KR20190001412A - 돼지 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 및 인간 유래 조직혈액응고 억제인자와 인간의 이뮤노글로불린을 융합하여 제조된 새로운 재조합 단백질인 돼지 및 인간 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자, 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 벡터로 형질전환된 세포, 이뮤노글로불린을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 돼지 및 인간 유래 조직혈액응고 억제인자와 인간의 이뮤노글로불린을 융합한 새로운 재조합 단백질인 융합 이뮤노글로불린은 인간의 혈청 조건에서 돼지 유래 조직인자의 활성저해효과를 나타내어 혈액 응고 반응의 결과물인 트롬빈의 합성을 저해할 수 있다. 따라서, 상기 융합 이뮤노글로불린을 이용하여 이종장기 이식 시 빈번하게 발생하는 혈액매개성 염증반응 및 미세혈관의 혈액응고를 억제하는 장기이식 거부반응의 면역억제제 또는 장기이식 거부반응의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다.

Description

돼지 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린{Pig and human tissue factor pathway inhibitor fusion immunoglobulin}

본 발명은 돼지 및 인간 유래 조직혈액응고 억제인자와 인간의 이뮤노글로불린을 융합하여 제조된 새로운 재조합 단백질인 돼지 및 인간 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자, 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 벡터로 형질전환된 세포, 이뮤노글로불린을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

의학기술의 발달로 인해 기능이 저하되거나 손상된 장기를 장기이식으로 대체하는 것이 가능해 졌지만, 수여자에 비해 공여자가 부족하기 때문에, 많은 환자들이 이식수술 대기 중에 사망하고 있다. 이러한 장기부족현상을 해소하기 위해 바이오 이종장기, 줄기세포 분화, 인공장기 등의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이 중에서도 바이오 이종장기이식은 생명공학의 발달로 유전공학적 기법을 이용해 환자 맞춤형 형질전환장기의 대량 생산이 가능하다는 점에서 현실적으로 가장 빠르게 장기부족현상을 해결할 수 있는 방법으로 각광받고 있다.

이종장기이식을 하는 경우에는 동종이식보다 빠르고 강한 거부반응이 일어나게 된다. 이종장기이식 거부반응은 발생 순서에 따라 초급성 거부반응(hyperacute rejection, HAR), 급성혈관성 거부반응(acute vascular rejection, AVR), 급성세포매개성 거부반응(cell mediated rejection, CMR)등이 나타날 수 있다. 이러한 면역거부반응의 억제를 위해서 효율적인 면역억제제 개발, 급성면역반응에 관여하고 있는 유전자를 조작한 돼지의 이용, 또는 조직혈액응고 경로를 차단하는 방법 등에 대해서 연구하고 있는 추세이다.

특히, 혈액응고 반응이 심한 급성혈액매개성 염증반응(Instant blood mediated inflammatory reaction, IBMIR)의 경우 혈액응고시스템의 활성화 및 혈소판 활성화, 혈청 내 보체의 활성화로 인한 세포 용해와 선천면역 세포의 이식된 장기 내 침윤 등의 반응이 일어난다. IBMIR은 이식된 장기가 수여자의 혈액에 직접 노출되었을 경우 발생하며, IgG, IgM과 같은 항체가 이식된 장기 표면에 결합하여 혈청 보체(complement)와 조직인자(tissue factor)를 활성화하고, 활성화된 조직인자에 의해 트롬빈(thrombin)이 형성되게 된다. 이와 같은 혈액 응고계 및 혈소판, 혈청 보체 활성화는 결국 이식된 장기 주위로 혈액 응고 및 섬유소 침착, 염증매개 세포의 침윤을 유발하여 이식된 장기가 급격히 파괴되는 현상을 야기한다. 이러한 IBMIR은 이식 초기에 이식된 장기 및 세포의 급격한 소실을 초래하므로 이를 조절하기 위해 혈액 응고 및 염증반응을 조절할 수 있는 항응고, 항혈소판, 항보체 등의 개발이 추가로 필요하지만 아직까지 미비한 단계이다. 특히, 이식하는 돼지 장기의 세포 표면에는 조직인자(tissue factor, TF)가 다량 노출되어 있으므로, 수여자의 혈액 내 혈액응고인자인 factor VIIa와 Xa와 결합하여 조직 미세혈관에서의 혈액 응고 및 IBMIR을 촉진하게 된다. 혈액 응고 조절에 관여하는 주요 유전자로는 조직혈액응고 억제인자(tissue factor pathway inhibitor, TFPI), Antithrombin, CD39 등이 있다. 이 중 조직혈액응고 억제인자(TFPI)는 factor VIIa와 Xa에 결합하여 조직인자(TF)에 의해 유도되는 혈액응고시스템의 초기단계를 억제할 수 있다.

따라서, 조직혈액응고 억제인자를 조절하여, 조직인자에 의해 유도되는 혈액응고 시스템의 초기단계를 조절하여 이종간 장기이식시의 면역억제반응의 억제제에 대한 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 돼지 및 인간 유래 조직혈액응고 억제인자와 인간의 이뮤노글로불린을 융합하여 새로운 재조합 단백질을 제조 및 정제하였다. 또한, 상기 융합이뮤노글로불린을 이용하여 인간의 혈청 조건에서 돼지 유래 조직인자(pTF)의 활성저해효과 및 이종장기 이식 시에 발생되는 문제점인 급성혈액매개성 염증반응(IBMIR) 및 미세혈관의 혈액 응고에 대한 억제를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 돼지 및 인간 유래 조직혈액응고 억제인자와 인간의 이뮤노글로불린을 융합하여 제조된 새로운 재조합 단백질인 돼지 및 인간 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자, 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 벡터로 형질전환된 세포, 이뮤노글로불린을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 제공한다.

또한 본 발명은 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 포함하는 면역억제제를 제공한다.

또한 본 발명은 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을을 포함하는 장기이식 거부반응 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 제공한다.

또한 본 발명은 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 포함하는 면역억제제를 제공한다.

또한 본 발명은 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을을 포함하는 장기이식 거부반응 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 돼지 및 인간 유래 조직혈액응고 억제인자와 인간의 이뮤노글로불린을 융합한 새로운 재조합 단백질인 융합 이뮤노글로불린은 인간의 혈청 조건에서 돼지 유래 조직인자의 활성저해효과를 나타내어 혈액 응고 반응의 결과물인 트롬빈의 합성을 저해할 수 있다. 따라서, 상기 융합 이뮤노글로불린을 이용하여 이종장기 이식 시 빈번하게 발생하는 혈액매개성 염증반응 및 미세혈관의 혈액응고를 억제하는 장기이식 거부반응의 면역억제제 또는 장기이식 거부반응의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다.

도 1은 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린(pTFPI-Ig) 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린(hTFPI-Ig)의 발현을 위한 유전자(도 1a) 및 융합 이뮤노글로불린을 발현하는 재조합 벡터(도 1b)를 나타낸 도이다.
도 2는 pTFPI-Ig 및 hTFPI-Ig의 발현을 나타낸 도이다.
도 3은 pTFPI-Ig 및 hTFPI-Ig의 단백질 정제 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 pTFPI-Ig 및 hTFPI-Ig을 농도별로 처리하여 조직인자 활성억제효능을 검증한 결과를 나타낸 도이다. (*p < 0.05)
도 5는 pTFPI-Ig 및 hTFPI-Ig을 1000 nM의 농도로 처리하였을 때의 트롬빈 생성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. (*p < 0.05)

본 발명은 돼지 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린은 서열번호 6으로 표시되는 단백질 또는 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 돼지 조직혈액응고 억제인자의 신호펩타이드(signal peptide) 부분을 제외한 성숙 형태(mature form)인 서열번호 2의 25 내지 303 번째 아미노산 서열 및 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역(Fc region)이 융합된 단백질일 수 있다.

상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 6로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 6으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한 본 발명의 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린은 서열번호 8로 표시되는 단백질일 수 있다. 상기 인간 상기 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린은 서열번호 8로 표시되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인간 조직혈액응고 억제인자의 신호펩타이드(signal peptide) 부분을 제외한 성숙 형태(mature form)인 서열번호 4의 29 내지 304 번째 아미노산 서열 및 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역(Fc region)이 융합된 단백질일 수 있다.

인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역의 cDNA는 human peripheral lymphocyte로부터 mRNA를 추출한 후, 역전사를 통해 얻어낸 cDNA일 수 있다.

본 발명은 돼지 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 돼지 또는 인간 조직혈액응고 억제인자는 돼지 신장 상피세포인 PK15 및 인간 유래 상피세포인 Hela 세포에 트리졸(Trizol, Invitrogen) 1 ml 당 200 μl의 클로로포름(sigma)을 넣고 전체 RNA를 추출하였고, 이때 추출한 1 μg의 mRNA를 주형으로 Superscript III (Invitrogen) 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용하여 역전사 연쇄중합반응에 의해 cDNA를 합성하였다. 이 후, 상기 cDNA를 주형으로 하여 유전자 데이터베이스에서 얻은 염기서열에 따라 프라이머를 제작한 후, 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자 및 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자를 획득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열도 가질 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열도 가질 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 7의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 돼지 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공할 수 있다.

돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자로부터 이뮤노글로불린을 발현시키기 위해, 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자 또는 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자를 포유류 발현벡터인 pLNCX2에 클로닝할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 5′말단에 제한효소 Xho Ⅰ의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 Sma Ⅰ의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단부위를 만들 수 있다. 그 후, 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc region의 cDNA를 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자의 3′말단 쪽에 융합(fusion)시켰다. 상기 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역의 cDNA는 human peripheral lymphocyte로부터 mRNA를 추출한 후, 역전사를 통해 얻어낸 cDNA를 이용할 수 있다. 융합 시 사용된 제한효소 부위는 5′말단에 제한효소 Sma Ⅰ, 3′말단에 제한효소 NotⅠ을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 상기 돼지 조직혈액응고 억제인자 및 인간 조직혈액응고 억제인자를 발현시킬 수 있는 복제가능한 어떤 발현벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 상기 재조합 발현벡터는 pTFPI-hIgG/pLNCX2 및 hTFPI-hIgG/pLNCX2인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자는 돼지 조직혈액응고 억제인자를 발현할 수 있는 어떤 염기서열도 가질 수 있으며, 서열번호 6으로 표시되는 단백질을 코딩하는 염기서열일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터에 있어서, 상기 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자는 인간 조직혈액응고 억제인자를 발현할 수 있는 어떤 염기서열도 가질 수 있으며, 서열번호 8로 표시되는 단백질을 코딩하는 염기서열일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 7의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명은 돼지 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 당업자에게 잘 알려진 전기천공 등의 방법을 이용하여 세포에 형질도입될 수 있다. 상기 세포는 상업적으로 이용할 수 있는 어떤 세포주도 가능하며, 예컨대 박테리아, 이스트, 곤충 세포, 포유류 세포 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 원핵 및 진핵 세포가 될 수 있다.

또한 본 발명은 돼지 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 포함하는 면역억제제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 면역조절제는 인간 T 림프구의 활성 억제를 필요로 하는 어떤 질환에도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 백신의 면역조절 또는 항암 치료제의 면역조절, 또한 인간 및 돼지간의 장기이식에 따른 이식편대숙주 질환의 치료 또는 예방용으로 사용될 수 있다.

본 발명은 돼지 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 포함하는 장기이식 거부반응 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 상기 돼지 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린뿐만 아니라 제약학적으로 수용 가능한 운반체를 포함한다. 이와 같은 조성물은 통상의 기술에 따라 조제될 수 있다. 운반체는 선택되는 투여 경로 가령, 구강, 장관 외, 설하, 직장 또는 비강 등의 경로에 따라 다양한 형태로 될 수 있다. 장관 외 투여를 위한 조성물의 경우에, 운반체는 일반적으로 멸균된 물뿐만 아니라 조성물의 용해도를 촉진시키는 다른 가능한 성분 또는 조성물의 저장 능력을 촉진시키는 성분으로 구성될 수 있다. 장관 외 투여 경로는 정맥, 근육 내 또는 피하 주사를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 지속적으로 방출되는 타입이 될 수 있는데, 특히 이종간 면역 질환과 같은 장기간 치료를 하는 경우에 이용된다. 투여되는 약량은 치료를 받을 개체, 특히 원하는 보호 정도를 얻기 위한 환자의 면역계 능력에 따라 달라진다. 투여될 활성 성분의 정확한 양은 치료를 시작하는 의사가 결정되나, 바람직하게는 성인기준으로 일당 1μg 내지 1000 mg의 돼지 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린이 투여될 수 있다.

장기 이식 거부 반응은 면역거부 반응, 혈액매개성 염증반응 및 미세혈관의 혈액응고반응으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 면역거부 반응은 초급성 거부반응(hyperacute rejection, HAR), 급성혈관성 거부반응(acute vascular rejection, AVR), 급성세포매개성 거부반응(cell mediated rejection, CMR)일 수 있다.

본 발명을 이하 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: RT- PCR 방법에 의한 유전자의 클로닝

돼지 및 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자를 얻기 위해 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하였다. 돼지 신장 상피세포인 PK15 및 인간 유래 상피세포인 Hela 세포에 트리졸(Trizol, Invitrogen) 1 ml 당 200 μl의 클로로포름 (sigma)을 넣고 전체 RNA를 추출하였고, 이때 추출한 1 μg의 mRNA를 주형으로 Superscript III (Invitrogen) 역전사 효소 (Reverse transcriptase)를 이용하여 역전사 연쇄중합반응에 의해 cDNA를 합성하였다. 이 후, 상기 cDNA를 주형으로 하여 유전자 데이터베이스에서 얻은 염기서열에 따라 프라이머를 제작한 후, 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자 및 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자를 획득하였다. 이 때, 사용한 프라이머를 표 1에 나타내었으며, 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자를 서열번호 1에, 인간 조직혈액응고 억제인자를 서열번호 3에 나타내었다.

역전사 중합효소 연쇄반응에 사용한 프라이머

Gene name	프라이머	서열 (5'-3')	사이즈
pTFPIα	정방향	GTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTCCTGAGGAAGGT (서열번호 9)	867 bp
	역방향	TCCCCCGGGTATCTTTTTAACAAAAATTTCTTCATATACTATTTTCACT (서열번호 10)
hTFPIα	정방향	GTTCCAGGTTCCACTGGTGACGATTCTGAGGAAGAT (서열번호 11)	858 bp
	역방향	TCCCCCGGGCATATTTTTAACAAAAATTTCTTCATATGCTATTTTCAC (서열번호 12)

실시예 2 : 이뮤노글로불린 재조합 벡터의 제조 및 형질전환세포주 제작

2.1 : 돼지 및 인간 조직혈액응고 이뮤노글로불린 융합 재조합 벡터의 제조

돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자 및 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자로부터 단백질을 발현시키기 위해, 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자 또는 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자를 포유류 발현벡터인 pLNCX2에 클로닝하였다.

먼저, 5′말단에 제한효소 Xho Ⅰ의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단부위를 만들고, 3′말단에도 제한효소 Sma Ⅰ의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단부위를 만들었다. 그 후, 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역의 cDNA를 돼지 조직혈액응고 억제인자 유전자 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 유전자의 3′말단 쪽에 융합(fusion)시켰다. 상기 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc region의 cDNA는 human peripheral lymphocyte로부터 mRNA를 추출한 후, 역전사를 통해 얻어낸 cDNA이다. 융합 시 사용된 제한효소 부위는 5′말단에 제한효소 SmaⅠ, 3′말단에 제한효소 NotⅠ을 사용하였으며, 이를 도 1a에 나타내었다.

또한, 도 1a의 구조로 된 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 또는 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 발현하는 재조합 벡터 pTFPI-hIgG/pLNCX2 및 hTFPI-hIgG/pLNCX2를 완성하였고, 이를 도 1b에 나타내었다.

2.2 재조합벡터를 이용한 형질전환세포주의 제작

상기 실시예 2.1에서 생산한 재조합벡터를 이용한 형질전환 세포주를 제작하기 위해 각각 Tetracycline off system의 293GPG 세포와 포유동물 유래 세포주인 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 사용하여 형질전환 시켰다.

먼저, 293GPG 세포를 6 well 조직 배양 플레이트에 well당 5×10⁵ 세포가 되도록 접종한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 24 시간 후, 세포가 well 표면의 70 ~ 80% 정도를 덮을 정도로 자라면, 혈청이 무첨가된 DMEM 배지에서 1 ~ 2 μg의 pTFPI-hIgG/pLNCX2 및 hTFPI-hIgG/pLNCX2 벡터 DNA를 6 ~ 8 μg의 Lipofectamine plus (Invitrogen)를 사용하여 293GPG 세포에 도입시켰다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293GPG 세포를 24 시간 동안 배양하고 바이러스(레트로바이러스)를 포함하는 배양 상층액을 이용하여 숙주세포(CHO cell)를 4 ~ 5 시간 동안 배양한 후, 혈청이 10% 함유된 배지로 변경하여 24 시간 배양하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 상기 CHO 세포 중 형질도입된 세포를 얻기 위해 G418 항생제 1.5 mg/ml을 처리하여 유전자가 발현되는 세포를 얻었다.

실시예 3: 융합 이뮤노글로불린의 발현확인 및 정제

3.1 돼지 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질의 발현 확인

돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질이 포유류 세포에서 과발현됨을 확인하기 위해, 형질전환된 CHO 세포에서 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. RNA 추출방법은 상기 실시예 1의 방법과 동일하며, 이로부터 얻은 cDNA를 주형으로 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 유전자발현의 유무를 중합효소연쇄반응을 통하여 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내고, 이 때 사용한 프라이머는 표 2에 나타내었다. GAPDH는 세포내에서 발현량이 세포의 조건에 따라 잘 변하지 않는 유전자로써, 본 발명의 융합 이뮤노글로불린 발현량 조사에서 세포 내 기준으로 사용되었다.

역전사 중합효소 연쇄반응에 사용한 프라이머

Gene name	프라이머	서열 (5'-3')	사이즈
hIgG	정방향	GAGCCCAAATTTGTGACAAAACT (서열번호 13)	690 bp
	역방향	TCATTTACCCGGAGACAGG (서열번호 14)
GAPDH	정방향	ATGACCACAGTCCATGCCATC (서열번호 15)	271 bp
	역방향	CCTGCTTCACCACCTTCTTG (서열번호 16)

도 2에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 CHO 세포에서 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린이 각각 과발현되는 것을 확인하였다.

3.2 융합 이뮤노글로불린 단백질의 정제

상기의 실시예 3.1의 방법으로 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린의 세포내 발현을 확인한 후, 확인된 형질전환 세포를 배양하여 얻은 배양액으로부터 발현 단백질을 정제하기 위하여 Protein A Agarose kit(553-50-00, KPL)를 사용해 정제실험을 수행하였다. 먼저, Protein A Agarose column에 wash/binding buffer(0.1M sodium phosphate, 0.15M NaCl, pH 7.4)를 통과시켜 준비하였고, 그 후, 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질을 함유한 배양액을 통과시켜 Protein A와 이뮤노글로불린(Ig G)과의 결합력을 통해 column에 흡착시켰다. 흡착된 단백질들은 Elution buffer(0.2M Glycine, pH 3±1.85)를 이용하여 다시 용출시켜 정제하였다. 용출된 시료는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시한 후, 쿠마지블루(coomassie blue)로 염색하여 발현된 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질을 확인하였으며 상기 단백질 정제 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 나타낸 바와 같이, 발현된 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질은 약 80 kDa임을 확인하였고, 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질은 약 70 kDa임을 확인하였다.

실시예 4: 정제 단백질의 조직인자의 활성저해효과 검증

4.1 융합 이뮤노글로불린 단백질의 농도별 조직인자 활성억제효능

돼지 조직인자(pig tissue factor)의 기능적 차단을 위해 제작한 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질의 효능 평가를 위해, 돼지 신장상피세포인 PK15의 lysate를 이용하여 돼지 조직인자 활성실험을 수행하였다. PK15 세포 lysate를 factor VII과 함께 배양을 한 후, 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질을 농도별로 처리하였다. 이후 factor X를 넣어 배양한 뒤, factor Xa의 발광 기질(chromogenic substrate)을 이용해 조직인자 활성을 측정하였으며, 이를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질을 각각 처리하였을 때 돼지 조직인자 활성이 저해되었다. 또한, 농도 별로 비교 시, 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질보다 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질을 처리할 경우 조직인자 활성이 더 낮게 측정되었다. 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질을 100 nM 처리 시에는 조직인자 활성이 거의 모두 억제되었지만, 50 nM 처리 시에는 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질의 경우 약 90%의 활성 억제를 보였고, 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질의 경우 약 60%의 활성 억제를 보이며 억제 능력에 차이를 보였다. 즉, 50 nM의 동일한 농도의 융합단백질을 처리하였을 때, 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질의 활성억제능력이 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질의 억제 능력보다 유의적으로 뛰어남을 확인하였다. 이를 통해 돼지 조직인자의 활성억제능력에 있어서 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질의 억제효과가 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질보다 더 우수함을 확인할 수 있었다.

4.2 융합 이뮤노글로불린의 트롬빈 생성 억제의 확인

돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린 단백질의 조직인자 활성 저해능력이 혈액 응고 반응의 주요 결과물인 트롬빈의 합성을 저해할 수 있는지 확인하기 위해 트롬빈 생성 분석(Thrombin generation assay)을 Fluorskan Ascent Fluorometer를 이용하여 수행하였다. 먼저, 조직혈액응고 억제인자가 제거된 인간 혈청(Sekisui Diagnostics) 80 μl에 corn trypsin inhibitor (65 μg/ml) 20 μl와 돼지 신장상피세포에서 얻은 돼지 조직인자(1 pM) 20 μl를 첨가하여 준비하였다. 그 후, 돼지 및 인간 조직혈액응고 억제인자를 각각 1000 nM의 농도로 첨가한 후 37℃에서 10분간 배양하였다. 그 후, 형광기질을 20 μl 첨가하여 생성되는 트롬빈의 양을 Thrombinoscope software 프로그램을 통해 측정하였으며, 이를 도 5에 나타내었다. 이때, PBS 처리그룹(no)과 인간 이뮤노글로불린을 처리한 그룹(control Ig)이 음성대조구로 사용되었다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린(pTFPI-Ig) 및 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린(hTFPI-Ig) 단백질 모두 음성대조구에 비해 트롬빈 생성 곡선의 피크가 낮아짐을 확인하여 pTFPI-Ig 및hTFPI-Ig가 트롬빈 생성을 억제하였음을 확인하였다. 도 5b 및 도 5c에 나타낸 바와 같이 트롬빈 생성의 피크인 hTFPI-Ig가 pTFPI-Ig보다는 높았지만 양자 모두 peak 가 낮았으며, 트롬빈 생성의 지연 시기(Lag time)도 pTFPI-Ig가 hTFPI-Ig보다 길어진 것을 확인하였다. 따라서, 양자 모두 트롬빈의 생성을 지연시킬 수 있으며 이를 통해 트롬빈의 생성을 저해시킬 수 있음을 확인하였다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Pig and human tissue factor pathway inhibitor fusion immunoglobulin <130> 1-90 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 912 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 atgaaggaag gacagatttt tggggcttct gtatgtctgc tgcttagttg tgcctttgga 60 cctcttactg ctattcctga ggaaggtgaa gaatatgcaa acattacaga tgcaaagttg 120 ccaccaatga aacctataca ttcattttgt gcaatgaaag cagatgatgg cccatgcaaa 180 gcaatgatga agagattttt tttcaatatt aacacgcaac agtgtgaaga atttatatat 240 gggggatgtg aaggaaatca aaatcgattt gaaagtctgg aagaatgcaa agaaaaatgt 300 acaagagatt atccaaagaa gactagaaga ttaaacacaa cattgcaaaa agaaaagcca 360 gacttctgct ttttggaaga agatgctgga atctgtcgag gttatattac taggtatttt 420 tataacaatc agtcaaagca gtgtgaacgc ttcaagtatg gtggctgcct tggcaatcta 480 aacaactttg aatcgctgga agaatgcaag aacacctgtg aggatgcatt gaatgatctc 540 caggtggatg attatagaac ccctcttgag gctttgaata atgactcctt gactctccag 600 cctaccaaag cacccagctt ctttgaattt tacggcccct cctggtgtct gaccccggca 660 gacagaggat tatgtcaagc caatgaacgc agattctact acaattcagt cattgggaaa 720 tgccgcccct ttaagtacag tggatgtgga gggaatgaaa ataattttac ttctaaaaaa 780 gcatgtctta agacttgtaa aaaaggtttt gtccaaagaa tatcaaaaga tggattaatt 840 aaaaccaaaa gaaaaagaaa gaagcagcca gtgaaaatag tatatgaaga aatttttgtt 900 aaaaagatat aa 912 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 2 Met Lys Glu Gly Gln Ile Phe Gly Ala Ser Val Cys Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Ala Phe Gly Pro Leu Thr Ala Ile Pro Glu Glu Gly Glu Glu Tyr 20 25 30 Ala Asn Ile Thr Asp Ala Lys Leu Pro Pro Met Lys Pro Ile His Ser 35 40 45 Phe Cys Ala Met Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Met Met Lys 50 55 60 Arg Phe Phe Phe Asn Ile Asn Thr Gln Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr 65 70 75 80 Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys 85 90 95 Lys Glu Lys Cys Thr Arg Asp Tyr Pro Lys Lys Thr Arg Arg Leu Asn 100 105 110 Thr Thr Leu Gln Lys Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp 115 120 125 Ala Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln 130 135 140 Ser Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Asn Thr Cys Glu Asp Ala 165 170 175 Leu Asn Asp Leu Gln Val Asp Asp Tyr Arg Thr Pro Leu Glu Ala Leu 180 185 190 Asn Asn Asp Ser Leu Thr Leu Gln Pro Thr Lys Ala Pro Ser Phe Phe 195 200 205 Glu Phe Tyr Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu 210 215 220 Cys Gln Ala Asn Glu Arg Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly Lys 225 230 235 240 Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn Phe 245 250 255 Thr Ser Lys Lys Ala Cys Leu Lys Thr Cys Lys Lys Gly Phe Val Gln 260 265 270 Arg Ile Ser Lys Asp Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys 275 280 285 Gln Pro Val Lys Ile Val Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Lys Ile 290 295 300 <210> 3 <211> 915 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgatttaca caatgaagaa agtacatgca ctttgggctt ctgtatgcct gctgcttaat 60 cttgcccctg cccctcttaa tgctgattct gaggaagatg aagaacacac aattatcaca 120 gatacggagt tgccaccact gaaacttatg cattcatttt gtgcattcaa ggcggatgat 180 ggcccatgta aagcaatcat gaaaagattt ttcttcaata ttttcactcg acagtgcgaa 240 gaatttatat atgggggatg tgaaggaaat cagaatcgat ttgaaagtct ggaagagtgc 300 aaaaaaatgt gtacaagaga taatgcaaac aggattataa agacaacatt gcaacaagaa 360 aagccagatt tctgcttttt ggaagaagat cctggaatat gtcgaggtta tattaccagg 420 tatttttata acaatcagac aaaacagtgt gaacgtttca agtatggtgg atgcctgggc 480 aatatgaaca attttgagac actggaagaa tgcaagaaca tttgtgaaga tggtccgaat 540 ggtttccagg tggataatta tggaacccag ctcaatgctg tgaataactc cctgactccg 600 caatcaacca aggttcccag cctttttgaa tttcacggtc cctcatggtg tctcactcca 660 gcagacagag gattgtgtcg tgccaatgag aacagattct actacaattc agtcattggg 720 aaatgccgcc catttaagta cagtggatgt gggggaaatg aaaacaattt tacttccaaa 780 caagaatgtc tgagggcatg taaaaaaggt ttcatccaaa gaatatcaaa aggaggccta 840 attaaaacca aaagaaaaag aaagaagcag agagtgaaaa tagcatatga agaaattttt 900 gttaaaaata tgtga 915 <210> 4 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu 20 25 30 Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys 35 40 45 Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys 50 55 60 Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu 65 70 75 80 Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95 Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile 100 105 110 Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu 115 120 125 Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140 Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160 Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu 165 170 175 Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn 180 185 190 Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 195 200 205 Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly 210 215 220 Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly 225 230 235 240 Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn 245 250 255 Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile 260 265 270 Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys 275 280 285 Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met 290 295 300 <210> 5 <211> 1605 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for pig TFPI fusion immunoglobulin <400> 5 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacattcctg aggaaggtga agaatatgca aacattacag atgcaaagtt gccaccaatg 120 aaacctatac attcattttg tgcaatgaaa gcagatgatg gcccatgcaa agcaatgatg 180 aagagatttt ttttcaatat taacacgcaa cagtgtgaag aatttatata tgggggatgt 240 gaaggaaatc aaaatcgatt tgaaagtctg gaagaatgca aagaaaaatg tacaagagat 300 tatccaaaga agactagaag attaaacaca acattgcaaa aagaaaagcc agacttctgc 360 tttttggaag aagatgctgg aatctgtcga ggttatatta ctaggtattt 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Pro Lys Lys Thr Arg Arg Leu Asn Thr Thr Leu 100 105 110 Gln Lys Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Ala Gly Ile 115 120 125 Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Ser Lys Gln 130 135 140 Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Asn Thr Cys Glu Asp Ala Leu Asn Asp 165 170 175 Leu Gln Val Asp Asp Tyr Arg Thr Pro Leu Glu Ala Leu Asn Asn Asp 180 185 190 Ser Leu Thr Leu Gln Pro Thr Lys Ala Pro Ser Phe Phe Glu Phe Tyr 195 200 205 Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Gln Ala 210 215 220 Asn Glu Arg Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro 225 230 235 240 Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys 245 250 255 Lys Ala Cys Leu Lys Thr Cys Lys Lys Gly Phe Val Gln Arg Ile Ser 260 265 270 Lys Asp Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Pro Val 275 280 285 Lys Ile Val Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Lys Ile Pro Gly Glu Pro 290 295 300 Lys Ser Cys Asp Lys Thr 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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 515 520 525 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 530 <210> 7 <211> 1596 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for human TFPI fusion immunoglobulin <400> 7 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgattctg aggaagatga agaacacaca attatcacag atacggagtt gccaccactg 120 aaacttatgc attcattttg tgcattcaag gcggatgatg gcccatgtaa agcaatcatg 180 aaaagatttt tcttcaatat tttcactcga cagtgcgaag aatttatata tgggggatgt 240 gaaggaaatc agaatcgatt tgaaagtctg gaagagtgca aaaaaatgtg tacaagagat 300 aatgcaaaca ggattataaa gacaacattg caacaagaaa agccagattt ctgctttttg 360 gaagaagatc ctggaatatg tcgaggttat attaccaggt atttttataa caatcagaca 420 aaacagtgtg aacgtttcaa gtatggtgga tgcctgggca atatgaacaa ttttgagaca 480 ctggaagaat gcaagaacat ttgtgaagat ggtccgaatg gtttccaggt ggataattat 540 ggaacccagc tcaatgctgt gaataactcc ctgactccgc aatcaaccaa ggttcccagc 600 ctttttgaat ttcacggtcc ctcatggtgt ctcactccag cagacagagg attgtgtcgt 660 gccaatgaga acagattcta 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gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1560 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1596 <210> 8 <211> 531 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for human TFPI fusion immunoglobulin <400> 8 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile 20 25 30 Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala 35 40 45 Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe 50 55 60 Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met 85 90 95 Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln 100 105 110 Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg 115 120 125 Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu 130 135 140 Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr 145 150 155 160 Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln 165 170 175 Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr 180 185 190 Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser 195 200 205 Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn 210 215 220 Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr 225 230 235 240 Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys 245 250 255 Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly 260 265 270 Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala 275 280 285 Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met Pro Gly Glu Pro Lys Ser Cys 290 295 300 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 305 310 315 320 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 325 330 335 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 340 345 350 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 355 360 365 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 370 375 380 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 385 390 395 400 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 405 410 415 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 420 425 430 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 435 440 445 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 450 455 460 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 465 470 475 480 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 485 490 495 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 500 505 510 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 515 520 525 Pro Gly Lys 530 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence for pTFPI <400> 9 gttccaggtt ccactggtga cattcctgag gaaggt 36 <210> 10 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence for pTFPI <400> 10 tcccccgggt atctttttaa caaaaatttc ttcatatact attttcact 49 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence for hTFPI <400> 11 gttccaggtt ccactggtga cgattctgag gaagat 36 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence for hTFPI <400> 12 tcccccgggc atatttttaa caaaaatttc ttcatatgct attttcac 48 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence for hIgG <400> 13 gagcccaaat ttgtgacaaa act 23 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence for hIgG <400> 14 tcatttaccc ggagacagg 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer sequence for GAPDH <400> 15 atgaccacag tccatgccat c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer sequence for GAPDH <400> 16 cctgcttcac caccttcttg 20

Claims (15)

1. 서열번호 6으로 표시되는 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린(pig TFPI fusion immunoglobulin).
2. 제1항에 있어서, 상기 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린은 서열번호 2의 25 내지 303 번째 아미노산 서열 및 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역(Fc region)이 융합된 것인, 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린.
3. 제1항의 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자.
4. 제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 5로 표시되는 것을 특징으로 하는, 돼지 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자.
5. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
6. 제5항의 벡터로 형질전환된 세포.
7. 서열번호 8로 표시되는 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린(pig TFPI fusion immunoglobulin).
8. 제7항에 있어서, 상기 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린은 서열번호 4의 29 내지 304 번째 아미노산 서열 및 인간 이뮤노글로불린(human IgG)의 Fc 영역(Fc region)이 융합된 것인, 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린.
9. 제7항의 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자.
10. 제9항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 7로 표시되는 것을 특징으로 하는, 인간 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 코딩하는 유전자.
11. 제9항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
12. 제11항의 벡터로 형질전환된 세포.
13. 제1항 또는 제7항의 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 포함하는 면역억제제.
14. 제1항 또는 제7항의 조직혈액응고 억제인자 융합 이뮤노글로불린을 포함하는 장기 이식 거부반응 예방 또는 치료용 조성물.
15. 제14항에 있어서, 장기 이식 거부 반응은 면역거부 반응, 혈액매개성 염증반응 및 미세혈관의 혈액응고반응으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 장기 이식 거부반응 예방 또는 치료용 조성물.

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