20 분 동안 균질화시켰다.

상기 균질화된 나노구조체 현탁액 0.1ml과 같은 양의 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid) 용액 (2 % (w/v), pH 6.8)을 에펜도르프 튜브에 넣어 혼합하고 실온 (23 ℃)에서 6 시간 동안 방치하였다. 현탁액 한방울을 formvar/copper-coated grid (200 mesh, Electron Microscopy Sciences)로 옮기고 실온에서 48 시간 동안 건조시켰다.

TEM 사진은 투과 전자 현미경 (LEO 912AB OMEGA, Germany)에서 촬영 하였다. 도 3은 MONS (0/0) 입자(A), MONS (2/2) 입자(B), MONS (10/10) 입자(C), MONS (20/20) 입자(D)의 TEM 사진이다.

모든 모노올레인 나노구조체는 층상 이중층 (lamellar bilayers)를 보였다. 이는 모노올레인이 양친매성 분자이고 팩킹 파라미터(packing parameter)가 1보다 약간 크기 때문에 수상에서 이중층으로 자기조립된다는 것을 보여주는 것이다.

도 3에서와 같이 모노올레인 나노구조체들의 종류에 관계없이 그 입자 구조가 거의 동일하였고 HmPEI와 DTPA는 나노구조체 형성에 영향을 미치지 않았다. DTPA는 수용성 화합물이므로 나노구조체의 수상 채널에 포함되지만 나노구조체의 이중층에 있는 모노올레인 팩킹(packing) 상태에는 거의 영향을 미치지 않았다. 한편, HmPEI는 도 1에 도시 된 바와 같이 계면 활성제이기 때문에 모노올레인 나노구조체의 이중층과 소수성 상호 작용을 통해 상호 작용할 수 있다. HmPEI의 소수성 잔기(헥실기)는 나노구조체의 이중층에 삽입될 수 있으며, 동시에 모노올레인 팩킹(packing)에 영향을 줄 수 있다. 그러나 HmPEI의 양은 모노올레인 양에 대하여 단지 0.87 %에 불과하였기 때문에 HmPEI의 양은 나노구조체의 이중층 구조에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

[실시예 3] 모노올레인 나노구조체로부터 염료의 환원 응답성 방출

PBS(10mM, pH7.4)에 0 mM, 1 mM, 10 mM로 용해된 dithiothreitol(DTT, 환원제) 용액을 방출 매질로 사용하였다. DTT 용액 10 ㎖를 auramine O가 탑재된 나노구조체(20 ㎖ 바이알에 함유 된 MONS (0/0), MONS (2/2), MONS (10/10), MONS (20/20))위에 조심스레 첨가한다. 24 시간 동안 가끔씩 핸드 쉐이킹(hand shaking) 하면서 어두운 조건에서 실온 (23 ℃)에서 보관하였다. 특정 시간에서 방출매질과 나노구조체를 담고 있는 바이알로부터 1ml의 방출 매질을 채취하고, UV 분광 광도계 (6505 UV-Vis Spectrophotometer, JENWAY, UK)를 사용하여 440nm에서 auramine O 흡광도를 측정하고, 해당 유리 병에 다시 넣었다.

방출 된 염료의 양은 440 nm에서의 흡광도에 대한 auramine O 농도를 도식함으로써 얻은 검량선을 이용하여 결정하였다. 방출율은 나노구조체에 탑재된 염료 양에 대해서 특정 시간 동안 방출 된 염료의 양의 백분율로서 정의하였다. 도 4 내지 7은 DTT 농도가 0 mM, 1 mM, 10 mM 일 때 MONS (0/0), MONS (2/2), MONS (10/10), MONS (20/20)로부터의 auramine O의 방출율을 나타낸다.

도 4를 살펴보면, MONS (0/0)에 함유된 auramine O의 방출 정도는 처음 12 시간 동안 포화 상태로 증가하였고 이후에는 유의적으로 증가하지 않았다. 방출 프로파일은 1차 방출 거동(1st order)로 보였고 1차 방출 거동은 모노올레인 나노구조체와 같은 매트릭스 형태의 비히클로 얻어졌다. 방출율은 시험한 3 가지 DTT 농도 모두에서 거의 동일했다. 예를 들어, DTT 농도가 0 mM, 1 mM 및 10 mM 일 때, 24 시간 동안에서의 방출율는 각각 5.6 %, 5.5 % 및 5.5 % 이었다.

도 5를 살펴보면, MONS (2/2)에 탑재된 Auramine O의 방출 프로파일은 1차 방출 거동과 유사 하였으나 방출율은 DTT 농도에 의존함을 보여주었다. 예를 들어 DTT 농도가 0 mM, 1 mM 및 10 mM 일 때 24 시간 후의 방출율은 각각 2.9 %, 4.3 % 및 5.4 %였다. 상기 결과로 볼 때, 모노올레인 나노구조체는 DTT 농도에 의존하여 용질의 방출거동이 달라짐을 보여주고 있는 것으로, 본 발명의 지질 나노구조체가 환원 응답특성을 가지고 있음을 보여주는 것이다. 또한 DTT가 0 mM일 때 방출율이 2.9%로써 내부 수상채널이 가교되어 있지 않은 MONS (0/0)에 대비해 2배 가량 낮은 방출율을 보여주어 HmPEI 및 DTPA에 의해 내부 수상채널이 효과적으로 가교되어 있고, 이에 의해 확산저항의 작용효과를 나타내고 있음을 보여주었다.

상세하게, 환원제인 DTT가 방출 매체에 포함됨에 따라 나노구조체의 수상채널를 통해서 DTT가 확산되어 DTPA의 이황화 결합을 절단하게 된다. 결과적으로 HmPEI와 DTPA로 구성된 네트워크를 파괴하고 수상채널을 통한 확산저항을 제거하여 확산속도를 증가시킨다.

도 6 및 도 7을 살펴보면, MONS (2/2)에 탑재된 auramine O의 방출율과 같이, MONS (10/10)과 MONS (20/20)에 탑재된 auramine O의 방출율도 DTT 농도에 의해서 제어되었다.

상기 결과를 종합하여 보면, 이온성 이황화물에 의해서 가교된 이온성 고분자를 함유하고 있는 모노올레인 나노구조체는 환원조건에서 많은 양의 용질을 빠르게 방출하는 환원 응답성 방출특성을 나타내었다. 또한, 비환원조건에서는 내부 수상채널을 가교시킴으로써 가교되지 않은 모노올레인 나노구조체 대비 2배 가량 낮은 방출율을 나타내어 유효성분 또는 생리활성성분의 서방성을 기대할 수 있었다.

Claims

내부 수상채널에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체.
제1항에 있어서,
상기 지질 나노구조체는 모노올레인 큐빅상인 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체.
제1항에 있어서,
상기 이온성 고분자는 소수성으로 개질된 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체.
제1항에 있어서,
상기 이황화 결합은 이온성 고분자와 정전기적으로 결합된 2 이상의 연결기 사이에 개재되는 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체.
제4항에 있어서,
상기 이황화 결합은 하나의 분자 내에 이온기를 2개 이상 포함하고 이황화 결합을 포함하는 화합물을 통해 형성되며, 상기 화합물의 이온기와 이온성 고분자의 이온기는 서로 반대 전하를 가진 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체.
제1항에 있어서,
상기 지질 나노구조체는 환원제 또는 pH에 감응하여 내부 수상채널 밖으로 방출되는 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체.
제1항 내지 제6항 중에서 선택되는 어느 하나의 지질 나노구조체를 포함하는 유효성분 전달체.
내부 수상채널에 고정화된 이온성 고분자를 포함하고, 상기 이온성 고분자는 이황화 결합으로 가교된 지질 나노구조체를 이용하여 환원제 또는 pH의 감응에 따라 내부 수상채널 밖으로 방출되는 유효성분의 양을 조절하는 것을 특징으로 하는 환원 응답성 유효물질의 방출방법.
소수성으로 개질된 이온성 고분자 및 상기 이온성 고분자와 반대 전하를 가진 이온성 이황화물을 포함하는 고분자 수용액을 제조하는 단계; 및
상기 고분자 수용액을 모노올레인 용액에 첨가하는 단계;를 포함하는 지질 나노구조체의 제조방법.
제 9항에 있어서,
상기 모노올레인 용액은 모노올레인을 30 내지 70℃에서 가열하여 용융된 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체의 제조방법.
제 9항에 있어서,
상기 고분자 수용액은 유효성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체의 제조방법.
제 9항에 있어서,
모노올레인 100 중량부에 대하여, 상기 이온성 고분자 및 상기 이온성 이황화물이 각각 0.01 내지 10 중량부 포함되는 것을 특징으로 하는 지질 나노구조체의 제조방법.