KR20180118564A

KR20180118564A - 항암활성을 갖는 플라즈마 처리수 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20180118564A
Application number: KR1020180053216A
Authority: KR
Inventors: 은하 최; 구세광; 아트리 판카지; 인 한; 지훈 박
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2018-10-31
Also published as: KR102134956B1

Abstract

본 발명의 목적은 플라즈마 처리수를 제조하여 이를 경구투여할 경우에 항암효과가 있는지 여부와 독성평가를 하고자 하는 것이다.
그에 따라 플라즈마 처리수의 제조방법과 경구투여 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 플라즈마 발생장치를 이용하여 증류수에 플라즈마를 조사하여 플라즈마 처리수를 제조하고, 플라즈마 처리 수 내 생성된 활성종인 과산화수소(H₂O₂₎, 산화질소(NO), 아질산 이온(NO₂ ^-), 질산 이온(NO₃ ^-)을 측정하고, 이를 설치류에게 경구투여하여 안전성을 시험하여 안전성을 확인한 후, 종양세포를 이식한 설치류에게 상기 플라즈마 처리수를 경구투여하여 항암활성을 나타내는 항암치료를 실시하였다.

Description

항암활성을 갖는 플라즈마 처리수 및 그 제조방법{Plasma Treatment Water with Anticancer Activiyt and Manufacturing Method Thereof}

본 발명은 항암활성을 갖는 플라즈마 처리수에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는, 플라즈마 처리수의 제조 및 이를 항암치료에 응용하는 기술에 관한 것이다.

종래, 반도체 제조 분야에서 핵심적인 역할을 해온 플라즈마 기술은 최근 그 적용분야를 더욱 넓혀 연구되고 있다. 바이오 플라즈마 기술의 응용은 살균작용, 공기정화작용, 피부 미용, 치아 미백, 발모 촉진, 피부질환 치료, 농식품의 생산 및 보관 기술 등 매우 다양하게 그 범위가 확대되고 있다.

플라즈마는 다양한 이온, 전자, 자유라디칼, 중성입자, 광자 등을 포함하여 창상, 혈전, 멸균, 구강질환 치료 등에 효과가 있는 것으로 연구되고 있으며, 환부에 대한 직접적인 플라즈마 조사(助射) 처리 방식으로 시도되고 있다. 저용량의 플라즈마 조사는 세포분화를 촉진하는 반면, 고용량의 플라즈마 조사는 세포의 아포시스(apoptosis)를 초래하는 것으로 연구되어[Kalghatgi et al., 2010:Vandamme et al.,2012] 플라즈마는 다양한 생체 내 변화를 일으킬 수 있을 것으로 기대되고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2004-0003340호는 플라즈마 방전시 방사되는 자외선으로 암세포를 치료하는 방법을 기재한다.

그러나 플라즈마를 이용하여 종양을 치료하는 방법으로써 종양 세포에 직접적인 플라즈마 조사 처리는 수술과 같은 처치를 요한다는 점에서 한계가 있다. 모든 종양 지점에 처리할 수 없다는 점과 지속적인 처치를 위해 여러 번의 수술을 감내하기 어렵다는 점이 문제된다. 이러한 상황하에 플라즈마 처리수를 환자에게 경구 투여하는 방안을 고려해 볼 수 있다. 아직까지 플라즈마 처리수를 경구투여하는 방안과 그 독성 평가가 이루어진 바 없다.

따라서 본 발명의 목적은 플라즈마 처리수를 제조하여 이를 경구투여할 경우에 항암효과가 있는지 여부와 독성평가를 하고자 하는 것이다.

그에 따라 플라즈마 처리수의 제조방법과 경구투여 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 플라즈마 발생장치를 이용하여 증류수에 플라즈마를 조사하여 플라즈마 처리수를 제조하고, 플라즈마 처리 수 내 생성된 활성종인 과산화수소(H₂O₂₎, 산화질소(NO), 아질산 이온(NO₂ ^-), 질산 이온(NO₃ ^-)을 측정하고, 이를 설치류에게 경구투여하여 안전성을 시험하여 안전성을 확인한 후, 종양세포를 이식한 설치류에게 상기 플라즈마 처리수를 경구투여하여 항암활성을 나타내는 항암치료를 실시하였다.

본 발명에 따르면, 플라즈마 처리수는 설치류에 대해 안전성을 나타내어 최대 내성 용량은 20ml/kg 이상으로 판단되었고, 경구투여에 의한 종양 치료는 플라즈마 처리수의 농도 의존적인 항암활성을 나타내었고, 종양 관련 악액질 현상 역시 현저히 감소시켰다.

도 1은 본 발명에 따라 플라즈마 처리수를 제조하는 과정을 보여주는 사진이다.
도 2는 제조된 플라즈마 처리수에 함유된 과산화수소(H₂O₂)의 농도 측정 결과 그래프이다.
도 3은 제조된 플라즈마 처리수에 함유된 산화질소(NO)의 농도 측정 결과 그래프이다.
도 4는 제조된 플라즈마 처리수에 함유된 아질산 이온(NO₂ ^-)의 농도 측정 결과 그래프이다.
도 5는 제조된 플라즈마 처리수에 함유된 질산 이온(Nitrate ion, NO₃ ^-)의 농도 측정 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 플라즈마 처리수를 제조한 플라즈마 제트의 구조 및 인가전압의 파형을 보여주는 도면이다.
도 7은 도 6의 플라즈마 제트 OES(Optical Emission Spectroscopy) 스펙트럼을 보여준다.

이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따라 플라즈마 처리 수(水)를 제조하는 과정을 보여주는 사진이다.

플라즈마 처리수는 증류수에 직접 플라즈마를 조사(助射)하여 제조한다. 증류수 표면에서 이격된 지점에 플라즈마 방전부를 배치하고 증류수에 플라즈마가 방전 조사되게 하며, 이때 증류수의 증발을 방지할 수 있는 수단을 제공하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 증류수가 담긴 그릇의 개구부를 충분히 덮을 수 있는 덮개부를 플라즈마 방전부에 설치하거나, 플라즈마 방전부 자체를 증류수가 담긴 그릇의 개구부를 덮을 수 있는 면 방전 구조로 만들 수 있다. 증류수를 담은 그릇은 플라즈마 처리로 인해 생성된 활성종들의 수명을 지속시킬 수 있도록 주변에 얼음과 같은 냉매를 배치한다. 플라즈마 처리시간은 증류수의 양에 따라 조절될 수 있으며, 처리시간이 길어질수록 활성종의 함량도 증가한다. 대략 처리시간은 5ml 증류수에 대해 10 분 내지 30분 일 수 있다. 후술되겠지만, 항암활성은 플라즈마 처리수의 농도, 즉, 활성종의 농도에 비례한다는 결과가 있어, 처리 시간은 주요 변수가 된다.

또한, 인가전압과 처리 시간을 제어함으로써 활성종의 종류와 양을 제어할 수 있다. 실제 플라즈마 처리수를 제조한 실시예에서 제시하는 증류수의 양을 비롯한 수치는 예시적인 것으로 변형실시될 수 있다.

본 실시예에서는 도 6의 플라즈마 제트를 사용하였으며, 그 구조에 대한 상세한 설명은 후술된다.

본 실시예에서 플라즈마 처리 수는 5 ml의 증류수를 플라즈마 제트로 처리하여 제작하였다. 플라즈마 처리 시간은 20분과 30분으로 하였으며, 플라즈마 제트의 노즐에서부터 증류수 표면까지의 거리는 5 mm로 고정하였다. 플라즈마 처리 동안에 발생할 수 있는 증류수의 증발을 방지하고자 가로와 세로가 6 cm인 정사각형 아크릴판을 플라즈마 제트 노즐에 설치하였다. 즉, 아크릴 판에 플라즈마 제트 노즐의 단부로부터 약간 위 편에 개구부를 형성하여 노즐을 끼우고 노즐을 이루는 외벽면을 아크릴판 개구부 둘레와 부착하였다. 부착은 용접, 글루건 등의 수단을 사용하여 실시될 수 있다. 아크릴 판은 다른 유전체판으로 구성될 수 있고, 노즐과의 접촉면만 절연체로된 금속판일 수도 있다. 아크릴 판은 증류수의 증발을 방지함과 동시에 활성종의 잔존량도 지키는 데 도움이 될 수 있다.

또한, 증류수를 담은 직경 4 cm의 6 well plate (SPL Life Sciences co., Ltd)는 플라즈마 처리 동안에 발생하는 증류수 내 활성종의 수명을 지속시키기 위하여 얼음 위에 올려놓은 상태에서 플라즈마로 처리하였다.

이와 같이 제조된 플라즈마 처리수 내에 생성된 활성종들을 조사하고 함량을 측정하였다.

즉, 플라즈마에 의한 플라즈마 처리 수 내 생성된 활성종인 과산화수소(H₂O₂), 산화질소(NO), 아질산 이온(NO₂ ^-), 질산 이온(NO₃ ^-)을 측정하였다.

도 2는 제조된 플라즈마 처리수에 함유된 과산화수소(H₂O₂)의 농도 측정 결과 그래프이다.

과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)는 플라즈마 20분 처리 후에 0.14mM이 생성되었고, 30분 처리 후에는 0.15mM이 생성되었다. 과산화수소를 측정하기 위해 황산티타늄 비색법(titanium sulfate colorimetric method)을 사용하였다. 황산티타늄(titanium sulfate, Ti(SO₄)₂)의 수용액에 과산화수소를 작용시켜면 티탄과산화물의 황색 용액을 얻을 수 있다. 흡수 파장 대역은 407 nm이며 황색의 세기는 과산화수소의 농도와 비례한다.

도 3은 제조된 플라즈마 처리수에 함유된 산화질소(NO)의 농도 측정 결과 그래프이다.

산화질소(Nitrtic oxide, NO)는 20분과 30분의 플라즈마 처리 후에 각각 1.2±0.5과 1.9±0.7로 측정되었다. 산화질소 측정에는 DAF-FM(4-amino-5-methylamino-2',7'-difluorescein)를 사용하였으며 저농도의 산화질소 검출에 사용하는 시약으로 산화질소와 반응하면서 형광 벤조트리아졸(benzotriazole)을 형성하고 형광 상태가 된다. 형광 여기 파장은 495 nm이며 방출 파장은 515 nm이다.

도 4는 제조된 플라즈마 처리수에 함유된 아질산 이온(NO₂ ^-)의 농도 측정 결과 그래프이다.

아질산 이온(Nitrite ion, NO₂ ^-)은 플라즈마 20분 처리 후에 0.11mM이 생성되었고, 30분 처리 후에는 0.18mM이 생성되었다. 아질산 이온 측정을 위해 그리스 시약(Griess reagent)을 사용하였다. 플라즈마 처리 후에 생성된 용액 내 아질산 이온이 그리스 시약과 반응하면서 분홍색을 나타내며 아질산 이온의 생성이 많을수록 진한 분홍색을 띄게 된다. 540 nm 파장에서 최대의 흡광도를 가지며 이 흡광도를 측정함으로써 아질산 이온의 생성량을 정량하였다.

도 5는 제조된 플라즈마 처리수에 함유된 질산 이온(Nitrate ion, NO₃ ^-)의 농도 측정 결과 그래프이다.

질산 이온(Nitrate ion, NO₃ ^-)은 20분과 30분의 플라즈마 처리 후에 각각 0.64±0.18 mM과 1.12mM이 측정되었다. 용액 내 질산 이온을 측정하기 위해서 OAKTON Instruments사의 Acorn Ion 6 meter를 사용하였다. Acorn Ion 6 meter에는 다양한 이온을 측정할 수 있는 Ion selective electrodes (ISE)를 연결하여 사용하며 15ml의 참조 전해액(reference electrolyte)를 포함하고 있어 이온의 농도 측정이 가능하다.

도 6은 본 발명의 플라즈마 처리수를 제조한 플라즈마 제트의 구조 및 인가전압의 파형을 보여주는 도면이다.

플라즈마 제트의 상세 구성은 다음과 같다.

금속으로 된 속이 빈 니들 전극(100)을 내부 전극으로 하고, 상기 니들 전극(100)의 외측에 유전체 실린더(200)를 배치한다. 본 실시예에서는 수정 실린더를 사용하였다. 상기 유전체 실린더(200) 외측에 스텐레스스틸로 된 실린더형 외부전극(300)을 배치한다. 외부전극(300) 하단은 노즐(310)을 구성하도록 직경을 점차 좁혀 준다. 플라즈마가 방전되어 불꽃이 출발하는 니들 전극(100)의 단부에서부터 외부전극(300) 노즐(310) 하단부까지를 갭 간격이라 하며, 갭 간격은 수 mm(예를 들면, 1 내지 5mm)일 수 있으며, 노즐 하단의 개구부를 조절하여 방전 불꽃의 단면적을 조절할 수 있다. 본 실시예에서는 갭 간격을 2mm로 하였다. 상기와 같은 플라즈마 제트 전극 양단에 전압을 인가하면 노즐 개구부로부터 방전 불꽃이 노출되어 증류수에 직접 조사된다. 인가 전압전류 펄스형으로 그 파형을 도 6의 우측에 수록하였다.

도 7은 도 6의 플라즈마 제트 OES(Optical Emission Spectroscopy) 스펙트럼을 보여준다. 이는 앞서 설명한 활성종들에 대한 함량을 뒷받침한다.

이와 같이 제조된 플라즈마 처리 수를 설치류에게 경구투여하여 경구투여독성 실험을 진행하였다(식품의약품안잔청 고시 제2015-082"의약품 등의 독성시험 기준"에 의거함).

설치류 투여한계 용량인 20ml/kg를 최고 투여군으로 하여 공비 2로 멸균 증류수에 희석한 시료 5ml/kg, 10ml/kg을 저용량 및 중간 투여군으로 2주간 단회 경구투여 실험한 결과, 사망례, 임상증상, 체중, 장기중량, 육안부검 및 조직병리학적 소견이 인정 되지 않아 비교적 안전한 약물로 판단되었다.

또한, 상기 실험 후, 추가적으로 플라즈마 처리수 원액, 또는 멸균 증류수로 2 및 4배 희석한 용액을 20ml/kg의 용량으로 매일 1회씩 28일간 설치류에 경구투여하였고, 대조군에서는 동일 용량의 멸균 증류수만 20ml/kg의 용량으로 반복 투여하였다. 실험 결과, 설치류 투여한계 용량인 20ml/kg까지 플라즈마 처리수 투여와 관련된 사망례, 임상증상, 체중, 장기중량, 혈액 및 혈액 생화학적 변화, 육안 및 조직병리학적 변화가 인정되지 않아 최대 내용량성은 암수 모두 20ml/kg 이상으로 판단되어, 매우 안전한 물질로 판단되고 특별한 표적장기는 인정되지 않았다.

다음으로, 사람의 폐암에 대한 상기 플라즈마 처리수의 항암 효과를 실험하기 위해, 설치류에 사람 편평세포암종성 비소세포 폐암세포주 NCI-H520 세포 주를 이식하고 15일 경과 후부터 플라즈마 처리수 2, 1 또는 0.5ml/kg을 35일간 경구투여한 다음, 모든 동물을 희생하여 체중, 종양 볼륨, 종양 무게, 면역장기중량, 혈중 인터페론(IFN)-γ함량, NK cell 활성도, 비장내 TNF-α, IL-1β, IL-10 함량의 변화를 종양 및 임파장기의 조직병리학적 변화와 함께 관찰하여, 항암 및 면역활성효과를 관찰하였다. 그외 종양 관련 악액질에 미치는 영향도 관찰하였다. 즉, 난소 주위 지방 중량 변화, 혈중 IL-6 변화를 관찰하였다.

실험 결과, 플라즈마 처리수 2, 1 또는 0.5ml/kg 경구 투여는 면역활성 및 NCI-H520 종양 세포에 대해 산화스트레스(oxidative stress)를 통해 투여 농도 의존적인 항암활성을 나타내는 것으로 관찰되었으며, 특히, 플라즈마 처리수는 대표적인 경구용 항암제 gefitinib 120mg/kg과 비교할만한 항암 효과를 NCI-H520 세포이식 누드 마우스 모델에서 나타내었다. 또한, 플라즈마 처리수는 종양관련 악액질현상도 현저히 감소시켰다. 참고로 gefitinib 120mg/kg은 종양관련 악액질현상에는 별다른 영향을 미치지 못하는 것과 대조된다.

상기 실험예에서 플라즈마 처리수에 함유된 과산화수소(H₂O₂)와 질산 이온(NO₃ ^-)은 각각 2uM과 40ppm이었으며, 이들은 자체 분열이 빠른 종양 세포에 대한 oxidative stress로 작용한 것으로 판단된다.

살핀 바와 같이, 본 발명의 플라즈마 처리수는 인체 및 동물의 항암 치료에 효과적인 경구투여제가 될 수 있다.

한편, 상기 실시 예와 실험 예들에서 제시한 구체적인 수치들은 예시적인 것으로 필요에 따라 변형 가능함은 물론이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

100: 니들 전극
200: 유전체
300: 외부 전극

Claims

금속으로 된 속이 빈 니들 전극;
상기 니들 전극 외측에 배치되어 상기 니들 전극을 감싸는 실린더형 유전체; 및
상기 실린더형 유전체 외측에 배치되는 실린더형 외부 전극;을 포함하고,
상기 실린더형 외부전극의 하단은 직경을 점진적으로 좁혀 노즐을 구성하고,
상기 니들 전극과 상기 외부 전극에 전력을 인가하여 플라즈마를 방전하는 플라즈마 방전부;
증류수를 담는 그릇; 및
상기 그릇 주변에 배치되어 활성종의 수명을 지속시키는 냉매;를 포함하고,
상기 증류수에 플라즈마가 조사(照射)되게 하여 경구투여용 항암활성 플라즈마 처리수를 제조하며,
상기 증류수가 담긴 그릇은 증류수의 증발을 방지하기 위한 덮개부;를 구비하며, 상기 덮개부는 상기 노즐이 끼워지는 개구부와 상기 개구부로부터 확장되어 증류수가 담긴 그릇의 둘레를 커버할 수 있는 덮개면을 구비하여 플라즈마 처리수를 제조하는 것을 특징으로 하는 플라즈마 처리수 제조시스템.
증류수를 그릇에 담아 준비하여 상기 증류수에 대해 방전되는 플라즈마를 조사(照射)하여 과산화수소(H₂O₂), 산화질소(NO), 아질산 이온(NO₂ ^-) 및 질산이온(NO₃ ^-) 활성종을 포함한 경구투여용 항암활성 플라즈마 처리수를 제조하되,
상기 증류수에 대해 플라즈마를 조사하는 과정에 있어서, 증발을 방지할 수 있는 수단으로 상기 증류수가 담긴 그릇을 덮개로 덮어 증류수의 증발을 방지하며, 상기 증류수를 담은 그릇 주변에 냉매를 배치하여 플라즈마 조사에 의해 생성되는 활성종의 수명을 지속시키고,
상기 플라즈마 처리수는 원액 또는 멸균증류수에 의해 희석되어 폐암에 대한 경구투여용 항암치료수로 사용되는 것을 특징으로 하는 경구투여용 플라즈마 처리수의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 플라즈마 처리수에 함유되는 활성종의 종류와 농도를 제어하기 위해 플라즈마 처리 시간을 제어하는 것을 특징으로 하는 경구투여용 플라즈마 처리수의 제조방법.
제2항의 제조방법에 의해 제조되며, 증류수에 플라즈마가 조사됨으로써, 경구투여용 항암활성 플라즈마 처리수에 포함된 활성종의 농도는 과산화수소(H₂O₂) 0.14mM 내지 0.15mM, 산화질소(NO) 0.7 내지 2.6, 아질산 이온(NO₂ ^-) 0.11mM 내지 0.18mM, 질산 이온(NO₃ ^-) 0.46 mM 내지 1.12mM가 된 것을 특징으로 하는 경구투여용 플라즈마 처리수.