KR20180135441A - 신규한 면역자극 벡터 시스템 - Google Patents

신규한 면역자극 벡터 시스템 Download PDF

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KR20180135441A
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프랑크 슈니데르스
안드레아 미겔
카롤린 비르만-플라이슈하우어
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프로벡스 메디칼 게엠베하
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Abstract

본 발명은 면역 자극을 위한 신규한 벡터 및 면역치료, 구체적으로 암 면역치료에서 이를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 신규한 벡터는 4-1BB 리간드 (4-1BB ligand; 4-1BBL, CD137 리간드), 단쇄 IL-12 (single chain IL-12; scIL-12), 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 벡터는 상기 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현을 제공한다. 구체적으로, 상기 4-1BBL, scIL-12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 상기 벡터 내에서 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는다. 본 발명의 구체예는 상기 신규한 벡터를 포함하는 바이러스 입자뿐만 아니라 상기 신규한 벡터로 형질도입되거나 형질주입된 암 또는 면역세포를 포함한다.

Description

신규한 면역자극 벡터 시스템
본 발명은 일반적으로 면역학 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 면역치료 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 면역 자극을 위한 신규한 벡터 시스템 및 면역치료에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 신규한 벡터 시스템은 4-1BB 리간드 (4-1BB ligand; 4-1BBL, CD137 리간드), 단쇄 IL-12 (single chain IL-12; scIL-12), 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 특징으로 한다.
면역체계는 박테리아나 바이러스와 같은 외래 침입자뿐만 아니라 암세포를 포함한 신체의 손상된 세포, 병든 세포, 또는 비정상 세포를 인식하고 파괴하는 수단을 제공한다. 면역체계 반응의 주된 플레이어로 대식세포와 자연살해세포를 포함하며, 이는 일반적인 또는 비특이적인 면역 방어 수준을 제공한다. 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocytes; CTLs) 및 B 림프구를 비롯한 다른 세포 유형은 특정 표적에 대해 작용한다. 면역반응에는 B 세포가 항원-특이적 항체를 생산하는 체액성 반응과 항원 또는 항원-보유 세포가 다양한 유형의 T 세포에 의해 여러 가지 상이한 기전을 통해 인식되고 파괴되는 세포-매개 반응이 포함된다. CTL 반응을 포함한 세포-매개 면역반응은 종양 세포 및 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 데 핵심적인 것으로 간주된다.
일반적으로 비정상 세포를 감지하고 파괴하는 면역계의 자연적인 능력은 많은 암의 발병을 예방한다고 여겨진다. 그럼에도 불구하고, 일부 암세포는 면역계에 의한 파괴를 회피하기 위한 전략을 개발해왔다. 예를 들어, 암세포가 면역반응을 억제하는데 사용할 수 있는 여러 가지 상이한 기전이 존재한다. 그들은 또한 암-관련 항원의 손실로 이어지는 유전적 변화를 겪을 수 있어 면역계에 대해 "눈에 띄지 않게" 만든다. 유사한 고려사항이 다른 바이러스와 관련하여 적용되며, 이는 또한 면역 회피 전략을 채택하며, 이로 인해 숙주의 면역계가 바이러스 감염을 통제할 수 없게 된다.
면역치료의 목표는 효과적인 면역반응에 대한 이러한 장벽을 극복하는 것이다. 면역치료에 기반한 생물학적 치료법은 특정 면역계 구성 성분의 활성을 복원 또는 증가시키거나 또는 암세포 또는 바이러스 감염성 질환으로 인해 생성되는 면역 억제 신호를 방해한다. 그 중에서도 종양 세포는 항원-특이적인 방식으로 CTLs에 의해 사멸된다. 따라서, T 세포 활성화를 촉진하고 강한 세포용해성 및 염증성 특성을 부여하는 의약은 종양-특이적 면역을 향상시키기 위한 이상적인 후보이다.
새로운 형태의 치료법이 계속 필요하며, 면역치료법의 한 가지 주요 수단은 유전자 전달 기술에 기반을 두고 있다. 유전자 치료는 면역치료를 제공하는 방법으로 확립되었다. 비-복제성 바이러스 및 바이러스 벡터는 원래 20 년 전에 특히, 면역 활성화 (예를 들어, IL-2) 양상을 사용하는 항암제로 제안된 바 있다. (예를 들어, Crofts and Krimsky, 2005, Hum Gene Ther. 16: 169-177 참조). WO 2004/035799에는, 감염성 질환 및 암 치료에서 유전자 치료를 위한 단쇄 IL-12 (scIL-12), 공동자극(costimulatory) 단백질 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 아데노바이러스 벡터가 기재되어있다.
본 발명은 비활성을 활성 면역 미세 환경으로 전환시켜 암 및 바이러스 감염을 치료하는데 효과적인 종래의 유전자 치료법에 대한 개선을 나타내는 신규 한 벡터 기반 면역치료에 관한 것이다.
[발명의 요약]
본 발명은 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (scIL-12), 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 상기 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현을 제공한다. 구체적으로, 상기 4-1BBL, scIL-12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 상기 벡터 내에서 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는다. 본 발명은 또한 비활성을 활성 면역 미세 환경으로 전환시켜 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 신규한 벡터의 방법 및 용도를 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 암 및 바이러스 감염에 대한 면역력을 강화 및/또는 자극하기 위해 암세포 및 바이러스 감염에 대한 면역반응을 유도하는 청구된 바이러스 벡터의 구조물 및 검증을 포함한다.
본 발명의 측면은 다음을 포함한다:
1. 4-1BB 리간드 (4-1BB ligand; 4-1BBL), 단쇄 IL-12 (single chain IL-12; scIL-12), 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 하나 이상의 조절 핵산 서열, 바람직하게는 프로모터 서열을 추가로 포함하는, 상기 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현 수준을 제공하는 벡터.
2. 항목 1에 있어서, 벡터 Im01(도 20)의 발현 구조물에 의해 수득된 4-1BBL의 발현 수준과 비교하여 상기 4-1BBL의 발현 수준은 증가된 것인 벡터.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 벡터 Im01(도 20)의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12 및/또는 IL-2의 발현 수준과 비교하여 상기 scIL-12의 발현 수준은 감소되고 및/또는 상기 IL-2의 발현 수준은 증가된 것인 벡터.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4-1BBL, scIL-12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 서열은 1번 위치에 존재하지 않는 것인 벡터.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vector), 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector), 단순 헤르페스 바이러스 벡터(herpes simplex virus vector), 팍스 바이러스 벡터(pox virus vector), RNA 벡터, 플라스미드 벡터, 나노 입자 벡터, 및 네이키드 DNA(naked DNA) 중 어느 하나인 것인 벡터.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA, 상기 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA, 및/또는 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA인 것인 벡터.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 나타내며, 변이체 핵산 서열은 활성화된 T 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
8. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3의 핵산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 나타내며, 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성을 갖는 IL-2 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
9. 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5의 핵산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 나타내며, 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성을 갖는 scIL-12 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치하는 것인 벡터.
11. 항목 10에 있어서, 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치하고, 상기 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치하는 것인 벡터.
12. 항목 10 또는 11에 있어서, 프로모터는 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하나, 상기 scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 상류에는 위치하지 않는 것인 벡터.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4-1BBL, scIL-12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosomal entry sites; IRES)에 의해 연결되어있는 것인 벡터.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목의 벡터로 형질도입되거나(transduced) 형질주입된(transfected) 암세포 또는 면역세포.
15. 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목의 벡터 또는 항목 14의 암 또는 면역세포를 포함하는 의약.
16. 암, 바이러스 감염 및/또는 면역계 이상을 치료하는 방법에 사용하기 위한 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목의 벡터, 항목 14의 암 또는 면역세포, 또는 항목 15의 의약.
17. 항목 16에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 대장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원발성 뇌 암종(primary brain carcinoma), 두경부암(head-neck cancer), 신경교종(glioma), 교모세포종(glioblastoma), 간암, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 두경부 암종(head or neck carcinoma), 유방 암종, 난소 암종, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부 암종, 고환 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 대장 암종, 전립선 암종, 비뇨 생식기 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발성 골수종(multiple myeloma), 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 췌장 인슐린종(malignant pancreatic insulinoma), 악성 카르시노이드 암종(malignant carcinoid carcinoma), 융모막 암종(choriocarcinoma), 균상식육종(mycosis fungoides), 악성 고칼슘 혈증(malignant hypercalcemia), 자궁경부 과형성(cervical hyperplasia), 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 신경모세포종(neuroblastoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 진성 다혈구증(polycythemia vera), 특발성 혈소판 증가증(essential thrombocytosis), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 연부조직 육종(soft-tissue sarcoma), 중피종(mesothelioma), 골육종(osteogenic sarcoma), 원발성 마크로 글로불린혈증(primary macro globulinemia), 및 망막모세포종(retinoblastoma) 중 어느 하나인 것인 항목 16에 따른 사용을 위한 벡터, 또는 항목 16에 따른 사용을 위한 암 또는 면역세포, 또는 항목 16에 따른 사용을 위한 의약.
18. 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 항목 1 내지 13 중 어느 한 항목의 벡터, 또는 항목 14의 암 또는 면역세포, 또는 항목 15의 의약.
본 발명의 하나 이상의 구체예의 세부 사항은 첨부된 도면 및 이하의 상세한 설명에서 설명된다. 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명 및 도면, 및 청구 범위로부터 명백해질 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "및(and)", 및 "상기(the)" 는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, " (an) 항원"에 대한 언급은 복수의 그러한 항원을 포함하고, "(a) 세포" 또는 "상기(the) 세포"에 대한 언급은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 하나 이상의 세포 및 그의 등가물 (예를 들어, 복수의 세포)에 대한 언급을 포함한다. 유사하게, "(a) 화합물" 또는 "(a) 조성물"에 대한 언급은 복수의 그러한 화합물 또는 조성물을 포함하며, 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 각각 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 의미한다. 수치 또는 수치 범위를 언급할 때 "약(about)"이라는 용어는 언급된 수치 또는 수치 범위가 실험적 가변성 내에서의 근사치임(또는 통계적 실험 오차 이내)을 의미하므로, 수치 또는 수치 범위는 명시된 수치 또는 수치 범위의 1 % 내지 15 % 사이에서 달라질 수 있다. 용어 "포함하는(comprising)" (및 "포함한다(comprise)" 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "가지는(having)" 또는 "포함하는(including)"과 같은 관련된 용어)은 본 명세서에 기재된 다른 소정 구체예에서, 예를 들어, 물질 조성물, 조성물, 방법 등의 일 구체예가 "구성되는(consist of)" 또는 "필수적으로 구성되는(consist essentially of)" 일 수도 있다는 것을 배제하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 개시된 방법 및 조성물의 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법, 장치, 및 물질이 본 명세서에 기재되어있다.
용어 "코돈 최적화 서열(codon optimized sequences)"은 일반적으로 약 20 % 미만의 사용 빈도를 갖는 코돈을 대체함으로써 특정 숙주 종에 최적화된 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 코돈 최적화 이외에도, 위조(spurious) 폴리아데닐화 서열의 제거, 엑손/인트론 스플라이싱 신호의 제거, 트랜스포존-유사 반복의 제거 및/또는 GC 함량의 최적화에 의해 정해진 숙주 종에서의 발현을 위해 최적화된 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 "발현 강화 서열"이라고 칭한다.
본 명세서에서 용어 "프로모터 영역(promoter region)"은 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 하류 (3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 의미하는 것으로 통상적인 의미로 사용된다. 상기 조절 서열은 원하는 유전자 서열과 동종유래이거나 이종유래일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 또는 포유동물 프로모터를 포함하여 광범위한 프로모터가 이용될 수 있다. 상기 프로모터는 DNA 서열에 대해 배열되어 상기 DNA 서열의 전사를 개시할 수 있다.
용어 "조절 핵산 서열(regulatory nucleic acid sequence)"은 숙주 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 종합적으로 제공하는 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제 기점, 인핸서 등을 종합적으로 지칭한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한 이러한 조절 서열 모두가 항상 존재할 필요는 없다. 통상의 기술자는 공개 데이터베이스 및 물질로부터 조절 핵산 서열을 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 통상의 기술자는 의도된 용도, 예를 들어, in vivo, ex vivo, 또는 in vitro에 적용 가능한 조절 서열을 확인할 수 있다.　바람직하게는, 용어 "조절 핵산 서열"은 프로모터 또는 프로모터 서열을 의미한다.
다양한 구체예에 있어서, 용어 "조절 핵산 서열"은 또한 IRES 서열(internal ribosomal entry site, 내부 리보솜 진입 부위)을 지칭한다. 이는 구체적으로 다양한 바람직한 구체예에 적용되며, 그 구체예에서 상기 용어 "조절 핵산 서열"은 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들을 함유하는 트리시스트론(tricistronic) 발현 카세트/벡터 당 하나의 프로모터를 포함하고, 또한 상기 프로모터의 바로 하류에 위치하지 않은 각 시스트론에 대한 IRES 서열을 더 포함한다. 상기 프로모터 및 IRES 서열의 조합은 4-1BBL, IL-2, 및 scIL-12(이 순서로)를 코딩하는 핵산 서열을 4-1BBL에 대한 프로모터, 및 IL-2 및 scIL-12에 대한 IRES 서열과 함께 함유하는 트리시스트론 발현 카세트/벡터에서의 IL-2 및 scIL-12의 발현 수준 또는 발현율에 비해 4-1BBL의 개선된 발현 수준 또는 발현율을 제공하는 것으로 간주되고 입증되었다
어구 "작동 가능하게 위치된(operatively positioned)", "작동 가능하게 연결된(operatively linked)", "조절 하에 있는(under control)" 및 "전사 조절 하에 있는(under transcriptional control)"은 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 방향에 있어서 그 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절한다는 것을 의미한다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용(cis-acting) 조절 서열을 지칭하는 "인핸서(enhancer)"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
WO 2004/035799에는 마우스/인간 단쇄 IL-12 (scIL-12), 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 및 IL-2에 대한 유전자를 이 순서로 5' 에서 3' 방향으로, 즉, 위치 1에서 scIL-12를 코딩하는 유전자, 위치 2에서 4-1BBL을 코딩하는 유전자, 및 위치 3에서 IL-2를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 구조물을 포함하는 아데노바이러스 벡터가 기재되어있다. 이러한 발현 구조물은 WO 2004/035799의 도 1에 나타나 있으며, 그 해당 벡터는 "Ad-3"으로 명명되었다. 본 발명에서, 상기 종래 벡터 "Ad-3"에 대한 내부 벡터 코드는 "Im01"이며, 본 개시의 실시예 1을 또한 참조한다면 알 수 있다.
쥐과동물(murine) 및 인간 Im01의 scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2의 전이유전자 발현은, 본 발명의 실시예 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 전이유전자의 발현 수준이 마우스와 사람 종 간에 명백하게 다른 것으로 나타났다. 특히, 인간 scIL-12, 인간 4-1BBL, 및 인간 IL-2 ("인간 Im01"또는 "hu Im01")의 유전자를 갖는 Im01의 발현은 마우스 scIL-12, 마우스 4-1BBL, 및 마우스 IL-2 ("마우스 Im01" 또는 "m Im01")의 유전자를 갖는 Im01의 발현과 비교하여 IL-12의 현저한 증가를 초래하였다. 따라서, scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2의 유전자의 순서의 배열에 관한 마우스 및 인간 Im01의 동일한 벡터 구조에도 불구하고, 전이유전자의 발현 수준의 현저한 차이가 관찰되었다. 마우스와 인간의 Im01 간의 전이유전자 발현의 차이 중 적어도 일부는 전혀 예상하지 못한 것이다.
본 발명이 제공하는 벡터는 scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자에 관한 새로운 구조를 포함한다. 그 신규 벡터는 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준에 비해 4-1BBL의 증가된 발현을 제공한다. 구체적으로, 본 발명이 제공하는 벡터는 scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 핵산 서열 (또는 3 개의 유전자)이 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열하되, 단, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는 것인 발현 카세트를 포함한다. 이러한 신규 벡터 구조는 특히, 인간 Im01에서 동일한 유전자의 배열에 비해 4-1BBL의 증가된 발현을 제공하며, 동시에 IL-12가 감소한다. 놀랍게도, 이 신규한 벡터 구조는 IFN-γ 반응의 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (본 발명의 실시예 3 및 도 3 및 실시예 11 및 도 19 참조). 본 발명의 신규한 벡터가 제공하는 놀라운 효과는 그러한 치료를 필요로 하는 환자의 면역치료에 특히 유익한 것으로 입증되었다. 구체적으로, 본 개시의 벡터는 비활성 면역 미세환경을 활성 면역 미세환경으로 전환시켜 암 또는 바이러스 감염을 치료하는데 특히 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 벡터는 암 면역치료에 사용하기에 특히 적합하다. 예를 들어, 본 발명의 도 4 및 도 5는 대응되는 실시예 4 및 5에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 벡터가 종래 벡터 Im01에 비해 종양 미세 환경에서의 개선된 면역 자극 효과를 나타낸다는 것을 입증한다.　또한, 전사체 분석은 본 발명의 벡터의 치료 유전자 발현 프로파일이 독특하고 우수하며, 구체적으로 종래 벡터 Im01보다 우수하다는 것을 나타낸다 (실시예 6 및 표 1 및 2 참조). 또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 주요 면역세포 유형(type)의 활성화에 대한 유전자 발현 분석은 본 발명의 벡터에 의한 T 헬퍼세포 및 세포독성 T 세포 (CD8+ T 세포)의 활성화가 종래 벡터 Im01에 의한 동일한 면역세포의 활성화보다 우수한 것으로 나타났다 (실시예 7 참조).
본 개시의 신규한 벡터는 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (sc-IL12), 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 scIL-12를 코딩하는 유전자가 상기 3 개의 유전자의 가장 상류 위치에 있지 않도록 5 '에서 3' 방향으로 배열되었다. 따라서, 본 발명의 신규한 벡터는 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (sc-IL12), 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열하되 단, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 벡터는 4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열을 포함하며, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열하되 단, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 벡터는 4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열을 포함하며, 상기 유전자의 상기 핵산 서열은 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열하되 단, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 1번 위치에 존재하지 않는다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 상기 신규한 벡터는 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (sc-IL12), 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자 (보다 구체적으로는 3 개의 유전자의 핵산 서열)를 포함하는 발현 구조물(또는 발현 카세트)을 포함하며, 상기 유전자는 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자가 발현 카세트의 가장 상류 위치에 있지 않도록 발현 카세트에서 배열된다. 상기 발현 카세트의 가장 상류 위치는 발현 카세트의 5' 말단에서의 위치로서 보다 구체적으로 기술될 수 있다.　또한, 상기 발현 카세트의 가장 상류 위치는 상기 발현 카세트의 3 개의 유전자의 전사를 조절하는 프로모터의 바로 하류(immediately downstream) 위치로서 보다 구체적으로 기술될 수 있다.　상기 프로모터는 상기 발현 카세트의 일부인 프로모터, 또는 상기 발현 카세트의 상류의 프로모터일 수 있다. 상기 발현 카세트에서 3개의 전이유전자 (즉, 4-1BBL, sc-IL12 및 IL-2를 코딩하는 3개의 유전자)의 배열은 상기 3개의 유전자의 핵산 서열은 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 상기 발현 카세트의 상기 3개의 유전자의 1번 위치에 존재하지 않는 효과에 대해 보다 구체적으로 기술될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터는 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (sc-IL12), 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자를 포함하는 발현 구조물 (또는 발현 카세트)을 포함하며, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 벡터는 4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물 (또는 발현 카세트)을 포함하며, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 벡터는 4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열을 포함하는 발현 구조물 (또는 발현 카세트)을 포함하며, 상기 유전자의 상기 핵산 서열은 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 1번 위치에 존재하지 않는다. 다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 발현 카세트 또는 발현 구조물은 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 상기 발현 카세트 (또는 발현 구조물)의 전사를 조절하는 프로모터로서 보다 구체적으로 기술될 수 있다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 발현 카세트의 상류 (또는 상기 5' 말단에) (또는 상기 발현 카세트의 5' 말단의 상류)에 위치하는 하나의 프로모터를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 전술한 조건절의 상기 "1번 위치(position 1)"는 상기 순차적인 1, 2, 3의 순서의 1번 위치로서 보다 구체적으로 기술될 수 있다.
다양한 구체예에 있어서, scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 3개의 유전자의 5'에서 3' 방향으로의 배열은 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (sc-IL12), 및 IL-2를 코딩하는 3개의 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 카세트 또는 발현 구조물에 대한 scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 3개의 유전자의 5'에서 3' 방향으로의 배열을 의미한다. 따라서, 5 '에서 3' 방향은 상기 발현 카세트 (또는 발현 구조체) 또는 상기 발현 카세트의 상기 프로모터의 5 '에서 3' 방향을 의미한다.
본 개시의 다양한 다른 구체예에 있어서, scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 3개의 유전자의 5'에서 3'방향으로의 배열은 본 발명의 발현 카세트 (또는 발현 구조물)의 일부는 아니지만, 상기 발현 카세트 (또는 발현 구조물)의 상류에 위치한, 즉, 상기 발현 카세트 (또는 발현 구조물)의 5' 말단의 상류에 위치한 프로모터에 대한 scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 3개의 유전자의 5'에서 3' 방향으로의 배열을 의미한다. 여기서, 5'에서 3' 방향은 상기 발현 카세트 (또는 발현 구조물)의 5 '말단의 상류의 프로모터의 5'에서 3 '방향을 나타낸다. 상기 발현 카세트의 상류 (또는 상기 발현 카세트의 5 '말단의 상류)에 위치한 프로모터는 발현 카세트 (또는 발현 구조물)의 전사를 조절하는 프로모터로서 보다 구체적으로 기술될 수 있다.
또한, 5'에서 3' 방향은 상기 3개의 전이유전자의 가장 상류 위치에 있는, 본 발명의 3개의 전이유전자 (즉, scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는)의 유전자의 상류의 프로모터의 5'에서 3' 방향을 의미할 수 있다.
본 개시가 제공하는 벡터는 scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자에 관한 새로운 구조를 포함하고, 이는 또한 상기 3개의 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는 효과에 대해 기술될 수 있으며, 상기 1번 위치는 프로모터의 하류, 구체적으로 상기 3개의 유전자의 발현을 위한 프로모터의 하류에 있다. 따라서, 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (sc-IL12), 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 카세트 (또는 발현 구조물)와 관련하여, 상기 3개의 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5 '에서 3'방향으로 배열하되 단, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않으며, 여기에서 1번 위치란 프로모터의 하류, 구체적으로 상기 발현 카세트 (또는 발현 구조물)의 전사/발현을 위한 프로모터의 하류에 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "상류에 위치한(located upstream)"은 "바로 상류에 위치한(located directly upstream)"으로 보다 구체적으로 기술될 수 있다. 또한, "5' 말단에 위치한(located at the 5' end)" 또는 "5' 말단의 상류에 위치한(located upstream of the 5' end)"은 "전사 개시 부위의 5' 말단에 위치한(located at the 5' end of the transcription initiation site)" 또는 "전사 개시 부위의 5'말단의 상류에 위치한(located upstream of the 5' end of the transcription initiation site)" 으로 보다 구체적으로 기술될 수 있다.
본 개시의 신규한 벡터는 4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 유전자 (또는 유전자의 핵산 서열)를 발현할 수 있다. 따라서, 보다 구체적으로, 본 발명의 신규한 벡터는 발현 벡터, 보다 더 구체적으로는 재조합 발현 벡터이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 다양한 구체예에 있어서, 용어 "4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열(nucleic acid sequences of genes encoding 4-1BBL, sc-IL12, and IL-2)"은 "4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열"을 의미하고, 그 역도 마찬가지이다. 따라서, 다양한 구체예에 있어서, 용어 "4-1BBL을 코딩하는 유전자의 핵산 서열(nucleic acid sequence of a gene encoding 4-1BBL)"은 "4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열"을 의미하고, 그 역도 마찬가지이다. 따라서, 다양한 구체예에 있어서, 용어 "scIL-12를 코딩하는 유전자의 핵산 서열(nucleic acid sequence of a gene encoding scIL-12)"은 "scIL-12를 코딩하는 핵산 서열"을 의미하고, 그 역도 마찬가지이고, "IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열(nucleic acid sequence of a gene encoding IL-2)"은 "IL-2를 코딩하는 핵산 서열"을 의미하며, 그 역도 마찬가지이다. 마찬가지로, 다양한 구체예에 있어서, 용어 "sc-IL12 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열(nucleic acid sequences of genes encoding sc-IL12 and IL-2)"은 "sc-IL12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열"을 의미하고, 그 역도 마찬가지이다. 본 명세서에서 추가로 기술된 바와 같이, 다양한 구체예에 있어서, 용어 "4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 유전자(genes encoding 4-1BBL, sc-IL12, and IL-2)"는 "4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열"을 의미하고, 그 역도 마찬가지이다. 따라서, 다양한 구체예에 있어서, 용어 "4-1BBL을 코딩하는 유전자(gene encoding 4-1BBL)"는 "4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열"을 의미하고, 그 역도 마찬가지이다. 마찬가지로, 다양한 구체예에 있어서, 용어 "sc-IL12 및 IL-2를 코딩하는 유전자(genes encoding sc-IL12 and IL-2)"는 "sc-IL12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열"을 의미하고, 그 역도 마찬가지이다.
본 개시의 신규한 벡터는 scIL-12 및 IL-2의 발현에 비해 4-1BBL의 높은 발현을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 적어도 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (scIL-12) 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공하며, 상기 벡터 시스템은 scIL-12 및 IL-2의 발현에 비해 4-1BBL의 높은 발현을 제공한다. 상기 4-1BBL의 높은 발현은 상기 3개의 전이유전자의 전사를 조절하는 프로모터의 상이한 프로모터 강도에 의해 조절된다. 상기 하나 이상의 벡터는 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 발현 할 수 있는 발현 벡터이다. 보다 구체적으로, 상기 발현 벡터는 재조합 발현 벡터이다. 다양한 구체예에 있어서, 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템은 일정한 수준의 IL-12 및 IL-2 생산을 제공하면서 높은 수준 또는 증가된 수준의 4-1BBL 생산을 제공한다. 다양한 구체예에 있어서, 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템은, 본 명세서의 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 암세포 또는 면역세포의 5 % 이상이 4-1BBL을 발현시키도록 하기 위한 의학적 환경으로 사용될 수 있다.
일 측면에 있어서, 본 발명은 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공하고, 상기 벡터 시스템은 일정한 수준의 IL-12 및 IL-2 생산을 제공하면서 높은 수준 또는 증가된 수준의 4-1BBL 생산을 제공한다. 이는 IFN-γ 발현이 4-1BBL 수준의 증가에 의존한다는 것을 보여주는 도 19의 결과를 반영한다. 도 19에 나타난 바와 같이, IL-12 및 IL-2가 MOI [5]의 일정한 수준이면서 4-1BBL 수준이 MOI [100]까지 증가하는 조합은, 적당한 IL-12 수준에서 IFN-γ 유도의 증가를 유발한다. 다양한 구체예에 있어서, 본 개시의 벡터 시스템은 IL-12 및 IL-2의 일정한 수준에서 4-1BBL의 증가된 수준으로 의학적 환경, 바람직하게는, 암의 치료에서 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 벡터 시스템은 MOI [10]로 4-1BBL을 코딩하는 벡터 및 MOI [5]로 IL-2 및 IL-12를 코딩하는 벡터로 의학적 환경에서 사용될 수 있다. 또한, 상기 벡터 시스템은 MOI [10]으로 4-1BBL을 코딩하는 벡터 및 MOI [5]로 IL-2 및 IL-12를 각각 코딩하는 2 개의 벡터로 의학적 환경에서 사용될 수 있다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 MOI [25]로 4-1BBL을 코딩하는 벡터 및 MOI [5]로 IL-2 및 IL-12를 코딩하는 1개 또는 2 개의 벡터로 의학적 환경에서 사용될 수 있다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 MOI [50]으로 4-1BBL을 코딩하는 벡터 및 MOI [5]로 IL-2 및 IL-12를 코딩하는 1개 또는 2 개의 벡터로 의학적 환경에서 사용될 수 있다. 다양한 추가적인 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 MOI [100]으로 4-1BBL을 코딩하는 벡터 및 MOI [5]로 IL-2 및 IL-12를 코딩하는 1개 또는 2 개의 벡터로 의학적 환경에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 4-1BBL을 코딩하는 벡터에 적용된 MOI는 본 명세서의 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 암세포 또는 면역세포의 5 % 이상이 4-1BBL을 발현하는 것을 달성한다.
상기 언급된 의학적 환경은 이에 한정되는 것은 아니나, 암 또는 바이러스 감염의 치료를 포함한다. 바람직하게는, 상기 의학적 환경은 암의 치료를 의미하며, 보다 바람직하게는 고형 암 또는 고형 종양의 치료를 의미한다.
본 발명의 신규한 벡터 시스템은 4-1BBL, sc-IL12, 및 IL-2를 코딩하는 유전자들(또는 상기 유전자들의 핵산 서열)를 발현할 수 있다. 따라서, 보다 구체적으로, 본 발명의 신규한 벡터 시스템은 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 발현 벡터 시스템이고, 보다 더 구체적으로 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 발현 벡터 시스템이다. 다양한 바람직한 구체예에 있어서, 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 하나이상의 벡터의 벡터 유형은 상기 벡터 시스템의 모든 벡터에서 동일하다. 상기 벡터는 전형적으로 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들을 가질 수 있는 유형이다. 따라서, 상기 벡터는 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들을 취할 수 있는 능력을 갖는 유형이다. 바람직하게는, 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 각각은 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 레트로 바이러스 벡터(retroviral vector), 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector), 팍스 바이러스 벡터(pox virus vector), 백시니아 바이러스 벡터 (vaccinia virus vector), 바람직하게는 MVA, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vector), 헤르페스 바이러스 벡터(aherpes virus vector), 알파 바이러스 벡터(alpha virus vector) 및 홍역 바이러스 벡터(measles virus vector)중 어느 하나이다. 보다 바람직하게는, 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 각각은 아데노바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 팍스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 바람직하게는 MVA, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 헤르페스 바이러스 벡터이다. 보다 더 바람직하게는, 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 각각은 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 백시니아 바이러스 벡터, 바람직하게는 MVA이다.
본 발명은 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 하나 이상의 벡터에 기초한 면역 자극 벡터 시스템의 맥락에서 IFN-γ 발현과 4-1BBL 수준의 증가 사이의 관계를 입증한다. 실시예 11에 기재되고 도 19에 나타난 바와 같이, Im02의 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 전이유전자 발현 및 IFN-γ 반응과 단일-유전자 발현 벡터의 조합은 IFN-γ 발현이 증가하는 4-1BBL 수준에 의존한다는 것을 보여준다.　도 19에 나타난 바와 같이, 모두 MOI [5]인 일정한 수준의 IL-12 및 IL-2 및 MOI [100]까지 증가한 4-1BBL 수준의 조합은 적당한 IL-12 수준에서 IFN-γ 유도의 증가를 유발한다. 본 발명의 중요한 발견은 IFN-γ의 최대 유도 및 관련된 면역 활성화가 벡터 Im02에 도시된 바와 같은 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 특정 배열에 의해서뿐만 아니라, scIL-12 및 IL-2의 발현과 비교하여 4-1BBL의 증가된 또는 높은 발현을 제공하는 대안적인 구체예에 의해 달성될 수 있다는 것이다. 따라서, 본 발명은 벡터는 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, 상기 벡터는 IL-12 및 IL-2의 일정한 수준에서 4-1BBL 의 높은 또는 증가된 수준의 생산을 위해 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 또한 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 추가적으로 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 또는 높은 발현 수준을 위해 제공하는 적어도 하나의 조절 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 양상은 벡터 Im02는 scIL-12 및 IL-2의 발현과 비교하여 4-1BBL의 높은 발현을 제공하는 것으로 나타난 것, 및 위에서 논의된 바와 같이, MOI [5]의 IL-12와 IL-2의 일정한 수준과 MOI [100]까지의 4-1BBL의 수준의 증가의 조합은 적당한 IL-12 수준에서 IFN-γ 유도의 증가로 이어진다는 것에 대한 발견을 반영한다.
도 3 및 도 19는 본 개시의 벡터 또는 벡터 시스템으로 수득된 4-1BBL의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 4-1BBL의 발현 수준과 비교하여 증가함을 나타낸다. 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 상기 4-1BBL의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 4-1BBL의 발현 수준에 비해 증가하였다.
도 3 및 도 19는 또한 scIL-12의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12의 발현 수준과 비교하여 감소함을 나타낸다. 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 상기 scIL-12의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12의 발현 수준과 비교하여 감소함을 나타낸다.
도 3 및 도 19는 추가적으로 IL-2의 발현 수준이 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 IL-2의 발현 수준과 비교하여 증가함을 나타낸다. 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 상기 IL-2의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 IL-2의 발현 수준과 비교하여 증가함을 나타낸다.
본 발명은 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 추가적으로 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 4-1BBL의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 또는 높은 발현 수준을 위해 제공하는 적어도 하나의 조절 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 바람직하게는, scIL-12의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12의 발현 수준과 비교하여 감소하였고 및/또는 IL-2의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 IL-2의 발현 수준과 비교하여 증가하였다. 보다 구체적으로는, 적어도 하나의 조절 핵산 서열이 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12의 발현 수준과 비교하여 scIL-12의 감소된 발현 수준을 제공하고 및/또는 적어도 하나의 조절 핵산 서열이 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 IL-2의 발현 수준과 비교하여 IL-2의 증가된 발현 수준을 제공한다.
벡터 Im01의 발현 구조물은 실시예 1에 도시하였고, 순차적인 순서: 5'- CMV - scIL-12 - IRES - 4-1BBL - IRES - IL-2 - 폴리-A 신호 - 3'로 5' 에서 3' 방향으로 배열된 CMV 프로모터, 2개의 IRES 요소, scIL-12, 4-1BBL, IL-2 및 폴리-A-신호를 포함한다.
보다 구체적으로, 벡터 Im01의 발현 구조물은 WO 2004/035799 A2의 도 1에 나타낸 "Ad-3"으로 표시한 벡터의 발현 구조물에 해당한다. 상기 벡터 "Ad-3"의 발현 구조물은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다. WO 2004/035799 A2의 도 1에서, "Ad-3"이라는 명칭은 상기 도 1에 나타낸 당해 발현 구조물 또는 카세트를 갖는 완전한 벡터를 의미한다.　따라서, 벡터 "Ad-3"의 발현 구조물은 WO 2004/035799 A2의 도 1의 하단 라인에 도시된 발현 구조물을 의미한다.　본 발명에서, 벡터 Im01의 발현 구조물은 바람직하게는, WO 2004/035799 A2의 도 1에 나타낸 벡터의 발현 구조물 "Ad-3"의 발현 구조물에 해당하고, scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 인간 cDNA를 포함한다. 따라서, 본 발명에서 언급된 벡터 Im01의 발현 구조물은 순차적인 순서: 5'- CMV - 인간 scIL-12 - PV-IRES - 인간 4-1BBL - EMCV-IRES - 인간 IL-2 - SV-40 폴리-A -3'로 5' 에서 3' 방향으로 배열된 다음의 요소를 포함한다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, "벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 발현 수준"에 대한 언급은 "벡터 Im01에 의해 수득된 발현 수준"을 의미한다. 벡터 Im01은 아데노바이러스 벡터이다. 따라서, 본 발명의 다양한 구체예에 있어서, "벡터 Im01에 의해 수득된 발현 수준"에 대한 언급은 WO 2004/035799 A2의 도 1에 나타낸 벡터"Ad-3"의 발현구조물을 scIL-12, 4-1BBL, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 인간 cDNA와 함께 포함하는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 보다 구체적으로는, "벡터 Im01에 의해 수득된 발현 수준"에 대한 언급은 다음의 순차적인 순서로 5' 에서 3' 방향으로 배열된 다음의 요소를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 의해 수득된 발현 수준을 의미한다: 5'- CMV - 인간 scIL-12 - PV-IRES - 인간 4-1BBL - EMCV-IRES - 인간 IL-2 - SV-40 폴리-A -3'. 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, "벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 발현 수준"에 대한 언급은 도 20에 나타낸 바와 같은 "벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 발현 수준"을 의미한다. 따라서, 도 20과 관련하여, 벡터 Im01은 셔틀 벡터 hu pE1.1 Im01을 의미한다. 도 20에 나타낸 벡터 Im01의 발현 구조물은 CMV 프로모터, 인간 scIL-12, PV IRES, 인간 4-1BBL, EMCV IRES, 인간 IL-2, 및 SV40폴리A를 포함한다. 도 20에 도시된 셔틀 벡터 hu pE1.1 Im01의 뉴클레오티드 서열은 총 7,845 bp이다. CMV 프로모터, 인간 scIL-12, PV IRES, 인간 4-1BBL, EMCV IRES, 인간 IL-2, 및 SV40폴리A의 뉴클레오티드 서열은 도 2에 도시된 셔틀 벡터 hu pE1.1 Im02의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 서열번호 11 (도 17)의 뉴클레오티드 서열에서 확인할 수 있다. 셔틀 벡터 hu pE1.1 Im01의 CMV 프로모터, 인간 scIL-12, PV IRES, 인간 4-1BBL, EMCV IRES, 인간 IL-2, 및 SV40폴리A의 뉴클레오티드 서열은 셔틀 벡터 hu pE1.1 Im02의 CMV 프로모터, 인간 4-1BBL, EMCV IRES, 인간 IL-2, PV IRES, 인간 scIL-12, 및 SV40폴리A의 각각의 뉴클레오티드 서열과 상응한다.
다양한 바람직한 구체예에 있어서, "벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 발현 수준"이란 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 DNA를 갖는 플라스미드 또는 벡터 내로 클로닝되거나 서브-클로닝된 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 발현 수준을 의미한다. 보다 바람직하게는, "벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 발현 수준"이란 아데노바이러스 벡터 내로 클로닝되거나 서브-클로닝된 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 발현 수준을 의미한다.
다양한 구체예에 있어서, 상기 벡터 유형은 4-1BBL, scIL-12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 벡터 Im01의 발현 구조물을 포함하는 벡터의 것과 동일하다. 상기　벡터는 전형적으로 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 가질 수 있는 유형이다. 따라서, 상기 벡터는 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 취할 수 있는 능력을 갖는 유형이다. 바람직하게는,　4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 각각은 아데노바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 팍스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 바람직하게는 MVA, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 알파 바이러스 벡터, 및 홍역 바이러스 벡터 중 어느 하나이다. 보다 바람직하게는, 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 각각은 아데노바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 팍스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 바람직하게는 MVA, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 또는 헤르페스 바이러스 벡터이다. 보다 더 바람직하게는, 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터 각각은 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 백시니아 바이러스 벡터, 바람직하게는 MVA이다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, "벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 발현 수준" 또는 "벡터 Im01에 의해 수득된 발현 수준"이란 벡터(즉, 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템, 또는 벡터 Im01 또는 벡터, 바람직하게는 벡터 Im01의 발현 구조물을 포함하는 아데노바이러스 벡터)로 형질도입될 종양 세포주, 바람직하게는 인간 A549 세포, 및 표적 세포로서 인간 혈액 면역세포의 후속 오버레이(overlay)를 포함하는 표준 in vitro 발현 시스템의 적용에 의해 수득된 발현 수준을 의미한다.
따라서, 본 발명은 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 추가적으로 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준에 비해 4-1BBL의 증가된 발현 수준을 위해 제공하는 적어도 하나의 조절 핵산 서열을 포함하는 포함하는 벡터를 제공하며, 상기 발현 수준은 벡터로, 바람직하게는 벡터 Im01의 발현 구조물을 포함하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입될 종양 세포주, 바람직하게는 인간 A549 세포주, 및 인간 혈액 면역세포, 바람직하게는, 말초혈액단핵세포 (PBMCs)를 포함하는 in vitro 발현 시스템 (또는 발현 분석)에서 결정된다.
본 명세서에 있어서, 용어 발현 수준(expression level) 또는 전이유전자 발현 수준(transgene expression level) 및 발현율(expression rate) 또는 전이유전자 발현율(transgene expression rate)은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 제공되는 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 발현 수준은 전이유전자-특이적인, 즉, 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 제공되는 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 발현 수준에 특이적인 면역반응을 유도한다. 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 제공되는 발현 수준은 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현 수준에 특히 특이적인 면역반응을 유도한다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 제공되는 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 발현 수준은 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현 수준에 특히 특이적인 면역반응을 유도하고, 상기 4-1BBL의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 4-1BBL의 발현 수준과 비교하여 증가하였다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 제공되는 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 발현 수준은 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현 수준에 특히 특이적인 면역반응을 유도하고, 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12 및/또는 IL-2의 발현 수준과 비교하여 상기 scIL-12의 발현 수준은 감소하였고 및/또는 상기 IL-2의 발현 수준은 증가하였다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 제공되는 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 발현 수준은 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현 수준에 특히 특이적인 면역반응을 유도하고, 상기 4-1BBL의 발현 수준은 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 4-1BBL의 발현 수준과 비교하여 증가하였고, 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12 및/또는 IL-2의 발현 수준과 비교하여 상기 scIL-12의 발현 수준은 감소하였고 및/또는 상기 IL-2의 발현 수준은 증가하였다.
상기 전이유전자-특이적인 면역반응은 바람직하게는 전이유전자-특이적인 IFN-γ 반응 또는 전이유전자-특이적인 IFN-γ 발현 또는 생산을 의미한다. IFN-γ 수준을 포함한 사이토카인 수준은 ELISA에 의해 정기적으로 분석될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 발현 수준에 의해 유도된 전이유전자-특이적인 면역반응은 in vitro 분석, 바람직하게는 ELISA에 의해 검출되거나 결정된다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열들은 2 개의 개별적인 조절 핵산 서열들로부터 하나의 벡터에 의해 발현되고, 그중 하나의 조절 핵산 서열은 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하며, 다른 하나의 조절 핵산 서열은 IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트의 상류에 위치한다. 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열을 5'- IL-2 - scIL-12 -3'의 순서로 5'에서 3 '방향으로 포함한다. 본 발명에 따르면, 상기 2개의 조절 핵산 서열은 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 또는 높은 발현 수준을 제공하고 및/또는 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 4-1BBL의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 또는 높은 발현 수준을 제공한다. 바람직하게는, 상기 2개의 조절 핵산 서열은 또한 또는 추가적으로 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12의 발현 수준과 비교하여 scIL-12의 감소된 발현 수준을 제공하고 및/또는 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 IL-2의 발현 수준과 비교하여 IL-2의 증가된 발현 수준을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조절 핵산 서열은 프로모터 서열이다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열들은 3 개의 개별적인 조절 핵산 서열들로부터 하나의 벡터에 의해 발현되고, 그중 하나의 조절 핵산 서열은 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하고, 하나의 조절 핵산 서열은 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하며. 하나의 조절 핵산 서열은 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치한다.　본 발명에 따르면, 상기 3개의 조절 핵산 서열은 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 또는 높은 발현 수준을 제공하고 및/또는 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 4-1BBL의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 또는 높은 발현 수준을 제공한다. 바람직하게는, 상기 3개의 조절 핵산 서열은 또한 또는 추가적으로 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 scIL-12의 발현 수준과 비교하여 scIL-12의 감소된 발현 수준을 제공하고 및/또는 벡터 Im01의 발현 구조물에 의해 수득된 IL-2의 발현 수준과 비교하여 IL-2의 증가된 발현 수준을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조절 핵산 서열은 프로모터 서열이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 조절 핵산 서열(들)은 바람직하게는 프로모터(들) (서열(들)) 또는, 보다 구체적으로, 발현 프로모터(들) (서열(들))를 의미한다. 4-1BBL의 증가된 또는 높은 발현 수준을 의도하기 위해 사용될 수 있는 강력한 프로모터는 다음 중 어느 하나를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 거대세포 바이러스 (Cytomegalovirus; CMV), 연장 인자 1 알파 (Elongation Factor 1 Alpha; EF1A), 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus; RSV) 시미안 바이러스 40 (Simian Virus 40; SV40). CMV는 특히 바람직한 프로모터이다. 이러한 프로모터는 본 발명의 다양한 구체예에서 사용될 수 있으며, scIL-12 및 IL-2의 발현 수준과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현 수준을 제공할 수 있는 바람직한 프로모터를 나타낸다. 이는 구체예에 구체적으로 적용되고, 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 3개의 핵산 서열은 트리시스트론 카세트에 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열되고, 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하며, 바람직하게는 상기 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 3개의 핵산 서열은 다음의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열된다: 5'- 4-1BBL - IL-2 - scIL-12 -3'.
IL-2 및/또는 IL-12의 발현을 의도하기 위해 사용될 수 있는 프로모터는 포스포글리세레이트 키나아제 (Phosphoglycerate Kinase; PGK) 및 유비퀴틴 C (Ubiquitin C; UBC)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 프로모터는 본 발명의 다양한 구체예에서 사용될 수 있고, IL-2 및 IL-12의 의도된 발현 수준을 제공할 수 있는 바람직한 프로모터를 나타낸다.　구체적으로, 이러한 프로모터는 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열이 2 개의 개별 조절 핵산 서열로부터 하나의 벡터에 의해 발현되고, 상기 하나의 조절 핵산 서열은 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하며, 다른 하나의 조절 핵산 서열은 IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트의 상류에 위치하는 구체예에서 사용될 수 있다. 이러한 프로모터는 또한 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열이 3 개의 개별 조절 핵산 서열로부터 하나의 벡터에 의해 발현되고, 상기 하나의 조절 핵산 서열은 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하고, 하나의 조절 핵산 서열은 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하며. 하나의 조절 핵산 서열은 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하는 구체예에서 사용될 수 있다.
다양한 구체예에 있어서, 4-1BBL, scIL-12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 적어도 하나의 조절 핵산 서열은 벡터 Im02에 의해 수득된 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2와 동일한 발현 수준 또는 발현율을 제공한다.
본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템의 하나 이상의 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터(herpes simplex virus vector), 팍스 바이러스 벡터, RNA 벡터, 플라스미드 벡터, 나노 입자 벡터, 및 네이키드 DNA(naked DNA), 또는 이들의 조합 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 신규한 벡터/벡터 시스템의 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러성 벡터는 살아 있는, 약독화된 (attenuated), 복제-조건부 또는 복제-결함성일 수 있으며, 또한 비-병원성 (결함), 복제능(replication-competent) 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템의 하나 이상의 벡터는 레트로 바이러스 벡터 게놈, 렌티 바이러스 벡터 게놈, 팍스 바이러스 벡터 게놈, 백시니아 바이러스 벡터 게놈, 아데노바이러스 벡터 게놈, 아데노-관련 바이러스 벡터 게놈, 헤르페스 바이러스 벡터 게놈, 알파 바이러스 벡터 게놈, 플라스미드 DNA 및 RNA로부터 선택된다.
바이러스 벡터의 안전성 특징, 예를 들어 통합 결함(integration deficiency)이 바람직하게 포함된다. 일 구체예에 있어서, 통합 결함은 벡터 게놈의 요소에 의해 부여될 수 있으나, 또한 패키징(packaging) 시스템의 요소(예를 들어, 벡터 게놈의 일부는 아니나 트랜스로 공급될 수 있는 비기능성 인테그레이즈(integrase) 단백질)로부터 유래될 수 있다.
다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템의 하나 이상의 벡터는 복제용 벡터이다. 바람직하게는, 상기 복제용 벡터는 복제하는 바이러스 벡터이고, 보다 바람직하게는 복제하는 아데노바이러스 벡터이다. 다양한 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템의 하나 이상의 벡터는 비-복제용 벡터, 바람직하게는 비-복제능 바이러스 벡터(non-replication competent virus vector), 보다 바람직하게는, 비-복제능 아데노바이러스 벡터이다.
본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템의 하나 이상의 벡터가 RNA 벡터인 경우, 이들은 삽입된 변형 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)를 포함할 수 있다.
본 발명의 예시적인 바이러스 벡터는 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 팍스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 및 알파 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
소정 구체예에 있어서, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터는 3개의 유전자 4-1BB 리간드 (4-1 BBL), 단쇄 IL-12 (scIL-12) 및 IL-2의 발현을 위해 사용될 수 있다. 벡터를 관리하기 위한 몇 가지 아데노바이러스 벡터 시스템 및 방법이 기재되어있다 (예를 들어, Mercier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101:6188-93 참조).
레트로 바이러스 벡터는 마우스 백혈병 바이러스 (murine leukemia virus; MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (gibbon ape leukemia virus; GaLV), 동종지향성 레트로바이러스(ecotropic retroviruses), 유인원 면역결핍 바이러스 (simian immunodeficiency virus; SIV), 인간 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus; HIV), 및 이들의 조합에 기초한 것들을 포함할 수 있다,
소정 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템의 하나 이상의 벡터는 레트로 바이러스 벡터, 바람직하게는 렌티 바이러스 벡터이다. 인간 유전자 치료에 적합한 게놈-기반한 렌티 바이러스 벡터는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV-1), HIV-2, 고양이 면역 결핍 바이러스 (feline immunodeficiency virus; FIV), 말 감염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus), 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular Stomatitis Virus; VSV), 및 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)에 기초한 것들이 있다.
다양한 구체예에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 DNA 또는 코스미드(cosmid) DNA이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA는 당해 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 용이하게 구성된다. 상기 벡터는 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주에 형질도입될 수 있는 플라스미드 형태로 구성될 수 있다. 상기 플라스미드는 일반적으로 박테리아에서 플라스미드의 복제에 유용한 서열을 포함한다. 그러한 플라스미드는 당해 기술분야에 공지되어있다. 또한, 원핵생물 복제 기점을 포함하는 벡터는 또한 그의 발현이 약물 내성과 같은 검출 가능하거나 선택 가능한 마커를 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 감염성 질환 또는 암 환경(setting)에서 면역반응을 유도하는 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2의 발현을 지시하기 위해, 각 벡터에서의 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 적절한 발현 조절 서열(조절 발현 서열 또는 특징이라고도 함)을 포함해야 한다. 코딩된 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 발현 조절 요소는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 유도성 프로모터, 구성적인(constitutive) 프로모터, 분비 신호, 인핸서, 리더(leaders) 및 다른 조절 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 상기 발현 벡터는 적어도 하나의 조절 발현 서열 (발현 조절 서열)을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 발현 벡터가 바이러스 벡터 게놈을 포함할 때, 특정 표적 세포에서 4-1BBL, sclL-12 및 IL-2의 발현이 요구된다. 전형적으로, 예를 들어, 바이러스 벡터에서 4-1BBL, scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 5' LTR 및 3' LTR 서열 사이에 위치한다. 또한, 상기 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(들)은 바람직하게는 다른 유전적 또는 조절 서열 또는 특징, 예를 들어, 특정 방식으로 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 또는 인핸서를 포함하는 전사 조절 서열과 기능적인 관계로 작동 가능하게 연결된다. 바이러스 벡터 구조물과 관련하여, "내부(internal)" 프로모터/인핸서는 바이러스 벡터의 5' LTR 및 3' LTR 서열의 사이에 위치한 것이고, 관심있는 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 상기 내부 프로모터/인핸서는 그것이 기능적인 관계에 있는 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려진 임의의 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 조합일 수 있다.　"기능적인 관계(functional relationship)" 및 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 서열이 프로모터 및/또는 인핸서에 대해 정확한 위치 및 방향에 있어 관심있는 서열이 프로모터 및/또는 인핸서가 적절한 분자와 접촉할 때 발현될 수 있는 것을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다.　일 예에 있어서, 유용한 전사 조절 서열은 시간적 및 공간적으로 활성에 대해 고도로 조절되는 서열이다. 내부 프로모터/인핸서의 선택은 3 개의 유전자 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2의 원하는 발현 패턴 및 공지된 프로모터/인핸서의 특정 특성에 기초한다. 따라서, 상기 내부 프로모터는 구성적으로 활성일 수 있다. 사용될 수 있는 구성적인 프로모터의 비-제한적인 예는 CMV 프로모터를 포함한다. 본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 신규한 벡터/벡터 시스템은 scIL-12 및 IL-2와 비교하여 4-1BBL의 높은 발현을 제공하는 내부 프로모터/인핸서를 포함한다. 바이러스 게놈 및 포유 동물 게놈의 많은 인핸서가 확인되고 특징화되었다 (예를 들어, GenBank와 같은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스 참조).
인핸서는 대개 보통 약 10 내지 300 bp 길이의 DNA의 cis-작용 요소이며, 프로모터에 작용하여 그의 전사를 증가시킨다. 포유동물 유전자 및 진핵 세포 바이러스 유래 많은 인핸서 서열이 알려져 있다. 예를 들어, 복제 기점의 말기 부분(bp 100-270)상의 SV40 인핸서, 거대세포 바이러스의 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 말기 부분상의 폴리오마(polyoma) 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 들 수 있다. 상기 인핸서는 관심 유전자(들)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱(splicing)될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5 ' 부위에 위치한다. 인핸서는 이종유래 프로모터와 결합되어 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2의 원하는 발현 패턴에 기초하여 적절한 인핸서를 선택할 수 있다.
다양한 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 조직 특이적인 프로모터일 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 표적 세포-특이적인 프로모터이다. 또한, 프로모터는 4-1BBL, scIL-12 및/또는 IL-2의 유도성 발현을 허용하도록 선택 될 수 있다. 테트라사이클린(tetracycline) 반응 시스템, 락 작동자(lac operator)-억제자(repressor) 시스템뿐만 아니라 열 충격, 금속 이온, 인터페론, 저산소증, 스테로이드, 및 방사선을 포함하는 다양한 환경적 또는 생리적 변화에 반응하는 프로모터를 포함하는 유도성 발현을 위한 다수의 시스템이 당해 기술분야에 공지되어있다. 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자 각각의 원하는 발현을 수득하기 위해 프로모터의 조합이 사용될 수 있다. 통상의 숙련된 기술자는 유기체 또는 관심 대상인 표적 조직 또는 표적 세포에서 폴리뉴클레오티드 서열(들)의 원하는 발현 패턴에 기초하여 프로모터를 선택할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 발현 벡터는 적어도 하나의 RNA 폴리머라제 II 또는 III 반응성 프로모터를 포함할 수 있다. 이 프로모터는 적어도 4-1BBL, scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 폴리 뉴클레오티드 서열(들)에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 또한 종결 서열에 연결될 수 있다. 또한, 하나 이상의 RNA 폴리머라제 II 또는 III 프로모터가 포함될 수 있다. RNA 폴리머라제 II 및 III 프로모터는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
세포-매개 면역반응을 유도하기 위해 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 재조합 발현 벡터를 특정 표적 세포 또는 표적 조직에 전달하는 것을 표적으로 할 경우, 벡터 게놈은 일반적으로 표적 세포 또는 표적 조직에 의해 인식되고 관심 서열(들), 바이러스 성분들(벡터가 바이러스 벡터인 경우), 및 본 명세서에서 논의된 다른 서열들에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 포함할 것이다.
프로모터는 유도성, 구성적, 일시적으로 활성 또는 조직 특이적일 수 있다. 유도성 프로모터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현이 예를 들어, 특정 조직에서 켜지거나 꺼질 수 있기 때문에 유전 공학에서 유용한 도구이다. 유도성 프로모터는 화학적-조절 프로모터, 및 물리적-조절 프로모터로 분류될 수 있다. 전형적인 화학적-조절 프로모터는 스테로이드-조절된 프로모터 (예를 들어, 래트의 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor; GR)-기반 프로모터, 인간 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor; ER)-기반 프로모터), 금속-조절된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자-기반 프로모터), 및 병원체(pathogenesis)-관련 프로모터 (예를 들어, 애기장대(Arabidopsis) 및 옥수수(maize) 병원체-관련 (pathogen-related; PR) 단백질-기반 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전형적인 물리적-조절 프로모터는 온도-조절 프로모터 (예를 들어, 열 충격 프로모터), 및 광-조절 프로모터 (예를 들어, 대두 SSU 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 예시적인 프로모터는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
다양한 구체예에 있어서, 인간 거대세포 바이러스(CMV)의 즉각 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복을 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 발현을 달성하기 위해 당해 기술분야에 잘 알려진 다른 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 박테리아 파지 프로모터의 사용도 또한 고려된다. 통상의 기술자는 특정 상황에 기초하여 적절한 프로모터를 선택할 수 있다. 많은 다른 프로모터가 발현될 폴리뉴클레오티드 서열에 프로모터를 작동 가능하게 연결시키는 방법으로서 당해 기술분야에 기술되어있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터 모두가 패키징 세포 및 표적 세포 또는 표적 조직에서 발현을 지시하는데 사용될 수 있다. 이종 프로모터는 천연 프로모터와 비교하여 일반적으로 원하는 단백질의 더 높은 전사 및 더 높은 수율을 허용하므로 전형적으로 사용된다. 상기 프로모터는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 파울팍스(fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 조류 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 거대세포 바이러스, 레트로 바이러스, B 형 간염 바이러스 및 유인원 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득될 수 있다. 상기 프로모터는 또한 표적 세포 또는 표적 조직과 양립 할 수 있다면 예를 들어, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴(actin) 프로모터 또는 면역 글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터, 또는 일반적으로 천연 서열과 관련된 프로모터일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 바이러스 발현 시스템에서 자연적으로 발생하는 바이러스 프로모터이다. 일부 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 종양세포-특이적인 프로모터이다.
발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 진핵 세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비번역 영역의 5' 에서 종종, 3'에서 때때로 발견되며 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 추가적으로 하나 이상의 면역원을 코딩할 수 있고, 이는 발암성(oncogenic) 바이러스(예를 들어, EBV, HPV, HBV, HCV, HTLV, 및 KSHV)로부터의 면역원 및 종양-관련 항원을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 종양-관련 항원은 방광암, 간암, 메르켈(Merkel) 세포 암종, 신장 세포 암종, 전립선 암, 중피종(mesothelioma), 췌장암, 흑색종, 유방암, 대장 암, 폐암, 난소 암으로부터의 종양-관련 항원이다. 보다 바람직하게는, 상기 종양-관련 항원은 방광암으로부터 유래한다. 일 구체예에 있어서, 상기 종양-관련 항원은 p53, Ras, c-Myc, A-Raf, B-Raf, C-Raf, NY-ESO-1, LAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, CT7, CT10, GAGE, IMP3, BK T-항원, MART-1, DAM-6, NA88-A, Gp100, PSA, PSM, 티로시나아제 (Tyrosinase), TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, MUC1, MUC2, TRK 수용체, PRAME, P15, SART-1, SART-2, SART-3, 빌름스 종양 항원(Wilms' tumor antigen; WT1), AFP, CEA, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, RAGE, 707-AP, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (interferon regulatory factor 4; IRF4), 종양-관련 칼슘 신호 형질도입체 1 (Tumor-associated calcium signal transducer 1; TACSTD1) TACSTD2, 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinases), 상피 성장 인자 수용체 (Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (platelet derived growth factor receptor; PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (vascular endothelial growth factor receptor; VEGFR), 세포질 티로신 키나아제 (cytoplasmic tyrosine kinases), src-군, 핵 인자-카파 B (Nuclear Factor-Kappa B; NF-κB), 노치 수용체(Notch receptors), c-Met, 세포외 신호-조절된 키나아제 (extracellular signal-regulated kinases; ERKs), PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린(Mesothelin), 신장 세포 암종-5T4, SM22-알파, STEAD, hTERT, 암종 전좌 중단점 (sarcoma translocation breakpoints), EpCAM, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체(androgen receptor), 사이클린 B1, MYCN, BORIS, 정자 단백질 17, SSX2, B7H3, TIE2, 페이지(Page) 4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, 및 fos 관련된 항원 1 중 어느 하나이다. 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 종양-관련 항원은 방광암 항원으로부터 선택되는 방법을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 상기 방광암 항원은 CTA, NY-ESO-1, LAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10, CT7, CT10, GAGE, PRAME; BAGE; RAGE, SAGE, HAGE, MPHOSPH1, DEPDCI, IMP3 및 MAGE-A, 및 BK T-항원 중 어느 하나이다.
상기 발현 벡터가 바이러스 벡터 게놈인 경우, 바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 바이러스 벡터 게놈 구조물의 생산을 위한 패키징 또는 생산자 세포주에 형질주입될 수 있는 플라스미드 형태로 제작될 수 있다. 상기 플라스미드는 일반적으로 박테리아에서 플라스미드의 복제에 유용한 서열을 포함한다. 그러한 플라스미드는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 또한, 원핵 생물 복제 기점을 포함하는 벡터는 또한 그의 발현이 약물 내성과 같은 검출 가능하거나 선택 가능한 마커를 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이, 코딩 서열은 특정 숙주에서 발현을 향상시키기 위해 코딩 서열을 변형시키는 것이 유리할 수 있다. 상기 유전적 코드는 64개의 가능한 코돈과 중복되지만, 대부분의 유기체는 이들 코돈의 부분 집합을 우선적으로 사용한다. 한 종에서 가장 많이 사용되는 코돈을 최적 코돈이라고 하며, 자주 사용되지 않는 것들은 희귀 또는 사용 빈도가-낮은 코돈으로 분류된다. 코돈은 숙주의 바람직한 코돈 사용법을 반영하는데 사용될 수 있는데, 때때로 "코돈 최적화(codon optimization)" 또는 "종 코돈 편향 조절(controlling for species codon bias)"이라고 불리는 과정이있다. 특정 원핵 생물 또는 진핵 생물 숙주에 의해 선호되는 코돈을 포함하는 최적화된 코딩 서열은, 예를 들어, 번역 속도를 증가시키거나 또는 비-최적화된 서열로부터 생산된 전사체와 비교하여 더 긴 반감기와 같은 바람직한 특성을 갖는 재조합 RNA 전사체를 생산하도록 제조될 수 있다.　다양한 구체예에 있어서, 적어도 4-1BBL, scIL-12, 및/또는 IL-2를 코딩하는 핵산 서열(들)은 인간에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA (4-1BBL의 인간 유전자)이고, scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA (scIL-12의 인간 유전자), 및/또는 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA (IL-2의 인간 유전자)이다.
다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템의 핵산 서열 (들)은 cDNA 서열이다. 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템에 포함된 4-1BBL, scIL-12, 및/또는 IL-2의 유전자의 핵산 서열은 이종 핵산 서열로 간주될 수 있다. 본 명세서에서 용어 핵산 서열(들)(nucleic acid sequence(s)) 및 폴리뉴클레오티드 (들)(polynucleotide(s))는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"은 단일-가닥 및 이중-가닥 핵산 서열 모두를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에 있어서, 핵산 서열은 DNA 서열이다.
다양한 구체예에 있어서, 상기 벡터는 DNA 벡터이다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 벡터는 RNA 벡터이다.　본 발명의 신규한 벡터는 보다 구체적으로 원형 벡터, 보다 더 구체적으로는 원형 발현 벡터로 기술될 수 있다.　본 명세서에서 기재된 바와 같이, 용어 "벡터(vector)"는 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는 단일-가닥 및 이중-가닥 벡터를 모두 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 4-1BBL을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 4-1BBL의 변이체, 구체적으로 서열번호 2 (도 13)에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 4-1BBL의 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 변이체 서열은 본 명세서의 하기에서 더 상세히 기술된다. 마찬가지로, IL-2을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 IL-2의 변이체, 구체적으로 서열번호 4 (도 14)에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 IL-2의 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 변이체 서열은 본 명세서의 하기에서 더 상세히 기술된다. 또한, scIL-12를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 scIL-12의 변이체, 구체적으로 서열번호 6 (도 15)에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 scIL-12의 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 변이체 서열은 본 명세서의 하기에서 더 상세히 기술된다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 4-1BBL을 코딩하는 (유전자의) 핵산 서열은 (i) 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 인간에서의 발현에 대해 코돈-최적화된 것, (ii) IL-2를 코딩하는 (유전자의) 핵산 서열은 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 인간에서의 발현에 대해 코돈-최적화된 것, 및/또는 (iii) scIL-12를 코딩하는 (유전자의) 핵산 서열은 서열번호 5의 핵산 서열을 포함하고, 상기 핵산 서열은 인간에서의 발현에 대해 코돈-최적화된 것이다.
4-1BB는 종양 괴사 인자 (Tumor Necrosis Factor; TNF) 수용체 군의 구성원이다. CD137은 CD 명명법에 따른 4-1BB에 대한 명칭이다. 본 명세서에서, 용어 CD137 및 4-1BB는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 용어 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 및 CD137 리간드도 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 4-1BBL (또는 CD137 리간드)을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1(도 13)의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 상기 변이체 핵산 서열은 활성화된 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1(도 13)의 핵산 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 상기 변이체 핵산 서열은 활성화된 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게는, 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1(도 13)의 핵산 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 상기 변이체 핵산 서열은 활성화된 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 단백질을 코딩한다. 보다 더 바람직하게는, 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1(도 13)의 핵산 서열과 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 상기 변이체 핵산 서열은 활성화된 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 단백질을 코딩한다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 4-1BBL의 변이체는 서열번호 1(도 13)의 서열에 의해 코딩되는 천연 4-1BBL과 동일한 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 결합 특이성을 나타낸다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1(도 13)의 서열을 포함한다 (또는 이루어진다). 다양한 바람직한 구체예에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 4-1BBL의 핵산 서열의 변이체 서열은 마우스 4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아니다. 따라서, 다양한 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 마우스 기원의 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
본 개시의 다양한 구체예에 있어서, IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3(도 14)의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 상기 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는 IL-2 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3(도 14)의 핵산 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는 IL-2 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게는, IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3(도 14)의 핵산 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는 IL-2 단백질을 코딩한다. 보다 더 바람직하게는, IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3(도 14)의 핵산 서열과 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는 IL-2 단백질을 코딩한다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 IL-2의 변이체는 서열번호 3(도 14)의 서열에 의해 코딩되는 천연 IL-2와 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 나타낸다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3(도 14)의 서열을 포함한다 (또는 이루어진다). 다양한 바람직한 구체예에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 IL-2의 핵산 서열의 변이체 서열은 마우스 IL-2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아니다. 따라서, 다양한 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 마우스 기원의 IL-2을 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
본 개시의 다양한 구체예에 있어서, scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5(도 15)의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는 scIL-12 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5(도 15)의 핵산 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는 scIL-12 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게는, scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5(도 15)의 핵산 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는 scIL-12 단백질을 코딩한다. 보다 더 바람직하게는, scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5(도 15)의 핵산 서열과 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는 scIL-12 단백질을 코딩한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 천연 IL-12 단백질의 2 개의 서브 유닛을 포함하는 아미노산 서열을 융합 단백질로서 포함하는 경우, 단백질은 scIL-12 단백질로 간주된다. 상기 서열번호 5(도 15)의 서열은 링커에 의해 연결된 인간 IL-12의 40 kDa 및 35 kDa 서브 유닛을 코딩하는 유전자의 서열을 나타낸다. 도 15에 도시된 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열에서, 링커 서열은 굵은 글씨체로 나타나있다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 scIL-12의 변이체는 서열번호 5(도 15)의 서열에 의해 코딩되는 천연 scIL-12 와 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 나타낸다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5(도 15)의 서열을 포함한다 (또는 이루어진다). 다양한 바람직한 구체예에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 scIL-12의 핵산 서열의 변이체 서열은 마우스 scIL-12를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아니다. 따라서, 다양한 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 마우스 기원의 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 4-1BBL (에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 4-1BBL 폴리펩티드는 활성화된 T 세포, 바람직하게는 활성화된 CD4+ T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 4-1BBL (에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 4-1BBL 폴리펩티드는 활성화된 T 세포, 바람직하게는 활성화된 CD4+ T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 보다 바람직하게는, 4-1BBL (에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 4-1BBL 폴리펩티드는 활성화된 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 4-1BBL (에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열과 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BBL 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 4-1BBL 폴리펩티드는 활성화된 T 세포, 바람직하게는 활성화된 CD4+ T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 4-1BBL (에 대한 유전자)의 핵산 서열 변이체는 4-1BBL 폴리펩티드를 코딩하며, 이는 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열을 갖는 천연 4-1BBL과 동일한 T 세포, 바람직하게는 CD8+ T 세포에 대한 결합 특이성을 나타낸다. 바람직한 구체예에 있어서, 4-1BBL(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열을 포함하는 (또는 이루어지는) 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, IL-2(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 IL-2 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는다. 바람직하게는, IL-2(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 IL-2 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, IL-2(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 IL-2 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 더 바람직하게는, IL-2(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열과 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 IL-2 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 IL-2의 핵산 서열 변이체는 IL-2 폴리펩티드를 코딩하며, 이는 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열을 갖는 천연 IL-2와 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 나타낸다. 바람직한 구체예에 있어서, IL-2(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열을 포함하는 (또는 이루어지는) 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, scIL-12(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scIL-12 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 scIL-12 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는다. 바람직하게는, scIL-12(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scIL-12 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 scIL-12 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, scIL-12(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scIL-12 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 scIL-12 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 더 바람직하게는, scIL-12(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열과 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scIL-12 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 scIL-12 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 갖는다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 scIL-12의 핵산 서열 변이체는 scIL-12 폴리펩티드를 코딩하며, 이는 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열을 갖는 천연 scIL-12와 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 나타낸다. 바람직한 구체예에 있어서, scIL-12(에 대한 유전자)의 핵산 서열은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열을 포함하는 (또는 이루어지는) 폴리펩티드를 코딩한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 폴리- 또는 다중시스트론 발현 단위는 2개 또는 모든 3개의 단백질을 코딩하는 2개 또는 3개의 폴리뉴클레오티드 서열, 즉, 각 서열이 적어도 (i) 4-1BBL 또는 scIL-12, 또는 (ii) 4-1BBL 또는 IL-2, 또는 (iii) scIL-12 또는 IL-2를 코딩하는 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 각 서열이 적어도 4-1BBL, scIL-12, 또는 4-1BBL을 각각 코딩하는 3개의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다중시스트론 벡터(또는 발현 단위)의 사용은 필요한 핵산 분자의 총 수를 감소시키고 따라서 여러 벡터 게놈으로부터의 발현을 조정하는 것과 관련된 가능한 어려움을 피할 수 있다. 다중시스트론 벡터에서 발현되는 다양한 요소는 하나 이상의 프로모터 (및 필요에 따라 다른 발현 조절 요소)에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
여러 가지 프로모터를 사용할 경우, 상기 프로모터의 상호 억제를 관찰할 수 있다. 적어도 트리시스트론이고, 발현 카세트 당 단지 하나의 프로모터만을 포함하고, 또한 프로모터의 바로 하류에 위치되지 않은 각각의 시스트론에 대한 IRES 서열을 포함하는 것을 추가적인 특징으로 하는 벡터를 사용하여 특히 높은 발현율을 달성 할 수 있다. 프로모터와 IRES (내부 리보솜 진입 부위) 서열의 조합은 개선된 단백질 발현을 제공하는 것으로 간주된다. 상이한 IRES 서열의 사용은 이들 서열 중에서 재조합 빈도를 최소화 할 수 있다는 추가적인 이점을 제공할 수 있다. 본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 상기 IRES는 EMCV (encephalomyocarditis virus; EMCV, 뇌 심근염 바이러스)로부터 유래한다. 본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 상기 IRES는 PV (poliovirus; PV, 폴리오 바이러스)로부터 유래한다. 본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 신규한 벡터/벡터 시스템은 3 개의 전이유전자 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12 사이에 2 개의 IRES를 포함하며, 상기 하나의 IRES는 EMCV IRES일 수 있고, 다른 하나의 IRES는 PV IRES일 수 있다. 본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 신규한 벡터/벡터 시스템은 3 개의 전이유전자 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12 사이에 2 개의 IRES를 포함하며, 상기 IRES는 모두 EMCV IRES일 수 있거나, 또는 IRES는 모두 PV IRES일 수 있다. 테트라시스트론 벡터를 사용할 경우, 그들을 다른 발현 카세트로 나누는 것이 유용 할 수 있다.　이 경우, 발현 카세트 당 하나의 프로모터가 존재하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 서로로부터 가능한 최대의 거리를 나타내는 2 개의 발현 카세트의 분리는 프로모터를 공간적으로 분리시킴으로써 상호 억제를 감소시킨다.
다양한 구체예에 있어서, 본 개시의 신규한 벡터/벡터 시스템은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 연결된 트리시스트론 구조물에서 이 순서로 (즉, 4-1BBL을 코딩하는 유전자의 하류에 위치한 IL-2를 코딩하는 유전자, 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 하류에 위치한 scIL-12를 코딩하는 유전자를 5 '에서 3'으로) 배열된 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12의 3 개의 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 3 개의 유전자는 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12의 유전자이다. 보다 바람직하게는, 상기 3 개의 유전자는 거대세포 바이러스 (CMV) 프로모터에 의해 구동된다. 즉, 벡터 시스템은 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12의 3 개의 유전자를 포함하는 트리시스트론 구조물의 상류에 CMV 프로모터를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 전사 폴리아데닐화는 SV40-유도된 신호에 의해 유도되며, 즉, 신규한 벡터/벡터 시스템은 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12(인간 scIL-12)의 3 개의 유전자를 포함하는 트리시스트론 구조물의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 벡터 DNA는 아데노바이러스 벡터 DNA이다.
따라서, 바람직한 일 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 (i) 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 연결된 트리시스트론 구조물에서 이 순서로 (즉, 4-1BBL을 코딩하는 유전자의 하류에 위치한 IL-2를 코딩하는 유전자, 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 하류에 위치한 scIL-12를 코딩하는 유전자를 5 '에서 3'으로) 배열된 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12의 3 개의 유전자, (ii) 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12의 3 개의 유전자를 포함하는 트리시스트론 구조물의 상류의 CMV 프로모터, 및 (iii) 상기 트리시스트론 구조물의 하류의 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12의 3 개의 유전자가 하기에 도시된 바와 같이 (a) 에서 (f) 중 어느 하나로 배열된 발현 구조물을 포함한다. (Prom. = 프로모터):
Figure pct00001
다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터는 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 순서로 배열된 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 3 개의 유전자(를 포함하는 발현 구조물)의 상류에 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 인간 4-1BBL의 유전자는 신규한 벡터의 3 개의 유전자의 1번 위치에, 보다 구체적으로는 상기 3 개 유전자를 포함하는 발현 구조물의 1번 위치에 존재한다.
다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터는 서열 번호 12(도 18)의 핵산 서열과 70 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하며, 그 변이체 핵산 서열의 발현은 서열번호 12의 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 서열 번호 12(도 18)의 핵산 서열과 80 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 핵산 서열의 발현은 서열번호 12의 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 더욱 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 서열 번호 12(도 18)의 핵산 서열과 90 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 핵산 서열의 발현은 서열번호 12의 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 서열 번호 12(도 18)의 핵산 서열과 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 핵산 서열의 발현은 서열번호 12의 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터는 서열 번호 12(도 18)의 핵산 서열을 포함하는 (또는 이루어진) 발현 카세트를 포함한다.
다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터는 하기의 서열 번호 11(도 17)의 핵산 서열을 포함하는 참조 발현 카세트와 70 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고: (i) bp 1,080-1,844의 핵산 서열 (인간 4-1BBL), (ii) bp 1,885-2,388의 핵산 서열 (EMCV IRES), (iii) bp 2,409-2,870의 핵산 서열 (인간 IL-2), (iv) bp 2,914-3,545의 핵산 서열 (PV IRES), 및 (v) bp 3,581-5,203의 핵산 서열 (링커에 의해 연결된 인간 IL-12의 p40 및 p35 서브유닛을 포함하는 인간 scIL-12), 그 변이체 발현 카세트의 발현은 상기 참조 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 상기 참조 발현 카세트와 80 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 발현 카세트의 발현은 상기 참조 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 보다 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 상기 참조 발현 카세트와 90 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 발현 카세트의 발현은 상기 참조 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다.　보다 더 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 상기 참조 발현 카세트와 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 발현 카세트의 발현은 상기 참조 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터는 하기의 서열 번호 11(도 17)의 핵산 서열을 포함하는 (또는 이루어진) 발현 카세트를 포함한다: (i) bp 1,080-1,844의 핵산 서열 (인간 4-1BBL), (ii) bp 1,885-2,388의 핵산 서열 (EMCV IRES), (iii) bp 2,409-2,870의 핵산 서열 (인간 IL-2), (iv) bp 2,914-3,545의 핵산 서열 (PV IRES), 및 (v) bp 3,581-5,203의 핵산 서열 (링커에 의해 연결된 인간 IL-12의 p40 및 p35 서브유닛을 포함하는 인간 scIL-12).
다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터는 하기의 서열 번호 11(도 17)의 핵산 서열을 포함하는 참조 발현 카세트와 70 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하고: (i) bp 484-1,059의 핵산 서열 (CMV 프로모터), (ii) bp 1,080-1,844의 핵산 서열 (인간 4-1BBL), (iii) bp 1,885-2,388의 핵산 서열 (EMCV IRES), (iv) bp 2,409-2,870의 핵산 서열 (인간 IL-2), (v) bp 2,914-3,545의 핵산 서열 (PV IRES), (vi) bp 3,581-5,203의 핵산 서열 (링커에 의해 연결된 인간 IL-12의 p40 및 p35 서브유닛을 포함하는 인간 scIL-12), 및 (vii) bp 5,271-5,510의 핵산 서열 (SVpolyA), 그 변이체 발현 카세트의 발현은 상기 참조 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 상기 참조 발현 카세트와 80 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 발현 카세트의 발현은 상기 참조 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 보다 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 상기 참조 발현 카세트와 90 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 발현 카세트의 발현은 상기 참조 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다.　보다 더 바람직하게는, 상기 발현 카세트는 상기 참조 발현 카세트와 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하며, 그 변이체 발현 카세트의 발현은 상기 참조 발현 카세트의 발현과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터는 하기의 서열 번호 11(도 17)의 핵산 서열을 포함하는 (또는 이루어진) 발현 카세트를 포함한다: (i) bp 484-1,059의 핵산 서열 (CMV 프로모터), (ii) bp 1,080-1,844의 핵산 서열 (인간 4-1BBL), (iii) bp 1,885-2,388의 핵산 서열 (EMCV IRES), (iv) bp 2,409-2,870의 핵산 서열 (인간 IL-2), (v) bp 2,914-3,545의 핵산 서열 (PV IRES), (vi) bp 3,581-5,203의 핵산 서열 (링커에 의해 연결된 인간 IL-12의 p40 및 p35 서브유닛을 포함하는 인간 scIL-12), 및 (vii) bp 5,271-5,510의 핵산 서열 (SVpolyA).
다양한 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 3 개의 개별 벡터에 배열된 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12의 3 개의 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 3 개의 유전자는 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12의 인간 유전자이다. 보다 바람직하게는, 상기 3 개의 유전자는 각각 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터에 의해 구동되며,　즉, 각각의 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12의 유전자 상류에 CMV 프로모터를 각각 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 전사 폴리아데닐화는 SV40-유도된 신호에 의해 유도되며, 즉, 각각의 벡터 시스템은 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12 (인간 scIL-12)의 유전자 각각의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 각각 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 각각의 분리된 벡터의 벡터 DNA는 아데노바이러스 벡터 DNA이다.
따라서, 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 3 개의 아데노바이러스 벡터를 포함하고, 각각은 (i) 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 또는 인간 단쇄 IL-12의 유전자, (ii) 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12 의 유전자 각각의 상류에 CMV 프로모터, 및 　(iii) 인간 4-1BBL (CD137L), 인간 IL-2 및 인간 단쇄 IL-12의 유전자 각각의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
다양한 측면에 있어서, 상기 벡터 시스템은 2 개의 개별 벡터에 배열된 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12의 3 개의 유전자를 포함한다. 구체적으로, 다양한 구체예에 있어서, 두 벡터 중 하나는 4-1BBL (CD137L) 및 IL-2의 유전자를 포함하고, 다른 하나의 벡터는 단쇄 IL-12의 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12의 인간 유전자이다. 보다 바람직하게는, 상기 유전자는 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터에 의해 구동되며,　즉, 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 IL-2의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자가 인간 IL-2의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류, 또는 인간 IL-2의 유전자가 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 IL-2의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함하고, 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함한다.　보다 더 바람직하게는, 전사 폴리아데닐화는 SV40-유도된 신호에 의해 유도되며, 즉, 두 벡터의 각각은 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 즉, 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 IL-2의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자가 인간 IL-2의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 IL-2의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 포함하거나, 또는 인간 IL-2의 유전자가 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 포함하고, 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 scIL-12의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 각 개별 벡터의 벡터 DNA는 아데노바이러스 벡터 DNA이다.
따라서, 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 2 개의 아데노바이러스 벡터를 포함하며, 하나는 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 IL-2의 유전자를 포함하고, 다른 하나는 인간 scIL-12의 유전자를 포함하며, (i) 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 IL-2의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자가 인간 IL-2의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류, 또는 인간 IL-2의 유전자가 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 IL-2의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 더 포함하고, 인간 scIL-12 유전자를 포함하는 벡터는 인간 scIL-12 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함하고, (ii) 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 IL-2의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 핵산 서열이 인간 IL-2의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 IL-2 유전자 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자, 또는 인간 IL-2 유전자가 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 4-1BBL (CD137L) 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 보다 더 포함하고, 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 scIL-12 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다양한 다른 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 2 개의 개별 벡터를 포함하고, 두 벡터 중 하나는 4-1BBL (CD137L) 및 단쇄 IL-12 (scIL-12)의 유전자를 포함하고, 다른 하나의 벡터는 IL -2의 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 4-1BBL (CD137L), scIL-12 및 IL-2의 인간 유전자이다. 보다 바람직하게는, 상기 유전자는 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터에 의해 구동되며,　즉, 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자가 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류, 또는 인간 scIL-12의 유전자가 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함하고, 인간 IL-2의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 IL-2의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함한다.　보다 더 바람직하게는, 전사 폴리아데닐화는 SV40-유도된 신호에 의해 유도되며, 즉, 두 벡터의 각각은 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 즉, 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자가 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 scIL-12의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 포함하거나, 또는 인간 scIL-12의 유전자가 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자를 포함하고, 인간 IL-2의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 IL-2의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 각 개별 벡터의 벡터 DNA는 아데노바이러스 벡터 DNA이다.
따라서, 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 2 개의 아데노바이러스 벡터를 포함하며, 하나는 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하고, 다른 하나는 인간 IL-2의 유전자를 포함하며, (i) 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자가 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류, 또는 인간 scIL-12의 유전자가 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 더 포함하고, 인간 IL-2 유전자를 포함하는 벡터는 인간 IL-2 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함하고, (ii) 인간 4-1BBL (CD137L) 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자가 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 scIL-12 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자, 또는 인간 scIL-12 유전자가 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 4-1BBL (CD137L) 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 보다 더 포함하고, 인간 IL-2의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 IL-2 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
다양한 다른 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 2 개의 개별 벡터를 포함하고, 두 벡터 중 하나는 IL-2 및 단쇄 IL-12 (scIL-12)의 유전자를 포함하고, 다른 하나의 벡터는 4-1BBL (CD137L)의 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 IL-2, scIL-12 및 4-1BBL (CD137L)의 인간 유전자이다. 보다 바람직하게는, 상기 유전자는 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터에 의해 구동되며,　즉, 인간 IL-2 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 IL-2의 유전자가 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 IL-2의 유전자의 상류, 또는 인간 scIL-12의 유전자가 인간 IL-2의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함하고, 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함한다.　보다 더 바람직하게는, 전사 폴리아데닐화는 SV40-유도된 신호에 의해 유도되며, 즉, 두 벡터의 각각은 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 즉, 인간 IL-2 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 IL-2의 유전자가 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 scIL-12의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 인간 scIL-12의 유전자가 인간 IL-2의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 IL-2의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 각 개별 벡터의 벡터 DNA는 아데노바이러스 벡터 DNA이다.
따라서, 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 2 개의 아데노바이러스 벡터를 포함하며, 하나는 인간 IL-2 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하고, 다른 하나는 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자를 포함하며, (i) 인간 IL-2 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 IL-2의 유전자가 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 IL-2의 유전자의 상류, 또는 인간 scIL-12의 유전자가 인간 IL-2의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 더 포함하고, 인간 4-1BBL (CD137L) 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L) 유전자의 상류에 CMV 프로모터를 포함하고, (ii) 인간 IL-2 및 인간 scIL-12의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 IL-2의 유전자가 인간 scIL-12의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 scIL-12 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 유전자, 또는 인간 scIL-12 유전자가 인간 IL-2의 유전자의 상류에 위치하는 경우에 인간 IL-2 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 보다 더 포함하고, 인간 4-1BBL (CD137L)의 유전자를 포함하는 벡터는 인간 4-1BBL (CD137L) 유전자의 하류에 SV40 폴리아데닐화 신호를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 개시의 바이러스 입자에 있어서, 상기 발현 단위는 패키징 세포에서 원하는 벡터 입자의 생산에 필수적인 엔벨로프(envelope)/캡시드(capsid) 분자 또는 하나 이상의 성숙 인자를 코딩하는 서열을 더 포함한다.
내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소는 다중 유전자 또는 다중- 또는 폴리시스트론 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5' 메틸화된 캡(cap) 의존성 번역의 리보솜 스캐닝(scanning) 모델을 우회하여 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다. IRES 요소는 이종유래의 오픈 리딩 프레임(open reading frames)과 연결될 수 있다. 각각 IRES로 분리된 여러 개의 오픈 리딩 프레임은 함께 전사되어 다중- 또는 폴리시스트론 메시지를 만들어낼 수 있다. 다중시트로닉 발현 벡터에서 발현되는 각각의 성분은 IRES 요소에 의해 분리되어 동일한 프로모터로부터의 다양한 단백질의 개별 발현을 허용할 수 있다. 다중시스트론 벡터, 구체적으로 IRES 요소에서 유전적 요소를 분리하는데 사용될 수 있는 도구는 당해 기술분야에 알려져있다. 특정 다중시트로닉 벡터의 효과는 표준 프로토콜을 사용하여 각각의 유전자의 발현을 검출함으로써 용이하게 시험될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 적어도 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열(들)은 하나의 벡터에 배열되고, 상기 scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열(들)은 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치한다. 이러한 벡터는 다중시스트론 발현 벡터로 간주된다. 일 구체예에 있어서, 상기 다중시스트론 발현 벡터는 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 (유전자의) 핵산 서열을 포함하는 트리시스트론 발현 벡터이며, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열하되 단, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는다. 다양한 구체예에 있어서, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열(들)은 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치한다. 바람직하게는, 다중시스트론 또는 트리시스트론 발현 벡터에서, IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치하고, scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치한다. 다중시스트론 또는 트리시스트론 발현의 다양한 구체예에 있어서, 프로모터는 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 상류에 위치하지만, scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 핵산 서열(들)의 상류에는 위치하지 않는다.
다중시스트론 또는 트리시스트론 발현 벡터의 소정 구체예에 있어서, 적어도 4-1BBL, scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 핵산 서열(들)은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 연결된다.
특정 예시에 있어서, 바이러스 벡터 게놈은 인핸서/프로모터 서열, 바람직하게는 거대세포바이러스(CMV) 인핸서/프로모터 서열; 바이러스 5' LTR의 R 및 U5 서열; 선택적으로 패키징 서열; 내부 인핸서; 내부 프로모터; 적어도 4-1BBL, scIL-12 및/또는 IL-12를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 그것의 인핸서 서열이 결실된 U3 요소; 및 바이러스 3' LTR의 R 및 U5 서열을 포함한다. 벡터 게놈의 제작은 예를 들어, Sambrook et al.(1989 and 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)에 기재된 바와 같은, 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease) 분해(digestion), 결찰(ligation), 형질 전환(transformation), 플라스미드 정제, 및 DNA 시퀀싱의 표준 기술을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 유전 공학 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
포유 동물 세포에서 일시적 발현을 위해 제작된 벡터도 또한 사용될 수 있다. 일시적인 발현은, 숙주 세포가 발현 벡터의 많은 카피를 축적하고 이어서 발현 벡터에서 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드를 높은 수준으로 합성하도록 숙주 세포에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함한다. Sambrook et al., supra, pp. 16.17-16.22, 1989 참조. 폴리펩티드의 발현에 대한 적용에 적합한 다른 벡터 및 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며 특정 상황에 용이하게 적용된다.
본 명세서에 제공된 교시 및 당해 기술분야의 지식을 사용함으로써, 통상의 기술자는 특정 발현 시스템의 효과는 리포터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 패키징 세포를 형질주입시키고, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 접합체로부터의 형광을 측정하는 것과 같은 적합한 기술을 사용하여 발현을 측정하는 것에 의하여 시험될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 다른 적합한 리포터 유전자는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
또한, 일 구체예에서 본 발명에 의해 제공되는 신규한 벡터/벡터 시스템은 scIL-12 대신에 천연 IL-12를 포함할 수 있음, 즉, 천연 IL-12를 코딩하는 (유전자의) 핵산 서열을 포함할 수 있음은 본 명세서에 의해 고려된다. IL-12는 2 개의 별도로 코딩된 p35 및 p40 서브유닛으로 구성된 디설피드-결합된 헤테로다이머(heterodimeric) 사이토카인이다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 (유전자의) 핵산 서열은 천연 인간 IL-12를 코딩 할 수 있다. 따라서, 다양한 구체예에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 신규한 벡터/벡터 시스템은 (i) 4-1BB 리간드 (4-1BBL), (ii) IL-12 p40 및 p35 서브유닛, 및 (iii) IL-12를 코딩하는 3 개의 유전자를 포함할 수 있고, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열하되 단, 상기 IL-12 p35 및 IL-12 p40 서브 유닛을 코딩하는 유전자(들)은 1번 위치에 존재하지 않는다.
다양한 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 천연 IL-12, 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자를 포함할 수 있고, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열하되 단, 상기 IL-12 p35 및 p40 서브 유닛을 코딩하는 유전자(들)은 1번 위치에 존재하지 않으며, 상기 IL-12 서브유닛 p40 및 p35를 코딩하는 유전자(들)는 서열번호 7 및 9 (도 16)의 핵산 서열과 70 % 이상 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는 IL-12 단백질을 코딩한다. 바람직하게는, 상기 IL-12 서브유닛 p35 및 p40를 코딩하는 유전자(들)는 서열번호 7 및 9 (도 16)의 핵산 서열과 80 % 이상 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는 IL-12 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게는, 상기 IL-12 서브유닛 p40 및 p35를 코딩하는 유전자(들)는 서열번호 7 및 9 (도 16)의 핵산 서열과 90 % 이상 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는 IL-12 단백질을 코딩한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 IL-12 서브유닛 p40 및 p35를 코딩하는 유전자(들)는 서열번호 7 및 9 (도 16)의 핵산 서열과 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 이상 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는 IL-12 단백질을 코딩한다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 상기 IL-12 서브유닛 p40 및 p35를 코딩하는 유전자(들)는 서열번호 7 및 9 (도 16)의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 IL-12 서브유닛 p35 및 p40의 변이체는 서열번호 7 및 9의 서열에 의해 코딩되는 IL-12 서브유닛 p35 및 p40과 동일한 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포 자극 활성을 나타낸다.
다양한 구체예에 있어서, 상기 IL-12 서브유닛 p40 및 p35의 유전자(들)는 서열번호 8 및 10 (도 16)의 아미노산 서열과 70 % 이상 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 IL-12 서브유닛 p40 및 p35의 유전자(들)는 서열번호 8 및 10 (도 16)의 아미노산 서열과 70 % 이상 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 IL-12 서브유닛 p40 및 p35의 유전자(들)는 서열번호 8 및 10 (도 16)의 아미노산 서열과 90 % 또는 95% 이상 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있으며, 상기 폴리펩티드는 면역 자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 상기 IL-12 서브유닛 p40 및 p35의 유전자(들)는 서열번호 8 및 10 (도 16)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
바람직하게는, 본명세서에 기술된 바와 같이 인간 IL-12 서브 유닛 p35 및 p40의 핵산 서열의 변이체 서열은 마우스 IL-12 서브 유닛 p35 및 p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 아니다. 따라서, 바람직하게는, 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 전술된 바와 같은 IL-12 서브 유닛 p35 및 p40, 및 IL-2를 코딩하는 3 개의 유전자를 포함하는 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템(즉, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열되고, 상기 IL-12 서브 유닛 p35 및 p40을 코딩하는 유전자(들)은 1번 위치에 존재하지 않는)은 마우스 기원의 IL-12 서브유닛 p35 및 p40을 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 구체예에 있어서, 벡터 입자가 제공된다. 본 개시는 본 개시의 벡터 시스템을 포함하는 바이러스 입자를 제공한다. 벡터 입자는 적어도 4-1BBL, scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 본 명세서에 기재된 신규한 벡터/벡터 시스템 중 어느 하나를 포함한다. 또한, 본 명세서는 표적 세포에 적어도 4-1BBL, scIL-12 및/또는 IL-2 (본원에 기술된 바와 같음)를 코딩하는 본 명세서의 벡터 시스템을 전달하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 표적 세포와 본 발명의 벡터 시스템을 전달하는 비히클(vehicle)과 접촉(즉, 상호 작용을 허용)시키는 단계를 포함한다. 구체적인 구체예에 있어서, 신규한 벡터/벡터 시스템을 전달하는 방법은 적어도 4-1BBL, scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템을 포함하는 벡터 입자를 개체에 투여함으로써 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 상기 벡터 입자는 바이러스 벡터 입자이고, 신규한 벡터/벡터 시스템의 상기 하나 이상의 벡터는 RNA 벡터, 플라스미드 벡터, 나노 입자 벡터, 및 네이키드 DNA 중 어느 하나이다. 다른 일 구체예에 있어서, 상기 벡터 입자는, 예를 들어, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 살모넬라 종 (Salmonella spp.), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 대장균 (Escherichia coli), 쉬 겔라 종(Shigella spp.), 및 예르시니아 종 (Yersinia spp.)과 같은 박테리아로부터 유래된 입자이고, 상기 벡터 시스템의 하나 이상의 벡터는 RNA 벡터, 플라스미드 벡터, 나노 입자 벡터 및 네이키드 DNA 중 어느 하나이다.
예시적인 바이러스 벡터 입자는 렌티 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 렌티 바이러스 벡터 입자; 팍스 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 팍스 바이러스 벡터 입자; 백시니아 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 백시니아 바이러스 벡터; 아데노바이러스 벡터 게놈을 포함하는 아데노바이러스 벡터 입자; 아데노바이러스-관련 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 아데노바이러스-관련 바이러스 벡터 입자; 헤르페스 바이러스 벡터 게놈 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 I 또는 II)을 포함하는 헤르페스 바이러스 벡터 입자; 또는 알파 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 알파 바이러스 벡터 입자를 포함한다.
상기 벡터 입자 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터 입자)는 in vivo로 주사될 수 있고, 구체적으로 입자가 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2의 발현에 의한 면역 자극 효과를 제공하는 종양에 주사될 수 있다. 바이러스 입자의 양은 3x106 ivp(감염성 바이러스 입자) 이상이고, 1Х107 ivp 이상, 3x107 ivp 이상, 1x108 ivp 이상, 3x108 ivp 이상, 1x109 ivp 이상, 또는 3x109 ivp 이상일 수 있다. 선택된 간격으로, 숙주의 악성 (종양) 또는 표적 병원체-감염 조직 유래의 세포를 이용하여, 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2의 발현을, 예를 들어, 벡터 입자에 포함된 백터 시스템에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 동시-발현되는 경우, GFP 또는 루시퍼라제(luciferase)와 같은 마커 발현을 관찰함으로써 측정할 수 있다. 구체적으로, 벡터 입자-처리된 숙주의 악성 (종양) 또는 표적 병원체-감염 조직 유래의 T-세포를 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2의 발현에 대해 측정할 수 있다.
용어 "복제 가능한 아데노바이러스 벡터(replication competent adenoviral vector)"는 특정 세포 또는 조직에서의 바이러스 복제에 필요한 임의의 유전자 기능에 결함이 있지 않은 임의의 아데노바이러스 벡터를 의미한다. 상기 벡터는 복제 및 패키징 되는 것이 가능해야 하지만, 조건부로 특정 세포 또는 조직에서만 복제될 수 있다.
아데노바이러스(ad)는 인간을 감염시키는 큰 (약 36kb) DNA 바이러스이지만, 넓은 숙주 범위를 나타낸다. 인간 아데노바이러스에는 약 50 개의 혈청형이 있으며, 이들은 분자적, 면역적, 및 기능적 기준에 따라 6 개의 군으로 나뉜다. 성인이 되면, 거의 모든 인간이 감기-유사 증상의 주요한 효과를 나타내는 보다 일반적인 아데노바이러스 혈청형에 감염되어 있게 된다. 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 아데노바이러스 DNA가 에피솜으로(episomally) 유지되게 하여, 벡터의 통합(integrating)과 관련된 잠재적인 유전 독성을 감소시킨다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하며, 광범위한 증폭 후 게놈 재배열이 검출되지 않았다.
본 발명에서 사용되는 아데노바이러스 벡터는 인간 또는 동물을 치료하는 방법으로 사용하기에 적합한 임의의 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 대안적으로, 다양한 유형의 아데노바이러스 벡터가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 상기 벡터를, 예를 들어, 임의의 바이러스 영역을 결실, 삽입, 돌연변이시키거나 또는 변형함으로써 변형시킬 수 있다. 상기 벡터는 복제에 관해 종양 특이적이게 만들어 질 수 있다. 예를 들어, 상기 아데노바이러스 벡터는 종양 특이적인 프로모터의 삽입, 영역의 결실 및 전이유전자의 삽입과 같은 E1, E3 및/또는 E4의 변형을 포함할 수 있다.
인간 Ad-5는 유전적으로 및 생화학적으로 잘 특성화된 인간 아데노바이러스 혈청형이다 (GenBank M73260; AC_000008). 따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 상기 아데노바이러스는 복제 능력이 있는 Ad5 혈청형이거나 또는 Ad5 성분을 포함하는 잡종 혈청형이다. 상기 아데노바이러스는 야생형 계통일 수 있고 또는 종양 선택성을 향상시키도록, 예를 들어, 종양 세포에서 복제하는 바이러스의 능력에 영향을 주지 않고 정상 대기(quiescent) 세포 내에서 복제하는 바이러스의 능력을 약화시키도록 유전적으로 변형된 것일 수 있다. 본 발명에 포함되는 아데노바이러스의 비제한적인 예로는 델타-24, 델타-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, ONYX-015, ColoAd1, 및 H1O1를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 아데노바이러스는 델타-24 또는 델타-24-RGD이다. 상기 델타-24 아데노바이러스는 5 형(Ad-5) 아데노바이러스로부터 유래되었고, E1 A 유전자의 CR2 부분에 내에 24-염기쌍 결실을 포함한다. 델타-24-RGD는 RGD-4C 서열의 삽입을 더 포함한다. 상기 E1 A 결실은 암세포에 대한 바이러스의 선택성을 증가시킨다; 상기 RGD-4C 서열은 신경 교종에서 바이러스의 감염성을 증가시킨다.
또한, 아데노바이러스 벡터의 근간(backbone)은 임의의 혈청형일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 키메라 벡터, 예를 들어, Ad5/3 벡터일 수 있다. 예로서, "Ad5/3 벡터"는 Ad5 및 Ad3 벡터 모두의 부분을 갖는 키메라 벡터를 의미한다.
상기 아데노바이러스는 매력적인 전달 시스템이며, 몇몇의 치료적 적용에 있어서 유전자 전달에 사용하기에 잘 확립되어 있다. 상기 아데노바이러스는 세포 표면 수용체를 통해 허용 숙주 세포에 들어가고, 그후 내재화된다.
종양 유형에 대한 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 (coxsackie virus and adenovirus receptor; CAR)의 부존재 또는 낮은 수준의 존재는 아데노바이러스의 효과를 제한할 수 있다. 캡시드를 변형하면 CAR 독립적인 표적 세포 감염이 가능해진다. 또한, 표적 조직으로의 아데노바이러스 흡수는 형질주입체-유사 양이온성 화합물의 첨가에 의해 향상될 수 있다. 아데노바이러스 흡수가 형질주입체 프로타민 황산염을 사용하여 특히 개선된다는 것이 본 명세서에서 입증되었다 (실시예 10 참조). 따라서, 다양한 구체예에 있어서, 프로타민 황산염은 본 발명의 벡터 시스템의 형질주입, 바람직하게는 본 발명의 아데노바이러스 벡터 시스템의 형질주입에 사용된다.
발현에 있어서, 전형적으로 전사물의 적합한 폴리아데닐화를 위해 폴리아데닐화 신호를 포함할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 성질은 본 발명의 성공적인 실시를 위해 중요하다고 여겨지지 않으며, 임의의 그러한 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 구체예는 다양한 표적 세포에서 편리하고 및/또는 잘 기능하는 것으로 알려진 SV40 폴리아데닐화 신호 및/또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 또한 발현 구조물의 요소로 본 명세서에서 고려된 것은 전사 종결 부위가 있다. 이들 요소는 메시지 레벨을 향상시키고 및/또는 다른 서열로 카세트를 읽는 것을 최소화하는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템에 감염된 세포는 상기 벡터 시스템에 리포터 유전자를 포함시킴으로써 in vitro에서 확인될 수 있다. 일반적으로, 선택 가능한 리포터는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 긍정적으로 선택 가능한 리포터는 리포터 유전자의 존재가 그 선택을 허용하는 것인 반면, 부정적으로 선택 가능한 리포터는 그것의 존재가 선택을 방해하는 것인 경우이다. 긍정적으로 선택가능한 마커의 한 예는 약물 내성 마커이다. 리포터의 다른 유형은 GFP (green fluorescent protein; GFP, 녹색 형광 단백질)와 같은 스크리닝할 수 있는 리포터를 포함한다.
본 개시의 구체예는 백신 또는 유전자 치료 구조물을 생성하도록 고안된 현재의 바이러스 벡터 플랫폼 기술을 사용할 수 있다. 바이러스 벡터 제작의 측면은 바이러스 벡터에 유전 물질을 삽입하고 핵산, 바이러스 및 바이러스 생산물을 특성화하고 시퀀싱하는 것을 통해 구조물을 확인하는 것을 포함한다. 상기 바이러스 벡터는 확장성을 평가하기 위해 고안된 일련의 실행가능성 연구를 거친다.
본 개시는 본 개시의 신규한 벡터/벡터 시스템을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 개시는 본 명세서에 개시된 바와 같은 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 즉, 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
이론에 구애됨이 없이, 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 발현하는 신규한 벡터/벡터 시스템의 사용은 종양 내 또는 주위에서 사이토카인의 국소적인 생산을 초래하고, 이는 전신적으로 또는 국소적으로 유도된 종양 특이적인 세포독성을 T-세포를 암 부위로 안내할 것이다. 이 메커니즘에 의해 제공된 면역-자극 효과를 통해 암, 바이러스 감염 및 면역계 이상의 면역치료의 효과가 크게 향상될 것이다. 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템에 의해 제공된 면역 자극 효과는 실시예에서 입증되었다.
본 개시는 의약으로서 사용하기 위해 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 포괄한다. 본 개시는 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자를 포함하는 의약을 제공한다. 본 개시는 또한 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드, 즉, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 의약을 제공한다.
본 개시는 치료 백신, 보다 구체적으로 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 치료 백신으로서 사용하기 위한 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자를 포함한다.
본 개시는 또한 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나(transduced) 형질주입된(transfected) 면역세포 또는 암세포를 제공한다. 그러한 형질도입된 또는 형질주입된 세포는 ex vivo 치료, 구체적으로 ex vivo 암 치료에 사용될 수 있다. 그러한 치료의 다양한 구체예에 있어서, 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 암세포의 5 % 이상이 4-1BBL을 발현한다.
본 개시에 있어서, 상기 암세포는 바람직하게는 종양의 세포, 즉, 종양 세포, 보다 구체적으로는 고형 종양의 세포이다.
또한, 본 개시는 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 면역세포 또는 암세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 개시는 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 면역세포 또는 암세포를 포함하는 의약을 제공한다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 면역세포는 T-세포, NK 세포, 단핵구 계통 세포 유형 (대식세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 비만 세포), 섬유모세포이다. 다양한 구체예에 있어서, 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 암세포의 5 % 이상이 4-1BBL을 발현한다.
본 개시의 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자는 암, 바이러스 감염 및/또는 면역계 이상을 치료 또는 개선하는 방법에 사용될 수 있다.　또한, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 암, 바이러스 감염 및/또는 면역계 이상의 치료에 사용될 수 있다.　또한, 본 명세서에서 전술된 조성물 또는 의약은 암, 바이러스 감염 및/또는 면역계 이상의 치료에 사용될 수 있다. 다양한 구체예에 있어서, 본 개시의 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자는 활성물질로 간주될 수 있다. 또한, 다양한 구체예에 있어서 본 개시의 폴리뉴클레오티드, 즉, 본 개시의 신규한 벡터/벡터 시스템을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 암세포는 활성물질로 간주될 수 있다.　이는 구체적으로 본 명세서에 개시된 의학적 치료의 맥락에서 적용된다.
본 개시는 본 개시의 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암, 바이러스 감염성 질환 (바이러스 감염), 또는 면역계 이상을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 개시는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 즉, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암, 바이러스 감염성 질환 (바이러스 감염), 또는 면역계 이상을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 개시는 또한 본 발명의 면역세포 또는 암세포, 즉, 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 면역세포 또는 암세포의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암, 바이러스 감염성 질환 (바이러스 감염), 또는 면역계 이상을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 암을 치료 또는 개선하는 방법은 환자로부터 암세포를 수득하고, 자가 암세포를 본 명세서에 개시된 벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입 또는 형질주입시키고, 본 명세서에 개시된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 자가 암세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 ex vivo 치료법으로서 수행된다. 본 개시는 또한 전술된 의약 또는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암, 바이러스 감염성 질환 (바이러스 감염), 또는 면역계 이상을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 질환 또는 이상 (예를 들어, 암 또는 감염성 질환)의 유해한 효과가 최소한으로 개선되는, 본 명세서에 개시된 활성물질, 조성물 또는 의약의 양을 의미한다.
바람직한 구체예에 있어서, 상기 암은 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 대장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원발성 뇌 암종(primary brain carcinoma), 두경부암(head-neck cancer), 신경교종(glioma), 교모세포종(glioblastoma), 간암, 방광암, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 두경부 암종(head or neck carcinoma), 유방 암종, 난소 암종, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부 암종, 고환 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 대장 암종, 전립선 암종, 비뇨 생식기 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발성 골수종(multiple myeloma), 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 췌장 인슐린종(malignant pancreatic insulinoma), 악성 카르시노이드 암종(malignant carcinoid carcinoma), 융모막 암종(choriocarcinoma), 균상식육종(mycosis fungoides), 악성 고칼슘 혈증(malignant hypercalcemia), 자궁경부 과형성(cervical hyperplasia), 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 신경모세포종(neuroblastoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 진성 다혈구증(polycythemia vera), 특발성 혈소판 증가증(essential thrombocytosis), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 연부조직 육종(soft-tissue sarcoma), 중피종(mesothelioma), 골육종(osteogenic sarcoma), 원발성 마크로 글로불린혈증(primary macro globulinemia), 및 망막모세포종(retinoblastoma) 중 어느 하나이다.
다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 암은 흑색종, 암 전이, 선암종(adenocarcinoma), 흉선종 (thyoma), 림프종, 육종(sarcoma), 폐암, 대장암, 호지킨 림프종, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁 경부암, 신장암, 및 췌장암 중 어느 하나이다. 구체적으로 바람직한 구체예에 있어서, 상기 암은 비뇨 생식기 암, 바람직하게는 방광암이다. 다른 특히 바람직한 구체예에 있어서, 상기 암은 간암이다. 또 다른 특히 바람직한 구체예에 있어서, 상기 암은 피부암이다. 본 발명에 의해 제공되는 수단 및 방법은 또한 암 전이를 치료 또는 예방하는 방법에 특히 유용하다.
다양한 구체예에 있어서, 상기 암은 본 발명의 활성물질 (예를 들어, 벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 또는 의약의 종양 내 또는 주위에 직접 주사가 가능하도록 접근 가능한 하나 이상의 종양을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 상기 암은 고형 종양을 포함하거나 또는 고형 종양이다. 일 구체예에 있어서, 상기 고형 종양은 암종, 육종 또는 림프종이다. 이와 관련하여, 림프종은 일반적으로 액체 종양으로 간주되는 반면, 접근 가능한 "고형" 종양은 림프절에서 형성될 수 있으며, 따라서 본 명세서에 개시된 방법 및 용도에 따라 치료 될 수 있다. 다양한 구체예에 있어서, 상기 감염성 질환은 병원성 박테리아에 의해 야기되는 감염성 질환이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스에 의해 야기되는 감염성 질환이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 감염성 질환은 병원성 기생충, 원생 동물 또는 곰팡이에 의해 유발되는 감염성 질환이다.
본 발명에 따라 치료, 보호, 및/또는 관리될 수 있는 바이러스 질환은 A 형 간염, B 형 간염, C 형 간염, 인플루엔자 (예를 들어, 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B), 수두(varicella), 아데노바이러스, I 형 단순 헤르페스(herpes simplex type I; HSV-I), II 형 단순 헤르페스(herpes simplex type II; HSV- II), 리노 바이러스(rhinovirus), 에코 바이러스(echovirus), 로타 바이러스(rotavirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 유두종 바이러스(papilloma virus), 파포바 바이러스(papova virus), 거대세포바이러스, 에키노 바이러스(echinovirus), 아르보 바이러스(arbovirus), 훈타 바이러스(huntaviru), 콕사키 바이러스, 멈프스 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 풍진 바이러스(rubella virus), 폴리오 바이러스(polio virus), 천연두(small pox), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus), 인간 면역 결핍 바이러스 I 형 (human immunodeficiency virus type I; HIV-I), 인간 면역 결핍 바이러스 II 형 (human immunodeficiency virus type II; HIV-II), 에볼라, 지카, 및 바이러스성 뇌수막염(meningitis), 뇌염(encephalitis), 뎅기열 또는 천연두와 같은 바이러스 질환의 제제에 의해 유발되는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 치료, 보호, 및/또는 관리될 수 있는 박테리아에 의해 유발되는 박테리아 질환은 라임병, 탄저병, 파상풍, 콜레라, 페스트(plague), 디프테리아, 클라미디아 및 백일해를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 치료, 보호, 및/또는 관리될 수 있는 원생동물에 의해 유발되는 원생동물 질환은 리슈마니아(leishmania) 및 말라리아를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 치료, 보호, 및/또는 관리될 수 있는 기생충에 의해 유발되는 기생충 질환은　클라미디아 및 리케차(rickettsia)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 면역계 이상은 면역계의 하향 조절, 구체적으로 면역반응의 하향 조절을 특징으로 한다. 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 비활성 면역 미세환경을 활성 면역 미세환경으로 전환시켜 면역계 이상을 치료함으로써 그러한 면역계 이상의 조절을 가능하게 한다.
마찬가지로, 본 명세서에서, 암은 면역계의 하향 조절, 구체적으로 면역반응의 하향 조절을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 비활성 종양 미세환경을 활성 종양 미세환경으로 전환시켜 암을 치료 또는 조절함으로써 암의 조절 또는 치료를 가능하게 한다.
또한, 본 명세서에서, 감염성 질환은 면역계의 하향 조절, 구체적으로 면역반응의 하향 조절을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템은 비활성을 활성 면역 미세 환경으로 전환시켜 감염성 질환을 치료 또는 조절함으로써 감염성 질환의 조절 또는 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 상기 벡터 시스템은 용량 단위 당 1 x 1011 ivp 이하, 바람직하게는 1 x 1010 ivp 이하, 보다 바람직하게는 1 x 109 ivp 이하, 보다 더 바람직하게는 1 x 107 또는 1 x 106 ivp 이하의 농도로 존재한다. 이는 구체적으로 본 명세서에서 개시된 의학적 치료에 적용되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 상기 바이러스 입자는 용량 단위 당 1 x 1011 ivp 이하, 바람직하게는 1 x 1010 ivp 이하, 보다 바람직하게는 1 x 109 ivp 이하, 보다 더 바람직하게는 1 x 107 또는 1 x 106 ivp 이하의 농도로 존재한다. 이는 구체적으로 본 명세서에서 개시된 의학적 치료에 적용되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다양한 구체예에 있어서, 본 개시의 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자의 5 x 106 ivp (감염성 바이러스 입자)는 이를 필요로하는 환자에게 투여된다. 다양한 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자의 5 x 107 ivp는 이를 필요로하는 환자에게 투여된다. 다양한 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자의 5 x 108 ivp는 이를 필요로하는 환자에게 투여된다.
본 명세서에서, 용어 "의약(medicament)" 또는 "약학 조성물(pharmaceutical composition)"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 의약 또는 약학 조성물은 투여에 적합한 임의의 형태, 예를 들어, 고체, 반고체 또는 액체 형태일 수있다. 제형는 용액, 에멀젼 또는 현탁액 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 약제학적 제제를 제형화하기 위한 수단 및 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 그 자체로 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 상기 의약(또는 약학 조성물)는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 투여될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있으며, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 아미노산, 멸균 등장성 수성 완충액, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 활성물질 (예를 들어, 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 및 의약은 비경구로 투여될 수 있다. 이러한 활성 화합물의 용액 또는 현탁액은 히드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 오일 중 이들의 혼합물로 제조될 수 있다. 예시적인 오일은 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 또는 미네랄 오일이다. 일반적으로, 물, 식염수, 수성 덱스트로오스 및 관련 당 용액, 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜은 구체적으로 주사 가능한 용액을 위한 바람직한 액체 담체이다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서 이러한 제제에는 미생물의 성장을 막기위한 방부제가 함유되어 있다. 비경구 및 경구 약물 전달을 위한 제제는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing (1995)에 개시되어 있고, 이는 본 명세서에 전체로서 참고로 인용되어 있다.
주사 가능한 사용에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 상기 형태는 멸균이어야하며 용이한 주사기가 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야하며 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 상기 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
본 발명에 따라 치료될 개체는 암, 감염성 질환, 또는 면역계 이상이 발병할 위험이 있거나, 또는 발병된 개체다. 그러한 개체는 인간 및 비인간 동물, 바람직하게는 포유동물 또는 조류 종을 포함한다. 예시적인 포유 동물 개체는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류, 소, 말, 양 및 돼지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 조류 개체는 닭, 메추라기, 칠면조, 오리 또는 거위를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시의 치료적 또는 예방적 활성물질, 조성물 또는 의약의 유효량은, 예를 들어, 종양 또는 감염성 질환에 대한 면역반응의 자극과 같은 의도된 목표에 기초하여 결정된다. 통상의 기술자는 in vivo 및 ex vivo에서 유전자 전달을 적용하는 방법을 잘 알고 있다. 바이러스 벡터의 경우, 일반적으로 바이러스 벡터 스톡을 준비할 것이다. 바이러스의 종류 및 달성할 수있는 적정 농도(titer)에 따라, 최소 약, 최대 약, 또는 약 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011 또는 1x1012 감염성 바이러스 입자, 또는 임의의 값 또는 그 사이의 범위로 개체에게 전달할 것이다.　다른 측면에서, 본 발명에 따른 바이러스 벡터(들)는 단일 투여 또는 다중 투여로 투여될 수 있다. 상기 바이러스 벡터(들)는 1 x 105 감염성 바이러스 입자 (ivp), 5 x 105 ivp, 적어도 1 x 106ivp, 5 x 106 또는 약 5 x 106 ivp, 1 x 107, 적어도 1 x 107 ivp, 1 x 108 또는 약 1 x 108 ivp, 적어도 1 x 108 ivp, 약 또는 적어도 5 x 108 ivp, 1 x 109 또는 적어도 1 x 109 ivp, 5 x 109 또는 적어도 5 x 109 ivp, 1 x 1010 ivp 또는 적어도 1 x 1010 ivp, 5 x 1010 또는 적어도 5 x 1010 ivp, 1 x 1011 또는 적어도 1 x 1011, 1 x 1012 또는 적어도 1 x 1012, 1 x 1013 또는 적어도 1 x 1013 ivp의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스 벡터(들)는 약 107 내지 1013 ivp, 약 108 내지 1013 ivp, 약 108 내지 1012 ivp 또는 약 109 내지 1012 ivp의 용량으로 투여될 수 있다.
치료 효과는 본 발명의 활성물질 (예를 들어, 벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 또는 의약의 단지 한 번의 투여로 달성될 수있다. 다른 한편으로는, 치료에는 여러 번의 투여가 포함될 수 있다.
벡터의 효과적인 용량은 적어도 치료가 필요한 개체, 질환의 유형 및 질환의 단계에 달려있다. 상기 용량은 예를 들어, 약 1x108 ivp (감염성 바이러스 입자) 내지 약 1x1014 ivp, 구체적으로 약 1x109 ivp 내지 약 1x1013 ivp, 보다 구체적으로는 약 5x109 ivp 내지 약 1x1012 ivp로 다양할 수 있다.
본 발명의 활성물질 (예를 들어, 벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 또는 의약의 투여는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 투여는 종양 내, 동맥 내, 정맥 내, 흉강 내, 소포 내(intravesicular), 강 내(intracavitary) 또는 복막 주사, 또는 경구 투여를 통해 수행된다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 투여는 근육 내, 피부 내, 피하, 비경 구, 비강 내, 기관 내, 경피, 척수 내, 안구 내, 또는 두개 내(intracranially)로 수행된다. 또한 상이한 투여 경로를 결합하는 것도 가능하다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 투여는 종양 내 투여, 즉, 종양 내로 본 발명의 활성물질 (예: 벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 또는 의약의 투여를 통해 수행된다.
본 발명의 활성물질 (예를 들어, 벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 또는 의약은 또한 다른 치료제 또는 치료 방법 또는 치료의 조합과 함께 (동시에, 순차적으로, 또는 부수적으로) 함께 사용될 수있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 방법 또는 용도는 방사선 요법, 화학 요법, 다른 약물의 투여, 예를 들어, 종양 성장 메커니즘, 면역세포 체크포인트 표적, 암 백신, 또는 임의의 임상 수술을 다루는 항체를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 면역 자극 (즉, 암, 감염성 질환 또는 면역계 이상의 치료와 관련하여 면역반응 메카니즘을 유도, 조절 및/또는 활성화 및/또는 자극하는, 구체적으로 관심 부위로 (예를 들어, 종양, 또는 감염의 점막 부위로) 면역 자극에 의해 유도된, 활성화된 및/또는 자극된 세포를 유인하거나 또는 모집하기 위한 방법 또는 용도가 제공된다. 면역반응에 관여하는 면역계의 세포는 일반적으로, 면역세포로 언급되고 림프구 및 부속 세포와 같은 비림프성 세포를 포함한다. 림프구는 외래 항원을 특이적으로 인지하고 반응하는 세포이다. 림프구의 주요 분류는 B 림프구 (B 세포), T 림프구 (T 세포) 및 대형 과립 림프구 인 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. B 세포는 항체를 생산할 수 있다. T 림프구는 더 세분화되어 있으며 헬퍼 T 세포 (CD4 + T 세포) 및 세포용해 또는 세포독성 T 세포 (CD8 + T 세포)를 포함한다. 헬퍼 세포는 T 세포 및 B 세포 및 대식 세포를 포함한 다른 세포의 증식 및 분화를 촉진하고 염증성 백혈구를 모집하고 활성화시키는 사이토카인을 분비한다. 조절 T 세포 또는 억제 T 세포라고 불리는 또 다른 T 세포 하위 그룹은 면역계의 활성화를 적극적으로 억제하고 병리학적 자가-반응성, 즉, 자가 면역 질환을 예방한다.
본 명세서에 기재된 면역 자극 방법은 다양한 유형의 T 세포를 포함하는 세포-매개 면역반응을 유도하는 것으로 간주된다. 세포 매개 반응에서, 다양한 유형의 T 림프구는 여러 메커니즘에 의해 항원을 제거하는 역할을 한다. 예를 들어, 특정 항원을 인식할 수 있는 헬퍼 T 세포는 면역반응에 참여하기 위해 면역계의 추가적인 세포를 모집하기 위해 사이토카인과 같은 용해성 매개체를 방출함으로써 반응할 수 있다. 또한, 세포독성 T 세포는 항원을 특이적으로 인식할 수 있으며, 항원-보유 세포 또는 입자에 결합하여 파괴하거나 손상시킴으로써 반응할 수 있다.
숙주 또는 개체에서의 면역반응은 통상의 기술자가 잘 알 수 있는 임의의 수의 잘 알려진 면역학적 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 면역반응의 존재 및 수준을 결정하기 위한 방법 및 기술은, 예를 들어, 형광 공명 에너지 전환(fluorescence resonance energy transfer), 형광 편광(fluorescence polarization), 시간-분해 형광 공명 에너지 전환(time-resolved fluorescence resonance energy transfer), 섬광 근접 분석(scintillation proximity assays), 리포터 유전자 분석, 형광 켄칭 효소 기질(fluorescence quenched enzyme substrate), 발색 효소 기질 및 전기화학발광(chromogenic enzyme substrate and electrochemiluminescence), 면역 분석법(immunoassays), (효소 결합 면역 흡척 측정법(enzyme-linked immunosorbant assays; ELISA), 방사면역측정법(radioimmunoassay), 면역블로팅(immunoblotting), 면역 조직 화학 등과 같은), 표면 플라스몬 공명, 리포터 유전자를 사용하는 것과 같은 세포-기반 분석법, 및 기능적 분석법(예를 들어, 면역 기능 및 면역반응을 측정하는 분석법)을 포함한다.
이러한 분석법은 수용성 항체, 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-6, IL-23, TNF-α, 및 TGF-β), 림포카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자 등과 같은 수용성 매개체뿐만 아니라 다른 가용성 작은 펩티드, 탄수화물, 뉴클레오티드 및/또는 지질 매개체의 존재 또는 수준의 in vivo 또는 in vitro 결정을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.　사이토카인의 수준은, 예를 들어, ELISA, ELISPOT, 세포 내 사이토카인 염색, 및 유세포 분석 및 이들의 조합(예를 들어, 세포 내 사이토카인 염색 및 유세포 분석)을 포함하는 당해 기술분야에서 기술되고 실시되는 방법에 따라 결정될 수 있다.
면역분석법은 또한 면역계의 세포의 변화된 기능적 또는 구조적 특성, 예를 들어, 세포 증식, 변화된 운동성, 특정 유전자 발현 또는 세포용해성 거동과 같은 특수화된 활성의 유도; 자극에 대한 반응으로 수지상 세포의 성숙과 같은 세포 성숙; Th1 반응과 Th2 반응 간의 관계의 변화; 변화된 표면 항원 발현 프로파일 또는 세포 사멸 (프로그램된 세포 사멸)의 시작을 포함하는, 면역계의 세포에 의한 세포 분화를 분석함으로써 세포 활성화 상태 변화를 결정하는 단계를 포함한다. 항원-특이적 CD4 + 및/또는 CD8 + T 세포, 작동자 기억 T 세포 (effector memory T cells; Tem), 중추 기억 T 세포 (central memory T cells; Tcm) 및/또는 조직-상주성 기억 T 세포 (tissue-resident memory T cells; Trm)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 면역세포의 다양한 집단을 확인하기 위해 세포 표면 마커를 측정하기 위한 다른 방법이 또한 이용 가능하다. 이들 및 유사한 분석을 수행하는 절차는 문헌에 기재되어있다. CTL 활성 (또는 CD8 + T 세포 활성)을 결정하기 위한 세포독성 분석은 당해 기술분야에서 일상적으로 실시되는 몇 가지 기술 및 방법 중 어느 하나를 사용하여 수행될 수 있다.
특정 구체예에 있어서, 국소적으로 침투하는 항원-특이적인 T 세포의 2 내지 50 배 증가가 본 명세서에 개시된 방법 및 용도에 따라 관찰된다. 일 구체예에 있어서, 국소적으로 침투하는(예를 들어, 종양-침투하는) 항원-특이적인 T 세포의 2 내지 40 배 증가, 2 내지 30 배 증가, 2 내지 20 배 증가, 2 내지 10 배 증가, 3 내지 8 배 증가, 4 내지 7 배 증가, 또는 5 내지 6 배 증가가 관찰된다. 일반적으로, 상기 국소적으로 침투하는 항원-특이적인 T 세포의 증가는 투여하지 않을 때 존재하는 국소적으로 침투하는 항원-특이적인 T 세포의 수와 비교되거나 또는 또는 적절한 대조군 투여와 비교된다. 본 명세서에 개시된 방법 및 용도는 본 발명의 활성물질, 조성물 또는 의약의 투여의 부존재하에 적절한 대조군과 비교하여 국소적으로 침투하는 항원-특이적인 T 세포의 통계적, 생물학적, 및/또는 임상적으로 유의한 방식으로의 증가를 제공하는 것으로 간주된다.
생물학적 샘플은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 본 발명의 활성물질 (예를 들어, 벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 또는 의약으로 치료를 받은 개체에서 면역반응의 존재 및 수준을 결정하기 위해 개체로부터 수득될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "생물학적 샘플(biological sample)"은 혈액 샘플 (혈청 또는 혈장이 제조될 수 있는), 분리반출법(apheresis) 샘플, 생검 샘플, 종양 생검 샘플, 체액 (예를 들어, 폐 세척액, 복수, 점막 세척액, 활액), 골수, 림프절, 조직 외식편(tissue explants), 기관 배양물, 또는 개체 또는 생물학적 공급원으로부터의 임의의 다른 조직 또는 세포 제제일 수 있다.
면역반응을 결정하기 위한 본 명세서에 기재된 모든 면역 분석법 및 방법과 관련하여, 통상의 기술자는 또한 이들 방법을 실시할 때 어느 대조군이 적절하게 포함되는지 쉽게 인식하고 이해할 것이다. 반응 성분의 상호 작용을 허용하기에 충분한 반응 성분의 농도, 완충액, 온도 및 시간은 통상의 기술자가 잘 알고있는 방법에 따라 결정 및/또는 조절될 수 있다.
본 명세서의 또 다른 측면은 종양을 갖는 개체에게 본 명세서에 개시된 방법에 따라 본 발명의 활성물질 (예를 들어, 벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 또는 의약을 투여하여 종양에 대한 면역반응을 유도하는 단계를 포함하는 종양 미세 환경에서 T-세포를 증가시키는 방법을 제공한다.
의학 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 용어 "치료하는(treat)" 및 "치료(treatment)"는 개체(즉, 환자)의 질환, 이상 또는 상태의 의학적 관리를 의미한다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이익을 제공하기에 충분한 양으로 본 발명의 활성물질 (예를 들어, 벡터 시스템 또는 바이러스 입자), 조성물 또는 의약을 제공한다. 치료적 및/또는 예방적 이익은, 예를 들어, 치료적 치료 및 예방적(prophylactic) 또는 예방적(preventative) 조치 모두에서의 개선된 임상 결과를 포함하며, 상기 목적은 원하지 않는 생리적 변화 또는 이상을 예방 또는 둔화 또는 지연 (감소)시키거나, 또는 그러한 질환이나 이상의 확장 또는 중증도를 예방 또는 둔화 또는 지연(감소)시키는 것이다. 개체를 치료함에 따른 유익한 또는 바람직한 임상 결과는 치료될 질환 또는 이상과 관련된 또는 이로부터 유발되는 증상의 경감, 감소, 또는 완화; 증상의 감소된 발생; 삶의 질 향상; 질환이 없는 상태의 지속 (즉, 개체가 질환의 진단을 기초로 하여 증상을 나타낼 가능성 또는 경향을 감소시킴); 질환 범위의 감소; 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태; 질환 진행의 지연 또는 둔화; 질환 상태의 개선 또는 완화; 및 검출 가능 여부에 관계없이 (부분적이든 또는 전체적이든) 병의 차도; 및/또는 전반적인 생존율을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.　"치료"는 또한 개체가 치료를 받지 않은 경우의 예상 생존 기간과 비교했을 때 생존 기간을 연장시키는 것을 의미할 수 있다.　치료가 필요한 개체는 이미 질환이나 이상을 가지고 있는자 뿐만 아니라 질환이나 이상을 가지기 쉽거나 발병할 위험에 있는 개체를 포함한다.
본 발명에 따른 벡터 시스템을 포함하는 핵산 분자는 당해 기술분야에 기재된 몇 가지 방법 중 어느 하나에 따라 세포 내로 전달될 수 있다. 통상의 기술자에게 공지된 이러한 전달 방법은 이온영동치료법(iontophoresis)에 의한, 또는 생분해성 중합체; 하이드로겔; 사이클로덱스트린; 폴리(락틱-코-글라이콜릭)에시드(poly(lactic-co-glycolic)acid; PLGA) 및 PLCA 마이크로스피어; 생분해성 나노 캡슐; 및 생부착성 마이크로스피어와 같은 다른 비히클 내로의 결합에 의한, 또는 단백질성 벡터에 의한 리포솜 내에서의 캡슐화를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시는 4-1BB 리간드 (4-1BBL), IL-2 및 단쇄 IL-12 (scIL-12)를 포함하는 단백질의 조합을 제공하며, 4-1BBL의 양은 scIL-12 및 IL-2의 양보다 많다.
다양한 구체예에 있어서, 상기 4-1BB 리간드는 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열과 70 % 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 4-1BB 리간드는 T 세포, 바람직하게는 활성화된 CD4 + T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 4-1BB 리간드는 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 4-1BB 리간드는 T 세포, 바람직하게는 CD8 + T 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 4-1BB 리간드는 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열과 90 % 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 4-1BB 리간드는 T 세포, 바람직하게는 활성화된 CD4 + T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 상기 4-1BB 리간드는 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열과 95 % 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 4-1BB 리간드는 T 세포, 바람직하게는 활성화된 CD4 + T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 4-1BBL의 변이체는 서열번호 2(도 13)의 아미노산 서열을 갖는 천연 4-1BBL과 동일한 T 세포, 바람직하게는 활성화된 CD4+ T 헬퍼 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 결합 특이성을 나타낸다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 상기 IL-2 단백질은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열과 70 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내고, 상기 IL-2 단백질은 면역자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 IL-2 단백질은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내고, 상기 IL-2 단백질은 면역자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 IL-2 단백질은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열과 90 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내고, 상기 IL-2 단백질은 면역자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 상기 IL-2 단백질은 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열과 95 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내고, 상기 IL-2 단백질은 면역자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 IL-2의 변이체는 서열번호 4(도 14)의 아미노산 서열을 갖는 천연 IL-2와 동일한 면역자극 활성, 바람직하게는 T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 나타낸다.
본 발명의 다양한 구체예에 있어서, 상기 scIL-12 단백질은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열과 70 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scIL-12 단백질은 면역자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 scIL-12 단백질은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scIL-12 단백질은 면역자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 scIL-12 단백질은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열과 90 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scIL-12 단백질은 면역자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 상기 scIL-12 단백질은 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열과 95 % 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 scIL-12 단백질은 면역자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 갖는다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 scIL-12의 변이체는 서열번호 6(도 15)의 아미노산 서열을 갖는 천연 scIL-12와 동일한 면역자극 활성, 바람직하게는 단핵구, T 헬퍼 세포 및 CD8 + T 세포 자극 활성을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 단백질은 융합 단백질로서 천연 IL-12 단백질의 2 개의 서브유닛 p35 및 p40을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경우 scIL-12 단백질로 간주된다. 서열번호 8 및 10의 서열은 인간 IL-12의 40 kDa 및 35 kDa 서브유닛의 아미노산 서열을 나타낸다. 일 구체예에 있어서, 전술된 바와 같은 scIL-12의 변이체는 서열번호 8 및 10의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 천연 scIL-12와 동일한 면역자극 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 scIL-12의 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커이다. 본 개시는 구체적으로 도 15(서열번호 5 및 6)에서 굵은 글씨로 나타낸 링커 서열은 특히 링커 서열의 길이에 관하여 변형된 것인, 본 명세서에 기재된 바와 같은 scIL-12의 변이체를 포함한다. 상기 링커의 아미노산 서열의 길이는 경험적으로 또는 구조적 정보로부터 유도되거나 또는 상기 두 가지 방법의 조합을 사용하여 선택될 수 있다. 통상의 기술자는 길이가 과도하게 길거나 짧지 않다는 일차적인 고려 사항과 함께 링커로서 작용할 수있는 길이 또는 조성이 다른 많은 서열이 있음을 인식할 것이다.
본 발명에 의해 제공된 신규한 벡터/벡터 시스템 또는 바이러스 입자는 키트로서 포장될 수 있다. 키트는 사용 및 투여를 위한 지침, 장치 (예를 들어, 개체에 조성물 또는 조성물들을 투여하기 위한 것), 및 추가적인 시약, 및 튜브, 용기와 같은 성분, 예를 들어, 유리병(vials) 및 상기 방법 및 용도의 실시를 위한 주사기와 같은 하나 이상의 성분을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터 시스템을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트 또한 본 명세서에서 고려된다. 본 발명의 벡터 시스템 또는 바이러스 입자로 형질도입되거나 형질주입된 암세포를 포함하는 키트도 또한 본 명세서에서 고려된다. 본 발명의 활성물질, 조성물, 또는 의약을 포함하는 키트도 또한 본 명세서에서 고려된다. 본 발명의 신규한 바이러스 벡터/벡터 시스템 및 선택적으로 성숙 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트도 또한 고려된다.
본 명세서에 비추어, 본 명세서에는, 여기에 한정되는 것은 아니나, 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 측면 및 구체예와 관련하여 고려되어야 하는 하기의 항목이 포함된다:
1. 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 단쇄 IL-12 (scIL-12) 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 상기 유전자는 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열하되 단, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자는 1번 위치에 존재하지 않는 벡터.
2. 항목 1에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 팍스 바이러스 벡터, RNA 벡터, 플라스미드 벡터, 나노 입자 벡터, 및 네이키드 DNA중 어느 하나인 것인 벡터.
3. 항목 2에 있어서, 상기 RNA 벡터는 삽입된 변형 리보뉴클레오티드를 포함하는 것인 벡터.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4-1BBL을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 인간 cDNA이고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 인간 cDNA이고, 및/또는 상기 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 인간 cDNA인 것인 벡터.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4-1BBL을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 서열번호 1(도 13)의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 T 세포, 바람직하게는 활성화된 T 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
6. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 IL-2을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 서열번호 3(도 14)의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성을 갖는 IL-2 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
7. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 scIL-12을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 서열번호 5(도 15)의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성 또는 서열 동일성을 나타내며, 그 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성을 갖는 scIL-12 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 상기 4-1BBL을 코딩하는 유전자의 핵산 서열의 하류에 위치한 것인 벡터.
9. 항목 8에 있어서, 상기 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 상기 4-1BBL을 코딩하는 유전자의 핵산 서열의 하류에 위치하고, 상기 scIL-12를 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치한 것인 벡터.
10. 항목 8 또는 9에 있어서, 프로모터는 상기 4-1BBL을 코딩하는 유전자의 핵산 서열의 상류에 위치하지만, 상기 scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열의 상류에는 위치하지 않는 것인 벡터.
11. 항목 8 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 4-1BBL, scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 유전자의 핵산 서열들은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 연결된 것인 벡터.
12. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
13. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 벡터를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
14. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 벡터 또는 항목 12의 바이러스 입자로 형질도입되거나 또는 형질주입된 암세포 또는 면역세포.
15. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 벡터, 항목 12의 바이러스 입자, 항목 13의 폴리뉴클레오티드, 또는 항목 14의 암세포 또는 면역세포를 포함하는 조성물.
16. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 벡터, 항목 12의 바이러스 입자, 항목 13의 폴리뉴클레오티드, 또는 항목 14의 암세포 또는 면역세포를 포함하는 의약.
17. 암, 바이러스 감염 및/또는 면역계 이상을 치료하는 방법으로 사용하기 위한 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 벡터, 항목 12의 바이러스 입자, 항목 13의 폴리뉴클레오티드, 항목 14의 암세포 또는 면역세포, 항목 15의 조성물, 또는 항목 16의 의약.
18. 항목 17에 따른 사용을 위한 벡터, 항목 17에 따른 사용을 위한 바이러스 입자, 항목 17에 따른 사용을 위한 폴리뉴클레오티드, 항목 17에 따른 사용을 위한 암세포 또는 면역세포, 항목 17에 따른 사용을 위한 조성물, 또는 항목 17에 따른 사용을 위한 의약에 있어서, 상기 암은 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 대장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원발성 뇌 암종(primary brain carcinoma), 두경부암(head-neck cancer), 신경교종(glioma), 교모세포종(glioblastoma), 간암, 방광암, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 두경부 암종(head or neck carcinoma), 유방 암종, 난소 암종, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부 암종, 고환 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 대장 암종, 전립선 암종, 비뇨 생식기 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발성 골수종(multiple myeloma), 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 췌장 인슐린종(malignant pancreatic insulinoma), 악성 카르시노이드 암종(malignant carcinoid carcinoma), 융모막 암종(choriocarcinoma), 균상식육종(mycosis fungoides), 악성 고칼슘 혈증(malignant hypercalcemia), 자궁경부 과형성(cervical hyperplasia), 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 신경모세포종(neuroblastoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 진성 다혈구증(polycythemia vera), 특발성 혈소판 증가증(essential thrombocytosis), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 연부조직 육종(soft-tissue sarcoma), 중피종(mesothelioma), 골육종(osteogenic sarcoma), 원발성 마크로 글로불린혈증(primary macro globulinemia), 및 망막모세포종(retinoblastoma) 중 어느 하나인 것인 벡터, 바이러스 입자, 폴리뉴클레오티드, 암세포 또는 면역세포, 조성물, 또는 의약.
19. 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목의 벡터, 항목 12의 바이러스 입자, 항목 13의 조성물, 또는 항목 14의 의약.
20. 항목 17 내지 19 중 어느 한 항목에 따른 사용을 위한 벡터에 있어서, 상기 벡터 시스템은 용량 단위 당 1x1011 ivp (감염성 바이러스 입자) 이하, 바람직하게는 1x1010 ivp 이하, 보다 바람직하게는 1x109 ivp 이하, 보다 더 바람직하게는 1x107 ivp 또는 1x106 ivp 이하의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 것인 벡터.
21. 항목 17 내지 19 중 어느 한 항목에 따른 사용을 위한 바이러스 입자에 있어서, 상기 바이러스 입자는 용량 단위 당 1x1011 ivp 이하, 바람직하게는 1x1010 ivp 이하, 보다 바람직하게는 1x109 ivp 이하, 보다 더 바람직하게는 1x107 ivp 또는 1x106 ivp 이하의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 것인 벡터.
22. 4-1BB 리간드 (4-1BBL), IL-2 및 단쇄 IL-12 (scIL-12)를 포함하고, 상기 4-1BBL의 양이 상기 scIL-12 및 IL-2의 양보다 많은 것인 단백질의 조합물.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 속(genera), 및 제제에 한정되지 않고 다양할 수 있음을 인정해야 한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 인정해야 한다.
도 1은 쥐과동물 및 인간 Im01의 IL-12, IL-2, 및 4-1BBL 전이유전자(transgene)의 발현 및 IFN-γ 반응의 비교를 나타낸다. MOI (multiplicity of infection; MOI, 감염 다중도) 숫자는 [괄호] 안에 표시되어 있다; "m"= 마우스; "hu"= 인간.
도 2는 셔틀(shuttle) 플라스미드 pE1.1 Im02의 도식적인 유전자 지도를 나타낸다. 인간 4-1BBL (CD137L), IL-2, 및 단쇄 IL-12의 3 가지 치료 유전자의 cDNA는 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosomal entry sites; IRES)에 의해 연결되고 거대세포바이러스 (Cytomegalovirus; CMV) 프로모터에 의해 구동되는 트리시스트론(tricistronic) 구조로 배열되었다. 전사 폴리아데닐화는 SV40 유도 신호에 의해 유도된다. lm02에 대한 발현 카세트는 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 DNA를 갖는 플라스미드로 서브-클로닝하기에 적합한 플라스미드 pE1.1에 기반한 전구체 전달 플라스미드로서 설명된다.
도 3은 Im02 및 종래 벡터 Im01의 전이유전자 발현 및 IFN-γ 반응의 비교를 나타낸다. MOI (감염 다중도) 숫자는 [괄호] 안에 표시되어 있다. 표시된 데이터 의 점수는 4 명의 개별 기증자의 각 4번의 반복실험의 평균이다.
도 4는 방광 조직-기반 모델에서 Im02와 Im01의 비교를 나타낸다. "T"= 방광 종양 조직; "B"= 정상 방광 조직.
도 5는 서로 다른 용량 수준에서 Im02와 Im01의 비교를 나타낸다. Dosis ivp는 감염성 바이러스 입자의 용량을 의미한다. "T"= 방광 종양 조직; "B"= 정상 방광 조직.
도 6은 인간 방광 RT-4 암종(carcinoma) 세포와 인간 PBMC의 공동 배양에서 면역세포 유형의 활성화를 보여주는 열-플롯 (heat-plot)을 나타낸다. 후속 행은 기본 및 활성화된 ("act") 면역세포 유형을 나타낸다. 벡터가 없는 RT-4 세포 ("대조군") 및 빈 아데노바이러스 벡터("Ad0")로 형질도입된 세포를 대조군으로 사용하였다. Th = T 헬퍼 세포; Tc = 세포 독성 T 세포 (CD8 + T 세포); PC = 혈장 세포; NK = 자연살해세포; mono = 단핵구; DC = 수지상 세포; neutro = 호중구.
도 7(도 7a-b)은 Im02 또는 Ad0로 자극된 샘플 또는 대조군으로서 처리하지 않은 샘플의 헤마톡실린 및 에오신 염색 후의 조직 검사를 나타낸다.　A : 배양하지 않은 방광 종양 조직; B : 방광 종양 조직, 108 ivp Ad0, 치료 6 일 후; C : 방광 종양 조직, 108 ivp lm02, 치료 6 일 후.
도 8은 Im02 존재 또는 부존재로 자극된 샘플의 헤마톡실린 및 에오신 염색 후의 조직 검사를 나타낸다. 배양하지 않은 요로상피세포(Urothelial) 종양 조직, 하부 패널 : 방광 종양 조직, 108 ivp lm02로 자극됨, 치료 6 일 후.
도 9(도 9a-c)는 투과 전자 현미경에 의한 표적 세포 분석 및 흡수 기전을 나타낸다. 패널 1: 개요 (오른쪽 이미지) 및 세부 사항 (A): 미지의 세포 유형에 의한 소포가 없는 입자 흡수. 세부 사항 (B), 백색: 랑게르한스 세포 / 대식세포 / 수지상 세포 형태의 세포에 의한 소포성 입자 흡수. 패널 2: 개요 (B) 및 세부 사항 (A): 랑게르한스 세포 / 대식세포 / 수지상 세포 형태의 세포에 의한 소포성 아데노바이러스 입자 흡수. 패널 3: 개요 (B) 및 세부 사항 (A): 림프구 형태의 세포에 의한 강한 소포성 구조에 의한 아데노바이러스 입자 흡수. 패널 4: 개요 (B) 및 세부 사항 (A): 섬유모세포 형태의 세포에 의한 소포에 의하지 않은 아데노바이러스 입자 흡수. 패널 5: 개요 (B) 및 세부 사항 (A): 미지의 표적 세포 유형에 의해 흡수된 소포가 없는 큰 그룹의 아데노바이러스 입자. 패널 6: 개요: 상피 세포 또는 종양 세포의 형태학적 특징을 가진 표적 세포의 풍부한 소포성 구조 사이에 소포 코팅 (백색 화살표)이 없는 아데노바이러스 입자. 세부 사항 (A): 혈장 막에 부착된 아데노바이러스 입자의 초기 내포작용 수치. 세부 사항 (B): 다른 비-바이러스 성 구조를 또한 포함하는 큰 소포에서 아데노바이러스 입자의 음세포작용.
도 10은 정상 방광 및 방광 종양 샘플에서의 차등 발현의 비교를 나타낸다. lm02는 실시예 2에서 기술된 바와 같은 아데노바이러스 벡터를 의미한다. Ad0은 대조군으로서 사용되는 빈 아데노바이러스 벡터를 의미한다. n = 방광/종양 샘플 수.
도 11은 세포 배양에서 상이한 형질주입체의 검사를 나타낸다. GFP = 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP). CAR = 콕사키-아데노바이러스-수용체(Coxsackie-Adenovirus-Receptor; CAR). MOI = 감염 다중도 (표적 세포 당 감염성 바이러스 입자).
도 12는 프로타민 황산염이 전이유전자 발현 및 IFN-γ 유도에 미치는 영향을 나타낸다. Im02는 실시예 2에 기술된 바와 같은 아데노바이러스 벡터를 의미한다; Ad0 = 빈 아데노바이러스 벡터(empty adenoviral vector; Ad0), 대조군으로 사용됨. ivp = 감염성 바이러스 입자(infectious viral particles; ivp). "T"= 방광 종양 조직; "B"= 정상 방광 조직.
도 13은 인간 4-1BBL (CD137L)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 14는 인간 IL-2의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 15(도 15a-b)는 링커에 의해 연결된 인간 IL-12의 p40 및 p35 서브유닛을 포함하는 인간 단쇄 IL-12 (scIL-12)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 링커 서열은 굵은 글씨로 표시하고 서열 번호 5 및 6에 각각 밑줄을 그었다.
도 16(도 16a-b)은 인간 IL-12의 35 kDa 및 40 kDa 서브유닛의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 17(도 17a-d)은 도 2에 도시된 셔틀 벡터 hu pE1.1 Im02의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 11)을 나타낸다. 상기 뉴클레오티드 서열은 총 7,845 bp이다. 서열 번호 11의 뉴클레오티드 서열에서 CMV 프로모터, 인간 4-1BBL, EMCV IRES, 인간 IL-2, PV IRES, 인간 scIL-12, 및 SV40polyA는 다음과 같이 확인할 수 있다: CMV 프로모터 : bp 484-1,059; 인간 4-1BBL: bp 1,080-1,844; EMCV IRES: bp 1,885-2,388; 인간 IL-2: bp 2,409-2,870; PV IRES: bp 2,914-3,545; 인간 scIL-12: p40 서브유닛 bp 3,581-4,564, 링커 bp 4,565-4,609, p35 서브유닛 bp 4,610-5,203; 및 SV40polyA: bp 5,271-5,510.
도 18(도 18a-d)은 도 2 및 서열 번호 11 (도 17)에 각각 도시된 셔틀 플라스미드 hu pE1.1 Im02에 포함된 CMV, 인간 4-1BBL, EMCV IRES, 인간 IL-2, PV IRES, 인간 scIL-12, 및 SV40polyA를 포함하는 발현 카세트의 도식적인 개요 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 19는 Im02의 4-1BBL, IL-2, 및 scIL-12의 및 상이한 MOI에서 단일-유전자 발현 벡터의 전이유전자의 발현, 및 IFN-γ 반응을 나타낸다. "4-1BBL + 세포의 %"로 표시된 하단 축은 4-1BBL의 발현 양성 세포를 의미한다. 왼쪽에 있는 막대는 4-1BBL의 상이한 MOI([10], [25], [50], 및 [100])를 갖는 각각 [5] MOI에서의 ILI-12와 IL-2의 조합을 나타낸다. lm02는 실시예 2에서 기술된 바와 같은 아데노바이러스 벡터를 의미한다. MOI = 감염 다중도 (즉, 표적 세포 당 감염성 바이러스 입자). 4-1BBL, IL-2 및 scIL-12의 전이유전자 발현, 및 Im02의 IFN-γ 반응 및 단일-유전자 발현 벡터의 조합은 IFN-γ 발현이 4-1BBL 수준의 증가에 의존함을 나타낸다.
도 20은 셔틀 플라스미드 pE1.1 lm01의 도식적인 유전자 지도를 나타낸다. 인간 4-1BBL (CD137L), IL-2 및 단쇄 IL-12의 3 가지 치료 유전자의 cDNA는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 연결되고 거대세포바이러스(CMV) 프로모터에 의해 구동되는 트리시스트론 구조로 배열되었다. 전사 폴리아데닐화는 SV40 유도 신호에 의해 유도된다. lm01의 발현 카세트는 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 DNA를 갖는 플라스미드로 서브-클로닝하기에 적합한 플라스미드 pE1.1에 기반한 전구체 전달 플라스미드로서 설명된다.
하기의 실시예는 예시로서 제공되는 것이지 한정하기 위한 것은 아니다.
다른 구체예 및 용도는 본 명세서에 비추어 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 하기의 실시예는 단지 다양한 구체예의 예시로서 제공되며 어떠한 방식으로든 본 개시를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 쥐과동물 및 인간 Im01의 IL-12, IL-2, 및 4-1BBL의 전이유전자 발현 및 IFN-γ 반응
Im01은 하기 도식에 나타낸 순서로 단쇄 IL-12, 4-1BBL, 및 IL-2에 대한 인간 유전자를 포함하는 발현 구조물을 포함하는 아데노바이러스 벡터이다:
Figure pct00002
벡터 Im01의 구조는 WO 2004/035799의 도 1에 도시된 상기 도식에 따라 WO 2004/035799에 기술되어있다. WO 2004/036799에서의 벡터 이름은 "Ad-3"이다. 본 개시에서, 상기 종래 벡터에 대한 내부 벡터 코드는 Im01이다.
인간 A549 세포와 마우스의 Hepa1-6 세포에 각각 상기 3 개의 인간 또는 마우스 유전자를 운반하는 Im01로 표시된 감염 다중도 (MOI, [괄호] 안의 숫자)로 1 시간 동안 형질도입시켰다. 인간 말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells; PBMCs) 또는 마우스 림프구를 형질도입 4 시간 후에 첨가하고, 34 시간의 공동-배양 후 사이토카인 분석을 위해 상층액(supernatants)을 채취하였다. 사이토카인의 수준은 ELISA(eBioscience)로 검출하였다. 종양 세포를 분리하고 4-1BBL 발현을 유세포 분석(flow-cytometry)으로 분석하였다. 그 결과, 마우스와 인간 벡터 구조가 동일하더라도, 인간 Im01이 마우스 Im01보다 15 배까지 더 높은 IL-12 발현을 나타낸다는 점에서 전이유전자의 발현 수준은 마우스와 인간 종 사이에서 명확하게 다르다. 임상 환경에서 이러한 증가된 IL-12 수준은 독성 및 제한된 치료 적용 가능성에 대한 위험을 동반한다.
실시예 2 : 벡터 디자인 및 연구 개요
Im02
본 개시에 따른 벡터는 ex vivo 치료 시뮬레이션 연구를 위해 디자인되고 생산되었다. 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터를 기반으로 하며 Im02 (내부 벡터 코드 "Im02")로 명명되었다. Im02는 하기 도식에 나타낸 순서로 4-1BBL, IL-2, 및 단쇄 IL-12 (scIL-12)에 대한 인간 유전자를 포함하는 발현 구조물을 포함한다:
Figure pct00003
도 2는 셔틀 플라스미드 pE1.1 lm02의 도식적인 유전자 지도를 나타낸다. lm02의 발현 카세트는 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 DNA를 갖는 플라스미드로 서브-클로닝하기에 적합한 플라스미드 pE1.1에 기반한 전구체 전달 플라스미드로서 설명된다. 더욱 구체적으로, 아데노바이러스 벡터 lm02에 포함된 발현 카세트는 서열 번호 12의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 도 18에 나타낸 바와 같은 발현 카세트이다. 본 개시의 벡터는 종양 내 면역 미세환경의 다가(multivalent) 변형에 의해 방광암에서 종양 세포에 대한 면역 방어 기전을 유도하는 것으로 확인되었다.
환자 집단 개요(patient cohort review)
인간 종양 생검 샘플의 ex vivo 배양물을 신규한 벡터 시스템에 대한 연구 모델로 선택하였다. 샘플은 Urology 클리닉, Asklepios 병원, Hamburg-Barmbek으로부터 제공되었다. 43명의 환자들로부터의 총 244개의 종양 샘플과 270개의 정상 방광 조직 대조군 생검을 분석하였다. 8 명의 환자 샘플은 경요도 절제술 (transurethral resection; TUR) 동안 채취되었고, 연구에 포함된 샘플의 대부분은 방광 절제술에서 얻은 것이다. 이 연구에서, 종양 및 방광 조직은 초기 단계부터 후기 단계까지 광범위한 질병 단계에 걸쳐 분석되었다. 16 명의 여성과 27 명의 남성의 샘플을 분석하였다. 이 환자 집단에서의 사전치료(pretreatment)는 전립선 암종의 동시 진단으로 인해 연속적인 TUR, 화학 요법, 또는 항-안드로겐 요법이었다.
실시예 3: Im02 및 종래 벡터 Im01의 4-1BBL, IL-2, 및 scIL-12의 전이유전자 발현 및 IFN-γ 반응
4-1BBL, IL-2, 및 IL-12의 전이유전자 발현 및 Im02(실시예 2 참조) 및 종래 벡터 Im01 (실시예 1 참조)의 IFN-γ 반응을 비교하였다.
인간 A549 세포를 도 3에 나타낸(괄호 안의 MOI 수) MOI (감염 다중도, 즉, 표적 세포 당 감염성 바이러스 입자)로 Im01 또는 Im02로 1 시간 동안 형질도입시켰다. 인간 말초혈액단핵세포 (PBMCs)를 형질도입 4 시간 후에 첨가하고, 34 시간의 공동-배양 후 사이토카인 분석을 위해 상층액을 채취하였다. 사이토 카인 수준은 ELISA로 검출하였다. 종양 세포를 분리하고 4-1BBL 양성 세포를 유세포 분석기로 검출 하였다. 표시된 데이터의 점수는 4 명의 개별 기증자의 각 4번의 반복실험 평균이다.
도 3에 나타난 바와 같이, Im02에서 4-1BBL, IL-2, 및 scIL-12에 대한 유전자의 배열은 IL-12의 감소와 동시에 Im01에서 동일한 유전자의 배열과 비교하여 4-1BBL의 증가된 발현을 제공하며, 이는 IFN-γ 반응의 증가를 유도한다.
구체적으로, Im02에서 4-1BBL, IL-2, 및 scIL-12에 대한 유전자의 배열은 종래 벡터 Im01에서의 유전자 배열과 비교하여 4-1BBL 발현의 평균에서 1.7 배 증가를 유도하고, IL-2 발현의 평균에서 1.5 배 증가를 유도한다. 이것은 IL-12 발현 수준의 2.6 배 감소와 함께 나타난다. Im02에서 유전자의 배열로, IL-2/IL-12의 몰 비율은 평균 2.5 %에서 9.1 %로 증가하였다.　또한, IL-2 및 4-1BBL의 더 높은 발현이 MOI 2.5, 5, 10, 및 50의 모든 용량 범위에서 1.4 배 더 높게 검출된 IFN-γ 유도로 이어졌다.
Im02는 Im01 보다 우수한 IFN-γ 반응을 제공한다. 그 결과, Im02는 종래 벡터 Im01에 비해 개선된 면역자극 효과를 나타낸다.
실시예 4: 조직-기반 모델에서의 Im02 및 Im01 및 단일 벡터간의 비교
Im02 및 Im01뿐만 아니라(후자의 상세한 내용은 실시예 1 참조), scIL-12, IL-2, 또는 4-1BBL만을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용한 단회 투여를 조사하였다.
종양 미세환경에 대한 Im02의 효과를 연구하기 위해, 분리되지 않은 종양 조직 샘플을 기반으로 한 치료 시뮬레이션 모델이 확립되었다. 경요도 절제술이나 방광 절제술로 얻은 조직 샘플을 사용하였다.
방광 종양 ("T") 및 정상 방광 ("B") 조직은 Im02 또는 Im01의 108 ivp (감염성 바이러스 입자)로 형질도입되었다. 종양 및 방광 조직 샘플의 생존력을 효소 LDH-방출 분석법을 사용하여 배양 배지 상층액에서 관찰하였다. 전이유전자의 발현 및 IFN-γ 반응을 형질도입 후 6 일째 배양 상층액에서 ELISA로 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. scIL-12 및 IL-2 단독의 높은 발현 수준에서도 상기 IFN-γ 반응은 배경에 가깝다. 이 결과는 방광과 종양의 조직 차원에서의 세 유전자의 협력적인 작용을 제시한다. 또한, Im02는 Im01에 비해 IL-2 및 IFN-γ 반응의 증가를 유도한다. 도 4는 종양 미세환경에서의 면역 자극에서 종래 벡터 Im01에 비해 Im02의 개선된 효과를 나타낸다.
실시예 5: 상이한 용량 수준에서 Im02 및 Im01의 비교
전이유전자 발현 및 종양 미세환경에서 IFN-γ 반응을 위한 용량 증가에 대해, Im02 및 Im01 (이들 벡터에 대한 보다 상세한 내용은 실시예 2 및 3 참조)을 비교하였다.
종양 샘플을 개별 환자로부터 얻었고, 방광 종양 ("T") 및 정상 방광 ("B") 조직의 일치된 쌍을 107 및 108 ivp (감염성 바이러스 입자) 용량 수준에 대해 조사하였다. 발현을 ELISA에 의해 6일째에 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 상이한 용량 수준에서, Im02는 IFN-γ 반응을 제공하며 이는 Im01보다 우수하다. 그 결과, 상이한 용량 수준에서 Im02는 종래 벡터 Im01에 비해 종양 미세환경에서의 면역 자극에서 개선된 효과를 나타낸다.
실시예 6: lm02 및 Im01에 대한 유전자 발현 프로파일링
전사체 분석은 lm02에 대한 치료 유전자 발현 프로파일을 보여주기 위해 수행되었다. 구체적으로, lm02 및 Im01에 의한 백혈구 활성화의 포괄적인 프로파일을 얻기 위해, 종양 세포 및 PBMC와의 공동-배양 실험의 종양 세포를 lm02, Im01 및 Ad0 (빈 벡터)로 형질도입시키고, 백혈구의 mRNA 유전자 활성 분석 (일루미나 칩 HT12 전체 게놈 발현 분석)을 수행하였다. 이를 위해 말초 백혈구를 형질도입 후 공동-배양에 첨가하였다. 비-형질도입 종양 세포상의 백혈구를 대조군으로 사용하였다. 4, 24, 32, 48, 72 및 96 시간 후, 백혈구를 채취하고 RNA를 단리하고 정제하였다. 품질검사 후, 상기 RNA는 상보적 DNA (complimentary DNA; cDNA)로 역전사되어, 비드 칩의 프로토콜에 따라 분류되고 비드 칩 HT12에 탑재되고 스캔이 수행되었다 (Life & Brain, department of human genetics at the University of Bonn). 얻어진 데이터는 게놈스튜디오 소프트웨어 (Illumina)로 옮겼다. 그 후, 상기 데이터는 IPA® 소프트웨어 (Ingenuity)를 사용하여 평가하였다. 별도로 조절된 과정을 보여주는 핵심 분석을 수행하였다. 조절된 과정의 개요를 파악하고, 그 중요성과 관련된 분자의 수를 설명하기 위해 IPA® 과정 분석을 수행하였다. 표 1 및 표 2 참조:
표 1: lm02, 24 시간에서 가장 많이 조절되는 5 가지 과정
분자 및 세포 기능
Figure pct00004
생리학적 시스템 발달 및 기능
Figure pct00005
표 2: Im01, 24 시간에서 가장 많이 조절되는 5 가지 과정
분자 및 세포 기능
Figure pct00006
생리학적 시스템 발달 및 기능
Figure pct00007
그 결과, lm02는 생리학적 발달 및 기능의 가장 많이 조절되는 5가지 과정 중 (관련된 분자의 수 및 중요성에 의해) 61 개의 조절된 유전자(표 1, 하단 참조)가 관여되는 "세포-매개 면역반응"을 특징으로 하는 면역 자극을 제공한다. Im01 (표 2, 하단 참조)의 경우, 이 기능 (즉, "세포- 매개 면역반응")은 총 28 개의 분자만 차이나게 조절되기 때문에 생리학적 발달 및 기능에 있어 가장 많이 조절되는 5 가지 과정 중에 나타나지 않는다. 표에 언급된 다른 시스템 (혈액학적 시스템, 면역세포 수송, 조직 형태학, 및 일반 조직 발달과 같은)은 다가 면역치료법으로 인한 광범위한 변화를 제시한다. 전사체 분석으로부터 분명해지는 것은 lm02에 대한 치료 유전자 발현 프로파일이 독특하고 우수하며, 구체적으로 종래 벡터 Im01보다 우수하다는 것이다.
상기 조절된 과정은 IPA® 소프트웨어 (Ingenuity Pathway Analysis, Qiagen)를 사용하여 특별히 조절된 (세포) 기능에 할당되었다. 이는 생물학적 과정의 활성화/불활성화와 관련하여 더 정확한 정보를 허용한다.
그 결과 (데이터 미도시), 가장 많이 유도된 5 가지 기능은 림프구 활성화, 단핵 백혈구의 활성화, 백혈구의 세포 독성, 단핵 백혈구의 분화, 및 T 림프구 (T 세포)의 활성화이다.
실시예 7: 주요 면역세포 유형의 활성화를 위한 유전자 발현 분석
96 시간의 시간 경과에 걸친 주요 면역세포 유형의 활성화는 모든 주요 면역세포 유형의 존재 및 활성화 상태에 대한 유전자 발현 데이터를 분석할 수 있는 CELLMIX 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 도 6의 열 플롯은 인간 방광 RT-4 암종 세포와의 공동-배양에서 4 일 (96 시간)의 시간 경과에 걸친 B 세포 (peripheral blood mononuclear cells; PBMC, 말초혈액단핵세포)를 제외한 모든 주요 혈액 면역세포 아형(subtype)의 활성화를 설명한다. 도 6에 나타난 바와 같이, lm02에 의한 T 헬퍼세포 및 세포독성 T 세포의 활성화는 Im01에 의한 동일한 면역세포의 활성화보다 우수하다.
실시예 8: ex vivo 조직 연구 결과
조직학에 의한 조직 프로파일링
조직의 질(quality) 및 세포 조성의 변화를 포르말린 고정 및 파라핀 삽입 후 또는 조직 냉동 및 고정 후 조직 절편에서 관찰하였다. 전반적인 질은 헤마톡실린-에오신 염색 (hematoxylin-eosin; HE) 후 평가하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, lm02는 Ad0 대조군 벡터 (B), 또는 단일 유전자 벡터 (데이터 미도시)에서 보이지 않는 조직학적 재배열 (C)를 유도하였다. 종양 조직에서 관찰된 Im02 유도 형태학적 변화(도 7, 패널 C)는 대조군 Ad0/AdNull (패널 B) 또는 단일-유전자 벡터 (데이터 미도시)로 처리된 조직에 대한 면역세포 침윤물의 수 및 분포를 포함한다.
또한, 도 8은 lm02가 백혈구 침윤물의 분포 및 빈도에서 분명한 조직학적 재 배열을 유도함을 나타낸다. 도 8의 하부 패널의 화살표는 세포 사멸의 징후가 있는 종양 영역을 나타낸다. 이러한 형태학적 변화는 Im02-유도된 면역반응에 대한 조직학적 증거를 제공한다.
표적 세포 유형의 확인
lm02로 형질도입된 조직에 대한 투과 전자 현미경 검사 (Transmission Electron Microscopy; TEM)를 특히, 아데노바이러스 입자 흡수(uptake)의 표적 세포 유형, 소포 막의 존재 및 형태에 의해 판단되는 흡수 경로, 및 세포 당 입자의 존재량을 확인하기 위하여 수행하였다.
방광 절제술에서 얻은 종양 조직을 해부하여 샘플을 37 ℃에서 1 시간 동안 108 ivp lm02를 함유한 500 μl 배양 배지로 침지시켜 형질도입시켰으며, 2 % 글루타르 알데하이드를 함유하는 얼음처럼 차가운 고정 용액으로 배지를 교체하여 흡수를 중단시켰다.　조직 샘플을 표준 절차에 따라 처리하고 Vironova SA, Stockholm, Sweden이 공급하는 투과 전자 현미경으로 촬영한 이미지를 얻었다.
양성 염색 투과 전자현미경에서, 아데노바이러스 입자는 약 80 nm의 크기 및 입자의 기하학적 구조를 갖는 것으로 확인되었다.　그 결과를 도 9에 나타내었다. 1 시간의 형질도입 후, lm02 아데노바이러스 입자는 초미세 구조 형태학 분석에 의해 확인된 바와 같이 다양한 세포 유형에서 검출 가능하다. 아데노바이러스 입자 주변의 소포 구조의 존재와 형태는 흡수 기전을 나타낸다.
그들의 개별 형태에 따라, 종양 기질과 면역세포의 종양 세포(미도시), 결합 조직 세포 (섬유모세포, 패널 4)를 포함하는 방광 암종 샘플에서 상이한 세포 유형이 표적 세포로 발견되었다. 아데노바이러스 입자는 림프구(패널 3) 및 단핵구(패널 2) 형태의 세포에서 검출되었다. 방광 암종에서 단핵구 형태는 랑게르한스 세포, 대식세포 또는 수지상 세포의 존재를 나타낸다.
중요하게도, 이러한 확인된 모든 표적 면역세포는 사이토카인으로 형질도입시킨 후 작동자 세포(effector cell) 유형으로 활성화 및 분화를 겪는데 반해, 4-1BBL-발현은 역 신호 형질도입(reverse signal transduction)에 의해 항원-제시 세포 및 림프구에서 발현될 때 활성화 과정을 지지하는 것으로 나타나는 것으로 기술되었기 때문에 (Ju et al., 2009, International Immunology, 21(10), 1135-1144), 이러한 발견은 작용-양식(mode-of-action)에 대한 특별한 가치가 있다.
흡수경로 및 존재량: 아데노바이러스 입자는 서로 다른 위치 및 다른 환경의 표적 세포의 세포질에서 발견되었다. 전통적인 흡수는 콕사키 및 아데노바이러스 수용체에 결합한 후 매개된 다음 내포작용성 소포(endocytotic vesicles)로 운반(shuttling)된다.
이 경로는 입자가 소포 형성 과정에서 이미지화되는 패널 6A에서 활성화되는 것으로 제안된다.　패널 6B에서는, 아데노바이러스 입자는 큰 소포 내에 위치하며, 다른 정의되지 않은 구조를 포함하여, 이는 흡수의 음세포 작용 방식(pinocytic way)을 시사한다. 패널 3A에서는, 아데노바이러스 입자는 원형 막 구조로 포획되어 진보된 내포작용성 흡수를 나타낸다.
조직 샘플을 lm02에 1시간 동안만 노출시키는 것은 장래의 소포내 점적 주입(instillation) 프로토콜에 따라 선택되었다. 우리의 조직 모델에서 입자가 여러 세포층의 깊이에 있는 영역에 도달한다. 규칙적으로 세포 당 최대 30 개의 아데노바이러스 입자 그룹이 확인되었다 (패널 5A).
실시예 9: 정상 방광 및 방광 종양 샘플에서의 차등 발현의 비교
정상 방광과 종양 조직은 108 ivp lm02로 형질도입하였다. 배양은 6 일까지 계속 수행하였다. 대조군으로서 Ad0 (빈 아데노바이러스 벡터)로 처리한 샘플과 비교하여 차등 발현을 측정하였다. 도 10은 9 개의 방광과 10 개의 종양 조직 샘플 풀(pool)에 대한 결과를 나타낸다. 전체 자극(즉, 면역반응 과정의 유도)은 정상 방광 조직에서보다 종양 조직에서 더 높다 (도 10 참조).　이 효과는 정상 및 종양 조직 간의 미세 환경에서의 차이, 예를 들어 면역세포 침윤 수의 차이 또는 종양 세포 부근의 억제 수준의 차이를 가리킨다.
실시예 10: 아데노바이러스 흡수를 위한 형질주입체의 검사
손상되지 않은 방광 조직으로의 아데노바이러스의 흡수는 형질주입체-유사 다가양이온성 화합물의 첨가에 의해 향상될 수 있다. lm02의 ex vivo 조직 샘플 관류를 위해, 프로타민 황산염(10 μg/ml)은 세포주 세트에서의 후보 화합물 스크린에서 콕사키-아데노바이러스-수용체 (Coxsackie-Adenovirus-receptor; CAR) 발현과 무관하게 아데노바이러스 생성물의 흡수를 가능하게 하는 것으로 확인하였다 (도 11 참조). 인간 방광 암종주(carcinoma line) RT-4는 CAR을 발현하는 반면, 마우스 대장 암종주 CT-26은 CAR을 발현하지 않는다고 한다. 아데노바이러스 생성물을 도 11의 범례에 나타낸 바와 같이 완충액 중에 제제화하였다.　인간 방광암세포주 RT-4와 CAR-음성 마우스의 대장암세포주 CT-26은 Ad-GFP (GFP를 보유하는 아데노바이러스 벡터)로 표적 세포 당 상이한 다중도 (MOI: 감염 다중도)로 형질도입되었다. 결과는 유세포 분석법으로 측정된 형질도입 48 시간 후 GFP-양성 세포의 백분율로 표시하였다. 그 결과, 두 세포주 모두에서 10 μg/ml의 프로타민 황산염이 가장 높은 형질도입 효율을 가능하게 하였다.
약어: 머크(Merck) 완충액: 5 mM Tris pH 8.0, 75 mM NaCl, 5 % 수크로오스, 0.005 % 폴리소르베이트(Polysorbate) 80, 1 mM MgCl2; 모든 추가적인 첨가는 머크 완충액에서 제제화된다; 키토산: 1 %, 마니톨(mannitol): 1M; 프로타민: 10 μg/ml 프로타민 황산염, 플루로닉(pluronic) F68: 0.001 %; 혼합: 수크로오스, 마니톨, 및 플루로닉 F68의 혼합. 머크-완충액은 형질주입체 첨가제를 지원하지 않는 기본 제재를 나타낸다.　CAR의 존재는 낮은 감염 다중도(MOI, 표적 세포 당 감염성 바이러스 입자)에서 충분한 형질도입으로 나타난다. CAR이 없는 경우, 인테그린(integrin)-매개된 흡수를 통한 낮은 친화도 흡수만으로 흡수가 이루어진다. 첨가제가 없는 효과는 CT-26 (MOI 5000에서 <5 % 형질도입) 대비 RT-4 (MOI 100에서 약 25 % 형질도입)로 설명된다. 10 μg/ ml의 프로타민 황산염을 첨가하면 RT-4에서는 형질도입이 2배로 증가하고 CT-26에서는 3배 증가한다.
프로타민 황산염의 협력적인 증강 효과는 또한 ex vivo 조직 배양에서 발견되었다 (도 12 참조). 종양 및 방광 조직을 10 μg/ml 프로타민 황산염을 첨가하거나 첨가하지 않은 108 ivp Im02 또는 Ad0 (빈 아데노바이러스 벡터)로 형질도입시켰다. 전이유전자 발현 및 반응 사이토카인으로서의 IFN-γ 발현은 배양 상층액에서 형질도입 후 6 일째에 ELISA로 측정하였다. 10 μg/ml 프로타민 황산염의 존재 하에서, 반응 사이토카인 IFN-γ의 발현은 심지어 낮은 전이유전자 발현에서 더 높으며, 이는 프로타민 황산염의 존재하에 Im02가 보다 많은 면역세포를 자극한다는 것을 시사한다.
세포주 패널의 결과 및 표적 세포 상태의 평가에 기초하여, 이 제제를 ex vivo 치료 시뮬레이션 연구에 적용하였다.
실시예 11: Im02의 4-1BBL, IL-2, 및 scIL-12의 전이유전자 발현 및 상이한 MOI에서의 단일-유전자 발현 벡터의 전이유전자 발현, 및 IFN-γ 반응
Im02의 4-1BBL, IL-2, 및 scIL-12의 전이유전자 발현 및 IFN-γ 반응, 및 단일-유전자 발현 벡터의 조합은 IFN-γ 발현이 4-1BBL 수준의 증가에 의존함을 나타낸다.
인간 A549-세포를 Im02 또는 scIL-12, IL-2 및 4-1BBL을 각각 발현하는 단일-유전자 아데노바이러스 벡터의 조합으로 괄호 안의 숫자로 나타낸 감염 다중도(MOI, 즉, 표적 세포 당 감염성 바이러스 입자)에서 1시간 동안 형질도입시켰다 (도 19 참조). 인간 말초혈액단핵세포(PBMCs)를 형질도입 4 시간 후에 첨가하고, 34 시간의 공동-배양 후 사이토카인 분석을 위해 상층액을 채취하였다. 사이토카인 수준은 ELISA로 검출하였다. 종양 세포를 분리하고 4-1BBL 양성 세포를 유세포 분석기로 검출하였다. 표시된 데이터 의 점수는 4 명의 개별 기증자의 각 4번의 반복실험 평균이다.
도 19에 나타난 바와 같이, MOI[5]에서 IL-12, IL-2, 및 4-1BBL만을 발현하는 단일-유전자 벡터는 최대 4.2 ng/ml IFN-γ의 기초 수준을 유도한다. IL-12와 IL-2의 조합은 이 수준을 크게 증가시키지 않는다. 모두 MOI [5]에서의 IL-12와 IL-2의 일정한 수준의 조합은, 최대 MOI [100]까지의 4-1BBL 수준의 증가시 중간 수준의 IL-12에서 IFN-γ 유도를 증가시킨다.
IL-12 발현은 실시예 3에서 기술된 벡터 Im01에 의해 발현된 바와 같이 무제한으로 증가되어서는 안된다는 점에 유의해야 한다 (도 3 참조). 높은 IL-12 발현은 면역 활성화의 하향 조절을 유도하고 독성을 일으키는 것으로 여겨진다. 이러한 높은 IFN-γ 및 중간 정도의 IL-12 발현의 조건은 본 개시의 벡터, 특히 벡터 Im02에 나타낸 4-1BBL, IL-2, 및 IL-12의 배열에 의해 충족된다.
SEQUENCE LISTING <110> Provecs Medical GmbH <120> NOVEL IMMUNOSTIMULATING VECTOR SYSTEM <130> PCT102466FZRPpau <140> not yet assigned <141> 2016-02-25 <150> EP16157423.1 <151> 2016-02-25 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 765 <212> DNA <213> Human <400> 1 atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60 gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120 ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180 tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240 cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300 ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360 acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420 tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480 gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540 ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600 ggccgcttgc tgcacctgag 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Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser 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aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420 acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480 ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540 agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600 gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660 gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720 ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780 acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840 agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900 cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960 gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987 <210> 8 <211> 328 <212> PRT <213> Human <400> 8 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys 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540 atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600 atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660 gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720 gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762 <210> 10 <211> 253 <212> PRT <213> Human <400> 10 Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala 1 5 10 15 Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg 20 25 30 Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val 35 40 45 Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro 50 55 60 Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg 65 70 75 80 Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr 85 90 95 Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys 100 105 110 Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu 115 120 125 Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys 130 135 140 Leu Ala Ser Arg 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atctgaataa ttttgtgtta ctcatagcgc gtaatatttg tctagggaga 360 tcttctagac ccgggagcgg ccggccgctg tcgaccgtaa ctataacggt cctaaggtag 420 cgaaccacgt caggtcgagt gttcatgaat ggaagatatc tgcgccctag cgccggcgag 480 ctctagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 540 taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 600 ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 660 gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 720 ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 780 ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 840 atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 900 agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 960 ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 1020 gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagac ggaccgacca 1080 tggaatacgc ctctgacgct tcactggacc ccgaagcccc gtggcctccc gcgccccgcg 1140 ctcgcgcctg ccgcgtactg 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tgtcaaagca tcatctcaac actgacttga acgcgtgcta 2880 gcaggcccgg ccggccttgt taaagacagg atgaagctta aaacagctct ggggttgtac 2940 ccaccccaga ggcccacgtg gcggctagta ctccggtatt gcggtaccct tgtacgcctg 3000 ttttatactc ccttcccgta acttagacgc acaaaaccaa gttcaataga agggggtaca 3060 aaccagtacc accacgaaca agcacttctg tttccccggt gatgtcgtat agactgcttg 3120 cgtggttgaa agcgacggat ccgttatccg cttatgtact tcgagaagcc cagtaccacc 3180 tcggaatctt cgatgcgttg cgctcagcac tcaaccccag agtgtagctt aggctgatga 3240 gtctggacat ccctcaccgg tgacggtggt ccaggctgcg ttggcggcct acctatggct 3300 aacgccatgg gacgctagtt gtgaacaagg tgtgaagagc ctattgagct acataagaat 3360 cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcccaa cctcggagca ggtggtcaca aaccagtgat 3420 tggcctgtcg taacgcgcaa gtccgtggcg gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc 3480 ttttatttta ttgtggctgc ttatggtgac aatcacagat tgttatcata aagcgaattg 3540 gattgcgtac gcggaccgaa ctagtttcgc cgcctccaac atgtgtcacc agcagttggt 3600 catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc gtggccatat gggaactgaa 3660 gaaagatgtt tatgtcgtag 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actatagctc atcttggagc gaatgggcat ctgtgccctg 4560 cagtggtggc ggtggaagcg gcggtggcgg aagcggcggt ggcggcagca gaaacctccc 4620 cgtggccact ccagacccag gaatgttccc atgccttcac cactcccaaa acctgctgag 4680 ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag acaaactcta gaattttacc cttgcacttc 4740 tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc agcacagtgg aggcctgttt 4800 accattggaa ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc agagagacct ctttcataac 4860 taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg atggccctgt gccttagtag 4920 tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag accatgaatg caaagcttct 4980 gatggatcct aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg ctggcagtta ttgatgagct 5040 gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa aaatcctccc ttgaagaacc 5100 ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt catgctttca gaattcgggc 5160 agtgactatt gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc taaaaaccgg cccggccggc 5220 cccgcggccg ctcgagccta agcttctaga taagatatcc gatccaccgg atctagataa 5280 ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca 5340 cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt 5400 gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 5460 ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta gcgccggcgg 5520 gtcgacagcc tagtggtacc cacgaggtgg caggagctgc atcgatgtcg cttcctcgct 5580 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 5640 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 5700 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 5760 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 5820 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 5880 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 5940 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6000 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6060 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6120 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6180 tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 6240 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 6300 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 6360 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 6420 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 6480 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 6540 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc acagagtggc agagactgca 6600 ttcgaaaacg tttgaattga taattattat catttgcggg tcaattctta gaaaaactca 6660 tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga 6720 aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gattgcaaga 6780 tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc 6840 tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag 6900 aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg 6960 tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga 7020 cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc 7080 aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc 7140 tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg 7200 ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc 7260 tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca 7320 tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc 7380 catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac 7440 gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc cttgtattac tgtttatgta agcagacagt 7500 tttattgttc atgcgaaaac gtttgaattg ataattatta tcatttgcgg gtcctttccg 7560 gcgatccgcc ttgttacggg gcggcgacct cgcgggtttt cgctatttat gaaaattttc 7620 cggtttaagg cgtttccgtt cttcttcgtc ataacttaat gtttttattt aaaataccct 7680 ctgaaaagaa aggaaacgac agctgaaagc gagctttttg gcctctgtcg tttcctttct 7740 ctgtttttgt ccgtggaatg aacaatggaa gtcggcctcg tgatacgcct atttttatag 7800 gttaatgtca tgataataat ggtttcttag cgatatttaa attaa 7845 <210> 12 <211> 5545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the expression cassette comprising CMV, human 4-1BBL, EMCV IRES, human IL-2, PV IRES, human scIL-12, and SV40polyA as contained in hu pE1.1 <400> 12 taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60 agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120 tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180 ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240 tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300 ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggagat 360 cttctagacc cgggagcggc cggccgctgt cgaccgtaac tataacggtc ctaaggtagc 420 gaaccacgtc aggtcgagtg ttcatgaatg gaagatatct gcgccctagc gccggcgagc 480 tctagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 540 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 600 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 660 agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 720 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 780 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 840 tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 900 gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 960 caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 1020 aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accgtcagat ccgctagacg gaccgaccat 1080 ggaatacgcc tctgacgctt cactggaccc cgaagccccg tggcctcccg cgccccgcgc 1140 tcgcgcctgc cgcgtactgc cttgggccct ggtcgcgggg ctgctgctgc tgctgctgct 1200 cgctgccgcc tgcgccgtct tcctcgcctg cccctgggcc gtgtccgggg ctcgcgcctc 1260 gcccggctcc gcggccagcc cgagactccg cgagggtccc gagctttcgc ccgacgatcc 1320 cgccggcctc ttggacctgc ggcagggcat gtttgcgcag ctggtggccc aaaatgttct 1380 gctgatcgat gggcccctga gctggtacag tgacccaggc ctggcaggcg tgtccctgac 1440 ggggggcctg agctacaaag aggacacgaa ggagctggtg gtggccaagg ctggagtcta 1500 ctatgtcttc tttcaactag agctgcggcg cgtggtggcc ggcgagggct caggctccgt 1560 ttcacttgcg ctgcacctgc agccactgcg ctctgctgct ggggccgccg ccctggcttt 1620 gaccgtggac ctgccacccg cctcctccga ggctcggaac tcggccttcg gtttccaggg 1680 ccgcttgctg cacctgagtg ccggccagcg cctgggcgtc catcttcaca ctgaggccag 1740 ggcacgccat gcctggcagc ttacccaggg cgccacagtc ttgggactct tccgggtgac 1800 ccccgaaatc ccagccggac tcccttcacc gaggtcggaa taagaacgct agctcttgtg 1860 actggcgcgc ctgatcaatc gatgtttaaa cgttattttc caccatattg ccgtcttttg 1920 gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 1980 cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 2040 aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 2100 ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 2160 cacaacccca gtgcgacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 2220 caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 2280 atctggggcc tcggtgcaca tgctttacgt gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 2340 gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgattctcg agactagtcg 2400 tacgaccatg tacaggatgc aactcctgtc ttgcattgca ctaagtcttg cacttgtcac 2460 aaacagtgca cctacttcaa gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatttact 2520 gctggattta cagatgattt tgaatggaat taataattac aagaatccca aactcaccag 2580 gatgctcaca tttaagtttt acatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg 2640 tctagaagaa gaactcaaac ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa gcaaaaactt 2700 tcacttaaga cccagggact taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg aactaaaggg 2760 atctgaaaca acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct 2820 gaacagatgg attacctttt gtcaaagcat catctcaaca ctgacttgaa cgcgtgctag 2880 caggcccggc cggccttgtt aaagacagga tgaagcttaa aacagctctg gggttgtacc 2940 caccccagag gcccacgtgg cggctagtac tccggtattg cggtaccctt gtacgcctgt 3000 tttatactcc cttcccgtaa cttagacgca caaaaccaag ttcaatagaa gggggtacaa 3060 accagtacca ccacgaacaa gcacttctgt ttccccggtg atgtcgtata gactgcttgc 3120 gtggttgaaa gcgacggatc cgttatccgc ttatgtactt cgagaagccc agtaccacct 3180 cggaatcttc gatgcgttgc gctcagcact caaccccaga gtgtagctta ggctgatgag 3240 tctggacatc cctcaccggt gacggtggtc caggctgcgt tggcggccta cctatggcta 3300 acgccatggg acgctagttg tgaacaaggt gtgaagagcc tattgagcta cataagaatc 3360 ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac ctcggagcag gtggtcacaa accagtgatt 3420 ggcctgtcgt aacgcgcaag tccgtggcgg aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttcct 3480 tttattttat tgtggctgct tatggtgaca atcacagatt gttatcataa agcgaattgg 3540 attgcgtacg cggaccgaac tagtttcgcc gcctccaaca tgtgtcacca gcagttggtc 3600 atctcttggt tttccctggt ttttctggca tctcccctcg tggccatatg ggaactgaag 3660 aaagatgttt atgtcgtaga attggattgg tatccggatg cccctggaga aatggtggtc 3720 ctcacctgtg acacccctga agaagatggt atcacctgga ccttggacca gagcagtgag 3780 gtcttaggct ctggcaaaac cctgaccatc caagtcaaag agtttggaga tgctggccag 3840 tacacctgtc acaaaggagg cgaggttcta agccattcgc tcctgctgct tcacaaaaag 3900 gaagatggaa tttggtccac tgatatttta aaggaccaga aagaacccaa aaataagacc 3960 tttctaagat gcgaggccaa gaattattct ggacgtttca cctgctggtg gctgacgaca 4020 atcagtactg atttgacatt cagtgtcaaa agcagcagag gctcttctga cccccaaggg 4080 gtgacgtgcg gagctgctac actctctgca gagagagtca gaggggacaa caaggagtat 4140 gagtactcag tggagtgcca ggaggacagt gcctgcccag ctgctgagga gagtctgccc 4200 attgaggtca tggtggatgc cgttcacaag ctcaagtatg aaaactacac cagcagcttc 4260 ttcatcaggg acatcatcaa acctgaccca cccaagaact tgcagctgaa gccattaaag 4320 aattctcggc aggtggaggt cagctgggag taccctgaca cctggagtac tccacattcc 4380 tacttctccc tgacattctg cgttcaggtc cagggcaaga gcaagagaga aaagaaagat 4440 agagtcttca cggacaagac ctcagccacg gtcatctgcc gcaaaaatgc cagcattagc 4500 gtgcgggccc aggaccgcta ctatagctca tcttggagcg aatgggcatc tgtgccctgc 4560 agtggtggcg gtggaagcgg cggtggcgga agcggcggtg gcggcagcag aaacctcccc 4620 gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 4680 gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 4740 gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 4800 ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 4860 aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 4920 atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 4980 atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 5040 atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 5100 gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 5160 gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aaaaaccggc ccggccggcc 5220 ccgcggccgc tcgagcctaa gcttctagat aagatatccg atccaccgga tctagataac 5280 tgatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac 5340 acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg 5400 cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 5460 tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttag cgccggcggg 5520 tcgacagcct agtggtaccc acgag 5545

Claims (18)

  1. 4-1BB 리간드 (4-1BB ligand; 4-1BBL), 단쇄 IL-12 (single chain IL-12; scIL-12), 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 하나 이상의 조절 핵산 서열, 바람직하게는 프로모터 서열을 추가로 포함하는 벡터로서, 상기 scIL-12 및 IL-2의 발현 수준에 비해 4-1BBL의 발현 수준의 증가를 제공하는 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 4-1BBL의 발현 수준은 벡터 Im01(도 20)의 발현 구조물에 의해 수득되는 4-1BBL 발현 수준에 비해 증가된 것인 벡터.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 벡터 Im01(도 20)의 발현 구조물에 의해 수득되는 scIL-12 및/또는 IL-2의 발현 수준에 비해 상기 scIL-12의 발현 수준은 감소하고 및/또는 상기 IL-2의 발현 수준은 증가한 것인 벡터.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BBL, scIL-12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 순차적으로 1, 2, 3의 순서로 5'에서 3' 방향으로 배열되고, 상기 scIL-12를 코딩하는 서열은 1번 위치에 존재하지 않는 것인 벡터.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated virus vector), 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector), 단순 헤르페스 바이러스 벡터(herpes simplex virus vector), 팍스 바이러스 벡터(pox virus vector), RNA 벡터, 플라스미드 벡터, 나노 입자 벡터, 및 네이키드 DNA(naked DNA) 중 어느 하나인 것인 벡터.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA, 상기 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA, 및/또는 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 인간 cDNA인 것인 벡터.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 나타내며, 그중 변이체 핵산 서열은 활성화된 T 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 4-1BBL 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
  8. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3의 핵산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 나타내며, 그중 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성을 갖는 IL-2 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
  9. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 5의 핵산 서열과 70 % 이상의 서열 동일성을 나타내며, 그중 변이체 핵산 서열은 면역 자극 활성을 갖는 scIL-12 단백질을 코딩하는 것인 벡터.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scIL-12 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들은 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 하류(downstream)에 위치하는 것인 벡터.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열은 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치하고, 상기 scIL-12를 코딩하는 핵산 서열은 상기 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 하류에 위치하는 것인 벡터.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 프로모터는 상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산 서열의 상류(upstream)에 위치하나, 상기 scIL-12 및/또는 IL-2를 코딩하는 핵산 서열의 상류에는 위치하지 않는 것인 벡터.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-1BBL, scIL-12, 및 IL-2를 코딩하는 핵산 서열들은 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosomal entry sites; IRES)에 의해 연결되어 있는 것인 벡터.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 벡터로 형질도입(transduced) 또는 형질주입된(transfected) 암세포 또는 면역세포.
  15. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 벡터 또는 청구항 14의 암세포 또는 면역세포를 포함하는 의약.
  16. 암, 바이러스 감염 및/또는 면역계 질환을 치료하는 방법에서의 사용을 위한 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 벡터, 청구항 14의 암세포 또는 면역세포, 또는 청구항 15의 의약.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 대장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원발성 뇌 암종(primary brain carcinoma), 두경부암(head-neck cancer), 신경교종(glioma), 교모세포종(glioblastoma), 간암, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 두경부 암종(head or neck carcinoma), 유방 암종, 난소 암종, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 자궁경부 암종, 고환 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 대장 암종, 전립선 암종, 비뇨 생식기 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발성 골수종(multiple myeloma), 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 췌장 인슐린종(malignant pancreatic insulinoma), 악성 카르시노이드 암종(malignant carcinoid carcinoma), 융모막 암종(choriocarcinoma), 균상식육종(mycosis fungoides), 악성 고칼슘 혈증(malignant hypercalcemia), 자궁경부 과형성(cervical hyperplasia), 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 신경모세포종(neuroblastoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 진성 다혈구증(polycythemia vera), 특발성 혈소판 증가증(essential thrombocytosis), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 연부조직 육종(soft-tissue sarcoma), 중피종(mesothelioma), 골육종(osteogenic sarcoma), 원발성 마크로 글로불린혈증(primary macro globulinemia), 및 망막모세포종(retinoblastoma) 중 어느 하나인 것인, 사용을 위한 벡터, 또는 사용을 위한 암세포 또는 면역세포, 또는 사용을 위한 의약.
  18. 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에서의 사용을 위한 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 벡터, 또는 청구항 14의 암세포 또는 면역세포, 또는 청구항 15의 의약.
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