KR20180122436A - 세포 분비 분석을 위한 장치 및 방법 - Google Patents

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Abstract

세포외 효과를 나타내는 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인하기 위한 방법 및 장치가 제공된다. 상기 방법은 각각 선택적으로 1 이상의 효과 세포를 포함하는, 복수의 개방 챔버 내 복수의 세포 군집을 보유하는 단계를 포함한다. 개방 챔버는 각각 판독 입자 군집을 포함할 수 있으며, 개방 챔버는 제1 성분 및 선택적으로 제2 성분을 포함하는 장치의 제1 성분 내 존재한다. 개방 챔버는 0.6 이상의 평균 종횡비를 가지며 제1 성분은 제2 성분과 가역적인 밀봉을 형성한다. 상기 방법은 복수의 세포 군집 또는 그의 서브세트, 및 1 이상의 판독 입자, 또는 그의 서브세트를 챔버 내 인큐베이팅 하는 단계, 세포 군집을 세포외 효과에 대해 분석하는 단계로 판독 입자(들)는 세포외 효과의 직접 또는 간접적 판독을 제공하는 단계, 및 상기 분석하는 단계의 결과에 기초하여, 복수 중 1 이상의 세포 군집 내 1 이상의 세포가 세포외 효과를 보이는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

Description

세포 분비 분석을 위한 장치 및 방법
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2018년 3월 17일에 출원된 미국 가출원 제 62/309,663 호의 우선권을 주장하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 참고로 인용된다.
세포는 생명의 기본 단위이며 어떤 두 세포도 동일하지 않다. 실제로, 세포의 겉으로 보기에 동일한 클론 군집은 개체군 내 세포 간에 표현형 차이를 나타내는 것으로 보인다. 세균 세포에서 부분적으로 분화된 세포 (예를 들어, 성체 줄기 및 전구 세포), 고도로 분화된 포유류 세포 (예를 들어, 항체 분비 세포 (ASC)와 같은 면역 세포)에 이르기까지, 모든 생명 수준에 걸쳐 세포 차이가 존재한다. 세포 상태, 기능 및 반응의 차이는, 다른 세포 간에 상이한 이력, 상이한 분화 상태, 후성적 변이, 세포 주기 효과, 확률적 변이, 게놈 서열의 차이, 유전자 발현, 단백질 발현 및 상이한 세포 상호작용 효과를 포함한 다양한 기작으로부터 발생할 수 있다. 따라서, 단일 세포의 특성을 분석하기 위한 민감한 도구의 개발에 관심이 많다.
많은 세포 유형이 생물학적 기능을 갖는 단백질을 분비한다. 예를 들어, 상이한 면역 세포는 세포 신호전달을 통해 작용하는 성장 인자, 면역 활성 또는 억제를 촉진하는 사이토카인, 및 바이러스, 세균, 세포, 단백질, 글리칸, 또는 기타 외래 위협을 포함하는 병원체를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 다양한 인자를 분비한다. 항체는 항암 반응 또는 자가면역 상태의 일부로서 비-외래 항원 (자기-항원 또는 자가항원)을 또한 인식할 수 있다. 이와 같이, 세포에 의해 분비되는 단백질의 양 및/또는 세포에 의해 분비되는 단백질의 특징 (예: 서열, 결합 파트너)을 측정하는 능력에 대한 관심이 많다. 이러한 측정은 개별 세포에서 이상적으로 수행되어 동일한 환경 또는 군집 내 다른 세포와 비교하여, 임의의 정해진 세포에 의해 분비되는 단백질의 특성 상의 차이를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 소수의 ASC에 의해 분비되는 항체의 분석은, 대량 군집에 대해 동일한 분석이 수행될 때 이용할 수 없는 개별 세포와 관련된 정보를 제공할 수 있다 (예: 항체 결합 특성, 기능적 역할).
유악류 (jawed vertebrate)의 적응 면역계는 매우 다양한 상이한 항체를 생성할 수 있다. 이러한 다양성은 궁극적으로 고유의 항체로 발현되는 중쇄 및 경쇄 유전자에서 유전적으로 코딩되는 다양성을 만드는 가변 영역 유전자의 결합적 재조합을 포함하여 다양한 기작을 통해 생성된다. 인간에서, 이러한 유전자 재조합은 B-세포 발달 중에 일어나며 개체 내 수십억 개의 상이한 항체를 제조할 수 있다. 위협에 이어, 위협을 인식하는 항체를 발현하는 B-세포는 활성화되어 클론 관련된 B-세포를 생성하도록 확장된다. 상기 확장 동안, 체세포 초돌연변이 및 선택은 군집 내 일부 항체의 개선된 친화력을 초래한다. 상기 과정의 결과는 많은 상이한 항체를 발현하는 다양한 세트의 B-세포이다. 이들 B-세포는 배지 내 항체를 계속 분비하는 형질 세포로 성숙되거나 막-결합된 항체를 발현하는 기억 B-세포로 성숙된다. 개선된 특성, 예를 들어 친화력, 기능적 활성을 갖는 군집 내 항체를 확인하기 위하여, 개별 항체 및 이어 ASC는 개별 세포로 연구되어야 한다.
연구, 진단, 및 치료제 개발에 사용되는 항체의 생성을 위하여, 특정 표적에 결합하는 항체, 및/또는 특정 기능적 역할을 효과적으로 확인하기 위한 능력에 관심이 높다. 최적의 치료 특성을 갖는 항체, 특히, 표면 수용체를 표적하는 항체의 개발은 약물 개발에서 심각한 병목으로 남아있다. 면역화에 반응하여, 동물은 수백만의 상이한 단일클론 항체 (mAb)를 만들 수 있다. 각 mAb는 항체-분비 세포 (ASC)로 불리는 단일 세포에 의해 생성되며, 각 ASC는 단 한 종류의 mAb만을 만든다. 이에 따라, 예를 들어 약물 개발 목적의 항체 분석은 그 자체로 단일 세포 분석에 제공된다. 그러나, ASC가 대량의 세포 군집 내에서가 아닌 개별적으로 분석된다고 하더라도, 단일 ASC는 아주 소량의 항체만을 생산하기 때문에, 종래 분석 형식의 부피로 분석하면, 항체가 너무 희석되어 완전히 검출할 수 없게 된다.
단일 세포 분석 방법은 새로운 항체 확인의 속도, 처리량, 및 효율을 증가시키는 접근법을 제공한다. 단일 세포 항체 특성화 방법의 공통된 주제는 분석 감도를 높이기 위한 소량의 제한 (confinement)을 사용하는 것이다. 관심있는 세포가 확인되면, 이들은 그 항체 유전자의 서열분석 및/또는 이후 실험에서 사용될 수 있는 대량의 항체 발현을 포함한 이후의 분석을 위해 회수된다. 단일 세포로부터의 항체 스크리닝 및 선별을 위한 소형화된 형식의 예는 플레이트-기반 방법 (Czerkinsky et al. (1983). Journal of Immunological Methods 65(1-2), pp. 109-121; Leslie et al. (1996). Faseb Journal 10(6), pp. 346-346), 미세유체 장치(microfluidic device)(Koster et al. (2008). Lab on a Chip 8(7), pp. 1110-1115; Mazutis et al. (2013). Nature Protocols 8(5), pp. 870-891; Singhal et al. (2010). Analytical Chemistry 82(20), pp. 8671-8679), 마이크로프린트 (Loveet et al. (2006). Nature Biotechnology 24(6), pp. 703-707), 및 개방 마이크로웰 어레이 (Jin et al. (2011). Nature Protocols 6(5), pp. 668-676; Wrammert et al. (2008). Nature 453(7195), pp. 667-U10)를 포함한다.
단일 ASC 분석을 위한 기술이 존재함에도 불구하고, 이들은 여전히 낮은 처리량, 감도 및 수행될 수 있는 특성화 유형에 의해 어려움을 겪고 있다. 본 발명은 단일 항체 분비 세포의 분석을 수행하기 위한 보다 강력한 장치, 기구 및 분석법 분야에서의 요구를 다룬다.
본 발명은, 일 양태에서, 단일 효과 세포(effector cell)로 인한 세포외 효과의 분석을 위한 플랫폼에 대한 것이다. 효과 세포는, 일 실시양태에서, 생물학적 인자, 예를 들어, 항체 (ASC)를 분비하는 세포이다. 세포외 효과는, 일 실시양태에서, 세포 증식, 감소된 성장, 세포사멸, 용해, 분화, 감염, 결합 (예: 세포 표면 수용체 또는 에피토프에의 결합), 형태 변화, 신호전달 캐스케이드의 유도 또는 저해, 효소 저해, 바이러스 저해, 사이토카인 저해 또는 보체 활성화이다. 플랫폼은, 일 실시양태에서, 개방 미세챔버를 가진 제1 성분, 및 제2 성분을 포함하는 2개-성분 미세유체 장치이다. 장치는 일 실시양태에서, 도 4 내지 도 8 중 하나에 도시된 장치이다.
일 양태에서, 세포외 효과를 보이는 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인하는 방법이 제공된다. 본 양태의 일 실시양태에서, 1 이상의 세포 군집은 제1 성분 및 제2 성분을 갖는 2개-성분 미세유체 장치 또는 개방 미세챔버(open microchamber)를 포함하는 하나의 성분 장치 내에서 분석된다. 방법은 각각 선택적으로 1 이상의 효과 세포를, 미세유체 장치의 제1 성분에 위치한 복수의 상이한 챔버 내에 포함하는 개별 세포 군집을 보유하는 단계를 포함하며, 개별 세포 군집은 개별 챔버 내에 보유된다. 각 챔버는 약 0.6 이상, 예를 들어 0.7 이상, 1 이상, 또는 1 이상 약 10 이하의 종횡비 (최소 측면 치수에 대한 높이로 정의됨)를 갖는다. 또는, 장치의 각 챔버의 평균 종횡비는 약 0.6 이상, 예를 들어 0.7 이상, 1 이상, 또는 1 이상 약 10 이하이다. 1 이상의 복수의 개방 챔버의 내용물은 1 이상의 판독 입자를 포함하는 판독 입자 군집을 추가로 포함한다. 미세유체 장치의 제2 성분은 제1 성분과 접하게 되어 두 성분 간 가역적인 밀봉 또는 가역적인 부분적 밀봉을 형성한다. 제1 성분 및 제2 성분 각각 또는 모두의 접촉면은 채널 구조 또는 챔버 구조와 같은 미세규모 구조를 포함할 수 있어, 이러한 밀봉이 형성되면, 장치의 제1 성분의 1 이상의 개방 챔버가 봉쇄되거나 대체로 봉쇄될 수 있다. 나아가, 2 이상의 개방 챔버는 제2 성분을 제1 성분과 접촉시키면, 예를 들어 채널 구조가 제2 성분 내에 존재하면 상호 연결될 수 있다. 방법은 복수의 세포 군집 또는 그의 서브세트, 및 1 이상의 판독 입자, 또는 그의 서브세트를 1 이상의 복수의 개방 챔버 내에서 인큐베이팅(incubating) 하는 단계, 복수의 세포 군집 또는 그의 서브세트를 세포외 효과의 존재에 대하여 분석하는 단계로, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 세포외 효과에 대한 직접 또는 간접적 판독을 제공하는 단계, 및 상기 분석하는 단계의 결과에 기초하여, 복수 중 1 이상의 세포 군집 내 1 이상의 효과 세포가 세포외 효과를 보이는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 효과 세포는 생물학적 인자, 예를 들어 항체를 분비하는 세포이다. 세포외 효과의 존재가 특정 챔버에서 검출되는 한 특정 효과 세포 또는 세포외 효과를 보이는 효과 세포가 처음에 확인될 필요는 없다. 즉, 효과가 측정되는 챔버 내 일부 또는 모든 세포는, 세포외 효과를 보이는 특정 세포(들)을 확인하기 위한 추가 특성 분석을 위해 원하는 경우 회수될 수 있다.
도 1은 단일 효과 세포 확인 및 선택을 위한 하나의 실시양태에 대한 공정 흐름도이다. 단일 세포는 임의의 동물 또는 배양액 내 세포 군집으로부터 수득되며, 효과 세포 군집에 대해 선택적으로 농축된다. 2개-성분 미세유체 장치를 이용한 고속대량 미세유체 분석은 단일 효과 세포로부터 분비되며, 어떤 경우 이질적 세포 군집 내에 존재하는 항체에 대한 기능적 스크리닝을 수행하기 위해 사용된다. 하나 또는 복수 회의 분석 이후, 세포는 회수되며 항체 가변 영역 유전자는 서열분석 (Vh/Vl) 및/또는 세포주로의 클로닝을 위해 증폭된다. 본 과정은 1주 후 서열이 회수된 단일 장치 작동에서 약 100,000개의 세포 내지 약 100,000,000개의 세포의 스크리닝을 가능하게 한다.
도 2는 미세유체 효과 세포 농축 방법의 일 실시양태에 대한 공정 흐름도이다. 효과 세포는 먼저 챔버 당 25개의 세포의 평균 농도로 로딩되어 항체의 다클론 혼합물을 생산하기 위해 인큐베이팅 된다. 분석된 세포를 배양하는 단계를 이용하여 또는 이용하지 않고 생성되는 다클론 혼합물의 스크리닝은, 세포외 효과 (예: 결합, 친화력, 또는 기능적 활성)를 보이는 챔버를 확인하기 위해 사용된다. 40개의 양성 챔버는 이후 회수되어 관심있는 항체를 제조하는 ~4%의 효과 세포로 농축된 군집을 얻는다. 농축된 군집의 효과 세포를 이후 제2 어레이에서 한계 희석법으로 분석하여 세포외 효과를 나타내는 단일 ASC(들)을 선택하였다. 농축에 요구되는 시간은 약 4시간이며 총 스크리닝 처리량은 작동 (run) 당 약 100,000 내지 100,000,000개의 세포이다. 농축 과정은 필요한 경우 2회 수행될 수 있으며, 각 스크린에 대해 동일하거나 상이한 특성을 이용할 수 있다.
도 3은 인간, 토끼, 마우스 및 랫트를 가로지르는 PDGFRα에 대한 세포외 영역의 정렬이다. (상단) 2개의 PDGFRβ가 PDGFBB 이량체와 복합체를 이루는 세포외 영역 (ECD)의 구조를 보여주는 리본 다이어그램 (출처: Shim et al. (2010). Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A . 107, pp. 11307-11312, 이는 전체가 본 명세서에서 참고로서 포함됨). 유사한 구조의 PDGFRα가 예측되나 이를 얻을 수 없었기 때문에 PDGFRβ를 나타내었음을 유의한다. (하단) 인간, 마우스, 토끼, 랫트를 가로지르는 PDGFRα에 대한 ECD의 정렬이다. 인간 동형으로부터의 변화 영역은 밝은 음영과 “ * ”으로 표시하였다. 상당한 변화는 항체 인식에 이용 가능한 많은 에피토프가 있음을 나타내며, 토끼는 인간으로부터 가장 변화가 컸다.
도 4는 본 명세서에서 제공되는 하나의 장치 실시양태(400)의 단면도이다. 상기 장치는 본 명세서에서 다층 상단을 가지는 스플릿 (split) 장치, 또는 다성분 장치라고 한다. 상단 성분(401)은 푸쉬 다운 밸브 구조(404) 및 개방 채널(405)을 포함한다. 하단 성분(402)은 개방 챔버(403)를 포함한다.
도 5는 장치 실시양태(500 및 500')의 단면도이다.
도 6은 전환 가능한 단층 상단 성분(601)을 포함하는, 2개-성분 장치 실시양태(600)의 단면도이다. 위의 개략도는 장치의 하단 성분 내 챔버로의 유동이 개방적인 장치의 횡단면이다. 아래의 개략도는 상단 성분의 전환을 통해 밀봉된 챔버를 보여준다.
도 7은 본 명세서에서 제공되는 하나의 장치 실시양태(700)의 단면도이다. 상기 장치는 본 명세서에서 패턴화되지 않은 단층 상단을 가지는 스플릿 장치, 또는 다성분 장치라고 한다.
도 8은 본 명세서에서 제공되는 하나의 장치 실시양태의 단면도이다. 상기 장치는 영상화를 위한 부피 압출 (extrusion)을 갖는 개방 챔버 어레이를 포함한다.
도 9는 입자를 챔버 내에 위치시키는 자기장의 사용을 보여주는 본 발명의 실시양태에 따른 미세유체 챔버의 개략도 다이어그램이다.
도 10은 주형-전환을 이용한 단일 세포 HV/LV 접근법의 개략도이다. 단일 세포를 마이크로퓨즈 튜브 내에 넣고 cDNA를 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 표적하는 다중화된 유전자-특이적 프라이머로부터 생성하였다. MMLV 효소의 주형-전환 활성은 결과로 도출된 cDNA의 3’ 말단 상의 주형-전환 올리고의 역상보를 첨부하기 위해 사용되었다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역에 어닐링하는 다중화된 프라이머 및 복사된 주형 전환 올리고에 상보적인 보편적 프라이머를 이용한, 세미-네스티드 PCR은 cDNA를 증폭하고 각 단일 세포 앰플리콘에 특이적인 인덱싱 서열을 도입하기 위해 사용되었다. 앰플리콘은 이후 모아져 서열분석되었다.
도 11은 표적 판독 입자에 특이적으로 결합이 가능한 생체분자를 생산하는 효과 세포를 확인하는 실시양태에 따른 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 12는 악성 세포에는 특이적으로 결합하나 정상 세포에는 특이적으로 결합하지 않는 생체분자 (예: 항체)를 생산하는 적어도 하나의 효과 세포를 확인하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 13은 효과 세포의 부분집단이 또한 판독 세포로 작용하도록 기능화된, 판독 세포에 결합하는 생체분자를 생산하는 효과 세포를 확인하는 방법의 실시양태의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 14는 항체 테트라머의 개략도 다이어그램이다.
도 15는 알려진 생체분자가 결합하는 표적 에피토프/분자에 대한 실시양태에 따른 스크리닝 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 16은 표적 에피토프/항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 효과 세포를 확인하는 실시양태에 따른 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 17은 세포 용해를 정량하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 18은 표적 에피토프/항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 효과 세포의 존재를 확인하는 실시양태에 따른 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 19는 세포 용해를 정량하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 20은 판독 세포의 성장을 유도하는 생체분자를 생산하는 효과 세포를 확인하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 21은 세포사멸을 겪도록 판독 세포를 자극하는 생체분자를 생산하는 효과 세포의 존재를 확인하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 22는 판독에서 자가 포식을 유도하는 생체분자를 생산하는 효과 세포를 확인하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 23은 사이토카인을 중화시키는 생체분자를 생산하는 효과 세포를 확인하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 24는 세포성 바이러스 감염을 저해하는 생체분자를 생산하는 효과 세포를 확인하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 25는 표적 효소의 기능을 저해하는 생체분자를 생산하는 효과 세포의 존재를 확인하는 본 발명의 실시양태에 따른 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 26은 판독 입자에 영향을 미치는 분자를 차례로 분비하는, 제2 유형의 효과 세포를 활성화하는 분자를 보이는 효과 세포를 확인하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 27은 판독 입자에 영향을 미치는 분자를 차례로 분비하는, 제2 유형의 효과 세포를 활성화하는 분자를 분비하는 효과 세포를 확인하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 28은 동일한 항원에 대한 낮은 친화력을 갖는 항체를 분비하는 세포를 포함하는 세포의 이질적 군집 내 존재하는, 높은 친화력의 항체를 분비하는 효과 세포를 검출하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 29는 상이한 에피토프를 나타내는 판독 입자를 상이한 광학 특성에 의해 식별할 수 있는, 본 발명의 실시양태에 따른 항원에 대해 증가된 특이성을 갖는 항체의 스크리닝 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 30은 동시에 (i) 효과 세포의 동질 또는 이질적 군집 내 생체분자를 분비하는 세포를 확인하고 (ii) 분자에 의해 영향을 받는 1 이상의 세포내 화합물을 분석하는 방법의 상단 (우측) 및 횡단면 (좌측)의 다이어그램을 보여준다.
도 31은 본 발명의 일 실시양태에 따른 기구의 개략도이다. 기구는 본 명세서에서 기술되는 하나의 장치 및/또는 방법, 예를 들어 세포외 효과를 갖는 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인하기 위한 장치 및/또는 방법과 함께 사용될 수 있다.
도 32는 1개-성분 채널, MSL을 통해 제조된 다층 미세유체 장치를 통한 로딩 이후의 Tango™ CXCR4-bla U2OS 세포를 보여주는 광학 현미경사진 세트이다. 축척 막대: 100 μm.
도 33은 2개-성분 미세유체 장치의 하단 챔버로의 로딩 12시간 이후의 Tango™ CXCR4-bla U2OS 세포를 보여주는 광학 현미경사진 세트이다. 축척 막대: 34 μm.
도 34의 좌측은 1.0의 종횡비를 가지는 100 μm × 100 μm × 150 μm (깊이 × 너비 × 길이) 규모의 챔버를 통한 유동으로부터 나타난 스트림라인 (streamline)이다. 스트림라인은 챔버의 하단에 침투하여 높은 유량에서 입자의 이동 및/또는 입자의 손실을 유발한다. 도 34의 우측은 깊이 125 μm, 직경 100 μm, 및 종횡비 1.25의 원통형 챔버를 통한 유동의 스트림라인이다. 스트림라인은 챔버의 하단 절반에서 재순환 소용돌이를 보여준다. 챔버는 규모에 맞게 도시되지 않았다.
도 35는 면역화된 동물로부터의 ASC을 로딩한 후의 미세유체 챔버의 광학 현미경 사진이다 (좌측 패널). ASC는 부모 세포주 (음성 대조군, 좌측에서 3번째 패널) 및 CXCR4 발현 세포와 함께 공배양되었다. CXCR4에 특이적인 항체가 검출되었다 (좌측에서 2번째 패널). 발현된 CXCR4와 부모 세포주 모두에 결합하는 CXCR4에 특이적이지 않은 항체가 또한 검출되어 분석에서 제외하였다 (우측 패널). 축척 막대: 34 μm.
도 36은 3개의 상이한 인플루엔자 관련 항원 (H1N1 (10 μm 비드(bead)), H3N2 (5 μm 비드(bead)) 및 B 균주 (3 μm 비드))으로 코팅된 미세비드를 보여주는 광학 현미경 사진이다. 인간 B-세포를 로딩하고 분비된 항체를 축적하기 위해 인큐베이팅한 후, 형광 표지된 이차 항-인간 항체, 및 상이한 색으로 표지되며 각각 상이한 동형, IgG, IgA 및 IgM의 검출에 특이적인 상이한 이차 항체의 혼합물을 이용하여 상이한 비드 타입에 대한 특이적 항체 결합을 검출하였다. 인간 IgG는 H1N1, H3N2 및 B 종 항원에 특이적인 항체를 분비하는 3개의 상이한 세포에서 나타났다.
도 37은 다단계 세포외 효과 분석법을 이용한 항원 특이적 항체의 검출 및 선택의 타당성을 보여준다. 미세유체 챔버의 광학 현미경사진이 제시된다. m4-1BB 및 h4-1BB에 특이적인 항체가 탐색되었다. 표적 특이적 항체의 존재 하에서 천연 수용체에 리간드가 결합하는 것을 억제할 수 있는지 검출하기 위하여 Dylight-650으로 표지된 h4-1BB 리간드를 또한 챔버 내에서 인큐베이팅 하였다.
도 38은 형광 표지된 이차 항체로 항원-특이적 항체를 검출한 후의 챔버 패널을 보여준다. 픽셀 강도의 히스토그램은 ASC를 포함하는 중앙 챔버뿐만 아니라, 인접한 상단, 하단, 우측, 및 대각선 (상단-우측) 챔버에 대해 도시한다. 히스토그램은 양성의 비드 신호로 인한 픽셀을 나타내기 위해 표지되며, 중앙 챔버가 백그라운드 형광보다 많은 픽셀을 가지며 이들 픽셀이 보다 높은 총 강도를 가짐을 보여준다.
도 39는 생균 (클렙시엘라 뉴모니아)과 함께 인큐베이팅된 인간 시료로부터 분리된 ASC를 보여주는 광학 현미경 사진이다. IgG 및 IgA 결합의 실시예는 인간 편도선 및 인간 골수로부터 나타난다.
도 40은 미세유체 장치의 상이한 미세챔버 내 K562 세포의 성장을 나타내는 일련의 타임-랩스 영상을 보여준다. 축척 막대: 100 μm.
도 41은 ASC를 포함하거나 ASC가 없는 모세관-회수된 연속적인 개별 미세유체 챔버로부터 생성된 20개의 PCR 반응을 분리한 아가로오스 겔이다. 10개의 상위 반응 (H)은 항체 중쇄 특이적 프라이머를 이용하여 생성되었고, 10개의 하위 반응 (L)은 항체 경쇄 특이적 프라이머를 이용하여 생성되었다.
본 명세서에서 사용되는, 단수형 (“a”,“an” 및 “the”)은 문맥 상 명시적으로 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 “판독”은 세포외 효과가 보고되는 방법을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 “판독 입자”는 비드 또는 세포, 예를 들어 기능화된 비드 또는 기능성 또는 특성이 보고된 세포를 포함하는 임의의 입자를 의미하며, 효과 세포의 세포외 효과 (예: 기능성 또는 특성)를 결정하기 위한 분석법, 또는 항체와 같은 효과 세포의 산물에서 사용된다. “판독 입자”는 단일 판독 입자로서 또는 단일 분석 챔버 내 동질적 또는 이질적 판독 입자의 군집 내에 존재할 수 있다. “판독 입자 군집”은 1 이상의 판독 입자를 포함한다. 일 실시양태에서, 판독 입자는 효과 세포 (예: 1 이상의 항체)에 의해 분비되거나 용해 시 효과 세포 또는 부속 세포에 의해 방출된 1 이상의 생체분자에 결합하도록 기능화된 비드이다. 단일 판독 입자는 1 이상의 상이한 유형의 생체분자, 예를 들어 단백질 및/또는 핵산을 포착하기 위해 기능화될 수 있다. 1 이상의 단백질은, 일 실시양태에서, 1 이상의 상이한 단일클론 항체이다. 일 실시양태에서, 판독 입자는 항체를 생성 및/또는 분비하는 효과 세포에 의해 생성되는 항체에 결합할 수 있는 비드 또는 세포이다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 군집 내 하나의 효과 세포의 분비 산물이 보다 크거나, 상이한 하위-군집의 효과 세포에 영향을 미치거나, 또는 하나의 효과 세포의 분비 산물이 포획의 판독을 위해 동일한 세포 상에서 포획되는 경우, 효과 세포는 또한 판독 입자일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “판독 세포”는 단일 효과 세포, 또는 1 이상의 효과 세포, 예를 들어 항체를 분비하는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집의 존재 하에서 반응을 보이는 유형의 판독 입자이다. 다양한 실시양태에서, 판독 세포는 표면 항원 또는 수용체 (예: GPCR 또는 RTK 또는 이온 채널)를 드러내는 세포이다. 일 실시양태에서, 분비된 분자가 판독 세포에 결합하는 것은 분석된 세포외 효과이다. 판독 세포는 형광 표지되고/되거나 결합 시 활성화되는 형광 리포터를 보유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “효과 세포”는 세포외 효과를 발휘할 수 있는 세포를 나타낸다. 세포외 효과는 판독 입자에 대한 직접적 또는 간접적 효과이다. 세포외 효과는 효과 세포, 또는 효과 세포에 의해 분비된 분자, 예를 들어 신호전달 분자, 대사산물, 항체, 신경 전달 물질, 호르몬, 효소, 사이토카인에 기인한다. 일 실시양태에서, 효과 세포는 항체와 같은 단백질을 분비하거나 T-세포 수용체와 같은 단백질을 보이는 세포이다. 본 명세서에서 기술되는 실시양태에서, 세포외 효과는 판독 입자 또는 판독 입자 군집 또는 부분집단의 사용을 통해 특징화된다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 세포외 효과는 판독 세포 또는 판독 비드 상에 존재하는, 세포 표면 수용체, 이온 채널 또는 ATP 결합 카세트 (ABC) 수송체에 작용하거나 길항 작용한다. 일 실시양태에서, 효과 세포는 항체 분비 세포 (ASC)이다. 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 분석될 수 있는 효과 세포 종류 또는 세포 군집에 제한되지 않는다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 효과 세포의 종류의 예는 임의의 종 (예: 인간, 마우스, 토끼 등)으로부터의 일차 항체 분비 세포, 일차 기억 세포 (예: 세포 표면 상에 나타나거나 형질 세포로 확장/분화되는 IgG, IgM, IgD 또는 기타 면역글로빈), 그 표면 상에 단백질 또는 펩티드를 드러내는 수지상 세포, 선택 이후의 또는 직접적으로 융합 이후의 하이브리도마 융합, 1 이상의 단일클론 항체 (mAb)의 라이브러리로 형질감염된 (안정된 또는 일시적인) 세포주 (예를 들어, fab 영역 내 변이의 라이브러리를 이용한 확인된 mAb의 친화력 성숙 또는 Fc 영역 내 변이를 갖는 확인된 mAb를 이용한 효과 기능 최적화를 위하여) 또는 인간/동물/라이브러리로부터 얻은 증폭된 HC/LC 가변 영역으로부터의 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 조합으로 형질감염된 세포주 또는 mAb를 발현하는 세포의 조합 (시너지 효과를 위해 특징 지어지거나 특징 지어지지 않는)을 포함한다. 기타 효과 세포는 T-세포 (예: CD8+ T-세포, 및 CD4+ T-세포), 조혈 세포, 인간 및 동물로부터 유래한 세포주, 재조합 세포주, 예를 들어 항체를 생산하기 위해 조작된 재조합 세포주, T-세포 수용체를 발현하기 위해 조작된 재조합 세포주를 포함한다.
“항체 분비 세포” 또는 “ASC”는 항체를 생성하고 분비하는 임의의 세포 유형이다. 형질 세포 (또한 “형질 B-세포,” “플라스마세포” 및 “효과 B-세포”라고도 함)는 말기에 분화되며, ASC의 한 종류이다. 기타 ASC는 형질아세포, 기억 B-세포의 확장을 통해 생성되는 세포, 재조합 단일클론 항체를 발현하는 세포주 및 하이브리도마 세포주를 포함한다. 다른 실시양태에서, 효과 세포는 항체 외의 단백질을 분비하는 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 “세포외 효과”는 이에 제한되는 것은 아니나 증가된 세포 증식, 감소된 성장, 세포사멸, 용해, 분화, 감염, 결합 (예: 세포 표면 수용체 또는 에피토프에의 결합), 형태 변화, 신호전달 캐스케이드의 유도 또는 저해, 효소 저해, 바이러스 저해, 사이토카인 저해, 보체 활성화를 포함하는, 많은 실시양태에서 항체 분비 세포 (ASC)인 효과 세포의 판독 입자에 대한 세포외의 직접 또는 간접적인 효과이다. 세포외 효과는 일 실시양태에서, 효과 세포에 의해 분비되는 관심있는 생체분자의 표적에 대한 결합 특성이다. 다른 실시양태에서, 세포외 효과는 제2 세포의 세포사멸과 같은 반응이다. 측정된 세포외 효과는 일 실시양태에서, 제2 효과 세포를 포함하는 제2 효과 세포 또는 세포 군집에 의해 나타나는 효과와 비교할 때, 또는 대조군 (음성 또는 양성 대조군)과 비교할 때 상이하다 (즉, 변화).
본 명세서에서 언급되는 “이질적 군집”은, 특히 입자 또는 세포 군집과 관련하여, 상이한 특징을 갖는 적어도 2개의 입자 또는 세포를 포함하는 입자 또는 세포 군집을 의미한다. 특징은, 일 실시양태에서, 형태, 크기, 형광 리포터, 세포 종, 표현형, 유전자형, 세포 분화 유형, 1 이상의 발현된 RNA 종의 서열 또는 기능적 특성이다.
본 명세서에서 사용되는 “코팅”은 효과 세포, 항체와 같은 분비 분자, 판독 입자 또는 부속 입자가 표면에 부착하는 능력을 촉진하거나 저해하거나, 세포 성장과 같은 생물학적 과정을 촉진하는, 챔버 또는 채널 표면에 대한 임의의 첨가일 수 있다. 표면 코팅은, 일 실시양태에서, 표면 기능화이다. 코팅은, 일 실시양태에서, 하기로부터 선택된다: 세포; 폴리머 브러쉬, 폴리머 하이드로겔, 자기 조립 단분자막 (SAM), 광-그래프트 분자, 세포 결합 특성을 갖는 단백질 또는 단백질 단편 (예를 들어, 액틴, 피브로넥틴, 인테그린, 단백질 A, 단백질 G 등으로부터의 세포 결합 영역), 폴리-L-리신. 일 실시양태에서, 아르기닌-글리신-아스파르테이트-(세린) (RGD(S)) 펩티드 서열 모티프는 코팅으로 사용된다. 다른 실시양태에서, 폴리-리신은 정전기적 상호작용을 통한 세포 접착을 향상시키는 PDMS를 이용한 폴리머 코팅으로 사용되며; 세포 결합 특성을 갖는 인지질, 세포 결합 특성을 갖는 콜레스테롤, 세포 결합 특성을 갖는 당단백질 또는 세포 결합 특성을 갖는 당지질이 사용된다. 다른 실시양태에서, PDMS 표면은 비오틴이 부착된 생체분자를 이용하여 기능화된다. 소 혈청 알부민 (BSA)이 또한 코팅으로 사용될 수 있다. 그의 소수성 영역 때문에, BSA는 소수성 효과를 통해 챔버 내의 스트렙타아비딘 기반 컨쥬게이트 (단백질, DNA, 폴리머, 형광단)의 추가적인 직접적 커플링을 가능하게 하는 소수성 PDMS 표면 상에 쉽게 흡착한다. 폴리에틸렌 글리콜 기반 폴리머는 또한 그 생물-부착 특성으로 알려져 있으며 세포 부착을 저해하며 PDMS 표면 상에 코팅 (흡착, 공유 융합 (covalent grafting))될 수 있다. 폴리(파라자일릴렌), 예를 들어 파릴렌 C는 또한 화학적 기상 증착법 (CVD)을 이용하여 PDMS 표면 상에 증착되어 세포 부착을 방지할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “분리된”은 특정한 챔버가 미세유체 장치의 다른 챔버의 입자(들) 또는 생체분자(들)과 함께 분석되는 효과 세포 및/또는 판독 입자의 실질적 오염을 허용하지 않는 환경을 나타낸다. 이러한 분리는 예를 들어, 챔버 또는 챔버 세트의 밀봉에 의해, 화합물 챔버의 경우, 챔버 간 유체 커뮤니케이션을 제한하거나 예를 들어 종횡비와 같은 특정 챔버의 조형적 특징에 의해 챔버 간 유체 유동을 제한하여 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 “미세유체 장치”는 1 mm 미만의 최소 크기의 특징을 포함하는 유체의 조작을 위해 사용되는 장치를 나타낸다.
“종횡비”는, 달리 명시되지 않는 한, 최소 측면 치수에 대한 미세유체의 특징, 예를 들어 챔버의 높이/깊이의 비율을 나타낸다.
미세유체 장치가 처리량 및 단일 세포 감도의 문제를 처리하기에 유용하더라도, 많은 경우에 있어, 미세규모 채널을 통한 세포의 장치 내로의 로딩은 어려울 수 있다. 보다 큰 세포 유형, 또는 채널 표면에 자연적으로 부착하는 세포는 장치의 분석 챔버로 전달되기 전에 채널을 막을 수 있으므로, 분석을 지연시키며 장치가 실패하도록 만든다. 세포가 미세채널을 통해 챔버로 로딩될 때, 장치로의 세포의 비효율적인 로딩 또는 장치에 걸친 세포의 균일하지 않은 로딩이 또한 나타날 수 있다. 나아가, 미세채널을 통해 세포를 로딩하는 동안, 장치의 입구에서 포트로 “침강”하는 상당 수의 세포가 있을 수 있으며 이는 이후 분석 챔버로 진입하지 않는다. 이들 문제는 강력한 기기 내 세포 로딩 및 분석을 표준화하고 자동화하려는 경우 특히 심각하다. 이 경우, 작동자는 로딩 파라미터를 실시간으로 조정할 필요가 없다. 나아가, 다양한 상이한 세포-기반 항체 개발 분석법이 요구될 수 있는 부착 세포 유형 또는 기타 더 큰 세포 유형을 이용하여 작업하는 경우 세포 로딩은 문제가 될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 장치 및 기구는 광범위한 세포 유형을 이용한 사용에 적합한 대안적인 분석 형식을 제공함으로써 이러한 세포 로딩 문제를 처리한다.
하나 이상의 세포를 수용하도록 설계된 당업계에 알려진 방법 및 기구는 본 명세서에서 기술된 종류의 분석법에 적합하지 않도록 한다는 한계를 갖는다. 예를 들어, 세포 생존력을 유지하는 것, 관심있는 효과 세포를 선택적으로 회수하는 것, 장치 내 증발을 제한/방해하는 것, 실질적으로 동일한 압력을 유지하는 것, 교차-오염을 제거하는 것은 모두 문제가 될 수 있다. 알려진 장치 구성은 또한 영상화 능력을 제한하며 (예를 들어 입자를 상이한 초점면에 감소된 해상도로 제공함으로써) 본 발명의 처리량이 부족하다 (WO 2012/072822 및 Bocchi et al. (2012), 이들 각각은 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함됨).
본 명세서에서 기술된 양태 및 실시양태에서, 본 발명의 장치 및 분석법은 배지 세척 단계 및/또는 상이한 세포 유형을 이용한 공-배양을 포함한다. 이러한 형식은 다양한 종류의 단일 세포 항체 스크리닝 분석을 수행하는데 사용될 수 있는 여러 유리한 특징을 제공한다. 다단계 스크리닝 전략을 이용하여, 이러한 장치 및 분석법은 장치 작동 당 수십만의 세포를 스크리닝 하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 방법은 다양한 종류의 분석 형식을 지원하는 고해상도 현미경 검사와 호환가능하다. 나아가, 본 명세서에서 기술되는 장치 및 분석 형식은 분석을 위해 항체 분비 세포 (ASC)를 고정하는 수단을 제공하는 한편, 배지 성분의 제어된 교환을 여전히 가능하게 하며, 이로 인해 1 이상의 배지 교환 단계를 이용하는 분석법을 지원한다. 중요하게, 배지 교환 능력은 또한 장기적인 항체 분비 세포 및 기타 세포 유형의 배양을 가능하게 한다. 특히, 본 발명의 장치 및 분석법은 항체와 같은 분비된 생체분자를 농축할 뿐만 아니라 분석에서 높은 공간 밀도를 이루기 위한 수단을 제공한다.
앞서 기술된 세포 로딩 문제를 해결하는 것 외에, 본 명세서에서 제공되는 장치 및 방법은 단일 세포의 세포외 효과, 예를 들어, 단일 ASC에 의해 분비된 항체의 세포외 효과를 평가하는데 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술되는 장치는 확장가능하며, 시약의 소비 감소 및 그렇지 않으면 실용적이지 않거나 매우 비싼 연구를 위한 큰 단일 세포 분석 플랫폼을 제공하는 처리량의 증가를 가능하게 한다.
이론에 구애됨이 없이, 본 명세서에서 제공되는 나노리터 분석 부피에 의해 나타나는 농축 향상 및 빠른 확산 혼합은 정확한 세포 처리 및 조작 (예: 배지 조건의 시공간적 제어)과 함께, 주요 기능이 항체 및 사이토카인 및 케모카인과 같은 상이한 효과 단백질의 분비를 포함하는 면역 세포 (예: B-세포, T-세포, 및 대식세포)와 같은 효과 세포의 단일 세포 분석을 가능하게 한다.
본 명세서에서 기술된 실시양태는 1 이상의 효과 세포를 각각 포함하는 복수의 세포 군집으로부터의 다세포 분석법, 및 뒤이어 이후의 분석을 위한 1 이상의 복수의 세포 군집의 회수를 수행할 수 있는 기구, 장치 및 방법을 제공한다. 다세포 분석법은, 일 실시양태에서, 군집 내 1 이상의 세포의 분비 산물, 예를 들어 항체의 분석법이다. 일부 실시양태에서, 세포 군집은 이질적인 세포 군집이다. 즉, 군집 내 2 이상의 세포는 유전자형, 표현형, 상이한 재조합된 항체 유전자, 상이한 재조합된 T-세포 수용체 유전자, 또는 일부 기타 특성이 다르다. 나아가, 복수의 세포 군집이 동시에 하나의 장치에서 분석되는 경우, 일 실시양태에서, 적어도 2개의 군집은 서로에 대해 이질적이다 (예: 상이한 세포 수, 세포 유형 등). 일부 분석 실시양태에서, 검출 시약으로 제공되는 1 이상의 판독 입자를 포함하는 판독 입자 군집 (예: 세포 수용체, 판독 비드, 센서, 가용성 효소 등을 발현하는 판독 세포)은 판독 신호 (예: 형광 신호)가 검출되기에 충분한 농도로, 1 이상의 효과 세포를 포함하는 개별 세포 군집, 및 1 이상의 효과 세포로부터 분비된 산물에 노출된다. 판독 신호는 효과 세포의 특성, 예를 들어 1 이상의 판독 입자 상의 군집 내 1 이상의 효과 세포에 의해 유도되는 생물학적 반응/세포외 효과 (예: 세포사멸)를 보고한다.
특히, 효과 세포는 많은 경우에 희귀 세포이기 때문에, 본 명세서에서 기술되는 방법에 의해 분석된 모든 세포 군집이 반드시 효과 세포를 포함하는 것은 아니다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 수천의 세포 군집이 단일 장치 상에서 분석되는 경우, 세포 군집의 일부만이 효과 세포를 포함한다.
본 명세서에서 기술된 장치 및 분석법은 1 이상의 효과 세포가 1 이상의 개별 세포 군집 내, 장치의 단일 분석 챔버 내에 존재하는 단일 세포 분석법을 제공한다. 중요하게, 단일 효과 세포의 효과는 더 큰 세포 군집, 예를 들어 이질적인 세포 군집 내에서 검출될 수 있다. 단일 분석 챔버 내 다세포 분석법을 시도함으로써, 본 명세서에서 기술된 실시양태는 이전에 단일 세포 분석법에 대해 보고된 것보다 큰 처리량으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 1,000,000개 챔버의 어레이가 실용적인 기판 크기로 제조될 수 있으며 챔버 당 최대 100개의 세포의 로딩밀도로 사용되어, 이로 인해 실험 당 최대 100,000,000개의 세포의 스크리닝 처리량이 달성되었다 (도 1). 일단 세포 군집이 판독 입자에 세포외 효과를 나타내는 것 (예: 다른 군집 또는 대조군 값과 비교할 때 세포외 효과 상의 변화)으로 확인되면, 세포 군집은, 일 실시양태에서, 개별 세포 부분집단 (예를 들어, 회수된 세포 군집은 한계 희석법에서 분석된다)으로서 회수되어 군집 내 어떤 효과 세포(들)이 세포외 효과의 원인이 되는지를 결정하기 위하여 추가로 분석된다.
본 발명은 관심있는 특성, 즉, “세포외 효과”에 대해 개별 세포 군집 (이는 단일 세포 또는 소수의 세포를 포함할 수 있음)을 분석하기 위해, 작은 반응 부피 및 대량 병렬 분석능을 이용한다. 세포외 효과는, 일 실시양태에서, 세포 군집 내 존재하는 세포에 의해 분비된 항체의 특성이다. 세포외 효과는 특정 효과에 제한되지 않으며, 오히려, 결합 특성 (특이성, 친화력, Kon, Koff 등) 또는 기능적 특성, 예를 들어 세포 표면 수용체의 작용 (agonism) 또는 길항 작용일 수 있다. 일 실시양태에서, 세포외 효과는 효과 세포 (예: 항체)의 분비 산물에 의해 발휘되는 효과이다. 그러나, 세포외 효과는 세포 자체의 효과, 예를 들어 효과 세포의 세포 표면 단백질에 의해 발휘되는 효과일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 장치 및 방법은 작은 것이 민감하다는 개념에 부분적으로 기초한다. 본 명세서에서 제공되는 장치는 종래 플레이트-기반 분석법에 비해 각각 약 10,000 내지 약 100,000배 작은 부피를 갖는 많은 수천의, 수만의, 또는 수십만의, 나노리터 부피의 세포 분석 챔버를 포함한다. 이들 나노리터 또는 서브-나노리터 챔버에서, 각 단일 효과 세포 (예: ASC)는 몇분 내에 고농도의 분비된 생체분자, 예를 들어 항체를 생산한다. 이러한 농축 효과는, 일 실시양태에서, 세포 표면 수용체 활성의 조절 (예: 작용 또는 길항 작용)과 같은, 특정 기능적 특성(들)을 가지는, 단일 일차 ASC에 의해 제조되는 항체를 확인하는 세포-기반의 스크리닝 분석을 수행하는데 이용된다. 이러한 농축 효과는 또한 다른 효과 세포의 존재하에서 관심있는 특성을 보이는 단일 효과 세포 및 이러한 특성을 보이지 않는 비-효과 세포를 확인하도록 한다. 본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치와 함께 사용하기에 적합한 기능적 세포외 효과 분석법이 본 명세서에서 구체적으로 기술된다.
중요하게는, 본 명세서에서 제공되는 분석법에서, 세포외 효과의 존재가 세포 군집을 포함하는 특정 챔버 내에서 검출되는 한 특정한 특성을 갖는 특정 효과 세포 또는 효과 세포의 부분집단이 처음으로 확인될 필요가 있는 것은 아니다. 효과가 측정되는 챔버 내 일부 또는 모든 세포가 특정 세포 또는 세포외 효과의 원인이 되는 세포를 확인하기 위하여, 예를 들어 한계 희석법에서 추가 특성화를 위해 회수될 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 실시양태에서, 단일 세포로부터의 세포외 효과는 동일한 챔버 내 기타 세포, 예들 들어 동일한 챔버 내 약 2 내지 300개의 기타 세포, 예들 들어 동일한 챔버 내 약 2 내지 약 250개의 세포, 동일한 챔버 내 약 2 내지 약 150개의 세포, 동일한 챔버 내 약 2 내지 약 100개의 세포, 동일한 챔버 내 약 2 내지 약 50개의 세포, 동일한 챔버 내 약 2 내지 약 30개의 세포, 동일한 챔버 내 약 2 내지 약 20개의 세포, 또는 동일한 챔버 내 약 2 내지 약 10개의 세포의 존재 내에서 검출될 수 있다.
세포외 효과 분석법을 수행하기 위해 설계된 장치가 본 명세서에서 제공된다. 이러한 분석법은 본 명세서에서 기술되는 이질적인 세포 군집에, 또는 단일 세포로서, 하나의 장치의 분석 챔버에 존재하는 관심있는 단일 효과 세포의 검출을 가능하게 한다. 특히, 챔버가 이질적인 세포 군집을 포함하는 경우, 군집 내 1 이상의 세포가 항체를 분비하는 경우 (즉, 단일 반응 챔버 내 이질적인 ASC 군집), 오직 하나의 효과 세포 또는 효과 세포의 부분집단이 원하는 세포외 효과를 생성하는 항체를 분비하는 경우, 본 명세서에서 기술된 실시양태는 정성적으로 및/또는 정량적으로 세포외 효과를 검출하는 장치 및 방법을 제공한다. 일단 챔버가 효과를 나타내는 것으로 확인되면, 챔버로부터의 세포 군집은, 예를 들어, 한계 희석법에서 세포 군집을 부분집단으로 나눔으로써 다운스트림 분석을 위해 회수된다. 일 실시양태에서, 세포외 효과를 보이는 1 이상의 이질적 군집의 세포는 회수되어 어떤 세포가 세포외 효과에 원인이 되는지 결정하기 위하여 한계 희석법에서 추가 스크리닝된다.
단일 세포 항체 분비 세포 (ASC)/항체 선택 파이프라인을 위한 작업 흐름도의 일 실시양태는 도 1에 도시되었다. 본 실시양태에서, 숙주 동물은 표적 항원으로 면역화되며 세포는 최종 면역 주사 1주 후 비장, 혈액, 림프절 및/또는 골수로부터 수득된다. 이들 시료는 이후 기존의 표면 마커 (가능한 경우)를 이용하거나 미세유체 농축을 이용한 유세포 분석 (예: FACS) 또는 자기 비드 정제에 의해 선택적으로 ASC에 대해 농축된다. 결과로 도출된 ASC가 풍부한 군집은 이후 나노리터 부피의 챔버를 포함하는 장치 어레이에, 챔버 당 약 1 내지 약 250개의 세포, 예를 들어 챔버 당 약 2 내지 약 100개의 세포, 챔버 당 약 10 내지 약 100개의 세포, 또는 챔버 당 약 10 내지 약 50개의 세포를 얻기 위해 선택된 로딩 농도로 로딩된다. 일 실시양태에서, 장치의 80%가 넘는 챔버는 세포 군집을 포함한다. 본 명세서에서 추가로 기술되는 것과 같이, 세포 로딩은 장치의 하단 성분 내 개방 챔버로의 직접적 로딩에 의해, 예를 들어 액체 컬럼에 의해 생성되는 정수압 (hydrostatic pressure)에 의해, 피펫과 같은 분배 기구를 이용한 유동을 생성함으로써, 또는 하단 성분의 위에 있는 배지를 교체하고 상단 성분 또는 하단 성분을 위아래로 이동시켜 미세챔버로의 유체 전달을 일으킴으로써 이루어진다.
전-농축이 수행되는지 여부 및 그 방법에 따라, 개별 챔버는 다수의 ASC, 단일 ASC를 포함하거나 ASC를 포함하지 않을 것이다. 세포는 챔버 내에서 인큐베이팅 되어 항체가 챔버 부피 내로 분비되도록 한다. ASC가 일반적으로 항체를 초당 1000개의 항체 분자의 속도로 분비하며, 본 명세서에서 제공되는 개별 챔버의 부피는 일 실시양태에서, 약 2 nL 내지 약 5 nL 가량이기 때문에, 약 10 nM 농도의 각 분비된 단일클론 항체가 약 3시간 동안 제공된다 (각 고유의 ASC는 고유의 단일클론 항체를 분비함). 추가적인 실시양태에서, 챔버 내 시약의 이동 및 교환은 자동화된 현미경 검사 및 실시간 영상 처리를 이용한 판독인 영상-기반 세포외 효과 분석법을 수행하기 위해 사용된다. 시약은 액체 컬럼에 의해 생성되는 정수압에 의해, 피펫과 같은 분배 기구를 이용하여 미세챔버의 어레이 상의 유동을 생성함으로써, 또는 하단 성분의 위에 있는 배지를 교체하고 상단 성분 또는 하단 성분을 위아래로 이동시켜 미세챔버로의 유체 전달을 일으킴으로써 교환될 수 있다.
원하는 특성 (예: 결합, 특이성, 친화력, 기능)의 항체를 분비하는 개별 ASC 또는 1 이상의 ASC를 포함하는 세포 군집은 이후 개별 챔버로부터 회수된다. 이후 한계 희석법에서 회수된 세포 군집에 대한 추가 분석이, 예를 들어 벤치탑 (benchtop) 방법을 통해 또는 본 명세서에서 제공되는 다른 미세유체 장치에서 수행된다 (예를 들어 도 2를 참조한다). 또는, 항체 서열을 결정하기 위하여 핵산은 단일 서열분석 반응에서 세포 군집으로부터 서열분석될 수 있다. 개별 ASC가 챔버로 제공되어 회수되는 경우, 개별 ASC에 대한 추가 분석이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 추가 분석은 서열분석 및 세포주로의 클로닝을 위해, 짝지은 HV 및 LV을 증폭하기 위한 단일 세포 RT-PCR을 포함한다.
다른 실시양태에서, 동물이 면역화되고 세포가 비장, 혈액, 림프절 및/또는 골수로부터 수득된 이후, 세포는 장치의 개별 챔버 내로 직접 로딩되는, 즉, 복수의 세포 군집으로서 시작 군집을 형성하며, 개별 세포 군집은 각 챔버 내에 존재한다. 세포외 효과 분석법은 이후 개별 챔버 내에서, 임의의 개별 세포 군집이 세포외 효과의 원인이 되는 1 이상의 효과 세포를 포함하는지를 확인하기 위하여 수행된다.
세포외 효과 분석법의 수행 전에 숙주 동물이 표적 항원으로 면역화될 수 있더라도, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 세포는 숙주 (인간 포함)로부터의 비장, 혈액, 림프절 또는 골수로부터 수득되며 이후 ASC에 대해 농축된다. 또는, 농축 단계가 일어나지 않고 세포가 본 발명에서 제공되는 장치의 챔버에, 즉, 개별 세포 군집이 각 챔버에 존재하는 복수의 세포 군집으로서, 직접 로딩된다.
본 명세서에서 제공되는 방법은 임의의 숙주 종으로부터 항체를 선택하도록 한다. 이는 치료용 항체 개발에 있어 2가지 주요 이점을 제공한다. 먼저, 마우스 및 랫트 외의 종에서 작업할 수 있는 능력은 마우스 단백질에 높은 상동성을 가지는 표적에 대한 mAb뿐만 아니라 마우스와 교차 반응하는 인간 단백질에 대한 mAb를 선택하도록 하며, 이는 쉽게 접근가능한 전임상 마우스 모델에서 사용될 수 있다. 두번째로, 마우스 면역화는 흔히 몇 가지 에피토프에 대한 면역 우세를 특징으로 하는 반응을 초래하고, 생성된 항체의 낮은 다양성을 초래하며; 다른 종으로 확정되어, 상이한 에피토프를 인식하는 항체의 다양성을 매우 증가시킨다. 이에 따라, 본 명세서에서 기술되는 실시양태에서, 마우스, 랫트 및 토끼는 면역화와 이어 이들 면역화된 동물로부터의 ASC 선택을 위해 사용된다. 일 실시양태에서, 토끼는 항원으로 면역화되며, 면역화된 토끼로부터의 ASC는 본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치에 대해 선택된다. 당업자가 인식하는 것과 같이, 토끼는 더 큰 항체 다양성, 더 큰 물리적 크기 (더 큰 항체 다양성), 및 인간으로부터 더 큰 진화적 거리 (보다 인식된 에피토프)를 가져오는 유전자 전환을 이용하는 친화력 성숙의 뚜렷한 기작의 이점을 제공한다.
면역화 전략은, 일 실시양태에서, 단백질, 세포, 및/또는 DNA 면역화이다. 예를 들어, PDGFRα의 경우, 포유류 세포주 내 발현으로부터 얻거나 상업적 출처 (Calixar)로부터 구입한 세포외 영역이 사용된다. CXCR4의 경우, 일 실시양태에서, 원래 형태의, 상업적 출처 (Integral Molecular)로 부터의 천연 바이러스-유사 입자 (VLP) 제제, GPCR이 높게 발현되는 나노입자가 사용된다. 세포-기반 면역화는 세포주 (예: 마우스/랫트의 경우 32D-PDGFRα 세포, 그리고 토끼의 경우 토끼 섬유아세포 세포주 (SIRC 세포)) 내 전장 단백질의 과발현에 의해; 새로운 세포주가 특이적 mAb를 농축하기 위한 최종 촉진제로 사용되는 프로토콜을 포함하여 수행된다. 다양한 확립된 DNA 면역화 프로토콜은 본 발명과 함께 사용하기에 적합하다. DNA 면역화는 (1) 단백질 발현 및 정제의 필요성을 제거하고, (2) 항원의 원래 형태를 보장하며, (3) 다른 세포막 항원에 대한 비특이적 면역 반응의 가능성을 감소시키고, (4) 표적을 도발하는데 효과적이라는 것이 입증되었기 때문에, 복합 막 단백질을 선택하는 방법이 되었다 (Bates et al. (2006). Biotechniques 40, pp. 199-208; Chambers and Johnston (2003). Nat. Biotechnol. 21, pp. 1088-1092; Nagata et al. (2003). J. Immunol . Methods 280, pp. 59-72; Chowdhury et al. (2001). J. Immunol Methods 249, pp. 147-154; Surman et al. (1998). J. Immunol . Methods 214, pp. 51-62; Leinonen et al. (2004). J. Immunol . Methods 289, pp. 157-167; Takatasuka et al. (2011). J. Pharmacol . and Toxicol . Methods 63, pp. 250-257, 각 문헌은 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함된다). 동물 관리 요건 및 확립된 프로토콜에 따라 면역화를 수행하였다.
항-PDGFRα 항체는 이전에 랫트, 마우스, 및 토끼에서 생산되어 왔으며, PDGFRα의 세포외 영역의 비교는 여러 위치의 상당한 변화를 보여준다 (도 3). 따라서, 상기 항원으로부터 양호한 면역 반응이 얻어질 수 있을 것으로 보인다. 항-CXCR4 mAb는 또한 이전에 지질입자 및 DNA 면역화를 이용하여 생성되어 왔으므로, 상기 표적은 또한 양호한 면역 반응을 보일 가능성이 있다. 일 실시양태에서, 분자 항원보강제 (adjuvant)로서 GroEl 또는 GM-CSF의 공-발현 (공-발현된 또는 융합으로서)이 사용된다. 또는, 문헌 [Takatsuka et al. (2011). J. Pharmacol . and Toxicol. Methods 63, pp. 250-257; 및/또는 Fujimoto et al. (2012) J. Immunol . Methods 375, pp. 243-251, 이들은 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함됨]에 개시된 항원보강제 및 면역 스케쥴이 사용되었다.
본 발명은 부분적으로는 ASC와 같은 단일 효과 세포에 대한 분석법 수행을 위한, 대단히 재현가능한 효율적인 세포 로딩 공정을 위해 설계된 장치 조형에 관한 것이다. 본 명세서에서 제공되는 장치 구조는: (i) 세포 또는 입자를 분석 챔버에 손쉽고 효과적으로 로딩하게 하며, (ii) 세포 및/또는 입자가 배지 성분을 교환하는 능력을 유지하면서 고정되도록 하고, (iii) 고해상도 현미경 검사와 호환가능하며, (iv) 가용성 형광 시약으로부터 감소된 백그라운드 형광 신호를 제공하고, (v) 고밀도 분석 형식을 제공하며, (vi) 임의의 특정 챔버로부터 선택된 세포 또는 입자의 회수를 용이하게 하고, (vii) 스크리닝 기기 장치와 통합될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 장치는 사용 당 수만 내지 수백만개의 세포를 수용하기 위해 설계된다. 챔버 당, 그리고 장치 작동 당 분리된 효과 세포의 수는 장치 상에 로딩된 세포 현탁액 내 세포의 농도, 선택될 특정 효과 세포(들)의 세포 현탁액 내 빈도, 및 장치 내 챔버의 총 수의 함수이다. 최대 1,000,000개 그리고 1,000,000개가 넘는 세포외 효과 분석 챔버의 어레이를 갖는 장치가 제조되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 장치는 각각이 1 mm 미만의 최소 치수를 포함하는 구성 (예: 분석 챔버 및/또는 유동 채널)을 포함하는 미세유체이다. 그러나, 본 명세서에서 제공되는 실시양태에서, 하나의 장치의 구성의 최소 치수는 500 μm 미만, 100 μm 미만, 또는 30 μm 미만이다.
본 명세서에서 제시되는 미세유체 장치는 각각 복수의 분석 챔버를 포함한다. 분석 챔버는 이중 성분 미세유체 장치의 단일 성분 내에, 또는 단일 성분 장치 내에 존재할 수 있다. 장치의 복수의 성분이 다른 성분으로부터 분리되는 경우, 및/또는 단일 성분의 미세유체 장치가 사용되는 경우, 분석 챔버는 환경에 개방적으로, 즉, 챔버는 예를 들어 피펫팅 또는 주입을 통해 위에서 직접 접근될 수 있으며 따라서 본 명세서에서 “개방 챔버”로 언급된다. 챔버가 처음에 개방되더라도, 2번째 “상단” 성분이 위에, 챔버의 상단에 위치하면, 챔버는 폐쇄된 것으로 간주될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에서 제공되는 장치의 분석 챔버는, 일 실시양태에서 약 50 μm 내지 약 300 μm, 약 50 μm 내지 약 250 μm, 약 50 μm 내지 약 200 μm, 약 50 μm 내지 약 150 μm, 약 50 μm 내지 약 100 μm의 평균 최소 측면 치수를 갖는다. 다른 실시양태에서, 장치의 분석 챔버는 약 50 μm, 약 75 μm, 약 100 μm, 약 125 μm, 150 μm 또는 약 200 μm의 평균 최소 측면 치수를 갖는다.
본 명세서에서 제공되는 장치의 분석 챔버는, 일 실시양태에서 약 50 μm 내지 약 300 μm, 약 50 μm 내지 약 250 μm, 약 50 μm 내지 약 200 μm, 약 50 μm 내지 약 150 μm, 약 50 μm 내지 약 100 μm의 평균 높이 (깊이)를 갖는다. 다른 실시양태에서, 장치의 분석 챔버는 약 50 μm, 약 75 μm, 약 100 μm, 약 125 μm, 150 μm 또는 약 200 μm의 평균 높이/깊이를 갖는다.
장치의 분석 챔버는, 일 실시양태에서, 약 100 pL 내지 약 100 nL, 또는 약 100 pL 내지 약 10 nL, 또는 약 100 pL 내지 약 1 nL의 평균 부피를 갖는다. 일 실시양태에서, 장치의 분석 챔버는 약 100 pL, 약 200 pL, 약 300 pL, 약 400 pL, 약 500 pL, 약 600 pL, 약 700 pL, 약 800 pL, 약 900 pL 또는 약 1 nL의 평균 부피를 갖는다. 다른 실시양태에서, 분석 챔버의 부피는 약 2 nL, 약 1 nL 내지 약 5 nL, 약 1 nL 내지 약 4 nL 또는 약 1 nL 내지 약 3 nL이다. 다른 실시양태에서, 장치의 분석 챔버의 평균 부피는 약 10 pL 내지 약 10 nL, 약 10 pL 내지 약 1 nL, 약 10 pL 내지 약 100 pL, 약 500 pL 내지 약 5 nL, 약 50 pL 내지 약 5 nL, 약 1 nL 내지 약 5 nL, 또는 약 1 nL 내지 약 10 nL이다. 다른 실시양태에서, 장치 내 분석 챔버의 평균 부피는 약 150 pL, 약 250 pL, 약 350 pL, 약 450 pL, 약 550 pL, 약 650 pL, 약 750 pL, 약 1 nL, 약 5 nL, 또는 약 10 nL이다.
본 명세서에서 제공되는 장치는, 일 실시양태에서, 세포 및/또는 입자의 중력-기반 면역화를 이용한다. 중력 기반 면역화는 비-부착 세포 유형의 관류, 및 일반적으로, 효과 세포 및/또는 판독 입자를 포함하는 챔버 내, 챔버를 통한, 또는 챔버 상의, 예를 들어 챔버 층 위로 버퍼 및 시약 교환을 가능하게 한다. 하나의 장치 실시양태에서, 각 챔버는 상단을 통과하는 접속 채널을 갖는 입방 기하학적 구조를 갖는다. 본 명세서에서 기술되는 것과 같이, 접속 챔버는 장치의 상단 성분에 형성되어 개방 분석 챔버를 포함하는 하단 성분에 정렬될 수 있다. 또는, 접속 채널은 개방 챔버 구조와 연결되는 장치의 하단 성분 내에, 미세 제작된 트렌치 (trench)에 의해 형성될 수 있다.
장치 챔버의 로딩 동안, 일 실시양태에서, 입자 (예: 세포 또는 비드)는 개방 챔버로 직접 도입되어 2개-성분 장치의 하단 성분 내에 위치하며 챔버의 하단으로 떨어진다. 단일 성분 장치의 실시양태에서, 단일 성분은 개방 챔버를 포함하는 성분이며 따라서 입자와 함께 로딩된 성분이다. 복수-성분의 장치가 사용되는 실시양태에서, 세포는 장치의 상단 성분 및 하단 성분의 경계면에 형성된 접속 채널을 통해 도입될 수 있다. 이 경우, 세포는 로딩 중에 스트림라인을 따라 챔버를 통과하지만, 이후 유동이 멈추면 챔버의 하단으로 떨어진다. 층류 (laminar flow) 프로파일로 인해, 유속은 챔버 하단 근처에서 무시할 수 있다. 이는 채널을 통해 용액을 유입시킴으로써 결합된 장치를 관류할 때 적용된다. 이는 또한 챔버 내에서, 액체를 부드럽게 피펫팅 또는 흡인할 때, 예를 들어 유체 저장소가 챔버 위로 제공될 때 하단 성분 내 개방 챔버 너머로 액체가 교환될 때 적용된다. 상기 유체 구조는 챔버 내 비-부착 세포 (또는 판독 비드와 같은 판독 입자)의 위치를 방해하지 않고, 챔버 어레이의 관류 및 결합된 대류/확산을 통한 시약 교환을 가능하게 한다.
일 실시양태에서, 분석 챔버를 포함하는 성분은 배지 저장소가 직접적으로 챔버보다 위에 위치하도록 하는 구조를 포함한다. 배지 저장소는 일 실시양태에서, 증발을 막고, 영양분 또는 기타 분자를 챔버에 제공하고, 세포 생존력을 확보하며/하거나 세포에 성장 배지를 제공하도록 제공된다. 저장소 구조는 전체 챔버 어레이, 또는 그의 부분에 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, 다수의 저장소 구조는 상이한 배지, 예를 들어 세포 성장 배지 또는 분석 시약을 어레이의 상이한 부분에 전달하도록 챔버 어레이의 상이한 구획에 제공된다. 일 실시양태에서, 저장소 구조는 약 1 mL 내지 약 20 mL, 약 2 mL 내지 약 20 mL, 약 3 mL 내지 약 20 mL 또는 약 4 mL 내지 약 20 mL의 배지가 챔버 위에 위치하여 제공되도록 제조된다. 다른 실시양태에서, 저장소 구조는 약 1 mL 내지 약 15 mL, 또는 약 2 mL 내지 약 15 mL, 또는 약 2 mL 내지 약 15 mL, 또는 약 3 mL 내지 약 15 mL의 배지가 챔버 위에 위치하여 제공되도록 제조된다. 다수의 저장소 구조가 단일 장치에 이용되는 경우, 이러한 구조는 개별 저장소 당 약 100 μL 내지 약 2 mL의 저장소 부피가 되도록 제조될 수 있다. 저장소 구조가 제공되는 일 실시양태에서, 배지 교환은 저장소로부터 흡인한 후 어레이 위로 새로운 배지를 저장소 내로 제공하여 수행된다.
본 명세서에서 제공되는 장치 구성은 추가 성분, 예를 들어 부속 입자 또는 세포 신호전달 리간드가 챔버에 가해질 때, 또는 관류 또는 세척 액/배지가 도입될 때 효과 세포의 가용성 분비 산물 (또는 분비 산물의 일부)이 챔버로부터 씻겨나가지 않도록 설계된다. 나아가, 본 명세서에서 제공되는 장치는 장치의 개별 챔버 간에 분비 산물 (예: 항체)의 상당한 교차-오염이 없이 챔버로 성분이 첨가되도록 한다. 이러한 챔버의 다른 챔버로부터의 분리는 부분적으로 약 0.6 이상, 또는 약 1 이상의 종횡비 (즉, 최소 측면 치수에 대한 높이/깊이)를 갖는 챔버의 제조에 의해 이루어진다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 장치는 복수 중 개별 챔버가 각각 챔버의 최소 측면 치수의 약 60% 보다 크거나 그와 동일한 깊이를 가지는 복수의 챔버를 각각 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 개별 챔버의 종횡비 (즉, 최소 측면 치수에 대한 높이/깊이)는 약 1.1 이상, 약 1.5 이상, 약 2 이상, 약 2.1 이상, 약 2.5 이상, 약 3 이상, 약 4 이상 또는 약 5 이상이다. 다른 실시양태에서, 장치 내 챔버의 평균 종횡비는 약 0.6 이상, 약 0.7 이상, 약 0.8 이상, 약 0.9 이상, 약 1 이상, 약 1.1 이상, 약 1.5 이상, 약 2 이상, 약 2.1 이상, 약 2.5 이상, 약 3 이상, 약 4 이상 또는 약 5 이상이다. 다른 실시양태에서, 장치 내 챔버의 평균 종횡비는 0.6 이상 15 이하, 0.8 이상 10 이하, 1 이상 10 이하, 1.1 이상 10 이하, 1.2 이상 10 이하, 또는 1 이상 5 이하, 또는 1.5 이상 10 이하이다.
본 명세서에서 제공되는 장치, 또는 그의 일부는 소프트 리소그래피(soft lithography)를 통해 제조된다. 일부 실시양태에서, 장치는 분리된 상단 및 하단 성분을 포함하며, 적어도 하나의 성분은 소프트 리소그래피를 통해 제조된다. 장치는 투명하거나 대체로 투명하여 분석 챔버의 영상화를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 장치의 상단 및 하단 성분은 엘라스토머이며, 예를 들어, 상단 및 하단 성분, 또는 단일 성분은, 폴리디메틸실록산 (PDMS)으로부터 제조된다.
본 명세서에서 제공되는 장치는 다수의 분석 챔버를 포함하는 성분을 포함한다. 챔버 크기는 일 실시양태에서, 포토레지스트에서 정의되며, 챔버는 소프트 리소그래피 공정을 통해 PDMS와 같은 폴리머 물질로부터 주조된다. 소프트 리소그래피 공정 및 포토리소그래피의 양성 및 음성 포토레지스트는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌 [Xia and Whitesides (1998). Agnew. Chem . Int . Ed. Engl . 37(5), pp. 551-575, 그 내용은 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함된다]을 참조한다. 챔버 횡단면은 임의의 특정 형태로 제한되지 않으며, 챔버는 원형, 타원형, 직사각형, 삼각형, 또는 기타 형태의 횡단면을 갖는 소프트 리소그래피를 통해 제조될 수 있음이 의도된다.
일부 실시양태에서, PDMS와 같은 액체 엘라스토머를 두꺼운 포토레지스트로 패턴화된 실리콘 웨이퍼와 같은 미세제조 기판에 붓고, 부어진 PDMS는 이후 탈기되며, 유리 기판은 미세제조 기판 상단에 위치하고, 과량의 폴리머 재료를 압출하기 위해 가압되며, PDMS를 중합하기 위해 가열되고, 이후 유리 기판 상의 박형 PDMS 층을 남기기 위해 분리되는, 각인 공정이 사용된다. 일 실시양태에서, 성형된 챔버의 하단과 유리 기판 사이의 PDMS 층의 두께는 약 5 내지 50 μm 미만이다. 일 실시양태에서, 성형된 챔버 아래의 물질의 총 두께는 주로 유리 기판의 두께에 의해 결정되며, 이는 약 100 μm, 200 μm, 400 μm, 또는 1 mm 미만일 수 있다. 얇은 투명한 기판 상에 직접 성형된, 예를 들어 약 0.6 이상 또는 약 1 이상, 또는 약 1 내지 약 10의 높은 종횡비 챔버 어레이를 갖는 장치는 유리 기판의 하단을 통한 고해상도의 영상화를 가능하게 한다. 본 명세서에서 제공되는 종횡비의 챔버 어레이를 갖는 장치는 또한 핫 엠보싱, 사출 성형, 반응성 이온 에칭, 또는 기타 이방성 에칭 공정을 포함하는, 당업계에 알려진 다른 미세제조 공정에 의해 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 장치는 예를 들어, 채널을 밀폐하는 밸브를 포함하는 미세유체 채널을 정의하기 위하여, 다층을 갖는 “상단 성분 (top component)”을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 장치의 “하단 성분 (bottom component)”은 상기 제공되는 것과 같이 소프트 리소그래피를 통해 제조될 수 있는 개방 챔버를 포함한다. 각 성분의 면이 접촉하는 하단 성분의 위로 상단 성분이 즉시 도입될 때, 개방 챔버는 밀폐되거나 실질적으로 밀폐될 수 있다 (인접한 챔버를 연결하는 작은 채널 또는 개구를 이용하여).
다층을 포함하는 장치의 상단 성분은 다층 소프트 리소그래피 (MSL)를 통해 제조될 수 있다 (Unger et al. (2000). Science 7, pp. 113-116, 전체가 참고로서 포함됨). 나아가, “상단 성분” 및 “하단 성분” 모두가 엘라스토머성 물질로부터 예를 들어, 소프트 리소그래피를 통해 제조되고 비가역적 밀봉을 함께 형성하도록 구성되는 경우, 장치의 다수의 성분은 MSL에 의해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.
모든 미세유체공학 기술 중에서, MSL은 수천개의 집적 미세밸브를 갖는 장치의 신속하고 저렴한 프로토타이핑 측면에서 독특하다 (Thorsen et el. (2002). Science 298, pp. 58-584). 이러한 밸브는 믹서, 연동 펌프 (Unger et al. (2000). Science 7, pp. 113-116) 및 유체 다중 구조 (Thorsen et al. (2002). Science 298, pp. 58-584; Hansen and Quake (2003). Curr . Opin . Struc . Biol . 13, pp. 538-544)를 포함하여 높은 수준의 유체 성분을 제조하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 높은 수준의 통합 및 온-칩 (on-chip) 액체 처리가 가능하다 (Hansen et al. (2004). Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 101, pp. 14431-1436; Maerkl and Quake (2007). Science 315, pp. 233-237). 이 단락에서 전술한 참고 문헌 각각의 개시는 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로서 포함된다.
MSL 제조 공정은 잘 확립된 포토리소그래피 기술 및 마이크로전자 제조 기술의 발전을 이용한다. MSL의 첫번째 단계는 컴퓨터 제도 소프트웨어를 이용하여 유동 및 제어 채널의 도안을 그린 다음, 이를 고해상도 마스크에 인쇄하는 것이다. 포토레지스트로 덮인 실리콘 (Si) 웨이퍼를 자외선에 노출시켜, 마스크에 의해 특정 영역을 제외한다. 포토레지스트가 음성인지 양성인지에 따라, 노출되거나 (음성) 노출되지 않은 (양성) 영역 중 어느 하나가 가교되며 저항은 중합될 것이다. 중합되지 않은 레지스트 (resist)는 현상액 (developer solution)에 가용성이며 이어 씻겨나간다. 상이한 포토레지스트 및 스핀 코팅을 상이한 속도로 결합함으로써, 실리콘 웨이퍼를 다양한 상이한 형태와 높이로 패턴화하여, 다양한 채널과 챔버를 정의한다. 이후 웨이퍼를 주형으로 사용하여 폴리디메틸실록산 (PDMS)에 패턴을 전사한다. 일 실시양태에서, PDMS로 성형하기 전, 그리고 포토레지스트 층을 정의한 후에, 주형은 파릴렌 코팅되어 (화학 기상 증착된 폴리(p-자일릴렌) 폴리머 장벽) 성형 중 PDMS의 부착을 감소시키고, 주형 내구성을 향상시키며 작은 구성의 복제를 가능하게 한다.
MSL에서, 서로의 위에 위치한 상이한 주형으로부터 주조된 상이한 PDMS 층의 적층은 중첩된 층에 채널을 생성하는데 사용된다. 2개 (또는 그 이상)의 층은 포팅 (potting) 프리폴리머 성분과 경화제 성분을 상보적인 화학량적 비율로 혼합함으로써 서로 결합하며 경화된다.
일 실시양태에서, 장치 내 유체 유동은 예를 들어 하단 성분 내 챔버에 걸쳐 시약 유동을 유도하기 위하여, 상단 성분의 채널 내 유체에 가해지는 압력을 작동시키는 오프-칩 컴퓨터 프로그래밍 가능한 솔레노이드를 이용하여 제어된다.
당업자에 의해 이해되는 것과 같이, 포토레지스트 층의 두께는 부분적으로 스핀 코팅 속도 및 사용을 위해 선택된 포토레지스트에 의해 제어될 수 있다. 분석 챔버의 대부분은, 일 실시양태에서, Si 웨이퍼 상에 직접 놓이는 SU-8 100 구성에 의해 정의된다. 당업자에게 공지된 것과 같이, SU-8은 일반적으로 사용되는 에폭시계 음성 포토레지스트이다. 또는, 당업자에게 알려진 다른 포토레지스트를 사용하여 전술한 높이의 분석 챔버를 정의할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분석 챔버는 SU-8 구성에 의해 정의되는 것과 같이 각각 50-500 μM 및 50-500 μM의 높이와 너비를 갖는다.
소프트 리소그래피 및 MSL 제조 기술은 광범위한 장치 밀도, 및 챔버 부피를 제조할 수 있도록 한다. 본 명세서에서 제공되는 장치의 경우, 일 실시양태에서, 약 2000 내지 약 1,000,000개의 분석 챔버, 예를 들어 약 1000 내지 약 200,000개의 분석 챔버가 단일 장치 내에, 즉, 장치의 하단 성분 내에 제공된다. 효과 세포 분석 챔버는, 일 실시양태에서, 약 0.5 nL 내지 약 4 nL, 예를 들어, 약 1 nL 내지 약 3 nL, 또는 약 2 nL 내지 약 4 nL의 평균 부피를 갖는다.
본 명세서에서 제공되는 장치는 효과, 부속 또는 판독 다양성에 상관없이 장기간 배양 및 세포의 유지 (예: 약 12시간 내지 약 2주, 또는 약 12시간 내지 약 10일, 또는 약 12시간 내지 5일, 또는 약 12시간 내지 2일, 또는 약 1일 동안)를 가능하게 한다. 일 실시양태에서, 하단 성분 내 챔버 어레이는 세포 성장 배지의 저장소와 중첩될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상단 성분은 PDMS 엘라스토머의 두꺼운 막 (예: 약 150 μm 내지 약 500 μm 두께, 약 200 μm 두께, 약 300 μm 두께, 약 400 μm 두께 또는 약 500 μm 두께)을 포함한다. 막은 챔버 위에, 일 실시양태에서, 배지의 저장소에 배치되며, 예를 들어 1 mL의 배지가 막 위에 중첩된다. 유사한 형식이 이전에 기술되었다 (Lecault et al. (2011). Nature Methods 8, pp. 581-586, 모든 목적을 위해 본 명세서에서 전체가 참고로서 포함됨). 챔버에 대한 배지 저장소 (삼투압 용기)의 근접성은 효과적으로 증발을 저해하며 (가스-침투성 PDMS 물질을 통해) 강한 세포 생존력과 세포가 충분히 분화하지 않은 경우 수일 동안의 성장을 보장하고, 부피 형식과 일치하는 성장률 및 세포 반응으로 nL 부피에서 장기간의 배양을 달성하는데 기여한다.
일부 실시양태에서, 2개-성분 장치의 조립체는 챔버의 상단을 통과하는 유동 채널 (상단 성분)에 의해 연결되는 하단 성분 내 분석 챔버의 열을 형성한다. 챔버는 유체가 챔버 상에 제공될 때, 챔버의 하단에서의 유속 프로파일이 크게 약화되거나 방해되는 충분히 높은 종횡비로 설계된다. 세포 군집, 또는 비드 군집의 로딩 중에, 세포 또는 비드의 현탁액은 개방 챔버 어레이를 특징으로 하는 장치의 하단 성분 (또는 단일 성분)에 직접 로딩된다. 이는 예를 들어 피펫팅을 통해, 공지된 수의 세포를 이용한 부피의 세포 현탁액을 하단 성분 내 개방 챔버 어레이의 상단에 이동시킴으로써 달성될 수 있다. 충분한 수의 세포/비드가 어레이에 도입되면, 주변 액체보다 조밀한 세포/비드가 챔버의 하단으로 떨어진다. 유속은 챔버의 하단에서 무시될 수 있으므로, 챔버의 하단에서 세포는 효과적으로 유동으로부터 분리된다. 다양한 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 장치는 하단 성분 내 챔버에 연결하는 상단 성분 내 채널이 폐쇄되도록 하여 각 챔버를 분리하는 활성 미세밸브를 포함한다. 이러한 밸브 구조는 또한 제어되고 자동화된 방식으로 시약을 어레이의 특정 영역으로 이동시키기 위해 사용될 수 있다. 유동이 다시 챔버의 상단 위로 통과하는 경우, 그 유동은 세포/비드가 움직이지 않도록 챔버의 하단에서 충분이 약화된다. 그러나, 챔버의 상단과 챔버의 하단 간의 짧은 길이 스케일은 확산이 어레이의 챔버 내 배지 내용물을 신속하게 교환할 수 있도록 한다. 이러한 방식으로, 장치는 배지 내용물을 신선하게 하거나 교환하는데 필요한 세척 단계를 수행하는 능력을 유지하면서 현탁 세포 유형 및 비드가 고정되도록 한다. 본 장치 실시양태 및 장치 기하 구조의 또 다른 특징은, 챔버의 하단이 유리 기판에 근접하도록 챔버가 제조되며 도립 현미경 배치 또는 기타 기기 장치를 이용하여 고품질의 영상화를 가능하게 한다는 것이다.
그 주변 환경으로부터 챔버의 분리는 일 실시양태에서, 챔버를 그 주변 환경으로부터 물리적으로 밀폐하지 않고 이루어진다. 오히려, 일 실시양태에서, 챔버 간의 유체 커뮤니케이션을 제한하여 하나의 챔버와 인접한 챔버 사이의 유의한 오염을 방지함으로써 분리가 이루어진다. 예를 들어, 1 이상의 밸브를 사용하는 대신, 인접한 챔버가 챔버 간의 확산을 제한하기 위한 종횡비로 제조되며/되거나, 챔버 유입구 및/또는 유출구를 차단하기 위하여 오일과 같은 비혼화성 유체상을 이용하여 분리된다. 예를 들어, 챔버는 챔버 내 분비된 산물 (예: 항체)의 분석을 유의하게 방해하지 않게 챔버 내외로의 분자의 확산이 충분히 느리도록 설계된다. 예를 들어, 이론에 구애됨이 없이, 챔버가 분자가 하나의 챔버의 하단으로부터 다른 챔버의 하단으로 이동하도록 확산되어야 할 총 최소 거리가 챔버의 최소 측면 치수의 2배가 되도록 설계될 때, 판독 입자와의 상호작용으로 인해 분비 분자가 판독 입자에 결합한다면, 인접한 챔버 내 판독 입자와 상호작용하는 분비 분자의 비율에 대한 원래 챔버 내 판독 입자와 상호작용하는 분비 분자의 비율은 10이상이다. 이러한 조건은 최소 측면 치수에 대한 높이로 정의되는 챔버의 종횡비가 0.6 이상, 예를 들어 1 이상, 0.6 이상 10이하, 1 이상 10이하, 1.25 이상 5 이하일 때 만족된다. 특히, 이 종횡비는 또한 챔버 내에서 세포를 유지하면서 챔버 내 시약이 교환되도록 하기에 충분하다.
본 명세서에서 제공되는 장치의 실시양태는 시약 및 세포를 개방 챔버 내외로 직접 로딩함으로써 각 어레이 내 챔버로부터의 세포 회수뿐만 아니라 세포 및 시약 취급을 크게 용이하게 한다.
일 실시양태에서, “스플릿 (split)” 미세유체 장치는 본 명세서에서 기술되는 1 이상의 세포외 효과 분석법을 수행하기 위해 제공된다. 스플릿 장치는 2개의 성분 (상단 성분 및 하단 성분)을 포함한다. 하단 성분은 세포외 효과 분석 챔버를 포함한다. 상단 성분은, 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 또한 다층일 수 있으며 MSL을 통해 제작될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상단 성분은 단층이다. 스플릿 장치의 일 실시양태는 도 4에 도시된다. 도 4는 상단 성분(401) 및 하단 성분(402)을 포함하는 2개-성분 장치(400)를 보여준다. 하단 성분은 개방 챔버(403)를 포함한다. 상단 성분은 푸쉬 다운 밸브 구조(404) 및 개방 채널(405)을 포함한다.
세척 및 관류 단계가 본 명세서에서 기술된 세포외 효과 분석법에서 구현되고, 상대적으로 낮은 압력에서 수행될 수 있으며, 인접한 챔버 간의 일부 누출에 의해 일반적으로 악영향을 받지 않기 때문에, 이 스플릿 장치 구조는 본 명세서에서 기술된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 나아가, 챔버 간의 확산 경로의 존재는, 분비 세포를 갖는 챔버 내 분비 세포 및 판독 입자 간의 확산 경로와 비교할 때 확산 경로의 총 거리가 충분히 길다는 조건 하에, 또는 확산 경로가 인접한 챔버 사이에 확산성 물질이동을 제한하도록 제약된다는 조건 하에, 또는 둘 모두의 조건 하에서, 챔버 간의 유의한 오염을 초래하지 않는다. 따라서, 인접한 챔버는 단단한 밀봉을 요구하지 않는다. 이와 같이, 하기 2개의 분리된 성분을 포함하는 장치가 본 명세서에서 기술된 1 이상의 세포외 효과 분석법의 수행을 위해 제공된다: (i) 높은 종횡비 챔버의 개방 어레이를 포함하는 하단 성분 및 (ii) 하단 성분의 챔버의 어레이 및 이러한 미세채널을 통과하는 유동을 제어하는데 사용될 수 있으나 주변 환경으로부터 챔버를 밀폐하는데는 필요하지 않은 통합된 미세밸브에 정렬하도록 설계된 하단층에, 개방 미세채널을 포함하는 상단 유체 성분 (도 4). 상단 성분 내 이러한 다층은 예를 들어 상술된 MSL을 통해 제조된다. 미세밸브가 챔버 사이에 위치하여, 작동될 때 각 챔버를 다른 하나로부터 밀봉하도록 상단 성분이 하단 성분에 정렬되어 가압된다. 채널 구조는 장치의 하단 성분에 의해 정의될 수 있으며 상단 성분은 채널 아래로의 유동을 방해하는 막을 편향시킴으로써 이러한 채널을 작동시키는 밸브를 정의하는데 사용될 수 있음이 또한 의도된다.
이 스플릿 미세유체 장치는 비-스플릿 장치, 즉, MSL를 통해 제조된, 완전 밀폐된 층, 즉, 및 미세채널을 통해 처리되는데 필요한 챔버를 포함하는 장치와 비교할 때 세포 로딩을 크게 용이하게 한다. 하단 성분의 개방 챔버 어레이는 먼저 세포 현탁액 및/또는 입자의 첨가에 의해 로딩된다. 세포/입자가 스플릿 장치의 챔버에 자리잡으면, 장치의 상단 성분은 스크리닝에 필요한 유체 처리 및 영상화 단계를 수행하기 위하여 어레이 상에 위치한다. 분석이 완료되면, 장치의 상단 성분은 다시 제거되어 하단 성분 내 어레이를 노출하고 세포, 또는 판독 입자, 또는 둘다를 선택된 챔버로부터 회수할 수 있다. 로딩 절차를 단순화하는 것에 더하여, 이러한 전략은 얇은 PDMS 막 내에 장치를 제조할 필요가 없으므로 장치의 제조를 또한 단순화한다. 특히, 0.6 이상, 예를 들어 0.7 이상, 1 이상의 종횡비를 갖는 챔버의 사용은 세포를 챔버 밖으로 씻어내지 않고 용액을 교환할 수 있는 능력을 유지하기 때문에, 그리고 이는 세포의 손실을 초래하는 챔버 내 유동을 생성하지 않고 상단 기판을 제거할 수 있기 때문에, 이러한 접근법에서 중요하다. 일 실시양태에서, 개방 챔버를 포함하는 장치의 하단 성분의 종횡비는 0.6 이상, 예를 들어 0.7 이상, 1 이상, 약 10 미만이다.
다른 실시양태에서, “스플릿” 2개-성분 미세유체 장치는 본 명세서에서 기술된 1 이상의 세포외 효과 분석법을 수행하기 위해 제공된다. 스플릿 장치는 2개의 성분 (상단 성분 및 하단 성분)을 포함한다. 상단 성분은 단층을 포함하고 하단 성분은 단층을 포함한다. 각 층은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 소프트 리소그래피를 통해 제조될 수 있다. 또한 “2개-성분” 장치가 2개의 성분을 포함하더라도, 이들 성분은 MSL에 의해 제조된 단일 성분 장치에서 나타나는 다수의 “층”과 상이함을 유의하여야 한다. 본 명세서에서 기술되는 2개-성분 장치는 가역성 결합을 통해 형성되며 개별 분석 단계 이후 분리될 수 있는 반면, MSL에 의해 제조된 장치의 층은 장치 실패 없이 분리될 수 없다.
스플릿 장치의 다양한 실시양태(500 및 500')의 개략도의 횡단면은 도 5 (상단 및 하단)에 도시된다. 이러한 실시양태에서, 다층 상단을 가지는 스플릿 장치와 달리, 장치(500)의 상단 성분은 통합된 밸브를 포함하지 않으며, 대신 채널 구조 또는 유량 세포 구조(504)를 포함하는 단층(501)으로 이루어진다 (도 5). 이러한 버전의 장치가 활성 밸브를 포함하지 않음에도 불구하고, 이는 챔버 어레이에 걸쳐 시약의 유동과 교체를 제어하는, 주변 제어 유체장치와 함께 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상단 성분은 특징이 없는 표면을 가지며 하단 성분에 정의된 채널을 형성하는데 사용된다.
다양한 유동 구조, 예를 들어 단일 와이드 유량 세포(504) (도 5, 상단), “스탠드-오프 (stand-off)” 스페이서 모음을 갖는 유량 세포(504') (도 5, 하단), 다수의 채널 등이 상단 성분(501 및 501')에서 사용될 수 있다. 하단 성분(502 및 502')의 챔버(503 및 503')로의 세포 로딩이 전체 장치의 조립 전에 수행되기 때문에, 상단 또는 하단 성분 내 유동 구조는 종래 미세유체 장치, 예를 들어 MSL에 의해 제조되는 미세유체 장치에서보다 좁을 수 있다. 예를 들어, 유동 구조는 약 2 μm, 또는 5 μm, 10 μm, 또는 20 μm부터의 최소 치수를 가질 수 있음을 추가로 유의한다.
이러한 기하학적 구조가 분석 챔버를 다른 챔버로부터 밀폐하기 위한 미세밸브를 포함하지 않음에도 불구하고, 1 이상의 챔버를 용액이 흐를 수 있는 유입구 및 유출구에 연결시키는 작은 채널을 사용하는 것이 인접한 챔버 간 느린 확산에 충분하며 이에 따라 교차-오염을 분석 성능을 저해하지 않는 수준까지 감소시킨다. 챔버 간 확산 이동을 최소화하는 것에 더하여, 본 명세서에서 기술된 채널과 같이 작은 횡단면을 갖는 채널의 사용은 인큐베이션 동안 챔버 간 원치 않는 대류를 억제하는 높은 유체 임피던스를 초래한다는 점에 더욱 유의하여야 한다. 나아가, 상단 성분은, 장치의 상단 및 하단 성분을 함께 가져오는데 사용되는 압력이 챔버를 연결하는 유로의 횡단면을 조절하고 심지어 챔버를 밀폐하기 위해 사용되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 상단 성분은 압력을 증가시킴으로써 붕괴될 수 있는 부응하는 “스탠드-오프” 구조(504')로 제조될 수 있으며, 이에 따라 어레이는 2가지 성분 간 편향가능한 막 구조의 필요 없이 밀폐될 수 있다 (도 5, 하단). 도 5가 모든 1개 간격의 챔버 사이의 “스탠드-오프 구조”를 도시하더라도, 그 구조는 모든 챔버 사이 간, 모든 2개 간격의 챔버 등 사이에서 사용될 수 있음을 유의하여야 한다. 상기 실시양태는 로딩을 용이하게 하고 WO 2014/153651 (그 개시 내용 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨)에 개시된 장치의 핵심 기능을 보존할 뿐만 아니라, 또한 장치 제조를 크게 단순화하며, 일련의 거시적인 밸브 및 유동체를 가짐으로써 어레이로의 이동을 조절하는데 사용되는 기기의 자동화를 위해 쉽게 적용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, (i) 0.6 이상, 예를 들어 0.7 이상, 1 이상 약 10 이하, 1 이상 약 5 이하의 높은 종횡비 챔버의 개방 어레이를 포함하는 하단 기판 성분, 및 (ii) 하단 성분에 대한 상단 성분의 전환에 의해 하단 성분의 어레이 내 챔버가 가역적 밀폐되도록 설계된 상단 성분을 포함하는 스플릿 장치. 미세챔버(603)를 포함하는 상단 성분(601) 및 하단 성분(602)을 포함하는 이러한 장치(600)의 단면도가 도 6에 제공된다. 본 실시양태에서, 장치(600)의 상단 성분(601)은, 장치 및 챔버(603)의 하단 성분 너머로 정렬되는 경우 어레이의 챔버(603)로 용액이 전달되는 유로를 제공하는 미세채널(604)의 도관을 이용하여 제조된다 (도 6). 유체/시약의 이동 후, 상단 성분은 하단 성분에 대하여 전환될 수 있다 (도 6, 하단). 그렇게 하면, 채널(604)은 챔버와 접촉하지 않게 되고 챔버(603)는 상단 성분의 표면에 의해 밀폐된다 (도 6, 하단). 상단층의 전환 이동 (Translationally shifting)은 하단 성분 내 챔버를 완전히 밀폐하는 방법을 제공한다. 다른 스플릿 성분 장치에 존재하는, 세포 및 시약 처리 및 세포 회수의 이점이 상기 장치에도 존재한다.
또 다른 스플릿 성분 장치 실시양태는 도 7에 단면도가 제공되는 상단 성분(701) 및 하단 성분(702)을 포함하는 장치(700)를 포함한다. 도 7에 도시된 것과 같이, 상단 성분(701)은 패턴화되지 않은 상단을 포함한다. 구체적으로, 스플릿 성분 장치는 (i) 각각 0.6 이상, 예를 들어 0.7 이상, 또는 1 이상 약 10 이하, 1 이상 약 5 이하의 종횡비를 갖는 챔버의 개방 어레이(703)를 포함하는 하단 성분, 및 (ii) 실질적으로 평평하고 패턴화되지 않은 상단 성분을 포함한다. 하단 성분은 1 이상의 돌출 부위 (스페이서)(704)를 챔버 어레이의 챔버 사이에 포함한다. 일 실시양태에서, 돌출 부위는 당업자에게 알려진 것과 같이, 다수의 포토레지스트를 이용한 소프트 리소그래피 및 포토리소그래피를 통해 제조된다. 1 이상의 돌출 부위는 2개의 성분이 함께 묶일 때 상단 성분과 하단 성분 사이의 간격을 정의한다.
본 실시양태에서, 챔버를 가로지르는 유동은 본 명세서에서 기술된 다른 스플릿 장치와 비교할 때 덜 제어되나, 어레이에 걸친 압력을 일반적으로 적용함으로써, 예를 들어 액체 컬럼에 의해 생성되는 정수압에 의해, 또는 피펫과 같은 분배 기구를 이용하여 유동을 생성함으로써, 또는 제2 부분 위에 있는 배지를 교체하고 이후 제2 부분을 잠시 위아래로 이동시켜 어레이로의 유체 전달을 일으킴으로써, 여전히 달성될 수 있다. 상단 성분은 인큐베이션 중에 1 이상의 챔버를 밀폐하도록 챔버의 어레이 표면에 직접적으로 접촉될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 명세서에서 기술되는 1 이상의 세포외 효과 분석법을 수행하기 위한, 복수의 챔버를 포함하는 개방 챔버 미세유체 어레이가 제공된다. 본 실시양태에서, 어레이는 1 이상의 세포외 효과 분석법을 수행할 때 상단 성분없이 사용된다. 그러나, 상단 성분, 예를 들어 PDMS로부터 제조된 상단 장치 성분은 선택적으로 사용되며, 영상화 (세포외 효과 분석법의 판독) 중에 챔버 어레이의 일부만을 커버한다. 장치(800)의 단면도가 도 8에서 제공된다. 스플릿 장치와 마찬가지로, 어레이 챔버는 세포/입자가 유동에 의해 방해받지 않도록 하며, 또한 인접한 챔버와 비교할 때 정의된 실험 조건 (예: 인큐베이션 시간, 비드 수, 비드 크기, 챔버 간격 등)에 대하여 각 세포가 위치한 챔버 내 입자에 의한 세포 분비 산물 (예: 항체)의 상대적 포획 효율이 5보다 크도록 하나의 챔버의 하단으로부터 다른 하나로의 확산 통로가 충분히 길도록 하는 깊이로 제조된다 (즉, 챔버(803)는 약 0.6 이상, 예를 들어 0.7 이상, 1 이상, 1 이상 약 10 이하, 1 이상 약 5 이하의 종횡비를 가진다).
포획의 상대적 효율 (Relative Efficiency of capture) = RE = [세포를 갖는 챔버 내 포획되는 세포를 갖는 챔버로부터의 세포 분비 산물의 수] / [인접한 챔버 내 포획되는 세포를 갖는 챔버로부터의 세포 분비 산물의 수].
본 실시양태에서, 패턴화되지 않은 상단 성분(801)은 사용되는 경우, 영상화 동안 챔버 어레이의 상단에 존재하는 대량의 가용성 형광 분자(804)로부터 유래한 백그라운드 형광 신호를 제거한다. 패턴화되지 않은 상단(801)의 크기는 예를 들어, 챔버 어레이 또는 그의 부분 위에 놓인 저장소 내 배지를 대체할 수 있는 배지의 부피를 정의한다.
예로서, 챔버 내의 항체가 동일한 챔버에 위치한 항체 포획 비드 상에 포획되는 경우를 고려한다. 포획되면, 항체는 어레이의 상단의 용액에 첨가되거나, 어레이를 덮는 일부 또는 실질적으로 모든 용액을 먼저 제거한 다음 가용성 형광 항원에 용액을 처리함으로써 첨가될 수 있는 가용성 형광 항원에 노출된다. 항체가 형광 항원에 결합하면, 비드 상에 결합한 항체는 형광 신호를 축적한다. 그러나, 비드 위에 대량의 형광 항원이 또한 존재하며, 이는 특정 형광 신호를 흐리게 하는 백그라운드 형광을 생성한다. 영상화 전에 형광 분자가 제거되면, 벌크 용액에서 항원의 농도가 낮아지며, 비드 상에 결합된 항체의 양이 항체-항원 상호작용의 오프-레이트 (off-rate)에 의해 영향을 받는 속도로 감소한다. 이는 상당히 강한 상호작용 (~1 nM)에 대해서도, 어레이의 영상화 시간보다 짧은 기간 (예: 약 10분) 동안 신호의 유의한 감소를 유발할 수 있다. 그러나, 이 백그라운드 형광은 영상 획득 단계 동안 형광 용액을 어레이의 부근으로부터 제거하기 위해 상단 성분(801)을 이용함으로써 어레이를 세척하지 않고 제거될 수 있다. 상기 상단 성분은 예를 들어 영상화 시스템에 고정될 수 있으며, 장치가 전체 어레이에 대한 영상 포착 동안 전환되는 동안, 영상 획득 영역 위에 배치될 수 있다.
일부 실시양태에서, 효과 세포 및 판독 입자는 예를 들어 표면 기능화를 통해 챔버의 1 이상의 벽을 코팅함으로써 챔버 내에 분포된다. 일 실시양태에서, 그래프트, 공유 결합, 흡착 또는 1 이상의 분자를 챔버의 표면에 달리 부착하거나, 챔버 표면으로의 세포 또는 입자의 부착이 변경되도록 챔버의 표면을 개질함으로써, 표면 기능화가 수행된다. 본 명세서에서 사용하기 위한 이러한 기능화의 비제한적 예는 단백질의 비특이적 흡착, 단백질의 화학적 커플링, 폴리머의 비특이적 흡착, 폴리머의 정전기적 흡착, 저분자의 화학적 커플링, 핵산의 화학적 커플링, 표면의 산화 등이다. PDMS 표면 기능화는 이전에 기술되어 왔으며, 이러한 방법은 본 명세서에서 제공되는 장치의 표면을 기능화하기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Zhou et al. (2010). Electrophoresis 31, pp. 2-16]을 참조하며, 모든 목적을 위해 본 명세서에서 참고로서 포함됨). 본 명세서에서 기술되는 표면 기능화는, 일 실시양태에서, 일 유형의 효과 세포 (예: 세포 군집 내 효과 세포)에 선택적으로 결합하거나, 일 유형의 판독 입자에 선택적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 표면 기능화는 챔버 내에 존재하는 모든 판독 입자를 격리하는데 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 표면 기능화, 또는 복수의 상이한 표면 기능화일 수 있는 표면 코팅은 장치의 챔버 내에 공간적으로 정의된다. 또는, 표면 기능화는 전체 챔버 표면을 덮는다. 두 실시양태는 모두 분석 챔버 내에 별개의 위치로의 판독 입자인 효과 세포의 분포에 유용하다. 예를 들어, 모든 유형의 도입된 판독 입자에 결합하는 분자로 전체 챔버가 기능화된 실시양태에서, 입자는 기능화된 (코팅된) 표면 상에 고정된다. 다른 실시양태에서, 전체 챔버는 다수의 판독 입자 종이 도입되는 경우, 오직 하나의 특정 유형의 판독 입자에 결합하도록 기능화된다. 본 실시양태에서, 모든 입자는 먼저 본 명세서에서 기술된 하나의 방법을 이용하여 하나의 영역으로 향하며, 이는 입자의 서브세트가 기능화된 영역 내 챔버 표면에 부착하고, 이후 기능화된 표면 또는 표면들에 결합하지 않는 입자만을 대체하는 상이한 영역으로 힘을 가하도록 한다. 또 다른 실시양태에서, 장치의 영역 (예: 단일 챔버 내 상이한 챔버 또는 영역)은 효과 세포 및/또는 판독 입자의 상이한 서브세트에 선택적으로 결합하는 상이한 분자로 기능화되어, 효과 세포 및/또는 판독 입자와 실질적으로 전체 챔버 표면의 상호작용을 유도하는 것이 상이한 영역 내 상이한 입자 또는 세포 유형을 나누도록 한다. 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 표면 기능화는 효과 세포 및 판독 입자 조작에 대해 본 명세서에서 기술된 다른 방법과 별개로 또는 조합하여 사용될 수 있음이 의도된다. 다수의 유체 기하학적 구조와 함께 입자 및 세포 격리 방법의 다수의 조합이 가능하다.
다른 실시양태에서, 효과 세포 및/또는 판독 입자는 자기장을 사용하여 챔버 내에 위치한다. 효과 세포(들) 및/또는 판독 세포(들)을 자기적으로 조작하고 배치하기 위하여, 효과 세포(들) 및/또는 판독 세포(들)은 이들에 결합하는 자성 입자로 먼저 기능화되거나 이에 노출됨이 이해될 것이다. 일 실시양태에서, 자기장은 외부에서, 즉, 미세유체 장치 외부의 자석을 이용하여, 영구 자석, 전자석, 솔레노이드 코일, 또는 다른 수단을 이용하여 생성된다. 다른 실시양태에서, 도 9를 참조하면, 자기장은 장치 내에 통합되거나 장치로부터 분리된 자기 구조(90)에 의해 국부적으로 형성된다. 자기장은, 일 실시양태에서 상이한 시점에 가해지며, 일 실시양태에서, 자기장은 자기장에 반응하는 효과 세포 및/또는 판독 입자의 위치에 영향을 미치기 위하여, 입자 로딩과 관련하여 가해진다. 생물학적 시료의 분리 및/또는 정제에 사용되는 상업적으로 입수 가능한 비드 또는 나노입자는 본 명세서에서 제공되는 장치 및 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, “Dynabeads” (Life Technologies)는 초상자성, 단일크기의 구형 폴리머 입자이며, 일 실시양태에서, 판독 입자로 사용된다. 상이한 표적 에피토프 또는 세포 유형에 특이적으로 결합하는 분자와 결합된 자성 입자는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 제공되는 장치 및 방법과 함께 사용하기에 또한 적합하다. 불균일한 특성을 갖는 자기장의 존재 하에서, 이러한 자성 입자는 자기장의 기울기로 향하는 힘을 받는다. 상기 경도력 (gradient force)은, 일 실시양태에서, 챔버 내에 입자가 위치하도록 가해진다.
챔버가 세포 군집 및 판독 입자 또는 판독 입자 군집, 및 세포 군집에 대한 분석법을 수행하기 위한 선택적으로 추가적인 시약(들)로 로딩되면, 챔버는, 일 실시양태에서, 미세유체 장치의 나머지 1 이상의 챔버로부터 유체적으로 격리된다.
본 명세서에서 제공되는 것과 같이, 일 양태에서, 본 발명은 세포외 효과를 보이는 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인하는 방법에 관한 것이다. 세포 군집이 세포외 효과를 보이는 것으로 확인되면, 세포 군집 또는 그의 일부분은 회수된 세포 군집을 얻기 위해 회수된다. 회수는, 일 실시양태에서, 미세모세관 또는 미세피펫을 이용하여 본 명세서의 하나의 장치의 챔버에 접근하는 단계, 및 챔버의 내용물 또는 그의 부분을 흡인하여 회수된 세포 군집을 얻는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 장치가 상단 성분으로 가역적으로 밀폐된 하단 성분 내 챔버를 이용하기 때문에, 관심있는 세포를 갖는 챔버가 확인되면, 2개 성분을 분리하고 챔버(들)에 직접 접근함으로써 그 내용물은 흡착 또는 피펫팅을 통해 쉽게 회수된다.
회수된 세포 군집(들)은, 일 실시양태에서, 예를 들어 회수된 세포 군집으로부터 세포외 효과의 원인이 되는 단일 효과 세포 또는 효과 세포의 부분집단을 확인하기 위하여 추가 분석 처리된다. 회수된 세포 군집(들)은 제1 세포외 효과와 동일하거나 상이할 수 있는 제2 세포외 효과에 대한 부분집단으로서 한계 희석법에서 분석될 수 있다. 제2 세포외 효과를 보이는 세포 부분집단은 이후 예를 들어 본 발명의 장치에 대한 제3 세포외 효과에 대하여, 또는 벤치탑 방법, 예를 들어 RT-PCR 및/또는 차세대 서열분석에 의한 추가 분석을 위해 회수될 수 있다. 또는, 세포 군집으로부터의 핵산은 예를 들어 군집의 항체 서열을 결정하기 위해 서열분석된다. 항체는 이후 클로닝되어 추가 검사를 위해 발현될 수 있다.
1 이상의 분석 챔버로부터의 1 이상의 세포의 회수는, 일 실시양태에서, 자기적 분리/회수를 포함한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 분석 챔버는 챔버 내 1 이상의 세포에 부착하는 자성 입자 (또는 복수의 자성 입자)에 노출된다. 부착은 웰(들) 내 단일 세포 및 세포 군집의 부분집단에 대해 선택적이거나 비선택적, 즉 자석이 모든 세포에 부착할 수 있다. 이 경우, 자성 입자로 표지된 세포는 자기장 기울기를 형성하는 자성 탐침으로 끌어당겨진다. 탐침은, 일 실시양태에서, 자기장이 작동되거나 꺼지도록 설계되어, 세포가 제거를 위해 탐침에 부착하도록 하며 이후 침전 동안 유리된다 (EasySep Selection Kit, Stemcell Technologies).
챔버로부터 회수된 단일 세포 또는 복수의 세포는, 일 실시양태에서, 추가 분석을 위해 1 이상의 용기, 예를 들어, 개방 미세-웰, 미세-방울, 튜브, 배양 디쉬, 플레이트, 패트리 디쉬, 효소-결합 면역흡착점 (ELISPOT) 플레이트, 제2 미세유체 장치, 동일한 미세유체 장치 (상이한 영역 내) 등에 놓여진다. 용기의 선택은 당업자에 의해 결정되며, 다운스트림 분석 및/또는 저장의 특성에 기초한다.
일부 실시양태에서, 확인된 챔버로부터 단일 세포 또는 복수의 세포의 회수 대신 또는 이에 더하여, 세포-유래 산물 또는 세포내 물질이 관심있는 분석 챔버로부터 회수된다. 예를 들어, 분석 챔버가 세포외 효과에서 변화를 보이는 세포를 갖는 것으로 확인되면, 일 실시양태에서, 챔버로부터의 분비 산물은 다운스트림 분석 (예: 서열분석)을 위해 회수된다. 다른 실시양태에서, 세포 또는 복수의 세포는 미세유체 장치 상에서, 예를 들어 제1 분석이 수행되고 용해물이 예를 들어 핵산 서열분석과 같은 추가 분석을 위해 회수되는 챔버 내에서 용해된다.
다른 실시양태에서, 모든 챔버 또는 챔버의 서브세트 내 세포는 용해 시약을 이용하여 용해되며, 이후 정해진 챔버 또는 챔버의 서브세트의 내용물이 회수된다. 다른 실시양태에서, 관심있는 챔버 또는 관심있는 챔버들 내 세포가 세포로부터 방출된 RNA를 포획하는 비드의 존재하에서 용해되고 이어 비드가 회수된다. 이 경우 RNA는 회수 전에 또는 회수 후에 역전사효소를 이용하여 cDNA로 또한 전환될 수 있다.
챔버 또는 챔버들로부터 세포 또는 세포-유래 물질의 회수에 이어, 이들 물질 또는 세포는 단리물 또는 단일 세포 또는 복수의 세포를 확인하거나 특성화하기 위해 분석된다. 추가 분석은 본 명세서에서 제공되는 장치 (예를 들어 도 2를 참조함) 중 하나를 통해, 이전에, 예를 들어 WO 2014/153651에서 기술된 하나의 장치를 통해, 또는 종래 벤치탑 방법을 통해 가능할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 예를 들어 제2 세포외 효과, 제3 세포외 효과 및/또는 제4 세포외 효과를 보이는 회수된 세포 군집으로부터 세포 부분집단을 확인하기 위하여 여러 번의 미세유체 분석을 허용한다. 회수된 세포 군집에 대한 세포외 효과 분석을 반복함으로써, 방법의 사용자는 관심있는 기능적 특성 또는 관심있는 다수의 기능적 특성에 대해 고도로 농축된 세포 군집을 얻는다. 또는, 제2 세포외 효과 분석을 수행하지 않고 예를 들어 군집 내 항체의 서열을 결정하기 위하여 세포외 효과를 보이는 세포 군집을 회수하여 핵산 분석한다.
일 실시양태에서, 세포외 효과 (예: 다른 군집 또는 대조군 값과 비교할 때 세포외 효과의 변화)를 보이는 1 이상의 세포 군집은 1 이상의 회수된 세포 군집을 얻기 위해 회수된다. 1 이상의 개별 세포 군집은 관찰된 세포외 효과의 원인이 되는 세포 또는 세포들을 확인하기 위하여, 예를 들어 한계 희석법에서 세포 부분집단으로서 추가로 분석된다. 일 실시양태에서, 방법은 본 명세서에서 기술된 미세유체 장치의 분리된 챔버 내 1 이상의 회수된 세포 군집으로부터 비롯된 복수의 세포 부분집단을 보유하는 단계를 포함한다. 각 분리된 챔버는 1 이상의 판독 입자를 포함하는 판독 입자 군집을 포함한다. 개별 세포 부분집단은 판독 입자 군집과 함께 인큐베이팅 된다. 개별 세포 부분집단은 제2 세포외 효과에 대해 분석되며, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 제2 세포외 효과의 판독을 제공한다. 제2 세포외 효과는 회수된 세포 군집애서 측정된 세포외 효과와 동일한 세포외 효과 또는 상이한 세포외 효과일 수 있다. 제2 세포외 효과 분석법에 기초할 때, 1 이상의 개별 세포 부분집단은 제2 세포외 효과 (예: 다른 군집 또는 대조군 값과 비교할 때의 제2 세포외 효과의 변화)를 나타내는 것으로 확인된다. 1 이상의 개별 세포 부분집단은 일 실시양태에서, 이후 추가 분석, 예를 들어 핵산 서열분석을 위해 회수된다.
용어 “세포 하위-부분집단”은 세포 부분집단의 부분집단을 의미한다. 일 실시양태에서, 회수된 부분집단 또는 복수의 세포 부분집단으로부터의 세포는 복수의 용기에 세포 하위-부분집단으로서 보유된다. 당업자는 세포 부분집단이 추가적인 부분집단으로 나뉘어질 수 있고, 용어 “하위-부분집단”의 사용이 이러한 구별에 필수적이지 않다는 것을 인식할 것이다. 오히려, 본 명세서에서 제공되는 방법은 한계 희석법에서 회수된 세포 군집의 추가 분석을 가능하게 한다. 각 세포 부분집단은 개별 용기에 존재한다. 개별 부분집단 또는 하위-부분집단은 용해되며, 각 용해된 세포 부분집단 또는 용해된 세포 하위-부분집단 내 1 이상의 핵산은 증폭된다. 추가적인 실시양태에서, 1 이상의 핵산은 항체 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나를 이용한 분석을 포함하는 여러 접근법은 세포의 성질, 원래 스크린 내의 세포의 수, 및 분석의 의도에 따라, 본 다운스트림 분석을 위해 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 효과 세포 군집이 챔버로부터 회수되거나, 복수의 군집이 다수의 챔버로부터 회수되면, 복수 중 각 세포가 개별 용기 (예: 개별 분석 챔버)에 분리되어 각 효과 세포에 대해 개별적으로 분석이 수행된다. 또는, 다수의 챔버의 내용물이 예를 들어 군집 내 항체 서열을 확인하기 위하여, 개별 챔버 또는 핵산 서열분석과 같은 다운스트림 분석을 위한 용기에 모아질 수 있다. 생물정보학은 필요한 경우 중쇄 및 경쇄를 연결하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 효과 세포 군집이 챔버로부터 회수되거나, 복수의 군집이 다수의 챔버로부터 회수되면, 세포 군집은 분리된 영역, 또는 제2 장치 내 동일한 미세유체 장치로 재도입되며, 세포는 한계 희석법에서, 즉, 세포 부분집단으로서 챔버 내로 분리되는데, 예를 들어 세포는 챔버 당 약 1개의 세포, 또는 챔버 당 약 2 내지 약 10개의 세포의 밀도로 분리되며, 제2 세포외 효과 분석이 수행된다. 다운스트림 분석은 예를 들어 다수의 챔버로부터의 세포가 모아질 때, 임의의 크기, 예를 들어, 초기 세포외 효과 세포 분석법과 동일한 크기, 또는 보다 작은 군집 크기, 예를 들어 1개의 세포, 2개의 세포, 약 2개의 세포 내지 약 20개의 세포, 약 2개의 세포 내지 약 25 세포의 세포 부분집단 상에서 이루어질 수 있다. 판독 입자는 세포 부분집단을 포함하는 챔버 내로 도입되며, 제2 세포외 효과 분석이 수행된다. 세포외 효과 (예: 다른 세포 군집 또는 대조군 값과 비교할 때 세포외 효과의 변화)를 보이는 세포 부분집단을 포함하는 챔버의 내용물이 추가 분석을 위해 회수된다. 본 추가 분석은 본 명세서에서 제공되는 장치 (예: 제3 세포외 효과 분석법, 단일 세포 PCR의 수행에 의해), 벤치탑 분석 (예: PCR, 차세대 서열분석) 또는 그의 조합 중 어느 하나와 함께 이루어질 수 있다.
일 실시양태에서, 개별 회수된 효과 세포는 회수된 세포로부터 클론을 얻기 위해 한계 희석법에서 복수의 세포를 복수의 세포 배양 용기에 분산시킴으로써 배양물에서 확장된다. 예를 들어, 항체 라이브러리를 발현하도록 조작된 세포주의 복수의 효과 세포가 관심있는 챔버 또는 챔버들 내에 존재하는 실시양태에서, 챔버 또는 챔버들로부터의 세포에 한계 희석법을 적용하여 챔버 또는 챔버들 내 존재했던 단일 효과 세포를 분리한다. 단일 효과 세포는 이후 각 개별 효과 세포의 클론 군집을 얻기 위해 사용된다. 1 이상의 클론 군집은 이후 분비된 항체의 특성을 측정함으로써 (예: ELISA 또는 기능 분석법에 의해) 어떤 효과 세포가 관심있는 항체를 생산하는지를 평가하기 위해 분석될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 세포는 분석 챔버로부터 회수되고, 예를 들어 한계 희석법에 의해 분리되며, 관심있는 1 이상의 유전자의 서열분석 또는 증폭 및 정제를 위한 충분한 재료, 예를 들어 항체를 코딩하는 유전자를 얻기 위해 확장된다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 분석 챔버로부터 회수되고, 예를 들어 한계 희석법에 의해 분리되어, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 역전사효소 (RT)-PCR에 의한 단일-세포 DNA 또는 mRNA 증폭에 사용되며, 이어 관심있는 1 이상의 유전자의 서열을 확인하기 위해 서열분석된다. 다른 실시양태에서, 세포외 효과를 보이는 세포 군집은 1 이상의 분석 챔버로부터 회수되며, 예를 들어 한계 희석법에 의해 분리되고, 이어 관심있는 유전자의 단일-세포 DNA 또는 mRNA 증폭에 사용되며, 이어 이들 유전자는 연이은 발현 및 분석을 위해 다른 세포 유형 내로 클로닝된다. 다른 실시양태에서, 세포 군집으로부터의 핵산은 동일한 반응에서 서열분석된다.
일 실시양태에서, 회수된 세포 군집(들) 또는 부분집단(들)은 분리되어 예를 들어 이들 (또는 회수된 세포 군집으로부터의 항체)을 동물 내로 주입함으로써 생체내 (in vivo) 분석을 위해 사용될 수 있거나 배양물 내로 확장될 수 있다.
일 실시양태에서, 세포외 효과를 보이는 세포 군집 또는 부분집단은 회수되며 (예를 들어 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나에서 제1 또는 제2 세포외 효과 분석 이후) 회수된 세포의 1 이상의 핵산은 증폭 처리된다. 증폭은, 일 실시양태에서, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), cDNA 말단의 5’-급속 증폭 (RACE), 시험관내 전사 또는 전장 전사체 증폭 (WTA)에 의해 수행된다. 추가적인 실시양태에서, 증폭은 역전사 (RT)-PCR에 의해 수행된다. RT-PCR은 단일 세포, 또는 군집 내 복수의 세포에 대한 것일 수 있다. 단일 세포로부터의 항체 유전자를 회수하기 위한 2개의 주요 접근법은 축퇴 프라이머를 이용한 RT-PCR 및 cDNA 말단 (RACE) PCR의 5' 신속한 증폭을 포함한다. 일 실시양태에서, RT-PCR법은 유전자-특이적 주형-전환 RT, 이어 세미-네스티드 PCR 및 차세대 앰플리콘 서열분석에 기초한다. 핵산 분석은 또한 모아진 세포 군집에 대하여 수행될 수 있으며, 이어 중쇄 및 경쇄 항체 짝을 확인하기 위한 생물정보 접근법이 수행될 수 있다.
세포외 효과의 변화를 보이는 확인된 효과 세포를 이용한 용도를 위한 RT-PCR 방법의 일 실시양태는 도 10에 도시되었다. 개략도는 주형 전환 역전사 및 다중화된 프라이머를 이용한 단일 세포 HV/LV 접근법을 보여준다. 본 실시양태에서, 단일 세포는 마이크로퓨즈 튜브 내에 놓아지고 cDNA가 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 표적으로 하는 다중화된 유전자-특이적 프라이머로부터 생성된다. MMLV 효소의 주형-전환 활성은 결과로 도출된 cDNA의 3’ 말단 상의 주형-전환 올리고의 역 상보를 첨가하는데 사용된다 (Huber et al. (1989). J. Biol . Chem. 264, pp. 4669-4678; Luo and Taylor (1990). J. Virology 64, pp. 4321-4328; 이들 각각은 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함됨). 중쇄 및 경쇄의 불변 영역에서의 다중화된 프라이머를 이용한 세미-네스티드 PCR (공통의 3' 프라이머 및 RT 프라이머 영역 내 위치한 다중화된 네스티드 프라이머), 및 복제된 주형 전환 올리고에 상보적인 보편적인 프라이머는 cDNA를 증폭하고 각 단일 세포 앰플리콘에 특이적인 인덱싱 서열을 도입하기 위해 사용된다. 결과로 도출된 단일 세포 앰플리콘은 모아져 서열분석된다.
경우에 따라, 회수된 세포 군집은, 미세유체 장치로부터의 회수에 이어, 단일 세포로 추가 단리되거나, 추가 분석을 위해 한계 희석법 처리되지 않는다. 예를 들어, 챔버로부터 분리된 복수의 세포가 관심있는 항체를 분비하는 세포 (예를 들어 다른 항체(들)을 분비하는 1 이상의 추가 세포 군집 내 존재함)를 포함하면, 복수의 세포는, 일 실시양태에서, 배양물에서 확장되어 바람직한 산물 (즉, 관심있는 항체)을 생성하는 복수, 하나 또는 일부의 세포 글론 군집을 생성한다. 다른 실시양태에서, 챔버로부터 회수된 복수의 세포는 용해되며 (미세유체 장치 상에서 또는 회수 이후에), 이어 용해물로부터 모아진 핵산 군집은 증폭되고, 서열분석에 의해 분석 처리된다. 이 경우, 얻어진 서열의 생물정보학 분석은 관심있는 단백질 (예를 들어, 항체)을 코딩할 가능성이 있는 서열을 다른 출처로부터의 정보를 이용하여 추측하기 위해 사용될 수 있다. 중요하게는, 본 발명에 의해 제공되는 분석 방법은 회수되는 세포의 수가 제한되므로, 많은 수의 세포를 대량 분석하는 것과 비교하여 크게 단순화된다. 이러한 제한된 수의 세포는 세포 군집 내의 게놈 정보의 복잡성을 감소시킨다.
일 실시양태에서, 복수의 세포의 증폭된 DNA 서열은 당업자에게 공지된 방법에 따라 불멸화된 세포주에서 재조합 발현되는 서열 라이브러리를 생성하는데 사용된다. 이후 상기 세포주는 관심있는 항체 유전자를 확인하기 위해 클론을 먼저 분리되어 분석될 수 있다. 경우에 따라 이러한 라이브러리를 사용하여 관심있는 단백질 복합체가 되는 유전자 조합을 스크리닝한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 유전자는 전장 항체 서열을 확인하기 위해 항체 유전자의 중쇄 및 경쇄 모두를 포함한다. 이러한 분석의 복잡성은 회수된 챔버의 세포 수가 적다는 사실 때문에 크게 감소한다. 예를 들어, 챔버에 세포외 효과를 나타내는 10개의 세포가 있는 경우, 항체 중쇄 및 경쇄 짝만 100가지가 될 수 있다. 이와 대조적으로, 대량 시료는 일반적으로 수천 가지의 서로 다른 항체 서열을 가지며 수백만 개의 가능한 쌍에 대응한다.
일부 실시양태에서, 회수된 세포는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 추가로 단리될 수 있는 상이한 세포 유형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분석 챔버가 ASC 및 섬유아세포 모두를 포함하는 경우, ASC를 유지하는데 사용되는 후자, ASC는 일 실시양태에서, 회수 후, 예를 들어 친화력 포획 방법 (affinity capture method)을 사용하여 섬유아세포로부터 분리된다.
일 실시양태에서, 1 이상의 군집 내 효과 세포가 항체 또는 세포의 성장을 저해하거나 어떤 다른 세포외 효과를 보이는 다른 생체분자를 분비하는지 여부를 결정하기 위하여, 단일 장치의 개별 챔버에 존재하는 복수의 세포 군집에 대한 분석법이 수행된다. 챔버의 내용물은 이후 예를 들어, 어떤 효과 세포가 그 효과의 원인이 되는지를 확인하기 한 효과 세포의 한계 희석법에서의 추가 분석을 위해 회수될 수 있다. 항체 서열은 또한 회수되어 당업자에게 알려진 방법에 의해 서열분석될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 본 발명의 장치는 세포 처리 및 세포 회수를 크게 용이하게 할 수 있다.
관심있는 세포외 효과를 보이는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집(들)을 확인한 후, 세포 군집(들)은, 일 실시양태에서, 한계 희석법에서, 예를 들어 개별 챔버 내 단일 세포 (또는 기타 반응 용기), 또는 개별 챔버 내 더 작은 군집 (제1 스크리닝과 비교할 때)으로서 다시 분석되어, 세포외 효과의 원인이 되는 개별 효과 세포(들)의 정체를 확인한다. 본 2단계 스크리닝 방법의 일 실시양태가 도 2에 도시된다. 세포외 효과의 원인이 되는 효과 세포(들)가 확인되면, 그 유전 정보가 증폭 및 서열분석될 수 있다.
일 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 장치 및 방법은 1 이상의 다른 세포 군집과 비교할 때 세포외 효과를 보이는 세포 군집을 확인하도록 한다. 즉, 세포외 효과 신호의 비교는 대조군 값 또는 장치 내 어떤 다른 챔버 또는 복수의 챔버에 의해 나타나는 값을 이용하여 이루어진다. 본 양태에서, 개별 세포 군집은 적어도 하나의 개별 세포 군집이 1 이상의 효과 세포를 포함하며 분리된 챔버 각각이 1 이상의 판독 입자를 각각 포함하는 판독 입자 군집을 포함하는, 장치 내 분리된 챔버에 보유된다. 세포 군집은 세포외 효과가 있는지 여부에 대해 분석되며, 이에 따라 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 세포외 효과의 판독을 제공한다. 복수 중으로부터 세포외 효과, 예를 들어, 복수 중 1 이상의 나머지 세포 군집, 또는 대조군 값과 비교할 때 상이한 효과 신호를 나타내는 세포 군집을 이후 확인할 수 있다. 세포 군집이 세포외 효과를 나타내는 것으로 확인되면, 군집은 회수되어 세포외 효과의 원인이 되는 군집 내 세포 또는 세포들을 확인하기 위한 한계 희석법에서 추가로 분석될 수 있다.
본 명세서에서 분석될 수 있는 세포 군집은 특정 유형 또는 공급원에 한정되지 않는다. 예를 들어, 일 실시양태에서 챔버 내의 개별 세포 집단으로 나누어진 세포 군집은 면역화되거나 항원에 노출된 동물로부터 분리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)일 수 있다. 세포 군집은, 다른 실시양태에서, 면역화되거나 항원에 노출된 동물로부터 분리된 B-세포이다. 세포 군집의 공급원은 면역화되었거나 항원에 노출된 동물의 전혈일 수 있다. 세포 군집은 면역화되었거나 항원에 노출된 동물의 림프 조직 또는 골수 또는 비장에서 유래한 것일 수 있다. 미경험 (naive) 레퍼토리를 고려하는 것이 바람직할 경우, 세포 군집의 공급원은 면역화되지 않았거나 항원에 노출되지 않은 동물에서 유래한 것일 수 있다.
1 이상의 효과 세포를 선택적으로 포함하는 개별 세포 군집은 각 세포 군집이 세포외 효과를 보이는 효과 세포를 포함하는지 여부 (예: 다른 세포 군집 또는 대조군 값과 비교할 때 세포외 효과의 차이)를 확인하기 위하여 분석된다. 게다가, 효과 세포를 포함하는 세포 군집은 많은 효과 세포를 포함하거나 단지 효과 세포만의 군집일 필요가 없다. 오히려, 비-효과 세포가, 본 명세서에서 기술되는 실시양태에서, 군집 내에 포함된다. 비-효과 세포는 군집의 다수 또는 소수일 수 있다. 효과 세포를 포함하는 이질적 군집은 많은 효과 세포를 포함할 필요가 없다. 오히려, 이질적인 세포 군집은 2개의 세포가 서로에 대해 이질적인 경우 이질적이다. 장치 챔버 내 세포 군집은 효과 세포가 없거나, 하나의 효과 세포 또는 복수의 효과 세포를 포함할 수 있다. 유사하게, 세포 부분집단은 효과 세포가 없거나, 하나의 효과 세포 또는 복수의 효과 세포를 포함할 수 있다.
세포외 효과는 일 실시양태에서 결합 특성 (예: 단백질 상호작용 분석 (kinetic measurement), 특이성, 친화력 등), 또는 세포 또는 세포에 의해 분비되는 생체분자, 예를 들어 항체의 어떤 다른 세포외 효과이다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 세포외 효과는 세포 표면 수용체의 작용 (agonism) 또는 길항 작용, 이온 채널의 작용 또는 길항 작용, 또는 ABC 수송체의 작용 또는 길항 작용, 세포사멸의 조절, 세포 증식의 조절, 판독 입자의 형태학적 모양의 변화, 판독 입자 내 단백질의 국재화의 변화, 판독 입자에 의한 단백질 발현, 부속 입자의 생물학적 활성의 중화, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포 용해, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포사멸, 판독 세포의 세포 괴사, 판독 세포에 의한 항체 내재화, 판독 세포에 의한 부속 입자 내재화, 효과 세포에 의한 효소 중화, 가용성 신호전달 분자의 중화, 또는 그의 조합이다.
관심있는 표적 (예: 항원)에 결합하는 생체분자 (예: 항체)를 분비하는 효과 세포의 존재 및 정체는 관심있는 표적에 특이적이지 않은 항체를 분비하는 복수의 효과 세포를 포함하는 이질적인 세포 군집 내에 효과 세포가 존재하는 실시양태에서 쉽게 확인된다. 일 실시양태에서, 이는 항체를 포획하도록 기능화된 항체 (예를 들어, 단백질 G 또는 단백질 A로 기능화된) 판독 입자(들) (예: 비드) 상의 모든 또는 실질적으로 모든 군집의 분비된 항체를 챔버 내에서 최초로 포획하고, 형광 표지된 항원을 챔버 내로 첨가하며, 고정된 항체(들)에 대한 항원의 결합으로 인한 형광의 증가의 존재 또는 비존재를 검출하기 위하여 입자(들)를 영상화하여 달성된다. 신뢰할 수 있는 검출에 필요한, 비드 상에 포획된 항체의 최소 수는 단일 세포로부터의 항체 분비를 측정하기 위한 실험을 수행함으로써 추정될 수 있다. 일 실시양태에서, 이질적 군집의 약 250개의 세포 내의 단일 ASC로부터 분비되는 항원-특이적 항체를 검출하는 것이 가능하다. 개별 반응 챔버 내에 존재하는 세포 군집은 따라서 약 2 내지 약 250개의 세포, 예를 들어 챔버 당 약 10 내지 약 100개의 세포, 또는 챔버 당 약 10 내지 약 50개의 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 챔버는 약 2 내지 약 250개의 ASC, 또는 약 2 내지 약 100개의 ASC를 포함한다. 일 실시양태에서, 장치의 챔버 중 80% 이상이 챔버는 세포 군집을 포함한다. 상술한 것과 같이, 세포 군집은 효과 세포 외의 세포를 포함할 수 있으며 모든 세포 군집이 효과 세포를 포함하는 것은 아니다. 이는 동일한 세포 유형의 대체로 순수한 세포 군집을 얻기 위해 종래 농축 프로토콜 (예: FACS)이 사용될 수 없을 때 특히 적용된다.
일 실시양태에서, 개별 세포 또는 판독 입자의 영상화가 요구되는 경우, 군집 내 세포 수는 영상화되는 챔버의 하단을 덮기에 불충분하여 영상화되는 세포가 단층으로 배열되도록 선택된다. 또는, 세포 군집은 챔버의 표면을 덮은 이중층을 형성하기에는 불충분한 많은 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 보다 큰 세포 군집은 군집 내 단일 효과 세포 또는 소수의 효과 세포로부터 유래한 세포외 효과의 검출을 저해하지 않고 단일 챔버 내 군집 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 세포 군집 내 세포수는 2 내지 약 300, 또는 약 10 내지 약 300, 또는 약 100 내지 약 300이다. 다른 실시양태에서, 세포 군집 내 세포수는 2 내지 약 250, 또는 약 10 내지 약 250, 또는 약 100 내지 약 250이다. 다른 실시양태에서, 세포 군집 내 세포수는 2 내지 약 200, 또는 약 10 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 200이다. 다른 실시양태에서, 세포 군집 내 세포수는 2 내지 약 100, 또는 약 10 내지 약 100, 또는 약 50 내지 약 100이다. 다른 실시양태에서, 세포 군집 내 세포수는 2 내지 약 90, 또는 약 10 내지 약 90, 또는 약 50 내지 약 900이다. 또 다른 실시양태에서, 세포 군집 내 세포수는 2 내지 약 80, 또는 10 내지 약 80, 또는 2 내지 약 70, 또는 약 10 내지 약 70, 또는 약 2 내지 약 60, 또는 약 10 내지 약 60, 또는 약 2 내지 약 50, 또는 약 10 내지 약 50, 또는 약 2 내지 약 40, 또는 약 10 내지 약 40, 또는 2 내지 약 30, 또는 약 10 내지 약 20, 또는 2 내지 약 10이다. 일부 실시양태에서, 세포 군집 내 대다수의 세포는 효과 세포이다.
세포 시료는, 일 실시양태에서, 수천개의 챔버 내 복수의 세포 군집으로 분리되며, 단일 챔버 내 개별 세포 군집은 세포외 효과에 대해 분석된다. 1 이상의 군집 내 효과 세포가 세포외 효과를 보이는 경우 1 이상의 개별 세포 군집은 확인되고 회수된다. 세포외 효과는 사용자에 의해 결정되며 이는 일 실시양태에서, 항원, 세포 표면 수용체, ABC 수송체 또는 이온 채널과의 결합 상호작용이다.
본 명세서에서 제공되는 방법이 결합 상호작용, 예를 들어 항원 친화력 및 특이성에 기초하여 단일 효과 세포 (단독 또는 이질적 군집 내에서)를 확인하기 위해 사용될 수 있더라도, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 오히려, 세포 군집의 확인은, 일 실시양태에서, 직접적 기능 분석법의 구현을 통해 수행된다. 본 발명은 따라서, 친화력 및 항원 표적에 대한 선택성과 같은 결합 특성에 대하여 “기능적 항체”를 초기에 스크리닝할 필요 없이 “기능적 항체”를 분비하는 세포 군집 내 ASC의 직접적 발견을 가능하게 하는 방법 및 장치를 포함한다.
이러한 맥락에서, 본 명세서에서의 방법에 의해 발견될 수 있는 기능적 항체와 수용체가 제공된다. 예를 들어, 세포외 효과의 원인이 되는 효과 세포의 핵산이 증폭되고 서열분석된다. 핵산은 분비되는 생체분자 (예: 항체, 또는 그의 단편)를 코딩하는 유전자 또는 세포 수용체 또는 그의 단편, 예를 들어 T-세포 수용체를 코딩하는 유전자이다. 항체 또는 그의 단편 또는 세포 수용체 또는 그의 단편은 당업계에 알려진 방법에 의해 클로닝되고/되거나 서열분석될 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 기능적 항체를 분비하는 ASC는 표적이 되는 세포 표면 단백질, 예를 들어 이온-채널 수용체, ABC 수송체, G-단백질 결합 수용체 (GPCR), 티로신 키나아제 수용체 (RTK) 또는 고유의 구아닐산 고리화효소 활성과 같이 고유의 효소 활성을 갖는 수용체에 결합함으로써 세포 신호전달을 조절하는 것이다.
하나 또는 복수의 효과 세포를 포함하는 세포 군집이 챔버 내에서 수행된 세포외 효과 분석법의 결과에 기초하여 챔버 내에서 확인된다. 세포외 효과가 챔버 내 세포에 기인하는 경우, 세포 군집은 효과의 원인이 되는 군집 내 효과 세포 또는 효과 세포들을 밝히기 위해 회수되고 분석된다 (예를 들어 도 2를 참조한다). 효과 세포가 항체를 분비하는 실시양태에서, ASC 또는 ASC들에 의해 생성되는 항체를 코딩하는 DNA 서열은 이후 결정되고 이어 클로닝될 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 DNA 서열은 클로닝되고 세포주에서 발현되어 추가 검증 및 전임상 시험을 위한 단일클론 항체의 불멸의 원천을 제공한다.
일 실시양태에서, 세포 군집은 표적 에피토프를 결합할 수 있는 분자 라이브러리를 발현하기 위해 유전적으로 조작된 세포, 관심있는 cDNA 라이브러리로부터 유래한 유전자 또는 유전자 단편을 발현하기 위해 유전적으로 조작된 세포, 다양한 생물학적 기능을 위한 리포터로 유전적으로 조작된 세포, 및 불멸화된 세포주 또는 일차 원천으로부터 유래한 세포의 집단을 포함한다. 단일 세포로부터 비롯된 클론은, 일 실시양태에서, 예를 들어, 유전자 침묵, 분화, 변형된 유전자 발현, 형태 변화 등으로 인해 서로에 대해 이질적이다. 게다가, 불멸화된 세포주 또는 일차 원천으로부터 유래한 세포는 단일 세포의 동일한 클론이 아니며 서로에 대해 이질적인 것으로 간주된다. 자연적으로 체세포 초돌연변이를 나타내거나 체세포 초돌연변이를 나타내도록 조작된 (예를 들어, 활성화 유도 시티딘 탈아미노효소 등의 발현을 유도함으로써) 단일 세포로부터 유래한 세포는 클론으로 간주되지 않으므로 이들 세포가 함께 존재할 경우, 이질적인 세포 군집으로 간주된다.
세포 군집(들)이 세포외 효과를 나타내는 것으로 확인되면, 일 실시양태에서, 이는 회수된 세포 군집을 얻기 위해 선택적으로 회수된다. 다수의 세포 군집이 세포외 효과를 나타내는 것으로 확인되면, 일 실시양태에서, 회수된 세포 군집을 얻기 위해 다수의 세포 군집이 회수되어 모아진다. 회수된 세포 군집은 장치에 원래 로딩된 시작 세포 군집과 비교할 때 효과 세포에 대해 농축되어, 전자가 후자와 비교하여 더 큰 비율의 효과 세포를 갖는다. 또는, 세포로부터의 핵산을 서열분석하여 항체 핵산 서열을 결정한다.
일 실시양태에서, 회수된 세포 군집의 부분집단은 제2의 세포외 효과의 존재에 대해 분석된다. 제2의 세포외 효과는 확인된 세포 군집 상에서 분석된 것과 동일한 효과 또는 상이한 세포외 효과일 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 확인된 군집의 부분집단은 각각 약 1 내지 약 10개의 세포를 포함한다. 심지어 다른 실시양태에서, 확인된 군집의 부분집단은 각각 평균 1개의 세포를 포함한다. 세포외 효과를 보이는 1 이상의 부분집단은 이후 확인되고 회수되어 일 실시양태에서, 효과 세포가 풍부한 회수된 부분집단이 얻어진다. 많은 세포 부분집단이 확인되는 경우, 일 실시양태에서, 이들은 회수되어 모아져, 회수된 세포 부분집단이 얻어진다. 회수된 세포 부분집단으로부터의 유전 정보, 예를 들어 항체 유전자 서열 또는 그의 단편은 이후 분리, 증폭되고/되거나 서열분석된다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 세포 군집은 그 원천에 의해 제한되지 않으며, 오히려 인간 또는 다른 포유류를 포함한 임의의 동물, 또는, 시험관내 조직 배양으로부터 유래될 수 있다. 세포는 직접 분석될 수 있는데, 예를 들어, 공급원에서 회수한 이후, 또는 당업계에 알려진 다양한 프로토콜, 예를 들어 유세포 분석의 사용에 의해 원하는 특성 (예를 들어 특정 항원에 결합하는 항체의 분비)을 갖는 군집의 농축 이후 직접 분석될 수 있다. 동물 공급원으로부터 회수하기 전에, 일 실시양태에서, 동물은 1 이상으로 면역화 처리된다. 일 실시양태에서, 유세포 분석은 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나에 로딩하기 전에 효과 세포를 농축하기 위해 사용되며, 유세포 분석은 형광 활성 세포 분류 (FACS)이다. 세포 군집이 효과 세포, 예를 들어 ASC를 농축하기 위해 사용되고, 개별 분석 챔버 내에 개별 세포 군집으로서 보유되는 경우, 개별 세포 군집은 전체적으로 효과 세포로 구성될 필요는 없다. 오히려 다른 세포 유형이 다수 또는 소수로 존재할 수 있다. 게다가, 1 이상의 개별 세포 군집은 효과 세포를 전혀 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치에 의한 분석을 위한 세포 군집을 풍부하게 하고 제공하기 위해 사용될 수 있는, 당업자에게 공지된 동물로부터 유래된 ASC의 농축을 위한 몇 가지 방법이 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, FACS는 표면 마커 CD19+CD20lowCD27hiCD38hi를 이용하여 인간 ASC를 농축하기 위해 사용된다 (Smith et al. (2009). Nature Protocols 4, pp. 372-384). 다른 실시양태에서, 세포 군집은 표면 마커를 나타내는 세포의 양성 또는 음성 선택에 기초한 자기 면역포획에 의해 농축된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 중 하나를 수행하기 전에 또는 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나 상에서 시작 세포 군집을 로딩하기 전에, 플라크 분석법 (Jerne et al. (1963). Science 140, p. 405), ELISPOT 분석법 (Czerkinsky et al. (1983). J. Immunol . Methods 5, pp. 109-121), 방울 (droplet) 분석법 (Powel et al. (1990). Bio/Technology 8, pp. 333-337), 세포 표면 형광-결합 면역흡착 분석법 (Yoshimoto et al. (2013), Scientific Reports 3, 1191) 또는 세포 표면 친화력 매트릭스 분석법 (Manz et al. (1995). Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 92, pp. 1921-1925)이 ASC의 농축을 위해 사용된다. 본 단락에서 인용된 각 참고문헌의 개시는 모든 목적을 위하여 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
본 명세서에서 제공되는 장치와 관련하여, 장치 상의 모든 챔버가 반드시 세포 군집 및/또는 판독 입자 군집을 포함하는 것은 아니며, 예를 들어 빈 챔버 또는 부분적으로 채워진 챔버가 존재할 수 있음을 유의하여야 한다.
일부 실시양태에서, 세포 군집 내 1 이상의 세포의 생존능 및/또는 기능을 지지하기 위하여 또는 세포외 효과 분석법을 구현하기 위하여, 분석 챔버에 존재하는 1 이상의 부속 세포를 포함할 수 있는 1 이상의 부속 입자를 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 일 실시양태에서 하나의 부속 세포, 또는 복수의 부속 세포는, 섬유아세포 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 살해 T-세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 재조합 세포, 또는 그의 조합을 포함한다.
부속 입자 또는 세포, 또는 이를 포함하는 군집은, 일 실시양태에서, 세포 군집과 함께 및/또는 판독 입자 군집과 함께 챔버로 이동한다. 일 실시양태에서, 부속 세포는 챔버로 이동되는 세포 군집의 일부이다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 세포외 효과가 분석될 세포 군집의 챔버 또는 복수의 챔버로의 로딩에 앞서, 또는 그 이후에 부속 입자(들) 또는 부속 세포(들)는 챔버로 이동된다. 세포 군집이 로딩된 이후 연속적으로 부속 입자 (예: 세포)가 챔버로 이동될 수 있다. 이동은 장치의 상단 성분 내 미세채널을 통해, 또는 직접적으로 개방 챔버에 로딩하여 일어날 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 “부속 입자”는 이에 제한되는 것은 아니나 (i) 효과 세포의 생존력 및/또는 기능을 지지하거나, (ii) 세포외 효과를 가능하게 하거나, (iii) 세포외 효과의 측정을 용이하게 하거나, (iv) 효과 세포의 세포외 효과의 검출을 용이하게 하는, 단백질, 단백질 단편, 또는 세포를 포함하는 임의의 입자를 의미한다. 따라서 부속 입자는 가용성 분자를 나타낼 수 있다.
부속 입자는 이에 제한되는 것은 아니나, 단백질, 펩티드, 성장 인자, 사이토카인, 신경 전달 물질, 지질, 인지질, 탄수화물, 대사산물, 신호전달 분자, 아미노산, 모노아민, 당단백질, 호르몬, 바이러스 입자 또는 그의 조합을 포함한다. 일 실시양태에서, 1 이상의 부속 입자는 스핑고신-1-포스페이트, 리소포스파티드산 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 효과 세포의 분비 산물이 판독 세포 또는 그의 조합에 결합되는 경우, 부속 입자는 단백질, 단백질 단편, 펩티드, 성장 인자, 사이토카인, 신경 전달 물질 (예: 신경조절물질 또는 신경펩티드), 지질, 인지질, 아미노산, 모노아민, 당단백질, 호르몬, 바이러스 입자, 또는 보체 경로 활성물질을 포함한다. 일 실시양태에서, 1 이상의 부속 입자는 스핑고신-1-포스페이트, 리소포스파티드산 또는 그의 조합와 같은 부속 분자이다.
부속 세포의 예로서, 일 실시양태에서, 섬유아세포 군집 (항체를 분비하지 않음)은 군집 내 효과 세포(들) (예: ASC(들))의 생존력을 향상시키 위해 효과 세포 (예: ASC)가 풍부한 세포 군집 내에 포함된다. 다른 실시양태에서, 항체가 표면에 결합할 때 NK 세포가 공격하여 표적 세포를 용해하는 항체-의존적 세포-매개 세포독성 분석법을 수행하기 위하여 NK 세포 군집이 부속 입자로서 첨가될 수 있다. 기능적 세포 분석법이 1 이상의 세포 군집 상에서 수행되는 실시양태에서, 1 이상의 세포 군집 내 효과 세포(들)는 미세유체 장치의 챔버 내에서 연장된 기간 동안 생존 가능한 상태로 유지될 필요가 있음이 이해될 것이다. 이를 위하여, 부속 입자 및/또는 부속 세포는, 일 실시양태에서, 1 이상의 효과 세포를 선택적으로 포함하는 세포 군집의 생존력을 지속하기 위해 사용된다. 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 부속 입자, 예를 들어 부속 세포는 판독 세포 또는 그의 군집의 생존력을 지속 또는 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 실시양태의 하나의 이점은 단일 분석 챔버 내에서 1 이상의 효과 세포의 분석 및/또는 다른 세포의 존재하에서 단일 또는 소수의 효과 세포의 분석이, 훨씬 더 많은 분석 처리량을 가능하게 한다는 것이며, 따라서 효율적으로 검출하기에는 너무 드문 원하는 효과 세포의 확인 및 선택이 가능하다. 이는 원하는 세포 유형을 풍부하게 하기 위한 제한된 방법이 있거나, 그러한 농축이 분석될 세포의 생존력의 감소와 같은 유해한 효과를 갖는 경우 유리하다.
ASC는 표면 마커에 기초한 농축의 필요 없이 확인되고 분리될 수 있다. 면역 후 PBMC로부터 분리된 B-세포에서, ASC의 빈도는 0.01% 내지 1%일 수 있다. 챔버 당 약 10 내지 100개의 세포로 1,000,000개의 챔버 어레이를 로딩함으로써 달성될 수 있는 것과 같이, 장치 당 10,000,000 내지 100,000,000개의 세포의 처리량에서, 임의의 사전 정제 없이 수천 개의 ASC를 스크리닝하는 것이 가능하다. ASC의 FACS 정제가 세포 생존력을 감소시킬 수 있기 때문에 이는 마커가 이용 가능한 경우에도 중요하다. 게다가, ASC의 농축을 위한 적절한 시약은 관심있는 숙주 종에 대해 이용할 수 없기 때문에, 추가 정제 없이 ASC를 스크리닝하는 능력은 ASC의 연구에서의 진전이다. 면역화 후, PBMC에서 항체 분비 세포의 빈도는 0.01 내지 1 % 일 수 있으므로 본 명세서에서 제공되는 장치를 사용하여 검출할 수 있다. 따라서, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 분리가 특정 포획 시약 없이 임의의 종에서 수행될 수 있기 때문에, 본 방법의 일부는 임의의 종으로부터 관심있는 항체를 분비하는 세포의 신속하고 경제적인 선택을 제공한다.
인간의 기저 수준으로부터의 ASC는, 일 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 방법 및 장치에 의해 확인된다. 대부분의 항원에 대해 새로운 항체를 생성하기 위해 동물을 면역화할 수 있지만, 승인된 백신을 제외하고는 동일한 절차를 사람에게 널리 시행할 수 없다. 그러나, 항원에 자연적으로 노출되었거나 생의 어느 시점에서 백신 접종된 사람은 일반적으로 항원에 특이적인 항체-분비 세포의 기저 수준이 낮다. 본 발명은 대규모의 세포 (예를 들어 장치 작동 당 100,000 내지 100,000,000 이상)로부터 특이적인 항체를 분비하는 매우 희귀한 효과 세포를 확인하고 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본 명세서에서 기능적 항체, 예를 들어 자기항체가 존재할 수 있는 자가면역 질환 및 암에 대한 치료제의 개발을 위해 사용된다.
전체에 걸쳐 제공된 것과 같이, 본 발명은 부분적으로, 단일 장치의 챔버 내에서 대량 병렬 방식으로 수행되는 세포외 효과 분석법에 관한 것이다. 세포 군집 내 효과 세포, 또는 복수의 효과 세포에 의해 발휘되는 세포외 효과를 측정하고 검출하는 분석법이 수행된다. 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 세포외 효과의 판독을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 방법은 세포외 효과를 발휘하지 않는 최대 약 250개의 세포 (예를 들어, 약 2 내지 약 100개의 세포, 또는 약 2 내지 약 50개의 세포)의 백그라운드 내에서, 세포외 효과, 예를 들어 원하는 항원에 특이적인 항체의 분비를 발휘하는 효과 세포를 포함하는 이질적인 세포 군집의 확인을 가능하게 한다.
일 실시양태에서, 본 명세서에서 기술된 방법이 적용되는 세포 군집은 하나의 ASC 또는 복수의 ASC를 포함하며, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 하나의 표적 에피토프 또는 복수의 표적 에피토프들을 드러낸다. 판독 입자 군집은 일 실시양태에서 에피토프 또는 에피토프들에 의해 항체를 포획하도록 기능화된 비드 군집이다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 판독 입자 군집은 항체의 Fc 영역에 특이적이며, 따라서 상이한 에피토프를 갖는 항체를 구별하지 않는다. 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은, 일 실시양태에서 예를 들어 ELISA 분석법을 수행하기 위해, 표적 에피토프를 포함하는 형광-결합된 분자로 표지된다. 형광 기반의 항체 및 사이토카인 비드 분석법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Singhal et al. (2010). Anal. Chem. 82, pp. 8671-8679, Luminex® Assays (Life Technologies), BDTM Cytometric Bead Array]을 참조한다 (이들 문헌은 전체가 참고로서 포함된다). 이들 방법은 효과 세포가 판독 입자 상에서 세포외 효과를 보이는지 여부를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
나아가, 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 장치의 개별 챔버는 챔버 내에서 시약 교환이 가능하도록 구성되어, 교차 오염이 챔버 사이에서 제거되거나 실질적으로 제거된다. 이는 각 결합 복합체를 표지하고, 이어 영상화하기 위하여, 개별 챔버 내 세포 배양뿐만 아니라, 단일 챔버 내 많은 세포외 효과, 예를 들어, 단일 챔버 내 고유의 항원 결합 작용 및/또는 다른 세포외 효과의 검출이 예를 들어, 항원 및 이차 항체의 교체에 의해 가능하도록 한다. 이러한 일련의 분석 단계에서, 각 반응은 세척 단계 이후 연속적으로 수행되므로, 동일한 형광단을 이용하여 분석이 수행될 수 있다. 또는, 상이한 형광단이 상이한 세포외 효과를 연속된 방식으로, 또는 동시에, 하나의 분석 챔버에서 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 1 이상의 종횡비 (최소 측면 치수에 대한 높이로 정의됨)를 갖는 챔버가 제조되어 실질적인 교차 오염 없이 시약을 교체할 수 있다. 일 실시양태에서, 장치의 복수의 챔버의 평균 종횡비는 약 0.6 이상, 약 0.7 이상, 약 0.8 이상, 약 0.9 이상, 약 1 이상, 약 1.5 이상, 약 2 이상, 약 2.5 이상, 약 3 이상, 약 3.5 이상, 약 4 이상, 약 4.5 이상, 약 5 이상, 약 5.5 이상, 약 6이다. 또 다른 실시양태에서, 장치의 복수의 챔버의 평균 종횡비는 약 1 이상 10 이하, 또는 약 1 이상 약 9 이하, 또는 약 1 이상 약 8 이하이다.
일 실시양태에서, 판독 입자 군집은 적어도 일부 판독 세포가 표면 상에 표적 에피토프를 드러내는 판독 세포 군집이다. 일 실시양태에서, 판독 세포 군집, 또는 그의 부분집단은 살아있으며 독자 생존이 가능하다. 다른 실시양태에서, 판독 세포 군집 또는 그의 부분집단은 고정된다. 위의 논의로부터 알 수 있듯이, 항체 결합이 분석되는 경우, “항체 결합”은 효과 세포 또는 복수의 효과 세포의 세포외 효과로 간주된다. 항체 결합은 예를 들어, 세포를 1 이상의 형광 표지된 이차 항체로 염색하여 검출할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항체의 판독 입자 또는 판독 세포 상의 표적 에피토프에 대한 결합은 판독 세포의 사멸, 또는 본 명세서에서 논의된 것과 같은 어떤 다른 판독 세포 반응 (예: 생체분자의 분비, 세포 신호전달 경로의 활성화 또는 저해)을 유발한다.
판독 세포는 예를 들어 형태, 크기, 표면 부착성, 운동성 및 형광 반응과 같은 특징에 의해 구별될 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 판독 세포가 반응을 나타내는지를 결정하기 위해 판독 세포의 군집은 그 표면 또는 세포 내에서 표지된다. 예를 들어, 칼세인, 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 리포터 (CFSE), 또는 GFP/YFP/RFP 리포터는 세포외 수용체와 세포내 단백질 및 기타 생체분자를 포함하여 1 이상의 리포터 세포를 표지하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 판독 입자 군집은 이질적인 판독 입자 군집, 예를 들어 이질적인 판독 세포 군집이다. 예를 들어, ASC 또는 복수의 ASC가 세포 군집에 존재하는 경우, 군집 내의 개별 판독 입자는 상이한 표적 에피토프를 나타낼 수 있거나, 2개의 상이한 세포 수용체 (예를 들어, 2 이상의 GPCR 등과 같은 다수 종의 상이한 클래스를 포함하는, GPCR 또는 RTK 또는 이온 채널 또는 조합)를 나타낼 수 있다. 이에 따라, 세포외 효과의 특이성, 예를 들어 표적 에피토프에 대한 항체의 특이성 또는 특정 세포 표면 수용체의 저해가 평가될 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 군집 내의 효과 세포는 ASC이고, 판독 입자 군집은 모든 항체를 비선택적으로 포획하는 (예를 들어, Fc 영역 특이적인) 이질적인 비드 군집 및 독특한 표적 에피토프에 특이적인 비드 군집을 포함한다.
일 실시양태에서, 부속 입자는 세포외 효과의 판독 및/또는 측정을 용이하게 하기 위해 제공된다. 전반적으로 기술된 것과 같이, 세포외 효과는 효과 세포 분비 산물 (예: 항체)에 의해 나타나는 효과를 포함한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 판독 세포의 용해 측정을 용이하게 하기 위해 NK 세포가 부속 입자로 제공된다. 본 실시양태에서, 세포외 효과는 효과 세포에 의해 분비된 항체가 상기 판독 세포에 결합할 때 NK 세포에 의해 특정 에피토프 또는 세포 수용체에 결합하는 판독 세포의 용해를 포함한다.
일 실시양태에서, 1 이상의 사이토카인이 부속 입자로서 사용된다. 부속 입자로 사용될 수 있는 사이토카인의 예는 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인, 종양 괴사 인자를 포함한다. 일부 실시양태에서 부속 분자는 판독 세포에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 부속 입자로 사용되며 하기 표 1에 제공되는 1 이상의 사이토카인이다. 다른 실시양태에서, 1 이상의 하기 사이토카인은 부속 입자로 사용된다: 인터루킨 (IL)-1α, IL-1β, IL-1RA, IL18, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL17, IL-18, IL-19, IL-20, 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-집락 자극 인자 (GM-CSF), 백혈병 억제 인자, 온코스타틴 M, 인터페론 (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, CD154, 림포톡신 베타 (LTB), 종양 괴사 인자 (TNF)-α, TNF-β, 전환 성장 인자 (TGF)-β의 다양한 동형, 에리트로포에틴, 거핵구 성장 및 발달 인자 (MGDF), Fms-관련 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt-3L), 줄기 세포 인자, 집락 촉진 인자-1 (CSF-1), 대식세포 자극 인자, 4-1BB 리간드, 증식-유도 리간드 (APRIL), 분화 집단 70 (CD70), 분화 집단 153 (CD153), 분화 집단 178 (CD17)8, 글루코코르티코이드 유발 TNF 수용체 리간드 (GITRL), LIGHT (TNF 리간드 수퍼패밀리 멤버 14, HVEM 리간드, CD258로도 언급됨), OX40L (CD252로도 언급되며 CD134에 대한 리간드이다), TALL-1, TNF 관련 세포사멸 유발 리간드 (TRAIL), 세포사멸의 종양 괴사 인자 약한 유도자 (TWEAK), TNF-관련 활성화-유발 사이토카인 (TRANCE) 또는 그의 조합.
대표적인 사이토카인 및 그들의 수용체.
이름 동의어(들) 아미노산 염색체 분자량 사이토카인 수용체(들)(Da) 및 형태 수용체 위치(들)
인터루킨
IL-1α 헤마토포이에틴-1 271 2q14 30606 CD121a, CDw121b 2q12, 2q12-q22
IL-1β 카타볼린 269 2q14 20747 CD121a, CDw121b 2q12,2q12-q22
IL-1RA IL-1 수용체 안타아고니스트 177 2q14.2 20055 CD121a 2q12
IL-18 인터페론-γ 유도 인자 193 11q22.2-q22.3 22326 IL-18Rα, β 2q12
공통 g 사슬 (CD132) 　 　 　 　 　 　
IL-2 T-세포 성장 인자 153 4q26-q27 17628 CD25, 122,132 10p15-p14, 22q13.1, Xq13.1
IL-4 BSF-1 153 5q31.1 17492 CD124,213a13, 132 16p11.2-12.1, X, Xq13.1
IL-7 　 177 8q12-q13 20186 CD127, 132 5p13, Xq13.1
IL-9 T-세포 성장 인자 P40 144 5q31.1 15909 IL-9R, CD132 Xq28 또는 Yq12, Xq13.1
IL-13 P600 132 5q31.1 14319 CD213a1, 213a2, X, Xq13.1-q28,
CD1243, 132 16p11.2-12.1, Xq13.1
IL-15 　 162 4q31 18086 IL-15Ra, CD122, 132 10p14-p14, 22q13.1, Xq13.1
공통 b 사슬 (CD131) 　 　 　 　 　 　
IL-3 다분화능 CSF, MCGF 152 5q31.1 17233 CD123, CDw131 Xp22.3 또는 Yp11.3, 22q13.1
IL-5 BCDF-1 134 5q31.1 15238, 호모다이머 CDw125, 131 3p26-p24, 22q13.1
또한 관련됨
GM-CSF CSF-2 144 5q31.1 16295 CD116, CDw131 Xp22.32 또는 Yp11.2, 22q13.1
IL-6-유사 　 　 　 　 　 　
IL-6 IFN-βBSF-2 212 7p21 23718 CD126, 130 1q21, 5q11
IL-11 AGIF 199 19q13.3-13.4 21429 IL-11Ra, CD130 9p13, 5q11
또한 관련됨
G-CSF CSF-3 207 17q11.2-q12 21781 CD114 1p35-p34.3
IL-12 NK 세포 자극 인자 219/328 3p12-p13.2/ 24844/37169 CD212 19p13.1, 1p31.2
　 　 　 5q31.1-q33.1 헤테로다이머 　 　
LIF 백혈병 억제 인자 202 22q12.1-q12.2 22008 LIFR, CD130 5p13-p12
OSM 온코스타틴 M 252 22q12.1-q12.2 28484 OSMR, CD130 5p15.2-5p12
IL-10-유사 　 　 　 　 　 　
IL-10 CSIF 178 1q31-q32 20517, 호모다이머 CDw210 11q23
IL-20 　 176 2q32.2 20437 IL-20Rα, β ?
기타 　 　 　 　 　 　
IL-14 HMW-BCGF 498 1 54759 IL-14R ?
IL-16 LCF 631 15q24 66694, 호모테트라머 CD4 12pter-p12
IL-17 CTLA-8 155 2q31 17504, 호모다이머 CDw217 22q11.1
인터페론 　 　 　 　 　 　
IFN-α 　 189 9p22 21781 CD118 21q22.11
IFN-β 　 187 9p21 22294 CD118 21q22.11
IFN-γ 　 166 12q14 19348, 호모다이머 CDw119 6q23-q24
TNF 　 　 　 　 　 　
CD154 CD40L, TRAP 261 Xq26 29273, 호모트리머 CD40 20q12-q13.2
LT-β 　 244 6p21.3 25390, 헤테로트리머 LTβ 12p13
TNF-α 카켁틴 233 6p21.3 25644, 호모트리머 CD120a, b 12p13.2, 1p36.3-p36.2
TNF-β LT-α 205 6p21.3 22297, 헤테로트리머 CD120a, b 12p13.2, 1p36.3-p36.2
4-1BBL 　 254 19p13.3 26624, 트리머? CDw137 (4-1BB) 1p36
APRIL TALL-2 250 17p13.1 27433, 트리머? BCMA, TACI 16p13.1, 17p11.2
CD70 CD27L 193 19p13 21146, 트리머? CD27 12p13
CD153 CD30L 234 9q33 26017, 트리머? CD30 1p36
CD178 FasL 281 1q23 31485, 트리머? CD95 (Fas) 10q24.1
GITRL 　 177 1q23 20307, 트리머? GITR 1p36.3
LIGHT 　 240 16p11.2 26351, 트리머? LTbR, HVEM 12p13, 1p36.3-p36.2
OX40L 　 183 1q25 21050, 트리머? OX40 1p36
TALL-1 　 285 13q32-q34 31222, 트리머? BCMA, TACI 16p13.1, 17p11.2
TRAIL Apo2L 281 3q26 32509, 트리머? TRAILR1-4 8p21
TWEAK Apo3L 249 17p13.3 27216, 트리머? Apo3 1p36.2
TRANCE OPGL 317 13q14 35478, 트리머? RANK, OPG 18q22.1, 8q24
TGF -β 　 　 　 　 　 　
TGF-β1 TGF-β 390 19q13.1 44341, 호모다이머 TGF-β 9q22
TGF-β2 　 414 1q41 47747, 호모다이머 TGF-β 3p22
TGF-β3 　 412 14q24 47328, 호모다이머 TGF-β 1p33-p32
다양한 헤마토포이에틴 　 　 　 　 　 　
Epo 에리트로포에틴 193 7q21 21306 EpoR 19p13.3-p13.2
Tpo MGDF 353 3q26.3-q27 37822 TpoR 1p34
Flt-3L 　 235 19q13.1 26416 Flt-3 13q12
SCF 줄기 세포 인자, c-kit 리간드 273 12q22 30898, 호모다이머 CD117 4q11-q12
M-CSF CSF-1 554 1p21-p13 60119, 호모다이머 CD115 5q33-q35
MSP 대식세포 자극 인자, MST-1 711 3p21 80379 CDw136 3p21.3
문헌 [Cytokines , Chemokines and Their Receptors. Madame Curie Bioscience Database. (Landes Biosceince)]으로부터 편집함
일 실시양태에서, 부속 입자는 사이토카인 또는 판독 세포의 반응을 자극하도록 작동할 수 있는 기타 인자이다. 예를 들어, 판독 세포는 효과 세포 또는 이의 다수와 함께 인큐베이션 될 수 있고, 판독 세포에 영향을 줄 수 있는 사이토카인으로 펄스될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 판독 입자에 영향을 줄 수 있는 사이토카인-분비 세포가 부속 세포로서 챔버에 제공된다. 효과 세포 분비물에 의한 분비된 사이토카인의 중화는, 일 실시양태에서, 판독 세포에 대한 사이토카인의 예상된 효과의 부재에 의해 검출된다. 다른 실시양태에서, 부속 입자가 제공되며 1 이상의 판독 세포를 감염시키도록 작동 가능한 바이러스이고, 바이러스의 중화는 바이러스에 의한 판독 세포의 감소된 감염으로서 검출된다.
본 명세서에서 기술된 것과 같이, 일 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치로 식별 가능한 세포외 효과는 기능적 효과이다. 기능적 효과는, 일 실시양태에서 세포사멸, 세포 증식의 조절, 판독 입자의 형태학적 외관의 변화, 다수의 판독 입자의 응집체에서의 변화, 판독 입자 내의 단백질의 국재화의 변화, 판독 입자에 의한 단백질의 발현, 판독 입자에 의한 단백질의 분비, 세포 신호전달 캐스케이드의 촉발, 효과 세포에 의해 분비된 분자의 판독 세포 내재화, 또는 판독 입자에 영향을 줄 수 있는 부속 입자의 중화이다.
세포 군집을 포함하는 챔버에서 세포외 효과가 확인되면, 그 군집은 회수되며 어떤 효과 세포(들)가 측정된 세포외 효과의 원인이 되는지 결정하기 위해 회수된 세포 군집의 부분 집단에 대해 다운스트림 분석을 수행할 수 있다. 또는, 회수된 군집을 서열분석하여 군집 내의 효과 세포(들)의 항체 서열을 결정할 수 있다. 다운스트림 분석은, 일 실시양태에서, 제1 세포외 효과 분석법과 동일한 장치에서 수행된다. 그러나, 다른 실시양태에서, 다운스트림 분석은 장치, 예를 들어, 벤치탑 단일 세포 역전사효소 (RT)-PCR 반응에서 수행된다. 일 실시양태에서, 확인되고 회수된 효과 세포의 항체 유전자 서열을 분리, 클로닝 및 발현시켜 신규한 기능성 항체를 제공한다
단일 ASC의 기능적 세포외 효과가 본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치에 의해 측정될 수 있더라도, 친화력, 결합 및 특이성은 또한 효과 세포의 “세포외 효과”, 예를 들어 효과 세포 분비 산물의 효과로서 측정될 수 있다. 예를 들어, ASC가 특정 표적에 결합하는 항체를 분비하는지 여부를 결정하기 위하여, 문헌 [Dierks et al. (2009). Anal. Biochem . 386, pp. 30-35, 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨]에 의해 제공되는 결합 분석법이 본 명세서에서 제공되는 장치에서 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포외 효과는 친화력 또는 항원에 대한 결합 동역학 (binding kinetics)이며, 문헌 [Singhal et al. (2010). Anal. Chem. 82, pp. 8671-8679, 모든 목적을 위해 본 명세서에서 참고로서 포함됨]에 의해 기술된 방법은 세포외 효과를 분석하기 위해 사용된다.
일 실시양태에서, 많은 세포외 효과의 병렬 분석이 많은 종류의 판독 입자를 이용함으로써 하나의 챔버 내에서 수행된다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 단일 미세유체 장치 상의 많은 기능적 효과의 병렬 분석이 상이한 판독 입자를 이용함으로써 적어도 2개의 상이한 챔버 내에서 수행된다.
판독 입자는, 일부 실시양태에서, 분자, 예를 들어 효소이다. 일 실시양태에서, 판독 입자는 가용성 분자로서 존재하거나 챔버 표면 또는 챔버 내 다른 물리적 지지체에 묶여 있는 효소이다. 이 경우, 판독 입자의 효소 활성을 저해하는 항체의 결합은, 일 실시양태에서, 형광 신호 또는 색도 신호 또는 침전 반응을 포함하여 효소 활성에 대해 보고하는 감소된 신호에 의해 검출된다.
일 실시양태에서, 세포 군집 내 하나의 효과 세포 또는 많은 효과 세포가 세포외 효과를 보이는지 여부를 결정하는 것은 세포 군집을 포함하는 분석 챔버의 광 및/또는 형광 현미경 검사의 사용을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시양태는 현미경 검사에 의해 입자의 영상화를 용이하게 하기 위해 단일 평면 내에 판독 입자 군집을 유지하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 챔버 내의 판독 입자 군집은 챔버의 하나 또는 다수의 고해상도 영상을 생성하기 위해 장치 재료 또는 그 일부 (예를 들어, 유리 또는 PDMS)를 통해 영상화되는 단일 평면 내에 유지된다. 일 실시양태에서, 고해상도 영상은 비교 가능한 광학 기기 (렌즈 및 대물 렌즈, 조명 및 콘트라스트 기작 등)와 함께 표준 현미경 검사 형식을 사용하여 달성되는 것과 비교 가능한 영상이다.
세포 군집 및 판독 입자 군집은 챔버에 동시에 로딩될 수 있다 (예를 들어, 상이하거나 동일한 용액 내에서 챔버에 직접적으로 로딩됨으로써, 예를 들어, 액체 컬럼에 의해 생성된 정수압에 의해, 피펫과 같은 분배 기구를 이용하여 유동을 생성함으로써, 또는 하단 성분의 위에 있는 배지를 교체하고 상단 성분 또는 하단 성분을 위아래로 이동시켜 미세챔버로의 유체 전달을 일으킴으로써). 또는, 효과 세포 및 판독 입자는 챔버 내로 순차적으로 로딩된다. 당업자는 챔버로 판독 입자(들)을 로딩하기 전에 (또는 로딩한 후에) 세포 군집이 챔버에 제공될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 판독 입자 군집 및 세포 군집은 혼합물로서 함께 제공될 수 있다. 부속 입자와 마찬가지로, 판독 입자는 장치의 하단 성분, 즉 개방 챔버에 직접적으로 또는 장치의 상단 성분 내의 채널을 통해 로딩될 수 있다. 이와 같이, 장치 구조는 로딩이 수행되는 방법을 좌우한다.
실시양태들에서, 개별 판독 입자 군집 및 세포 군집은 장치의 단일 챔버 내에 보유된다. 일 실시양태에서, 챔버는 예를 들어 챔버들 사이의 오염을 최소화하기 위해, 개별 세포 군집 및 판독 입자 군집을 또한 포함하는 장치의 다른 챔버로부터 실질적으로 분리된다. 분리는 유체 구조의 유무에 관계없이 발생할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 장치의 상단 성분은 그 아래에 얇은 막이 있는 제어 채널을 포함할 수 있다. 챔버를 연결하는 하단층 채널과 함께 마련되면 밸브가 작동될 수 있다. 또는, 하단 면에 개방 채널 구조가 있고 상단에 제어 선이 있는 "푸시 다운" 기하학적 구조로 상단 성분을 설정할 수 있다.
그러나, 본 명세서에서 제공되는 방법을 실시하기 위해 완전한 분리가 반드시 필요한 것은 아니다. 일 실시양태에서, 분리가 요구되는 경우, 분리는 유체 분리를 포함하며, 챔버의 유체 분리는 예를 들어 전환가능한 장치 (예를 들어 도 6 참조)를 사용하여 이들을 물리적으로 밀폐함으로써 달성된다. 그러나, 분리는, 다른 실시양태에서, 대류 또는 확산에 의해 장치의 한 챔버와 다른 챔버 사이의 오염을 방지하기 위해 챔버들 사이의 유체 커뮤니케이션을 제한함으로써, 챔버를 물리적으로 밀봉하지 않고서 달성된다. 예를 들어, 챔버의 기하학적 구조 (예를 들어, 특정 종횡비)는 챔버들 간의 대류 이동을 억제하고, 동일한 챔버 내의 효과 세포와 판독 입자 사이의 거리가 임의의 다른 챔버 내 효과 세포와 판독 입자 사이의 거리보다 훨씬 작도록 선택될 수 있으며, 이로 인해 임의의 정해진 챔버에서 판독 입자 상의 분비 분자의 확산 및 축적이 그 챔버 내의 효과 세포로부터 우세하게 되도록 보장된다.
세포외 효과 분석을 수행하기 위해, 1 이상의 효과 세포를 선택적으로 포함하는 세포 군집, 및 판독 입자 군집을 챔버 내에서 함께 인큐베이션 하고, 이들 인큐베이션을 각 장치 내에서 대량 병렬 방식으로 수행한다. 예를 들어 부속물 입자와 같은 성분이 챔버에 첨가되면 부가적인 인큐베이션 단계(들)가 일어날 수 있으며, 초기 인큐베이션 단계가 판독 입자를 첨가하기 전에 및/또는 판독 입자가 세포 군집을 포함하는 챔버에 첨가된 후에 일어날 수 있음이 이해될 것이다.
예를 들어, 인큐베이션 단계는 세포 군집을 건강하게 유지하기 위한 배지 교환 및/또는 세포 세척 단계를 포함할 수 있다. 인큐베이션은 또한 세포외 효과 분석을 수행하기 위해 사용되는 부속 입자 (예: 부속 분자)의 첨가를 포함할 수 있다.
배양 단계는, 일 실시양태에서, 세포 생존력 (효과 세포, 부속 세포 또는 판독 세포)을 유지하고/유지하거나 분비, 표면 마커 발현, 유전자 발현, 신호전달 기작 등과 같은 챔버 내 세포의 1 이상의 기능적 특성을 유지하기 위하여 챔버의 1 이상의 특성, 예를 들어 습도, 온도 및/또는 pH를 제어하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 배양 단계는 관류 유체를 챔버 또는 복수의 챔버를 통해, 또는 그 위로 (예를 들어, 챔버 표면 위로) 유입시키는 단계를 포함한다. 관류 유체는 챔버 내의 효과 세포 및/또는 판독 세포의 유형에 따라 선택된다. 예를 들어, 관류액은 일 실시양태에서, 예를 들어, 고갈된 산소를 보충하거나 폐기물을 제거하거나, 예를 들어 필수 사이토카인을 보충하기 위해 세포 상태를 유지하거나, 예를 들어 형광 검출 시약을 추가하기 위해 원하는 효과를 분석하는데 도움을 주기 위해 세포 생존력을 유지하도록 선택된다. 관류는 또한 예를 들어 다수의 세포외 효과를 연속적으로 분석하기 위해 시약을 교환하는데 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포 군집을 인큐베이팅 하는 단계는, 판독 입자 (예를 들어, 판독 세포)의 세포 반응을 유도하기 위해 하나의 챔버 또는 복수의 챔버를 통해 또는 그 위로 (예를 들어, 챔버 표면 위로) 관류 유체를 유입시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 인큐베이팅 단계는, 일 실시양태에서 신호전달 사이토카인을 포함하는 유체를 세포 군집을 포함하는 챔버에 첨가하는 것을 포함한다. 인큐베이팅 단계는 주기적, 연속적 또는 그의 조합일 수 있다. 예를 들어, 분석 챔버 또는 챔버에 관류 유체를 흐르게하는 것은 주기적으로 또는 연속적으로 또는 이들의 조합이다. 일 실시양태에서, 인큐베이팅 액체의 유동은 예를 들어 압축 공기, 주사기 펌프 또는 중력을 사용하여 유동을 조절함으로써 압력 구동된다.
장치 내의 개별 챔버에 세포 군집 및 판독 입자 군집이 제공되면, 군집 내의 세포가 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단에 세포외 효과를 나타내는지 여부를 결정하는 방법이 수행된다. 세포 군집 및 판독 입자 군집 및/또는 그의 부분집단은, 적절하게, 이후 조사되어 군집 내 세포(들)가 세포외 효과를 나타내는지 여부를 결정한다. 챔버 내에서 효과의 존재가 감지되는 한, 세포외 효과를 나타내는 특정 세포 또는 세포들이 챔버 내에서 확인될 필요는 없다. 일 실시양태에서, 세포 군집이 세포외 효과를 나타내는 것으로 확인되면, 세포 군집을 회수하여 세포외 효과의 원인이 되는 특정 효과 세포(들)를 확인한다. 다른 실시양태에서, 세포 군집이 세포외 효과 (예를 들어, 다른 세포 군집 또는 대조군 값과 비교한 세포외 효과의 변화)를 나타내는 것으로 확인되면, 이는 회수되고 세포 군집으로부터의 핵산은 증폭되어 서열분석된다.
세포외 효과는, 일 실시양태에서, 효과 세포(들) 및 판독 입자, 예를 들어 비드 또는 세포에 의해 생성된 단백질 (예: 항체 또는 그의 단편) 간의 결합 상호 작용이다. 일 실시양태에서, 군집 내 1 이상의 효과 세포는 항체 분비 세포 (ASC)이며, 판독 입자는 표적 에피토프를 갖는 항원을 포함한다. 세포외 효과는, 일 실시양태에서, 대조군 수준 또는 세포의 제2 군집에 의해 나타나는 수준과 비교할 때 항원에 대한 차등적인 결합이다. 또는, 세포외 효과의 변화는 특정 항원에 대해 조절된 친화력을 갖는 항체를 분비하는 효과 세포의 존재이다. 즉, 결합 상호작용은 1 이상의 항원-항체 결합 특이성, 항원-항체 결합 친화성, 및 항원-항체 결합 동역학의 척도이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 세포외 효과는 세포사멸의 조절, 세포 증식의 조절, 판독 입자의 형태학적 모양의 변화, 판독 입자 내 단백질의 국재화의 변화, 판독 입자에 의한 단백질 발현, 부속 입자의 생물학적 활성의 중화, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포 용해, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포사멸, 판독 세포 괴사, 항체 내재화, 부속 입자 내재화, 효과 세포에 의한 효소 중화, 가용성 신호전달 분자의 중화 또는 그의 조합이다.
다수의 판독 입자는 형광단 유형, 다양한 수준의 형광 강도, 형태, 크기 및 표면 염색과 같은 각각의 판독 입자에 고유한 1 이상의 특성에 의해 구별될 수 있다.
효과 세포(들)를 포함하는 세포 군집과 함께 인큐베이팅 되면, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 세포 군집 내의 1 이상의 효과 세포가 1 이상의 판독 입자에 대해 세포외 효과 (예를 들어 다른 세포 군집 또는 대조군 값과 비교한 세포외 효과의 변화)를 나타내는지, 직접적 또는 간접적인지를 결정하기 위해 조사된다. 효과를 나타내는 것으로 세포 군집이 확인된 후, 이들은 다운스트림 분석을 위해 회수된다. 전반적으로 제공된 것과 같이, 세포외 효과의 존재가 분석 챔버 내에서 검출되는 한, 1 이상의 판독 입자에 세포외 효과를 나타내는 특정 효과 세포(들)가 확인될 필요는 없다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 효과 세포는 생체 분자, 예를 들어, 항체를 분비하며, 분비된 생체분자의 세포외 효과는 세포외 효과를 나타내는 세포 군집을 검출하기 위해 판독 입자 또는 복수의 판독 입자 (예를 들어, 판독 세포) 상에서 평가된다. 다른 실시양태에서, 세포외 효과는 T-세포 수용체의 효과, 예를 들어, 항원에 결합하는 효과이다.
일 실시양태에서, 판독 입자 군집은 cDNA 라이브러리를 발현하도록 조작된 세포를 포함하는 이질적 군집의 판독 세포이며, 이로 의해 cDNA 라이브러리는 복수의 세포 표면 단백질을 코딩한다. 이들 세포에 대한 항체의 결합은 표적 에피토프에 결합하는 항체를 분비하는 세포를 회수하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 1 이상의 판독 입자는 표적 항원을 표시 또는 발현하는 판독 세포를 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 자연 살해 세포 또는 이의 복수는 측정되는 세포외 효과 (용해)를 촉진하는 부속 세포(들)로서 챔버에 제공된다. 부속 세포는 판독 입자(들)가 로딩되기 전에 또는 판독 입자(들)가 챔버에 로딩된 후에 세포 군집, 판독 입자(들)로 챔버에 제공될 수 있다. 자연 살해 세포가 사용되는 일 실시양태에서, 자연 살해 세포는 효과 세포에 의해 생산된 항체가 결합된 1 이상의 판독 세포를 표적으로 한다. 세포외 효과는 따라서 자연 살해 세포에 의한 1 이상의 판독 세포의 용해를 포함할 수 있다. 용해는 생존 염료, 막 보전 염료, 형광 염료의 방출, 효소 분석법 등에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포외 효과는 판독 입자, 예를 들어 적어도 하나의 판독 세포의 반응을 자극하도록 하는 사이토카인 (부속 입자)에 영향을 줄 수 있는 부속 입자 (또는 부속 시약)의 중화이다. 예를 들어, 판독 입자 세포에 영향을 줄 수 있는 사이토카인-분비 세포가 챔버에 추가로 제공될 수 있다. 분비된 사이토카인의 효과 세포에 의한 중화는 판독 세포에 대한 사이토카인의 예상되는 효과, 예를 들어 증식의 부재로서 검출될 수 있다. 다른 실시양태에서, 부속 입자는 판독 세포(들)를 감염시킬 수 있는 바이러스이고, 바이러스의 중화는 바이러스에 의한 판독 세포의 감소된 감염으로서 검출된다.
일부 실시양태에서, 하나의 효과 세포의 세포외 효과는 제2 효과 세포의 활성화 (예를 들어, 제2 효과 세포에 의한 항체 또는 사이토카인의 분비)를 유도하며, 이는 이후 적어도 하나의 판독 세포에서 반응을 이끌어 낼 수 있다.
일 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나의 챔버 내 분리된 세포 군집은 단일클론 항체를 분비하는 ASC를 포함한다. 일 실시양태에서, 판독 비드 기반 분석법은 항체를 분비하지 않는 1 이상의 추가 세포의 백그라운드 하에 항체를 분비하는 ASC의 존재를 검출하는 방법에서 사용된다. 예를 들어, 비드 기반 분석법은 일 실시양태에서, 관심있는 표적 에피토프에 결합하지 않은 항체를 분비하는 1 이상의 추가적인 ASC의 존재 하에서 그 항체가 관심있는 표적 에피토프에 결합하는, 세포 군집 내에서 ASC를 검출하는 방법에서 이용된다.
다른 실시양태에서, 항체가 표적 세포에 특이적으로 결합하는 능력이 평가된다. 도 11을 참조하면, 분석법은 적어도 하나의 효과 세포(182) (ASC)에 더하여 적어도 2개의 판독 입자, 예를 들어 판독 세포(181 및 186)를 포함한다. 판독 세포(181)는 그 표면 상에 (자연적으로 또는 유전 공학을 통해) 공지된 관심있는 표적 에피토프, 즉 표적 에피토프(183)를 발현하는 반면, 판독 세포(186)는 그렇지 않다. 2가지 유형의 판독 세포(181 및 186)는 구별 가능한 형광 마커, 다른 착색제 또는 형태에 의해 그들 자신 및 효과 세포(182)로부터 구별될 수 있다. 효과 세포(182)는 동일한 챔버에서 판독 세포(181 및 186)로서 항체(184)를 분비한다. 효과 세포(182)에 의해 분비된 항체(184)는 표적 에피토프(183)를 통해 판독 세포(181)에 결합하나, 판독 세포(186)에는 결합하지 않는다. 항체(184)의 판독 세포(181)에 대한 선택적 결합을 검출하기 위해 이차 항체가 사용된다. 분석 챔버는 이후 판독 세포(181) 및/또는 판독 세포(186)에 대한 항체(184) 결합이 나타나는지 여부를 확인하기 위해 영상화된다.
이러한 분석법은 고해상도 현미경을 사용하여 판독 세포(들) 상의 또는 내부에 결합하는 항체의 위치를 평가하는데 또한 사용될 수 있다. 본 실시양태에서, 판독 입자는 결합 특이성 및/또는 국재화를 평가하기 위해 상이한 방식 (예를 들어 투과성 및 고정에 의해)으로 제조된 상이한 입자 유형 (예: 세포 유형) 또는 입자/세포를 포함한다. 예를 들어, 분석법은 살아있는 세포에서 표적의 자연적 형태와 고정된 세포에서 변성된 형태에 결합하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 분석법은 대안적으로, 상이한 차단된 에피토프를 갖는 상이한 군집의 판독 입자를 갖는, 공지된 에피토프에 대한 항체로 분자의 다른 부분을 먼저 차단함으로써 표적 분자상의 에피토프의 위치를 결정하는데 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 적어도 하나의 개별 세포 군집이 효과 세포 (예: ASC)를 포함하는 개별 이질적인 판독 입자 군집 (예: 악성 및 정상 세포를 포함하는 판독 세포 군집) 및 개별 세포 군집은, 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나의 복수의 분석 챔버 (예: 1000개 이상의 챔버)에 제공된다. 예를 들어, 도 12를 참조하면, 판독 세포 집단 내의 1 이상의 악성 판독 세포(425)에의 결합 및 건강한 판독 세포(426)에 대한 결합 부재는 관심있는 항체를 생산하는 1 이상의 효과 세포, 즉, 군집 내 1 이상의 악성 세포에 특이적인 항체(428)를 생산하는 효과 세포(427)를 포함하는 세포 군집을 확인하는데 사용된다. 챔버 내의 2 가지 유형의 판독 세포(425 및426)는 적어도 하나의 특성, 예를 들어 형광, 다양한 수준의 형광 세기, 형태, 크기, 표면 염색, 분석 챔버 내의 위치에 의해 구별될 수 있다. 이어서, 세포를 개별 챔버 내에서 인큐베이팅 하고, 1 이상의 챔버가 세포외 효과를 나타내는 세포 집단을 포함하는지 여부, 즉 악성 판독 세포에 결합하지만 건강한 판독 세포에는 결합하지 않는 항체를 확인하기 위해 영상화한다.
존재하는 경우, 악성 판독 세포(425)에는 결합하지만 건강한 판독 세포(426)에는 결합하지 않는 항체를 분비하는 1 이상의 ASC를 포함하는 세포 군집이 회수되어, 챔버 내 항체의 서열을 찾거나 군집 내의 개별 세포에 대해 다른 다운스트림 분석, 예를 들어, 군집 중 어느 ASC가 원하는 결합 특성을 갖는지를 결정하는 분석을 수행할 수 있다. 이에 따라, 본 명세서에서 기술되는 1 이상의 방법에 의해 개발된 신규한 기능적 항체가 제공된다. 악성 판독 세포(425) 상의 에피토프는 알려지거나 알려지지 않을 수 있다.
일 실시양태에서, 단일 세포 유형은 효과 세포 및 판독 세포로서 제공될 수 있다. 도 13을 참조하면, 상기 분석은, 예를 들어 표면 마커 및 관심있는 분자(432)에 대한 테트라머 항체(433), 또는 비오틴 부착된 항체에 결합하는 세포에 대한 친화력-매트릭스를 이용하여, 그들 표면 상에 관심있는 분자(432)를 포획하도록 기능화된 효과 세포(430) 및 판독 세포(431)를 이용하여 수행된다. 도 14를 참조하면, 테트라머 항체 복합체는 세포에 결합하는 항체 (A)(435) 및 세포로부터 분비된 항체에 결합하는 항체 (B)(436)로 이루어지며, 항체 A 및 B는 항체 A 및 B의 Fc 영역에 결합하는 2개의 항체(437)에 의해 연결된다. 이러한 테트라머 항체 복합체는 해당 기술분야에서 기술되어 왔으며 (Lansdorp et al. (1986). European Journal of Immunology 16, pp. 679-683, 모든 목적을 위해 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨) 상업적으로 입수 가능하다 (StemCell Technologies, Vancouver Canada). 이러한 테트라머를 이용하어, 분비된 항체는 포획되어 세포 표면 상에 연결되며, 따라서 효과 세포가 판독 입자로서 또한 기능하도록 한다. 세포 표면 상에 결합되면, 이들 항체는 예를 들어 형광 표지된 항원의 첨가에 의해 결합에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 특정 표적에 결합하는 단일클론 항체를 분비하는 세포를 포함하는 챔버를 확인하려는 경우, 효과 세포로부터 분비되는 항체는 적절한 포획 제제를 이용하여 효과 세포의 표면 상 그리고 챔버 내 나머지에 포획될 수 있다. 따라서 도 13을 다시 참조하면, 효과 세포(430)는 판독 세포로서 기능하며, 즉, 관심있는 분자(432)를 분비하는 효과 세포가 판독 세포(431)보다 관심있는 분자를 보다 효율적으로 포획할 수 있다는 것이 이해된다.
일 실시양태에서, 세포외 효과 분석법은 복수의 분석 챔버에서 병렬로 수행되며, 챔버 내의 판독 입자 군집은 이질적이고 (예를 들어, 이질적인 판독 세포 군집)이고 각 챔버에서 세포의 실질적으로 동질적인 군집이며, 실질적으로 동질적인 군집 내의 개별 효과 세포는 각각 동일한 항체를 생산한다. 추가적인 실시양태에서, 판독 입자는 효과 세포에 의해 분비되는 항체의 표적 에피토프를 결정하기 위하여 단백질 또는 단백질 단편의 라이브러리를 발현하도록 유전적으로 조작된 판독 세포이다. 도 15를 참조하면, 분석의 일 실시양태는 복수의 효과 세포(190) 분비 항체(191)를 포함한다. 분석은 에피토프(196, 197, 198, 및 199) 각각을 보이는 판독 세포(192, 193, 194, 및 195)를 포함하는 이질적인 판독 세포 군집을 추가로 포함한다. 효과 세포(190)는 판독 세포(192, 193, 194, 및 195)로 확산되는 항체(191)를 분비한다. 항체(191)는 판독 세포(194)에 표적 에피토프(198)를 통해 결합하지만, 판독 세포(192, 193, 또는 195)에 결합하지는 않는다. 이차 항체는 항체(191)의 판독 세포(194)에 대한 선택적 결합을 검출하기 위해 이용될 수 있다.
판독 세포(194) (또는 다른 에피토프)에 결합하는 항체(191)를 분비하는 세포 군집은 이후 장치로부터 회수되어 추가 분석을 위해 처리될 수 있다.
일 실시양태에서, 챔버 내의 세포 군집 내의 ASC가 표적 세포의 세포 용해를 활성화하는지, 즉 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 활성화하는지를 결정하기 위해 개별 장치 챔버에서 분석을 병렬로 수행한다. ADCC는 면역계의 효과 세포가, 특정 항체, 즉 본 명세서에서 제공되는 특정 분석 챔버 내에서 ASC에 의해 분비된 항체에 의해 그의 막-표면 항원이 결합된 표적 세포를 용해시키는 세포 매개 면역 방어의 기작이다. 대표적인 ADCC는 자연 살해 (NK) 세포에 의해 매개된다. 그러나, 대식세포, 호중구 및 호산구는 또한 ADCC를 매개할 수 있으며, 본 명세서에서는 ADCC 세포외 효과 분석에 사용되는 부속 세포로서 제공될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 ADCC 분석의 일 실시양태는, 효과 세포 또는 이의 다수, 판독 세포 군집 (표면 상에 관심있는 에피토프를 가짐) 및 부속 세포로서 NK 세포를 포함하는 세포 군집을 포함한다. 분석은 세포 군집으로부터의 ASC가 NK 세포가 표적 세포를 공격하여 그들을 용해시키는 것을 유도하는지를 확인하기 위해 수행된다. 도 16을 참조하면, 예시된 실시양태는 항체(202 및 203) 각각을 분비하는 ASC(200 및 201)를 포함하는 세포 군집을 포함한다. 예시된 실시양태는 에피토프(206 및 207)를 각각 나타내는 판독 세포(204 및 205)를 포함하는 이질적인 판독 세포 군집을 추가로 포함한다. ASC(200 및 201)는 판독 세포(204 및 205)로 확산되는 항체(202 및 203)를 분비한다. 항체(202)는 표적 에피토프(207)를 통해 판독 세포(205)에 결합하나, 판독 세포(204)에는 결합하지 않는다. 항체(203)는 판독 세포(204 및 205) 모두에 결합하지 않는다. NK 세포(208)는 판독 세포(205)가 항체(202)에 의해 결합되어 왔음을 검출하며 판독 세포(205)를 살해하게 되었으나, 결합되지 않은 판독 세포(204)는 놓아두었다.
당업자는 NK 세포가 효과 세포와 판독 세포의 인큐베이션 중에 또는 인큐베이션 후에 챔버에 첨가될 수 있다 (단, 판독 세포에 대한 접근 (예: 광학적 접근)을 용이하게 하는 방식으로 챔버에 첨가된다)는 것을 이해할 것이다. NK 세포 (또는 다른 유형의 부속 세포)는 일 실시양태에서, 장치의 하단 성분에 직접적으로, 즉 개방 챔버에 직접적으로 추가된다. 대안적으로, 또는 추가적으로, NK 세포 (또는 다른 종류의 부속 세포)는 장치의 상단 성분에 형성된 미세채널을 통해 챔버에 첨가된다. NK 세포는 이질적인 부속 세포 군집, 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포로부터의 것일 수 있다. NK 세포는 동물 - 또는 인간-유래 세포주로부터의 것일 수 있으며, ADCC 활성을 증가시키기 위해 조작될 수 있다. 당업자는 ADCC를 매개할 수 있는 대식세포, 호산구 또는 호중구와 같은 조혈 세포 유형을 이용하여 상기 분석이 수행될 수 있음을 더욱 이해할 것이다. 이 경우, 대식세포, 호산구 또는 호중구는 분석법 내 부속 세포이다. ADCC를 매개할 수 있는 세포 유형은 또한 ADCC 활성이 증가되도록 또는 표적 세포에 항체가 결합할 때 신호를 보고하도록 조작된 동물- 또는 인간-유래 세포주일 수 있다. 후자의 경우, 표적 세포는 부속 입자인 한편, 세포 매개 ADCC는 판독 입자이다.
ADCC 세포외 효과 분석법이 도 16에 도시된 것과 같이 단일 세포 (예: 단일 효과 세포), 동질적인 세포 군집, 또는 이질적인 세포 군집에 대해 수행될 수 있다. 유사하게, ADCC 분석법은 도 16에 도시된 것과 같이, 단일 판독 세포, 동질적인 판독 세포 군집, 또는 이질적인 판독 세포 군집을 이용하여 수행될 수 있다. 그러나, 많은 경우에 있어 판독 세포의 무작위적 죽음으로 인한 위양성 (false positive)의 검출을 피하기 위해 복수의 판독 세포로 ADCC 분석을 수행하는 것이 바람직하다.
세포 용해는, 일 실시양태에서, 클론원성 분석법에 의해, 막 보전 염료의 첨가에 의해, 세포 내 형광 분자의 손실에 의해 또는 용액 중의 세포내 분자의 방출에 의해 정량화된다. 방출된 생체 분자는 용액에서 직접 측정할 수 있거나 측정을 위해 판독 입자에서 포획된다. 경우에 따라, 산화환원 분석을 위한 기질 또는 효소 분석을 위한 기질과 같은 부속 분자가 첨가된다. 도 17을 참조하면, 예를 들어, 제1 생체분자(502)를 분비하는 효과 세포(500) 및 제1 생체 분자(502)를 분비하지 않는 제2 효과 세포(501)를 포함하는 세포 군집은, 판독 세포(503) 및 판독 입자(504), 및 부속 입자 (예: 자연 살해 세포(505))를 포함하는 이질적인 판독 입자 군집의 존재하에 인큐베이션 된다. 제1 생체분자(502)의 판독 세포(503)로의 결합은 판독 세포(503)가 용해되도록 하는 자연 살해 세포(505)의 모집을 유도한다. 세포 용해 시, 제2 생체분자(506)가 판독 세포(503)로부터 유리되며, 예를 들어 분자(507)를 통해 제2 생체분자(506)를 포획하도록 기능화된 상이한 유형의 판독 입자인 판독 입자(504) 상에 포획된다. 분자(507)는, 일 실시양태에서, 항체 또는 효소, 반응성 그룹 및/또는 핵산과 같은 단백질이다. 포획된 제2 생체분자(506) 판독 세포(503)에 존재하는 단백질, 효소, 탄수화물 또는 핵산과 같은 임의의 분자일 수 있다. 제2 생체분자(506)의 판독 입자(504)로의 결합은, 일 실시양태에서, 형광 분석법, 색도 분석법, 생물발광 분석법 또는 화학발광 분석법을 이용하여 정량화된다. 분석은, 예를 들어, 포획된 생체분자(506)가 상이한 광학 특성을 갖는 산물로 기질을 전환시키는 효소인 경우, 판독 입자(504) 상에서 직접적으로 또는 주변 용액에서 간접적으로 수행된다. 임의의 챔버가 세포 용해를 유도하는 생체분자 (예를 들어, 항체)를 분비하는 효과 세포를 포함하는지를 확인하기 위해, 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나의 다중 챔버에서 분석이 수행된다.
ADCC 분석법은 당업계에 알려져 있으며 그 성분은 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 유세포 분석을 위한 Guava 세포 독성 키트 (Millipore), ADCC 리포터 바이오어세이 코어 키트 (Promega), ADCC 어세이 (GenScript), 생존/사멸 세포 매개 세포독성 키트 (Life Technologies) 및 DELFIA 세포 독성 분석법이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포외 효과 분석법은 보체-의존적 세포독성 (CDC) 분석법이다. 하나의 CDC 실시양태에서, 전형적인 보체 경로를 통한 판독 세포의 용해를 유도하기에 필수적인/필수적이거나 충분한 가용성 인자의 존재하에서 판독 세포에 결합하는 세포 군집 내 ASC (또는 ASC의 분비된 항체)의 존재를 확인하기 위한 방법이 제공된다. 이에 따라, 분석법은 일 실시양태에서, ASC에 의해 분비되는 항체가 전형적인 보체 경로에 의해 1 이상의 표적 세포의 용해를 자극하는지 여부를 결정하는 것이다.
CDC 분석법은 적어도 하나의 효과 세포 및 적어도 하나의 판독 세포를 포함하며, 하나의 CDC 실시양태는 도 18에 도시된다. 실시양태는 효과 세포(210)를 포함하는 세포 군집을 포함하며 효과 세포(211)는 항체(212 및 213) 각각을 분비한다. 예시된 실시양태는 에피토프(216 및 217) 각각을 보이는 판독 세포(214) 및 판독 세포(215)를 포함하는 이질적인 판독 세포 군집을 추가로 포함한다. 효과 세포(210 및 211)는 판독 세포(214 및 215)로 확산되는 항체(212 및 213)를 분비한다. 항체(212)는 표적 에피토프(217)를 통해 판독 세포(215)에 결합하나 판독 세포(214)에는 결합하지 않는다. 항체(213)는 판독 세포(214 및 215) 모두에 결합하지 않는다. 효소 C1(218), 부속 입자, 및 전형적인 보체 경로를 통해 세포의 용해를 유도하는데 필요한 하나의 가용성 인자는 결합되지 않은 판독 세포(214)는 남겨두고 판독 세포(215) 및 항체(212)의 복합체에 결합한다. 효소 C1(208)의 판독 세포(215) 및 항체(212)의 복합체로의 결합은 클래스 보체 경로 (미도시)를 통해 세포의 용해를 유도하는데 필요한 추가적인 가용성 인자를 포함하는 전형적인 보체 경로를 유발하여 판독 세포(215)의 파열 및 죽음을 초래한다.
판독 세포 (즉, 분석에 필요한 부속 입자)의 용해를 유도하기 위해 필요하고/하거나 충분한 가용성 인자는 효과 세포가 판독 세포와 함께 인큐베이션 되는 동안 또는 그 후에 첨가되며, 단, 판독 세포에 대한 접근을 용이하게 하는 방식으로 챔버에 첨가된다. 이러한 부속 입자는 상술한 것과 같이, 상단 장치 성분 또는 하단 장치 성분을 챔버에 첨가될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 CDC 분석은 도 18에 도시된 것과 같이 단일 효과 세포, 동질의 효과 세포 군집 또는 이질적인 세포 군집에서 수행될 수 있다. 유사하게, CDC 분석은 단일 판독 세포, 동질의 판독 세포 군집 또는 이질적인 판독 세포 군집을 이용하여 도 18에 도시된 것과 같이 수행될 수 있다. 그러나, 많은 경우에 있어 판독 세포의 무작위 적 죽음으로 인한 위양성의 검출을 피하기 위해 판독 세포 군집을 이용하여 CDC 분석을 수행하는 것이 바람직하다.
보체 경로에 의한 세포 용해는 당업자에게 공지된 방법에 따라 정량화된다. 예를 들어, 세포 용해는 클론원성 분석법에 의해, 막 보전 염료의 첨가에 의해, 세포 내 형광 분자의 손실에 의해 또는 용액 중의 세포내 분자의 방출에 의해 정량화된다. 방출된 생체분자는 용액에서 직접 측정될 수 있거나 판독 입자 상에서 포획된다. 경우에 따라, 산화환원 분석을 위한 기질 또는 효소 분석을 위한 기질과 같은 추가적인 부속 분자가 첨가될 수 있다. 도 19를 참조하면, 제1 생체분자(512)를 분비하는 효과 세포(510) 및 제1 생체 분자(512)를 분비하지 않는 제2 효과 세포(511)를 포함하는 세포 군집은, 부속 입자(515) (예를 들어, 보체 단백질)의 존재하에 이질적인 판독 입자, 예를 들어 판독 입자(513) 및 판독 입자(514)의 존재하에 인큐베이팅 된다. 부속 입자(515)의 존재하에 판독 분자(513)로의 생체분자(512)의 결합은 판독 세포(513)을 용해시킨다. 세포 용해시, 제2 생체분자(516)는 유리되어, 예를 들어 분자(517)를 통해 생체 분자(516)를 포획하도록 기능화된 제2 유형의 판독 입자인 판독 입자(514) 상에 포획된다. 분자(517)는 단백질, 항체, 효소, 반응성 그룹 및/또는 핵산과 같은 1 이상의 유형의 분자일 수 있다. 포획된 생체 분자(516)는 유형에 제한되지 않는다. 오히려, 포획된 생체분자(516)는 판독 세포(513)에 존재하는 단백질, 효소, 염료, 탄수화물 또는 핵산과 같은 임의의 분자이다. 판독 입자(514)에 대한 제2 생체 분자(516)의 결합은 형광 분석법, 색도 분석법, 생물발광 분석법 또는 화학발광 분석법을 사용하여 정량화된다. 예를 들어, 포획된 생체 분자(516)가 상이한 광학 특성을 갖는 산물로 기질을 전환시키는 효소인 경우, 분석은 판독 입자(514) 상에서 직접적으로 또는 주변 용액에서 간접적으로 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
다른 실시양태에서, 단독으로 또는 세포 군집 내에서 효과 세포가 세포 성장을 조절하는지 여부를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 특히, 효과 세포가 생체분자, 예를 들어, 판독 세포의 성장 속도를 조절하는 사이토카인 또는 항체를 분비하는지 여부를 확인하기 위해 사용된다. 도 20을 참조하면, 예시된 실시양태는 생체분자(222 및 223)를 각각 분비하는 효과 세포(220) 및 효과 세포(221)를 포함하는 세포 군집을 포함한다. 예시된 실시양태는 판독 세포(224)를 포함하는 동질의 판독 세포 군집을 추가로 포함한다. 효과 세포(220 및 221)는 판독 세포(224)로 확산되는 생체분자(222 및 223)를 분비한다. 생체분자(222)는 판독 세포(224)에 결합하여 판독 세포(224)의 성장을 유도하는 반면 (점선으로 나타남), 생체분자(223)는 판독 세포(224)에 결합하지 않는다. 챔버의 현미경 영상화는 생체분자에 노출되지 않은 다른 챔버의 세포에 대하여 판독 세포(224)의 성장을 평가하는데 사용된다.
세포 성장 조절 분석이 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 이용하여 수행될 수 있다. 위에서 언급한 것과 같이, 일부 실시양태에서, 모든 세포 군집이 효과 세포를 포함하는 것은 아닌데, 그 이유는 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나에 초기에 로딩되는 출발 군집에서 세포 군집의 희귀성 및/또는 농축의 어려움 때문이다. 본 발명은 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인함으로써 이러한 희귀 세포의 확인을 가능하게 한다.
세포 성장 조절 분석은 단일 챔버 내 단일 판독 세포, 또는 이질적인 판독 세포 군집을 이용하여 또한 수행될 수 있다. 그러나, 많은 경우에 있어, 성장 속도의 보다 정확한 측정을 가능하게 하기 위해 균일한 판독 세포 군집을 이용하여 세포 성장 조절 분석을 수행하는 것이 바람직하다.
세포 성장 조절 분석은, 일 실시양태에서, 세포 성장을 억제하는 생체 분자를 생산하는 세포를 스크리닝하는데 적합하다. 다른 실시 양태에서, 방법은 판독 세포의 증식 속도를 조절, 즉 증가 또는 감소시키는 분자를 생산하는 세포를 스크리닝하는데 적합하다. 성장 속도는, 일 실시양태에서, 광학 현미경 영상, 형광을 나타내는 세포의 총 형광 강도, 희석 염료 (예: CFSE)로 표지된 세포의 평균 형광 강도, 핵 염색 또는 당업자에게 공지된 어떤 다른 방법으로부터 수동 또는 자동 세포 계수에 의해 측정된다.
증식을 측정하기 위해 상업적으로 가능한 분석법은 alamarBlue® 세포 생존력 분석법, CellTraceTM CFSE 세포 증식 키트 및 CellTraceTM 바이올렛 세포 증식 키트 (출처: 모두 Life Technologies)를 포함하며, 각각은 본 명세서에서 기술된 방법 및 장치를 이용하여 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 다른 세포의 세포 사멸, 즉 판독 세포 또는 부속 세포의 세포 사멸을 유도하는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 선택하기 위한 세포사멸 분석법이 제공된다. 추가적인 실시양태에서, 방법은 생체분자, 예를 들어 판독 세포 또는 부속 세포의 세포사멸을 유도하는 사이토카인 또는 항체를 분비하는 효과 세포의 존재를 확인하는데 사용된다. 도 21을 참조하면, 분석은 생체 분자(232)를 분비하는 효과 세포(230) 및 생체분자(233)를 분비하는 효과 세포(231)를 포함하는 세포 군집을 포함하는 챔버에서 수행된다. 챔버는 판독 세포(234)를 포함하는 동질의 판독 세포 군집을 추가로 포함한다. 효과 세포(230) 및 효과 세포(231)는 판독 세포(234)를 향해 확산하는 생체분자(232 및 233)를 분비한다. 생체 분자(232)는 판독 세포(234)에 결합하고 판독 세포(234)의 세포 사멸을 유도하는 반면, 생체분자(233)는 판독 세포에 결합하지 않는다. 챔버의 현미경 영상화는, 일 실시양태에서, 당업계에 공지된 착색제 및 다른 세포사멸 마커 (예를 들어, 아넥신 5, 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소 (TdT) - 매개 dUTP 닉 말단 표지, 미토콘드리아 막 전위 파괴 등)의 포함을 이용하여 잠재적으로 세포사멸을 평가하는데 사용된다. 일 실시양태에서, 프로피디움 요오드화물 (PI), LIVE/DEAD® 생존/세포독성 키트 (Life Technologies) 또는 LIVE/DEAD® 세포-매개 세포독성 키트 (Life Technologies)를 사용하여 상업적으로 입수 가능한 염료 또는 키트를 사용하여 세포 죽음을 측정한다.
세포사멸 분석은, 일 실시양태에서, 단일 효과 세포를 포함하는 세포 군집, 선택적으로 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집 또는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집에 대해 수행된다. 일 실시양태에서, 세포사멸 분석은 단일 판독 세포, 또는 이질적인 판독 세포 군집을 이용하여 수행된다. 그러나, 많은 경우에 있어, 동질의 판독 세포 군집으로 세포사멸 분석을 수행하여 세포사멸의 보다 정확한 평가를 가능하게 하는 것이 바람직하다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 장치 및 분석법은 판독 세포의 자가 포식을 유도하는 생체분자, 예를 들어 사이토카인 또는 항체를 분비하는 효과 세포를 확인하기 위해 사용된다. 본 방법의 일 실시양태는 도 22에 도시된다. 본 실시양태에서, 효과 세포(441)가 생체분자(443)를 분비하는 효과 세포(441) 및 효과 세포(442)를 포함하는 세포 군집이 분석 대상이 된다. 예시된 실시양태는 표적 에피토프(449)를 보이는 제1 판독 세포(444) 및 표적 에피토프가 없는 제2 판독 세포(445)를 포함하는 이질적인 판독 세포 군집을 추가로 포함한다. 효과 세포(441)는 생체분자(443)를 분비하며, 제1 판독 세포(444) 및 제2 판독 세포(445) 방향으로 확산된다. 생체분자(443)는 제1 판독 세포(444)에 결합하여 제1 판독 세포(444)의 자가 포식을 유도하는 반면, 생체분자(443)는 제2 판독 세포(445)에는 결합하지 않는다. 챔버의 현미경 영상화가 일 실시양태에서, 당업계에 알려진 자가 포식 리포터 (예: FlowCellect™ GFP-LC3 리포터 자가 포식 분석 키트 (U20S) (EMD Millipore), Premo™ 자가 포식 탄뎀 센서 RFP-GFP-LC3B 키트 (Life Technologies))를 이용하여 조작된 세포주를 이용하여 자가 포식을 평가하기 위하여 사용된다.
일 실시양태에서, 자가 포식 분석은 단일 효과 세포를 포함하는 세포 군집, 선택적으로 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집 또는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집에 대해 수행된다. 일 실시양태에서, 자가 포식 분석은 단일 판독 세포, 또는 이질적인 판독 세포 군집, 또는 동질의 판독 세포 군집을 이용하여 수행된다. 분석은, 일 실시양태에서, 동질의 판독 세포 군집을 이용하여 수행된다.
다른 실시양태에서, 효과 세포의 존재를 확인하거나 또는 알려진 생체 분자, 예를 들어 사이토 카인이 판독 세포에서의 반응을 유도하는 능력을 방해하는 항체와 같은 생체 분자, 예를 들어 항체를 분비하는 효과 세포를 선택하기 위한 방법이 제공된다. 그 반응은 종류에 제한되지 않는다. 예를 들어, 반응은 일 실시양태에서 세포사멸, 세포 증식, 리포터의 발현, 형태 변화, 또는 방법의 사용자에 의해 선택되는 어떤 다른 반응으로부터 선택된다. 본 방법의 일 실시양태는 도 23에 제공된다. 도 23을 참조하면, 예시된 실시양태는 효과 세포(240) 및 효과 세포(241) 분비 생체분자(242 및 243)를 각각 포함하는 세포 군집을 포함한다. 예시된 실시양태는 추가로 판독 세포(244)를 포함하는 동질의 판독 세포 군집을 포함한다. 효과 세포(240 및 241)는 항체(242 및 243)를 분비하며, 챔버 내 배지로 확산된다. 챔버는 사이토카인(245)으로 펄스되며, 이는 판독 세포(244)에 대해 알려진 효과를 보통 가진다. 항체(242)는 사이토카인(245)에 결합하며, 이로 인해 이들이 판독 세포(244)에 결합하는 것을 방지한다. 이에 따라, 예상된 반응이 관찰되지 않았는데, 이는 효과 세포(240 및 241) 중 하나가 판독 세포(244)를 자극하여 반응을 일으키는 사이토카인(245)의 능력을 중화할 수 있는 항체를 분비함을 시사한다.
일 실시양태에서, 사이토카인 중화 분석법을 사용하여 판독 세포 상에 존재하는 사이 사이토카인 수용체를 표적으로 하는 생체분자를 생산하는 효과 세포를 포함하는 세포 군집의 존재를 확인한다. 이 경우, 항체, 예를 들어 판독 세포(244) 상의 사이토카인(245)에 대한 수용체(246)에 대한 항체(242)의 결합은 사이토카인 및 수용체의 상호작용을 차단하므로 아무런 반응도 자극되지 않는다. 사이토카인 수용체는, 다른 실시양태에서, "가용화"되거나 "안정화”되는데, 이는 예를 들어, Heptares StaR® 플랫폼을 통해 조작된 사이토카인 수용체이다.
사이토카인에 대한 반응은, 일 실시양태에서, 이에 제한되는 것은 아니나 세포 죽음, 세포 성장, 형광 리포터 단백질의 발현, 세포 성분의 국재화, 세포 형태의 변화, 운동성, 주화성, 세포 응집성 등을 포함하는, 당업계에 알려진 것과 같은 관련 신호전달의 현미경 측정에 의해 확인된다. 일 실시양태에서, 효과 세포를 갖는 챔버의 반응을 효과 세포가 없는 챔버와 비교하여 반응이 억제되는지를 확인한다. 반응이 억제되면, 챔버 내의 효과 세포를 추가 분석을 위해 회수한다.
일 실시양태에서, 사이토카인 분석은 단일 효과 세포를 포함하는 세포 군집, 1 이상의 효과 세포를 선택적으로 포함하는 세포 군집 또는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집 상의 개별 장치 챔버 내에서 수행된다. 상기 방법은 복수의 세포 군집 상의 단일 장치의 복수의 챔버에서 병렬로 수행된다. 일 실시양태에서, 사이토카인 분석은 단일 판독 세포, 또는 이질적인 판독 세포 군집을 이용하여 수행된다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 판독 세포의 자극 또는 오히려 그의 결핍을 보다 정확하게 평가하도록 하기 위해 균질한 판독 세포 군집을 이용하여 수행된다.
이러한 분석법을 위해 상업적으로 입수 가능한 사이토카인-의존적 또는 사이토카인-민감성 세포주의 예는 이에 제한되는 것은 아니나 TF-1, NR6R-3T3, CTLL-2, L929 세포, A549, HUVEC (인간 제대 정맥 내피 세포), BaF3, BW5147.G.1.4.OUAR.1, (모두 ATCC로부터 입수 가능함), PathHunter® CHO 세포 (DiscoveRx) 및 TANGO 세포 (Life Technologies)를 포함한다. 당업자는 일차 세포 (예: 림프구, 단핵구)가 사이토카인 분석법을 위한 판독 세포로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일 실시양태에서, 신호전달 분석법은 판독 세포의 수용체에 작용 활성을 갖는 분자 (예: 항체 또는 사이토카인)를 분비하는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인하기 위해 사용된다. 수용체에 결합하면, 판독 세포 군집에 대한 효과는 형광 리포터의 발현, 세포 내 형광 리포터의 전좌에 의해 시각화되는 신호전달 경로의 활성화, 성장률의 변화, 세포사멸, 형태 변화, 분화, 판독 세포 등의 표면 상에 발현되는 단백질의 변화를 포함할 수 있다. 여러 조작된 리포터 세포주를 상업적으로 입수 가능하며 이는 그러한 분석을 수행하기 위해 이용될 수 있다. 예로는 PathHunter 세포® (DiscoverRx), TANGOTM 세포 (Life Technologies) 및 EGFP 리포터 세포 (ThermoScientific)가 포함된다. 일 실시양태에서 수용체는 GPCR 수용체이며 판독 세포는 사이클릭 AMP 2차 메시지에 반응하여 전사 리포터를 발현하도록 조작된 세포이다. 일 실시양태에서 상기 수용체는 이온 채널이며 판독 세포는 칼슘-민감성 형광 염료를 이용함으로써 효과에 대해 분석된다.
일 실시양태에서, 표적 판독 세포 또는 표적 부속 세포를 감염시키는 바이러스의 기능을 방해하는 생체분자, 예를 들어 항체를 분비하는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인 및/또는 선택하기 위해 바이러스 중화 분석이 수행된다. 본 방법의 일 실시양태는 도 24에 도시된다. 도24를 참조하면, 예시된 실시양태는 효과 세포 250 및 효과 세포 251 분비 생체분자, 예를 들어 항체(252 및 253)를 각각 포함하는 세포 군집을 포함한다. 예시된 실시양태는 판독 세포(254)를 포함하는 동질의 판독 세포 군집을 추가로 포함한다. 효과 세포(250 및 251)는 생체분자, 예를 들어 항체(252 및 253)를 분비하며, 이는 챔버 내 배지로 확산된다. 챔버는 이후 바이러스(255) (부속 입자)로 펄스되며, 이는 보통 판독 세포(254)를 감염시킨다. 항체(252 또는 253)는 바이러스(255)에 결합하여, 바이러스가 판독 세포(254)에 결합하는 것을 방지한다. 예상된 감염이 발견되지 않는 경우, 하나의 효과 세포(250 또는 251)는 바이러스(255)를 `중화할 수 있는 항체를 분비하는 것으로 결론 내려진다.
바이러스 중화 분석법은 판독 세포 상의 바이러스에 대한 수용체에 결합하는 생체분자를 생산하는 효과 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이 경우, 항체, 예를 들어 항체(252)가 판독 세포(254)상의 바이러스(255)의 수용체(256)에 결합하는 것은 바이러스와 수용체의 상호작용을 차단하며, 감염이 발견되지 않는다.
당업계에 알려진 방법을 이용하여 바이러스 감염의 평가가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 감염, 바이러스 감염 동안 상향 조절되는 판독 세포 내 형광 단백질의 발현, 바이러스 감염 동안 증가된 판독 입자 상에서 포획되고 측정되는 판독 세포 또는 부속 세포로부터의 단백질 분비, 판독 세포 또는 부속 세포의 사멸, 판독 세포 또는 부속 세포의 형태 변화, 및/또는 판독 세포의 응집에 이어 판독 세포에 의해 발현되는 형광 단백질을 포함하도록 조작될 수 있다.
일 실시양태에서, 세포외 효과 분석법은 바이러스 중화 분석법이다. 일 실시양태에서, 바이러스 중화 분석은 단일 판독 세포, 또는 이질적인 판독 세포 군집을 이용하여 수행된다. 일 실시양태에서, 방법은 동질의 판독 세포 군집을 이용하여 수행되어, 반응을 경험한 판독 세포의 자극, 또는 오히려 그의 결핍에 대해 보다 정확한 평가를 가능하게 한다. 바이러스 중화 분석을 위해 상업적으로 이용 가능한 세포주는 MDCK 세포 (ATCC)이며 CEM-NKR-CCR5 세포 (NIH Aids Reagent Program)가 본 명세서에서 기술된 방법 및 장치와 함께 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포외 효과 분석법은 효소 중화 분석법이며, 효과 세포가 표적 효소를 저해하는 생체분자를 드러내거나 분비하는지 여부를 확인하기 위해 수행된다. 본 방법의 일 실시양태는 도 25에 제시된다. 도 25를 참조하면, 예시된 실시양태는 효과 세포(280) 및 생체분자를 분비하는 효과 세포(281), 예를 들어 단백질(282 및 283) 각각을 포함하는 세포 군집을 포함한다. 예시된 실시양태는 표적 효소(285)가 결합되는 동질의 판독 입자 군집, 예를 들어 비드(284)를 추가로 포함한다. 그러나, 다른 실시양태에서, 표적 효소(285)는 장치의 표면에 연결되거나 가용성이다. 단백질(282 및 283)은 배지를 통해 확산되며 단백질(282)은 표적 효소(285)에 결합하여, 그의 활성을 저해하는 한편, 단백질(283)은 표적 효소에는 결합하지 않는다. 챔버 내 존재하는 기질에 대한 효소 활성 또는 오히려 그의 결핍의 검출은, 일 실시양태에서, 이에 제한되는 것은 아니나 형광 판독, 색도 판독, 침전 등을 포함한 당업계에 알려진 방법에 의해 평가된다.
다른 실시양태에서, 효소 중화 분석은 개별 챔버 당 단일 효과 세포를 포함하는 세포 군집, 1 이상의 효과 세포를 선택적으로 포함하는 세포 군집 또는 1 이상의 효과 세포를 포함하는 세포 군집에 대해 수행된다. 일 실시양태에서, 효소 중화 분석은 개별 챔버 내 단일 판독 입자를 이용하여 수행된다. 일 실시양태에서, 분석 반응 상의 변화를 보이는 세포 군집을 확인하기 위해 효소 중화 분석이 복수의 세포 군집에 대해 수행된다.
다른 실시양태에서, 판독 입자에 영향을 미치는 분자를 차례로 분비하는 제2 유형의 효과 입자의 활성화를 유발하는 분자를 드러내거나 분비하는 효과 세포의 존재를 확인하기 위한 분석법이 제공된다. 이에 따라, 본 실시양태에서, 개별 세포 군집은 개별 분석 챔버에 제공된다. 본 방법의 일 실시양태가 도 26에 제공된다. 도 26을 참조하면, 예시된 실시양태는 분자(461)(예: 항체, 표면 수용체, 주조직적합성 복합체 분자 등)를 드러내는 하나의 효과 세포(460)를 그의 표면 상에 포함하는 세포 군집을 포함하며, 이는 판독 입자(464)에 의해 포획된 상이한 유형의 분자(463)(예: 사이토카인, 항체)의 분비를 유도하는 상이한 유형의 인접한 효과 세포, 이 경우 효과 세포(462)를 활성화시킨다. 본 실시예에서, 판독 입자(464)는 항체(465) 또는 분비 분자(463)에 특이적인 수용체를 이용하여 기능화된다.
다른 실시양태에서, 효과 세포는, 부속 입자에 의해 활성화되면, 증식, 생존력, 형태, 운동성 또는 분화와 같은 표현형의 변화를 나타낼 수 있다. 이 경우 효과 세포는 또한 판독 입자이다. 이러한 효과는 활성화된 효과 세포에 의한 부속 입자 및/또는 단백질의 자가 분비에 의해 유발될 수 있다.
도 27을 참조하면, 예시된 실시양태는 상이한 유형의 제2 효과 세포, 이 경우 효과 세포(472)를 활성화하는 분자(471) (예: 항체, 사이토카인 등)를 분비하는 효과 세포(470)를 포함하는 세포 군집을 포함한다. 효과 세포(472)는, 활성화되면, 판독 입자(474)에 의해 포획되는 분자(473) (예: 사이토카인, 항체)를 분비한다. 본 실시예에서, 판독 입자(474)는 항체(475) 또는 분비 분자(473)에 특이적인 수용체를 이용하여 기능화된다.
본 명세서에서 제공되는 것과 같이, 낮은 오프-레이트 (off-rate)를 갖는 단일클론 항체는 동일한 항원에 또한 특이적이나 보다 빠른 오프-레이트를 갖는 큰 백그라운드의 단일클론 항체 (동일한 챔버 내)의 존재 하에서 검출될 수 있다. 그러나, 친화력은 또한 본 명세서에서 제공되는 장치 및 방법을 이용하여 측정될 수 있으므로, 온-레이트 (on-rate) 또한 측정될 수 있다. 이들 측정은 광학계의 감도뿐만 아니라 포획 시약 (예: 비드)의 결합 능력에 의존한다. 특이성 분석을 위하여, 포획 시약 (판독 입자)은 관심있는 에피토프를 제시하여 원하는 특이성을 갖는 항체에만 결합하도록 설계될 수 있다
도 28을 참조하면, 예시된 실시양태는 동일한 항원에 특이적이나 상이한 친화력을 가지는 동질의 세포 군집 분비 항체를 포함한다. 본 분석법은 높은 친화력을 갖는 항체를 생산하는 효과 세포를 확인하기 위해 사용된다. 효과 세포(450 및 451)는 표적 에피토프에 대해 낮은 친화력을 갖는 항체(453 및 454)를 분비하는 반면 (미도시), 효과 세포(452)는 표적 에피토프에 대해 높은 친화력을 갖는 항체(455)를 분비한다. 항체(453, 454, 및 455)는 판독 비드(456)를 포함하는 동질의 판독 입자 군집에 의해 포획된다. 판독 비드는 이후 모든 항체에 결합하는 형광 표지된 항원과 함께 인큐베이팅 된다 (미도시). 비-표지된 항원을 이용하여 세척하면 (미도시), 형광 표지된 항원은 판독 비드가 높은-친화력 항체(455)를 그 표면 상에 드러내는 경우에만 남아있게 된다.
도 29를 참조하면, 효과 세포(260)분비 생체분자, 예를 들어 항체(261)는 챔버 내에 제공된다. 챔버는 광학적으로 식별가능한 판독 입자, 예를 들어 상이한 표적 에피토프(264 및 265) 각각을 드러내는 비드(262 및 263)를 포함하는 판독 입자 군집을 추가로 포함한다. 항체(261)는 챔버 내에서 확산되며, 에피토프(264)에 결합하나, 에피토프(265)에는 결합하지 않는다. 항체(261)의 에피토프(264)로의 우선적인 결합은, 일 실시양태에서, 비드(262)의 형광 측면에서는 관찰되나 비드(263)에 대해서는 관찰되지 않는다.
예시된 실시양태에서, 비드(262 및 263)는 교차 반응을 평가하기 위해 형태에 의해 광학적으로 구별 가능하다. 그러나, 판독 입자는 다른 수단, 예를 들어 형광 표지 (상이한 형광 파장 길이를 포함함), 다양한 수준의 형광 강도 (예를 들어, 상이한 형광 강도, 형태, 크기, 표면 염색 및 분석 챔버에서의 위치를 갖는 StarfireTM 비드를 이용함)와 같은 1 이상의 특성에 의해 또한 구별될 수 있다.
일 실시양태에서, 비드(262 및 263)는 상이한 컬러 형광단의 사용을 통해 광학적으로 식별가능하다.
일 실시양태에서, 특이성은 표적 에피토프의 결합을 위해 효과 세포에 의해 분비된 항체와 경쟁하는 항체를 포함시킴으로써 측정된다. 예를 들어, 일 실시양태에서 항원을 나타내는 판독 입자에 결합된 분비된 항체의 존재는 형광 표지된 이차 항체로 확인된다. 상이한 숙주로부터 생성되며 항원 상의 공지된 표적 에피토프에 결합하는 것으로 알려진 비-표지 경쟁 항체의 연이은 첨가는, 분비된 항체가 경쟁 항체로서 동일한 표적 에피토프에 결합된 경우에만 분비된 항체의 치환으로 인해 형광 감소를 초래한다. 또는, 분비된 항체가 낮은 특이성을 갖는 경우 분비된 항체와 표적 에피토프의 결합과 경쟁하는 다양한 항원의 혼합물을 첨가함으로써 특이성이 측정된다. 또는, 특이성은 분비된 항체를 비드 상에 포획한 다음 차별적으로 표지된 항원을 사용하여 분비된 항체의 결합 특성을 평가함으로써 측정된다.
일 실시양태에서, 생체분자를 분비하는 효과 세포의 존재를 확인하는 방법은 효과 세포의 1 이상의 세포내 화합물의 존재 또는 부재의 분석법과 결합된다. 전반적으로 설명된 것과 같이, 효과 세포의 확인은, 일 실시양태에서 처음에 효과 세포를 포함하는 세포 군집의 확인을 포함한다. 도 30을 참조하면, 관심있는 생체분자(522) (예를 들어, 항체 또는 사이토카인)를 분비하는 적어도 하나의 효과 세포 유형(520) 및 관심있는 생체분자를 분비하지 않는 다른 효과 세포 유형(521)을 포함하는 세포 군집은, 관심있는 생체분자를 포획하도록 기능화된 판독 입자(523)를 포함하는 판독 입자 군집의 존재 하에 인큐베이팅 된다. 인큐베이션 기간 이후, 효과 세포 유형(520 및 521)를 포함하는 세포 군집은 용해되어 군집 내 세포의 세포내 내용물이 방출된다. 판독 입자(523)는 또한 세포내 관심있는 생체분자(524) (예: 핵산, 항체와 같은 단백질)를 포획하도록 기능화된다. 세포 용해는 당업자에게 공지된 상이한 방법에 의해 이루어질 수 있다.
일 실시양태에서, 바람직한 결합 특성을 갖는 분비된 생체분자의 다클론성 혼합물을 확인하기 위한 방법이 제공된다. 분석은 표적 에피토프, 표적 분자 또는 표적 세포 유형에 대해 공지된 친화력을 갖는 항체를 생산하는 효과 세포의 이질적인 혼합물을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 혼합물이 개선된 효과를 제공하는지를 확인하기 위해, 이후 혼합물의 상황에서 표적의 결합을 개별 효과 세포 단독의 상황에서 표적의 결합과 비교할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 분석법의 일 실시양태에서, 판독 입자가 분석 챔버에서 세포 군집과 인큐베이션 된 후, 형광 측정이 실시되어 군집 내의 세포가 세포외 효과를 나타내는지를 확인한다. 이 실시양태에서, 판독 입자 군집 (또는 그의 부분집단)은 형광으로 표지되고 형광의 변화는 세포외 효과의 존재 및/또는 크기와 상관 관계가 있다. 판독 입자 군집은 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 당업자라면 이해할 수 있는 것과 같이, 정확한 영상화 및 형광 측정을 가능하게 하기 위해 하나의 초점면에서 판독 입자 및 효과 세포를 제공하는 분석이 수행된다.
일 실시양태에서, 판독 입자 반응은 자동화된 고해상도 현미경을 사용하여 모니터링된다. 예를 들어, 영상화는 Axiovert 200 (Zeiss) 또는 DMIRE2 (Leica) 전동 도립 현미경에서 20X (0.4 N.A.) 대물 렌즈를 사용하여 모니터링될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 자동화된 현미경 시스템을 사용하면 약 30분 내에 1개의 명시야 및 3개의 형광 채널을 포함하는 약 4000개의 챔버를 포함하는 어레이의 완전한 영상화가 가능하다. 이 플랫폼은 문헌 [Lecault et al. (2011). Nature Methods 8, pp. 581-586, 모든 목적을 위해 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨]에 기술된 것과 같이, 다양한 장치 설계에 적용 할 수 있다. 중요하게, 본 명세서에서 사용된 영상화 방법은 세포에 대한 광 손상을 최소화하면서 효과적으로 양성 챔버에서 충분한 신호를 얻는다.
일 실시양태에서, 본 명세서에서 제공된 세포외 효과 분석법은 장기적 세포 배양으로부터 이익을 얻으며, 따라서 장치에 유지되는 효과 세포는 생존 가능하고 건강한 세포인 것을 요구한다. 판독 세포 또는 부속 세포가 세포외 효과 분석법에서 사용되는 실시양태에서, 이들은 또한 건강한 상태로 유지되고 생존 가능하고 건강하다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에서 제공된 유체 구조는 세포외 효과 분석법이 수행될 수 있도록 효과 및 판독 세포 생존력을 유지하는 배지 조건의 조절을 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 세포 유형은 분비된 산물의 축적에 의존하는 자가 분비 또는 주변 분비 인자를 필요로 한다. 예를 들어, CHO 세포 성장률은 접종 밀도에 크게 의존한다. 4-nL 챔버에 단일 CHO 세포를 가두는 것은 기존의 거대 세포 배양과 비교되는 250,000개의 세포/ml의 접종 밀도에 해당한다. 이 세포들은 높은 접종 밀도에서 잘 자라기 때문에, CHO 세포는 여러 날 동안 관류를 필요로 하지 않을 수 있다. 그러나 다른 세포 유형, 특히 사이토카인-의존적 세포 (예: ND13 세포, BaF3 세포, 조혈 줄기 세포)는 일반적으로 대규모 배양에서 고농도에 도달하지 못하며, 사이토카인 고갈을 막기 위해 미세유체 장치에 사이토카인의 빈번한 공급을 요할 수 있다. 사이토카인은 배지에 첨가되거나 공급 세포에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 골수 유래 간질 세포와 호산구는 IL-6 및 다른 인자의 생성으로 인해 형질 세포의 생존을 뒷받침하는 것으로 나타났다 (Wols et al. (2002). Journal of Immunology 169, pp. 4213-21; Chu et al. (2011), Nature Immunology 2, pp. 151-159, 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨). 이 경우, 관류 빈도는 양분 고갈을 방지하면서 주변 분비 인자의 충분한 축적을 허용하도록 조절될 수 있다.
전반적으로 제공된 것과 같이, 본 발명의 일 양태는 1 이상의 효과 세포 (예: ASC)를 선택적으로 포함하는 세포 군집이 판독 입자 (예를 들어, 세포 표면 수용체를 포함하는 세포)에 세포외 효과를 발휘하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 효과 세포는 ASC이다. 세포외 효과는, 일 실시양태에서, 판독 세포 상에서 세포 표면 수용체의 저해 (길항 작용) 또는 활성화 (작용)이다 (예를 들어, 항체 분비 세포에 의해 분비된 항체의 아고니스트 및/또는 안타아고니스트 특성). 추가적인 실시양태에서, 세포외 효과는 막관통 단백질에 대한 아고니스트 또는 안타아고니스트 효과이며, 추가적인 실시양태에서 막관통 단백질은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR), 수용체 티로신 키나아제 (RTK), 이온 채널 또는 ABC 수송체이다. 추가적인 실시양태에서, 수용체는 사이토카인 수용체이다. GPCR과 RTK 이외의 다른 대사성 수용체에 대한 세포외 효과가 평가될 수 있다. 예를 들어, 구아닐릴 고리화효소 수용체에 대한 세포외 효과는, 세포 군집을 구아닐릴 고리화효소 수용체를 발현하는 판독 세포 군집과 함께 배양함으로써 평가될 수 있다.
판독 세포가 사용되는 실시양태에서, 판독 세포는 살아 있거나 고정될 수 있다. 세포외 효과는 일 실시양태에서, 고정된 판독 세포의 세포내 단백질에 대한 효과이다. 세포외 효과는 살아 있거나 고정된 판독 세포의 세포외 단백질 또는 살아있는 판독 세포의 분비된 단백질에서도 측정할 수 있다.
다른 실시양태에서, 판독 세포는 세린/트레오닌 키나아제 수용체 또는 히스티딘-키나아제 연관 수용체를 발현하며 세포외 효과 분석법은 세포 수용체의 결합, 작용 또는 길항 작용을 측정한다.
특정 수용체 (예: 수용체 세린/트레오닌 키나아제, 히스티딘-키나아제 연관 수용체 또는 GPCR)가 고아 수용체인, 즉, 특정 수용체를 활성화하기 위한 리간드가 알려지지 않은 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 세포외 분석법을 판독 세포에 대해 수행하고, 고아 수용체를 발현하는 판독 세포에 대한 세포외 효과의 변화 (예: 대조군 값과 비교할 때 고아 수용체의 작용 또는 길항 작용)를 초래하는데 원인이 되는 효과 세포를 포함하는 세포 군집 또는 부분집단을 확인함으로써 특정 고아 수용체에 대한 리간드를 발견하도록 한다.
일 실시양태에서, 판독 세포의 표면 상의 세포 표면 단백질은 막관통 이온 채널이다. 추가적인 실시양태에서, 이온 채널은 리간드 의존성 이온 채널이고, 분석법에서 측정된 세포외 효과는 이온 채널 개폐의 조절, 예를 들어, 아고니스트 결합에 의한 이온 채널의 개방 또는 안타아고니스트 결합에 의한 이온 채널의 폐쇄/차단의 조절이다. 안타아고니스트 또는 아고니스트는 예를 들어, 1 이상의 효과 세포에 의해 분비된 생체분자 (예: 항체)일 수 있다. 본 명세서에서 기술된 세포외 효과 분석법은 Cys-루프 수퍼패밀리, 통로형 글루탐산 수용체 및/또는 ATP 의존성 이온 채널에서 리간드 의존성 이온 채널을 발현하는 세포에서 효과 세포의 세포외 효과를 측정하는데 사용될 수 있다. 음이온성 cys-루프 이온 의존성 채널의 구체적인 예는 GABAA 수용체 및 글리신 수용체 (GlyR)를 포함한다. 양이온성 cys-루프 이온 의존성 채널의 구체적인 예는 세로토닌 (5-HT) 수용체, 니코틴성 아세틸콜린 (nAChR) 및 아연-활성화 이온 채널을 포함한다. 1 이상의 전술한 채널은 판독 세포에 의해 발현되어, 효과 세포가 이온 채널에 작용 또는 길항 작용함으로써 각 세포에 세포외 효과를 갖는지 여부를 확인할 수 있다. 이온 유속 측정은 일반적으로 짧은 시간 (즉, 수 초 내지 수 분) 동안 일어나며, 이들의 실행을 위해 정확한 유체 제어가 필요하다. 일 실시양태에서, 이온 유속 측정은 분비 분자가 판독 세포에 결합한다는 것을 먼저 확인한 후에 수행된다. 이온 유속 측정은 칼슘 유속의 지표인 형광 염료를 사용하여 수행될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 이온 채널 분석법의 예로는 Fluo-4-Direct 칼슘 분석 키트 (Life Technologies), FLIPR 막 전위 분석 키트 (Molecular Devices)가 포함된다. 이온-채널 발현 세포주 또한 상업적으로 이용 가능하다 (예: PrecisIONTM 세포주, EMD Millipore).
일 실시양태에서, 판독 세포는 그의 표면 상에 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체를 발현하며, 세포외 효과 분석법은 막을 가로지르는 기질의 수송을 측정하는 것을 포함한다. 판독 입자는 비드 상에 고정될 수 있는 단백질을 발현하는 세포 유래의 막 소포 (vesicle) (예: GenoMembrane ABC 수송체 소포 (Life Technologies))일 수 있다. 예를 들어, ABC 수송체는 투과성 당단백질 (다중약물 내성 단백질)일 수 있으며, 효과는 판독 세포에서 칼세인의 형광 강도로 측정될 수 있다. Vybrant™ 다중약물 내성 분석 키트 (Molecular Probes)가 이러한 분석을 수행하기 위해 상업적으로 이용 가능하다.
세포외 효과 분석은 또한 AMPA 수용체 (클래스 GluA), 카이닛 수용체 (클래스 GluK) 또는 NMDA 수용체 (클래스 GluN)와 같은 통로형 글루탐산 수용체를 발현하는 판독 세포의 사용을 통해 수행될 수 있다. 유사하게, 세포외 효과 분석은 ATP 의존성 채널 또는 포스파티딜이노시톨 4-5-바이포스페이트 (PIP2)-의존성 채널을 발현하는 판독 세포의 사용을 통해 또한 수행될 수 있다.
본 발명은 세포외 효과에 변화를 보이는 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은 복수의 개별 세포 군집을 분리된 분석 챔버에 보유하는 단계로, 여기서 적어도 하나의 개별 세포 군집은 1 이상의 효과 세포를 포함하고 분리된 분석 챔버의 내용물은 1 이상의 판독 입자를 포함하는 판독 입자 군집을 추가로 포함하는 단계, 분석 챔버 내 개별 세포 군집 및 판독 입자 군집을 인큐베이팅 하는 단계, 개별 세포 군집을 세포외 효과의 존재에 대하여 분석하는 단계로, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단이 세포외 효과의 판독을 제공하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 세포외 효과는 수용체 티로신 키나아제 (RTK)에 대한 효과, 예를 들어, RTK에의 결합, RTK의 길항 작용, 또는 RTK의 작용이다. RTK는 많은 폴리펩티드 성장 인자, 사이토카인 및 호르몬에 대해 높은 친화력을 갖는 세포 표면 수용체이다. 현재까지, 인간 게놈에서 확인되는 약 60개의 수용체 키나아제 단백질이 있어왔다 (Robinson et al. (2000). Oncogene 19, pp. 5548-5557, 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함됨). RTK는 세포 과정을 조절하고 많은 유형의 암의 발병과 진행에 역할을 하는 것으로 나타나왔다 (Zwick et al. (2001). Endocr . Relat . Cancer 8, pp. 161-173, 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함됨).
세포외 효과가 RTK에 대한 효과인 경우, 본 발명은 특정 RTK 클래스 또는 멤버에 한정되지 않는다. 약 20개의 상이한 RTK 클래스가 확인되었으며, 이 클래스 중 임의의 하나의 멤버에 대한 세포외 효과를 본 명세서에서 제공되는 방법과 장치로 스크리닝할 수 있다. 표 2는 상이한 RTK 클래스 및 각 클래스의 대표 멤버를 제공하며, 각각은 판독 입자, 예를 들어 판독 세포 또는 소포 상에 발현될 때 본 명세서에서 사용하기 적합하다. 일 실시양태에서, 표 2에 제공된 서브 클래스 중 하나의 RTK 상에 세포외 효과를 갖는 효과 세포를 포함하는 1 이상의 군집을 확인하기 위하여, 병렬 방식으로 복수의 세포 군집을 스크리닝하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 실시양태에서, 방법은 회수된 세포 군집을 제공하기 위해 세포외 효과를 나타내는 ASC를 포함하는 1 이상의 세포 집단을 회수하는 단계, 및 세포외 효과의 원인이 되는 ASC를 확인하기 위하여 한계 희석법에서 회수된 세포 군집을 1 이상의 추가적인 세포외 효과 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 본 실시양태에서, 회수된 군집은 한계 희석법에서 부분집단으로 나누어질 수 있다. 추가적인 세포외 효과 분석이 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나, 또는 벤치탑 분석법을 통해 수행될 수 있다. 또는, RTK에 세포외 효과를 나타내는 세포를 가지는 세포 군집이 확인되면, 세포 군집은 회수되어 용해되며, 핵산 증폭되어 서열분석된다. 추가적인 실시양태에서, 핵산은 1 이상의 항체 유전자를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 예를 들어, 분비 산물, 예를 들어 단일클론 항체를 통해 RTK에 길항 작용하거나 작용하는 (즉, 세포외 효과) 효과 세포를 포함하는 세포 군집의 확인에 관한 것이다. 효과 세포는 단독의 효과 세포, 균질한 환경 또는 이질적 환경 (예를 들어, 많은 상이한 효과 세포를 갖는)으로 존재한다.
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일 실시양태에서, RTK는 혈소판 유도 성장 인자 수용체 (PDGFR), 예를 들어, PDGFRα이다. PDGF는 여러 호모- 및 헤테로-다이머를 형성하기 위해 결합하는 가용성 성장 인자 (A, B, C 및 D) 패밀리이다. 이들 이량체는 서로 다른 특이성을 가진 2개의 밀접 관련된 수용체, PDGFRα 및 PDGFRβ에 의해 인식된다. 특히, PDGFα는 PDGFRα에 선택적으로 결합하여 폐 섬유증 (pulmonary fibrosis), 간 경화증 (liver cirrhosis), 경피증 (scleroderma), 사구체 경화 (glomerulosclerosis) 및 심장 섬유증 (cardiac fibrosis)을 비롯한 섬유성 질환에서 병리학적 중간엽의 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Andrae et al. (2008). Genes Dev. 22, pp. 1276-1312]을 참조하며, 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨). 마우스에서 PDGFRα의 구성적 활성화가 여러 기관에서 진행성 섬유화를 유도한다는 것이 또한 밝혀졌다 (Olson et al. (2009), Dev. Cell 16, pp.3303-313, 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨). 따라서, PDGFRα를 억제하는 치료법은 질병의 40%를 복잡하게 하는 상태인 섬유증 (fibrosis)의 치료에 대한 높은 가능성을 가지며, 고령화 인구에서 큰 충족되지 못한 의료 문제를 나타낸다. 항체 (이매티닙 (Imatinib) 및 닐로티닙 (Nilotinib))가 PDGFRα의 저해제로 연구되어 왔으나, 이들은 c-kit와 Flt-3를 포함하는 다른 중심 RTK에 유의한 부정확한 영향을 미쳐 수많은 부작용이 발생한다. 따라서, 이매티닙 및 닐로티닙은 PDGFRα와 PDGFRβ를 효과적으로 억제할 수 있으나, 부작용으로 인해 섬유성 질환의 치료에 허용되지 않으며 고도로 특이적인 항체 억제제에 대한 잠재성이 강조된다. 본 발명은 일 실시 양태에서, 이매티닙 및 닐로티닙과 비교할 때보다 큰 PDGFRα 특이성을 갖는 항체를 제공함으로써 이러한 문제점을 극복한다.
PDGFRα는 섬유증의 치료를 위한 표적으로 이미 확립되어 있다. 암 치료를 위한 초기 임상 시험에 진입하는 2개의 항-인간 PDGFRα mAb 안타아고니스트가 개발 중이다 (예를 들어, 문헌 [Shah et al (2010). Cancer 116, pp.1018-1026]를 참조하며, 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨). 본 명세서에서 제공되는 방법은 PDGFRα에 결합하는 효과 세포 분비 산물의 확인을 용이하게 한다. 추가적인 실시양태에서, 분비 산물은 암 및 섬유증 모델 모두에서 인간 및 마우스 PDGFRα 모두의 활성을 차단한다.
효과 세포 분비 산물이 PDGFRα에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 세포외 효과 분석법의 일 실시양태는, 생존 및 성장을 위해 사이토카인 IL-3에 절대적으로 의존하는 현탁 세포주 (예: 32D 및 Ba/F3)의 사용에 기초하지만, 거의 모든 티로신 키나아제의 발현 및 활성화를 통해 이 "IL-3 중독"을 치료할 수 있다. 이 접근법은 처음에 Dailey와 Baltimore가 BCR-ABL 융합 종양유전자를 평가하는 데 사용되었으며 저분자 티로신 키나아제 저해제의 고속대량 스크리닝에 광범위하게 사용되었다 (예를 들어, 문헌 [Warmuth et al. (2007) Curr. Oncology 19, pp.55-60, Daley and Baltimore (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, pp.9312-9316]을 참조하며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함됨). 신호전달을 모니터하기 위해, PDGFRα와 PDGFRβ (사람과 마우스 형태 모두)는 자연적으로 두 수용체를 발현하지 않는 쥐 조혈 세포주인 32D 세포 (판독 세포)에서 발현된다. 이것은 각 경로의 분리를 가능하게 하는데, 두 수용체가 종종 함께 발현되기 때문에 달리 어려운 점이 있다. 32D 세포에서의 인간 PDGFRα/β의 발현은 기능적 PDGF-유도 세포분열 촉진 반응을 제공하는 것으로 이미 확인되었다 (Matsui et al. (1989). Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A . 86, pp. 8314-8318, 전체가 참고로서 포함됨). IL-3가 없는 경우, 32D 세포는 전혀 분열하지 않지만, RTK를 발현하는 세포의 PDGF 자극은 IL-3에 대한 요구를 완화시키고 현미경으로 검출할 수 있는 신속한 세포분열 촉진 반응을 제공한다. 검출 가능한 반응은, 일 실시양태에서, 안타아고니스트의 존재하의 세포 증식, 형태학적 변화, 증가된 운동성/주화성 또는 세포 죽음/세포사멸이다. 광학적 다중화 방법은, 일 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나에서 PDGFRα 및 PDGFRβ 반응 모두의 저해/활성화를 동시에 측정하기 위해 사용된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 장치 중 하나에서 PDGFRα 및 PDGFRβ 반응 모두의 저해/활성화는, 동일한 분석 챔버에서 연속적으로 수행되는 2가지 세포외 분석법에 의해 측정된다.
인간/마우스 PDGFRα 및 PDGFRβ (Sino Biological)에 대한 전장 cDNA는, 일 실시양태에서, GFP 또는 RFP를 갖는 IRES 서열을 또한 포함하는 변형된 pCMV 발현 벡터를 사용하여 32D 세포 (ATCC; CRL-11346)에서 발현되어, 형광 영상화로 각각 구별할 수 있는 2가지 유형의 "판독 세포"를 만든다. 판독 세포는 배지 및 공급 조건을 최적화하고, PDGF 리간드에 대한 투여량 반응을 결정하는 것을 특징으로 하며, 반응의 형태 및 동역학을 특성화하는 것을 특징으로 한다. 현탁 세포 (예: 32D 또는 Ba/F3)을 사용하는 것은, 단일 세포를 영상 분석으로 쉽게 확인할 수 있다는 이점과, 단일 챔버가 세포 밀집에 도달하기 전에 100 이상의 판독 세포를 수용할 수 있도록 단일 세포가 부착 세포보다 물리적으로 더 작다 (투영된 영역에서)는 이점을 제공한다. 다른 실시양태에서, 32D 세포 대신에, 32D와 유사한 특성을 갖는 다른 IL-3 의존성 마우스 세포주인 Ba/F3 세포가 판독 세포로서 사용된다. 32D 및 Ba/F3 세포는 모두 골수에서 유래되었고, ASC를 위해 최적화된 배지에서 잘 자라며, ASC의 유지를 위한 중요한 성장 인자인 IL-6을 분비한다 (예를 들어, 문헌 [Cassese et al. (2003). J. Immunol . 171, pp. 1684-1690]을 참조하며, 전체가 본 명세서에서 참고로서 포함됨).
섬유증에서 PDGFRα의 역할을 평가하기 위한 전임상 모델이 개발되어 왔으며, 이는 세포외 효과 분석법에서 사용될 수 있다. 특히, 아래에서 논의되는 심장 섬유증의 2가지 모델이 사용될 수 있다. 첫번째는 허혈성 손상 (이소프로테레놀- 유발성 심장 손상 (isoproterenol-induced cardiac damage), ICD)을 기초로 하며, 두 번째는 관상 동맥 결찰-유발성 심근 경색 (coronary artery ligation-induced myocardial infarction, MI)을 기초로 한다. 손상 시, 섬유아세포 반응은 PDGFRα+/Sca1+ 양성 전구 세포의 신속한 확장에 의해 시작되는데, 손상에 반응하여 증식하는 세포의 50% 이상을 차지하며, 이어 PDGFRα 저(low)/Sca1 저(low) 근섬유아세포를 생성하는 매트릭스로 이들 자손을 분화한다. RT-qPCR에 의한 유전자 발현은 α-평활근 액틴 (αSMA) 및 콜라겐 타입 I (Col1)을 포함하여 섬유증 기질 침착과 관련된 다수의 마커의 발현을 보여주며, (Sca1+) 전구체에서 검출 가능하지만 차별화된 군집에서 실질적으로 상향조절된다. 일 실시양태에서, 섬유화를 감소시키는, 전구체 확장을 팽창을 약화시키는 단일클론 항체를 분비하는 효과 세포를 포함하는 세포 군집이 확인된다. 이 세포외 효과 분석은 Sca1+/PDGFRα+ 전구체 세포와 ColI-유도 GFP의 조기 증식이라는 2가지 독립적인 마커를 모니터링함으로써 수행된다. 특히, MI 이후, 섬유증 반응은 PDGFRα+/Sca1+ 전구체 내 먼저 GFP의 발현, 이후 새로 만들어진 근섬유아세포 군집에서의 증가된 강도를 특징으로 한다.
세포외 효과 분석법은, 일 실시양태에서, GPCR 세포외 효과 분석법, 예를 들어, GPCR 결합, 작용 또는 길항 작용이다. 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 세포외 효과는 군집 내의 모든 세포 또는 다수의 세포에 기인할 필요는 없다. 오히려, 본 명세서에서 제공되는 방법은, 효과 세포가 수십에서 수백 개의 세포 (예를 들어, 약 10 내지 약 250개의 세포 또는 약 10 내지 약 100개의 세포)를 포함하거나, 약 2 내지 약 50개의 세포, 예를 들어 약 2 내지 약 10개의 세포를 포함하는 이질적 군집 내 존재할 때, 단일 효과 세포의 세포외 효과의 검출을 가능하게 한다.
GPCR은 인간 게놈에서 800개 이상의 멤버를 포함하는 7개의 막관통 수용체의 수퍼패밀리이다. 각 GPCR은 세포의 세포외 표면에 위치하는 아미노 말단과 세포질을 향하는 C-말단 꼬리를 갖는다. 세포의 내부에서 GPCR은 헤테로트리머 G-단백질에 결합한다. 아고니스트 결합시, GPCR은 연관된 G-단백질의 활성화를 유도하는 구조 변화를 겪는다. 이들 중 약 절반은 후각 수용체이며 나머지는 칼슘과 대사 산물에서부터 사이토카인과 신경 전달 물질에 이르는 상이한 리간드 전반에 반응한다. 본 발명은, 일 실시양태에서, GPCR에 세포외 효과를 갖는 1 이상의 ASC를 선택하는 방법을 제공한다. 세포외 효과 분석법은 판독 입자, 예를 들어 판독 세포 또는 부속 입자, 예를 들어 부속 세포 상에 발현될 수 있는 한, 임의의 GPCR을 사용할 수 있다.
특정 GPCR과 자연적으로 연관되는 G-단백질의 유형은 형질도입된 세포 신호전달 케스케이드에 영향을 준다. Gq 결합 수용체의 경우, 수용체 활성화로 인한 신호는 세포 내 칼슘 수준의 증가이다. Gs 결합 수용체의 경우, 세포 내 cAMP의 증가가 관찰된다. 모든 GPCR의 50%를 구성하는 Gi 결합 수용체의 경우, 활성화는 cAMP 생산의 저해를 초래한다. 효과 세포 특성이 Gi 결합 GPCR의 활성화인 실시양태에 있어서, 아데닐릴 고리화효소의 비특이적 활성화제로 판독 세포(들)를 자극하는 것이 종종 필요하다. 일 실시양태에서, 아데닐 고리화효소 활성화제는 포스콜린 (forskolin)이다. 따라서, 1 이상의 효과 세포에 의한 Gi 결합 수용체의 활성화는 포스콜린에 의해 유도된 cAMP의 증가를 방지할 것이다. 이에 따라, 포스콜린은 본 명세서에서 제공되는 1 이상의 GPCR 세포외 효과 분석법에서 부속 입자로서 사용될 수 있다.
본 발명은, 일 실시양태에서, 세포 군집 내의 효과 세포 (예: ASC)가 GPCR에 세포외 효과를 나타내는지 여부를 결정하기 위한 수단을 제공한다. GPCR은 분석 챔버 내의 1 이상의 판독 입자 상에 존재하며, 세포외 효과는 일 실시양태에서, GPCR에 대한 결합, 예를 들어, 입증된 친화력 또는 특이성, 저해 또는 활성화이다. GPCR은 Heptares Therapeutics (안정화된 수용체, StaR® 기술)의 방법에 의해 제조된 GPCR 중 하나와 같은 안정화된 GPCR일 수 있다. 효과 세포 (예: ASC)는, 일 실시양태에서, 단일 세포로서 또는 분석 챔버 내의 동질의 또는 이질적인 세포 군집 내에 존재한다. 일 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치는 각각 표 3A 및/또는 표 3B에 기재된 GPCR 중 하나, 또는 문헌 [국제 PCT Publication WO 2004/040000, 전체가 참고로서 포함됨]에 개시된 GPCR 중 하나에 대한 세포외 효과를 입증하는 1 이상의 항체를 분비하는 1 이상의 ASC를 각각 포함하는 1 이상의 세포 군집을 확인하는데 사용된다. 예를 들어, 일 실시양태에서, GPCR은 하기의 분류 중 하나에 속한다: 클래스 A, 클래스 B, 클래스 C, 부착, 프리즐드 (frizzled).
다른 실시양태에서, 세포외 효과는 내피 분화, G-단백질-결합 (EDG) 수용체에 대한 효과이다. EDG 수용체 패밀리는 지질 신호전달의 원인이 되며 리소포스파티드산 (LPA) 및 스핑고신 1-포스페이트 (S1P)에 결합하는 11개의 GPCR (S1P1-5 및 LPA1-6)을 포함한다. LPA 및 S1P를 통한 신호전달은 세포 증식, 면역 세포 활성화, 이동, 침입, 염증 및 혈관신생을 포함하는, 건강 및 질병의 다양한 기능을 조절한다. 이 패밀리에 강력하고 특이적인 저분자 저해제를 생성하는데 거의 성공하지 못했기 때문에 mAb는 매우 매력적인 대안이 되었다. 일 실시양태에서, EDG 수용체는 S1P3 (EDG3), S1PR1 (EDG1)이고, 후자는 유방, 림프종, 난소 및 흑색종을 포함하는 암에서 NF-κB 및 STAT3를 활성화시키는 것으로 나타 났으며, 면역 세포 이동 (trafficking) 및 암 전이에서 중요한 역할을 한다 (문헌 [Milstien and Spiegel (2006), Cancer Cell 9, pp.148-15]을 참조하며, 본 명세서에서 전체가 참고로서 포함됨). S1P 리간드 (소넵시주맙 (Sonepcizumab))를 중화하는 단일클론 항체는 최근 진행성 고형 종양 치료를 위한 2상 임상 시험을 완료하였다 (NCT00661414). 일 실시양태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치는 소넵시주맙보다 큰 친화력을 갖는 항체, 또는 소넵시주맙보다 더 큰 정도로 S1P를 저해하는 항체를 분비하는 ASC를 확인 및 분리하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 세포외 효과는 LPA2 (EDG4) 수용체에 대한 효과이다. LPA2는 갑상선, 결장, 위 및 유방 암종뿐만 아니라 많은 난소 종양에서 과발현되며, 이에 대해 LPA2는 감도 및 LPA의 해로운 영향의 주요 원인이다.
일 실시양태에서, 세포 군집은 1 이상이 판독 입자 상에 존재하는 케모카인 수용체에 대한 세포외 효과를 보이는지 여부에 대해 분석된다. 추가적인 실시양태에서, 케모카인 수용체는 푸신 (fusin) 또는 CD184로도 알려진 C-X-C 케모카인 수용체 유형 4 (CXCR-4)이다. CXCR4는 C-X-C 모티프 케모카인 12 (CXCL12)라고도 알려진 면역 세포 모집에 강한 화학주성인 SDF1α (CXCL12)와 결합한다. DNA 면역화는 이 표적에 대해 92개의 하이브리도마를 생성하는데 사용되었으며, 그 중 75개는 상이한 사슬의 사용 및 에피토프 인식을 보였는데 (Genetic Eng and Biotech news, Aug 2013), 이는 하이브리도마 선택이 이용 가능한 항체 다양성의 작은 부분만을 포획함을 보여준다. CXCR4/CXCL12 축을 통한 신호전달은 종양 세포 성장, 혈관신생, 세포 생존에서 중추적인 역할을 하며 간 및 골수와 같은 CXCL12-생성 기관에서 2차 전이의 성장을 매개하는 데 관여하는 것으로 나타났다 (Teicher and Fricker (2010). Clin . Cancer Res. 16, pp. 2927-2931, 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨).
다른 실시양태에서, 세포 군집은 최근 SDF1α에 결합하는 것으로 밝혀진 케모카인 수용체 CXCR7에 대한 효과를 발휘할 수 있는 능력에 대해 스크리닝된다. 기본 G 단백질 커플링을 통해 신호를 전달하는 CXCR4와는 달리, CXCR7은 β-어레스틴 경로를 통해 고유하게 신호를 전달한다.
다른 실시양태에서, GPCR은, 노출된 N-말단의 트롬빈-매개 절단에 의해 활성화되고 섬유증에 관여하는 클래스의 GPCR인 프로테아제 활성화 수용체 (PAR1, PAR3 및 PAR4)이다. 또 다른 실시양태에서, GPCR은 하기 표 3A 또는 표 3B의 GPCR 중 하나이다.
결합, 활성화 또는 저해의 판독을 제공하도록 조작된, GPCR을 발현하는 세포주는 예를 들어 Life Technologies (GeneBLAzer® 및 Tango™ 세포주), DiscoveRx, Cisbio, Perkin Elmer로부터 상업적으로 입수 가능하며, 본 명세서에서 기술된 GPCR 세포외 효과 분석법에서, 예를 들어 판독 세포로서 사용하기에 적합하다.
일 실시양태에서, 하나의 하기 수용체 패밀리로부터의 GPCR은 1 이상의 판독 세포에 발현되며, 세포외 효과는 1 이상의 하기 GPCR와 관련하여 측정된다: 아세틸콜린 수용체, 아데노신 수용체, 아드레날린 수용체, 안지오텐신 수용체, 브래디키닌 수용체, 칼시토닌 수용체, 칼슘 감지 수용체, 카나비노이드 수용체, 케모카인 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 보체 성분 (C5AR1), 코르티코트로핀 분비 인자 수용체, 도파민 수용체, 상피 분화 유전자 수용체, 엔도텔린 수용체, 포르밀 펩티드-유사 수용체, 갈라닌 수용체, 가스트린 방출 펩티드 수용체, 수용체 그렐린 수용체, 위 억제 폴리펩티드 수용체, 글루카곤 수용체, 고나도트로핀 방출 호르몬 수용체, 히스타민 수용체, 키스펩틴 (KiSS1) 수용체, 류코트리엔 수용체, 멜라닌-응집 호르몬 수용체, 멜라노코르틴 수용체, 멜라토닌 수용체, 모틸린 수용체, 신경펩티드 수용체, 니코틴산, 오피오이드 수용체, 오렉신 수용체, 고아 수용체, 혈소판 활성 인자 수용체, 프로키네티신 수용체, 프로락틴 방출 펩티드, 프로스타노이드 수용체, 프로테아제 활성화 수용체, P2Y (퓨린성) 수용체, 릴랙신 수용체, 세크레틴 수용체, 세로토닌 수용체, 소마토스타틴 수용체, 타키키닌 수용체, 바소프레신 수용체, 옥시토신 수용체, 혈관작용 장 펩티드 (VIP) 수용체 또는 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 폴리펩티드 (PACAP) 수용체.
[표 3a]
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[표 3b]
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일 실시양태에서, 효과 세포는 GPCR을 발현하는 판독 세포에 대한 세포외 효과에 대해 표 4에 제공된 1 이상의 분석법에 의해 분석된다. 다른 실시양태에서, 판독 입자 군집은 소포 또는 막 추출물로 기능화된 비드 (Integral Molecular로부터 입수 가능함), 또는 안정화된 가용화된 GPCR (예: Heptares)을 포함한다. 상단 및 하단 성분을 함께 제공하기에 앞서, 판독 입자는 장치의 상단 성분 내에 형성된 미세채널을 통해 챔버에, 또는 하단 성분 내 개방 챔버에 직접 첨가된다.
GPCR은 인산화되어 아레스틴으로 불리우는 단백질과 상호작용할 수 있다. 아레스틴의 활성화를 측정하는 3개의 주요 방법은 다음과 같다: (i) 현미경 관찰 - 형광 표지된 아레스틴 (예: GFP 또는 YFP)를 이용함; (ii) 효소 상보성; (iii) TANGO™ 리포터 시스템 (β-락탐아제) (Promega)의 이용. 일 실시양태에서, TANGO™ 리포터 시스템이 판독 세포 또는 복수의 판독 세포에서 이용된다. 이러한 기술은 절단가능한 링커를 통해 전사 인자에 연결된 GPCR을 사용한다. 아레스틴은 무능한 (crippled) 프로테아제에 융합된다. 아레스틴이 GPCR에 결합하면, 프로테아제 및 링커의 높은 국소 농도는 링커의 절단을 초래하여, 전사 인자를 핵에 방출하여 전사를 활성화한다. β-락탐아제 분석이 살아있는 세포에 대해 수행될 수 있으며, 이는 세포 용해를 요하지 않고, 6시간만큼 적은 아고니스트 인큐베이션 동안 영상화될 수 있다.
일 실시양태에서, GPCR 신호전달의 안타아고니스트 및 아고니스트의 검출에 보편적으로 사용될 수 있는 β- 아레스틴 GPCR 분석법은, GPCR에 결합하는 생체분자를 분비하는 효과 세포를 확인하기 위하여 본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치에서 사용된다 (Rossi et al. (1997). Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 94, pp. 8405-8410, 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함됨). 본 분석법은 현재 DiscoveRx에 의해 상용화된 β-갈락토시다아제 (β-Gal) 효소-보완 기술에 기초한다. GPCR 표적은 β-Gal 효소의 작은 N-말단 단편과 프레임 내에서 융합된다. GPCR 활성화시, β-Gal의 N-말단 서열에 연결된 β-어레스틴을 포함하는 두 번째 융합 단백질이 GPCR에 결합하여, 기능적 β-Gal 효소를 형성한다. 이후 β-Gal 효소는 비 형광성 기질인 디-β-D-갈락토피라노시드 (FDG)를 플루오레세인으로 신속하게 전환시켜, 큰 증폭력과 탁월한 감도를 제공한다. 본 실시양태에서, 판독 세포는 (GPCR와 함께) 1 이상의 장치 챔버로 도입되기 전에 세포-투과성 전-기질 (아세틸화된 FDG)로 미리 로딩된다. 전-기질은 아세테이트 그룹의 에스터라아제 분해에 의해 세포-불투과성 FDG로 전환된다. 플루오레세인은 살아있는 세포에서 능동 수송되지만, 분석 챔버 내에서 이 분석을 수행함으로써 형광 물질이 농축되어, 플레이트-기반 분석법에 비해 훨씬 향상된 감도를 제공한다. DiscoveRx는 GPCR의 대형 패널 전반에 걸쳐 마이크로웰 형식으로 사용되는, 이 분석 방법을 검증하였다.
일 실시양태에서, 효과 세포에 의한 GPCR의 활성화는, 판독 세포(들)에서 세포질 칼슘의 증가를 검출함으로써 확인된다. 추가적인 실시양태에서, 세포질 칼슘의 증가는 1 이상의 칼슘 민감성 염료로 검출된다. 칼슘 민감성 염료는 칼슘이 없는 경우 낮은 수준의 형광을 나타내며 칼슘이 결합하면 형광 특성이 증가한다. 형광 신호는 약 1분에서 최고점에 도달하며 5분에서 10분 사이에 감지된다. 따라서, 형광 칼슘을 사용하여 활성을 검출하기 위해, 아고니스트의 검출 및 첨가는 밀접하게 연결된다. 이러한 연결을 이루기 위해, 효과 세포는 판독 세포 군집 및 1 이상의 칼슘 민감성 염료에 동시에 노출된다. 일 실시양태에서, 1 이상의 칼슘 민감성 염료는 FLIPR ™ 칼슘 분석 (Molecular Devices)에서 제공되는 염료이다.
재조합 발현된 해파리 광단백질인 에쿠오린은, 일 실시양태에서, 기능적 GPCR 스크린, 즉 세포외 효과가 GPCR의 조절인 세포외 효과 분석에서 사용된다. 에쿠오린은 코엘렌테라진 (coelenterazine) 유도체를 첨가하면 발광 신호를 생성하는 칼슘-민감성 리포터 단백질이다. 미토콘드리아 표적화된 버전의 에쿠오린을 이용하여 발현된 GPCR을 이용하여 조작된 세포주는 상업적으로 입수 가능하다 (Euroscreen). 일 실시양태에서, Euroscreen에서 입수 가능한 1 이상의 세포주는 효과 세포의 세포외 효과 (예: 다른 세포 군집 또는 대조군 값과 비교할 때 세포외 효과의 변화)를 평가하는 방법에서 판독 세포 군집으로서 사용된다.
일 실시양태에서, GPCR에 대한 세포외 효과는 판독 세포의 군집으로서 GPCR 및 사이클릭 뉴클레오티드-의존성 (CNG) 채널을 발현하는 ACTOne 세포주 (Codex Biosolutions) 중 하나를 사용하여 측정된다. 본 실시양태에서, 세포외 효과 분석법은 외인성 사이클릭 뉴클레오티드-의존성 (CNG) 채널을 포함하는 세포주에서 작용한다. 채널은 cAMP의 상승된 세포 내 수준에 의해 활성화되어, 이온 유속 (흔히 칼슘 반응성 염료에 의해 검출 가능함) 및 형광 막 전위 (MP) 염료로 검출될 수 있는 세포막 탈분극을 초래한다. ACTOne cAMP 분석법은 형광 마이크로플레이트 리더로 세포 내 cAMP 변화의 종료점 및 단백질 상호작용 분석 (kinetic measurement)을 가능하게 한다.
리포터 유전자 분석법은, 일 실시양태에서, 효과 세포가 특정 GPCR를 조절하는지 여부 (예: 효과 세포를 포함하는 세포 군집이 특정 GPCR을 조절하는지 여부)를 확인하기 위해 사용된다. 본 실시양태에서, GPCR의 조절은 평가되는 세포외 효과이다. 리포터 유전자 분석법은, 일 실시양태에서, 사용자에 의해 선택된 리포터 단백질의 발현을 차례로 제어하는 최소 프로모터의 업스트림에 위치한 반응성 성분을 활성화 또는 저해하는 칼슘 (AP1 또는 NFAT 반응 성분) 또는 cAMP (CRE 반응 성분)와 같은 GPCR 2차 메신저에 기초한다. 리포터의 발현은, 일 실시양태에서, GPCR를 통한 신호전달에 의해 활성화되는 전사 인자의 반응 성분에 연결된다. 예를 들어, 리포터 유전자 발현은 하기 전사 인자 중 하나에 대한 반응성 성분에 연결된다: ATF2/ATF3/AFT4, CREB, ELK1/SRF, FOS/JUN, MEF2, GLI, FOXO, STAT3, NFAT, NFκB. 추가적인 실시양태에서, 전사 인자는 NFAT이다. 리포터 유전자 분석법은 예를 들어 SA Biosciences로부터 상업적으로 이용 가능하다.
리포터 단백질은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제 (예를 들어 문헌 [Paguio et al. (2006). "Using Luciferase Reporter Assays to Screen for GPCR Modulators," Cell Notes Issue 16, pp. 22-25; Dual-Glo™ Luciferase Assay System Technical Manual #TM058; pGL4 Luciferase Reporter Vectors Technical Manual #TM259]을 참조하며, 이들 각각은 모든 목적을 위해 전체가 참고로서 포함됨), 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 시안 형광 단백질 (CFP), β-락탐아제를 포함한다. GPCR 신호전달을 측정하기 위한 리포터 유전자 분석법은 상업적으로 이용 가능하며 본 명세서에서 기술된 방법 및 장치에서 사용될 수 있다. 예를 들어, GeneBLAzer® 어세이 (Life Technologies)가 본 발명과 함께 사용하기에 적합하다.
일 실시양태에서, cAMP 결합 GPCR이 칼슘을 통해 신호전달하도록 강제하기 위해 (강제 커플링 (force coupling)으로 칭해짐) 리포터 세포 내 G 단백질의 과발현이 수행된다.
일 실시양태에서, Gq 결합 세포주는 본 명세서에서 기술된 방법에서 판독 세포주로 사용된다. 일 실시양태에서, Gq 결합 세포주는 β-락탐아제를 통한 GPCR 신호전달을 보고한다. 예를 들어, 세포-기반 GPCR 리포터 세포주 GeneBLAzer®가 사용될 수 있다 (Life Technologies). 리포터 세포주는 분열 정지되거나 정상 분열 세포를 포함할 수 있다.
cAMP 반응성 성분-결합 단백질 (CREB)은 상술한 전사 인자이며, 일 실시양태에서 Gs 및/또는 Gi 결합 GPCR에 대해 사용된다. 추가적인 실시양태에서, 포스콜린은 부속 입자로 이용된다. CRE 리포터는 GFP 발현을 일으키기 위한 플라스미드 또는 렌티바이러스 형태로 이용 가능하며 (SA Biosciences), 본 명세서에서 기술된 방법 및 장치와 함께 사용하기에 적합하다. 예를 들어, SA Biosciences로부터 이용 가능한 분석 시스템은, 일 실시양태에서 판독 세포를 생산하기 위해 본 명세서에서 사용된다 (http://www.sabiosciences.com/reporter_assay_product/HTML/CCS-002G.html). Life Technologies는 또한 특정 GPCR을 발현하는 CRE-반응성 세포주를 갖고 있으며, 이들은 판독 세포뿐만 아니라 본 명세서에서 기술된 방법에서 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 세포 군집 내 존재하는 1 이상의 효과 세포는 1 이상의 판독 세포 내 존재하는 GPCR 활성화 또는 길항 작용 능력에 대해 1 이상의 판독 세포 내 cAMP 수준의 증가 또는 감소를 검출함으로써 분석된다. ELISA 기반 어세이, 균일 시분해 형광분광법 (HTRF) (문헌 [Degorce et al. (2009). Current Chemical Genomics 3, pp. 22-32]을 참조하며, 이는 전체가 참고로서 포함된다), 및 효소 complementation는 모두 본 명세서에서 제공되는 장치 및 분석법과 함께 판독 세포 내 cAMP 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이들 cAMP 검출 방법 각각은, 실제로 측정되는 사이클릭 AMP이므로, 검출을 위해 cAMP를 유리시키는 세포 용해를 필요로 한다.
전체 세포 내 cAMP를 측정하고 막 내 아데닐 고리화효소 활성을 측정하는 분석법은 상업적으로 이용 가능하며 (예를 들어 문헌 [Gabriel et al. (2003). Assay Drug Dev . Technol. 1, pp. 291-303; Williams (2004). Nat. Rev. Drug Discov. 3, pp. 125-135]을 참조하며, 각각은 전체가 참고로서 포함됨), 본 명세서에서 제공되는 장치 및 방법에서 사용하기에 적합하다. 즉, 1 이상의 분석 챔버 내 세포 군집은 본 방법에 따라 분석될 수 있다.
Cisbio International (Codolet, France)은 시분해 형광 공명 에너지 전이 기술에 기초한 민감한 고속대량 균일 cAMP 분석법 (HTRF, 문헌 [Degorce et al. (2009). Current Chemical Genomics 3, pp. 22-32]을 참조하며, 본 개시는 전체가 참고로서 포함된다)을 개발해왔으며, 이는 본 명세서에서 GPCR에 효과를 보이는 효과 세포를 스크리닝 하는데 사용될 수 있다. 방법은 세포에 의해 생산되는 native cAMP와 cAMP-표지된 염료 (cAMP-d2) 간의 경쟁 면역분석법이다. cAMP-d2 결합은 크립테이트로 표지된 MaB 항-cAMP에 의해 시각화된다. 특이적 신호 (즉, 에너지 전이)는 시료 내 cAMP의 농도, 이 경우, 판독 세포 내 효과 세포 또는 효과 세포 분비 산물에 의해 활성화된 cAMP의 양에 반비례한다. cAMP가 측정되면, 판독 세포는 먼저 용해되어 검출을 위해 cAMP를 유리한다. 상기 분석법은 Gs- (β2- 아드레날린, 히스타민 H2, 멜라노코르틴 MC4, CGRP 및 도파민 D1) 및 Gi /o-결합 (히스타민 H3) 수용체 모두에 대해 입증되었다. 본 명세서에 기술된 다른 분석법과 마찬가지로, 성분은 예를 들어 장치의 하단 성분을 노출시키고 하단층의 챔버를 통해 또는 하단 성분의 챔버 위로 유입되는 제2 성분 내 채널을 통해 성분을 포함하는 용액을 피펫팅함으로써, 하단 성분의 챔버에 직접적으로 도입될 수 있다. 일 실시양태에서, 액체 컬럼에 의해 생성된 정수압을 통해, 피펫과 같은 분배기구를 사용하여 유동을 생성함으로써, 또는 하단 성분 위에 위치한 배지를 교환하고 상단 성분 또는 하단 성분을 위아래로 움직여 미세챔버로의 유체 이동을 유발함으로써, 시약/배지의 챔버로의 이동이 일어날 수 있다.
형광 편광에 기초한 cAMP 분석 키트는 또한 예를 들어 Perkin Elmer, Molecular Devices 및 GE Healthcare로부터 상업적으로 입수 가능하며, 각각은 본 명세서에서 제공되는 방법 및 장치에서 세포외 효과 분석법으로 사용하기에 적합하다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시양태는 cAMP 형광 편광 분석의 결과에 기초하여 1 이상의 효과 세포를 포함하는 효과 세포 및/또는 세포 군집을 선택하는 것을 포함한다. 본 방법은 일 실시양태에서 효과 세포가 특정 GPCR을 활성화(작용)하는지 또는 저해(길항 작용)하는지를 확인하기 위해 사용된다.
일 실시양태에서, 레이저 활성화를 필요로하는 민감한 비드-기반 화학발광 분석법인, AlphaScreen™ cAMP 분석법 (Perkin Elmer)은 판독 세포에 대한 효과, 구체적으로 GPCR의 활성화 또는 억제를 갖는 효과 세포를 스크리닝하기 위한 본 명세서에서 제공되는 장치에서 사용된다.
DiscoveRx (http://www.discoverx.com)는 형광 또는 발광 기질을 사용하는 특허된 효소 (β- 갈락토시다아제) 보완 기술 (Eglen and Singh (2003). Comb Chem. High Throughput Screen 6, pp. 381-387; Weber et al. (2004). Assay Drug Dev. Technol . 2, pp. 39-49; Englen (2005). Comb. Chem . High Throughput Screen 8, pp. 311-318, 각각은 전체가 참고로서 포함됨)에 기초한 HitHunterTM로 불리우는 균일한 고속대량 cAMP 분석 키트를 제공한다. 상기 분석법은 GPCR을 발현하는 판독 세포 상에 세포외 효과를 나타내는 효과 세포를 검출하는데 사용될 수 있다.
GPCR 수용체 활성화 또는 저해로부터 유래된 세포 작용은 또한 판독 세포에서 효과 세포의 특성(들) (예를 들어, 항체 생산 세포의 활성화 또는 길항 능력)을 결정하기 위해 검출될 수 있다. 예를 들어, Gq 결합 수용체의 경우, GPCR이 활성화될 때, Gq 단백질이 활성화되어, 막 인지질의 포스포리파아제 C 절단을 초래한다. 이 절단은 이노시톨 트리포스페이트 3 (IP3)의 생성을 가져온다. 유리 IP3은 소포체의 표면에서 그 표적에 결합하여 칼슘의 방출을 일으킨다. 칼슘은 활성화된 T 세포 (NFAT)의 핵 인자와 같은 특정 칼슘 반응성 전사 벡터를 활성화시킨다. 따라서, NFAT 활성 또는 발현을 모니터링함으로써, 판독 세포에서 GPCR의 간접적 판독이 이루어진다. 예를 들어 문헌 [Crabtree and Olson (2002). Cell 109, pp. S67-S79, 전체가 본 명세서에 참고로서 포함됨]을 참조한다.
활성화되면, 모든 GPCR 중 60% 이상이 내재화된다. 표지된 GPCR (일반적으로 C-말단 GFP 표지로 행해짐)을 이용하여, 수용체의 분포는, 일 실시양태에서, 리간드의 존재 및 부재 하에서 영상화된다. 리간드 자극에 따라, 일반적으로 균일하게 분포된 수용체가 흔히 세포내 섭취된 반점 (endocytosed puncta)으로 나타난다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 GPCR 기능 분석.
분석법 생물학적 측정 시약 (부속 입자) 근거 종료점 비고
유로퓸-GTPTM
결합 (Perkin
Elmer)		 막-기반 GPCR 매개된 구아닌 뉴클레오티드 교환 유로퓸-GTP 유로퓸-표지된 GTP의 수용체 활성화 G 단백질에 대한 결합 시분해 형광 발광 수용체 활성화, 비방사능에 근접함
AlphaScreen ™ (Perkin Elmer) 세포-기반 cAMP 축적 cAMP MAb 결합된 수용체 비드, 화학발광 화합물과 함께 스트렙타아비딘-코팅된 공여체 비드, 비오티닐-cAMP cAMP는 높은-친화력의 스트렙타아비딘-코팅된 공여체 비드에 결합한 비오티닐-cAMP와 경쟁함, 수용체-공여체 비드의 근접성 감소에 따른 신호 손실 높은 감도, 균질함, 자동화에 적합함, 넓은 선형 검출 범위
형광 편광 (Perkin Elmer, Molecular Devices, GE Healthcare) 세포- 또는 막-기반 cAMP 축적 cAMP MAb, 형광 cAMP cAMP는 cAMP MAb에 결합한 Fluor-cAMP와 경쟁함, 회전 및 편광의 감소에 따른 신호 손실 형광 편광 균질함, 자동화에 적합함
HTRF cAMP (Cisbio) 세포-기반, cAMP 축적 유로크립테이트와 결합된 cAMP MAb, 수용체 분자 표지된 cAMP cAMP는 유로퓸-결합된 cAMP Mab에 결합하는 수용체-표지된 cAMP와 경쟁함, 유로퓸-수용체 분자 근접성의 감소로 인한 신호 손실 시분해 형광 넓은 선형 범위, 높은 신호-to-노이즈, 균질함, 자동화에 적합함
HitHunter™(DiscoveRx) 세포-기반, cAMP 축적 cAMP MAb, ED-cAMP (효소 단편 dono-cAMP 결합체) 결합된 펩티드, 수용체 단백질, 용해 버퍼 cAMP는 ED-cAMP와 수용체 펩티드의 결합을 이용한 β-Gal 활성 보완에 대해 경쟁함, 효소 보완으로서 신호 손실이 감소됨 형광 또는 발광 낮은 화합물 간섭, 높은 감도, 균질함, 자동화에 적합함
IP1™ (Cisbio) 세포-기반 IP1 축적 유로퓸-결합된 IP1 MAb, 수용체 표지된 IP1 IP1이 유로퓸-Mab 결합된 수용체-표지된 IP1의 결합에 대해 경쟁함에 따른 신호의 손실 시분해 형광 균질함, 구성적으로 활성인 Gq-결합 GPCR에 사용될 수 있음
FLIPR™(Molecular Devices) 세포-기반, 세포내 칼슘의 증가 칼슘 민감성 염료; 칼슘-3 세포내 염료가 칼슘에 결합함에 따라 증가된 형광 형광 민감성, 균질함, 세포 용해 없음, 자동화에 적합함
AequoScreen™(EuroScreen) 세포-기반, 세포내 칼슘의 증가 발현되는 세포주는 난잡한 또는 키메릭 G 단백질 및 미토콘드리아 표적된 버전의 아포 에쿠오린과 함께 GPCR을 선택함 칼슘-민감성 에쿠오린은 코엘렌테라진 유도체가 첨가되면 발광 신호를 생성함 발광 민감성, 균질함, 세포 용해 없음, 자동화에 적합함
리포터 유전자 세포-기반, GPCR 결합에 의해 활성화된 2차 메신저 내 증가로 인한 리포터 유전자 발현의 증가 여러 프로모터 플라스미드 및 리포터 2차 메신저 내 GPCR 변화는 선택된 리포터 유전자의 발현을 변화시킴 형광, 발광, 흡광 균질함, 신호 증폭
흑색소포 (Arena Pharmaceuticals) 세포-기반, 색소 분산의 변화 PKA의 저해와 멜라노솜 응집은 PKA 또는 PKC의 활성화로 흩어짐 흡광 민감성, 균질함, 세포 용해 없음, 자동화에 적합함
문헌 [Thomsen et al. (2005). Current Opin . Biotechnol . 16, pp. 655-665, 모든 목적을 위해 본 명세서에서 전체가 참고로서 포함됨]으로부터 편집함
판독 입자 반응은 선택된 단일 세포를 자동으로 회수하고 회수된 세포를 고속대량 게놈 분석에 적합한 마이크로웰 플레이트에 위치시킨 후 세포 생존 가능성에 필요한 조건을 유지하면서 다수의 형광 채널에서 보다 신속한 영상화를 가능하게 하는 기기 장치를 사용하여 평가할 수 있다 (도 31). 일 실시양태에서, 기기 장치는 컴퓨터 제어 및 소프트웨어 자동화, 정밀 인코더, 전동 초점, 고해상도 카메라, 급속 형광 조명 시스템, 온도, 습도 및 이산화탄소 가스 수준을 유지하는 환경 테두리 (enclosure), 및 임의의 선택된 챔버로부터 세포를 회수하기 위한 미세피펫을 유도할 수 있는 로봇식의 미세조작 로봇을 갖는 자동화된 x-y 이동 스테이지가 구비된 도립 형광 현미경, 및 회수된 세포가 놓아지는 인접한 멀티웰-플레이트를 포함한다. 일 실시양태에서, 기기 장치는 세포의 회수 전에 장치의 상단이 제거되도록 하는 2개-성분 미세유체 장치와 관련하여 사용된다. 일 실시양태에서, 장치의 상단 성분의 제거는 기기 장치의 로봇 조작기를 사용하여 자동화된다. 다른 실시양태에서, 기기 장치는 개방 어레이를 포함하는 장치 내의 세포를 분석하는데 사용되며, 고체 조각은 영상화 동안 어레이의 상단 위로 배지의 압출을 위해 위치된다. 일 실시양태에서, 기기 장치는 챔버의 개방 어레이를 특징으로 하는 장치 내의 세포를 분석하는데 사용된다. 일 실시양태에서, 기기 장치는 챔버의 개방 어레이를 특징으로하는 장치로 구성되며, 각 챔버는 그 최소 측면 치수보다 큰 높이/깊이를 갖는다. 일 실시양태에서, 미세유체 장치로의 시약의 이동 솔레노이드 밸브 또는 연동 펌프를 사용하여 자동화된다. 일 실시양태에서, 기기 장치는 관심있는 효과 세포를 포함하는 챔버의 신속한 확인을 가능하게 하는 영상 분석 소프트웨어와 함께 사용된다. 일 실시양태에서, 미세유체, 2개-성분 미세유체, 또는 챔버의 개방 어레이는 적어도 10,000개의 챔버, 적어도 100,000개의 챔버, 또는 적어도 1,000,000개의 챔버를 가진다. 일 실시양태에서, 기기 장치는 광역장 현미경 대물 렌즈 및 고해상도 카메라를 사용한 신속한 영상화를 위해 구성되어, 8개 이상의 챔버가 단일 영상에서 영상화될 수 있다. 일 실시양태에서, 기기 장치는 광역장 현미경 대물 렌즈 및 고해상도 카메라를 사용한 신속한 영상화를 위해 구성되어, 약 10개 초과, 약 15개 초과, 또는 약 16개 초과의 챔버가 단일 영상에서 영상화될 수 있다. 하나의 시야에서 영상화될 수 있는 챔버의 수는 챔버의 전체 밀도에 의존하고 챔버의 밀도가 높아지면 전체 영상화 속도가 더 빨라질 것임이 이해될 것이다. 본 발명의 맥락에서, 최대 챔버 밀도는, 적어도 하나의 세포 및 세포 또는 비드일 수 있는 적어도 하나의 판독 입자를 수용하는데 필요한 챔버의 요구된 면적에 의해 결정된다. 이 최소 크기는 대략 10㎛ × 10㎛ = 100㎛2이지만, 실제로는 영상화를 용이하게 하기 위해 입자 또는 세포의 챔버 내 분산을 위한 충분한 영역을 제공하기 위하여, 그리고 챔버 당 보다 많은 수의 세포 또는 입자를 이용하여 분석을 할 수 있도록 하기 위하여, 챔버 당 1 이상의 판독 입자를 달성하는 확률적 로딩 전략을 용이하게 하는 더 큰 챔버 영역을 갖는 것이 바람직하다. 약 25 μm × 25 μm, 또는 약 50 μm × 50 μm 또는 약 75 μm × 75 μm 또는 약 100 μm × 100 μm 또는 약 150 μm × 150 μm 또는 약 200 μm × 200 μm, 또는 약 300 μm × 300 μm의 챔버 측면 치수가 사용될 수 있다. 약 25 μm의 간격이 챔버 간에 제공된다면, 이는 약 400/mm2 또는 약 178/mm2 또는 약 100/mm2 또는 약 33/mm2 또는 약 20/mm2 또는 약 9/mm2의 챔버 밀도에 대응한다.
실시예
본 발명은 추가로 다음의 실시예들을 참조하여 추가로 설명된다. 그러나, 앞서 기술된 실시양태와 마찬가지로 이들 실시예들은 예시적이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안됨을 유의하여야 한다.
실시예 1 - 2개-성분 미세유체 장치에의 균일한 로딩
각 미세유체 챔버의 어레이를 포함하는 2개-성분 미세유체 장치의 로딩의 효능을, 장치의 하단 성분의 개방 챔버에 여러 유형의 미세입자를 로딩하여 평가하였다. 미세유체 챔버의 면적은 80 μm × 120 μm × 160 μm (너비, 길이, 높이)였다.
각각 상이한 농도의 형광단으로 표지된 5 μm 직경의 폴리스티렌 비드를 포함하는 5개의 군집의 미세입자를 mL당 약 1,000,000 비드의 일정한 농도에서 제조하였다. 각 5개의 군집을 함께 단일 튜브에서 동일한 부피비로 혼합하였다. 약 100,000개의 총 미세비드를 포함하는 혼합물의 100 μL의 분획을 약 10,000개의 총 챔버를 갖는 2개-성분 미세유체 장치의 하단층의 단면에 도입하였다. 이는 챔버 당 약 10개의 비드에 대응한다.
상기 장치를 이후 20분 동안 인큐베이팅 하여 비드가 챔버 내에 자리잡도록 하였다. 이후 챔버 내 배지를 제거하고 어레이에 신선한 배지를 흘려 챔버를 세척하였다. 장치의 제2 층을 챔버 하단층의 위에 올려두었다. 미세유체 챔버 어레이의 10,000개의 챔버를 이후 형광으로 영상화하고 자동 영상 분석을 사용하여 챔버 내 각 비드 타입의 분포를 확인하였다. 상기 분석은 각 비드 타입에 대하여 검출된 챔버 당 하기 평균 비드 수 및 표준 편차를 나타내며, 챔버에 걸쳐 비드의 일반적으로 균일한 분포를 보여주었다:
타입 1 = 0.53/챔버, SD = 0.89;
타입 2 = 1.46/챔버, SD = 1.4;
타입 3 = 2.45/챔버, SD = 1.89;
타입 4 = 3.90/챔버, SD = 2.33;
타입 5 = 2.89/챔버, SD = 1.70.
영상 서브세트의 수동 검사는 타입 1 비드의 주파수가 낮게 측정된 것의 원인이 주로 영상 분석 소프트웨어가 그 비드 타입을 검출하지 못하기 때문임을 보여주며; 이는 가장 낮은 농도의 형광 염료를 갖는 타입 1 비드를 원인으로 한다. 장치의 상이한 영역에 걸친 비드 분포 밀도의 육안 검사에 의해 결정되는, 비드 분포의 공간적 균일성에 대한 정성 분석은, 이러한 특성이 비드를 투입 채널을 통해 미세유체 챔버에 로딩할 때 얻어지는 특성과 비교할 때 우수함을 나타내었다.
실시예 2 - 2개-성분 미세유체 장치로의 세포 로딩
부착 판독 세포의 로딩을 본 발명의 2개-성분 장치에서 평가하고 MSL를 통해 제조된 미리 조립된 미세유체 장치로의 동일한 세포의 로딩과 비교하였다.
미리 조립된 미세유체 장치로의 부착 세포주 (Tango™ CXCR4-bla U2OS)의 로딩은 세포를 유입구를 통해 도입하고 이를 개별 챔버로 미세유체 채널 (채널 너비 100 μm)을 통해 유입시킴으로써 평가하였다. 이는 장치의 중앙에서 세포의 농도가 증가되고 장치의 모서리에는 세포 로딩이 낮은, 좋지 않은 챔버 로딩 균일성, 및 인접한 챔버 간에 세포 로딩 밀도의 큰 차이를 초래하였다. 세포 부착으로 인해 트립신을 포함하는 배지 조건에서도 채널이 막힌 것이 관찰되었다 (도 32). 나아가, 챔버로 로딩되면 인큐베이션 이후, 세포가 아래로 잘 내려가지 않았으며 압력에 일정한 형태를 보였다. 세포는 처음 24시간의 배양 후 대부분 죽어 생존력이 좋지 않았다.
생존력 문제를 해결하고 챔버 내 세포 플레이팅을 개선하기 위하여, Tango™ CXCR4-bla U2OS 세포를 미리 조립된 제2 미세유체 장치에 유입구를 통해 로딩하였으며, 이후 개별 챔버로 미세유체 채널을 통해 유입시켰다. 그러나, 제1 장치와 대조적으로, 채널 및 챔버는 먼저 폴리-리신을 포함하는 배지에 노출되었다. 세포를 폴리-리신으로 코팅된 채널을 통해 로딩하려는 시도는 세포가 채널 표면에 빠르게 달라붙는 결과를 초래하였으며, 이로 인해 채널이 막히고 실험이 실패하였다.
2개-성분 장치 내 부착 세포의 로딩을 테스트하는 세번째 실험을 수행하였다. 장치의 하단층을 먼저 폴리-리신을 포함하는 배지로 약 10분 동안 코팅하고, 폴리-리신을 포함하지 않는 신선한 배지로 세척하였다. 이어 Tango™ CXCR4-bla U2OS 세포를 장치의 하단 어레이 층의 챔버에 로딩하고, 수 시간 동안 아래로 내려가도록 하였다. 챔버 (67 μm 너비 ×112 μm 길이)를 이후 신선한 배지로 세척하고, 2개-성분 장치를 제조하기 위하여 장치의 상단층을 하단층 위에 위치시켰다. 조립된 2개-성분 장치의 영상은, 접종 밀도 및 어레이에 걸친 무작위 배치에 기초하여 예측되는 것과 일치하며, 로딩 밀도에서의 임의의 명백한 공간 편재와 일치하지 않는 세포 수를 갖는 챔버로의 세포 로딩이 양호하게 균일하게 되었음을 보여주었다 (도 33). 나아가, 총 세포 수가 챔버 당 원하는 세포 수 및 챔버의 총 수의 곱과 거의 같도록 계산된 로딩 용액 내 세포 농도 및 부피의 선택에 의해 이루어지는 세포 접종 밀도의 제어는, 세포 로딩 제어가 챔버 당 약 1개의 세포 내지 챔버 당 약 20개의 세포가 되도록 하였다. 부착 세포의 경우, 광학 접종 밀도가 챔버 하단의 면적에 의해 결정되었다. 예를 들어, U20S 세포 및 67 μm ×112 μm의 측면 치수를 갖는 챔버의 경우, 챔버 당 평균 약 10 내지 15개의 세포가 균일성 및 세포를 플레이팅 하는 능력의 측면에서 좋은 결과를 제공하였다. 폴리-리신으로 코팅된 2개-성분 장치에 로딩되는 경우, 세포는 정상적 형태를 나타내는 것으로 확인되었으며, 양호한 생존력을 가지며 스트레스의 징후 없이 밤새 배양하기에 적합하다.
실시예 3 - 배지 교환 동안의 챔버 종횡비에 대한 영향
챔버 배지의 교환 동안 2개-성분 미세유체 장치 성능에 대한 챔버 종횡비의 영향을 평가하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 일 실험에서, 상이한 종횡비 (깊이/최소 측면 치수에 대한 높이의 비)의 챔버를 갖는 미세유체 장치를 검사하여, 세포 또는 비드를 포함하는 챔버에 용액을 제공함에 따른 배지 교환이 챔버로부터 세포 또는 비드의 손실, 또는 챔버 내 세포 또는 비드의 이동을 초래하는지 결정하였다.
약 1의 종횡비 및 20 μm × 100 μm (높이 × 너비)의 채널 크기에 대응하는 100 μm × 100 μm × 150 μm (깊이/높이 × 너비 × 길이) 크기의 챔버를 갖는 장치를 상이한 유량으로 검사하였다. 장치의 유입구 및 유출구의 유체 포트를 압력 조절기에 연결하고 압력을 조정하여 채널로의 유량을 조절하였다. 제곱 인치 당 (PSI) 1-3 파운드의 상이한 포트 압력에서 채널을 통한 유입에 의한 배지 교환이 챔버로부터 입자의 손실을 초래하지 않는다는 것이 확인되었다. 이러한 압력에서 채널 당 체적 유량 (15 μm × 100 μm의 채널 횡단면)은 장치의 단면 및 압력이 적용되는 채널 길이에 의존하여, 약 0.1 nL/초 내지 10 nL/초로 추정되었다. 그러나, 이러한 유압에서, 입자 (비드 또는 세포)는 챔버의 하단을 따라 유동 방향으로 나아가, 챔버의 하류 측에서 함께 모이는 것으로 관찰되었는데, 이는 허용가능하나 영상화를 위해서는 최적이 아닌 결과이다. 5 내지 9 PSI의 보다 높은 유압에서, 유동은 세포 또는 비드가 챔버 밖으로 벗어나도록 하였는데, 이는 세포에 대한 다단계 분석을 수행하는 능력에 부정적인 영향을 미치는 결과이다.
1.0보다 유의하게 낮은 챔버 종횡비에서, 낮은 유량 (예: 1 내지 3 PSI)은 챔버로부터 세포 또는 비드의 손실을 초래하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과에 기초하여, 높은 종횡비의 챔버를 검사하였다. 1.0보다 큰 종횡비는 높은 유량이 챔버로부터 어떤 입자의 손실도 없이 사용될 수 있음을 확인하였다.
이들 결과는 상이한 유량 및 챔버 종횡비로 인한 유동 프로파일의 수치 모델링에 의해 설명될 수 있다. 예를 들어, 100 μm × 100 μm × 150 μm (깊이 × 너비 × 길이) 크기의 챔버를 이용하면, 주로 챔버의 상단 절반을 통해 유동이 일어나지만, 챔버의 하단으로 0이 아닌 유동이 있음이 확인되었다 (도 34, 좌측). 보다 높은 종횡비의 챔버를 통한 유동의 시뮬레이션은 모든 경우에서 개선된 성능을 보였으며, 경우에 따라, 질적으로 상이한 유동 프로파일을 보였다. 예를 들어, 시뮬레이션된 유동 프로파일은 1.25의 종횡비 및 원통형의 기하학적 구조 (100 μm 직경 및 125 μm 깊이)를 갖는 챔버를 통해 계산하였다 (도 34, 우측). 이러한 시뮬레이션은 결과로 도출된 유동이, 낮거나 높은 유량에서조차 입자를 유지시키는 재순환 소용돌이를 챔버 하단에서 만든다는 것을 보여준다. 이러한 계산에 따라, 최대 15 PSI의 높은 작동 압력이 챔버로부터 입자의 손실을 불러오지는 않으나, 챔버의 하단에서 입자의 이동을 초래함을 확인하였다. 이러한 결과에 기초하여, 약 1 이상의 종횡비가 2개-성분 장치에서 사용하기 위한 챔버의 설계에 사용되어야 한다고 결정하였다.
챔버 내 유체 역학적 움직임은 챔버의 상단에서의 유속에 의해 주로 결정되므로, 이러한 높은 종횡비 챔버의 사용은 상단층에 밸브 구조를 포함하는 2개-성분 장치에 제한되지 않으나, 챔버의 상단을 가로지르는 유동에 의해 배지가 교환되도록 하는 임의의 2개-성분 장치와 또한 함께 효과적으로 사용될 수 있다. 이는 상단 성분이 단일 유동 채널 층을 갖는 2개-성분 장치, 하단층과 함께 도입될 때 유동 구조를 생성하는 특징을 갖는 2개-성분 장치, 또는 하단층에 근접하거나 하단층 위에 위치하는 판 덮개를 포함하여 장치의 2개 성분 사이에 유동을 가능하게 하는 2개-성분 장치를 포함할 수 있다. 또는, 높은-종횡비의 챔버를 갖는 하단 성분이 특정 실험에서의 분리에서, 즉, 상단층 없이 사용될 수 있다. 이 경우, 높은 종횡비의 챔버는 입자 및 세포를 어레이 상의 액체 교환을 수반하는 일시적인 유동으로부터 보호하여, 챔버로부터 입자의 이동 없이 배지의 교환을 가능하도록 한다. 이러한 실시양태에서, 유체 저장소는 챔버 위에 위치하여 유체 교환을 가능하도록 할 수 있다.
실시예 4 - CXCR4 세포외 효과 분석법
본 명세서에서 기술된 장치는 판독 세포 유형에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 단일 세포를 확인하는 다단계 분석을 수행하기 위한 수단을 제공한다.
마우스를 GPCR 표적 CXCR4를 포함하는 바이러스-유사 입자로 면역화하였다. 마우스의 비장으로부터 수득한 ASC를 2개-성분 미세유체 장치의 챔버에 로딩하였는데, 각 챔버는 약 68 μm의 최소 측면 치수 및 약 150 μm의 깊이를 가지며, 이어 2개의 판독 세포 군집을 챔버에 로딩하였다 (도 35). 하나의 판독 세포 군집은 CXCR4를 안정적으로 발현하는 현탁 세포주를 포함하였다. 2번째 판독 세포 군집은 CXCR4를 발현하지 않으며 수동적 염료인 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 형광 표지된, 동일한 세포주로 이루어졌다. 로딩에 이어, 조합된 세포 군집을 미세유체 장치 내에서 인큐베이팅 하여 각 챔버 내 분비된 항체의 농축 및 표적 세포에 대한 특이적 항체의 결합을 가능하도록 하였다. 인큐베이션에 이어, 형광 표지된 이차 항체를 포함하는 배지를 장치에 제공하여 챔버를 세척하였고, 그 결과 상기 표적에 특이적인 항체를 생산하는 ASC와 함께 챔버 내에 존재하는, CXCR4 발현 세포가 선택적으로 염색되었다 (도 35). 표적을 발현하는 세포와 표적을 발현하지 않는 세포의 차등적 염색은 분리된 채널 내 수동적 염료의 형광 신호의 비교에 의해 결정된다 (도 35, 우측).
실시예 5 -인플루엔자 항원 세포외 효과 분석법
본 명세서에서 기술된 장치는, 1 이상의 항원에 결합하는지 여부를 결정하기 위하여 개별 세포에 의해 분비되는 항체를 동시에 분석하는 수단을 제공한다. 인플루엔자의 경우, 다수의 균주에 결합할 수 있는 항체를 확인하는데 유용하다.
인간 B-세포가 3개의 상이한 인플루엔자 균주 H1N1, H3N2, 및 B 균주로부터의 항원에 결합하는지 검사하였다. 각 항원을 상이한 직경을 갖는 상이한 비드 군집 (H1N1 - 10 μm, H3N2 - 5 μm 그리고 B 균주 - 3 μm) 상에 코팅하여, 비드 크기에 따라 항원의 고유성을 결정할 수 있다. 세포 및 비드는 모든 챔버에서 약 3 내지 20개의 각 비드 유형을 생성하도록 선택된 비드 밀도와, 챔버 당 1 미만의 세포를 갖도록 선택된 세포 밀도로, 2개-성분 장치의 하단층에 로딩하였다.
장치의 상단 성분을 하단 성분에 정렬시키고 챔버를 인큐베이팅 하여 분비된 항체를 농축하고 이들 항체와 각 비드 유형의 효율적인 상호작용을 보장하였다. 인큐베이션에 이어, 배지를 챔버의 어레이를 가로질러 제공함으로써, 챔버를 형광 표지된 이차 항체를 포함하는 신선한 배지로 세척하였다. 형광 표지된 이차 항체는, 상이한 색으로 표지되어 각각 상이한 동형 (IgG, IgA 및 IgM)의 검출에 특이적인 상이한 이차 항체와 함께 항-인간 항체의 혼합물을 포함하였다. 이후 챔버에 신선한 배지를 제공함으로써 챔버를 다시 세척하여 백그라운드 형광을 제거하였다. 이차 항체로 선택적으로 염색되는 비드를 갖는 챔버를 검출하기 위하여 장치를 영상화하였다. 도 36은 3개의 각 상이한 항원 (인간 IgG)에 특이적인 단일 B-세포를 포함하는 것으로 확인된 3개의 상이한 챔버로부터의 영상을 보여준다.
실시예 6 - h4- 1BB 막관통 당단백질에 대한 다중화된 세포외 효과 분석법
표적 인간 4-1BB (h4-1BB), 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리에 속하는 타입 2 막관통 당단백질에 결합하는 항체를 검출할 수 있도록 비드-기반 분석법을 설계하였다. h4-1BB 항체가 쥐의 4-1BB에 결합할 수 있는 능력을 또한 검사하였다. 마지막으로, h4-1BB 항체가 4-1BB와 천연 리간드 h4-1BB 리간드의 상호작용을 억제할 수 있는 능력에 대하여 평가하였다.
마우스 항체 분비 세포는 가용성 h4-1BB로 면역화된 마우스의 비장 및 골수로부터 수득되었다. 본 실험에서 사용된 마우스는 인간 가변 영역 유전자를 갖는 h4-1BB 항체를 생산하도록 유전적으로 조작되었다. 분비된 항체의 불변 영역에 결합되도록 연결된 비드를 챔버 당 약 20 내의 30개의 평균 농도로 2개-성분 장치의 챔버에 로딩하였다. 이후 ASC를 장치에 로딩하고 챔버를 약 2시간 동안 인큐베이팅 하여 분비된 항체가 챔버 내에 축적되고 분비된 항체가 비드 상에 포획되도록 하였다.
이후 h4-1BB (형광단으로 표지된) 및 m4-1BB (제2 방출 프로파일을 갖는 형광단으로 표지된)의 혼합물을 포함하는 용액을 챔버 상단에 제공하여 챔버를 세척하였다. 인큐베이션에 이어, 분비된 항체가 h4-1BB 및/또는 m4-1BB에 결합하는지 확인하기 위하여 챔버를 2가지 색으로 영상화 하였다. 결과는 도 37에 도시되었다.
다음으로, 제3 파장 범위에서 방출되는 제3 형광단에 결합된 h4-1BB 리간드를 챔버의 상단에 흘려 챔버를 다시 세척하였다. 인큐베이션에 이어, 챔버를 제3 형광 채널에서 영상화하여, 결합된 h4-1BB가 여전히 h4-1BB 리간드에 결합할 수 있는지, 또는 h4-1BB와 항체 간의 상호작용이 상기 상호작용을 저해하는지 여부를 결정하였다 (도 37, 우측). 바람직한 특성 (h4-1BB에 결합하고 h4-1BB 리간드 상호작용을 지속하는 항체)을 갖는 것으로 확인된 챔버로부터의 ASC를, 장치의 상단 성분을 제거하고 이어 챔버의 내용물을 로봇 모세관으로 흡인함으로써 챔버로부터 회수하였다.
흡인되면, 챔버 내용물은 선택된 항체를 코딩하는 RNA의 증폭을 위해 튜브에 놓았다. 결과로 도출된 항체 서열은 서열분석에 의해 결정하였다. 대응되는 DNA 삽입물을 발현 벡터에 클로닝하고 항체의 재조합 발현에 사용하였다. 생성된 항체의 서브세트를 이후 검사하여 미세유체 스크린으로부터 확인되는 특성을 갖는지 확인하였다.
실시예 7 - 1개-성분 개방 미세유체 장치 내 항체의 검출
본 명세서에서 제시되는 2개-성분 장치 내 상단 성분이 포함되는 것은 단일 세포로부터 분비된 항체의 분석에서 여러 이점을 제공한다. 예를 들어, 2개-성분 장치는 분비된 항체를 단일 챔버의 부피에 국한시킴으로써 증가된 감도를 제공하며; 다단계 분석을 구현하는데 필요한 유체 처리 단계를 용이하게 하고; 백그라운드 형광을 감소시켜 노이즈로의 신호를 증가시키며; 항체의 확산에 의한 챔버 간의 교차-오염을 방지한다.
그럼에도 불구하고, 여기서 제시된 장치는 또한 상단 성분을 포함하지 않는 형식에서 사용될 수 있다. 본 실시예에서, 장치의 하단 성분 (단일 성분)을 항원과 결합된 미세비드와 함께 로딩하였다. 다음으로, 항체 분비 세포 군집을 장치 챔버에 챔버 당 약 1개 세포의 농도로 로딩시키고 이를 인큐베이팅 하여, 세포를 포함하는 챔버 내 그리고 보다 적으나 세포를 포함하는 챔버와 인접한 챔버 내 비드 상에 항원-특이적 항체가 포획되도록 하였다. 낮은 농도 (~10 nM)의 형광 표지된 이차 항체를 이후 챔버에 입혀진 용액에 가하고 약 1시간 동안 인큐베이팅 한 후, 챔버를 영상화하였다. 그 결과를 도 38에 나타내었다.
영상 분석은 비드의 픽셀 강도가 가용성 이차 항체에 의해 생성되는 백그라운드 형광보다 유의하게 높은 챔버 그룹의 존재를 나타내었다. 이러한 챔버 그룹의 픽셀 강도의 히스토그램에 대한 분석 결과, 중앙 챔버가 백그라운드와 비교할 때 가장 높은 수치의 픽셀 강도를 나타냄을 보였으며, 상기 챔버의 하단 및 상단에 직접적으로 위치한 챔버가 그 다음으로 높았으며, 이어 우측 및 좌측에 직접적으로 위치 챔버가, 그리고 마지막으로 중앙 챔버로부터 대각선에 있는 챔버가 높았다 (도 38). 이러한 강도의 차이는 항체를 생성하는 세포 (중앙 챔버에서)에 대한 각 챔버 내 비드의 근접도의 차이에 의해 설명된다 - 본 실험에서의 어레이 간격은 x-좌표와 비교할 때 y-좌표에서 더 작으며, 이는 우측 및 좌측 챔버 (x-좌표)와 비교할 때 상단 및 하단 챔버 (y-좌표)에서 더 높은 강도가 나타나는 것에 기여함을 주의한다. 이러한 분석으로부터, 바람직한 특이성을 갖는 단일 항체 분비 세포의 중앙 챔버로부터의 검출 및 회수가 수행되었다. 항체의 고유성을 서열분석, 클로닝, 및 발현 또는 대응되는 항체 서열에 의해 확인하였다.
단층 형식 내 항체의 검출은, 형광 분자를 포함하는 챔버보다 큰 부피의 존재로 인해 (예: 유체 저장소의 이용을 통해) 보다 높은 백그라운드 (상단 성분이 2개-성분 장치에서 사용되는 경우와 비교할 때)의 존재 하에서, 그리고 인접한 챔버로의 확산에 의해 빠져나가는 항체의 존재 하에서, 항체 분비 세포가 검출되기에 충분한 항체를 생성할 것을 요구한다. 이는 동일한 시료를 상단-성분을 포함하는 장치 형식를 이용하여 분석하면, 검출되었던 특정 항체의 수의 증가뿐만 아니라 챔버 간의 확산의 제한과 증가된 노이즈 신호로 인해 인접한 형광의 제거가 나타남을 관찰함으로써 확인되었다.
실시예 8 - 5개 항원의 다중화된 검출
5개의 상이한 항원에 대한 토끼 단일클론 항체를 분리하기 위해 다중화된 면역화 및 스크리닝을 수행하였다. 토끼를 5개의 상이한 항원으로 약 6주의 기간 동안 면역화하였다. 면역화에 이어, 혈액 시료를 5개의 항원 모두에 대해 역가를 나타내는 토끼로부터 얻었으며, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 상기 시료로부터 분리하였다. 형질 세포를 포함하는 분리된 PBMC를 이후 5개의 상이한 비드 패밀리의 혼합물 (Starfire™ 비드, Bangs Laboratories)로 미리 로딩된 미세유체 장치의 하단층에 로딩하였다. 각 비드 패밀리를 토끼를 면역화시키는데 사용한 5개 항원 중 하나와 결합시켰으며, 각 패밀리는 비드 매트릭스에 포함된 형광 염료의 수준에 의해 광학적으로 식별될 수 있었다. 세포 및 비드의 로딩에 이어, 2개-성분 장치를 조립하고 챔버를 약 2시간 동안 인큐베이팅 시켜 분비된 항체의 농축, 및 대응하는 항원을 갖는 비드 상의 특이적 항체의 효율적인 포획을 가능하게 하였다. 이후 비드 매트릭스에서 사용되는 형광단과 광학적으로 상이한 형광단으로 표지된 이차 항체를 포함하는 신선한 배지로 챔버를 세척하였다. 이후 미세유체 장치를 2개의 형광 채널에서 영상화하였으며 제1 채널의 자동화된 실시간 영상 분석을 사용하여 각 챔버 내 비드를 자동으로 나누고 확인하였다. 제2 형광 채널에서 촬영한 영상의 영상 분석을 사용하여 항체가 각 상이한 비드 타입에 결합하였는지 여부를 결정하였다. 그 결과는 5개 항원 모두가 검출가능하였음을 보였다.
실시예 9 - 클렙시엘라 뉴모니아 ( Klebsiella pneumonia ) 결합 세포외 효과 분석법
여기서 기술된 장치를 세균 병원체 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia)에 대한 완전 인간 항체의 개발을 위해 사용하였다. 항체 분비 세포를 인간 골수, 편도선, 및 인간 혈액으로부터 얻었다. 이들 세포의 스크리닝을 위하여, 전체 클렙시엘라 뉴모니아를 미세유체 장치에 챔버 당 약 100 세균의 농도로 로딩하였다. 항체 분비 세포를 이후 장치의 챔버에 로딩하고 상단 성분을 하단층에 정렬한 후, 분비된 항체가 축적되도록 인큐베이션 하였다. 나노리터 부피의 챔버의 제한은 세균 표면에 제시된 항원을 인식하는 항체가 이어 세균에 결합하도록 하였다.
이후 2개의 차별적으로 표지된 이차 항체 (인간 IgG에 특이적인 하나와 인간 IgA에 특이적인 하나)의 혼합물을 포함하는 신선한 배지를 챔버의 상단으로 흘려 챔버를 세척하였다. 영상화를 통해 세균이 신선한 배지를 흘리는 동안 손실되지 않았음을 확인하였다. 이론에 구애됨이 없이, 세균의 유지는 낮은 유량 및/또는 챔버의 약 1의 종횡비때문인 것으로 생각된다.
2개의 차별적으로 표지된 이차 항체의 혼합물을 포함하는 배지를 이용한 두번째 인큐베이션에 이어, 세균 상의 항원에 특이적인 항체를 생산하는 단일 항체 분비 세포를 포함하는 챔버를 확인하기 위하여, 그리고 이들 항체 (IgG 또는 IgA)의 동형을 결정하기 위하여 미세유체 장치를 2가지 색으로 영상화하였다. 결과는 도 39에 제시되었다.
검출에 이어, 미세유체 장치의 상단 성분을 제거하고 선택된 챔버의 내용물을 회수하였다. 이들 내용물을 이후 주형으로 사용하여 항체 서열을 증폭하였다. 이들 서열은 이어 합성되고, 클로닝된 후, 재조합 항체를 생산하도록 발현되었다. 재조합 항체 세트를 이후 검사하여 이들이 클렙시엘라 뉴모니아 세균에 결합하는 것으로 확인하였다.
실시예 10 - 단일 챔버 내 다수의 상이한 ASC의 존재 하 단일클론 항체의 검출
동일한 챔버에 다수의 기타 세포, 예를 들어 기타 항체 분비 세포가 있을 경우 단일 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체가 단일 챔버에서 검출되고 분석될 수 있는 분석법에서 본 명세서에서 기술되는 장치 및 방법을 사용하는 것이 적합한지 입증하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
세균 병원체, 클렙시엘라 뉴모니아에 결합하는 희귀한 항체에 대해 인간 시료를 스크리닝 하였다. 인간 PBMC의 시료를 얻어, 기억 B-세포의 확산 및 ASC로의 분화를 촉진하는 활성화 조건 하에서 배양하였다. 활성화에 이어, 2개-성분 미세유체 장치의 하단 성분을 생균과 함께 미리 로딩하고 PBMC 배양물로부터의 세포를 챔버 당 약 50개의 세포의 농도로 로딩하였다. 이후 장치를 제2 성분과 함께 조립하고, 분비된 항체가 챔버 내 축적되고 이들 항체가 세균과 상호작용하도록 하기 위해 인큐베이팅 하였다. 인큐베이션 이후, 2개의 차별적으로 표지된 이차 항체 (인간 IgG에 특이적인 하나와 인간 IgA에 특이적인 하나)의 혼합물을 포함하는 신선한 배지를 챔버의 상단으로 흘려 챔버를 세척하였다. 영상화를 통해 세균이 신선한 배지를 흘리는 동안 손실되지 않았음을 확인하였다. 이론에 구애됨이 없이, 세균의 유지는 낮은 유량 및/또는 챔버의 약 1의 종횡비 때문인 것으로 생각된다.
2개의 차별적으로 표지된 이차 항체의 혼합물을 포함하는 배지를 이용한 두번째 인큐베이션에 이어, 세균 상의 항원에 특이적인 항체를 생산하는 단일 항체 분비 세포를 포함하는 챔버를 확인하기 위하여, 그리고 이들 항체 (IgG 또는 IgA)의 동형을 결정하기 위하여 미세유체 장치를 2가지 색으로 영상화하였다. 모든 90,000개의 챔버 중 0.1% 미만이 세균에 특이적인 항체를 포함하는 것으로 확인되었으며, 이로 인해 약 50개의 기타 세포 군집 내 존재하는 단일 항원-특이적 항체 분비 세포가 일부 챔버에서 관찰되는 양성 신호의 원인이 되는 것으로 나타났다. 양성 챔버의 검출에 이어, 미세유체 장치의 상단 성분을 제거하고 선택된 챔버의 내용물을 회수하고 함께 모아 세균에 특이적인 세포의 대략적인 빈도가 2% (50개 세포 당 1개)인 농축된 항체 분비 세포 군집을 생성하였다. 이어 상기 농축된 세포 군집을 한계 희석법 (챔버 당 1개 미만의 세포)에서 두번째 장치에 대해 다시 스크리닝하고, 세균에 특이적인 항체를 분비하는 개별 항체 분비 세포를 성공적으로 검출하여 회수하였다.
실시예 11 - 포유류 세포의 장기간의 미세유체 배양
본 명세서에서 제시되는 2개-성분 장치 및 방법이, 생존력이 높은 포유류 세포의 장기간의 배양을 필요로 하는 실험을 수행할 수 있도록 함을 입증하기 위하여 하기 실시예를 수행하였다. 미세유체 장치에 K562 세포 군집을 로딩하였다. 장치의 상이한 구역에 챔버 (챔버 크기: 200 μm 너비 x 200 μm 길이 x 140 μm 깊이) 당 1 내지 약 20개 세포 범위로 챔버 당 다양한 수의 세포를 로딩하였다. 로딩에 이어, 장치를 영상화하여 각 챔버 내 세포 수를 확인하였다. 각 챔버 내 세포의 확장 및 생존력을 평가하기 위해 장치 챔버의 서브세트를 명시야 현미경검사로 48시간 동안 모니터링하였다. 실험 전반에 걸쳐, 챔버를 매 6시간마다 신선한 배지로 씻어내어 배지 내 충분한 양분을 이용할 수 있도록 하며 세포 성장을 저해할 수 있는 대사 산물을 제거하였다. 챔버는 강한 성장능 및 뛰어난 생존력을 보이며, 세포가 성장하여 합류하는 챔버 내에서도 강한 세포 성장이 유지되는 것으로 관찰되었다 (도 40).
실시예 12 - 개별 미세유체 챔버로부터 세포의 회수
교차-오염 없이 그리고 회수된 세포의 온전함을 훼손시키지 않고 개별 장치 챔버로부터의 회수가 이루어질 수 있음을 입증하기 위해 하기 실시예를 수행하였다.
본 실시예에서, 분비된 항체를 포획하도록 설계된 미세비드를 따라 2개-성분 미세유체 장치의 하단 성분에 존재하는 챔버에 인간 항체 분비 세포 (ASC)의 군집을 로딩하고, 하단 성분에 대해 상단 성분을 정렬하였다. 세포를 챔버 당 1개 미만의 세포의 농도로 로딩하였다. 인큐베이션에 이어, 챔버를 인간 IgG에 대한 형광 표지된 이차 항체를 포함하는 신선한 배지로 세척하였다. 장치를 인큐베이팅 하고 영상화하여 IgG를 분비하는 단일 세포를 갖는 챔버 또는 세포를 갖지 않는 대조군 챔버를 검출하였다. 이후 장치의 상단 성분을 제거하고, 로봇으로 제어된 미세-모세관을 사용하여 단일 IgG 분비 세포를 포함하는 챔버와 세포를 포함하지 않는 대조군 챔버를 오가며 10개의 챔버의 내용물을 회수하였다. 각 챔버의 내용물을 분리된 마이크로퓨즈 튜브에 넣고 RT-PCR 반응을 수행하여 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭하였다.
증폭에 이어, 아가로오스 겔을 러닝시켜 결과로 나타난 증폭 산물을 분석하였다. 결과는 단일 세포, 즉, 단일 IgG 항체 분비 세포를 갖는 챔버 유래 주형을 포함하는 반응이 선명한 중쇄 및 경쇄 밴드를 생성하였으며, 주형을 포함하지 않는 모든 반응 (대조군 챔버)이 산물을 생성하지 않았음을 보여주었다 (도 41). 이는 (i) 세포가 챔버로부터 효과적으로 회수되었으며, (ii) 챔버 간 유의한 교차-오염은 없었고, iii) 회수된 세포가 온전하며 충분한 RNA를 포함하여 RT-PCR에 의해 항체 유전자를 회수하도록 함을 확인해주었다.
실시예 13 - 챔버 내 배지 교환의 시공간 제어.
본 명세서에서 제시된 장치 및 방법이 미세유체 장치의 1 이상의 챔버 내 배지의 교환에 대한 시공간적 제어를 가능하도록 함을 입증하기 위해 하기 실험을 수행하였다. 이러한 제어는 기능적 세포외 효과 분석법이 영상화에서 높은 시간 해상도를 요구하는 실험을 수행할 때 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 분석법은 인자, 예를 들어 항체에 노출되는 세포의 용해에 대한 모니터링, 판독 세포 내 형광 단백질의 전좌에 대한 모니터링, 자극에 따른 판독 세포 내 이온 채널 유속에 대한 모니터링, 자극에 따른 제2 메시지 칼슘 유속에 대한 모니터링을 포함할 수 있다. 예를 들어, 판독 세포 내 미리 로딩된 칼슘-민감성 형광 염료에 의해 측정되는 것과 같이 판독 세포 내에서 아고니스트의 첨가에 반응하여 빠른 칼슘 유속을 저해하는 항체를 확인하기 위하여 미세유체 단일 세포 분석이 수행되었다. 이 경우, 신호는 일시적이어서 10,000개 이상의 챔버로 구성된 전체 장치의 영상화가 충분한 시간 해상도를 제공하지 못할 수 있다. 상기 문제는 제어된 타이밍 하에서 장치의 하위 영역 (subsection)에 아고니스트가 선택적으로 첨가될 수 있도록 상단 성분이 설계된 2개-성분 미세유체 장치를 이용하여 극복될 수 있어서, 아고니스트 첨가 이후 알려진 적당한 시간에 챔버를 영상화할 수 있다. 이는 상단층이 챔버의 선택된 서브세트에만 용액을 흐르도록 하는 밸브 및 채널 구조를 포함하는 2개-성분 미세유체 장치를 이용하여 달성될 수 있다. 하위 영역의 수 및 하위 영역 당 챔버의 수는 분석의 요구 사항에 따라 달라지며 유체 네트워크 내로 설계될 수 있다. 또는, 채널을 가지나 밸브가 없는 상단 성분은 정해진 수의 챔버와 접속하는 유체 네트워크의 상이한 구역에 대해 분리된 유입구를 가짐으로써, 동일한 결과를 얻기 위해 사용될 수 있다. 또는, 이는 아고니스트가 이를 통해 챔버로 흐를 수 있는 구멍을 포함하며 하단층에 대하여 위치가 고정되지 않은 상단층을 이용함으로써 성취될 수 있으나, 노출된 상이한 영역으로 챔버 어레이를 가로질러 전환될 수 있다. 또는, 장치는 상단층 없이 이용될 수 있으며 로봇으로 제어된 모세관은 어레이의 상이한 영역에 아고니스트를 흐르게 하는데 사용될 수 있다. 또는, 장치는 상단층 없이 사용될 수 있으나 각각이 분석에 적절한 수의 챔버를 가지는 장치의 상이한 하위 영역을 분리하는 구획을 포함하도록 설계될 수 있으며, 상이한 하위어레이 각각에 아고니스트를 첨가하는 것은 하위어레이 상에 대한 피펫팅을 통해 이루어질 수 있다.
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본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든, 문헌, 특허, 특허 출원, 출판물, 제품 설명, 및 프로토콜은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로서 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서 예시되고 논의된 실시양태는 본 발명을 제조하고 사용하기 위해 본 발명자에게 알려진 최선의 방법을 당업자에게 교시하는 것만으로 의도된다. 본 발명의 전술된 실시양태의 수정 및 변형은 상기 교시에 비추어 당업자에게 자명한 것과 같이, 본 발명을 벗어나지 않고 가능하다. 따라서 청구항 및 그 균등물의 범위 내에서, 본 발명은 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시될 수 있음이 이해될 것이다.

Claims (125)

  1. 0.6 이상의 평균 종횡비 (챔버 높이: 최소 측면 치수)를 갖는 복수의 개방 챔버 내 복수의 세포 군집을 보유하는 단계로서, 복수의 개방 챔버는 제1 성분, 및 선택적으로 제2 성분을 포함하는 미세유체 장치의 제1 성분 내 존재하고, 제1 성분은 선택적인 제2 성분과 가역적인 밀봉을 형성하며,
    복수 중 개별 세포 군집은 선택적으로 1 이상의 효과 세포를 포함하며 복수 중 개별 개방 챔버 내 보유되고,
    복수 중 개별 개방 챔버, 또는 그의 서브세트는 1 이상의 판독 입자를 포함하는 1 이상의 판독 입자 군집을 추가로 포함하는 단계,
    상기 개방 챔버의 내용물을 인큐베이팅 하는 단계,
    복수의 개방 챔버, 또는 그의 서브세트를 세포외 효과의 존재에 대하여 분석하는 단계로서, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 세포외 효과에 대한 직접 또는 간접적 판독을 제공하는 단계, 및
    상기 분석하는 단계의 결과에 기초하여, 개별 세포 군집 내 1 이상의 세포가 세포외 효과를 보이는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 세포외 효과를 보이는 효과 세포를 포함하는 세포 군집을 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 미세유체 장치는 제2 성분을 포함하며, 제2 성분은 다층 소프트 리소그래피 (MSL)를 통해 제조된 다층을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제2 성분은 1 이상의 유동 채널을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 1 이상의 시약을 1 이상의 유동 채널을 통해 개방 챔버로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 효과 세포는 항체 분비 세포 (ASC)를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 효과 세포는 형질세포, B-세포, 형질아세포, 기억 B-세포, 하이브리도마 세포, T-세포, CD8+ T-세포, 및 CD4+ T-세포의 확장을 통해 생성된 세포, 항체를 생성하도록 조작된 재조합 세포, T-세포 수용체를 발현하도록 조작된 재조합 세포, 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 세포 군집은 평균 약 2 내지 약 250개의 세포, 약 10 내지 약 100개의 세포, 약 50 내지 약 100개의 세포, 약 10 내지 약 50개의 세포, 약 2 내지 약 50개의 세포, 또는 약 2 내지 약 10개의 세포를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집은 1 이상의 판독 비드, 1 이상의 판독 세포, 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집은 단백질 또는 펩티드를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집은 바이러스 입자, 사이토카인, 케모카인, 신경 전달 물질, 성장 인자, 호르몬, 막 추출물, 지질입자, 안정화된 수용체, 수용체의 세포외 영역, 막 추출물로 기능화된 소포, 막 추출물로 기능화된 비드, 가용성 단백질과 같이 안정해지도록 조작된 G 단백질 결합 수용체 (GPCR), 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집은 제1 성분 내 존재하는 미세유체 채널을 통해 개방 챔버로 첨가되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집은 제2 성분 내 존재하는 미세유체 채널을 통해 개방 챔버로 첨가되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집, 또는 그의 서브세트는 그의 표면 상에 ATP 결합 카세트 수송체 (ABC 수송체)를 발현하는 1 이상의 판독 세포를 포함하며,
    세포외 효과는 ABC 수송체의 길항 작용 (antagonism), ABC 수송체의 작용 (agonism) 또는 1 이상의 효과 세포, 또는 1 이상의 효과 세포에 의해 분비되는 분자에 의한 ABC 수송체로의 결합인, 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집, 또는 그의 서브세트는 표면 상에 G 단백질-결합 수용체 (GPCR) 또는 가용화된 GPCR을 발현하는 1 이상의 판독 세포를 포함하며,
    세포외 효과는 GPCR의 길항 작용 (antagonism), GPCR의 작용 (agonism) 또는 1 이상의 효과 세포, 또는 1 이상의 효과 세포에 의해 분비되는 분자에 의한 GPCR로의 결합인, 방법.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집, 또는 그의 서브세트는 표면 상에 티로신 키나아제 수용체 (RTK)를 발현하는 1 이상의 판독 세포를 포함하며,
    세포외 효과는 RTK의 길항 작용 (antagonism), RTK의 작용 (agonism) 또는 1 이상의 효과 세포, 또는 1 이상의 효과 세포에 의해 분비되는 분자에 의한 RTK로의 결합인, 방법.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집, 또는 그의 서브세트는 표면 상에 이온-채널을 발현하는 1 이상의 판독 세포를 포함하며,
    세포외 효과는 이온-채널의 길항 작용 (antagonism), 이온-채널의 작용 (agonism) 또는 1 이상의 효과 세포, 또는 1 이상의 효과 세포에 의해 분비되는 분자에 의한 이온-채널로의 결합인, 방법.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집, 또는 그의 서브세트는 표면 상에 고유의 효소 활성을 갖는 수용체를 발현하는 1 이상의 판독 세포를 포함하며,
    세포외 효과는 고유의 효소 활성을 갖는 수용체의 길항 작용 (antagonism), 고유의 효소 활성을 갖는 수용체의 작용 (agonism) 또는 1 이상의 효과 세포, 또는 1 이상의 효과 세포에 의해 분비되는 분자에 의한 고유의 효소 활성을 갖는 수용체로의 결합인, 방법.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집, 또는 그의 서브세트는 사이토카인 수용체를 발현하는 1 이상의 판독 세포를 포함하며,
    세포외 효과는 사이토카인 수용체의 길항 작용 (antagonism), 사이토카인 수용체의 작용 (agonism) 또는 1 이상의 효과 세포, 또는 1 이상의 효과 세포에 의해 분비되는 분자에 의한 사이토카인 수용체로의 결합인, 방법.
  19. 제14항에 있어서, GPCR은 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 클래스 A GPCR, 클래스 B GPCR, 접착 GPCR, 프리즐드 (frizzled) GPCR, 아세틸콜린 수용체, 멜라토닌 수용체, 멜라코르틴 수용체, 모틸린 수용체, 리소인지질 (LPA) 수용체, 아데노신 수용체, 아드레날린 수용체, 안지오텐신 수용체, 브래디키닌 수용체, 칼시토닌 수용체, 칼슘 감지 수용체, 카나비노이드 수용체, 케모카인 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 보체 성분 (C5AR1) 수용체, 코르티코트로핀 분비 인자 수용체, 도파민 수용체, 상피 분화 유전자 수용체, 엔도텔린 수용체, 포르밀 펩티드-유사 수용체, 갈라닌 수용체, 가스트린 방출 펩티드 수용체, 수용체 그렐린 수용체, 위 억제 폴리펩티드 수용체, 글루카곤 수용체, 고나도트로핀 방출 호르몬 수용체, 히스타민 수용체, 키스펩틴 (KiSS1) 수용체, 류코트리엔 수용체, 멜라닌-응집 호르몬 수용체, 멜라노코르틴 수용체, 멜라토닌 수용체, 모틸린 수용체, 신경펩티드 수용체, 니코틴산, 오피오이드 수용체, 오렉신 수용체, 고아 (orphan) 수용체, 혈소판 활성 인자 수용체, 프로키네티신 수용체, 프로락틴 방출 펩티드, 프로스타노이드 수용체, 프로테아제 활성화 수용체, P2Y (퓨린성) 수용체, 릴랙신 수용체, 세크레틴 수용체, 세로토닌 수용체, 소마토스타틴 수용체, 타키키닌 수용체, 바소프레신 수용체, 옥시토신 수용체, 혈관작용 장 펩티드 (VIP) 수용체 또는 뇌하수체 아데닐산 고리화효소 활성화 폴리펩티드 (PACAP) 수용체, 미각 1 수용체, 대사성 글루타메이트 수용체, 칼슘-감지 수용체, 뇌 특이적 혈관신생 저해제 수용체 (1, 2 또는 3), 카드헤린 수용체 또는 에스트로겐 수용체인, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 사이토카인 수용체는 하기의 사이토카인 중 하나에 대한 수용체인, 방법: (IL)-1α, IL-1β, IL-1RA, IL18, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL17, IL-18, IL-19, IL-20, 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-집락 자극 인자 (GM-CSF), 백혈병 억제 인자, 온코스타틴 M, 인터페론 (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, CD154, 림포톡신 베타 (LTB), 종양 괴사 인자 (TNF)-α, TNF-β, 전환 성장 인자 (TGF)-β, 에리트로포에틴, 거핵구 성장 및 발달 인자 (MGDF), Fms-관련 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt-3L), 줄기 세포 인자, 집락 촉진 인자-1 (CSF-1), 대식세포 자극 인자, 4-1BB 리간드, 증식-유도 리간드 (APRIL), 분화 집단 70 (CD70), 분화 집단 153 (CD153), 분화 집단 178 (CD178), 글루코코르티코이드 유발 TNF 수용체 리간드 (GITRL), CD258, OX40L, CD252, TALL-1, TNF 관련 세포사멸 유발 리간드 (TRAIL), 세포사멸의 종양 괴사 인자 약한 유도자 (TWEAK) 또는 TNF-관련 활성화-유발 사이토카인 (TRANCE).
  21. 제15항에 있어서, 티로신 키나아제 수용체 (RTK)는 ErbB-1, ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4, 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 알파 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 베타 수용체, 비만/줄기 세포 성장 인자 수용체 (SCFR), 집락 촉진 인자 1 수용체, CD135, 섬유아세포 성장 인자 수용체-1 (CD331), 섬유아세포 성장 인자 수용체-2 (CD332), 섬유아세포 성장 인자 수용체-3 (CD333), 섬유아세포 성장 인자 수용체-4 (CD334), 섬유아세포 성장 인자 수용체-6, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 1 수용체, VEGF 2 수용체, VEGF 3 수용체, 간세포 성장 인자 수용체, 트로포미오신-수용체 키나아제 (Trk) A, Trk B, Trk C, 에프린 (EPH) 수용체 A1, EPH 수용체 A2, EPH 수용체 A3, EPH 수용체 A4, EPH 수용체 A5, EPH 수용체 A6, EPH 수용체 A7, EPH 수용체 A8, EPH 수용체 A9, EPH 수용체 A10, EPH 수용체 B1, EPH 수용체 B2, EPH 수용체 B3, EPH 수용체 B4, EPH 수용체 B5, EPH 수용체 B6, AXL, RTK 클래스 IX 수용체 패밀리 멤버, 역형성 림프종 키나아제/백혈구 티로신 키나아제 (ALK/LTK) 수용체 패밀리 멤버, RTK 클래스 XI 수용체 패밀리 멤버, 신경영양 티로신 키나아제, 수용체-관련 1 수용체, 디스코이딘 영역 수용체, RTK 클래스 XIV 수용체 패밀리 멤버, RTK 클래스 XV 수용체 패밀리 멤버, RTK 클래스 XVI 수용체 패밀리 멤버 또는 근육-특이적 키나아제 수용체인, 방법.
  22. 제16항에 있어서, 이온 채널은 GABAA 수용체, 글리신 수용체 (GlyR), 세로토닌 (5-히드록시트립타민) 수용체, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR), 아연-활성화 이온 채널, 통로형 글루탐산 수용체, AMPA 수용체, 카이닛 수용체, NMDA 수용체 또는 ATP 의존성 채널인, 방법.
  23. 제17항에 있어서, 고유의 효소 활성을 갖는 수용체는 수용체 티로신 키나아제 (RTK), 수용체 세린-트레오닌 키나아제, 수용체 티로신 포스파타아제 또는 수용체 구아닐릴 고리화효소인, 방법.
  24. 제18항에 있어서, 사이토카인 수용체는 타입 I 사이토카인 수용체, 타입 II 사이토카인 수용체, 인터루킨-1 수용체, 종양 괴사 인자 수용체, 케모카인 수용체, 전환 성장 인자 베타 수용체인, 방법.
  25. 제19항에 있어서, GPCR은 케모카인 수용체인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 케모카인 수용체는 인터루킨-8 수용체, C-C 케모카인 수용체 타입 1, C-X-C 케모카인 수용체, CXC3 케모카인 수용체 또는 XC 케모카인 수용체인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 케모카인 수용체는 인터루킨-8 수용체, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CCR11, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, XCR1 (GPR5), 또는 CX3CR1 (프랙탈카인)인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집은 동질적 군집 또는 이질적 군집의 판독 입자를 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집은 동질적 군집의 판독 입자를 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집은 복수의 판독 비드, 복수의 판독 세포, 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집은 항원 또는 에피토프로 기능화되는, 방법.
  32. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집은 항체 결합 모이어티(moiety)로 기능화되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 항체 결합 모이어티는 단백질 A, 단백질 A/G, 단백질 G, 면역글로빈에 결합하는 단일클론 항체, 면역글로빈에 결합하는 단일클론 항체 단편, 면역글로빈에 결합하는 다클론 항체, 면역글로빈에 결합하는 다클론 항체 단편, 또는 그의 조합인, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 세포 군집은 판독 입자 군집에 앞서 복수의 챔버에 로딩되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 판독 입자 군집은 복수의 세포 군집에 앞서 복수의 챔버에 로딩되는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 복수의 세포 군집은 액체 컬럼에 의해, 분배 기구에 의해 생성되는 정수압을 통해, 또는 상단 성분 또는 하단 성분을 위아래로 이동시켜 미세챔버로의 유체 이동을 유발시킴으로써, 개방 챔버에 로딩되는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 복수의 세포 군집은 분배 기구를 통해 개방 챔버로 로딩되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 분배 기구는 피펫인, 방법.
  39. 제1항 내지 제11항 및 제14항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집, 또는 그의 서브세트는 액체 컬럼에 의해, 분배 기구에 의해 생성되는 정수압을 통해, 또는 상단 성분 또는 하단 성분을 위아래로 이동시켜 미세챔버로의 유체 이동을 유발시킴으로써, 개방 챔버에 로딩되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 복수의 판독 입자 군집, 또는 그의 서브세트는 분배 기구를 통해 개방 챔버로 로딩되는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 분배 기구는 피펫인, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 1 이상의 복수의 챔버의 표면 상에 고정화된, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 세포 군집 및 1 이상의 판독 입자 군집을 1 이상의 부속 입자와 함께 인큐베이팅 하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 판독 입자 군집, 또는 그의 부분집단에 대한, 1 이상의 효과 세포, 또는 그의 서브세트에 의해 분비되는 분자 간의 결합 상호작용인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 세포외 효과는 복수의 부속 입자 중 1 이상의 부속 입자에 대한, 1 이상의 효과 세포, 또는 그의 서브세트에 의해 분비되는 분자 간의 결합 상호작용인, 방법.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 효과 세포에 의해 분비되는 입자는 인큐베이팅 하는 단계 동안 부속 입자에 결합하는, 방법.
  47. 제44항 또는 제45항에 있어서, 결합 상호작용은 항원-항체 결합 특이성 상호작용, 항원-항체 결합 친화성 상호작용 또는 항원-항체 결합 동적 상호작용이며, 항체는 1 이상의 효과 세포 중 효과 세포에 의해 분비되는 분자인, 방법.
  48. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 세포사멸의 조절, 세포 증식의 조절, 판독 입자의 형태학적 모양의 변화, 판독 입자 내 단백질의 국재화의 변화, 판독 입자에 의한 단백질 발현, 부속 입자의 생물학적 활성의 중화, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포 용해, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포사멸, 판독 세포 괴사, 항체 내재화, 부속 입자 내재화, 효과 세포에 의한 효소 중화, 가용성 신호전달 분자의 중화 또는 그의 조합인, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 세포 군집을 1 이상의 복수의 챔버 내에 주로 단일 평면으로 유지시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 1 이상의 판독 입자 군집을 1 이상의 세포 군집과 주로 동일한 평면에 유지시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이팅 하는 단계는 1 이상의 세포 군집을 포함하는 1 이상의 복수의 챔버 내에서 배지를 교환하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제43항에 있어서, 1 이상의 부속 입자는 단백질, 펩티드, 성장 인자, 사이토카인, 신경 전달 물질, 지질, 인지질, 아미노산, 모노아민, 당단백질, 탄수화물, 호르몬, 바이러스 입자, 항체, 항체 단편, 형광 기질, 형광단, 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이팅 하는 단계는 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간, 1주, 적어도 약 30분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간, 또는 적어도 약 1주인, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 효과 세포, 또는 그의 서브세트는 인큐베이팅 하는 단계 동안 나누어지는, 방법.
  55. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 판독 세포, 또는 그의 서브세트는 인큐베이팅 하는 단계 동안 나누어지는, 방법.
  56. 제43항에 있어서, 1 이상의 부속 입자는 1 이상의 부속 세포를 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 1 이상의 부속 세포 또는 그의 서브세트는 인큐베이팅 하는 단계 동안 나누어지는, 방법.
  58. 제43항에 있어서, 1 이상의 부속 입자는 이차 항체, 형광단, 사이토카인 또는 형광 기질을 포함하는, 방법.
  59. 제43항 및 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 부속 입자는 이질적인 부속 입자 군집을 포함하는, 방법.
  60. 제52항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 부속 입자는 이질적 또는 동질적인 사이토카인 군집을 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 사이토카인 군집은 인터루킨 (IL)-1α, IL-1β, IL-1RA, IL18, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL17, IL-18, IL-19, IL-20, 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-집락 자극 인자 (GM-CSF), 백혈병 억제 인자, 온코스타틴 M, 인터페론 (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, CD154, 림포톡신 베타 (LTB), 종양 괴사 인자 (TNF)-α, TNF-β, 전환 성장 인자 (TGF)-β, 에리트로포에틴, 거핵구 성장 및 발달 인자 (MGDF), Fms-관련 티로신 키나아제 3 리간드 (Flt-3L), 줄기 세포 인자, 집락 촉진 인자-1 (CSF-1), 대식세포 자극 인자, 4-1BB 리간드, 증식-유도 리간드 (APRIL), 분화 집단 70 (CD70), 분화 집단 153 (CD153), 분화 집단 178 (CD178), 글루코코르티코이드 유발 TNF 수용체 리간드 (GITRL), CD258, OX40L, CD252, TALL-1, TNF 관련 세포사멸 유발 리간드 (TRAIL), 세포사멸의 종양 괴사 인자 약한 유도자 (TWEAK),TNF-관련 활성화-유발 사이토카인 (TRANCE) 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  62. 제43항 및 제52항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 부속 입자는 스핑고신-1-포스페이트, 리소포스파티드산 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  63. 제43항 및 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 부속 입자는 형광 기질 또는 절단 시 형광이 되는 비-형광 기질을 포함하는, 방법.
  64. 제43항 및 제52항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 부속 세포는 1 이상의 섬유아세포, 자연 살해 (NK) 세포, 살해 T-세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 재조합 세포, 또는 그의 조합을 포함하는, 방법.
  65. 제43항 및 제52항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 부속 입자는 1 이상의 바이러스 입자를 포함하는, 방법.
  66. 제43항 및 제52항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 부속 입자는 1 이상의 보체 경로 유도 인자를 포함하는, 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이팅 하는 단계 동안 세포 군집을 포함하는 1 이상의 복수의 챔버를 그의 주변 환경으로부터 실질적으로 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제65항에 있어서, 실질적으로 분리하는 단계는 장치의 제2 성분 내 존재하는 1 이상의 밸브의 사용을 포함하는, 방법.
  69. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 세포 표면 수용체 또는 이온 채널의 길항 작용인, 방법.
  70. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 수용체 또는 이온 채널의 작용 (agonism)인, 방법.
  71. 제69항에 있어서, 세포 표면 수용체는 GPCR이고, 세포외 효과는 GPCR의 작용 (agonism)이며, 그 작용은 세포내 cAMP 또는 칼슘, 단백질 리포터의 발현, 또는 단백질의 국재화의 증가에 의해 측정되는, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 세포 표면 수용체는 GPCR이고, 세포외 효과는 GPCR의 길항 작용이며, 그 길항 작용은 세포내 cAMP 또는 칼슘, 단백질 리포터의 발현, 또는 단백질의 국재화의 감소에 의해 측정되는, 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 1 이상의 효과 세포 또는 그의 서브세트에 의해 유도되는, 복수의 판독 세포 또는 그의 서브세트의 세포 용해인, 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 1 이상의 효과 세포 또는 그의 서브세트에 의해 유도되는 복수의 판독 세포 또는 그의 서브세트의 세포사멸 또는 세포 괴사인, 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 1 이상의 효과 세포 또는 그의 서브세트에 의한 효소 중화인, 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 사이토카인 신호전달 과정의 중화인, 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 1 이상의 효과 세포에 의해 분비되는 항체 내재화, 또는 부속 입자 내재화인, 방법.
  78. 제43항 및 제52항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과는 1 이상의 판독 세포에 의한 효소 발현이며, 상기 효소는 복수의 부속 입자, 또는 그의 서브세트에 작용하여 형광 신호를 생성하는, 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 효과가 검출된 챔버로부터 세포 군집을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 장치의 0.6 이상의 평균 종횡비 (챔버 높이: 최소 측면 치수)를 갖는 복수의 개방 챔버 내 회수된 세포 군집으로부터 비롯된 복수의 세포 부분집단을 보유하는 단계로서, 복수의 개방 챔버는 제1 성분, 및 선택적으로 제2 성분을 포함하는 미세유체 장치의 제1 성분 내 존재하고, 제1 성분은 선택적인 제2 성분과 가역적인 밀봉을 형성하며,
    복수 중 개별 세포 부분집단은 선택적으로 1 이상의 효과 세포를 포함하며, 복수 중 개별 개방 챔버 내 보유되고,
    복수 중 개별 개방 챔버, 또는 그의 서브세트는 1 이상의 판독 입자를 포함하는 1 이상의 판독 입자 군집을 추가로 포함하는 단계,
    상기 챔버의 내용물을 인큐베이팅 하는 단계,
    복수의 챔버, 또는 그의 서브세트를 세포외 효과의 존재에 대하여 분석하는 단계로서, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 세포외 효과에 대한 직접 또는 간접적 판독을 제공하는 단계, 및
    상기 분석하는 단계의 결과에 기초하여, 제2 세포외 효과를 보이는 1 이상의 세포를 포함하는 복수로부터 세포 부분집단을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 복수 중 세포 부분집단은 평균 약 1개의 세포 내지 약 25개의 세포를 포함하는, 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 복수 중 세포 부분집단은 평균 약 1개 내지 약 3개의 세포 또는 약 1개 내지 약 5개의 세포를 포함하는, 방법.
  83. 제80항에 있어서, 복수의 용기 내 회수된 세포 군집로부터 비롯된 복수의 세포 부분집단을 보유하는 단계로서, 각 세포 부분집단은 개별 용기 내에 존재하는 단계,
    개별 세포 부분집단을 용해하여 용해된 세포 부분집단을 제공하는 단계, 및
    각 용해된 세포 군집 내 1 이상의 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 증폭하는 단계는 중합효소 연쇄 반응 (PCR), cDNA 말단의 5'-급속 증폭 (RACE), 시험관내 전사 또는 전장 전사체 증폭 (WTA)을 포함하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, PCR은 역전사효소 (RT)-PCR 또는 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라임 (degenerate oligonucleotide primed) PCR인, 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 핵산은 1 이상의 항체 유전자를 코딩하는 1 이상의 핵산, 또는 1 이상의 그의 단편을 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 하나의 항체 유전자 또는 항체 유전자들, 또는 그의 단편을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  88. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포외 효과는 효과 세포 또는 그의 분비 단백질과 판독 입자 간의 결합 상호작용, 판독 세포 상에 존재하는 세포 표면 수용체의 길항 작용, 판독 세포 상에 존재하는 세포 표면 수용체의 작용, ABC 수송체의 길항 작용, ABC 수송체의 작용, 이온 채널의 길항 작용, 이온 채널의 작용, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포 용해, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포사멸, 판독 세포의 세포 괴사, 항체 내재화, 부속 입자 내재화, 효과 세포에 의한 효소 중화, 가용성 신호전달 분자의 중화 또는 그의 조합인, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 가용성 신호전달 분자는 사이토카인인, 방법.
  90. 제80항 내지 제82항 및 제88항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 부분집단 내 1 이상의 세포가 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단 상에 제2 세포외 효과를 나타내는 경우, 세포 부분집단 또는 그의 부분을 회수하여 회수된 세포 부분집단을 얻는, 방법.
  91. 제89항에 있어서, 회수된 세포 부분집단으로부터의 핵산을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  92. 제90항에 있어서, 장치의 0.6 이상의 평균 종횡비 (챔버 높이: 최소 측면 치수)를 갖는 복수의 개방 챔버 내 회수된 세포 부분집단으로부터 비롯된 복수의 세포 부분집단을 보유하는 단계로서, 복수의 개방 챔버는 제1 성분, 및 선택적으로 제2 성분을 포함하는 미세유체 장치의 제1 성분 내 존재하고, 제1 성분은 선택적인 제2 성분과 가역적인 밀봉을 형성하며,
    복수 중 개별 세포 부분집단은 선택적으로 1 이상의 효과 세포를 포함하며, 복수 중 개별 개방 챔버 내 보유되고,
    복수 중 개별 개방 챔버, 또는 그의 서브세트는 1 이상의 판독 입자를 포함하는 1 이상의 판독 입자 군집을 추가로 포함하는 단계,
    상기 챔버의 내용물을 인큐베이팅 하는 단계,
    복수의 챔버, 또는 그의 서브세트를 세포외 효과의 존재에 대하여 분석하는 단계로서, 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단은 세포외 효과에 대한 직접 또는 간접적 판독을 제공하는 단계, 및
    상기 분석하는 단계의 결과에 기초하여, 제2 세포외 효과를 보이는 1 이상의 세포를 포함하는 복수로부터 세포 부분집단을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 복수의 용기 내 확인된 세포 부분집단으로부터 비롯된 복수의 세포 부분집단을 보유하는 단계로서, 각 세포 부분집단은 개별 용기 내에 존재하는 단계,
    세포 부분집단을 용해하여 용해된 세포 부분집단을 제공하는 단계, 및
    각 용해된 세포 군집 내 1 이상의 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 1 이상의 증폭된 핵산을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  95. 제92항에 있어서, 제3 세포외 효과는 효과 세포 또는 그의 분비 단백질과 판독 입자 간의 결합 상호작용, 판독 세포 상에 존재하는 세포 표면 수용체의 길항 작용, 판독 세포 상에 존재하는 세포 표면 수용체의 작용 (agonism), ABC 수송체의 길항 작용, ABC 수송체의 작용, 이온 채널의 길항 작용, 이온 채널의 작용, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포 용해, 효과 세포에 의해 유도되는 판독 세포의 세포사멸, 판독 세포의 세포 괴사, 항체 내재화, 부속 입자 내재화, 효과 세포에 의한 효소 중화, 가용성 신호전달 분자의 중화 또는 그의 조합인, 방법.
  96. 제92항에 있어서, 세포 부분집단 내 1 이상의 세포가 판독 입자 군집 또는 그의 부분집단 상에 제3 세포외 효과를 나타내는 경우, 세포 부분집단 또는 그의 부분을 회수하여 회수된 세포 부분집단을 얻는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 복수의 용기 내 회수된 세포 부분집단으로부터 비롯된 복수의 세포 부분집단을 보유하는 단계로서, 각 세포 부분집단은 개별 용기 내에 존재하는 단계,
    세포 부분집단을 용해하여 용해된 세포 부분집단을 제공하는 단계, 및
    각 용해된 세포 군집 내 1 이상의 핵산을 증폭하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 증폭하는 단계는 중합효소 연쇄 반응 (PCR), cDNA 말단의 5’-급속 증폭 (RACE), 시험관내 전사 또는 전장 전사체 증폭 (WTA)을 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, PCR은 역전사효소 (RT)-PCR 또는 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라임 PCR인, 방법.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 핵산은 1 이상의 항체 유전자를 코딩하는 1 이상의 핵산 또는 1 이상의 그의 단편을 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 1 이상의 항체 유전자, 또는 그의 단편을 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 성분이 존재하며 이는 엘라스토머인, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 엘라스토머는 폴리디메틸실록산 (PDMS)인, 방법.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 제2 성분은 다층을 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 제2 성분은 다층 소프트 리소그래피(soft lithography)를 통해 제조되는, 방법.
  106. 제100항 또는 제101항에 있어서, 제2 성분은 패턴이 없는, 방법.
  107. 제102항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 성분은 1 이상의 유동 채널 및 1 이상의 푸쉬 다운 밸브 구조를 포함하는, 방법.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 챔버의 평균 종횡비는 약 1 이상, 약 1.5 이상, 약 2 이상, 약 2.5 이상, 약 3 이상, 약 3.5 이상, 약 4 이상, 약 4.5 이상 또는 약 5 이상인, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 제1 성분의 챔버의 평균 종횡비는 10 이하인, 방법.
  110. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 각 챔버의 종횡비는 약 1 초과 약 10 미만, 약 1.5 초과 약 10 미만, 약 2 초과 약 10 미만, 약 2.5 초과 약 10 미만, 약 3 초과 약 10 미만, 약 3.5 초과 약 10 미만, 약 4 초과 약 10 미만, 약 4.5 초과 약 10 미만 또는 약 5 초과 약 10 미만인, 방법.
  111. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 챔버의 평균 종횡비는 약 1 초과 약 10 미만, 약 1.5 초과 약 10 미만, 약 2 약 10 미만, 약 2.5 초과 약 10 미만, 약 3 초과 약 10 미만, 약 3.5 초과 약 10 미만, 약 4 초과 약 10 미만, 약 4.5 초과 약 10 미만 또는 약 5 초과 약 10 미만인, 방법.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 챔버의 평균 부피는 약 100 피코리터 (pL) 내지 약 10 나노리터 (nL)인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 제1 성분의 챔버의 평균 부피는 약 100 pL 내지 약 1 nL, 약 200 pL 내지 약 1 nL, 약 300 pL 내지 약 1 nL, 약 400 pL 내지 약 1 nL, 약 500 pL 내지 약 1 nL 또는 약 600 pL 내지 약 1 nL인, 방법.
  114. 제112항에 있어서, 제1 성분의 챔버의 평균 부피는 약 100 pL 내지 약 10 nL, 약 200 pL 내지 약 10 nL, 약 300 pL 내지 약 10 nL, 약 400 pL 내지 약 10 nL, 약 500 pL 내지 약 10 nL, 약 600 pL 내지 약 10 nL, 약 700 pL 내지 약 10 nL, 약 800 pL 내지 약 10 nL, 약 900 pL 내지 약 10 nL 또는 약 1 nL 내지 약 10 nL인, 방법.
  115. 제1항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 성분의 챔버는 약 10/mm2 초과 약 50/mm2 미만, 약 50/mm2 초과, 약 50/mm2 초과 약 100/mm2 미만, 약 100/mm2 초과 약 200/mm2 미만, 약 200/mm2 초과 약 300/mm2 미만, 약 300/mm2 초과 약 400/mm2 미만 또는 400/mm2 초과 500/mm2 미만에서 밀도의 장치에 존재하는, 방법.
  116. 복수의 개방 챔버를 포함하며, 챔버의 평균 종횡비 (깊이/높이: 최소 측면 치수)는 0.6 이상이고 챔버의 평균 부피는 약 100 pL 내지 약 10 nL인, 미세유체 장치(microfluidic device).
  117. 제116항에 있어서, 장치는 투명한, 미세유체 장치.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 챔버의 평균 종횡비는 약 1 이상, 약 1.5 이상, 약 2 이상, 약 2.5 이상, 약 3 이상, 약 3.5 이상, 약 4 이상, 약 4.5 이상 또는 약 5 이상인, 미세유체 장치.
  119. 제118항에 있어서, 제1 성분의 챔버의 평균 종횡비는 10 이하인, 미세유체 장치.
  120. 제116항 또는 제117항에 있어서, 챔버의 평균 종횡비는 약 1 초과 약 10 미만, 약 1.5 초과 약 10 미만, 약 2 초과 약 10 미만, 약 2.5 초과 약 10 미만, 약 3 초과 약 10 미만, 약 3.5 초과 약 10 미만, 약 4 초과 약 10 미만, 약 4.5 초과 약 10 미만 또는 약 5 초과 약 10 미만인, 미세유체 장치.
  121. 제116항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 챔버의 평균 부피는 약 100 pL 내지 약 1 nL, 약 200 pL 내지 약 1 nL, 약 300 pL 내지 약 1 nL, 약 400 pL 내지 약 1 nL, 약 500 pL 내지 약 1 nL 또는 약 600 pL 내지 약 1 nL인, 미세유체 장치.
  122. 제116항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 챔버의 평균 부피는 약 100 pL 내지 약 10 nL, 약 200 pL 내지 약 10 nL, 약 300 pL 내지 약 10 nL, 약 400 pL 내지 약 10 nL, 약 500 pL 내지 약 10 nL, 약 600 pL 내지 약 10 nL, 약 700 pL 내지 약 10 nL, 약 800 pL 내지 약 10 nL, 약 900 pL 내지 약 10 nL 또는 약 1 nL 내지 약 10 nL인, 미세유체 장치.
  123. 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 챔버는 약 10/mm2 및 약 50/mm2 미만, 약 50/mm2 초과, 약 50/mm2 초과 약 100/mm2 미만, 약 100/mm2 초과 약 200/mm2 미만, 약 200/mm2 초과 약 300/mm2 미만, 약 300/mm2 초과 약 400/mm2 미만 또는 400/mm2 초과 500/mm2 미만의 밀도에서 장치 내 존재하는, 미세유체 장치.
  124. 제116항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 장치 재료는 PDMS를 포함하는, 미세유체 장치.
  125. 제116항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 챔버의 하단에서 측정한 장치의 최소 두께는 약 3 mm 미만 약 2 mm 초과, 약 2 mm 미만 약 1 mm 초과, 1 mm 미만 약 0.5 mm 초과 또는 0.5 mm 미만 약 0.1 mm 초과인, 미세유체 장치.
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