KR20180120751A

KR20180120751A - 프레닐화 검정

Info

Publication number: KR20180120751A
Application number: KR1020187029109A
Authority: KR
Inventors: 로버트 이. 멕라렌; 마리아 인네스 모레이라 파트리시오
Original assignee: 나이트스타엑스 리미티드
Priority date: 2016-03-10
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2018-11-06
Also published as: WO2017153774A1; CN109072281A; CN109072281B; ES2862773T3; US20220380831A1; PT3426795T; AU2017230952B2; US20190017096A1; GB201604146D0; JP7021122B2; HRP20210273T1; CA3016492A1; EP3868892A1; KR20230093528A; EP3426795B1; EP3426795A1; JP2019509762A; DK3426795T3; HK1258918A1; CY1124274T1

Abstract

본 발명은 (a) Rab 에스코트 단백질 1(REP1)을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 샘플을 Rab6a, Rab 게라닐게라닐트랜스퍼라제(Rab GGTase) 및 지질 공여체 기질과 접촉시키는 단계; 및 (c) 지질화된 Rab6a 생성물을 검출하는 단계를 포함하는 REP1의 활성을 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

프레닐화 검정

발명의 분야

본 발명은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)의 활성을 결정하는데 사용하기 위한 검정에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 검정에서 프레닐화를 위한 기질로서 Rab6a의 용도에 관한 것이고, 특히 REP1은 유전자 치료 벡터를 사용하여 세포에 전달되었다.

발명의 배경

범맥락막위축은 맥락막, 망막 색소 상피 및 눈의 광수용체의 퇴행을 가져오는 희귀 질환이다. 고통받는 남성은 전형적으로 10대에 야맹증, 20대와 30대에 주변 시력의 점진적인 상실 및 40대에 완전한 실명을 나타낸다. 여성 보인자는 경미한 증상, 가장 주목할 만하게는 야맹증을 나타내지만, 때때로 더 심한 표현형을 가질 수 있다.

범맥락막위축은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)을 인코딩하는 CHM 유전자의 돌연변이에 의해 초래된다. REP1과 75% 상동성인 Rab 에스코트 단백질 2(REP2)는 신체의 대부분의 세포에서 임의의 REP1 결핍을 보완한다. 그러나, REP2는 눈의 REP1 결핍을 보완할 수 없다. 이는 표적 Rab GTPase의 정상적인 프레닐화를 유지하기에 불충분한 Rab 에스코트 단백질 활성을 발생시키고, 세포 기능장애 및 궁극적으로 세포 사멸을 일으킨다.

범맥락막위축은 눈의 이환 세포에 REP1 트랜스진(transgene)의 기능적 복사체를 제공함에 의해 성공적으로 치료될 수 있다(MacLaren, R.E. et al. (2014) Lancet 383: 1129-37). 특히, 아데노-관련 바이러스(AAV) 유전자 치료 벡터는 이 질병을 치료하기 위해 기능성 REP1을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 눈에 전달하는데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

범맥락막위축의 유전자 치료가 임상 현실이 되고 있으므로, 외인성으로 전달된 REP1의 활성을 결정하기 위한, 특히 새로운 유전자 치료 벡터를 시험하고 임상 벡터 스톡을 위한 품질 관리 스크린으로서의 신뢰할 만하고 민감한 검정에 대한 필요성이 존재한다.

REP1을 검정하기 위한 기존의 방법은 프레닐화 기질로서 Rab27a를 사용한다(Tolmachova, T. et al. (2012) J. Gene Med. 14: 158-168; Tolmachova, T. et al. (2013) J. Mol. Med. 91: 825-837; Vasireddy, V. et al. (2013) PLoS ONE 8: e61396; and Black, A. et al. (2014) J. Gene Med. 16: 122-130). 이것은 범맥락막위축의 발병기전에서 Rab27a의 다수의 함축으로부터 나온 결과일 수 있다. 예를 들어, Rab27a는 범맥락막위축 세포에서 프레닐화되지 않은 채로 존재하는 반면 다른 Rab는 적절하게 프레닐화된 것으로 나타났다(Seabra, M.C. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 24420-24427). 더욱이, Rab27a는 범맥락막위축에서 가장 초기 변성의 두 부위인 망막 색소 상피 및 맥락막모세혈관에서 높은 수준으로 발현된다.

그러나, Rab27a의 프레닐화에 의존하는 검정은 매우 약한 신호를 발생시킨다. 결과적으로, 이러한 검정의 민감도는 낮고, 이들은 임상적 유전자 치료 벡터의 신뢰할 만한 스크리닝에 적합하지 않을 수 있다. 따라서, REP1 활성을 결정하고 유전자 치료 벡터를 시험하는데 사용될 수 있는 보다 신뢰할 만하고 민감한 검정에 대한 상당한 필요성이 존재한다.

발명의 개요

본 발명자들은 놀랍게도, Rab27a가 가장 적합한 프레닐화 검정 기질을 제공한다는 유력한 이해에도 불구하고, 프레닐화 반응에서 기질로서 Rab6a의 사용이 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)의 활성을 결정하기 위한 보다 민감한 방법을 제공한다는 것을 발견하였다. Rab6a는 프레닐화를 검출하는 검정에서 증가된 민감도를 제공할 뿐만 아니라 유리한 신호-대-잡음 비, 더 나은 동적 신호 범위 및 더 나은 일관성도 제공한다.

더욱이, 본 발명자들은 Rab6a-기반 검정의 증가된 민감도가 REP1-인코딩 벡터, 특히 임상에서 사용하기 적합한 것들과 같은 AAV 유전자 치료 벡터의 활성을 정확하고 신뢰할 만하게 결정하는데 활용될 수 있음을 입증하였다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)의 활성을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,

(a) REP1을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;

(b) 단계 (a)의 샘플을 Rab6a, Rab 게라닐게라닐트랜스퍼라제(Rab GGTase) 및 지질 공여체 기질과 접촉시키는 단계; 및

(c) 지질화된 Rab6a 생성물을 검출하는 단계를 포함한다.

예를 들어, 본 발명의 방법은 표적 세포로의 REP1의 전달에 적합한 유전자 치료 벡터를 시험하거나 벡터 스톡(예를 들어, 약제 스톡)의 품질 관리 분석을 위한 것일 수 있다.

유전자 치료 벡터의 검증은 임상에서 유전자 치료를 안전하고 효과적으로 수행하기 위해 필수적이다. 분석 및 품질 관리 단계를 위해, 대조 실험 또는 참조 수준과의 비교는 공지되거나 허용된 표준에 대한 유전자 치료 벡터 또는 REP1의 활성의 척도를 제공할 수 있다(예를 들어, 공지되거나 허용된 표준보다 좋거나 나쁨). 이것은 유전자 치료 벡터 스톡이 특정 표적 및 조절을 충족시키는지 여부를 검증하는데 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 일차 참조 표준으로서 정의된 REP1 또는 REP1-인코딩 AAV 벡터의 샘플에 대한 비교가 이루어진다. 본 발명의 방법은, 예를 들어. 시험 샘플 및 일차 참조 표준 샘플에서 동시에 수행될 수 있다. 시험 샘플의 효능 및/또는 거동은, 예를 들어, 일차 참조 표준과 관련하여 정의될 수 있다.

달리 말하면, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 효력이 있는(예를 들어, 범맥락막위축의 치료를 위해) 유전자 치료 벡터, 바람직하게는 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 입자의 품질 관리 분석 및 검증에 사용될 수 있고, 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해 임계 활성 이상이나 특정 표적 범위 이내(예를 들어, 대조 실험 또는 참조 수준과 비교하여)로 결정된 벡터의 출력 활성 또는 효능은 그 벡터가 유전자 치료 목적에 적합함을 나타낸다.

따라서, 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)-인코딩 유전자 치료 벡터(바람직하게는 AAV 벡터)의 품질 관리 분석을 위한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)-인코딩 유전자 치료 벡터(바람직하게는 AAV 벡터)의 품질 관리 분석을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은,

(a) 벡터로 세포를 형질도입하고, REP1의 발현에 적합한 조건 하에 세포를 배양하고, 세포를 용해시켜 REP1을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;

(c) 지질화된 Rab6a 생성물을 검출하는 단계를 포함한다.

따라서, 상기 방법은 REP1을 포함하는 샘플에 관한 파라미터는 변화되는 반면, 다른 파라미터(예를 들어, Rab6a, Rab GGTase 및 지질 공여체 기질에 관한 파라미터)는 일정하게 유지되는 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는 복수의 실험을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 파라미터는, 예를 들어, 관련 단백질(예를 들어, REP1)의 아미노산 서열, 세포에서 REP1을 발현하는데 사용되는 벡터에 포함된 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열, 세포에 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 전달하는데 사용된 벡터의 유형(예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터의 유형과 같은 바이러스 벡터의 유형), REP1의 농도 및/또는 세포에 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 전달하는데 사용된 벡터의 감염 다중도(multiplicity-of-infection, MOI)를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는 복수의 실험을 세포에 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 전달하는데 사용된 상이한 MOI의 벡터에서 수행하는 것을 포함한다(예를 들어, 용량-반응 곡선을 생성하기 위해).

한 구체예에서, 지질화된 Rab6a 생성물의 검출은 지질화된 Rab6a 생성물의 양을 정량하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 지질화된 Rab6a 생성물의 검출은 대조군 또는 참조 수준과 비교하여 지질화된 Rab6a 생성물의 양을 정량하는 것을 포함한다. 정량은, 예를 들어, 일차 참조 표준으로서 정의된 REP1 또는 REP1-인코딩 AAV 벡터의 샘플에 대해 이루어질 수 있다. 본 발명의 방법은, 예를 들어. 시험 샘플 및 일차 참조 표준 샘플에서 동시에 수행될 수 있다. 시험 샘플의 효능 및/또는 거동은, 예를 들어, 일차 참조 표준과 관련하여 정의될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 지질화된 Rab6a 생성물(예를 들어, 프레닐화, 예를 들어, 게라닐게라닐화 또는 바이오틴-게라닐화된 Rab6a)의 양을 REP1의 공지되거나 표준 샘플을 사용하는 실험과 같은 대조 실험으로부터 결정된 양과 비교하는 추가 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 상기 방법은 지질화된 Rab6a 생성물(예를 들어, 프레닐화, 예를 들어, 게라닐게라닐화 또는 바이오틴-게라닐화된 Rab6a)의 양을 참조 수준과 비교하는 추가 단계를 포함한다.

한 구체예에서, REP1을 포함하는 샘플은 REP1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포로부터 유래된다. 바람직하게는, REP1을 포함하는 샘플은 REP1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포의 용해물이다. 바람직하게는, REP1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 제공하기 위해 세포는 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙션되거나 형질도입된다. 바람직하게는, 벡터는 바이러스 벡터이다.

한 구체예에서, REP1은 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 발현된다.

한 구체예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 바람직하게는 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 입자의 형태이다.

AAV 벡터는 임의의 혈청형을 가질 수 있다(예를 들어, 임의의 AAV 혈청형 유전체 및/또는 캡시드 단백질을 포함함). 바람직하게는, 상기 벡터는 눈의 세포를 감염시키거나 형질도입시킬 수 있다.

한 구체예에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 유전체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 2, 4, 5 또는 8 유전체를 포함한다. 바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 혈청형 2 유전체를 포함한다.

한 구체예에서, AAV 벡터 입자는 AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 캡시드 단백질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터 입자는 AAV 혈청형 2, 4, 5 또는 8 캡시드 단백질을 포함한다. AAV 혈청형 8 캡시드 단백질은, 예를 들어, AAV8/Y733F 돌연변이체 캡시드 단백질일 수 있다. 바람직하게는, AAV 벡터 입자는 AAV 혈청형 2 캡시드 단백질을 포함한다.

한 구체예에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 유전체 및 AAV2 캡시드 단백질(AAV2/2); AAV2 유전체 및 AAV5 캡시드 단백질(AAV2/5); 또는 AAV2 유전체 및 AAV8 캡시드 단백질(AAV2/8)을 포함한다. 바람직하게는, AAV 벡터 입자는 AAV2 유전체 및 AAV2 캡시드 단백질(AAV2/2)을 포함한다.

상기 AAV 벡터 입자는 키메라일 수 있거나, 셔플링(shuffling)될 수 있거나, 하나 이상의 자연 발생 AAV의 캡시드-변형된 유도체일 수 있다. 특히, AAV 벡터 입자는 동일 벡터(즉, 슈도타이핑된 벡터(pseudotyped vector)) 내의 AAV의 다양한 혈청형, 클레이드(clade), 클론 또는 분리물로부터의 캡시드 단백질 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, AAV 벡터는 슈도타이핑된 AAV 벡터 입자의 형태이다.

한 구체예에서, REP1은 인간 REP1이다.

한 구체예에서, REP1은 SEQ ID NO:5와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 바람직하게는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

한 구체예에서, REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:6 또는 7과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO:5에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

한 구체예에서, REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 바람직하게는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:5에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

한 구체예에서, Rab6a 및/또는 RabGGTase는 실질적으로 순수하다.

한 구체예에서, Rab6a는 SEQ ID NO:1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 바람직하게는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

한 구체예에서, Rab GGTase는 SEQ ID NO:3 또는 8, 바람직하게는 SEQ ID NO:8과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 바람직하게는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:8에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유하고/하거나; SEQ ID NO:4 또는 9, 바람직하게는 SEQ ID NO:9과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 바람직하게는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:9에 의해 표현되는 단백질의 천연 기능을 실질적으로 보유한다.

다른 구체예에서, Rab6a:Rab GGTase 몰비는 약 1:0.25-3, 1:0.3-2.9, 1:0.35-2.8, 1:0.4-2.7, 1:0.45-2.6 또는 1:0.5-2.5, 바람직하게는 약 1:0.5-2.5이다.

한 구체예에서, Rab6a:Rab GGTase 몰비는 약 1:2-3, 1:2.1-2.9, 1:2.2-2.8, 1:2.3-2.7 또는 1:2.4-2.6, 바람직하게는 약 1:2.4-2.6이다. 한 구체예에서, Rab6a:Rab GGTase 몰비는 약 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6, 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9 또는 1:3, 바람직하게는 약 1:2.5이다.

다른 구체예에서, Rab6a:Rab GGTase 몰비는 약 1:0.25-0.75, 1:0.3-0.7, 1:0.35-0.65, 1:0.4-0.6 또는 1:0.45-0.55, 바람직하게는 약 1:0.4-0.6이다. 한 구체예에서, Rab6a:Rab GGTase 몰비는 약 1:0.25, 1:0.3, 1:0.35, 1:0.4, 1:0.45, 1:0.5, 1:0.55, 1:0.6, 1:0.65, 1-0.7 또는 1:0.75, 바람직하게는 약 1:0.5이다.

한 구체예에서, 지질 공여체 기질은 게라닐게라닐피로포스페이트(GGPP) 또는 이의 유사체이다. 바람직하게는, 지질 공여체 기질은 검출 가능한 마커로 표지된다. 예를 들어, 지질 공여체 기질은 동위원소로 표지될 수 있거나(예를 들어, 지질 공여체 기질은 ³H를 포함할 수 있다), 또는 형광성 기, 에피토프 또는 바이오틴 모이어티를 포함할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 지질 공여체 기질은 바이오틴-게라닐피로포스페이트(BGPP)이다.

한 구체예에서, 지질화된 Rab6a 생성물은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯 분석 또는 오토라디오그래피를 사용하여 검출된다. 바람직한 구체예에서, 지질화된 Rab6a 생성물은 ELISA를 사용하여 검출된다. ELISA는, 예를 들어, 샌드위치 ELISA일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 바이오틴-표지된 지질화된 Rab6a 생성물은 바이오틴에 특이적인 검출 시약, 예를 들어, 스트렙타비딘을 사용하여 검출된다. 바람직하게는, 바이오틴-표지된 지질화된 Rab6a 생성물은 바이오틴에 특이적인 검출 시약, 예를 들어, 스트렙타비딘(예를 들어, 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트)을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 검출된다. 보다 바람직하게는, 바이오틴-표지된 지질화된 Rab6a 생성물은 바이오틴에 특이적인 검출 시약, 예를 들어, 스트렙타비딘을 사용하여 ELISA를 사용하여 검출된다.

한 구체예에서, 상기 방법은 범맥락막위축의 치료에 사용하기 위한 REP1-인코딩 유전자 치료 벡터의 활성을 결정하기 위한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)의 활성을 결정하기 위한 Rab6a의 용도를 제공한다.

REP1, Rab6a, Rab GGTase, 지질 공여체 기질 및 REP1의 활성을 결정하는 방법은 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1) 인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터의 효능을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,

(a) REP1을 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, REP1이 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 발현되는 단계;

(c) 지질화된 Rab6a 생성물을 검출하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1) 인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터의 효능을 결정하기 위한 Rab6a의 용도를 제공한다.

바람직하게는, 상기 방법 및 용도는 범맥락막위축의 치료에 사용하기 위한 벡터의 효능을 결정하기 위한 것이다.

벡터, REP1, Rab6a, RabGGTase, 지질 공여체 기질, 지질화된 Rab6a 생성물, 검출 방법 및 방법 및 용도의 다른 특징은 본원에 기술된 바와 같을 수 있다.

도면의 설명
도 1
Rab27a를 기질로서 사용한 시험관 내 프레닐화 반응 이후 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 또는 AAV-REP1(MOI = 10000 gp/세포)로 형질도입된 세포를 사용하여 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
실험은 독립적으로 제조된 3 세트의 용해물을 포함하였다. 프레닐화 반응은 12.5 μL의 총 부피에서 10 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 2 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다. 검출 시간은 2분이었다.
(A) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:1000). 형질도입되지 않은 세포(#4, #9 및 #12)는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-GFP로 형질도입된 세포(#5, #10 및 #13)는 형질도입되지 않은 세포와 유사한 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포(#6, #11 및 #14)는 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 형질도입된 세포와 비교하여 REP1 수준의 증가를 나타낸다. 양성 대조군(+ve)은 내인성 REP1 수준을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:15000). 분석된 모든 샘플에서 β-액틴의 수준은 유사하다.
(C) Rab27a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석(1:10000). 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 형질도입된 세포는 Rab27a에서 검출할 수 없는 바이오틴의 혼입을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 Rab27a로 혼입된 일부 수준의 바이오틴을 나타낸다(#6, #11 및 #14). 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 전부 중 가장 강한 밴드를 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (C)에서 WB 분석의 반정량.
도 2
Rab27a를 기질로서 사용한 시험관 내 프레닐화 반응 이후 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 또는 AAV-REP1(MOI = 10000 gp/세포)로 형질도입된 세포를 사용하여 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
실험은 독립적으로 제조된 2 세트의 용해물을 포함하였다. 프레닐화 반응은 22 μL의 총 부피에서 30 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 1 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다. 검출 시간은 2분이었다.
(A) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:1000). 형질도입되지 않은 세포(#9 및 #12)는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-GFP로 형질도입된 세포(#10 및 #13)는 형질도입되지 않은 세포와 유사한 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포(#11 및 #14)는 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 형질도입된 세포와 비교하여 REP1 수준의 증가를 나타낸다. 양성 대조군(+ve)는 내인성 REP1 수준을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:15000). 분석된 모든 샘플에서 β-액틴의 수준은 유사하다.
(C) Rab27a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석(1:10000). 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 형질도입된 세포는 Rab27a에서 검출할 수 없는 바이오틴의 혼입을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 Rab27a로 혼입된 일부 수준의 바이오틴을 나타낸다(#11 및 #14). 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 전부 중 가장 강한 밴드를 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (C)에서 WB 분석의 반정량.
도 3
Rab6a를 기질로서 사용한 시험관 내 프레닐화 반응 이후 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 또는 AAV-REP1(MOI = 10000 gp/세포)로 형질도입된 세포를 사용하여 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
실험은 독립적으로 제조된 2 세트의 용해물을 포함하였다. 프레닐화 반응은 20 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 1 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다. 검출 시간은 2분이었다.
(A) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:1000). 형질도입되지 않은 세포(#9 및 #12)는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-GFP로 형질도입된 세포(#10 및 #13)는 형질도입되지 않은 세포와 유사한 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포(#11 및 #14)는 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 형질도입된 세포와 비교하여 REP1 수준의 증가를 나타낸다. 양성 대조군(+ve)는 내인성 REP1 수준을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:15000). 분석된 모든 샘플에서 β-액틴의 수준은 유사하다.
(C) Rab6a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석(1:10000). 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-GFP 형질도입된 세포는 Rab6a에서 매우 낮은 바이오틴의 혼입을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 Rab6a로 혼입된 바이오틴을 나타낸다(#11 및 #14). 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 전부 중 가장 강한 밴드를 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (C)에서 WB 분석의 반정량.
도 4
Rab6a를 기질로서 사용한 시험관 내 프레닐화 반응 이후 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-REP1(MOI = 250, 1000, 5000, 10000 및 20000 gp/세포)로 형질도입된 세포를 사용하여 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
프레닐화 반응은 15 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 0.5 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다. 검출 시간은 2분이었다.
(A) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:2500). 형질도입되지 않은 세포는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 사용된 MOI와 직접적으로 상관되는 REP1 수준의 증가를 나타낸다. 양성 대조군(+ve)은 내인성 REP1 수준을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:50000). 분석된 모든 샘플에서 β-액틴의 수준은 유사하다.
(C) Rab6a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석(1:10000). 형질도입되지 않은 세포는 Rab6a에서 매우 낮은 비오틴 혼입을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 점점 더 많은 양의 바이오틴이 Rab6a에 혼입됨을 나타낸다. 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 전부 중 가장 강한 밴드를 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (C)에서 WB 분석의 반정량.
도 5
Rab6a를 기질로서 사용한 시험관 내 프레닐화 반응 이후 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-REP1(MOI = 10000 gp/세포)로 형질도입된 세포를 사용하여 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
프레닐화 반응은 15 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 0.5 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다. 검출 시간은 REP1/액틴의 경우 2분이었고 바이오틴의 경우 30초였다.
(A) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:2500). 형질도입되지 않은 세포는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 REP1 수준의 증가를 나타낸다. 양성 대조군(+ve)은 내인성 REP1 수준을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:50000). 분석된 모든 샘플에서 β-액틴의 수준은 유사하다.
(C) Rab6a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석(1:10000). 형질도입되지 않은 세포는 Rab6a에서 매우 낮은 비오틴 혼입을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 Rab6a로의 바이오틴 혼입이 증가함을 나타낸다. 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 전부 중 가장 강한 밴드를 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (C)에서 WB 분석의 반정량.
도 6
시험관 내 프레닐화 반응 이후, 형질도입되지 않은 ARPE-19 세포 및 AAV-REP1으로 형질도입된 ARPE-19 세포에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
프레닐화 반응은 45 μL의 총 부피에서 15 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 0.1 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다. REP1/액틴에 대한 검출 시간은 2분; 바이오틴에 대해서는 30초였다.
실험은 다음 세포를 사용하여 동시에 수행되었다:
(a) 형질도입되지 않은 세포(#86 및 #87); 및
(b) 세포 + AAV-REP1 MOI 10,000(#90 및 #91) - R&D 등급 벡터.
(A) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:2,500). 형질도입되지 않은 세포는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 REP1 수준의 증가를 나타낸다. 양성 대조군(+ve)은 내인성 REP1 수준을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:50,000). 분석된 모든 샘플에서 β-액틴의 수준은 유사하다.
(C) Rab6a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석(1:10,000). 형질도입되지 않은 세포는 Rab6a에서 바이오틴의 매우 낮은 혼입을 나타낸다; AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 Rab6a로의 바이오틴 혼입이 증가함을 나타낸다. 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 전부 중 가장 강한 밴드를 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (C)에서 WB 분석의 반정량.
도 7
시험관 내 프레닐화 반응 이후, 형질도입되지 않은 HT1080 세포 및 AAV-REP1으로 형질도입된 HT1080 세포에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
프레닐화 반응은 20 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 0.1 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다. REP1/액틴에 대한 검출 시간은 2분; 바이오틴에 대해서는 30초였다.
실험은 다음 세포를 사용하여 동시에 수행되었다:
(a) 형질도입되지 않은 세포(#56 및 #57);
(b) 세포 + AAV-REP1 MOI 10,000(#60 및 #61) - R&D 등급 벡터; 및
(c) 세포 + AAV-REP1 MOI 10,000(#64 및 #65) - 임상 등급 벡터.
(A) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:2,500). 형질도입되지 않은 세포는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 REP1 수준의 증가를 나타낸다. 양성 대조군(+ve)은 내인성 REP1 수준을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:50,000). 분석된 모든 샘플에서 β-액틴의 수준은 유사하다.
(C) Rab6a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석(1:10,000). 형질도입되지 않은 세포는 Rab6a에서 바이오틴의 기선 수준을 나타낸다; AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 Rab6a로의 바이오틴 혼입이 증가함을 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (C)에서 WB 분석의 반정량.
도 8
시험관 내 프레닐화 반응 이후, 형질도입되지 않은 세포 및 AAV-REP1(MOI = 250, 1000, 5000, 10000 및 20000 gp/세포)로 형질도입된 세포에서 Rab6a 및 Rab27a 기질을 비교하는 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
프레닐화 반응은 15 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물, 및 2개의 다른 기질인 Rab27a(왼쪽 레인 및 플롯; 적색) 및 Rab6a(오른쪽 레인 및 플롯; 청색)를 사용하여 설정되었다. 각 기질에 대해 하나씩의 양성 대조군은 0.1 μM의 어류 REP1로 스파이킹되었다. 검출 시간: 2분.
(A) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:2,500). 형질도입되지 않은 세포는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 사용된 MOI와 직접적으로 상관되는 REP1 수준의 증가를 나타낸다. 양성 대조군(+ve)은 내인성 REP1 수준을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:50,000). 분석된 모든 샘플에서 β-액틴의 수준은 유사하다.
(C) Rab27a 및 Rab6a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석. 형질도입되지 않은 세포는 Rab 단백질로의 바이오틴의 매우 낮은 혼입을 나타내고, 이는 MOI가 증가함에 따라 증가한다. 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 강한 바이오틴 혼입을 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (C)에서 WB 분석의 반정량. 데이터는 (E)의 4개 플롯에 도시된 대로 Prism 소프트웨어를 사용하여 플롯팅되었다.
(E) 사용된 MOI를 가로질러 바이오티닐화된 기질로부터의 밴드 밀도 값(상부 2개 플롯) 및 사용된 MOI를 가로질러 바이오티닐화된 기질 및 REP1 사이의 비(하부 2개 플롯).
도 9
시험관 내 프레닐화 반응 이후, 형질도입되지 않은 세포에서 상이한 프레닐화 반응 조건을 비교한 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 웨스턴 블롯(WB) 분석.
프레닐화 반응은 15 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물, 및 2개의 상이한 기질인 Rab27a(적색)와 Rab6a(청색)를 사용하여 설정되었다. 각 기질에 대해 하나씩의 양성 대조군은 재조합 인간 REP1으로 스파이킹되었다. 검출 시간: 2분.
(A) Rab27a 및 Rab6a에서 혼입된 바이오티닐화된 지질 공여체의 WB 분석. 바이오틴 혼입의 수준은 반응에서 총 단백질의 양에 직접 비례한다. 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 강한 바이오틴 혼입을 나타낸다.
(B) 로딩 대조군으로서 β-액틴의 WB 분석(1:50,000). β-액틴의 수준은 반응에 사용된 총 세포 용해물의 양과 일치하며, 샘플 간에 유사하다.
(C) 세포 용해물에서 인간 REP1 수준의 WB 분석(1:2,500). 형질도입되지 않은 세포는 REP1의 내인성 수준을 나타낸다. 양성 대조군(+ve)는 REP1의 높은 밀도를 나타낸다.
(D) Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 (A)에서 WB 분석의 반정량. 데이터는 Prism 소프트웨어를 사용하여 플롯팅되었다. 강조 표시된 값은 기질 간의 더 높은 차이가 검출된 조건에 대한 것이다.
도 10
AAV-REP1 형질도입된 세포에서 프레닐화를 위한 기질로서 Rab27a와 Rab6a의 비교.

발명의 상세한 설명

본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구체예는 이제 비제한적인 예에 의해 기재될 것이다.

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 화학, 생화학, 분자생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 당업자의 능력 내이다. 그러한 기술은 문헌에서 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J., and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M., and McGee, J.O’D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M., and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press]을 참조한다. 상기 전반적 문헌 각각은 참조로서 본원에 포함된다.

프레닐화

이소프레노이드 모이어티의 첨가에 의한 단백질의 지질화는 포유동물 프로테옴의 최대 2%에 영향을 미치는 번역 후 변형이다. 그러한 지질화는 표적 단백질과 세포막의 가역적 결합을 가능하게 하며, 또한 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있다.

바람직하게는, 본원에서 언급된 지질화는 프레닐화여서, 지질 공여체 기질 및 지질화된 Rab6a 생성물은 각각 프레닐 공여체 기질 및 프레닐화된 Rab6a 생성물이다.

프레닐화는 게라닐게라닐 또는 파르네실 모이어티(또는 어느 하나의 유사체)가 티오에테르 결합을 통해 단백질의 1개 또는 2개의 C-말단 시스테인 잔기에 부착된 번역 후 변형의 특정 유형이다.

바람직하게는, 프레닐화는 게라닐게라닐 모이어티 또는 이의 유사체(예를 들어, 바이오틴-게라닐 모이어티)를 표적 단백질(예를 들어, Rab6a)에 첨가하는 것이다.

단백질에 부착된 게라닐게라닐 모이어티(단백질은 음영진 원으로 개략적으로 묘사됨)은 다음과 같다:

단백질에 부착된 파르네실 모이어티(단백질은 음영진 원으로 개략적으로 묘사됨)은 다음과 같다:

용어 "유사체"는 검출과 같은 특정 목적에 적합한 작용기를 포함하도록 변형된 화합물을 지칭하기 위해 본원에서 지질(예를 들어, 게라닐게라닐 또는 파르네실) 모이어티 또는 지질 공여체 기질과 관련하여 사용된다. 유사체는 변형에 의해 (본 발명의 활성 검정의 목적을 위해) 실질적으로 방해받지 않는 방식으로 프레닐화 기구(즉, REP1 및 Rab GGTase)에 의해 기질 단백질에 첨가될 수 있다.

따라서, 상기 모이어티의 유사체는 특정 목적을 위해 인위적으로 생성된 것들을 포함한다(예를 들어, 검정에서 검출에 적합한 표지된 모이어티). 특히, Nguyen 등(Nguyen, U.T. et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5: 227-235)은 시험관 내 단백질 프레닐화 반응에서 검출될 수 있는 다음의 바이오틴-게라닐 모이어티를 개발하였다(바이오틴-게라닐 모이어티는 음영진 원에 의해 개략적으로 묘사된 단백질에 부착된 것으로 도시됨):

Rab6a

Rab6a(Ras-관련 단백질 Rab-6A)는 포유동물 Rab GTPase 패밀리의 구성원이고, 이는 자체로 GTPase의 Ras-유사 슈퍼패밀리 중 가장 크다.

Rab GTPase(Rab 단백질로도 알려짐)는 말초 막 단백질이고, 소포 형성, 액틴 및 투불린 네트워크를 따른 소포 이동, 및 막 융합을 포함하는 막 트래피킹의 조절에 관여한다. Rab6a의 주요 기능은 골지 복합체에서 세포질세망으로의 단백질 수송의 조절인 것으로 이해된다.

Rab GTPase는 전형적으로 2개의 C-말단 시스테인 잔기에 공유적으로 결합된 프레닐 기(특히, 게라닐게라닐 기)를 통해 세포막에 고정된다.

Rab GTPase는 비활성, GDP-결합된 형태; 및 활성, GTP-결합된 형태의 두 입체형태를 나타낸다. GDP-결합된 형태에서 GTP-결합된 형태로의 전환은 GDP/GTP 교환 인자(GEF)에 의해 촉매되어, Rab GTPase를 활성화시킨다. 반대로, Rab GTPase에 의한 GTP 가수분해는 GTPase-활성화 단백질(GAP)에 의해 향상될 수 있고, 이로 인해 Rab 불활성화로 이어진다.

한 구체예에서, Rab6a는 인간 Rab6a이다.

Rab6a의 예시적인 아미노산 서열은 NCBI Accession No. NP_942599.1 하에 기탁된 서열이다.

Rab6a의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

Rab6a를 인코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 NCBI Accession No. NM_198896.1 하에 기탁된 서열이다.

Rab6a를 인코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

Rab 게라닐게라닐트랜스퍼라제(Rab GGTase)

Rab 게라닐게라닐트랜스퍼라제(Rab GGTase; 게라닐게라닐트랜스퍼라제 II로도 알려짐)는 Rab 패밀리의 GTPase를 독점적으로 프레닐화하는 단백질 프레닐트랜스퍼라제이다.

Rab GGTase는 전형적으로 Rab GTPase의 C-말단에서 2개의 게라닐게라닐 기의 시스테인 잔기로의 전이를 자연적으로 촉매한다. 각각의 게라닐게라닐 기는 시스테인 잔기에 대한 티오에테르 결합을 통해 Rab GTPase에 컨쥬게이션된다.

Rab GGTase는 광범위한 유도체화된 포스포이소프레노이드에 결합할 수 있는 것으로 나타났고, Rab GTPase 기질(예를 들어, Rab6a)로의 이들의 첨가를 촉매할 수 있다. 예를 들어, Nguyen 등(Nguyen, U.T. et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5: 227-235)은 Rab GTPase에 바이오틴-게라닐 모이어티의 성공적인 첨가를 입증하였다.

Rab GGTase는 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된 이종이량체 효소이다.

한 구체예에서, Rab GGTase는 인간 Rab GGTase이다. 바람직한 구체예에서, Rab GGTase는 래트 Rab GGTase이다.

Rab GGTase 알파 서브유닛의 예시적인 아미노산 서열은 NCBI Accession Nos. NP_004572.3 및 NP_113842.1 하에 기탁된 서열이다.

Rab GGTase 알파 서브유닛의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

및:

Rab GGTase 베타 서브유닛의 예시적인 아미노산 서열은 NCBI Accession Nos. NP_004573.2. 및 NP_619715.1 하에 기탁된 서열이다.

Rab GGTase 베타 서브유닛의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

및:

지질 공여체 기질

지질 모이어티를 Rab GTPase에 첨가하기 위해, Rab GGTase는 지질(예를 들어, 게라닐게라닐 또는 바이오틴-게라닐) 공여체 기질 형태의 지질 모이어티를 기질로서 사용할 수 있다. 이들은 전형적으로 지질 모이어티의 피로포스페이트 유도체이다.

예를 들어 게라닐게라닐피로포스페이트(GGPP) 또는 바이오틴-게라닐피로포스페이트(BGPP)는 게라닐게라닐 또는 바이오틴-게라닐 모이어티를 기질 Rab GTPase로 각각 전달하기 위해 Rab GGTase에 의한 지질 공여체 기질로서 사용될 수 있다.

게라닐게라닐피로포스페이트는 다음과 같은 구조를 갖는다:

바이오틴-게라닐피로포스페이트의 예시적인 구조는 다음과 같다:

Rab 에스코트 단백질 1(REP1)

Rab 에스코트 단백질(REP)은 프레닐화되지 않은 Rab GTPase를 Rab GGTase에 제시하고, 프레닐화된 Rab GTPase를 이들의 표적 막으로 운반하는 기능을 수행한다.

Rab GTPase는 Rab GGTase에 의해 인지될 수 있는 프레닐화 부위에 컨센서스 서열을 포함하지 않는다. 그러나, 기질 인지는 REP를 통해 이루어지는데, 이는 보존된 영역을 통해 Rab GTPase에 결합한 다음 Rab GTPase에 프레닐화를 위한 이의 기질을 제공한다.

일단 프레닐화되면, 지질 앵커는 Rab GTPase를 불용성으로 만든다. 따라서, REP는 게라닐게라닐 기에 결합하여 이를 용해시키고 표적 세포막에 Rab GTPase의 전달을 돕는데 필요하다.

REP1은 Rab 단백질 게라닐게라닐트랜스퍼라제 성분 A로도 알려져 있을 수 있다. 또한, REP1을 인코딩하는 유전자는 CHM 유전자로도 알려져 있을 수 있다.

한 구체예에서, REP1은 인간 REP1이다.

REP1의 예시적인 아미노산 서열은 다음과 같다:

REP1을 인코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

REP1을 인코딩하는 추가의 예시적인 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

REP1의 예시적인 변이체는 WO 2012/114090호(본원에 참조로서 포함됨)에 추가로 기재되어 있다.

활성 결정

한 양태에서, 본 발명은 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)의 활성을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,

(a) REP1을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;

(c) 지질화된 Rab6a 생성물을 검출하는 단계를 포함한다.

검정 민감도는 고려해야 할 중요한 요소인데, 그 이유는 이것이 낮은 수준의 표적을 검출할 수 있게 하기 때문이며, 이는 소량의 시약이 존재할 때 특히 관련이있다(예를 들어, 유전자 치료 시약을 이용한 경우일 수 있음). 그러나, 예를 들어, 낮거나 높은 민감도를 제공하는 시약과 상관이 없을 수 있는 검정 신호의 동적 범위를 최대화하는 것도 중요하다.

본 발명의 방법 및 용도는 Rab GTPase의 프레닐화에 관여하는 다른 제제, 예를 들어 Rab GGTase 또는 지질 공여체 기질의 활성, 또는 프레닐화 기질로서 Rab GTPase의 활성을 시험하기보다 REP1의 활성을 시험하기 위한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 표적 세포로의 REP1의 전달에 적합한 유전자 치료 벡터를 시험하거나 벡터 스톡(예를 들어, 약제 스톡)의 품질 관리 분석을 위한 것일 수 있다.

한 구체예에서, REP1을 포함하는 샘플은 REP1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포로부터 유래된다. 바람직하게는, REP1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 제공하기 위해 세포는 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙션되거나 형질도입된다. 바람직하게는, 벡터는 바이러스 벡터이다.

REP1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포(그러한 세포의 집단일 수 있음)는 세포주(예를 들어, HEK293)로부터의 세포와 같은 REP1의 유전 공학 및 발현에 적합한 임의의 세포일 수 있다. 세포는, 예를 들어, 인간 또는 마우스 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 인간 세포이다. 세포는, 예를 들어, 망막 색소 상피 또는 광수용체 세포와 같은 망막 세포일 수 있다. 한 구체예에서, 세포는 HEK293 세포이다. 또 다른 구체예에서, 세포는 ARPE-19 세포이다. 또 다른 구체예에서, 세포는 HT1080 세포이다.

바람직하게는, Rab6a 및/또는 RabGGTase는 반복적인 실험에서 최소 변이를 제공하거나 전혀 변이를 제공하지 않도록 표준 공급원으로부터 유래된다. 바람직하게는, Rab6a 및/또는 RabGGTase는 실질적으로 순수하다(즉, 본 발명의 방법 또는 용도를 방해하는 단백질 오염물을 실질적으로 포함하지 않음).

따라서, 상기 방법 또는 용도는 REP1을 포함하는 샘플에 관한 파라미터는 변화되는 반면, 다른 파라미터(예를 들어, Rab6a, Rab GGTase 및 지질 공여체 기질에 관한 파라미터)는 일정하게 유지되는 복수의 실험(예를 들어, 단계 (a) 내지 (c)를 포함함)을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 파라미터는, 예를 들어, 관련 단백질(예를 들어, REP1)의 아미노산 서열, 세포에서 REP1을 발현하는데 사용되는 벡터에 포함된 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열, 세포에 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 전달하는데 사용된 벡터의 유형(예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터의 유형과 같은 바이러스 벡터의 유형), REP1의 농도 및/또는 세포에 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 전달하는데 사용된 벡터의 감염 다중도(MOI)를 포함할 수 있다.

용어 "활성"은 본원에서 Rab GTPase(예를 들어, Rab6a)의 지질화를 촉진시키는 REP1의 능력을 지칭하기 위해 사용된다. REP1이 지질화 자체를 촉매하지는 않지만, 이것은 Rab GGTase가 이의 기질인 Rab GTPase의 지질화를 촉매하는데 필요하다. 따라서, 특정 조건 하에서 지질화된 Rab GTPase(즉, Rab6a)의 양을 결정함에 의해 REP1의 활성을 측정할 수 있다.

용어 "효능"은 본원에서 벡터에 의해 트랜스펙션되거나 형질도입된 세포에 REP1 활성을 제공하는 벡터의 능력을 지칭하기 위해, REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터의 효능과 관련하여 사용된다.

본원에 사용된 용어 "지질화된 Rab6a 생성물"은 지질 모이어티가 첨가된 Rab6a를 지칭한다. 바람직하게는, 지질화된 Rab6a 생성물은 게라닐게라닐화된 Rab6a 또는 바이오틴-게라닐화된 Rab6a와 같은 프레닐화된 Rab6a이다.

바람직하게는, 지질화된 Rab6a 생성물을 검출하는 단계는 지질화된 Rab6a 생성물의 양의 정량을 제공한다.

지질화된 Rab6a의 검출은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯, 오토라디오그래피(예를 들어, 동위원소-표지된, 예를 들어, 삼중수소화된 지질 공여체 기질 활용), 크로마토그래피(예를 들어, HPLC 또는 FPLC) 및/또는 질량 분광계-기반 방법(예를 들어, LC/MS)에 의해 수행될 수 있다.

한 구체예에서, 지질화된 Rab6a 생성물은 웨스턴 블롯을 사용하여 검출된다. 바람직한 구체예에서, 지질화된 Rab6a 생성물은 ELISA를 사용하여 검출된다.

예로서, 프레닐화 반응은 바이오틴-게라닐피로포스페이트 지질 공여체 기질을 사용하여 본 발명의 방법에 따라 수행될 수 있다. 반응 생성물은 지질화된 Rab6a 생성물(즉, 바이오틴-게라닐화된 Rab6a)이, 예를 들어, 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트와의 직접 인큐베이션에 의해 검출될 수 있는 웨스턴 블롯 분석으로 처리될 수 있다. 지질화된 Rab6a(즉, 바이오틴-게라닐화된 Rab6a)의 정량은 임의의 적합한 수단(예를 들어, Image Studio Lite 소프트웨어(LI-COR) 이용)에 의해 수행될 수 있는 결과적인 웨스턴 블롯의 농도계 분석에 의해 달성될 수 있다.

추가 예로서, 프레닐화 반응은 바이오틴-게라닐피로포스페이트 지질 공여체 기질을 사용하여 본 발명의 방법에 따라 수행될 수 있다. 반응 생성물은 Rab6a가 플레이트에 직접 고정되거나 플레이트에 부착된 항체를 이용하여 고정될 수 있는(즉, 샌드위치 ELISA) ELISA 분석으로 처리될 수 있고; 이어서 지질화된 Rab6a 생성물(즉, 바이오틴-게라닐화된 Rab6a)은, 예를 들어, 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트와의 인큐베이션에 의해 검출될 수 있다. 지질화된 Rab6a(즉, 바이오틴-게라닐화된 Rab6a)의 정량은 임의의 적합한 수단(예를 들어, 분광광도계, 형광측정기 또는 발광측정기를 이용한 검출)에 의해 달성될 수 있다.

반응 중에 존재하는 REP1의 양의 검출 또는 β-액틴(예를 들어, 로딩 대조군으로)의 양의 검출과 같은 추가 검출 단계가 필요에 따라(예를 들어, 제어 목적으로) 본 발명의 방법에 혼입될 수 있다.

한 구체예에서, 상기 방법은 지질화된 Rab6a 생성물(예를 들어, 프레닐화, 예를 들어, 게라닐게라닐화 또는 바이오틴-게라닐화된 Rab6a)의 양을 REP1의 공지되거나 표준 샘플을 사용한 실험과 같은 대조 실험으로부터 결정된 양과 비교하는 추가 단계를 포함한다.

그러한 대조 실험 또는 참조 수준과의 비교는 공지되거나 허용된 표준에 대한 REP1의 활성의 척도를 제공할 수 있다(예를 들어, 공지되거나 허용된 표준보다 좋거나 나쁨).

본 발명의 방법은, 예를 들어, 범맥락막위축의 치료를 위한 유전자 치료 벡터, 바람직하게는 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터 입자의 품질 관리 분석에 사용될 수 있고, 본 발명의 방법에 의해 임계 활성 이상이나 특정 표적 범위 이내(예를 들어, 대조 실험 또는 참조 수준과 비교하여)로 결정된 벡터의 출력 활성 또는 효능은 그 벡터가 유전자 치료 목적에 적합함을 나타낸다.

프레닐화 반응(예를 들어, 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 일어나는)의 조건은 Rab6a의 프레닐화를 실질적으로 방해하지 않는다면 특별히 제한되지 않는다.

REP1을 포함하는 샘플은 임의의 적합한 형태로 제형화될 수 있고, 예를 들어, 샘플은 약 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 포함하는 약 pH 7.5의 프레닐화 완충제에서 제조될 수 있다.

REP1을 포함하는 샘플은, 예를 들어, 약 1-100, 1-75, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20 또는 1-10 μg의 총 단백질을 포함할 수 있다. REP1을 포함하는 샘플은, 예를 들어, 약 10-100, 10-75, 10-50, 10-40, 10-30 또는 10-20 μg의 총 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, REP1을 포함하는 샘플은 약 10-30 μg의 총 단백질, 예를 들어, 약 10, 15, 20, 25 또는 30 μg의 총 단백질을 포함한다.

Rab6a는, 예를 들어, 약 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 μM, 바람직하게는 약 1-5 μM의 농도일 수 있다. Rab6a는, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 μM, 바람직하게는 약 4 μM의 농도일 수 있다.

Rab GGTase는, 예를 들어, 약 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5 또는 1-2.5 μM, 바람직하게는 약 1-2.5 μM의 농도일 수 있다. Rab GGTase는, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 μM, 바람직하게는 약 2 μM의 농도일 수 있다.

지질 공여체 기질(예를 들어, 바이오틴-게라닐피로포스페이트(BGPP))은, 예를 들어, 약 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 μM, 바람직하게는 약 1-5 μM의 농도일 수 있다. 지질 공여체 기질(예를 들어, 바이오틴-게라닐피로포스페이트(BGPP))은, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 μM, 바람직하게는 약 4 μM의 농도일 수 있다.

프레닐화 반응은 임의의 적합한 완충제에서 수행될 수 있고, 예를 들어, 반응은 약 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 포함하는 약 pH 7.5의 프레닐화 완충제에서 수행될 수 있다.

프레닐화 반응은 임의의 적합한 온도(예를 들어, 약 37℃)에서 임의의 적절한 시간 길이 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 프레닐화 반응은 약 1-10, 1-7.5, 1-5, 1-2.5 또는 1-2시간, 바람직하게는 약 1-2시간 동안 수행될 수 있다. 프레닐화 반응은, 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10시간, 바람직하게는 약 2시간 동안 수행될 수 있다.

범맥락막위축

범맥락막위축은 맥락막, 망막 색소 상피 및 눈의 광수용체의 희귀한 X-연관 진행성 퇴행이다. 고통받는 남성의 전형적인 자연 경과는 10대에 야맹증의 발병, 및 이후 20대와 30대에 주변 시력의 점진적인 상실이며 40대에 완전한 실명에 이른다. 여성 보인자는 경미한 증상, 가장 주목 할만하게는 야맹증을 나타내지만, 때때로 더 심한 표현형을 나타낼 수 있다.

범맥락막위축은 X 염색체 21q 영역에 위치한 CHM 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다. REP1과 75% 상동성인 Rab 에스코트 단백질 2(REP2)는 신체의 대부분의 세포에서 임의의 REP1 결핍을 보완한다. 그러나, 아직은 명확하지 않은 이유로, REP2는 눈의 REP1 결핍을 보완할 수 없다. 이는 표적 Rab GTPase의 정상적인 프레닐화를 유지하기에 불충분한 Rab 에스코트 단백질 활성을 발생시키고, 세포 기능장애 및 궁극적으로, 주로 외망막 및 맥락막에 영향을 미치는 세포 사멸을 일으킨다.

범맥락막위축은 눈의 이환 세포에 REP1 트랜스진의 기능적 복사체를 제공함에 의해 성공적으로 치료될 수 있다(MacLaren, R.E. et al. (2014) Lancet 383: 1129-37).

벡터

벡터는 한 환경으로부터 또 다른 환경으로의 실체의 전달을 가능하게 하거나 촉진하는 도구이다. 본 발명에 따라, 및 예로서, 재조합 핵산 기술에 사용되는 일부 벡터는 실체, 예를 들어, 핵산의 세그먼트(예를 들어, 이종성 DNA 세그먼트, 예를 들어, 이종성 cDNA 세그먼트)가 표적 세포로 전달되는 것을 가능하게 한다. 벡터는 세포 내에서 이종성 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 유지시키거나, 핵산의 세그먼트를 포함하는 벡터의 복제를 촉진하거나, 핵산의 세그먼트에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 촉진하는 목적으로 제공될 수 있다.

벡터는 비바이러스 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 재조합 핵산 기술에서 사용되는 벡터의 예는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 및 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 또한, 예를 들어, 네이키드 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)일 수 있다. 가장 간단한 형태에서, 벡터는 자체가 관심 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절인자를 포함할 수 있다.

바이러스 벡터

바람직한 구체예에서, 본 발명의 벡터는 바이러스 벡터이다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 입자의 형태이다.

바이러스 벡터는, 예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.

용어 "유전자 치료 벡터"는 본원에서 유전자 요법에 사용하기에 적합한 벡터를 지칭하기 위해 사용되며, 예를 들어, 바이러스(예를 들어, AAV) 벡터 및 벡터 입자를 포함한다.

변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편

본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드 외에, 본 발명은 또한 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 이들의 단편의 사용을 포함한다.

본 발명의 상황에서, 임의의 제공된 서열의 변이체는 잔기의 특정 서열(아미노산이거나 핵산 잔기이건 간에)이 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 이의 기능을 실질적으로 유지하도록 하는 방식으로 변형된 서열이다. 변이체 서열은 자연 발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 첨가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변화에 의해 획득될 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 결과로서 발생된 단백질 또는 폴리펩티드가 이의 내인성 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 유지한다면 서열로부터 또는 서열로의 하나(또는 그 초과)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변화, 변형, 대체, 결실 및/또는 첨가를 포함한다.

폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉, 이것이 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인성 기능 중 적어도 하나를 보유하는 화학적 화합물을 포함한다.

전형적으로, 아미노산 치환은, 예를 들어, 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개의 치환으로 이루어질 수 있으나, 단, 변형된 서열은 필요한 활성 또는 능력을 실질적으로 유지한다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 유사체의 사용을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 침묵 변화를 생성시키고, 기능적으로 동등한 단백질을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 계획적 아미노산 치환은 내인성 기능이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음성으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양성으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.

보존적 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 두번째 컬럼 내의 동일 블록, 바람직하게는 세번째 컬럼 내의 동일 라인의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:

본원에서 사용되는 용어 "동족체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 일정한 상동성을 갖는 실체를 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다.

상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 동족체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상동성은 또한 유사성과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본원에 상술된 SEQ ID NO 중 어느 하나에 대한 동일성 퍼센트를 갖는 서열에 대한 언급은 언급된 SEQ ID NO의 전장에 걸친 언급된 동일성 퍼센트를 갖는 서열을 나타낸다.

상동성 비교는 육안에 의해, 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 상동성 또는 동일성 퍼센트를 계산할 수 있다.

상동성 퍼센트는 연속 서열에 걸쳐 계산될 수 있으며, 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고, 한 서열 내의 각각의 아미노산이 한번에 하나의 잔기씩 다른 서열 내의 상응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "갭이 없는" 정렬로 언급된다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 단지 비교적 짧은 수의 잔기에 대해 수행된다.

이는 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들어, 서열의 달리 동일한 쌍에서, 뉴클레오티드 서열 내의 하나의 삽입 또는 결실이 다음 코돈을 정렬에서 벗어나게 하여, 이에 따라 잠재적으로는 전체적인 정렬이 수행되는 경우 상동성 퍼센트에서의 큰 감소를 발생시킬 수 있다는 것을 고려하지 못한다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어를 과도하게 불리하게 만들지 않으며 가능한 삽입 및 결실을 고려한 최적 정렬을 발생시키도록 설계된다. 이는 서열 정렬에 "갭"을 삽입하여 국소 상동성을 최대화시키려고 노력함에 의해 달성된다.

그러나, 이러한 더욱 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 "갭 페널티"를 할당하여, 동일한 수의 동일한 아미노산에 대해, 2개의 비교되는 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬이 많은 갭을 갖는 서열 정렬보다 더 높은 스코어를 달성하도록 할 것이다. 갭의 존재에 대해 상대적으로 높은 코스트 및 갭 내의 각각의 후속 잔기에 대해 더 적은 페널티를 부과하는 "Affine 갭 코스트(Affine gap cost)"가 전형적으로 사용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변형되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위해 그러한 소프트웨어를 이용할 때 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 이용하는 경우, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12 및 각각의 연장에 대해 -4이다.

따라서, 최대 상동성 퍼센트의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려한 최적 정렬의 생성을 필요로 한다. 그러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지(Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18 참조), FASTA(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 비교 도구의 GENEWORKS 스위트(suite)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA 둘 모두는 오프라인 및 온라인 검색에 이용 가능하다(Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60 참조). 그러나, 일부 적용에 대해, GCG Bestfit 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다. 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위해 BLAST 2 Sequences로 언급되는 또 다른 도구가 또한 이용 가능하다(FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; and FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8 참조).

최종 상동성 퍼센트는 동일성과 관련하여 측정될 수 있으나, 정렬 과정 자체는 전형적으로 올-오어-낫씽(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신, 스코어를 화학적 유사성 또는 진화적 거리(evolutionary distance)에 기반하여 각각의 쌍별 비교에 할당하는 스케일드 유사성 스코어 매트릭스(scaled similarity score matrix)가 일반적으로 이용된다. 일반적으로 사용되는 그러한 매트릭스의 예는 프로그램의 BLAST 스위트에 대한 디폴트 매트릭스인 BLOSUM62 매트릭스이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 값 또는 공급된 경우 맞춤 기호 비교 표를 이용한다(추가 세부사항에 대해서는 사용자 매뉴얼 참조). 일부 적용을 위해, GCG 패키지에 대한 공개 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우에, 디폴트 매트릭스, 예를 들어, BLOSUM62를 이용하는 것이 바람직하다.

소프트웨어가 최적 정렬을 생성한 후, 상동성 퍼센트, 바람직하게는 서열 동일성 퍼센트를 계산할 수 있다. 소프트웨어는 통상적으로 이를 서열 비교의 일부로서 수행하며, 수치적 결과를 발생시킨다.

본 발명의 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "단편"도 변이체이며, 이 용어는 기능적으로 또는, 예를 들어, 검정에서 관심 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 전형적으로 지칭한다. 따라서, "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다.

그러한 변이체는 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발을 이용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어져야 하는 경우, 삽입 부위의 양쪽의 자연-발생 서열에 해당하는 5' 및 3' 측접 영역과 함께 삽입물을 인코딩하는 합성 DNA가 제조될 수 있다. 측접 영역은 자연 발생 서열 내의 부위에 상응하는 편리한 제한 부위를 함유할 것이며, 이에 의해 서열은 적절한 효소(들)로 절단되고 합성 DNA는 그 절단부에 라이게이션될 수 있다. 이후, DNA는 본 발명에 따라 발현되어 인코딩된 단백질을 제조한다. 이러한 방법은 단지 DNA 서열의 조작을 위한 당업계에 공지된 다수의 표준 기술의 예시이며, 다른 공지된 기술이 또한 이용될 수 있다.

코돈 최적화

본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 WO 1999/41397호 및 WO 2001/79518호에 이전에 기재되었다. 다양한 세포는 이들의 특정 코돈의 사용에 있어서 상이하다. 이러한 코돈 편향은 그 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적 과다에서의 편향에 상응한다. 상응하는 tRNA의 상대적 과다와 일치하도록 맞춤화되도록 서열 내의 코돈을 변경시킴에 의해, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 같은 이유로, 상응하는 rRNA가 특정 세포 유형에서 드문 것으로 공지된 코돈을 일부러 선택함에 의해 발현을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 추가적인 번역 정도의 조절이 이용 가능하다.

실시예

물질 및 방법(실시예 1-2)

세포 형질도입 및 수확

배양된 HEK293 세포를 광범위한 감염 다중도(MOI, 유전체 입자/세포)의 rAAV2/2-REP1으로 처리하였다. RAAV2/2-GFP를 대조군 벡터로서 동시에 이용하였고, 트랜스진 발현의 개시에 대해 형광을 모니터하였다.

형질도입되지 않은 세포, 및 +AAV-GFP 형질도입 및 +AAV-REP1 형질도입된 세포에 대한 실험을 동시에 수행하였다.

세포 용해물을 하기 프로토콜을 사용하여 형질도입 5일 후에 제조하였다: 세포를 PBS로 세척하고, 프레닐화 완충제, pH 7.5(50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche))와 함께 얼음 위에서 5분 동안 인큐베이션하였다; 이후 세포를 세포 스크레이퍼를 사용하여 1.5 mL의 튜브로 긁어내어 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다; 이어서, 세포를 1 mL 주사기에 부착된 26-G 주사기 바늘을 통해 20회 밀어내어 붕괴시켰다.

용해된 세포를 4℃에서 1500×g으로 5분 동안 원심분리하였다. 이후 상청액을 셀룰로스 프로피오네이트 튜브로 옮기고 4℃에서 100000×g으로 1시간 동안 원심분리하였다. 두 번째 원심분리 단계로부터의 상청액을 시험관 내 프레닐화 반응에 사용하였다(하기 기재됨).

총 단백질 정량

총 세포 단백질 농도는 Bradford 방법을 사용하여 제조업체의 지시(Quick Start™ Bradford 1x Dye Reagent, BioRad, #500-0205)에 따라 정량되었다. 샘플 값은 표준 곡선으로부터 외삽되었다.

시험관 내 프레닐화 반응

프레닐화 반응은 프레닐화 완충제에서, 동결된 세포 용해물(10-30 μg), 2 μM Rab GGTase, 4 μM Rab 단백질(Rab27a 또는 Rab6a) 및 5 μM 바이오틴-게라닐피로포스페이트(BGPP)를 지질 공여체로서 사용하여 설정되었다. 모든 반응물에는 새로운 GDP(구아노신 디포스페이트, 20 μM) 및 DTT(1 mM)가 보충되었다.

양성 대조군 샘플의 경우, 어류 REP1(양에 대한 개별 실험 참조)를 형질도입되지 않은 세포로부터의 용해물을 함유하는 프레닐화 반응에 첨가하였다.

반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 샘플 완충제(Laemmli 완충제, 2× 농축액, Sigma #S3401)을 첨가함에 의해 중단시켰다. 이 완충제는 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올, 0.004% 브롬페놀 블루 및 0.125 M Tris HCl을 함유하며 pH는 약 6.8이다.

인간 REP-1, β-액틴(로딩 대조군으로) 및 바이오티닐화된 Rab 단백질(Rab27a 또는 Rab6a)을 검출하기 위해 웨스턴 블롯(WB)을 수행하였다.

인간 REP1의 검출을 위해, Millipore로부터의 마우스 모노클로날 항체(클론 2F1, #MABN52)를 사용하였다. β-액틴의 검출을 위해, Thermo Fisher Scientific으로부터의 마우스 모노클로날 항체(클론 AC-15, #AM4302)를 사용하였다. 둘 모두의 검출 이후에 이차 항체-표지 단계(당나귀 항-마우스 HRP, Abcam, #ab98799)가 따라왔다.

적절한 Rab 기질로의 바이오티닐화된 지질 공여체의 혼입은 스트렙타비딘-HRP(Thermo Fisher Scientific, #43-4323)와의 직접 인큐베이션에 의해 검출되었다.

모든 막을 ECL 기질 및 Odyssey FC 검출 시스템(LI-COR)을 사용하여 검출하였다. 밴드의 강도는 Image Studio Lite 소프트웨어(LI-COR)를 사용하여 정량적으로 분석되었다.

실시예 1 - 프레닐화 기질로서 Rab27a

Rab27a를 기질로 사용하는 프레닐화 검정의 민감도를 시험하기 위해, 다음 세포를 사용하여 동시에 실험을 수행하였다:

(a) 형질도입되지 않은 세포;

(b) MOI가 10000인 AAV-GFP로 형질도입된 세포; 및

(c) MOI가 10000인 AAV-REP1으로 형질도입된 세포.

프레닐화 반응은 12.5 μL의 총 부피에서 10 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 2 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다.

결과는 Rab27a가 AAV-REP1로 세포를 형질도입한 후 REP1 기능을 평가하기 위한 프레닐화 검정을 위한 기질임을 나타낸다(도 1). 그러나, WB 반정량으로부터의 신호는 그다지 강하지 않다.

WB 밴드 강도를 증가시키기 위해 총 세포 단백질의 양을 증가시키면서 이 연구를 반복하였다.

프레닐화 반응은 22 μL의 총 부피에서 30 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 1 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다.

결과는 Rab27a가 AAV-REP1로 세포를 형질도입한 후 REP1 기능을 평가하기 위한 프레닐화 검정을 위한 기질로서 작용함을 확인시켜 준다(도 2). 또한, WB 신호의 강도는 10 μg의 용해물을 사용하여 수득된 데이터에 비해 증가하였다. 그러나, 신호는 여전히 그다지 강하지 않다. 이상적으로는, 세포가 AAV-REP1로 형질도입될 때 프레닐화된 Rab 단백질의 더 큰 증가가 관찰되었을 것이다.

실시예 2 - 프레닐화 기질로서 Rab6a

Rab6a를 기질로 사용하는 프레닐화 검정의 민감도를 시험하기 위해, 다음 세포를 사용하여 동시에 실험을 수행하였다(실시예 1에서 사용된 동일한 세포 용해물):

(a) 형질도입되지 않은 세포;

(b) MOI가 10000인 AAV-GFP로 형질도입된 세포; 및

(c) MOI가 10000인 AAV-REP1으로 형질도입된 세포.

프레닐화 반응은 20 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 1 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다.

결과는 Rab6a가 AAV-REP1로 세포를 형질도입한 후 REP1 기능을 평가하기 위한 프레닐화 검정을 위한 효과적인 기질임을 나타낸다(도 3).

총 단백질이 덜 사용되었더라도, WB 신호의 강도는 도 2에 제시된 데이터와 비교하여 AAV-REP1이 형질도입된 세포에서 약 10배 증가하였다. 또한, 양성 대조군에 대한 밴드 강도는 도 2에 제시된 데이터와 비교하여 약 100배 더 크며, 이는 Rab6a-기반 검정의 증가된 민감도를 확인시켜 준다.

데이터는 또한 증가된 민감도가 내인성 수준에서도 차이를 검출할 수 있음을 입증하며, 이는 검정을 보다 정확하게 만든다.

프레닐화 기질로서 Rab6a의 사용에 의해 제공되는 증가된 검정 민감도의 성공적인 입증에 이어, 본 발명자들은 Rab6a 프레닐화가 AAV-REP1의 양과 관련이 있는지에 관하여 상이한 MOI의 AAV-REP1 연구를 사용하여 검정을 반복하였다.

실험은 다음 세포를 사용하여 동시에 수행되었다:

(a) 형질도입되지 않은 세포;

(b) MOI가 250인 AAV-REP1으로 형질도입된 세포;

(c) MOI가 1000인 AAV-REP1으로 형질도입된 세포;

(d) MOI가 5000인 AAV-REP1으로 형질도입된 세포;

(e) MOI가 10000인 AAV-REP1으로 형질도입된 세포; 및

(f) MOI가 20000인 AAV-REP1으로 형질도입된 세포.

프레닐화 반응은 15 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 0.5 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다.

결과는 Rab6a가 AAV-REP1로 세포를 형질도입한 후 REP1 기능을 평가하기 위한 프레닐화 검정을 위한 효과적인 기질임을 확인시켜 주고(도 4) 또한 Rab6a에서 바이오티닐화된 지질 공여체의 혼입이 세포 형질도입을 위해 사용된 AAV-REP1의 양과 관련이 있음을 입증한다.

Rab6a를 효과적인 검정 기질로서 검증한 다음, 이어서 본 발명자들은 현재 1상 임상 시험에 사용 중인 AAV-REP1 벡터를 시험하였다(MacLaren, R.E. et al. (2014) Lancet 383: 1129-37).

실험은 다음 세포를 사용하여 동시에 수행되었다:

(a) 형질도입되지 않은 세포(#29, #30 및 #31);

(b) MOI가 10000인 AAV-REP1으로 형질도입된 세포(#32, #33 및 #34); 및

(c) MOI가 10000인 GMP 등급 AAV-REP1으로 형질도입된 세포(#35, #36 및 #37).

결과는 이전의 실험과 일치하며, Rab6a에서 바이오티닐화된 지질 공여체의 혼입이 세포 형질도입을 위해 사용된 AAV-REP1의 양과 관련이 있음을 확인시켜 준다(도 5).

실시예 3 - ARPE-19 세포를 사용한 프레닐화 반응에서 기질로서 Rab6a

세포 형질도입 및 수확

배양된 ARPE-19 세포를 10,000개 유전체 입자/세포의 MOI의 rAAV2/2-REP1으로 처리하였다. 세포 용해물을 형질도입 13일 후에 제조하였다: 세포를 PBS로 세척하고, 얼음 위에서 pH 7.5의 프레닐화 완충제(50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche))와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세포 스크레이퍼를 사용하여 1.5 mL의 튜브로 긁어내어 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1 mL 주사기에 부착된 26-G 주사기 바늘을 통해 20회 밀어내어 붕괴시켰다. 세포를 1,500 g, 4℃에서 5분 동안 회전시켰다. 이후 상청액을 셀룰로스 프로피오네이트 튜브로 옮기고 4℃에서 100,000 g으로 1시간 동안 원심분리하였다. 상청액을 시험관 내 프레닐화 반응에 사용하였다.

총 단백질 정량

총 세포 단백질은 Bradford 방법을 사용하여 제조업체의 지시(Quick Start™ Bradford 1x Dye Reagent, BioRad, #500-0205)에 따라 정량되었다. 샘플 값은 표준 곡선으로부터 외삽되었다.

시험관 내 프레닐화 반응

프레닐화 반응은 프레닐화 완충제에서, 동결된 세포 용해물(15 μg), 2 μM Rab GGTase, 4 μM의 Rab 단백질(Rab6a) 및 5 μM의 바이오틴-게라닐피로포스페이트를 지질 공여체로서 사용하여 설정되었다. 모든 반응물에는 새로운 GDP(20 μM) 및 DTT(1 mM)가 보충되었다. 양성 대조군 샘플에서, 어류 REP1(양에 대한 실험 참조)를 형질도입되지 않은 세포 용해물을 함유하는 프레닐화 반응에 첨가하였다.

반응물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 SDS-PAGE 샘플 완충제의 첨가에 의해 중단시켰다.

인간 REP-1, β-액틴(로딩 대조군) 및 바이오티닐화된 Rab 단백질(Rab27a 또는 Rab6a)을 검출하기 위해 웨스턴 블롯(WB)을 수행하였다. 인간 REP1의 검출을 위해, Millipore로부터의 마우스 모노클로날 항체(클론 2F1, #MABN52)를 사용하였다. β-액틴의 검출을 위해, Thermo Fisher Scientific으로부터의 마우스 모노클로날 항체(클론 AC-15, #AM4302)를 사용하였다. 둘 모두의 검출 이후에 이차 항체-표지 단계(당나귀 항-마우스 HRP, Abcam, #ab98799)가 따라왔다. 적절한 Rab 기질로의 바이오티닐화된 지질 공여체의 혼입은 스트렙타비딘-HRP(Thermo Fisher Scientific, #43-4323)와의 직접 인큐베이션에 의해 검출되었다. 모든 막을 ECL 기질 및 Odyssey FC 검출 시스템(LI-COR)을 사용하여 검출하였다. 밴드의 강도는 Image Studi Lite 소프트웨어(LI-COR)를 사용하여 정량적으로 분석되었다.

결과 및 논의

ARPE-19 세포(인간 망막 색소 상피 세포)에서 기질로서 Rab6a를 사용한 프레닐화 검정을 시험하기 위해, 실험은 다음 세포를 사용하여 동시에 수행되었다:

(a) 형질도입되지 않은 세포(#86 및 #87); 및

(b) 세포 + AAV-REP1 MOI 10,000(#90 및 #91) - R&D 등급 벡터.

프레닐화 반응은 45 μL의 총 부피에서 15 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 0.1 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다.

결과는 Rab6a가 AAV-REP1로 ARPE-19 세포를 형질도입한 후 REP1 기능을 평가하기 위한 프레닐화 검정을 위한 기질로서 작용함을 나타낸다(도 6).

실시예 4 - HT1080 세포를 사용한 프레닐화 반응에서 기질로서 Rab6a

세포 형질도입 및 수확

배양된 HT1080 세포를 10,000개 유전체 입자/세포의 MOI의 rAAV2/2-REP1으로 처리하였다. 세포 용해물을 형질도입 5일 후에 제조하였다: 세포를 PBS로 세척하고, 얼음 위에서 pH 7.5의 프레닐화 완충제(50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche))와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세포 스크레이퍼를 사용하여 1.5 mL의 튜브로 긁어내어 얼음 위에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 1 mL 주사기에 부착된 26-G 주사기 바늘을 통해 20회 밀어내어 붕괴시켰다. 세포를 1,500 g, 4℃에서 5분 동안 회전시켰다. 이후 상청액을 셀룰로스 프로피오네이트 튜브로 옮기고 4℃에서 100,000 g으로 1시간 동안 원심분리하였다. 상청액을 시험관 내 프레닐화 반응에 사용하였다.

총 단백질 정량

시험관 내 프레닐화 반응

프레닐화 반응은 프레닐화 완충제에서, 동결된 세포 용해물(20 μg), 2 μM Rab GGTase, 4 μM의 Rab 단백질(Rab6a) 및 5 μM의 바이오틴-게라닐피로포스페이트를 지질 공여체로서 사용하여 설정되었다. 모든 반응물에는 새로운 GDP(20 μM) 및 DTT(1 mM)가 보충되었다. 양성 대조군 샘플의 경우, 어류 REP1(양에 대한 실험 참조)를 형질도입되지 않은 세포 용해물을 함유하는 프레닐화 반응에 첨가하였다.

결과 및 논의

HT1080 세포에서 기질로서 Rab6a를 사용한 프레닐화 검정을 시험하기 위해, 실험은 다음 세포를 사용하여 동시에 수행되었다:

(a) 형질도입되지 않은 세포(#56 및 #57);

(b) 세포 + AAV-REP1 MOI 10,000(#60 및 #61) - R&D 등급 벡터; 및

(c) 세포 + AAV-REP1 MOI 10,000(#64 및 #65) - 임상 등급 벡터.

프레닐화 반응은 20 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물을 사용하여 설정되었다. 양성 대조군은 0.1 μM의 어류 REP1으로 스파이킹되었다.

결과는 Rab6a가 AAV-REP1로 HT1080 세포를 형질도입한 후 REP1 기능을 평가하기 위한 프레닐화 검정을 위한 기질로서 작용함을 나타낸다(도 7).

실시예 5 - 프레닐화 반응에서 기질로서 Rab27a 및 Rab6a의 비교

동일한 세포 용해물을 도 4에 나타낸 실험에서와 같이 사용하였다:

(a) 형질도입되지 않은 세포;

(b) 세포 + AAV-REP1 MOI 250;

(c) 세포 + AAV-REP1 MOI 1,000;

(d) 세포 + AAV-REP1 MOI 5,000;

(e) 세포 + AAV-REP1 MOI 10,000; 및

(f) 세포 + AAV-REP1 MOI 20,000.

프레닐화 반응은 15 μL의 총 부피에서 20 μg의 용해물, 및 2개의 상이한 기질인 Rab27a 및 Rab6a를 사용하여 설정되었다. 각 기질에 대해 하나씩의 양성 대조군은 0.1 μM의 어류 REP1로 스파이킹되었다. 샘플을 SDS-PAGE 상에서 동시에 진행시키고 동시에 검출하였다.

결과 및 논의

둘 모두의 Rab27a 및 Rab6a는 AAV-REP1로 세포를 형질도입한 후 REP1 기능을 평가하기 위한 프레닐화 검정을 위한 기질로서 작용한다.

바이오티닐화된 지질 공여체의 혼입은 사용된 기질 각각에 대해 세포 형질도입을 위해 사용된 AAV-REP1의 양과 관련이 있다(도 8).

바이오티닐화된 Rab6a의 밴드 밀도는 Rab27a보다 높으며, 이는 Rab6a가 상대적 효능의 결정을 위한 평행선 분석에 보다 적합한 기질임을 나타낸다.

실시예 6 - 상이한 조건을 사용한 프레닐화 반응에서 기질로서 Rab27a 및 Rab6a 성능의 비교

Rab27a 및 Rab6a를 사용하는 이 실험에 사용하기 위해 293 세포의 형질도입되지 않은 용해물을 제조하였다. 시험된 조건은 도 9의 표에 제시되어 있다. 샘플을 SDS-PAGE 상에서 동시에 진행시키고 동시에 검출하였다.

결과 및 논의

둘 모두의 Rab27a 및 Rab6a는 내인성 REP1 기능을 평가하기 위한 프레닐화 검정을 위한 기질로서 작용한다.

바이오티닐화된 지질 공여체의 혼입은 사용된 기질 각각에 대한 반응에서 총 단백질의 양과 관련이 있다.

조건을 비교해 보면, 반응에서 Rab 기질의 농도가 신호에 가장 큰 영향을 주는 것으로 보인다.

Rab6a를 사용할 때 Rab27a와 비교하여 바이오티닐화된 기질에서 2.5배 증가가 존재한다.

실시예 7 - AAV2-REP1으로 형질도입된 용해물에서 프레닐화 반응의 기질로서 Rab27a 및 Rab6a의 비교

증가된 MOI의 AAV2-REP1(R & D material)을 이용하여 새로운 용해물(삼중으로)을 제조하였다.

(a) 형질도입되지 않은 세포;

(b) 세포 + AAV-REP1 MOI 100;

(c) 세포 + AAV-REP1 MOI 500;

(d) 세포 + AAV-REP1 MOI 1,000;

(e) 세포 + AAV-REP1 MOI 5,000;

(f) 세포 + AAV-REP1 MOI 10,000;

(g) 세포 + AAV-REP1 MOI 20,000; 및

(h) 세포 + AAV-REP1 MOI 50,000.

프레닐화 반응물은 10 μL의 총 부피로, 20 μg의 총 단백질, 2 μM의 Rab 기질(Rab27a 또는 Rab6a) 및 2 μM의 Rab GGTase를 사용하여 제조되었다. 각 기질에 대해 하나씩의 양성 대조군은 0.1 μM의 어류 REP1로 스파이킹되었다.

각 복제물로부터의 샘플을 SDS-PAGE에서 동시에 진행시키고, Image Studio Lite 소프트웨어를 사용하여 바이오티닐화된 기질(1:10,000), 로딩 대조군으로서 β-액틴(1:50,000) 및 인간 REP1(1:2,500)에 대해 검출하였다. 바이오티닐화된 기질에 대한 밴드 밀도의 반정량으로부터의 데이터를 Prism 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다(도 10).

결과

β-액틴의 수준은 분석된 모든 샘플에서 유사하였다. 형질도입되지 않은 세포(및 양성 대조군 샘플)는 REP1의 내인성 수준을 나타내었다. AAV-REP1으로 형질도입된 세포는 사용된 MOI와 직접적으로 상관되는 REP1 수준의 증가를 나타내었다. 양성 대조군은 어류 REP1 활성의 결과로서 더 강한 바이오틴 혼입을 나타낸다.

기질 및 MOI를 인자로서 갖는 3개 모두의 복제물의 이원 ANOVA 분석은 둘 모두가 고도로 유의하였음을 나타내었다(p<0.0001). 주어진 MOI의 기질의 효과에 대한 Bonferroni의 다중 비교 테스트는 MOI가 5,000(p=0.0023) 및 그 이상인 모두(p<0.0001)에서 유의한 쌍별 차이(pairwise difference)를 보였다.

논의

바이오티닐화된 기질에 대한 밴드 밀도의 반정량만이 Rab6a에 대한 값이 Rab27a에 대해 수득된 값보다 유의하게 높다는 것을 나타낸다.

상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 용도의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구체예와 관련하여 기재되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명은 그러한 특정 구체예로 부당하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> NightstaRx Limited <120> PRENYLATION ASSAY <130> P108257PCT <150> GB 1604146.9 <151> 2016-03-10 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Thr Gly Gly Asp Phe Gly Asn Pro Leu Arg Lys Phe Lys Leu 1 5 10 15 Val Phe Leu Gly Glu Gln Ser Val Gly Lys Thr Ser Leu Ile Thr Arg 20 25 30 Phe Met Tyr Asp Ser Phe Asp Asn Thr Tyr Gln Ala Thr Ile Gly Ile 35 40 45 Asp Phe Leu Ser Lys Thr Met Tyr Leu Glu Asp Arg Thr Val Arg Leu 50 55 60 Gln Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Arg Phe Arg Ser Leu Ile Pro 65 70 75 80 Ser Tyr Ile Arg Asp Ser Thr Val Ala Val Val Val Tyr Asp Ile Thr 85 90 95 Asn Val Asn Ser Phe Gln Gln Thr Thr Lys Trp Ile Asp Asp Val Arg 100 105 110 Thr Glu Arg Gly Ser Asp Val Ile Ile Met Leu Val Gly Asn Lys Thr 115 120 125 Asp Leu Ala Asp Lys Arg Gln Val Ser Ile Glu Glu Gly Glu Arg Lys 130 135 140 Ala Lys Glu Leu Asn Val Met Phe Ile Glu Thr Ser Ala Lys Ala Gly 145 150 155 160 Tyr Asn Val Lys Gln Leu Phe Arg Arg Val 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125 Asn Ser Thr Glu Ala Ala Asp Ser Ala Phe Leu Pro Thr Glu Asp Glu 130 135 140 Ser Leu Ser Thr Met Ser Cys Glu Met Leu Thr Glu Gln Thr Pro Ser 145 150 155 160 Ser Asp Pro Glu Asn Ala Leu Glu Val Asn Gly Ala Glu Val Thr Gly 165 170 175 Glu Lys Glu Asn His Cys Asp Asp Lys Thr Cys Val Pro Ser Thr Ser 180 185 190 Ala Glu Asp Met Ser Glu Asn Val Pro Ile Ala Glu Asp Thr Thr Glu 195 200 205 Gln Pro Lys Lys Asn Arg Ile Thr Tyr Ser Gln Ile Ile Lys Glu Gly 210 215 220 Arg Arg Phe Asn Ile Asp Leu Val Ser Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Gly 225 230 235 240 Leu Leu Ile Asp Leu Leu Ile Lys Ser Asn Val Ser Arg Tyr Ala Glu 245 250 255 Phe Lys Asn Ile Thr Arg Ile Leu Ala Phe Arg Glu Gly Arg Val Glu 260 265 270 Gln Val Pro Cys Ser Arg Ala Asp Val Phe Asn Ser Lys Gln Leu Thr 275 280 285 Met Val Glu Lys Arg Met Leu Met Lys Phe Leu Thr Phe Cys Met Glu 290 295 300 Tyr Glu Lys Tyr Pro Asp Glu Tyr Lys Gly Tyr Glu Glu Ile Thr Phe 305 310 315 320 Tyr Glu Tyr Leu Lys Thr Gln Lys Leu Thr Pro Asn Leu Gln Tyr Ile 325 330 335 Val Met His Ser Ile Ala Met Thr Ser Glu Thr Ala Ser Ser Thr Ile 340 345 350 Asp Gly Leu Lys Ala Thr Lys Asn Phe Leu His Cys Leu Gly Arg Tyr 355 360 365 Gly Asn Thr Pro Phe Leu Phe Pro Leu Tyr Gly Gln Gly Glu Leu Pro 370 375 380 Gln Cys Phe Cys Arg Met Cys Ala Val Phe Gly Gly Ile Tyr Cys Leu 385 390 395 400 Arg His Ser Val Gln Cys Leu Val Val Asp Lys Glu Ser Arg Lys Cys 405 410 415 Lys Ala Ile Ile Asp Gln Phe Gly Gln Arg Ile Ile Ser Glu His Phe 420 425 430 Leu Val Glu Asp Ser Tyr Phe Pro Glu Asn Met Cys Ser Arg Val Gln 435 440 445 Tyr Arg Gln Ile Ser Arg Ala Val Leu Ile Thr Asp Arg Ser Val Leu 450 455 460 Lys Thr Asp Ser Asp Gln Gln Ile Ser Ile Leu Thr Val Pro Ala Glu 465 470 475 480 Glu Pro Gly Thr Phe Ala Val Arg Val Ile Glu Leu Cys Ser Ser Thr 485 490 495 Met Thr Cys Met Lys Gly Thr Tyr Leu Val His Leu Thr Cys Thr Ser 500 505 510 Ser Lys Thr Ala Arg Glu Asp Leu Glu Ser Val Val Gln Lys Leu Phe 515 520 525 Val Pro Tyr Thr Glu Met Glu Ile Glu Asn Glu Gln Val Glu Lys Pro 530 535 540 Arg Ile Leu Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Met Arg Asp Ser Ser Asp Ile 545 550 555 560 Ser Arg Ser Cys Tyr Asn Asp Leu Pro Ser Asn Val Tyr Val Cys Ser 565 570 575 Gly Pro Asp Cys Gly Leu Gly Asn Asp Asn Ala Val Lys Gln Ala Glu 580 585 590 Thr Leu Phe Gln Glu Ile Cys Pro Asn Glu Asp Phe Cys Pro Pro Pro 595 600 605 Pro Asn Pro Glu Asp Ile Ile Leu Asp Gly Asp Ser Leu Gln Pro Glu 610 615 620 Ala Ser Glu Ser Ser Ala Ile Pro Glu Ala Asn Ser Glu Thr Phe Lys 625 630 635 640 Glu Ser Thr Asn Leu Gly Asn Leu Glu Glu Ser Ser Glu 645 650 <210> 6 <211> 1962 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atggcggata ctctcccttc ggagtttgat gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa 60 tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga 120 agctactatg gaggaaactg ggccagtttt agcttttcag gactattgtc ctggctaaag 180 gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt 240 gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta 300 ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa 360 aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc acagaagctg cagattctgc cttcctgcct 420 acggaggatg agtcattaag cactatgagc tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc 480 agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac 540 cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg 600 cctatagcag aagataccac agagcaacca aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt 660 attaaagaag gcaggagatt taatattgat ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga 720 ttactaattg atcttctaat caaatctaat gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt 780 accaggattc ttgcatttcg agaaggacga gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat 840 gtctttaata gcaaacaact tactatggta gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca 900 ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat gaatataaag gatatgaaga gatcacattt 960 tatgaatatt taaagactca aaaattaacc cccaacctcc aatatattgt catgcattca 1020 attgcaatga catcagagac agccagcagc accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac 1080 tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac actccatttt tgtttccttt atatggccaa 1140 ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt 1200 cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata 1260 gatcagtttg gtcagagaat aatctctgag catttcctcg tggaggacag ttactttcct 1320 gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg cagatctcca gggcagtgct gattacagat 1380 agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa cagatttcca ttttgacagt gccagcagag 1440 gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg 1500 aaaggcacct atttggttca tttgacttgc acatcttcta aaacagcaag agaagattta 1560 gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa 1620 gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt tacttcaata tgagagattc gtcagacatc 1680 agcaggagct gttataatga tttaccatcc aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt 1740 ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc 1800 aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat cctgaagaca ttatccttga tggagacagt 1860 ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc ataccagagg ctaactcgga gactttcaag 1920 gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag tcctctgaat aa 1962 <210> 7 <211> 1992 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gatatcgaat tcctgcagcc cggcggcacc atggcggata ctctcccttc ggagtttgat 60 gtgatcgtaa tagggacggg tttgcctgaa tccatcattg cagctgcatg ttcaagaagt 120 ggccggagag ttctgcatgt tgattcaaga agctactatg gaggaaactg ggccagtttt 180 agcttttcag gactattgtc ctggctaaag gaataccagg aaaacagtga cattgtaagt 240 gacagtccag tgtggcaaga ccagatcctt gaaaatgaag aagccattgc tcttagcagg 300 aaggacaaaa ctattcaaca tgtggaagta ttttgttatg ccagtcagga tttgcatgaa 360 gatgtcgaag aagctggtgc actgcagaaa aatcatgctc ttgtgacatc tgcaaactcc 420 acagaagctg cagattctgc cttcctgcct acggaggatg agtcattaag cactatgagc 480 tgtgaaatgc tcacagaaca aactccaagc agcgatccag agaatgcgct agaagtaaat 540 ggtgctgaag tgacagggga aaaagaaaac cattgtgatg ataaaacttg tgtgccatca 600 acttcagcag aagacatgag tgaaaatgtg cctatagcag aagataccac agagcaacca 660 aagaaaaaca gaattactta ctcacaaatt attaaagaag gcaggagatt taatattgat 720 ttagtatcaa agctgctgta ttctcgagga ttactaattg atcttctaat caaatctaat 780 gttagtcgat atgcagagtt taaaaatatt accaggattc ttgcatttcg agaaggacga 840 gtggaacagg ttccgtgttc cagagcagat gtctttaata gcaaacaact tactatggta 900 gaaaagcgaa tgctaatgaa atttcttaca ttttgtatgg aatatgagaa atatcctgat 960 gaatataaag gatatgaaga gatcacattt tatgaatatt taaagactca aaaattaacc 1020 cccaacctcc aatatattgt catgcattca attgcaatga catcagagac agccagcagc 1080 accatagatg gtctcaaagc taccaaaaac tttcttcact gtcttgggcg gtatggcaac 1140 actccatttt tgtttccttt atatggccaa ggagaactcc cccagtgttt ctgcaggatg 1200 tgtgctgtgt ttggtggaat ttattgtctt cgccattcag tacagtgcct tgtagtggac 1260 aaagaatcca gaaaatgtaa agcaattata gatcagtttg gtcagagaat aatctctgag 1320 catttcctcg tggaggacag ttactttcct gagaacatgt gctcacgtgt gcaatacagg 1380 cagatctcca gggcagtgct gattacagat agatctgtcc taaaaacaga ttcagatcaa 1440 cagatttcca ttttgacagt gccagcagag gaaccaggaa cttttgctgt tcgggtcatt 1500 gagttatgtt cttcaacgat gacatgcatg aaaggcacct atttggttca tttgacttgc 1560 acatcttcta aaacagcaag agaagattta gaatcagttg tgcagaaatt gtttgttcca 1620 tatactgaaa tggagataga aaatgaacaa gtagaaaagc caagaattct gtgggctctt 1680 tacttcaata tgagagattc gtcagacatc agcaggagct gttataatga tttaccatcc 1740 aacgtttatg tctgctctgg cccagattgt ggtttaggaa atgataatgc agtcaaacag 1800 gctgaaacac ttttccagga aatctgcccc aatgaagatt tctgtccccc tccaccaaat 1860 cctgaagaca ttatccttga tggagacagt ttacagccag aggcttcaga atccagtgcc 1920 ataccagagg ctaactcgga gactttcaag gaaagcacaa accttggaaa cctagaggag 1980 tcctctgaat aa 1992 <210> 8 <211> 567 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 8 Met His Gly Arg Leu Lys Val Lys Thr Ser Glu Glu Gln Ala Glu Ala 1 5 10 15 Lys Arg Leu Glu Arg Glu Gln Lys Leu Lys Leu Tyr Gln Ser Ala Thr 20 25 30 Gln Ala Val Phe Gln Lys Arg Gln Ala Gly Glu Leu Asp Glu Ser Val 35 40 45 Leu Glu Leu Thr Ser Gln Ile Leu Gly Ala Asn Pro Asp Phe Ala Thr 50 55 60 Leu Trp Asn Cys Arg Arg Glu Val Leu Gln His Leu Glu Thr Glu Lys 65 70 75 80 Ser Pro Glu Glu Ser Ala Ala Leu Val Lys Ala Glu Leu Gly Phe Leu 85 90 95 Glu Ser Cys Leu Arg Val Asn Pro Lys Ser Tyr Gly Thr Trp His His 100 105 110 Arg Cys Trp Leu Leu Ser Arg Leu Pro Glu Pro Asn Trp Ala Arg Glu 115 120 125 Leu Glu Leu Cys Ala Arg Phe Leu Glu Ala Asp Glu Arg Asn Phe His 130 135 140 Cys Trp Asp Tyr Arg Arg Phe Val Ala Ala Gln Ala Ala Val Ala Pro 145 150 155 160 Ala Glu Glu Leu Ala Phe Thr Asp Ser Leu Ile Thr Arg Asn Phe Ser 165 170 175 Asn Tyr Ser Ser Trp His Tyr Arg Ser Cys Leu Leu Pro Gln Leu His 180 185 190 Pro Gln Pro Asp Ser Gly Pro Gln Gly Arg Leu Pro Glu Asn Val Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Leu Glu Leu Val Gln Asn Ala Phe Phe Thr Asp Pro Asn 210 215 220 Asp Gln Ser Ala Trp Phe Tyr His Arg Trp Leu Leu Gly Arg Ala Glu 225 230 235 240 Pro His Asp Val Leu Cys Cys Val His Val Ser Arg Glu Glu Ala Cys 245 250 255 Leu Ser Val Cys Phe Ser Arg Pro Leu Thr Val Gly Ser Arg Met Gly 260 265 270 Thr Leu Leu Leu Met Val Asp Glu Ala Pro Leu Ser Val Glu Trp Arg 275 280 285 Thr Pro Asp Gly Arg Asn Arg Pro Ser His Val Trp Leu Cys Asp Leu 290 295 300 Pro Ala Ala Ser Leu Asn Asp Gln Leu Pro Gln His Thr Phe Arg Val 305 310 315 320 Ile Trp Thr Gly Ser Asp Ser Gln Lys Glu Cys Val Leu Leu Lys Asp 325 330 335 Arg Pro Glu Cys Trp Cys Arg Asp Ser Ala Thr Asp Glu Gln Leu Phe 340 345 350 Arg Cys Glu Leu Ser Val Glu Lys Ser Thr Val Leu Gln Ser Glu Leu 355 360 365 Glu Ser Cys Lys Glu Leu Gln Glu Leu Glu Pro Glu Asn Lys Trp Cys 370 375 380 Leu Leu Thr Ile Ile Leu Leu Met Arg Ala Leu Asp Pro Leu Leu Tyr 385 390 395 400 Glu Lys Glu Thr Leu Gln Tyr Phe Ser Thr Leu Lys Ala Val Asp Pro 405 410 415 Met Arg Ala Ala Tyr Leu Asp Asp Leu Arg Ser Lys Phe Leu Leu Glu 420 425 430 Asn Ser Val Leu Lys Met Glu Tyr Ala Asp Val Arg Val Leu His Leu 435 440 445 Ala His Lys Asp Leu Thr Val Leu Cys His Leu Glu Gln Leu Leu Leu 450 455 460 Val Thr His Leu Asp Leu Ser His Asn Arg Leu Arg Ala Leu Pro Pro 465 470 475 480 Ala Leu Ala Ala Leu Arg Cys Leu Glu Val Leu Gln Ala Ser Asp Asn 485 490 495 Ala Leu Glu Asn Val Asp Gly Val Ala Asn Leu Pro Arg Leu Gln Glu 500 505 510 Leu Leu Leu Cys Asn Asn Arg Leu Gln Gln Ser Ala Ala Ile Gln Pro 515 520 525 Leu Val Ser Cys Pro Arg Leu Val Leu Leu Asn Leu Gln Gly Asn Ser 530 535 540 Leu Cys Gln Glu Glu Gly Ile Gln Glu Arg Leu Ala 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Claims

(a) Rab 에스코트 단백질 1(REP1)을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)의 샘플을 Rab6a, Rab 게라닐게라닐트랜스퍼라제(Rab GGTase) 및 지질 공여체 기질과 접촉시키는 단계; 및
(c) 지질화된 Rab6a 생성물을 검출하는 단계를 포함하는 REP1의 활성을 결정하는 방법.
제1항에 있어서, REP1을 포함하는 샘플이 REP1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포, 바람직하게는 이의 용해물로부터 유래되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, REP1이 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 방법.
제3항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Rab6a 및/또는 Rab GGTase가 실질적으로 순수한 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Rab6a:Rab GGTase 몰비가 약 1:2-3, 바람직하게는 약 1:2.5인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 공여체 기질이 게라닐게라닐피로포스페이트(GGPP) 또는 이의 유사체, 바람직하게는 바이오틴-게라닐피로포스페이트(BGPP)인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 지질화된 Rab6a 생성물이 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯 분석 또는 오토라디오그래피를 사용하여 검출되는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 범맥락막위축의 치료에 사용하기 위한 REP1-인코딩 유전자 치료 벡터의 활성을 결정하기 위한 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 범맥락막위축의 치료에 사용하기 위한 REP1-인코딩 유전자 치료 벡터의 품질 관리 분석을 위한 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 지질화된 Rab6a 생성물의 검출 단계가 지질화된 Rab6a 생성물의 양을 정량하는 것을 포함하고, 바람직하게는 대조군 또는 참조 수준과 비교하여 양을 정량하는 것을 포함하는 방법.
Rab 에스코트 단백질 1(REP1)의 활성을 결정하기 위한 Rab6a의 용도.
제12항에 있어서, REP1이 REP1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포, 바람직하게는 이의 용해물로부터 유래되는 용도.
제12항 또는 제13항에 있어서, REP1이 REP1-인코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 용도.
제14항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인 용도.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도가 범맥락막위축의 치료에 사용하기 위한 REP1-인코딩 유전자 치료 벡터의 활성을 결정하기 위한 것인 용도.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용도가 범맥락막위축의 치료에 사용하기 위한 REP1-인코딩 유전자 치료 벡터의 품질 관리 분석을 위한 것인 용도.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Rab6a가 실질적으로 순수한 용도.